DK157036B - Endo-deoxyribonuklease a samt fremgangsmaade til fremstilling af samme - Google Patents

Description

DK 157036 B

Opfindelsen angâr en hidtil ukendt endo-deoxyribonuklease A (i det fplgende ofte blot omtalt som "endo-DNase A" eller "DNase A"). Den hidtil ukendte endo-DNase A er i stand til at genkende en specifik basesekvens i dobbeltstrengede deoxyribonukleinsyremolekyler (DNA) 5 og spalte strengene pâ specifikke steder i DNA-molekylerne til frembringelse af specifikke DNA-fragmenter.

Med udtrykket "hidtil ukendt endo-deoxyribonuklease A (endo-DNase A)" menés et enzym ifdlge den foreliggende opfindelse, som har de 10 nedenfor omtalte fysiske og kemiske egenskaber samt substratspeci-ficitet.

Deoxyribonuklease (DNase), som nedbryder deoxyribonukleinsyre (DNA), eksisterer i forskellige biologiske materialer og er meget involve-15 ret i vigtige processer af vital funktion, herunder DNA-metabolisme, sâsom nedbrydning, syntese og genetisk rekombination af DNA, og man er i den senere tid blevet opmærksom pâ DNasens enzymatiske og kemiske egenskaber samt biokemiske funktioner. Det er desuden af stor vigtighed, at enzymer, der har specifikke funktioner, isoleres 20 med henblik pâ at studere strukturen og funktionen af gener samt at kunne anvende enzymerne som et biokemisk reagens, navnlig til genkloning med forædling for 0je.

DNaser opdeles almindeligvis i eksonukleaser og endonukleaser ifpige 25 deres virkemâde. Fprstnævnte type virker pâ den terminale ende af DNA-molekylets polynukleotidkæde og hydrolyserer kæden gradvis til frigprelse af nukleotider, medens endonukleasen spalter phosphordi-esterbindinger i DNA-molekylet distributivt til frembringelse af DNA-fragmenter eller oligonukleotider. I den senere tid har der 30 indenfor endonuklease-enzymomrâdet været foretaget mange studier af enzymer, der har specificitet over for DNA-strukturen, navnlig over for nukleotidsekvenser eller de strukturelle variationer, der forekommer i naturen, eller som introduceres kunstigt, samt af enzymer, der genkender og virker pâ DNA fra en specifik organisme, 35 eller af enzymer, som har vigtige biologiske funktioner (se Tadahiko Ando, Chemistry and Life, bd.13, nr.6 , s.342 (1975)).

Der er blevet udfprt en række underspgelser med hensyn til frem-gangsmâder til fremstilling af enzymer, og der er tilvejebragt nogle 2

DK 157036 B

fremgangsmâder, sâsom en fremgangsmâde til fremstilling af et enzym, som fortrinsvis spalter purin-purin-bindinger i DNA-molekylet fra Asoergillus orvzae (JP patent nr. 621.205); en fremgangsmâde til fremstilling af et enzym, som fortrinsvis spalter guanin-guanin-5 bindinger i DNA-molekylet fra en flydende kultur af en alkalofil bakterie (JP patent nr. 831.171); samt en fremgangsmâde til frem-stilling af tre endo-DNaser, som genkender DNA'et fra en specifik organisme, og som spalter specifikke steder i DNA-molekylet til frembringelse af DNA-fragmenter af specifik stprrelse fra celler fra 10 Sporogenous aérobic tilhprende Bacillus-slaqten (JP patent nr. 1.008.416).

Studier af DNase, som genkender den primære struktur (nukleotidse-kvens) eller hpjere strukturer af DNA og virker pâ DNA-molekylet, er 15 for nylig blevet rettet mod opklaring af DNA-funktioner i vigtige processer i cellen, sâsom DNA-replikation, genetisk rekombination, réparation eller restriktion og modifikation af DNA, samt mod underspgelser og anvendelse af enzymer, der kan anvendes til analyse af DNA-strukturen, dannelse af sted-specifikke mutationer, frem-20 gangsmàder til genetisk rekombination af DNA in vitro og lignende.

