DK154437B - Fremgangsmaade til fremstilling af pentapeptidet h-arg-x-z-y-tyr-r ved oploesningssyntese - Google Patents

Description

DK 154437 B

i

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af pentapeptidet H-ARG-X-Z-Y-TYR-R, hvori X er LYS, og Y er VAL, eller X og Y begge er SAR, Z er ASP eller GLU, og R er OH eller NHg, ved opløsningssyntese.

5 Beskrivelsen til USA-patentskrift nr. 4.190.646 og dansk patentansøgning nr. 1557/80, indleveret d. 11. april 1980, omhandler forskellige peptider, der er nyttige på thymus-funktionelle og immunologiske områder. Det nævnte patent omhandler "thymopoietin-pentapeptidet" (TP5) og substituerede derivater deraf, hvorimod den nævnte ansøgning omhandler 10 peptidanal oger af TP5, som har større styrke end TP5. I det nævnte patent og den nævnte ansøgning blev peptiderne fremstillet ved fastfase-synteseteknikker, der i almindelighed beskrives som "Merrifield-syntese”. Patentet og ansøgningen omtaler også, at klassiske metoder (dvs. opløsnings-synteseteknikker) kan anvendes til fremstilling af 15 visse af disse materialer, men der var ikke beskrevet nogen specifik klassisk metode eller syntesevej.

Mens fastfase-syntesemetoden ifølge Merrifield er bekvem til fremstilling af små mængder peptider i laboratorie-målestok, er den upraktisk og i almindelighed uøkonomisk til fremstilling af store mængder 20 (fx. mere end ca. 100 g) peptid, hvor opløsningssynteseteknikken er mere hensigtsmæssig. Endvidere er opløsnings-syntesemetoder i almindelighed langt mindre kostbare end fastfase-metoder p.g.a de langt mindre enhedsomkostninger for visse af de anvendte reagenser. Blandt den store mængde af opløsnings-syntesemetoder, som er tilgængelige for anvendelse ved 25 fremstilling af polypeptider, er der nu fundet bestemte syntesemetoder, som bekvemt og på økonomisk måde giver det ønskede peptid i overraskende højt udbytte.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved de i kravets kendetegnende del anførte træk.

30 Den alfa-aminobeskyttende gruppe T kan være den samme eller forskellig for hver af de ovenfor nævnte aminosyrer og bør være stabil mod fjernelse ved de til sammenbinding af aminosyregrupperne anvendte trin samtidig med, at den let skal kunne fjernes ved slutningen af de forbindende trin under betingelser, som ikke vil spalte nogen af peptidets 35 amid-bindinger. For nogle grupper (fx. B0C) forårsages denne fjernelse af stærk syre (fx. tri fluoreddikesyre), hvilket resulterer i et ubeskyttet mellemprodukt, der opnås som det tilsvarende syreadditionssalt (fx. som tri fluoracetat).

2

DK 154437 B

Den guanidinobeskyttende gruppe F kar« vsra en hvilken see helst passende aminobeskyttende gruppe, som nedenfor beskrevet, eller en nitrogruppe samt syreadditionssalte såsom hydrochloridet. Blandt de aminobeskyttende grupper foretrækkes urethan-beskyttende grupper (formel 5 a) nedenfor) og substituerede syrederivater såsom p-methoxybenzensulfo-nyl og tosyl. Hydrochlorid-saltet foretrækkes mest. Denne guanidino-beskyttende gruppe er heri kaldt "omega"-gruppe for at indikere, at den befinder sig ved kædens ende. Den nøjagtige position af mange guanidino-beskyttende grupper på kæden kendes ikke med sikkerhed.

10 Selvfølgelig bør, hvis X er LYS, dens epsilon-aminogruppe også være passende beskyttet af den amino-beskyttende gruppe T" under fremstilling af fragmenter, som indeholder X, og deres anvendelse til fremstilling af slutprodukt-peptidet. T"-gruppen må let kunne fjernes under betingelser, som ikke vil ødelægge det resulterende peptid samtidig med, at den bør 15 være stabil under fjernelsen af T-grupperne.

