DK150209C

DK150209C - Fremgangsmåde til fremstilling af fedtstoffer ved omordning af fedtsyreadikaler i glycerider

Info

Publication number: DK150209C
Application number: DK056377AA
Authority: DK
Inventors: Herder Coleman Michael; Robin Macrae Alasdair
Original assignee: Unilever Nv
Priority date: 1976-02-11
Filing date: 1977-02-10
Publication date: 1991-12-23
Also published as: SE8903098D0; LU76736A1; SE432865B; BE851265A; IT1082528B; AU518240B2; DE2705608C2; SE7701524L; SE8903098L; CH630404A5; DK150209B; JPS6243678B2; NL184227B; FR2340979B1; DK56377A; SG8983G; AU2208477A; ES455814A1; DE2705608A1; ZA77786B

Description

DK 150209 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af fedtstoffer ved omordning af fedtsyreradikaler i glycerider ved interesterificering af fedtstoffer i nærværelse af en interesterificeringskatalysator.

Omordning af fedtsyreradikaler mellem triglyceridmolekyler ved interesterificering finder udstrakt anvendelse til opfyldelse af de krav, især med hensyn til smeltepunkter, der stilles til fedtstoffer, herunder glyceridolier.

Den foreliggende opfindelse er baseret på anvendelse af en lipase som katalysator ved interesterificeringsreaktioner, og i overensstemmelse hermed angår opfindelsen en fremgangsmåde af den ovenfor 2

DK 150209 B

angivne art, der er ejendommelig ved, at der som interesterificerings-katalysator anvendes et lipase-enzym, idet der anvendes en lille mængde vand op til 1% til aktivering af enzymet.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres ved moderate temperaturer, ved hvilken enzymet er aktivt, og under milde betingelser, hvorved der undgås nødvendigheden af stærkt sure eller basiske eller andre ekstreme betingelser. Foretrukne temperaturer ligger mellem 20 og 60°C og især på op til 50°C, alt efter det valgte enzyms evne til at tåle forhøjede temperaturer. Reaktionen sker i den flydende fase, og kan lettes ved, at reaktanterne opløses i et organisk opløsningsmiddel, fortrinsvis en lavtkogende alkan, f.eks. petroleumsether (kp. 60-80°C), hvilket opløsningsmiddel ikke må påvirke enzymet.

I modsætning til de sædvanlige interesterificeringsprocesser, hvor selv 0,1% vand er uønsket, idet det kræver yderligere mængder af katalysatoren, er en lille mængde op til 1%, men fortrinsvis 0,2-1%, vand eller pufferopløsning nødvendig ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen for at få enzymet til at fungere, og omstændelige foranstaltninger til tørring af det fedtstof eller andre materialer, der anvendes i fremgangsmåden, er derfor ikke påkrævede, da ethvert eventuelt fugtighedsindhold deri kan udgøre et bidrag til det vand, der kræves i reaktionen. Mere end 1% vand eller puffer er ikke ønskeligt ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, da den omvendte hydrolysereaktion derved fremmes under dannelse af partielle glycerider.

Det vand, der kræves til reaktionen, kan inkorporeres i reaktionsmediet adsorberet på et bæremiddel såsom kiselgur, der kan anvendes også til at bidrage til dispergering af enzymet og, som forklaret senere, fortrinsvis kombineres med enzymet. De anførte mængder er baseret på vægten af fedtreaktanterne. Formålet med pufferen er at holde reaktanterne på en pH-værdi, ved hvilken lipasen er reaktionsdygtig .

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes til opnåelse af de samme resultater som ved sædvanlige interesterificeringspro-cesser.

Fri fedtsyre kan sættes til glyceridblandinger for at bidrage til dannelsen af glycerider ved omordningen sammen med andre fedtsyrer, der frigøres fra triglyceriderne selv under reaktionen. Fortrinsvis anvendes der et molforhold på fra 0,3:1 til 7:1 mellem syrer og glycerider, alt efter den ønskede reaktionsgrad.

En yderligere fordel, som fremgangsmåden ifølge opfindelsen 3

DK 150209 B

-enzymer. Selv om nogle vil omordne fedtsyreradikalerne i en hvilken som helst stilling af triglyceridmolekylet, reagerer andre kun til ombytning af de radikaler, der findes i bestemte stillinger, medens andre igen kun er reaktionsdygtige over for specielle fedtsyrearter. Således er f.eks. Candida cylindracae-lipase ikke-specifik og giver en virkelig randomisering af alle fedtsyreradikaler i alle glycerid--stillingerne, medens Rhizopus-enzymer er specifikke over for de terminale 1,3-syreradikaler og kun giver meget lidt ombytning i syreradikaler i 2-stillingen. Geotrichum candidum-lipase er på den anden side specifik over for syrer med en dobbeltbinding i 9-stillin-gen, f.eks. oliesyre og linolsyre, uanset deres stilling i glycerid-radikalet.

