DK145715B - Fremgangsmaade til fremstilling af peptider ved kobling ved hjaelp af en aktiv ester og under tilsaetning af en n-heterocyclisk katalysator - Google Patents

Description

i 145715 o

Til fremstilling af peptider anvendes ofte med godt resultat de stærkt aktiverede estere af N-acylaminosyrer, f.eks. N-hydroxysuccinimid-(J. Arner. Chem. Soc. 86 (1964), side 1839), 1-hydroxybenzotriazol- (Chem. Ber. 103 (1970), 5 side 788) eller 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydrobenzotriazin-ester (Chem. Ber. 103 (1970), side 2034). Disse stærkt aktiverede estere kan imidlertid ikke i alle tilfælde fremstilles krystallinsk og med den ønskede renhed. De er desuden forholdsvis ubestandige og kan ofte ikke opbevares i længe-10 re tid. Bedre krystallisationsegenskaber og også større stabilitet har negativt substituerede phenylestere, f.eks. p--nitrophenylester (Chem. u. Ind. 1955, side 1517), 2,4,5-tri-chlorphenylester (Helv. Chim. Acta £6 (1963), side 1609), pentachlorphenylester (Roczniki Chem. 35 (1961), side 1533) 1® eller 2,6-dichlor-4-nitro-phenylester (Aust. J. Chem. 21 (1968), side 477). Disse estere besidder imidlertid den ulempe, at reaktionshastigheden ved syntesen af sterisk hindrede peptider går stærkt ned og derfor ofte resulterer i dagevise reaktionstider. I ekstreme tilfælde sker der overhovedet in-20 gen peptiddannelse.

Allerede i længere tid har det været forsøgt ved tilsætninger af de forskelligste arter at katalysere de noget reaktionstræge estere. Således kan f.eks. til esterkatalyse nævnes imidazol (Angew. Chem. 7_i (1962), side 904, TS_ (1963), 25 side 209), 2-hydroxypyridin, 1,2,4-triazol eller pyrazolderi-vater (Proc. Chem. Soc. 1963, side 266} Rec. Trav. chim. Pays--Bas 84_ (1965), side 213). Ved de nævnte katalysatorer forløb aminolysen af de aktiverede estere med undtagelse af imidazol endog uden racemisering, dog kunne reaktionshastigheden ikke 30 forøges så meget, at også stærkt sterisk hindrede peptider dannedes glat.

Det drejer sig altså her om svage katalysatorer, hvis virkning allerede opnås af polære, basiske opløsningsmidler såsom dimethylformamid. Dette har til følge, at de nævnte kata-35 lysatorer netop i de ved syntesen af højere peptider for det 2

O

145718 meste anvendte opløsningsmidler ikke mere bevirker en yderligere reaktionsacceleration.

En forbedring medførte katalyseringen med 2-hydroxypy-ridinnatriumsaltet (tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.031.826).

5 Allerede efter knap en times forløb kan man også selv ved ste-risk hindrede peptider opnå gode udbytter. Natriumsaltet af 2--hydroxypyridin besidder imidlertid den ulempe, at det reagerer stærkt basisk og kan bevirke racemisering ved de ømfindtlige peptidmolekyler. Således kan det faktisk iagttages ved 10 hjælp af et gaschromatografisk racemiseringsforsøg, at natriumsaltet af 2-hydroxypyridin virker racemiserende.

Det har nu vist sig, at aminolysen af visse aktiverede estere af phenylestertypen ved tilsætning af visse sure hete-rocycliske N-hydroxyforbindelser med en pK-værdi mellem 3,7 og 15 4,2 fremmes ekstremt, således at peptidsyntesen, der ellers behøvede dagevise reaktionstider, er afsluttet på nogle få minutter. Desuden er racemiseringen mindre ved den her omhandlede fremgangsmåde.

En sammenligning af halveringstiderne ved syntesen af 20 Z-Val-cyclohexylamid ud fra molære mængder Z-Val-ONp og cyclo- hexylamin under tilsætning af forskellige N-hydroxyforbindel-ser med pK-værdier af disse forbindelser viser den af pK-vær-dien afhængige katalytiske virkning af N-hydroxyforbindelser-ne særlig godt (jfr. tabel I i den efterfølgende eksperimen-25 telle del) .

Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til fremstilling af peptider ved omsætning af en beskyttet aminosyre eller et beskyttet peptid med formlen Η Y O Η Y 0 30 V-(N-CH-C-)ml-N-CH-C-0-R (II) i hvilken V betyder en inden for peptidkemien sædvanlig amino-beskyttelsesgruppe eller en pyroglutamylgruppe, Y betyder hydrogen, en lavere alkylgruppe, der eventuelt er forgrenet og/-eller kan være substitueret med om nødvendigt hensigtsmæssigt 35 beskyttede OH-, ΝΗ2_, SH-, C00H-, C0NH2-, guanidino-, aryl-, 3

O

145715 imidazoyl- eller indolylgrupper, hvorhos gruppen -NH-CHY-også kan betyde en pyrrolidinylgruppe, R betyder en di-, tri-, tetra- eller pentachlorphenylgruppe, en nitrophenylgruppe eller en chlornitrophenylgruppe, og m^ betyder et tal fra ca. 0 5 til 10, under tilsætning af en N-heterocyclisk katalysator, med en eventuelt beskyttet aminosyre eller et eventuelt beskyttet peptid med den almene formel Η Y 0 Η Y 0 H-N-CH-C-(N-CH-C-)m2 W (III) 10 i hvilken Y og -NH-CHY-gruppen har den ovenfor angivne betyd-2 ning, og m betyder tallene 0 til ca. 500, og W betyder en hy-droxygruppe, 0-alkyl, 0-aralkyl, en eventuelt med alkyl, aralkyl eller atyl substitueret aminogruppe eller en ester- eller amidagtigt bundet polymerbærer, og eventuelt hel eller 15 delvis fraspaltning af beskyttelsesgrupperne på i og for sig kendt måde i det fremkomne beskyttede peptid med formlen HYO ΗΥ0ΗΥ0ΗΥ0

1 I H I V II 1 I II I I II

V-(N-CH-C) l-N-CH-C-N-CH-C-(N-CH-C-)m2 W (IV) hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der som N-hete-20 rocyclisk katalysator anvendes en forbindelse med den almene formel { NN-OH (I) 25 i hvilken X betyder en af grupperne > C=0, >C=S eller -N=, og i hvilken X og N er led i en 5- eller 6-leddet ring, der yderligere kan indeholde et eller to heteroatomer valgt blandt N, S og 0, og som desuden kan være annelleret til en benzenring, hvilken ring eller hvilket ringsystem kan indeholde en phenyl-30 gruppe, 1-2 halogenatomer, en CF^-gruppe og/eller 1-3 alkyl-eller alkoxygrupper med indtil 4 carbonatomer som yderligere substituenter, og hvis pK-værdi, målt i en 0,5 molær opløsning i en opløsningsmiddelblanding af diethylenglycoldimethyl-ether og vand i forholdet 6:4 ved 30°C, ligger mellem 3,7 og 35 4,2.

145715 4

O

pK-Værdien af tilsætningsstofferne er afgørende for, at den foreliggende fremgangsmåde lykkes. pK-Målingen skal gennemføres som beskrevet i den eksperimentelle del. Er pK--værdien af forbindelserne med formlen I ved den nævnte syn-5 tese højere (som ved N-hydroxypiperidin) eller lavere (som ved l-hydroxy-6-nitro-benzotriazol), falder den katalytiske virkning stærkt.

Der arbejdes almindeligvis med mængder på 0,1 til ca.

1 ækvivalent N-hydroxyforbindelse, men der kan også anvendes 10 mindre eller større mængder.

Til katalysering egnede forbindelser er bl.a. 1-hy-droxybenzotriazoler, f.eks. l-hydroxy-5,6-dimethylbenzotria-zol, l-hydroxy-5-methyl-benzotriazol, l-hydroxy-6-methylben-zotriazol, l-hydroxy-5-methoxy-benzotriazol, 1-hydroxy-4-me-15 thyl-benzotriazol, l-hydroxy-6-brom-benzotriazol, 1-hydroxy--6-chlor-benzotriazol og l-hydroxy-5-chlor-benzotriazol, cy-cliske hydroxamsyrer, f.eks. pyridonerne 1-hydroxy-2-pyridon, l-hydroxy-4-methyl-2-pyridon (U.S. 2.540.218), l-hydroxy-4,6--dimethyl-2-pyridon, l-hydroxy-3,4,6-trimethyl-2-pyridon 20 (Belg. 738.288) og l-hydroxy-3,5-dichlor-4,6-dimethyl-2-pyridon, N-hydroxysuccinimid eller l-hydroxy-2-oxo-2,3-dihydro-indoler såsom l-hydroxy-6-chlor-2-oxo-2,3-dihydro-indol (J.

Amer. Chem. Soc. 78, side 222, (1956)), cycliske hydroxamsyrer med nitrogen som heteroatom i ringen, f.eks. 3-hydroxy-25 -4-oxo-3,4-dihydroquinazolin, 3-hydroxy-2-methyl-4-oxo-3,4- -dihydroquinazolin, 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-l,2,3-benzo-triazin og 3-hydroxy-4-oxo-2-phenyl-3,4-dihydroquinazolin (J. Chem. Soc. 1960), cycliske hydroxamsyrer med oxygen eller svovl som heteroatom i ringen, f.eks. passende substitue-30 ret 4-hydroxy-3,4-dihydro-3-oxo-l,4,2-benzooxaziner og 4-hy-droxy-3,4-dihydro-3-oxo-l,4,2-benzothiaziner, eller cycliske thiohydroxamsyrer, f.eks. 3-hydroxy-4-methyl-2,3-dihydro-thia-zol-2-thion kan ligeledes anvendes.