Den carboxy-beskyttende gruppe U bør let kunne fjernes under betingelser, som ikke vil ødelægge det resulterende peptid samtidig med, at den er stabil under fjernelsen af T-grupperne.

R'-gruppen er enten NHg (for produkt-peptider, hvor R er NHg) eller 20 0U (for produkt-peptider, hvor R er OH).

Eksempler på egnede amino-beskyttende grupper er sådanne med formlen: 0

II

25 a) Rj-OC-, hvori Rj betegner phenyl, tolyl, xylyl, adamantyl, allyl, /J-cyanoethyl, fluorenylmethyl, benzyl, benzyl, hvori phenylringen er subsitueret med fra 1-3 substituenter udvalgt blandt halogen, nitro, lavere alkyl og lavere alkoxy, diisopropylmethyl, diphenylmethyl, cyclohexyl, cyclopentyl, vinyl, t-butyl, t-amyl, dimethyltrifluormethylmethyl 30 eller dimethyl biphenylmethyl, 0 b) RgC-, hvori Rg betegner lavere alkyl med 2-4 carbonatomer såsom 35 ethyl, isopropyl og t-butyl eller lavere alkyl med 1-4 carbonatomer substitueret med fra 1-5 halogengrupper såsom trifluormethyl, chlormethyl og pentachlorethyl, v 3

DK 154437 B

c) R3O-P-J hvori V betegner S eller 0, og Rg og hver be- 5 0R4 tegner benzyl eller lavere al kyl, d) ^ hvori Rg og Rg hver for sig betegner lavere alkyl eller / .c- tilsammen betyder -CH9-C-CH0-, 10 '< J\ \X?=0 *7 R8 ' Rg hvori Ry og RQ hver for sig betegner hydrogen eller lavere al kyl, N°2 15 e) hvori Rg betegner hydrogen eller nitro, og o R 11 R11 c f) y ^ hvori Rjg er hydrogen, methyl, halogen eller nitro.

II

20 o

Den amino-beskyttende gruppe f), som er bidentat, kan alene anvendes for a-aminogrupperne i L-arginin eller-L-valin eller α-amino- og epsilon-aminogrupperne i L-lysin, men ikke for a-aminogruppen i sarco-sin. Den amino-beskyttende gruppe på sarcosinens a-aminogruppe skal være 25 monodentat p.g.a. methylsubstituenten på denne aminogruppe. De øvrige amino-beskyttende grupper kan anvendes på alle aminosyrer.

Som her anvendt, omfatter "halogen" fluor, chlor, brom og iod, men chlor og brom foretrækkes. Udtrykkene "lavere al kyl" og "lavere alkoxy" omfatter hhv. mættede alifatiske carbonhydrider med 1-6 carbonatomer så-30 som methyl, ethyl, isopropyl, t-butyl og n-hexyl og de tilsvarende alkoxygrupper såsom methoxy, ethoxy, isopropoxy, t-butoxy og n-hexoxy.

Methyl er den foretrukne lavere al kyl, og methoxy er den foretrukne lavere alkoxy.

De til indføring af disse beskyttende grupper anvendte reagenser 35 (sædvanligvis de tilsvarende syrechlorider, selvom andre derivater kan anvendes), omtales undertiden her som "beskyttelsesgruppereagenser".

Andre egnede beskyttende grupper er omhandlet i fx. "Protective Groups in Organic Chemistry", J.F.W. McOmie, ed., Plenum Press, N.Y., 1973.

4

DK 154437 B

Det foretrækkes, at hvert T og T" er ens, og at de er benzyloxycarboxy (CBZ) eller tri fluoracetyl (TFA). Det foretrækkes, at Τ' er hydrochloridsaltet.

En lang række forskellige reagenser kan anvendes til fremstilling 5 af de ovenfor beskrevne carboxy-aktiverede beskyttede aminosyrerester.

