DK152665B - Fremgangsmaade til fremstilling af en poroes collagenhudforbinding - Google Patents

Description

DK 152665B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af porøs collagenhudforbinding, ved hvilken collagen opløseliggøres ved behandling med et proteolytisk enzym, hvorefter den dannede gel ekstruderes til et koagulationsbad.

2

DK 152665B

En række forskere har foreslået anvendelsen af collagenmateriale som hud-, forbrændings- eller sårforbinding.

Fra DE-offentliggørelsesskrift nr. 2.348.685 er det f.eks. kendt at fremstille en collagenhudforbinding ved, at collagen opløseliggøres 5 ved behandling med et proteolytisk enzym, hvorefter den dannede gel ekstruderes til et koagulationsbad.

Det karakteristiske ved den foreliggende opfindelse består imidlertid i den særlige fremgangsmåde til fremstilling af sådanne ønskede typer af porøs collagenhudforbinding, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig •j_q ved det i kravets kendetegnende del angivne.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse omhandler således fem essentielle trin, nemlig dannelse af collagengel, ekstrudering af collagengel, dannelse af plade af collagen af den ekstruderede gel, tværbinding af den ekstruderede gel samt frysetørring af den tværbund-ne plade. Den tværbundne plade lufttørres fordelagtigt delvis, før pladen udsættes for frysetørring. Derved dannes en hudforbinding, hvor pladens overfladelag er mindre porøs end den underste flade. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen giver et produkt af langt højere 2g kvalitet, end det var muligt at fremstille ved hjælp af de kendte fremgangsmåder.

The National Fire Protection Association anførte i 1962, at ca. 1.800.00C personer led af forbrændinger årligt og optog over 11.000 hospitals-25 senge pr. dag. Der er et' stort behov for en lettilgængelig midlertidig erstatning for menneskehud, som let kan opbevares til effektiv behandling af varmeforbrændinger og andre former for hudtab. Det er almindelig praksis at dække arealer, hvor der mangler hud, med spalte-lagautotransplantationer, homotransplantationer og heterotransplanta-30 tioner. Sådanne behandlinger beskytter mod infektion, tab af protein, væske og elektrolytter fra det behandlede væv. Disse behandlinger har imidlertid følgende ulemper. Det er vanskeligt at opnå transplantationsmaterialer og at lagre dem i længere tidsrum, og omkostningerne i forbindelse hermed er også temmelig store. Disse vanskeligheder 35 kunne reduceres ved udviklingen af kunstige hudforbindinger, som er billige og lettilgængelige.

DK 152665 B

3

Collagen er et hovedprotein i hud, hornhinde etc. og kan gøres opløselig, separeres og renses ved behandlingen med pro-teolytiske enzymer (forskellig fra collagenase), f.eks. proctase, pepsin, trypsin og pronase. Collagen, der er gjort opløselig, er 5 fattig på telopeptider, relativt billig og ideel som materiale til dannelse af hudsårsforbinding.

Ved fremstillingen af collagengelen gøres collagenet opløselig i en enzym-opløsning ved sur pH-værdi. Den resulterende gel er et viskost stof, der udvindes ved filtrering, f.eks. gennem osteklæde og/eller et mil-10 liporefilter. Den viskose opløsning gøres alkalisk ved tilsætning af base til en pH-værdi på ca. 10. På dette stadium får stoffet lov til at henstå til inaktivering af eventuelt resterende enzym. Stoffet neutraliseres derpå, collagenet centrifugeres fra og vaskes med vand. Der følger et andet rensningstrin, nemlig genopløsning i vandig syre (pH-15 værdi 2,0-5,0), genudfældning ved neutralisation til en pH-værdi på 6' til 7 og rensning til fjernelse af syre ved dialyse overfor vand.

Den neutrale gel udvindes, og på dette stadium kan der tilsættes antibiotika eller baktericider eller begge dele før lagring af gelmaterialet.

20

Collagenhudforbindingen (porøs plade) blev fremstillet på følgende måde: Collagengel, der er gjort opløselig (pH-værdi 2,0-3,5, collagenkoncentration 1-10%),blev ekstruderet fra en ringdyse til et koagulationsbad (mættet NaCl). Koaguleret ringformet collagen blev opskåret på langs til opnåelse af en plade og garvet med 1-5% glutar-aldehyd i mættet NaCl indeholdende 0,05 M NajHPO^ i 0,5 - 3,0 timer. Garvet collagenplade blev vasket med vand gentagne gange, derpå frysetørret på methylmethacrylatplade. Til fremstillingen af en halvporøs filmtypeplade, hvori pladens øverste overflade er mere koncentreret med hensyn til collagen (hvilket resulterer i en øvre filmtypeoverflade ) , og hvori pladens nedre overflade er mindre koncentreret med hensyn til collagen,(dvs. mere porøs), underkastes pladen partiel lufttørring før frysetørring. Collagenpladen blev steriliseret ved hjælp af ethylenoxidgas og neddyppet i en typisk baseopløsning indeholdende 35 et eller flere baktericide midler, såsom sølvnitrat (0,5 g/100 ml) el- 4

DK 15266SB

ler sølvlactat (O',5 g/100 ml) eller lacteret Ringer's opløsning indeholdende 25 mg/ml gentamycin, 25 mg/ml lincomycin, 25 mg/ml colisti= methat, 25 mg/ml kanamycin og 5 mg/ml amfotericin B eller lacteret Ringer's opløsning indeholdende 25 mg/ml lincomycin, 5 mg/ml amfoteri= 5 cin B og 25 mg/ml gentamycin.