Da fremgangsmåden ifølge opfindelsen sædvanligvis tager 20-72 timer til fuldendelse, alt efter betingelserne; og mindre med fikserede katalysatorlag, er det endvidere muligt at standse reaktionen på et hvilket som helst trin, før den er fuldstændig, hvilket giver en yderligere reguleringsmulighed ved modificeringen af fedtstoffer, som ikke har eksisteret hidtil ved de mere hurtige interesterifice ringsreaktioner.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen frembyder derfor en vidtstrakt fleksibilitet gennem muligheden for at kombinere de forskellige variable, hvorved der opnås mange forskellige produkter med de anførte fordele.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan således anvendes til forbedring ("upgrading") af fedtstoffer til mange forskellige formål. Stærkere umættede syrer kan f.eks. erstattes i glyceriderne med mindre umættede eller mættede syrer eller omvendt efter ønske. Desuden kan ombytningen bevirkes i specielle stillinger i glyceridresten og/eller med specielle syrer ved anvendelse af enzymer med specifik reaktionsdygtighed. Endelig kan der anvendes kombinationer af disse forskellige aspekter af opfindelsen til opnåelse af specielle produkter med en kendelig formindskelse af dannelsen af mindre ønskede glyceridfraktio-ner, hvorved der opnås en simplificering af adskillelsen af de ønskede glycerid-arter fra produktblandingen og en forøgelse af udbyttet af dem.

Et vigtigt anvendelsesområde for forbedringen af fedtstoffer og glyceridolier ved selektiv udbytning af fedtsyrerester i deres glyceridmolekyler ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er til tilvejebringelse af erstatningsfedtstoffer for kakaosmør ud fra 4

DK 150209 B

billigere vegetabilske olier og fedtstoffer. Kakaosmør indeholder væsentlige mængder af 2—oleylglycerider af palmitin- og stearinsyre, og disse giver dette fedtstof de smelteegenskaber, som man sætter så stor pris på, idet de giver en skarp smeltning ved temperaturer omkring legemstemperatur fra et hårdt fast stof, som ikke smelter ved håndtering, til en mobil væske, der flyder let og hurtigt. Nogle få alternative kilder for vegetabilske smørsorter, især sheafedt og illipe er af lignende konstitution, men er i sig selvkostbare og af variabel kvalitet, da de stort set ikke er under kultur. Palmeolie er meget billigere og indeholder betydeligemængder af dipalmityl-2-umættede glycerider, og disse udvindes ved fraktionering. Hovedparten af glyceriderne af de fleste vegetabilske olier er imidlertid umættede i i det mindste én af α-stillingerne foruden i 3- eller 2-stillingen. Forsøg på at forbedre disse glyceridolier kræver derfor en specifik erstatning af de ydre, umættede 1,3-fedtsyreradikaler med mættede syrer til hærdning af produktet, især stearinsyre, og om nødvendigt også erstatning af alle stærkt umættede syreradikaler i den indre 2-stilling med oleylradikalet. Både hydrogenering og sædvanlige interesterifice-ringsprocesser, der kan anvendes til dette formål i hærdningsprocesser, er imidlertid ikke-selektive, idet de påvirker alle glyceridstillingerne. Desuden er hydrogeneringsprocesser uundgåeligt ledsaget af en isomerisering af alle umættede syreradikaler, der bliver tilbage i produktet, fra den naturlige cis-form til trans-formen, f.eks. olie--syre til dens isomere elaidinsyre. Denne isomerisering giver et glycerid, der indeholder et trans-syreradikal, et andet smeltepunkt, og den dannede mængde varierer efter katalysatoren og reaktionsbetingelserne, hvilket i høj grad forøger reaktionens komplekse karakter og usikkerheden angående produktets egenskaber. Gennem anvendelsen af selektiv lipase giver fremgangsmåden ifølge opfindelsen selektivt interesterificerede fedtstoffer og en hærdningsproces, der er fri for de ovenfor nævnte mangler, og gør det derved muligt at erstatte umættede syrer eller kortkædede mættede syrer i 1- og 3-stillingerne med mættede syrer, som giver produktet forbedrede smelteegenskaber. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen opnås der derfor som reaktionsprodukter elaidiniseringsfrie hærdede blandinger af glycerider af fedtsyrer, fortrinsvis £±2~(~22~ °9 ^sær og C^g-mættede fedtsyrer. De 5

DK 150209 B

således opnåede hærdede fedtstoffer udgør gode kakaosmørerstatninger og har fortrinsvis et iodtal på 25-40, hvilket viser en sammensætning svarende til gennemsnitligt en enkelt monoethylenisk umættet syrerest i hvert glyceridmolekyle. Denne syrerest findes i 2-stillingen, og de foretrukne hærdede, men stadig umættede fedtstoffer, der fås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er derfor i hovedsagen fri for mættede syrer i 2-stillingen.