En type carboxy-aktiveret beskyttet aminosyrerest er en reaktiv ester. Eksempler på midler, som kan anvendes til fremstilling af egnede aktive estere er phenol, phenol hvori phenylringen er subsitueret med 1-5 substituenter udvalgt blandt halogen, (fx. chlor eller fluor), nitro, 10 cyano og methoxy, thiophenyl, N-hydroxyphthalimid, N-hydroxysuccinimid, N-hydroxyglutarimid, N-hydroxybenzamid og 1-hydroxytriazol. Andre egnede midler er fx. omhandlet i "Protective Groups in Organic Chemistry", J.F.W. McOmie, ed., omtalt ovenfor. De nedenfor givne udførelseseksempler anvender almindeligvis N-hydroxysuccinimid eller 1-15 hydroxybenzotriazol.

Andre aktiveringsmetoder, såsom den blandede eller symmetriske anhydrid-metode, syrechlorid-metoden og azid-metoden er velkendte inden for denne teknik og beskrevet i fx. Bodanszky, et al., "Peptide Synthesis", 2. udgave, 1976, pp 85-128. Disse andre metoder kan også 20 anvendes.

For bekvemmelighedens skyld anvendes følgende forkortelser heri, som refererer til de forskellige aminosyrer:

Aminosyre Forkortel se

25 L-lysin LYS

L-val in VAL

L-tyrosin TYR

L-asparaginsyre ASP

L-glutaminsyre GLU

30 Sarcosin SAR

L-arginin ARG

5

DK 154437 B

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er vist skematisk i nedenstående skema: arg X Z Y tyr

T —-OH. T--OH

5 u T--OA H — -—OH T--OA H--R' U .

T ----OH T---R'

U

10 T----OA H---R'

U

T-- R'

Τ' U

T —-—OA H------R* 15 στ-----R'

H------R

20 Et eksempel på fremstilling af H-ARG-SAR-ASP-SAR-TYR-NH2 er vist skematisk i nedenstående skema II:

ARG SAR ASP SAR TYR

25 T--OH T--OH

U

T--OA H — —OH T-OA H---NH2

U

T-----OH T---NH2.

ϋ 30 / T--<--OA H--— NH2

U

T-----NH2

T* U

T — — OA H-------NH2 35

00 T* U

T — —-----nh2 H--:--:-----h NH2 6

DK 154437 B

I ovenstående skemaer har de beskyttende grupper U, T, T' og T" de ovenfor omtalte betydninger. Carboxy-aktiveringen af aminosyreresterne er angivet ved bogstaverne OA.

Under henvisning til skema II ovenfor kan fragment I i 5 almindelighed fremstilles som følger. For at beskytte aminogruppen på sarcosin dannes et vandopløseligt basisk additionssalt af sarcosin, som opløses i vand. Hensigtsmæssigt kan dette basiske additionssalt dannes ved opløsning af sarcosin i et lille molært overskud af natriumhydroxid.

Til denne opløsning sættes dernæst samtidigt et lille overskud af et 10 reagens til indføring af den beskyttende gruppe T (fx. det tilsvarende syrechlorid såsom benzyloxycarbonylchlorid) og en opløsning af base (fx. natriumhydroxid) til omsætning med syren (fx. HC1), som dannes under reaktionen. Det beskyttelsesgruppeadderende reagens kan være i opløsning eller på ren form og er fortrinsvis syrechloridet. Efter endt reaktion 15 fjernes overskydende beskyttelsesgruppe-adderende reagens (fx. ved ekstraktion med diethyl ether eller ethvert andet organisk opløsningsmiddel, som er ublandbart med vand), hvorefter den beskyttede sarcosin isoleres fra uomsat sarcosin ved behandling med syre (fx. saltsyre). Syrebehandlingen omdanner det basiske additionssalt af den 20 ubeskyttede sarcosin til et syreadditionssalt af den ubeskyttede sarcosin, hvilket salt er opløseligt i vand. Imidlertid omdanner syrebehandlingen kun det basiske additionssalt af beskyttet sarcosin til beskyttet sarcosin, eftersom der ikke kan dannes et syreadditionssalt p.g.a. den beskyttede aminogruppe. Denne beskyttede sarcosin, som er 25 uopløselig i vand, kan let adskilles fra saltet af den ubeskyttede sarcosin, fx. ved ekstraktion med et ublandbart organisk opløsningsmiddel, som beskrevet ovenfor. Som her anvendt, omfatter udtrykket "ublandbart organisk opløsningsmiddel" alle sædvanlige organiske opløsningsmidler fra laboratoriet, som ikke er blandbare med 30 vand som fx. diethylether, ethylacetat, benzen, toluen og xylen. Den foretrukne beskyttede sarcosin, N-benzyloxycarbonyl-sarcosin, er en kendt forbindelse. En fremgangsmåde til fremstilling deraf er vist af R.S. Tipton og B.A. Pawson, J. Org. Chem., 26, 4698 (1961), og forbindelsen er kommercielt tilgængelig fra Bachem, Inc., Torrance, CA.