Der er blevet fundet nogle sted-specifikke endonukleaser, som genkender specificerede basesekvenser i DNA-molekylerne og spalter strengene pâ specificerede steder inden for eller i nærheden af 25 sekvensen til frembringelse af specifikke DNA-fragmenter, nemlig restriktionsenzymet (II), som er involveret i restriktion og modifikation i prokaryoter, og de forskellige andre enzymer, som har lignende funktioner som enzymet (II), og mange af disse enzymer er blevet isoleret (se Tadahiko Ando, "Restriction enzymes", Chemistry 30 and Life, bd.17, nr.5 s.311 (1979), Tadahiko Ando, "What is a restriction enzyme? Specificity of restriction enzyme and use thereof", Chemistry, bd. 35, nr.l, s.20 (1980)).

Der er imidlertid ikke blevet pâvist enzymer af den ovenfor be-35 skrevne type i eukaryoter. Den foreliggende opfindelse bygger pâ studiet af en hidtil ukendt DNase, der har den ovenfor omtalte specifikke funktion, i forskellige gsrarter tilhprende eukaryoter, og det er lykkedes at separere og opsamle den hidtil ukendte DNase A, som har den substratspeci fi ci tet, at den genkender basesekvensen 3

DK 157036 B

i dobbeltstrenget DNA og spalter strengene pâ specifikke steder i DNA'et til frembringelse af specifikke DNA-fragmenter, ud fra cellefrie ekstrakter opnâet ved dyrkning af Saccharomvcetaceae. sâsom Saccharomvces uvarum eller Saccharomvces cerevisiae. som 5 tilhprer Saccharomvces-s1ægten, samt Pichia membranaefaciens. som tilh0rer Pichia-slæaten.

Den foreliggende opfindelse angâr sâledes en hidtil ukendt endode-oxyribonuklease (endo-DNase A), som er ejendommelig ved, at den er i 10 stand til at spalte pBR 322 DNA pâ mindst ét sted, $105C fag DNA og M2 fag DNA pâ adskillige steder samt λ fag DNA, $DNR2 fag DNA, Φ1 fag DNA, SPP1 fag DNA og pli fag DNA pâ mange steder, har en optimal pH-værdi pâ fra 6,5 til 10,0 i 50 mM tris-HCl puffer, en arbejdstem-peratur pâ fra ca. 30 til ca. 37°C, aktiveres af Mg++ eller Mn++, 15 inhiberes af mere end 0,2 M NaCl eller KC1, har en molekylvægt pâ ca. 80.000 Dalton mâlt ved gelfiltrering under anvendelse af "Ultrogel AcA 44", og er identisk med den endo-DNase A, der opnâs ved dyrkning af Saccharomyces cerevisiae FERM BP-94, Saccharomyces cerevisiae FERM BP-95, Saccharomyces uvarum ATCC 9080 eller Pichia 20 membranaefaciens FERM BP-96, opsamling af cellerne og isolering af endo-DNase A fra en cellefri ekstrakt af de sprængte celler.

"Ultrogel AcA 44" er den kommercielle betegnelse for et gelfiltre-ringsmedium, der fremstilles af l'Industrie Biologique Française, og 25 som bestâr af prækvældede, 60-140/jm partikler med et indhold af polyacrylamid pâ 4% og 4% agarose. Gel en angives af fabrikanten at være anvendelig til fraktionering af molekyler med en molekylvægt pâ fra 10.000 til 130.000 Dalton.

30 Endo-DNase A ifplge den foreliggende opfindelse kan anvendes bredt som biokemisk reagens i studiet af strukturen og funktionen af gener og kan anvendes til genkloning inden for forædling.

Opfindelsen angâr ogsâ en fremgangsmâde til fremstilling af endo-35 DNase A if0lge opfindelsen, hvilken fremgangsmâde er ejendommelig ved, at en stamme af en af arterne Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum eller Pichia membranaefaciens dyrkes, at cellerne opsamles, at der opnâs en cellefri ekstrakt herfra, og at DNase A separeres og isoleres fra den cellefrie ekstrakt.