Enzym-katalysatoren kan stamme fra animalske, vegetabilske eller mikrobielle kilder, men fortrinsvis fra de sidstnævnte. De i handelen værende enzym-præparater kan være velegnede, og de fås som pulverformede stoffer indeholdende protein- og sukkerstoffer samt salte foruden varierende mængder af det aktive enzym og indeholder fortrinsvis, hvad der svarer til 1-500 aktivitetsenheder/mg, baseret på den almindeligt accepterede standard, at 1 enhed frigør 1 mikromol fedtsyre fra et olivenoliesubstrat .på 1 minut under standardbetingelser Disse standardbetingelser består i, at olivenolien dispergeres til dannelse af en 5%'s emulsion i en 5%1 s vandig emulsion af gummi arabi-cum indeholdende 50 mM calciumchlorid, og at pH-værdien for reaktionen er 6,0 og temperaturen 37°C. Fortrinsvis anvendes der 0,02-7% af disse enzympræparater, beregnet på vægten af fedtreaktanterne.

Reagenserne omfattende fedtreaktanter, indbefattende glycerid, vand, indbefattende eventuelt puffer, og enzym omrøres fortrinsvis tilsammen under hele reaktionen for at holde enzymet dispergeret, og dette sker fortrinsvis i en lukket beholder for at forhindre indtrængen af fugtighed. Dispergeringen af vandet og enzymet kan lettes ved, at der i reagenserne inkorporeres et adsorptionsdygtigt, indifferent pulver, f.eks. et filtreringshjælpestof såsom kiselgur, der adsorberer vandet og hæfter til enzymet, fortrinsvis i en mængde på 1-10% af fedtreaktanterne, dvs. fedt eller olie og deres fedtsyrer.

I mange tilfælde kan der dannes en lille mængde fri fedtsyre og partielle glycerider ved hydrolyse, og disse kan da fjernes sammen med ethvert overskud af fri fedtsyre på sædvanlig måde indbefattende væske/væske-ekstraktion, neutralisation med alkali eller vakuum- eller molekular-destillation. Kiselsyre-chromatografi kan dog også anvendes, og partielle glycerider kan desuden fjernes ved krystallisation eller absorbtion, f.eks. på silica.

6

DK 150209 B

Det rensede glyceridprodukt kan underkastes opløsningsmiddelfraktionering eller andre konventionelle metoder til udvinding af foretrukne komponenter efter ønske. Økonomien ved hele fremgangsmåden kan også forbedres ved genvinding og genanvendelse af enzymet eller ved anvendelse af enzymet i fikserede lag, især hvis det findes på et bæremiddel til genanvendelse. Enzymer båret på mange forskellige indifferente materialer, sædvanligvis i findelt form, til genvinding og genanvendelse er velkendte produkter. Sådanne materialer omfatter kul, cellulose, glas, Celite ® (et kiselgurprodukt) og adsorptionsmidler baseret på aluminiumoxid og silica, samt hydroxylapa-tit, især i perleform, og syntetiske harpikser, og disse kan anvendes som beskrevet ovenfor til fremme af dispergeringen af vand og enzym. Enzymerne kan også stabiliseres til genanvendelse i en uopløselig form, hvilken teknik er velkendt inden for enzymteknologien, f.eks. ved aminosyrefremstillingen og ved fremstillingen af fructose--sirup ud fra glucose.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes til omordning af de i fedtstoffer almindeligt forekommende fedtsyrer, f.eks. syrer af forholdsvis kort kædelængde fra Cg til C14, eller af mere langkædede syrer, f.eks. C^-C^g eller endnu længere, f.eks. C20 eller C22' ^an være ura®ttede med én eller flere ethyleniske bindinger, enten cis- eller trans-isomeriserede, eller de kan være mættede.

De fedtreagenser, der anvendes til fremgangsmåden ifølge opfindelsen, omfatter de ovenfor nævnte syrer, såvel i fri form som bundet i glycerider, og fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes til glycerider i animalske, marine og vegetabilske fedtstoffer og olier, som i hovedsagen omfatter glycerider af C^g- og C^g-fedtsyrer, men også omfatter glycerider af syrer med kortere og længere kæder, f.eks. laurinfedtstoffer og crucifera-olier. Specielle eksempler på vegetabilske olier er palmeolie, bomuldsfrøolie, olivenolie, sojabønneolie og solsikkeolie, samt deres derivater-. Der kan også anvendes vegetabilske smørsorter indbefattende især shea og illipe.

7

DK 150209 B

Eksemgel_l I en lukket beholder omrørtes ved 40°C 25 g kokosnødolie og 25 g olivenolie i 66 timer sammen med "Celite" ® i en mængde på 5% af deres vægt og Candida cylindracae-lipase i en mængde på ca. 2,5% af deres vægt (1200 mg svarende til 45.000 enheder), samt 0,7% af en 20 mM pufferopløsning af N-trishydroxymethyl-methyl-2-aminoethansul-fonsyre ved en pH-værdi på 6,5. Den derved opnåede reaktionsblanding centrifugeredes, og olielaget dekanteredes fra, hvilket efterlod en kage, der vaskedes med 80 rumfangs% af den oprindelige olieblanding af en petroleumsether med kogeområde 40-60°C, hvorpå vaskevæsken sattes til olielaget.

Efter fjernelse af opløsningsmidlet ved afdampning opnåedes der et reaktionsprodukt i et udbytte på 96% af den oprindelige olieblanding.