35 Som forberedelse for kondensationen af denne beskyttede sarcosin med et beskyttet L-tyrosinamid-molekyle til dannelse af fragment I bør den aminobeskyttede sarcosin sædvanligvis aktiveres på en eller anden måde for at fremme dannelsen af bindingen. Selvom den foretrukne måde at 7

DK 154437 B

udføre denne aktivering på består i dannelse af en "aktiv ester", er det tanken, at også andre fra teknikken kendte aktiveringsmetoder kan anvendes såsom den blandede eller symmetriske anhydridmetode, azidmetoden eller syrechloridmetoden.

5 Det er hensigten, at enhver aktiv ester af den beskyttede sarcosin kan anvendes og en foretrukket aktiv ester er den, som dannes med hydroxysuccinimid. Den aktive ester af den beskyttede sarcosin fremstilles ved omsætning af ækvivalente mængder af den beskyttede sarcosin og et aktivester-reagens i opløsning i et egnet organisk 10 opløsningsmiddel som fx. tetrahydrofuran, dioxan, dimethyl formamid, pyridin eller lignende. Til denne opløsning sættes dernæst en ækvivalent mængde af et koblingsmiddel, typisk dicyclohexylcarbodiimid. Selvom andre koblingsmidler er effektive, er dicyclohexylcarbodiimid særligt anvendeligt, fordi biproduktet fra denne koblingsreaktion er meget 15 uopløseligt i den anvendte gruppe af opløsningsmidler og derfor let kan fjernes ved filtrering, således at det koblede produkt bliver tilbage i opløsning.

L-tyrosinamid er kommercielt tilgængeligt (fx. fra Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) eller kan fremstilles ved kendte metoder.

20 Det næste trin ved fremstillingen af fragment I består i omsætning af et molært ækvivalent af L-tyiros i namidet med den beskyttede, aktive sarcosinester i nærværelse af et ækvivalent af et saltdannende materiale såsom en organisk tertiær amin. Selvom enhver organisk tertiær amin kan anvendes, har det vist sig, at triethylamin fungerer godt.

25 Opløsningsmidlet er ethvert egnet organisk opløsningsmiddel som beskrevet ovenfor. De uomsatte aminosyrer fjernes ved behandling af reaktionsblandingen med syre (fx. eddikesyre) og adskillelse ved ekstraktion med et ublandbart organisk opløsningsmiddel som beskrevet ovenfor.

30 Det sidste trin er fjernelsen af den alfa-aminobeskyttende gruppe fra sarcosinen, fortrinsvis med tri fluoreddikesyre, til dannelse af fragment I.

Fremstillingen af fragment II begynder sædvanligvis med L-asparaginsyre, som er beskyttet på dens beta-carboxygruppe eller L-35 glutaminsyre, som er beskyttet på dens gamma-carboxygruppe. Denne beta-eller gamma-carboxygruppe betegnes sædvanligvis som "omega"-gruppen i overensstemmelse med den godkendte nomenklatur for at indikere, at den befinder sig ved kædens ende.

DK 154437 B

8

Eksempler på egnede carboxyl beskyttende grupper er benzyl og benzyl, hvori phenylgruppen er substitueret med fra 1-3 substituenter, hver i form af halogen (fx. chlor eller brom), nitro, C^^lavere alkoxy (fx. methoxy) eller Cj^lavere a^yl (fx. methyl). Der henvises til 5 ovennævnte tekst af McOmie for yderligere beskrivelse af sådanne grupper. Benzyl er foretrukket. Denne beta-beskyttede L-asparaginsyre og gamma-beskyttede L-glutaminsyre er kommercielt tilgængelig fra Bachem,

Inc., Torrance, Californien, eller kan fremstilles ved kendte metoder.