4

DK 157036 B

Pâ tegningen er figur 1 et skematisk diagram, som viser resultaterne fra en elektroforese pâ agarosegel af et DNA-substrat (pBR 322) behandlet med enzymet ifplge den foreliggende opfindelse, 5 figur 2 er et fysisk kort, der viser spaltningssteder for DNA-substrat (pBR 322) behandlet med enzymet ifpige den foreliggende opfindelse samt et forstprret billede af spaltningsstedet pâ DNA-substratet, og 10 figur 3 og 4 er diagrammer, som viser fragmentmpnstre af forskellige DNA-substrater behandlet med enzymet ifplge den foreliggende opfindelse.

DNase A ifplge den foreliggende opfindelse samt fremgangsmâden til 15 fremstilling heraf vil nu blive beskrevet i detaljer.

De mikroorganismer, som kan anvendes til fremstilling af DNase A ifplge den foreliggende opfindelse, tilhprer Saccharomvces -slægten eller Pichia-slgqten af Saccharomvcetaceae og er i stand til at 20 producere DNase A. Eksempler pâ sâdanne mikroorganismer indbefatter (i) Saccharomvces uvarum Bei.ierinck, (iî) Saccharomvces cerivisiae-Hansen nr.l. og (iii) Saccharomvces cerivisiae Hansen nr.2. som tilhprer Saccharomvces-slæaten samt (iv) Pi chia mem branaefaciens-Hansen. som tilhprer Pichia-slægten.

25

Saccharomvces uvarum Bei.ierinck (i) blev deponeret hos American Type Culture Collection (12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852) (herefter omtalt som "ATCC") med ATCC-deponeringsnummer 9080, hvorved kulturen bliver tilgængelig for offentligheden.

30 (ii) Saccharomvces cerivisiae Hansen nr.l. (iii) Saccharomyces-cerivisiae Hansen nr.2. og (iv) Pichia membranaefaciens Hansen blev deponeret hos Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and 35 Industry, Japan, international deponeringsmyndighed (herefter omtalt som "FERM") under fplgende deponeringsnumre: FERM BP-nr. 94, FERM BP-nr. 95 henholdsvis FERM BP-nr. 96, hvorved kulturerne bliver tilgængelige for offentligheden.

5

DK 157036 B

Deponeringsstederne samt deponeringsnumrene for de ovenfor nævnte mikroorganismer er anf0rt i tabel 1.

TABEL 1 5

Mikroorganismer Deponerinqssted Deponerinasnr.

(i) Saccharomvces uvarum Bei.ierinck ATCC ATCC 9080 10 (ii) Saccharomvces cerivisiae Hansen nr.l, FERM FERM BP-94 (iii) Saccharomvces 15 cerivisiae Hansen nr.2. FERM FERM BP-95 (iv) Pi chia membranaefaciens

Hansen FERM FERM BP-96 20 Mikroorganismerne kan opformeres ved at dyrke dem if0lge traditio-nelle dyrkningsmetoder, f.eks. ved, at de ovenfor nævnte mikroorganismer dyrkes i et flydende kulturmedium indeholdende aminosyrer, caseinhydrolysat, glucose osv., og dyrkes ved fra ca. 25°C til 35°C i 15 til 20 timer under lufttilf0rsel (forkultur), at kulturopl0s-25 ningen derefter overf0res til et kulturmedium indeholdende de samme bestanddele og med 20 volumendele medium i forhold til kultur til dyrkning ved 30°C i 8 timer under lufttilfprsel og omrystning, og at kulturoplpsningen centrifugeres til opsamling af cellerne. Cellerne slâs i stykker i en fransk presse til opnâelse af en cellefri 30 ekstrakt, som behandles med "Polymin P" (polyethylenimin) til udfældning og fjernelse af nukleinsyrefraktionen, fraktioneres med ammoniumsulfat og udsættes for kromatografi pâ en ionbytningsspjle under anvendelse af phosphorcellulose eller DEAE-cellulose, gel fil-trering eller en kombination af disse metoder til séparation og 35 opsamling af renset endo-DNase A.