En del af dette reaktionsprodukt analyseredes ved påføring på en kiselsyre-tyndtlagsplade, som opløsningsmiddel-fremkaldtes med en opløsningsmiddelblanding bestående af 60 dele petroleumsether (40-60°C), 40 dele diethylether og 1 del myresyre. Fra denne plade opnåedes der 72% af en triglyceridfraktion sammen med 16,5% diglyce-rid, 0,5% monoglycerid og 10,3.% fri fedtsyre.

Sammensætningen af triglyceridfraktionen bestemtes ved gas/væ-ske-chr oma tograf i og er i tabel I sammenstillet med sammensætningen af den oprindelige kokosnødolie/olivenolie-blanding og den samme blanding interesterificeret i nærværelse af en sædvanlig alkalimetal-katalysa-tor.

8

DK 150209 B

Tabel I

Triglycerid antal C (ekscl. gly· cerolrest) _Vægt% triglycerid_ i opr. olie i interesterificeret olie med enzym med alkali metal katalysator 26 28 0,1 0,3 0,1 0,2 0,3 0,5 30 1,1) 0,5) 0,7) ) ) ) 32 5,0) 1/4) 2,1) ) ) ) 34 6,7) 28,8 2,1) 14,9 2,1) 15,4 ) ) ) 36 8,4) 4,2) 4,0) ) ) ) 38 7,6) 6,7) 6,5) 40 4,5) 7,2) 6,6) ) ) ) 42 3,4) 13,1) 12,6) ) ) ) 44 1/9) 12,0 11/6) 60,9 11/4) 60,9 ) ) ) 46 1,2) 11/6) 11/7) ) ) ) 48 1/0) 17,4) 18,0) 50 4,7) 6,8) 7,4) ) ) ) 52 21,2) 7,4) 7,2) ) 58,7 ) 23,9 ) 23,5 54 31,8) 9,3) 8,4) ) ) ) 56 1/0) 0,4) 0,5) i alt 99,9 100 100

En væsentlig ændring af sammensætningen sker således mellem carbonatomantallene 40 og 48, fra de højere og lavere carbonatomantal, som et resultat af interesterificeringen, og dette gælder for både den enzym-katalyserede og den alkalimetal-katalyserede proces. De specielle olier, der er anvendt i dette eksempel, viser særlig godt virkningen af interesterificeringen, da på den ene side fedtsyreresterne i kokosnødolie stammer overvejende fra laurinsyre og lavere fedtsyrer, medens på den anden side fedtsyreresterne i olivenolie 9

DK 150209 B

Eksemgel_2 I en lukket beholder sammenrørtes 2,5 vægtdele mellemfraktion af palmeolie, 1,5 vægtdele stearinsyre, 0,25 vægtdele Celite®og 0,004 vægtdele Rhizopus delemar-lipase (200 enheder/mg) med 8 vægtdele petroleumsether med kogeområdet 60-80°C og 0,02 vægtdele af den i eksempel 1 angivne puffer ved 40°C. Det anvendte enzym stammede fra Seikagaku Kogyo.

Efter 48 timers forløb fortyndedes den opnåede blanding med 10 dele petroleumsether (40-60°C) og centrifugeredes, hvorpå opløsningsmidlet fjernedes ved afdampning, remanensen analyseredes som ovenfor ved tyndtlagschromatografi, og der udvandtes en triglyceridfraktion, hvis fedtsyresammensætning bestemtes ved gas/væske-chromato-grafi og i tabel II er sammenstillet med sammensætningen af den palme-olie-mellemfraktion, der anvendtes som udgangsmateriale. Triglyceri-det blev også underkastet en behandling med pankreatisk lipase, hvilket viste, at 98% af de inkorporerede stearat-rester fandtes i 1- og 3-stillingen i triglyceridmolekylerne.

Enkeltheder angående fedtsyrefordelingen i den oprindelige palmeoliemellemfraktion og triglyceridproduktet fremgår af tabel II sammen med lignende detaljer, til sammenligning, for de følgende eksempler, som var gentagelser af eksempel 2, men med anvendelse af et understøttet enzym, A. niger i eksempel 3, R. arrhizus i eksempel 4 og R. japonicus i eksempel 5.

De understøttede enzymer fremstilledes på følgende måde: I 20 vægtdele destilleret vand opløstes 2 vægtdele (7200 enheder /gi af lipasen, og 5 vægtdele Celite ® tilsattes under omrøring ved 0°C. Derefter tilsattes i løbet af 5'minutter 30 dele acetone, og omrøringen fortsattes i endnu 30 minutter, hvorpå det fremkomne faste produkt filtreredes fra og tørredes ved 20°C under formindsket tryk.

Af dette Celite ^lipase-pulver anvendtes 0,25 vægtdele (1028 enheder/g) til reaktionen, som ellers udførtes som beskrevet ovenfor.

De anvendte lipase-materialer havde følgende oprindelse: A. niger : Amano Pharmaceutical Co., Japan; R. arrhizus : Soc. Rapidase, Frankrig; R. japonicus : Nagase & Co. Ltd., Japan.