Den nævnte beta-beskyttede L-asparaginsyre eller gamma-beskyttede 10 L-glutaminsyre (omega-U-Z) omsættes dernæst med den alfa-aminobeskyttede sarcosin, som er blevet aktiveret (fx. ved omdannelse til en aktiv ester) som ovenfor beskrevet til dannelse af fragment II. I skema II er Z ASP.

Fragment I og II sammenbindes til dannelse af det beskyttede 15 tetrapeptid alfa-T-SAR-beta-U-ASP-SAR-TYR-NHg (fragment III) ved omsætning af ækvivalente mængder i et passende aprot opløsningsmiddel såsom dimethyl formamid i nærværelse af et lille overskud af et koblingsmiddel såsom dicyclohexylcarbodiimid. Det foretrækkes endvidere at udføre denne omsætning i nærværelse af et materiale, som minimerer 20 racemicering omkring carboxylgruppen på L-lysindelen af fragment I og forøger reaktionshastigheden, som fx. 1-hydroxybenzotriazol. Som det er tilfældet med fragment II, fjernes den alfa-aminobeskyttende gruppe på sarcosin-resten af fragment III med tri fluoreddikesyre til opnåelse af fragment IIIA.

25 Endelig bindes en alfa-amino- og guanidino-beskyttet L-argininrest efter en koblingsreaktion, der ligner den ved sammenbinding af fragment I og II anvendte, til aminoenden af fragment IIIA, hvilket efter fjernelse af alle beskyttende grupper giver det ønskede pentapeptidamid. Fjernelsen af de beskyttende grupper kan gennemføres fx. ved behandling 30 med hydrogengas i nærværelse af en palladium-på-carbon katalysator i et passende reducerende opløsningsmiddel som beskrevet ovenfor (fortrinsvis vandig eddikesyre). Hydrogengassen behøver ikke at være under højere tryk end atmosfærisk tryk, selvom anvendelsen af tryk er praktisk, da dette accelererer reduktionshastigheden.

35 Isoleringen og rensningen af det resulterende urene produkt kan udføres ved en kombination af krystallisation og ionbytningskromatografi (fortrinsvis under anvendelse af ammoniumacetat-pH5 som elueringsmiddel) under anvendelse af tyndt!ags-kromatografi for at 9

DK 154437 B

bestemme identiteten af materialerne i hver fraktion. Også andre isolerings- og rensningsmetoder end de i eksemplet angivne vil kunne anvendes.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres nærmere i det 5 efterfølgende eksempel.

Eksempel

Fremstilling af ARG-LYS-ASP-VAL-TVR

Boc(Bzl)^AspONp (2,22 g, 5,0 mmol, 4833-18) opløstes i 4,2 M 10 HCl»dioxan (10 ml) og omrørtes i 45 minutter. Derefter inddampedes reaktionsblandingen i vakuum og sønderdeltes i EtgO til dannelse af HC1·(Bzl)^AspONp som et farveløst fast stof, betegnet 4833-20A, 1,81 g, 95¾.

Til en omrørt opløsning af forbindelsen Boc(Cbz)6Lys (1,80 g, 4,73 15 mmol) i THF (10 ml) ved -15°C sattes NMM (0,55 ml, 1,1 ækv.) og derefter iBuOCOCl (0,63 ml, 1,02 ækv.). Den resulterende opslæmning omrørtes i 15 minutter, og det pulverformige faste stof 4833-20A (1,80 g, 4,73 mmol) tilsattes efterfulgt af endnu en portion NMM (0,55 ml). Efter omrøring i 45 minutter ved mindre end 0°C opvarmedes reaktionsblandingen til 20 stuetemperatur og omrørtes i 1 time. Suspensionen filtreredes, og filtratet inddampedes i vakuum. Den faste remanens sønderdel tes i 10% citronsyre, filtreredes, vaskedes med H«0 og lufttørredes.

^ f β

Omkrystallisation fra EtOAc/hexaner gav Boc(Cbz) Lys-(Bzl)p AspONp'l/^HgO som et farveløst fast stof, betegnet 4833-20RC, 3,06 g, 25 92%, smp. 127-129°C.