Den sàledes opnâede DNase er en hidtil ukendt nuklease med folgende fysiske og kemiske egenskaber:

DK 157036 B

6 1. Aktivitet oa substratspecificitet: DNA fra plasmidet pBR 322 formeret i Escherichia coli udvalgtes som DNA-substratet for den enzymatiske reaktion og behandledes med 5 forskellige restriktionsenzymer og DNase A. Efter enzymreaktionen udsattes produktet for elektroforese pâ agarosegel (1%) til adskil-lelse af det fragmenterede DNA-substrat efter stprrelse og antal af spaltningssteder. Der opnâedes de pâ figur 1 viste resultater. Figur 1 er sâledes et elektroforesediagram pâ agarosegel (1%) af DNA-10 substratet (pBR 322) behandlet med DNase A. Pâ tegningen angiver tallene 1 til 3, 7 og 8 fragmenter af pBR 322 DNA behandlet med bâde DNase A og et af de angivne restriktionsenzymer, og tallene 4 til 6 angiver fragmenter af forskelligt DNA, der kun er behandlet med et af de angivne restriktionsenzymer, og som vises med en angivelse af 15 molekylvægt. Aile de anvendte restriktionsenzymer er kommercielt tilgængelige.

Nr. Substrat-DNA Restri kti onsenzvmer

1 pBR 322 + Pst I + DNase A

20 2 pBR 322 + Sal I + DNase A

3 pBR 322 + BamH I + DNase A

4 λ + Hind III

5 §xl74.RF--I + Hae III

6 §xl74.RF~I + Hpa I

25 7 pBR 322 + EcoR I + DNase A

8 pBR 322 + Hind III + DNase A

Det fremgâr af figur 1, at DNase A spalter DNA-substratet (pBR 322) i fragmenter med specifik stprrelse. Figur 2 er et fysisk kort, som 30 er opnâet ud fra de pâ figur 1 viste resultater, og viser kl art spaltningsstedet. Spaltningsstedet pâ pBR 322 DNA med en molekylvægt pâ 2,6xl06 Dalton er vist ved en pii pâ figur 2.

140 150 35 * 1 *

GCTGTAGGCATAGGC

CGACATCCGTATCCG

î 7

DK 157036 B

Note: Tallene angiver positionerne pâ det fysiske kort (enhed: basepar) af pBR 322 DNA (1-4362).

Af de pâ figur 1 og 2 viste resultater fremgâr det, at DNase A 5 spalter DNA-substratet pâ et specifikt sted nær det spaltningssted pâ DNA-substratet (pBR 322), der opnâs ved behandling med restrik-tionsenzymet Hind III.

Figur 3 og 4 viser elektroforesediagrammer pâ agarosegel af forskel-10 lige DNA-substrater behandlet med DNase A.

Figur 3 viser, at DNase A spalter forskellige DNA-substrater pâ f0lgende mâde: 15 Nr\ Substrat DNA DNase A Spaltningssted 9 $105C fag DNA - ingen 10 " + adskillige 11 M2 fag DNA - ingen 12 " + adskillige 20 13 λ fag DNA - ingen 14 " + mange

Note: - ..... Der tilsattes ikke DNase A.

+ ..... Der tilsattes DNase.

25

Figur 4 viser, at DNase A spalter forskellige DNA-substrater som fdlger:

Nr. Substrat DNA DNase A Spaltningssted 30 15 §NR2 fag DNA - ingen 16 " + mange 17 §1 fag DNA - ingen 18 " + mange 19 SPP1 fag DNA - ingen 35 20 " + mange 21 pli fag DNA - ingen 22 " + mange 8

DK 157036 B

Note: - ..... Der tilsattes ikke DNase A.

+ ..... Der tilsattes DNase.

