DK149111B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af histidinderivater eller syreadditionssalte deraf - Google Patents

Description

U9111 i

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte histidinderi-vater med den almene formel

H

N

P

CH0

Λ I 2 /- (CH?) T

0 / 0\ * / ^ I

>C0-NH- CH-CON

O yJ

C0-NH2 hvor n er 1 eller 2, idet γ-karboxy-Y-butyrolaktongruppen og indgående aminosyregrupper kan være enten i L- eller D-konfiguration eller racemiske.

Det er formålet med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en fremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte histidinderivater med formel I. Disse histidinderi-vater er svagere end det kendte TRH (L-pyroglutamyl-L-histi-dyl-L-prolinamid) med hensyn til TSH (tyroidstimulerende hormon)-frigørende virkning, men er stærkere end det kendte TRH i det mindste med hensyn til en af virkningerne anæstesiantagonistisk virkning, spontan bevægelsesstimulerende virkning og dopamin-potentierende virkning.

I nærværende beskrivelse kan der angives aminosyrer, peptider, forbindelsesgrupper, beskyttelsesgrupper og opløsningsmidler ved forkortelser i overensstemmelse med IUPAC-IUB Commission on Biological Nomenclature eller med almindeligt anvendte trivialnavne.

I det følge gives en partiel liste på disse forkortelser og trivialnavne.

His: histidin Pro: prolin

Pip: pipekolinsyre (2-piperidinkarboxylsyre)

Glu: glutaminsyre 149111 2

Cbl: γ-karboxy-Y-butyrolakton

V A

COOH

Z: benzyloxykarbonyl BOC: t-butoxykarbonyl DCC: dicyklohexjlkarbodiimid N3: azid

Cr Bu: t-butylester

Tos: tosyl HONB: N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dikarboxiitiid Hobt: N-hydroxy-l,2,3-benzotriazol Hosu: N-hydroxysuccinimid DCHA: dicyklohexylamin DMF: dimetylformaiaid

De ovennævnte forkortelser kan stå for grupperne af de tilsvarende forbindelser med evne til at danne en peptidbinding.

De omhandlede forbindelser med formlen I kan ifølge opfindelsen fremstilles ved i og for sig kendte metoder til syntese af peptider. Således kan indføring af beskyttelsesgrupper, metoden til dannelse af peptidbindinger, fjernelsen af beskyttelsesgrupper osv. foregå på i og for sig konventionel måde. Forbindelserne med formlen I kan fremstilles enten i flydende fase eller i fast fase. Selve fremgangsmåderne til peptidsyntese som kan anvendes til fremstilling af forbindelserne med formlen I er fx beskrevet i The Peptides, bind 1 (1966), Schroder og Lubke,

Academic Press, New York, U.S.A.; Amino Acids, Peptides and Proteins, bind 1-5, redigeret af G.T. Young, udgivet af The Chemical Society, London? Peptide Synthesis af Nobuo Izumiya (Maruzen)? og DSA-patentskrift nr. 3870694. Blandt anvendelige fremgangsmåder kan således nævnes DCC/HONB-proces, azidproces, kloridproces, syreanhydridproces, blandet anhydrid-proces, DCC-proces, aktiveret ester-proces, processen med anvendelse af Woodward-reagens K, karbodiimidazol-proces, redox-proces og EEDQ (l-ætoxykarbonyl-2-ætoxy-l,2-dihydrokinolin)-proces.

149111 3

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del angivne. Reaktionsforløbet indbefattet fremstilling af udgangsmaterialet kan således foregå som vist i følgende skema:

P-N I

yj + nh3

COOH I

L-rJ

ψ kondensation (p) χ afblokering _χ

P-His-OH + h/j <-P'NyJ

conh2 conh2 i kondensation

(P) . χ ^ /—X

P-His-l/’ j blokering. ^ H*His-N^_| +(P)-CblTOH

com2 j yv ^kondensation (P) y /-x i r~x

Cbl-His-N i <---(P)-cbl- His-N i \—I afblokering 1—

CO-NH COM

2 * I de ovenfor viste formler er X = -(CH2)n-, hvor n er 1 eller 2, P er en beskyttelsesgruppe: (P) betyder at det ikke er nødvendigt at anvende en beskyttelsesgruppe; betegnelsen "kondensation" betyder ikke blot kondensation ved hjælp af et dehydra-tivt kondensationsmiddel, men også kondensation over et mellemprodukt såsom azidet, kloridet eller en aktiveret ester.

Før reaktionen til dannelsen af en peptidbinding ved fremstillingen af den pågældende forbindelse med formlen I, kan de funktionelle grupper, såsom aminogrupper, iminogrupper og karboxyl-grupper, der ikke skal eller ikke bør indblandes i rekationen, beskyttes med beskyttelsesgrupper på kendt måde. De aminogrupper, iminogrupper og karboxylgrupper der skal indgå i peptiddannelsesreaktionerne kan aktiveres ved kendte aktiveringsmetoder.