NMR: AR 1634-84 30 CHN: AR 1634-84

Beregnet: % C 60,41 H 6,06 N 7,83 Fundet: % C 60,52 H 6,09 N 7,76

Til en omrørt opløsning af den aktive ester 4833-20RC (1,94 g, 2,75 35 mmol), HCl.Val-TyrOBzl (DKE 3648-10, 1,12 g, 1,0 ækv.) og HOBT (0,37 g, 1,0 ækv.) i DMF (7 ml) ved stuetemperatur sattes NMM (0,33 ml, 1,1 ækv.). Den gule opløsning omrørtes i 20 timer, hvorefter der tilsattes mættet NaHCOg opløsning. Det resulterende faststof opsamledes, vaskedes

DK 154437 B

10 med H90, 10 procent citronsyre og H«0, hvorefter det lufttørredes. Omkrystallisation fra 1% HOAc/EtOAc/hexaner gav Boc(Cbz) Lys-(Bzl)pAsp-Val-TyrOBzl»l/ZHgO som et farveløst fast stof, betegnet 4833-21RC, smp. 162-164°C, 2,42 g, 94%. DSC (se 4833-21) viste ikke noget af den højere 5 smeltende form.

[a]22 = -19,3° (C = 1,02, DMF) AR 1679-84 NMR: AR 1679-84 10 CHN: AR 1679-84

Beregnet: % C 64,68 H 6,81 N 7,39 Fundet: % C 64,78 H 6,87 N 7,47 15 Ovennævnte tetrapeptid (0,5 g) opløstes i 2,5 ml TFA i et is/vandbad og omrørtes i 2 timer. 7 ml diethyl ether tilsattes, og blandingen omrørtes ved 0°C i 1 time. Det faste stof fjernedes ved filtrering og tørredes ved 50eC under reduceret tryk, hvorved der opnåedes 0,476 g (94 procent) TFA-Cbz-Lys-/?-Bzl-Asp-Val-Tyr-OBzl, smp.

20 168-172°.

Cbz-Arg(HCl) (0,003 mol) kobledes til saltet af tetrapeptidet (0,00286 mol) i DMA/ethylacetat, idet der anvendtes isobutylchlorformiat og N-methylmorpholin ved -5 til -10°C i 60 minutter. Udfældning af reaktionsblandingen i vand efterfulgt af krystallisationer fra 25 DMA/EtOAc/heptan gav 3,164 g (0,00272 mol, 95 procent) Cbz-Arg(HCl)-Cbz-Lys-Ø-Bzl-Asp-Val-Tyr-OBzl.

0,192 g (0,165 mmol) af det beskyttede tetrapeptid opløstes i 1,8 ml eddikesyre og 0,2 ml vand. 30 mg 10 procent Pd/c tilsattes, og blandingen rystedes under et hydrogentryk på 345 kPa (50 psi) i 24 timer 30 ved omgivel sestemperatur. Reaktionsblandingen filtreredes og lyofiliseredes, hvorved der opnåedes 0,177 g. Aminosyreanalyse gav et peptidindhold på 82 procent svarende til et udbytte på 88 procent. HPLC analyse viste en renhed på 99 procent.

Hvis enhederne i pentapeptidet nummereres som følger: 35

Arg-Lys-Asp-Val-Tyr 1 2 3 4 5

Claims (2)