Af de pâ figurerne 3 og 4 viste resultater fremgâr det, at DNase A 5 spalter DNA-substrat fra §105C fag og M2 fag pâ adskillige steder og DNA fra λ fag, §NR2 fag, $1 fag, SPP1 fag henholdsvis pli fag pâ mange steder.

De anvendte DNA-substrater var fplgende: 10 (1) $xl74«RF--I replikativ form I DNA fra Escherichia coli faa Φχ174 (2) $xl05C Bacillus fag ¢1050 dyrket pâ Bacillus sub til is Marbura 168 15 (3) M2 Bacillus fag M2 dyrket pâ Bacillus subtilis

Marbura 168

(4) λ E.coli fag A dyrket pâ Escherichia coli B

(5) $1 Bacillus fag §1 dyrket pâ Bacillus subtilis

Marburg 168 20 (6) SPP1 Bacillus fag SPP1 dyrket pâ Bacillus subtilis

Marbura 168 (7) pli Bacillus fag pli dyrket pâ Bacillus subtilis

Marbura 168 25 De anvendte restriktionsenzymer er fplgende: (1) Pst I isoleret fra Providencia staurtii 164

(2) Sa! I isoleret fra Streptomvces al bus G

(3) BamH I isoleret fra Bacillus amvloliouefaciens 30 (4) Hind III isoleret fra Haemophilus influenzae d.

(5) Hae III isoleret fra Haemophilus aeavptius (6) Hpa I isoleret fra Haemophilus parainfluenzae (7) EcoR I isoleret fra Escherichia coli RY13 35 Af de i figurerne 1 til 4 viste resultater er der blevet draget den konklusion, at DNase A er en endo-deoxyribonuklease, som er i stand til at genkende en specifik basesekvens i et molekyle fra forskel-lige substrat-DNA'er og spalte DNA-kæden i et eller flere specifikke positioner heraf til frembringelse af specifikke DNA-fragmenter.

9

DK 157036 B

2. pH-Optimum:

Den optimale pH-værdi for den enzymatiske aktivitet mâltes i 50 mM tris-saltsyrepuffer. Der blev fundet DNase aktivitet mellem pH 6,5 5 og pH 10,0, og den var maksimal mellem pH 6,8 og pH 8,5.

3. Arbe.idstemperatur:

Mellem ca. 30°C og ca. 37°C.

10 4. Fremganqsmàde til màlino af stvrke: DNase A sattes til en oplpsning indeholdende 50mM tris-saltsyrepuf-fer (pH 7,5), 5 mM 2-mercaptoethanol, 50 mM KCL, 10 mM MgClg og 15 forskelligt bakteriofag-DNA eller plasmid-DNA), og blandingen opvarmedes til 37°C i 60 minutter. Reaktionsprodukterne udsattes for elektroforese pâ 0,7% eller 1% agarosegel. De fremkomne agaroseplad-er udsattes for ultraviolet bestrâling i nærvær af ethidiumbromid.

Den sàledes udsendte fluorescens fotograferedes til pâvisning af 20 elektroforesempnsteret i form af bând pâ filmen. Antallet af bând og positionerne samt omfanget af hvert bând mâltes.

5. Inhiberinq, aktiverinq og stabilisering: 25 DNase A aktiveredes af Mg++, som kan erstattes af andre divalente métalioner, navnlig Mn++. DNase A inhiberedes af mere end 0,2 mol NaCl eller KC1.

6. Qprensninqsprocedure: 30

En DNase A-producerende mikroorganisme tilhprende Saccharomvces-slægten eller Pichia-slæqten dyrkes. Et fra cellerne opnâet celle-frit ekstrakt behandles med "Polyimin P" (polyethylenimin) til udfældning og fjernelse af nukleinsyrefraktionen, fraktioneres 35 derefter med ammoniumsulfat og udsættes for kromatografi pâ ionbyt-terspjler under anvendelse af phosphorcellulose, DEAE-cellulose eller lignende, gelfiltrering eller en kombination heraf til séparation og oprensning af DNase A.