10

DK 150209 B

Tabel II

Triglycerid Lipase -— 14:0 16:0 18:0 18:1 18:2 PMF Eks. 0,8 58,7 6,6 31,2 2,7 2 R. delemar 1/0 37,4 29,6 30,0 2,0 3 A. niger 0,3 (0,0 34,8 16,1 30,9 2/7 31.5 77.6 2,5 3,6) 4 R. arrhizus 0,3 37,4 30,5 29,8 2,0 5 R. japonicus 0,3 37,2 32,2 28,6 1/6

Disse resultater viser-den kendelige forøgelse af stearinsyreincl· holdet i triglyceridprodukterne opnået med hver lipase sammen med ingen væsentlig ændring af olie- eller linolsyreindhoIdet; En betydelig formindskelse af palmitinsyre-indholdet ses også.

De i parentes anførte data for eksempel 3 refererer til analyse af de syrer, der optager 2-stillingen, og derudfra bestemtes mængden af individuelle triglycerid-typer i det udvundne triglyceridprodukt under anvendelse af Wal & Coleman's hypotese (J. A. 0. C. S. 37 18 (1960) & 40 242 (1963) og Adv. Lipid Res. I, 1 (1963)). Resultaterne er anført i tabel II og sammenlignet med tilsvarende data for palme-olie-mellemfraktionen.

11

DK 150209 B

Tabel III

Triglycerid-arter PMF Interesterificeret triglycerid % POP 57 18,7 post 13 36,7 s tost 1 17,0 Andre glycerider 29 27,6

St = stearyl

Af tabel III fremgår det, at der sker en kendelig forøgelse af mængden af bundet stearinsyre i de 2-oleyl-symmetrisk dimættede-glyce-rider, der fås i produktet, idet hovedmængden er palmitostearyl-2--oleyl-glycerid.

Analyse af 2-stillingen i triglyceridprodukterne fra eksemplerne i tabel II viste, at 95-97% inkorporerede stearinsyreradikaler indtog 1,3-stillingerne samtidig med, at der praktisk taget ikke skete nogen fjernelse af oliesyreradikaler fra 2-stillingen.

Eksempel 3 blev gentaget ved 50 og 60°C, hvilket gav trigly-cerider, der indeholdt henholdsvis 32,9 og 27,6% bundet stearinsyre.

Eksempel_6

Eksempel 3 blev gentaget bortset fra, at enzympulveret blev genvundet og gen-inkuberet flere gange med friske udgangsmaterialer, som bestod 2,5 dele stearinsyre og 2,5 dele palmeolie med vand i stedet for puffer.

12

DK 150209 B

Tabel IV

Vagt% fedtsyre

Fedt syre i palmeolie i interesterificeret triglycerid 1 2 Inkubation 3 4 5 6 14:0 1,0 0,5 0,5 0,3 0,4 0,3 0,5 16:0 45,1 24,0 24,8 24,7 28,1 29,5 29,8 18:0 5,1 38,1 38,3 40,3 34,8 31,5 30,9 18:1 39,3 29,8 29,2 28,1 29,6 31,0 31,1 18:2 9,5 7,6 7,2 6,6 7,1 7,7 7,7 Inkubations- 2 2 3 2 2 3 tid (døgn) Vægtdele tilsat 0,020 1 0,020 0,015 0,015 0,010 0,015 vand

Som det fremgår af tabel IV, blev der tilsat mindre vand senere til undgåelse af en eventuel ophobning. Tidsrummet for hvert kredsløb varieredes kun for hensigtsmæssighedens skyld, idet omdannelsen blev praktisk taget opretholdt gennem eksemplet.

Eksempel_7 I 2 døgn omsattes 2,5 vægtdele palmeolie-mellemfraktion ved 40°C med 0,75 vægtdele stearinsyre og 0,75 vægtdele arachidinsyre opløst i 10 vægtdele petroleumsether (kogeområde 60-80°C) ved omrøring med 0,25 vægtdele Asp. niger-lipase/kiselgur-pulver, fremstillet som beskrevet i eksempel 2 og i forvejen fugtet ved omrystning i 30 minutter ved 0,02 vægtdele vand i et lukket reagensglas.

Fedtprodukterne bestod af 47% triglycerid, 11% diglycerid og 42% fri fedtsyre med mindre end 1% monoglycerid. Triglyceridet indeholdt som mættede syrer 0,3% C14, 31,3% C^g, 19,5% C^g og 15,2% C2Q, samt 30,0% oliesyre og 3,7% linolsyre. Analyse af syrerne i 2,-stil-lingen ved pankreatisk lipase-behandling viste, at 97% af de i tri-glyceridproduktet inkorporerede stearinsyre- og arachidinsyreester optog 1- og 3-stillingerne.