1. 25 Fremgangsmåde til fremstilling af pentapeptidet H-ARG-X-Z-Y-TYR-R, hvori X er LYS, og Y er VAL, eller X og Y begge er SAR, Z er ASP eller GLU, og R er OH eller NHg, ved opløsningssyntese KENDETEGNET ved, at man a) danner fragment I, som består af H-Y-TYR-R', hvori R' er 0U 30 eller NHg, ved i) beskyttelse af æ-aminogruppen af Y-aminosyren ved at lade den reagere med et reagens, som vil indføre den beskyttende gruppe T, ii) aktivering af den i trin i) dannede, beskyttede Y med hensyn til nukleofilt angreb ved carboxygruppen af en amin, til dannelse af en 35 carboxy-aktiveret, beskyttet Y-aminosyre, i i i) omsætning af den carboxy-aktiverede beskyttede Y med TYR-R', og iv) fjernelse af den beskyttende gruppe T, DK 154437 B b) danner fragment II, som består af alfa-T-(epsilon-T")X-omega-U-Z-OH, ved i) fremstilling af omega-U-Z-OH, hvori U er en beskyttende gruppe på omega-carboxygruppen af Z-aminosyren, 5 ii) beskyttelse af alfa-aminogruppen (og, hvis X er LYS, af epsilon-aminogruppen) på X-aminosyren ved at lade den reagere med et eller flere reagenser, som vil indføre den/de beskyttende gruppe(r) T (og T"), iii) aktivering af den i trin ii) dannede, beskyttede X med hensyn 10 til nukleofilt angreb ved carboxygruppen af en amin, til dannelse af en carboxy-aktiveret, beskyttet X-aminosyre, iv) omsætning af den carboxy-aktiverede, beskyttede X-aminosyre med omega-U-Z-OH, 15 c) omsætter fragment I og II til dannelse af fragment III, som består af T-(epsilon-T")X-omega-U-Z-Y-TYR-R', hvori R' er OU eller NHg, d) fjerner den beskyttende gruppe T fra fragment III til dannelse af fragment IIIA, som består af H-(epsilon-T")X-omega-U-Z-Y-TYR-R', hvori R' er OU eller NH2, 20 e) fremstiller alfa-T-omega-T'-ARG, hvori T er en beskyttende gruppe på alfa-aminogruppen af L-argininen, og Τ' er en beskyttende gruppe på guanidino-gruppen af L-argininen, f) omsætter fragment IIIA med alfa-T-omega-T'-ARG til dannelse af alfa-T-omega-T'-ARG-(epsilon-T")X-omega-U-Z-Y-TYR-R', hvori R' er OU 25 eller NH2, g) fjerner U, T, Τ' og T" grupperne til dannelse af peptidet H-ARG-X-Z-Y-TYR-R, og h) isolerer og renser det resulterende peptid, hvori 30. og T" hver er en gruppe udvalgt fra gruppen bestående af 0 a) Rj-OC-, hvori Rj betegner phenyl, tolyl, xylyl, adamantyl, ally!, /J-cyanoethyl, fluorenylmethyl, benzyl, benzyl, hvori phenyl ri ngen 35 er subsitueret med fra 1-3 substituenter udvalgt blandt halogen, nitro, lavere al kyl og lavere alkoxy, di isopropylmethyl, diphenylmethyl, cyclohexyl, cyclopentyl, vinyl, t-butyl, t-amyl, dimethyl trif1uormethyl-methyl eller dimethyl biphenylmethyl, DK 154437 B o II b) RgC-, hvori R2 betegner lavere al kyl med 2-4 carbonatomer eller lavere al kyl med 1-4 carbonatomer substitueret med fra 1-5 5 halogengrupper, V II c) R»0-P-, hvori V betegner S eller 0, og R- og R, hver be- i 10 0R4 tegner benzyl eller lavere al kyl, d) ^ r hvori R- og Rfi hver for sig betegner lavere ✓ I 5 OD / ^.c- alkyl eller tilsammen betyder -CH0-C-CH0-, ;< A 15. f-ο Ry Rg ' Rg hvori R7 og Rg hver for sig betegner hydrogen eller lavere al kyl, RQ ^ NO-, YY e) hvori Rg betegner hydrogen eller nitro, og 20 f) o u hvori Rin betegner hydrogen, methyl, halogen K1Q_ c Ι^γ v. eller mtro, II o 25 under den forudsætning, at T er monodentat, når X er SAR, U er benzyl eller benzyl, hvori phenyl gruppen er substitueret med fra 1-3 substituenter hver udvalgt blandt halogen, nitro, Cjglavere al kyl og Cj_glavere alkoxy, og Τ' er en gruppe udvalgt fra gruppen 0
2. 30 II bestående af Rj-OC-, hvori Rj er som defineret ovenfor, nitro, hydrochlorid, p-methoxybenzylsulfonyl og tosyl. 35