10

DK 157036 B

7. Molekvlvæat:

Molekylvægten af DNase A mâltes ved gelfiltrering under anvendelse af Ultro gel AcA 44, og molekylvægten var ca. 80.000 Dalton.

5 8. Grundstofanalvse:

Grundstofanalyse af DNase A er endnu ikke blevet udfprt, da det ikke synes at karakterisere DNase A.

10

Som beskrevet detaljeret ovenfor er DNase A en hidtil ukendt endo-deoxyribonuklease, som er i stand til at genkende en specifik basesekvens i dobbeltstrenget DNA fra nogle organismer, sâsom Escherichia coli og bakteriofager, og spalte strengene pâ specifikke 15 steder i DNA-molekylet til frembringelse af specifikke DNA-frag-menter. DNase A har en meget stor substrat-specificitet, som aldrig er blevet omtalt i 1itteraturen, og DNasen kan fremstilles effektivt ved fremgangsmâden ifpige den foreliggende opfindelse.

20 Fremgangsmâden ifplge den foreliggende opfindelse vil nu blive beskrevet under henvisning til de efterfplgende eksempler.

EKSEMPEL 1 25 Præparation af cellefri ekstrakt

Den ovenfor nævnte Saccharomvces cerevisiae Hansen nr.l (FERM BP-94) fordyrkedes i 500 ml af et flydende medium indeholdende 2% glucose, 2% polypepton og 1% gærekstrakt ved 30°C natten over under lufttil-30 fprsel. Forkulturen inokuleredes i 10 liter af samme kulturmedium og dyrkedes ved 30°C i 8 timer under lufttilfprsel og omrystning. Den fremkomne kulturoplpsning centrifugeredes ved 10.000 omdr./min i 20 minutter, vaskedes 2 gange med destilleret vand til frembringelse af 200 g celler (18-20 g pr. 1 liter kulturmedium), som kan fryses og 35 opbevares ved -80°C.

Cellerne (200 g) suspenderedes i 50 ml af en puffer A (50 mM tris-HC1 buffer (pH 7,5), 1 mM EDTA, 10 mM 2-mercaptoethanol og 10% glycerol) indeholdende 0,3 M ammoniumsulfat og blev sprængt i 7 11

DK 157036 B

stykker med en fransk presse (1800 kg/ctn ). Den sâledes behandlede masse suspenderedes i 200 ml af pufferen A indeholdende 0,3 M ammoniumsulfat, Suspensionen omrprtes ved 0°C i 30 minutter og centrifugeredes ved 13.000 omdr./min i 60 minutter ved 2°C til 5 opnâelse af 350 ml af supernatantfraktion I, som indeholdt DNase A-aktivitet.

Oprensninq 10 Til den sâledes opnâede fraktion I sattes under omrpring en oplps-ning af "Polymin P" (10%, pH 8,0) til opnâelse af en slutkoncentra-tion pâ 0,4%, og blandingen omrprtes ved 0°C i 40 minutter. Bland-ingen centrifugeredes derefter ved 13.000 omdr./min i 30 minutter ved 2°C til opnâelse af en supernatant, til hvilken der sattes knust 15 ammoniumsulfat til frembringelse af en 50% mættet oplosning, som derefter omrprtes ved 0°C i 50 minutter og igen centrifugeredes ved 16.000 omdr./min i 30 minutter ved 2°C til frembringelse af et précipitât. Præcipitatet oplostes i 100 ml af en puffer B (indeholdende 20 mM phosphatpuffer (pH 6,8), 1 mM EDTA, 10 mM 2-mercaptoetha-20 nol og 10% glycerol). Den fremkomne opl0sning dialyseredes mod 4 liter af pufferen B indeholdende 0,15 M KC1 i 4 timer til frembringelse af 154 ml af en fraktion II.

Fraktion II adsorberedes pâ en phosphorcellulosesojle (diameter 3,2 25 x 23 cm), som tidligere var ækvilibreret med pufferen B indeholdende 0,15 M KC1. Ved eluering med pufferen B elueredes den aktive fraktion til frembringelse af 230 ml af en fraktion III.