149111 4

Som beskyttelsesgrupper for ct-aminogruppen i et hvilket som helst udgangsmateriale, fx a-aminogruppen i histidin, som ikke tager del i omsætningen, kan der nævnes konventionelle beskyttelsesgrupper såsom Z, BOC, t-amyloxykarbonyl, isobornyloxykarbonyl, ftaloyl, trifluoracetyl eller formyl. Som beskyttelsesgruppe for histidindelens imidazolkerne kan man anvende kendte grupper såsom tosyl, benzyl, eller 2,4-dinitrofenyl, selv om en sådan beskyttelse ikke behøver at være essentiel.

Udgangsmaterialets karboxylgruppe, som ikke tager del i den påtænkte reaktion, kan beskyttes i forvejen med en kendt beskyttelsesgruppe. Således kan den fx beskyttes i form af en ester, fx metyl-, ætyl-, benzyl-, p-nitrobenzyl-, t-butyl eller t-amyl-ester, eller som et metalsalt, fx natrium- eller kaliumsalt.

En karboxylgruppe som skal deltage i den påtænkte omsætning kan i forvejen aktiveres til sådanne kendte former som aktiverede estere (pentaklorfenol-, 2,4,5-triklorfenol-, 2,4-dinitrofenol-, cyanometylalkohol-, p-nitrofenol-, N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dikarboximid-, N-hydroxysuccinimid-, N-hydroxyftalimid- og N-hydroxy-l,2,3-benzotriazolester) eller som karboxylsyreanhydrider eller azider, svarende til de som udgangsmateriale anvendte karb-oxylsyrer. Blandt de ovennævnte er aktiverede estere, N-hydroxy- 5-nprbornen-2,3-dikarboximid, N-hydroxy-1,2,3-benzotriazol, N-hydroxysuccinimid osv. i visse tilfælde mere fordelagtige til kondensationsreaktionen af histidindelen på grund af deres forholdsvis nedsatte tendens til fremkaldelse af racemisering.

Den foreliggende kondensationsreaktion kan gennemføres i et opløsningsmiddel som ikke forstyrrer den ønskede reaktion, fx DMF, kloroform, dioxan eller tetrahydrofuran.

Reaktionstemperaturen og reaktionstiden kan vælges hen-• sigtsmæssigt inden for de rammer der anvendes ved konventionel peptidsyntese, og de kan fortrinsvis være fra ca. -30 til ca.

60°C og fra ca. 2 til ca. 24 timer.

Hvor peptidet fremstillet ved denne kondensationsproces har en beskyttelsesgruppe kan beskyttelsesgruppen fjernes på konventionel måde. Som eksempler på en sådan afblokeringsprocedure kan nævnes katalytisk reduktion med en katalysator, fx palladium sort, palladium-på-kulstof eller platin, solvolyse ved hjælp af 5 149111 et surt reagens, fx hydrogenfluorid, hydrogenbromid, hydrogenklorid eller trifluoreddikesyre, og reduktion med natrium i flydende ammoniak.

Ved reaktionens afslutning kan produktforbindelsen med formel I adskilles fra reaktionsblandingen som den frie forbindelse eller i form af et syresalt, ved i og for sig kendte metoder, fx faseoverføring, ekstraktion, kromatografi, krystallisation og genudfældning.

Udgangsmaterialerne til fremstilling af forbindelserne med formel I kan også fremstilles ved kendte metoder eller ved dermed analoge metoder.

Forbindelserne med den almene formel I kan danne salte med farmakologisk acceptable uorganiske syrer, fx saltsyre, eller organiske syrer, fx eddikesyre eller vinsyre.

Forbindelserne med den almene formel I fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse er værdifulde, idet de udviser i det mindste en af virkningerne anæstesi-antagonisme, søvnantagonisme, spontan bevægelsesstimulerende virkning og dopamin-potentierende virkning hos dyr, fx mus, rotter, katte, hunde og aber. Da · disse forbindelser endvidere har ingen eller kun ringe TSH-fri-gørende virkning er de ligeledes værdifulde i denne henseende.

Af forbindelserne med formlen I er L-isomeren den mest foretrukne og den racemiske blanding er næstbedst. Forbindelser med formel I kan indgives til dyr, fx mus, rotter, katte, hunde eller aber, eller til mennesker som palinæstetika, spontan bevægelses-stimu-lanter eller dopamin-potentierende midler.