13

DK 150209 B

Eksemgel_8

Candida cylindracae-lipase fra Meito Sangyo Company Limited udfældedes med acetone på kiselgur på den i eksempel 2 beskrevne måde, og en opløsning af 2,5 vægtdele olivenolie og 1,5 vægtdele linolsyre 1 8 vægtdele petroleumsether (60-80°C) omsattes under omrøring i 2 døgn ved 40°C med en blanding af 0,137 vægtdele af den understøttede lipase og 0,113 vægtdele kiselgur, der i forvejen var fugtet med 0,02 vægtdele vand som beskrevet i eksempel 7. Efter udvindingen indeholdt det opnåede produkt 50% triglycerid, 11% diglycerid, 39% fri fedtsyre og mindre end 1% monoglycerid. Fedtsyresammensætningen i det interesterificerede triglycerid er i tabel V sammenlignet med den oprindelige olivenolie.

Tabel_V

Fedtsyre, vægt%

Interesterificeret Olivenolie triglycerid 16:0 11,5 7,9 16:1 0,2 0,1 18:0 1,8 2,7 18:1 77,2 55,1 18:2 9,3 .. 34,2 77% af de inkorporerede linoleat-rester i triglyceridproduktet fandtes ved analyse at optage 1- og 3-stillingerne, medens 95-98% kunne opnås med lipaser, der viste stillingsmæssig specificitet. Teoretisk skulle en fuldstændig ikke-specifik reaktion give en inkorporering på 67% i 1- og 3-stillingerne.

Eksempel_9

En blanding af lige store vægtmængder af shea-smør og palmeolie--mellemfraktion opløstes i en lige så stor vægtmængde petroleumsether (60-80°C) og omsattes i 2 døgn ved 40°C med 0,25 vægtdele af en A. niger-lipase udfældet på kiselgur som beskrevet i eksempel 2 og før anvendelsen fugtet med 0,02 vægtdele vand som beskrevet i eksempel 7. Efter udvinding viste triglycerid-fraktionen af produktet et væsentligt fald, fra 37,0 til 18%, i triglycerider med carbonantallet 14

DK 150209 B

50 og en tilsvarende forøgelse, fra 18,5 til 43,7%, i triglycerider med carbonantal 52. En lignende ændring, fra 39,1 til 33,3%, iagt-toges for triglycerider med carbonantal 54, medens der kun skete en ringe ændring i carbonantal under og over de angivne. Bestemmelse af fedtsyresammensætningerne viste, at der fra en samlet mængde på 91,1% af umættet syre i 2-stillingen i udgangsglyceridet kun iagtto-ges en nedgang til 87,3% i den tilsvarende stilling i det inter-esterificerede produkt, hvilket viste, at denne stilling næsten ikke har deltaget i interesterificeringen, og dermed enzymets stærke specifikke natur. Sammenligning med ændringen i carbonantal viser en væsentlig ændring i 2-oleyl-dimættede-triglycerider, fra en blanding af distearyl- og dipalmitylglycerider til det tilsvarende 2-oleyl--palmityl-stearylglycerid, og dette bekræftedes af sammensætningen af de forskellige triglycerid-arter, beregnet ved den ovenfor omtalte hypotese og sammenlignet med udgangsmaterialet. Ændringen i triglycerider fra udgangsmaterialet til triglycerid-produktet var følgende: POP 26-13%, POSt 9-22%, StOSt 17-9%, andre 48-56%.

Eksemgel_10 I 3 døgn omsattes 2,5 vægtdele olivenolie og 1 vægtdel erucosyre opløst i 2 vægtdele petroleumsether (60-80°C) ved 30°C med 0,25 vægtdele A. niger-lipase udfældet og fugtet med 0,02 vægtdele vand som beskrevet ovenfor. Pra reaktionsproduktet udvandtes og adskiltes 55% triglycerid, 11% diglycerid, 34% fri fedtsyre og spor af monoglycerid. Pankreatisk lipase-analyse af 2-stillingen viste, at 95% af de tilstedeværende erucat-rester fandtes i 1- og 3-stillin-gerne. Mængden af monoumættede C2Q- °9 C22-S^rer ste9 ^ra ® i olivenolien til henholdsvis 0,8 og 24,8 i triglyceridproduktet, idet de væsentligste øvrige ændringer var et fald fra 77,2 til 56,3 i mængden af tilstedeværende oliesyre og fra 11,5 til 7,8% i den tilstedeværende palmitinsyre.

Eksemgel^ll

Eksempel 8 blev gentaget, idet der som lipasen anvendtes Geotrichum Candidum. Denne var dyrket på et medium, der som hoved-bestanddele indeholdt gærekstrakt og olivenolie. Geotrichum Candidum- 15

DK 150209 B

-lipasepulver isoleredes fra den fremkomne dyrkningsvæske ved ultrafiltrering og frysetørring, hvorefter den udfældedes på kiselgur med acetone på den tidligere beskrevne måde.

I 3 døgn omsattes 2,5 vægtdele olivenolie og 0,75 vægtdele linolsyre opløst i 4 vægtdele petroleumsether (60-80°C) ved 40°C med 0,25 vægtdele af den understøttede G. Candidum-lipase, der i forvejen var fugtet som beskrevet i de tidligere eksempler.