Den fremkomne fraktion III fortyndedes til det dobbelte volumen med 30 pufferen B, hvorefter den adsorberedes pâ en phosphorcelluloses0jle (diameter 3,2 x 25 cm), som derefter vaskedes med 400 ml af pufferen B, hvorefter den elueredes med en fra 0 til 8,0 M lineær koncentra-tionsgradient af KC1. Den aktive fraktion elueredes med ca. 0,3 M KC1, og der opnâedes 166 ml af en fraktion IV.

35

Der sattes ammoniumsulfat til fraktion IV til frembringelse af en 70% mættet opl0sning, som derefter omr0rtes ved 0°C i 30 minutter og centrifugeredes ved 27.000 omdr./min i 20 minutter ved 2°C. Det fremkomne sédiment opl0stes i 6 ml af pufferen A, adsorberedes 12

DK 157036 B

derefter pâ en spjle pakket med Toyopearl HW 65F (diameter 1,9 x 45 cm), der forud var ækvilibreret med pufferen A indeholdende IM KC1, og spjlen elueredes med pufferen A.

5 De opsamlede aktive fraktioner dialyseredes mod 2 liter af pufferen A indeholdende 50% glycerol i 4 timer, og der opnâedes en fraktion V indeholdende DNase A.

Den sâledes opnâede DNase A kan opbevares ved -20°C.

10 EKSEMPEL 2

Fremgangsmâden fra eksempel 1 gentoges med den undtagelse, at der anvendtes Saccharomvces cerevisiae Hansen nr.2 (FERM BP-95) i stedet 15 for Saccharomvces cerevisiae Hansen nr.l. Der opnâedes 5 ml af fraktionen V af DNase A.

EKSEMPEL 3 20 Fremgangsmâden fra eksempel 1 gentoges med den undtagelse, at

Saccharomvces uvarum Bei.ierinck (ATCC 9080) anvendtes i stedet for Saccharomvces cerevisiae Hansen nr.l. Der opnâedes 6 ml af fraktionen V af DNase A.

25 EKSEMPEL 4

Fremstillina af cellefrit ekstrakt

Den tidligere nævnte Pichia membranaefaciens Hansen (FERM BP-96) 30 dyrkedes i forkultur i 500 ml af et flydende medium indeholdende 2% glucose, 2% polypeptone og 1% gærekstrakt ved 30°C natten over under lufttilfprsel. Den fordyrkede kultur inokuleredes i 10 liter af samme kulturmedium og dyrkedes ved 30°C i 16 timer under lufttil-fprsel og omrystning. Den fremkomne kulturoplosning centrifugeredes 35 ved 10.000 omdr./min i 20 minutter, vaskedes 2 gange med destineret vand til frembringelse af ca. 240 g af cellerne (20-23 g pr. liter kulturmedium), som kan nedfryses og opbevares ved -80°C.

Cellerne (240 g) suspenderes i 50 ml af pufferen A (50 mM tris-HCl 13

DK 157036 B

buffer (pH 7,5), 1 mM EDTA, 10 mM 2-mercaptoethanG] og 10% glycerol) indeholdende 0,3M ammoniumsulfat og sprængtes med en fransk presse 2 (1800 kg/cm ). Den sâledes behandlede niasse suspenderedes i 200 ml af pufferen A indeholdende 0,3 M ammoniumsulfat. Suspensionen 5 omrdrtes ved 0°C i 30 minutter og centrifugeredes ved 13.000 omdr./min i 60 minutter ved 2°C til opnâelse af 300 ml af en super-natantfraktion I, som udviste DNase A-aktivitet.