Fra DE offentliggørelsesskrifterne nr. 2.447.805 og 2.431.331 kendes beslægtede peptider, nemlig henholdsvis L-pyro-glutamyl-rL-histidyl-L-prolinamid (TRH) og TRH-tartrat. Desuden kendes fra DE offentliggørelsesskrift nr. 2.016.970 peptider med formlen L-pyroglutamyl-L-histidyl-N ' 1 2 hvor R og R hver er alkyl med 1-6 kulstofatomer eller sammen og sammen med nitrogenatomet danner en 5- til 8-leddet hetero- 149111 6 cyklisk ring, hvori en metylengruppe kan være erstattet med et heteroatom.

De i de ovennævnte tre offentliggørelsesskrifter beskrevne forbindelser udviser imidlertid kun tyrotropinfrigørende hormonvirkning. De nævnte skrifter antyder således intet om anæstesiantagonistisk virkning, spontan aktivitetsforøgende virkning eller dopaminpotentierende virkning. Det fremgår af omstående tabel 1, at de her omhandlede forbindelser er væsentligt bedre med hensyn til de tre sidstnævnte virkninger sammenlignet med den kendte forbindelse TRH.

Mulige indgiftsveje for de omhandlede forbindelser er parenteral indgift, fx intravenøs, intramuskulær eller subkutan, oral, rektal, nasal eller andre indgiftsveje.

Den dosis af en forbindelse med den almene formel I der er nødvendig til at opnå de ovennævnte virkninger afhænger af den pågældende type af forbindelsen med formlen I, arten og helbredstilstanden hos det under behandling værende dyr, indgifts-vejen osv. Fx kan man vælge en passende dosis i området fra ca.

.0,1 mg/kg til 10 mg/kg (pr. dosis) i tilfælde af parenteral indgift og området fra ca. 5 mg/kg til 500 mg/kg (pr. dosis) til oral anvendelse.

Forbindelser med formel I kan indgives som de er, men de kan også formuleres i dosisformer svarende til dem der kendes for TRH, fx injektionspræparater, pulvere eller tabletter.

Den omhandlede fremgangsmåde belyses nærmere i det følgende ved hjælp af nogle eksempler. I alle eksemplerne og i de farmakologiske prøveresultater der gives i det følgende gælder alle henvisninger til aminosyrer, peptider og andre forbindelser der omfatter optiske isomerer L-forbindelserne med mindre andet er angivet.

Eksempel 1

Cbl-His-Pro-NH,, a) y-Karboxy-y-butyrolakton I 200 ml vand suspenderes 29,4 g (0,2 mol) H-Glu-OH og en opløsning af 16,8 g (0,24 mol) natriumnitrit i 120 ml vand og 120 ml 2N tilsættes samtidigt dråbevis ved stuetemperatur i løbet af en periode på ca. 90 minutter. Reaktionsblandingen 7 149111 henstår i 12 timer. Vandet destilleres fra under nedsat tryk og der sættes varm acetone til remanensen. Acetonene afdestilleres fra ekstrakten og den olieagtige remanens renses ved destillation under nedsat tryk. Den ønskede forbindelse vindes som et destillat mellem 170,0 og 175,0°C/0,5 mm Hg. Udbytte 14,3 g (55,0%), smp.

50°C, optisk drejning [a]^7 = -11,4° (c = 0,77 i 2N NaOH).

Beregnet for C^HgO^, 1/2^0: C 44,61 H 4,87 N 0,00

Fundet: C 44,69 H 4,77 N 0,00 b) Cbi-His-Pro-NHp 1,43 g (0,011 mol) y-karboxy-y-butyrolakton og 3,46 g (0,013 mol) pentaklorfenol opløses i Ν,Ν-dimetylformamid og opløsningen afkøles med is. Derpå tilsættes 2,37 g (0,0115 mol) DCC og opløsningen omrøres i 4 timer. Separat opløses 3,85 g (0,01 mol) Z-His-Pro-N^ i 15 ml 25% HBr/eddikesyre og opløsningen henstilles ved stuetemperatur i 40 minutter. Efter tilsætning af 150 ml æter opsamles det resulterende bundfald ved filtrering og tørres i en ekssikkator med NaOH i 12 timer. Det tørrede pulver opløses i 21 ml Ν,Ν-dimetylformamid hvorved der opnås en opløsning af H-His-Pro-NH2 i Ν,Ν-dimetylformamid. De ovennævnte to opløsninger forenes og omrøres ved 4°C i 48 timer. Biproduktet dicyklohexylurinstof filtreres fra og opløsningsmidlet afdestilleres under vakuum. Remanensen tritureres med ætylacetat og det resulterende pulver opsamles ved filtrering.

Pulveret vaskes to gange med varmt acetonitril og derpå med ætylacetat. Det resulterende pulver opløses i vand og uopløselige materialer filtreres fra. Filtratet frysetørres. Udbytte 3,80 g, optisk drejning [a]^ = -53,4° (c = 0,56 i vand), tyndt-lagskromatografi Rf^ = 0,43.