Til yderligere forsøg gentoges dette eksempel under anvendelse af enten den samme mængde stearinsyre eller den samme mængde af begge syrer tilsammen. Der skete en væsentlig linolsyre-inkorporering både i nærværelse og fraværelse af stearinsyre, som selv forblev ubundet.

Eksempel_12 I 2 døgn omsattes 5 vægtdele shea-fedt og 5 vægtdele stearinsyre opløst i 24 vægtdele petroleumsether (60-80°C) ved 40°C med 0,5 vægtdele af et A. niger-lipase/kiselgur-pulver fremstillet ved udfældning som tidligere beskrevet og 0,04 vægtdele vand. Reaktionsproduktet indeholdt 34% triglycerid, 9% diglycerid, 54% fri syre og spor af monoglycerid og uidentificeret materiale, sandsynligvis gummi, terpen-estere etc., der udgjorde 3%.

Analyse af det ved molekular-destillation udvundne triglyce-rid-produkt viste en forøgelse af stearinsyrerester på ca. 15%, hvoraf praktisk taget alt (97%) viste sig i 1- og 3-stillingerne. Desuden skete der en formindskelse af palmitin- (ca. 2%), olie- (10%) og linol- (2%) •»syreester.

Eksempel.13

En opløsning af 600 g palmeolie og 600 g i handelen værende stearinsyre indeholdende 95,8% C 18:0 i 2880 g teknisk hexan omrørtes i en lukket beholder til udelukkelse af luft i 48 timer ved 40°C med 100 g kiselgur-pulver, hvorpå der i forvejen var udfældet 60 g A. niger-lipase som tidligere beskrevet, og som i forvejen var fugtet med 4,8 ml vand.

Pulveret fjernedes fra reaktionsmassen ved filtrering, og hexanen af dampedes, hvilket gav 1175 g af en rå blanding af inter-esterificeret fedt.

16

DK 150209 B

Fra en del heraf, der underkastedes molekular-destillation ved 185°C og 4 x 10 2 atm, udvandtes 595,5 g af et destillat, der indeholdt fri fedtsyre og spor af glycerider, medens remanensen indeholdt 324,8 g triglycerid i hovedsagen fri for fedtsyre og 90,6 g diglycerider. Fedtsyreanalysen på triglycerid-fraktionen af remanensen er i tabel VI sammenstillet med analysen for palmeolie og den derpå opnåede mellemfraktion, i hvilken tabel der også er anført triglycerid-analysen.

Af glyceridblandingen fraktioneredes 352 g to gange ved krystallisation fra acetone. Ved den første fraktionering opløstes blandingen i 1216 g acetone, som derefter afkøledes til 0°C og holdtes på denne temperatur i 1 time, hvilket gav en krystalliseret masse, der efter filtrering og vaskning med 2 x 875 ml acetone ved 0°C vejede 201,7 g. Dette produkt omkrystalliseredes fra 1000,8 g acetone ved 18°C, og filtratet forenedes med to vaskevæsker, hver på 88,2 g acetone af 18°C, og inddampedes til fjernelse af acetonen, hvorved der opnåedes 113,5 g af en mellemfraktion bestående af 91% triglycerid og 9% diglycerid. Diglyceridet fjernedes ved molekular-destillation, og triglycerid-komponenten i mellemfraktionen udvandtes i et udbytte på 80% ved molekular-destillation og gav den i tabel VI anførte fedtsyreanalyse.

De i tabel VI anførte resultater viser, at der i reaktionsblandingen sker en berigelse af 1- og 3-stillingerne med stearinsyre, og at opløsningsmiddelfraktionering giver en mellemfraktion, som, sammenlignet med palmeolie-mellemfraktionen selv, er beriget med hensyn til stearinsyre og derved også med hensyn til de værdifulde POSt- og StOSt-glycerider.

17

DK 150209 B

Tabel VI

Sammensætning, vægt% Fedtsyre Reaktionsprodukt Palme- Iriglycerid- rest Mellemfraktion olie 16:0 23,2 20,5 44 18:0 38,2 44,5 5 18:1 30,6 30,3 40 18:2 8,0 4,7 10 Triglycerider S - mættet U - umættet L - linolsyre 0 - oliesyre SSS 13,4 SSO 4,5 SLS 12,5 SUU 22,5 Andre 3,7 Fedtsyretrigly-c er id er P - palmitinsyre St - stearinsyre s tost 17,5 POST .20,1 POP 5,8 18