Oprensninq 10

Til den sâledes opnâede fraktion I sattes under omrpring en opl0$-ning af "Polymin P" (10%, pH 8,0) til opnâelse af en slutkoncen-tration pâ 0,4%, og blandingen omrdrtes ved 0°C i 40 minutter. Blandingen centrifugeredes derefter ved 13.000 omdr./min i 30 15 minutter ved 2°C til opnâelse af en supernatant, til hvilken der

sattes knust ammoniumsulfat til frembringelse af en 70% mættet opl0sning, som derefter omrdrtes ved 0°C i 50 minutter og derefter centrifugeredes ved 16.000 omdr./min i 30 minutter ved 2°C til frembringelse af et præcipitat. Præcipitatet opl0stes i 100 ml af en 20 puffer B (indeholdende 20 mM phosphatpuffer (pH 6,8), 1 mM EDTA, 10 mM 2-mercaptoethanol og 10% glycerol). Den fremkomne oplpsning dialyseredes mod 4 liter af pufferen B indeholdende 0,15 M KC1 i 4 timer til frembringelse af 140 ml af en fraktion IL

25 Den fremkomne fraktion II fortyndedes til det dobbelte volumen med pufferen B, hvorefter den adsorberedes pâ en phosphorcelluloses0jle (diameter 3,2 x 40 cm), som derefter vaskedes med 500 ml af pufferen B, hvorefter den elueredes med en 0 til 8,0 M lineær koncentrations-gradient af KC1. Den aktive fraktion elueredes med fra 0,3 til 0,4 M 30 KC1, og der opnâedes 200 ml af en fraktion III.

Der sattes ammoniumsulfat til fraktion III til frembringelse af en 70% mættet opl0sning, som derefter omr0rtes ved 0°C i 30 minutter og centrifugeredes ved 27.000 omdr./min i 20 minutter ved 2°C. Det 35 fremkomne sédiment opldstes i 6 ml af pufferen A, adsorberedes derefter pâ en spjle pakket med Toyopearl HM 65F (diameter 2,6 x 43 cm), der forud var ækvilibreret med pufferen A indeholdende IM KC1, og sdjlen elueredes med pufferen A.

14

DK 157036 B

De opsamlede aktive fraktioner dialyseredes mod 2 liter af pufferen A indeholdende 50% glycerol i 4 timer, og der opnâedes 6 ml af en fraktion IV indeholdende DNase A.

5 Den sâledes opnâede DNase A kan opbevares ved -20°C.

10 15 20 25 30 35

Claims (3)

1. Endo-deoxyribonuklease A (endo-DNase A), kendetegnet ved, at den er i stand til at spalte pBR 322 DNA pâ mindst ét sted, 5 $105C fag DNA og M2 fag DNA pâ adskillige steder samt λ fag DNA, §NR2 fag DNA, $1 fag DNA, SPP1 fag DNA og pli fag DNA pâ mange steder, har en optimal pH-værdi pâ fra 5,5 til 10,0 i 50 mM tris-HCl puffer, en arbejdstemperatur pâ fra ca. 30 til ca. 37°C, aktiveres af Mg++ eller Mn++, inhiberes af mere end 0,2 M NaCl eller KC1, har 10 en molekylvægt pâ ca. 80.000 Dalton mâlt ved gelfiltrering under anvendelse af "Ultro gel AcA 44", og er identisk med den endo-DNase A, der opnâs ved dyrkning af Saccharomyces cerevisiae FERM BP-94, Saccharomyces cerevisiae FERM BP-95, Saccharomyces uvarum ATCC 9080 eller Pi chia membranaefaciens FERM BP-96, opsamling af cellerne og 15 isolering af endo-DNase A fra en cellefri ekstrakt af de sprængte celler.

2. Fremgangsmâde til fremstilling af endo-DNase A ifplge krav 1, kendetegnet ved, at en stamme af en af arterne

20 Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum eller Pichia membranaefaciens dyrkes, at cellerne opsamles, at der opnâs en cellefri ekstrakt herfra, og at DNase A separeres og isoleres fra den celle-frie ekstrakt.

3. Fremgangsmâde ifpige krav 2, k e n d e t e g n e t ved, at den cellefrie ekstrakt behandles til fjernelse af nukleinsyrefraktionen derfra, og at der mindst anvendes én metode udvalgt blandt ammonium-sulfatfraktionering, ionbytningskromatografi og gelfiltrering til separering og opsamling af DNase A. 30 35