Beregnet for ci6H2i°5N5'5'5fH20: C 41,56 H 7,17 N 15,15

Fundet: C 41,55 H 5,41 N 15,02

Eksempel· 2 Cbl-His-Pip-NH2 390 mg (0,003 mol) Y-karboxy-y-butyrolakton behandles på samme måde som i eksempel 6 b) for at vinde pentaklorfenylesteren. Separat behandles 1,20 g (0,003 mol) Z-His-Pip-NH2 med 8 12 ml 25% Hgr/eddikesyre i 110 minutter, hvorefter der tilsættes 100 ml æter. Det resulterende bundfald udvindes ved filtrering og tørres i en ekssikkator med NaOH i 12 timer.

Det tørrede pulver opløses i 15 ml Ν,Ν-dimetylformamid hvorved der vindes en opløsning af H-His-Pip-NH2 i N,N-dimetyl-formamid. De to opløsninger kombineres og blandingen omrøres ved 4°C i 12 timer. Biproduktet dicyklohexylurinstof filtreres fra og filtratet destilleres under nedsat tryk. Remanensen tritureres med ætylacetat og det resulterende pulver vaskes to gange med varmt acetonitril og opløses i 0,1 N eddikesyre. De uopløselige materialer filtreres fra og filtratet renses ved passage gennem en kolonne (5,5 x 40,0 cm) af "Sephadex" LH-20. Fraktionerne rige på den ønskede forbindelse forenes og frysetørres. Udbytte 400 mg, optisk drejning [a]^ = -49,1° (c = 0,86 i H20), tyndtlagskromatografi Rf^ = 0,45.

Beregnet for C17H2305N5,1/2CH3COOH,3H20: C 46,85 H 6,77 N 15,18 Fundet: C 46,62 H 5,68 N 15,35

Farmakologiske prøveresultater Prøvemetode 1) TSH-frigørelsesvirkning

Under anvendelse af rotter gennemførtes en prøve i overensstemmelse med den metode der er angivet af Schally et al. (J. Biol. Chem. 244, 4077, 1969).

2) Anastesi-antagonisme (anti-depressant virkning) 55 mg/kg pentobarbital-natrium blev indgivet intraperitonealt til mus (ICR/JCL, hanner, 4 uger gamle) og da opretningsrefleksen var forsvundet, nemlig efter 10 minutter, blev forbindelsen med formel I og TRH (fysiologisk saltopløsning som kontrol) indgivet intravenøst og det tidsrum der gik før opretningsrefleksen var genvundet blev noteret. (Prange et al. Life Sci 14, 447-455, 1974).

3) Aktivitetsforøgende virkning

Under anvendelse af grupper på 10 mus (ICR/JCL, hanner, 4 uger gamle), anbragtes hver mus i et aktivitetshjul og den aktivitets forøgende virkning af prøveforbindelsen på musen blev iagttaget. De kumulative antal omdrejninger fremkaldt som følge af 9 149111 musens spontane aktivitet i løbet af en periode på 3 timer efter den intravenøse indgift af en forbindelse med formlen I blev sammenlignet med antallet af omdrejninger fra kontrolgruppen.

4) Dopaminaktivitetspotentierende virkning

Under anvendelse af grupper på 10 hanmus (ICR/JCL) med en af deres caudatkerner ødelagt ved sugning undersøgtes virkningerne af forbindelsen med formlen I på antallet af drejninger og den procentuelle forekomst af hoveddrejninger som fremkaldes af 0,25 mg/kg apomorfin (I.P.) dvs. en dopamin-receptor-stimulant, under indflydelse af forudgående (18-22 timer) indgift af 2 mg/kg reserpin (i.p.).

Således blev forbindelsen med formlen I indgivet 30 minutter før indgiften af apomorfin og resultatet sammenlignedes med resultatet for den ubehandlede kontrolgruppe. Denne prøve udførtes for at konstatere den potentierende virkning af forbindelsen på dopamins centralnervesystems-virkning, og prøvens princip er det samme som det der er anvendes i Everett et al.'s forsøg (Fed.

Proc. 23, 198, 1964) til afprøvning af DOPA-synergistisk virkning som indbefatter indgift af DL-DOPA.

De relative virkninger af forbindelserne med formlen I ved de ovenfor beskrevene 4 procedurer blev udtrykt som forholdet af virkningen ved den samme dosis mellem forbindelsen med formlen I og TRH med virkningen af TRH, dvs. L-pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolinamid, som enhed. Resultaterne er opstillet i følgende tabel .

Tabel 1 ^'vA£irkning TSH- Anæstesi- Spontan Dopamin- frigørende antago- aktivitets- potenti- virkning nisme forøgende erende

Forbindelse N. virkning virkning TRH 11 11

Cbl-His-Pro-NH2 0,01-0,02 1,25 1,0 16,00