DK 150209 B

Eksemgel_14

Eksempel 13 blev gentaget under anvendelse af en palmeoliemel lemfraktion i stedet for palmeolie, og hexan-opløsningen holdtes efter filtrering på 5°C i 1 time, hvorved der udfældedes en blanding af fri fedtsyre og en glycerid-topfraktion. Efter vaskning og forening af vaskevæskerne med filtratet blev der ved afdampning af opløsningsmidlet efterladt en fedtremanens bestående af glycerider og fri fedtsyre; hvoraf 125 g underkastedes molekular-destillation til fjernelse af fri fedtsyre. Der opnåedes 75,5 g remanens indeholdende 80% triglycerid og 20% diglycerid, og den krystalliseredes ved 4°C fra 755 g acetone, hvilket gav 35 g af en triglycerid-mellemfraktion indeholdende 3,4% diglycerid. Sammenligning af fedtsyreanalyserne for denne mellemfraktion og udgangsmaterialet viste et væsentligt fald i palmitinsyre fra 54 til 23,8% og en tilsvarende forøgelse fra 6,9 til 44% i stearinsyreindholdet. Desuden skete der små ændringer i oliesyre- og linolsyre-indholdet. Produktet viste sig at indeholde 79,8% SOS, 2,9% SSO, 5% SSS og 12,3% andre glycerider. En fysisk bedømmelse udførtes ved bestemmelser af dets stabiliserede dilatationer, målt som beskrevet i britisk patentskrift nr. 827.172, og de gav følgende resultater: 1810, D35 1575, Dg0 985, D^ 5 630, D35 325 og D4q 130.

Eksempel 15

Renset svinepankreas-lipase udfældedes på kiselgur på den i eksempel 3 beskrevne måde. Det opnåede pulver udviste en aktivitet på ca. 600 enheder/g, og 0,35 vægtdele af det dispergeredes sammen med 0,03 vægtdele vand i fedtreaktanter omfattende 2,5 vægtdele af en mellemfraktion af palmeolie og 0,5 vægtdele myristinsyre, opløst i 4 vægtdele petroleumsether (60-80°C) og omrørtes ved 30°C. Reaktionsproduktet indeholdt 50% triglycerid, 19% diglycerid, 31% fri fedtsyre og spor af monoglycerid. Triglycerid-fraktionen udvandtes, og dens fedtsyresammensætning bestemtes. Sammenlignet med den som udgangsmateriale anvendte palmeolie-mellemfraktion forøgedes myristinsyre-indholdet fra 0,7 til 10,1%, medens der iagttoges en formindskelse af palmitinsyre fra 54,2 til 44,9. Der skete ingen væsentlig 19

DK 150209 B

ceridet viste, at 98% af de inkorporerede myristat-rester fandtes i 1- og 3-stillingerne.

Eksempel 16

En dispersion af 0,25 vægtdele C. cylindracae-lipase, understøttet på kiselgur-pulver og i forvejen fugtet med 0,02-5 vægtdele vand som beskrevet i eksempel 7, i 2,5 vægtdele olivenolie og 0,5 vægtdele octansyre omrørtes i 2 døgn ved 40°C. Reaktionsproduktet indeholdt 51% triglycerid, 15% diglycerid, 34% fri fedtsyre og spor af monoglycerid. Triglycerid-fraktionen udvandtes, og dens fedtsyresammensætning bestemtes. Denne viste en forøgelse til 7,9% af Cg-mættet syre, medens der kun konstateredes mindre ændringer blandt højere mættede og umættede syrer, bortset fra 18:l-syren, der viste en formindskelse fra 72,8 til 69%.

Claims

1. Fremgangsmåde til fremstilling af fedtstoffer ved omordning af fedtsyreradikaler i glycerider ved interesterificering af fedtstoffer i nærværelse af en interesterificeringskatalysator, kendetegnet ved, at der som interesterificeringskatalysator anvendes et lipase-enzym, idet der anvendes en lille mængde vand op til 1% til aktivering af enzymet.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der er en 0,2-1% vand til stede, beregnet på vægten af fedtreaktanterne .

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at enzymet er til stede i en mængde på 0,05-5%, beregnet på vægten af fedtreaktanterne.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at der anvendes et enzym, der er specifikt med hensyn til reaktivitet.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at det anvendte enzym er valgt blandt Rhizopus-, Geotrichum- og Aspergillus-lipase.

6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at det anvendte enzym er Candida cylindracae, Geotrichum Candidum-, Rhizopus delemar-, Rhizopus arrhizus-, Rhizopus japonicus- eller .Aspergillus niger-lipase.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 2 eller 3, kendetegnet ved, at enzymet er en pankreatisk lipase.

8. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at der et indifferent bæremiddel til stede til lettelse af fordelingen af enzymet og vand. DK 150209 B

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at enzymet er fordelt på bæreren før anvendelse i processen.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 8 eller 9, kendetegnet ved, at der er 1-10% bæremiddel til stede.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 8, .9. eller 10, kendetegnet ved, at bæreren består af diatoméjord, aktivkul, aluminiumoxid, glas, carboxymethylcellulose eller hydroxylapatit.

12. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at enzymet genvindes og genanvendes i processen.

13. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at enzymet dispergeres i en opløsning af fedtreaktanterne i et indifferent organisk opløsningsmiddel.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, kendetegnet ved, at opløsningsmidlet omfatter en alkan eller jordoliefraktion.

15. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at fedtreaktanterne omfatter en . fri fedtsyre.

16. Fremgangsmåde ifølge krav 15, kend etegnet ved, at molforholdet mellem triglycerid og fri fedtsyre ligger mellem 0,3:1 og 7:1.