En effektiv hudforbinding bør have følgende egenskaber: 1. god vedhæftning til såroverflade, 10 2. modvirke tab af protein, væske og elektrolytter, 3. modvirke infektion, 4. lindre smerte, 5. ikke stimulere lokal vævreaktion, etc..

Collagenhudforbindinger, der er fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, opfylder de ovennævnte egenskaber og er lette at anvende og ikke dyre. Gelhudforbinding er specielt velegnet til anvendelse på uregelmæssige overflader, f.eks. ledoverflader. Porøse plade-og halvporøse filmtypeforbindinger klæber fast til såret. Der blev 20 observeret ekstensiv celleindvækst i den porøse collagenplade. Alle hudforbindinger viste effektiv beskyttelse mod infektion og god sårheling.

Den foreliggende opfindelse belyses nærmere ved hjælp af de følgende 25 eksempler.

Eksempel 1.

Fremstilling af collagengelen.

30

Frisk kalvehud (ca. 5 kg) blev afhåret, renset ved barbering og skåret til små stykker. Huden blev vasket gentagne gange med 10% NaCl indeholdende et 0,2% natriumacidbaktericid og med steriliseret vand. Huden 35 5

DK 152665B

blev gjort opløselig i 10 liter vand (pH-værdi 2,5 HC1) indeholdende 30 mg/ml gentamycin ved tilsætning af 1 g pepsin (omtrentliat forhold af enzym til collagen var 1/400) ved 20°C i 4 dage med intermitterende omrøring. Det resulterende viskose opløseliggjorte collagen blev fil-5 treret .gennem osteklæde, dets pH-værdi hævet til 10 ved hjælp af NaOH og fik lov til at henstå i 24 timer ved 20°C til inaktivering af pepsinet. Collagenets pH-værdi blev derpå indstillet på 7-8 (HC1), og collagenbundfaid blev centrifugeret fra og vasket med steriliseret vand. Det vaskede bundfald blev opløst igen i en sur opløsning og ud-10 fældet ved pH-værdi 7-8 til yderligere rensning.

Fremstilling af porøs hudforbinding.

Collagenet blev opløst i fortyndet HC1-opløsning (slut pH-værdi 2,5, 15 collagenkoncentrationen 3%) og afluftet under vakuum. Sur collagengel blev ekstruderet ind i et koaguleringsbad (mættet NaCl) gennem en passende dyse. Koagulerede rør blev udtaget og opskåret på langs til fremstilling af plader og garvet med 3% glutaraldehyd i mættet NaCl indeholdende 0,05 M Na„HPO. i 1 time. Efter vaskning med vand gentagne gan-20 z 4 ge blev collagenpladen frysetørret på en methylmethacrylatplade. De frysetørrede plader (10 cm x 10 cm) blev steriliseret ved behandling med ethylenoxidgas og konserveret ved neddypning i 0,5% sølvnitratopløsning. Pladens tykkelse til sidst var 3 mm. Denne hudforbinding var fremragende med hensyn til adhæsion til såret, med hensyn til beskyttelse mod 25 væsketab og mod infektion og med hensyn til sårheling.

Eksempel 2 1 2 3 4 5 6

Collagenplade blev fremstillet ved ekstrusion, garvning og vaskning 2 ved hjælp af den i eksempel 1 beskrevne metode, bortset fra, at der 3 blev anvendt 5% sur collagengel. Vasket collagenplade blev derpå 4 partielt lufttørret på en methylmethacrylatplade, indtil pladens tyk 5 kelse var halvdelen af den oprindelige tykkelse. Denne partielle 6 tørring reducerer den øverste pladeoverflades porøsitet (højere col= lagenkoncentration). Der blev derpå frysetørret for at gøre den nedre overflade porøs (lavere collagenkoncentration) og steriliseret med ethylenoxidgas. Den steriliserede plade blev konserveret i steril 0,5% sølvlactatopløsning (pH 7,4). Pladens tykkelse til sidst var 2 mm.

Claims (1)

1. 5 Eksempel 3. Steril, frysetørret collagenplade blev fremstillet ved hjælp af den i eksempel 1 beskrevne metode, bortset fra, at collagenkoncentrationen var 5%. Pladen blev konserveret ved neddypning i sterilt lacteret IQ Ringer's opløsning (pH-værdi indstillet på 7,4) indeholdende følgende antibiotika: 25 mg/ml gentamycin, 25 mg/ml lincomycin, 25 mg/ml coli= stimethat, 25 mg/ml kanamycin og 5 mg/ml amfotericin B. Pladens tykkelse til sidst var 4 mm. Denne plade havde ligeledes fremragende hudforbindingsegenskaber. Patentkrav . L5 _____________________ Fremgangsmåde til fremstilling af porøs collagenhudforbinding, ved hvilken collagen opløseliggøres ved behandling med et proteolytisk 10 enzym, hvorefter den dannede gel ekstruderes til et koagulationsbad, kendetegnet ved, at den ekstruderede gel formes til en plade af collagen, som derefter tværbindes, især ved garvning med glutar-aldehyd, hvorefter den tværbundne plade, der eventuelt lufttørres delvis, udsættes for frysetørring. >5