Som substituenter i forbindelserne med formlen I kom-35 mer især alkylgrupper eller alkoxygrupper med 1-2 carbonatomer og halogenatomer, især chlor, på tale.

O

145715 5

Aminokomponenterne III kan enten anvendes på fri form eller som salte af mineralsyre eller stærke eller svage organiske syrer, f.eks. p-toluensulfonsyre, trifluoreddikesyre eller eddikesyre.

5 Foreligger der en saltdannelse med stærke syrer, må der til frigørelse af aminogruppen tilsættes en tertiær organisk base, f.eks. triethylamin eller N-ethylmorpholin. Også en tilsætning af et salt af de ovennævnte N-hydroxyforbindelser, f.eks. 1-hydroxybenzotriazol-natriumsaltet er mulig. Herved 10 frigøres samtidig aminogruppen (natriumsaltdannelse), og den til katalyseringen nødvendige 1-hydroxyforbindelse med formlen I dannes.

Som beskyttelsesgrupper V kommer de inden for peptidkemien sædvanlige N-beskyttelsesgrupper på tale (jfr. Schroder-15 -Lubke, The Peptides, New York og London 1965/66). Der anvendes fortrinsvis aralkyloxycarbonylgrupper, f.eks. benzyloxy-carbonyl, eller tert.alkyloxycarbonylgrupper, f.eks. tert.bu-tyloxycarbonyl.

OH-Funktionen i serin, threonin eller tyrosin kan for-20 blive ubeskyttede. De kan imidlertid også beskyttes med egnede grupper, f.eks. tert.butyl- eller benzylgrupper.

Til fremstilling af cystein- og cystinpeptider må SH--funktionen i cysteinet beskyttes med de inden for peptidkemiens sædvanlige SH-beskyttelsesgrupper, eller man gennemfø-25 rer reaktionen med symmetriske eller asymmetriske cystinpeptider, der derpå eventuelt kan reduceres til cysteinpeptider.

W betyder i carboxylkomponenteme med den almene formel III også en polymerbærer, der er bundet esteragtigt eller amidagtigt til carboxylgruppen. Som egnede polymere kommer en 30 med 1-2% divinylbenzen tværbundet polystyren, tværbundne phe-nol-formaldehydkondensationsprodukter, tværbundne phenolether--formaldehydkondensationsprodukter, ved podepolymerisation kemisk bundet polystyren, som kan frembringes efter bestråling med γ-stråler af formstofoverflader ud fra f.eks. poly-35 ethylenterephthalat, polyamider eller polyalkylener, jfr.

6

O

145715 USA patentskrift nr. 3.439.063, 3.188.228 og 2.907.675, poly-benzyl-harpikser eller phenylsubstituerede glasoverflader, som f.eks. kan frembringes ud fra aminoalkylerede glassorter ved omsætning med chlormethylphenyleddikesyre og dicyclohexylcarbo-5 diimid på tale. Som egnede hæftegrupper er f.eks. halogenme-thylgrupper, halogenacetylgrupper eller aminobenzhydrylgrupper mulige.

Kondensationen gennemføres hensigtsmæssigt i opløsnings-midler som f.eks. dimethylformamid, dimethylacetamid, tetrame-10 thylurinstof eller phosphorsyretrisdimethylamid eventuelt under tilsætning af noget vand. Reaktionstemperaturen ligger fordelagtig ved 0-40°C, fortrinsvis ved stuetemperatur.

Oparbejdningen sker på simpel måde, da de her omhandlede N-hydroxyforbindelser med den almene formel I, såsom 1-hydroxy-15 benzotriazol eller 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydroquinazolin fuldstændigt lader sig udryste med natrium- eller kaliumbicarbonat eller sodaopløsning. Andre forbindelser, f.eks. l-hydroxy-2--pyridon eller 3-hydroxy-4-methyl-2,3-dihydro-thiazol-2-thion opløses allerede i vand og kan herved særlig let fjernes. Fra 20 tungt opløselige peptidderivater kan man også med isopropanol, alkohol, methanol, tetrahydrofuran eller varmt vand ekstrahere N-hydroxyforbindelserne. De ved omsætningen dannede phenoler har lignende opløsningsegenskaber som N-hydroxyforbindelserne og fjernes som regel samtidig med disse.

25 Den yderligere rensning sker på sædvanlig måde, ved la vere peptider f.eks. ved fordeling mellem en organisk og en vandig fase, ved omfældning eller omkrystallisation fra egnede opløsningsmidler eller ved chromatografi, f.eks. på "Sepha- (r) dex LH-20" w (tværbundet, delvis etherificeret dextragel) i et 30 organisk opløsningsmiddel eller en organisk vandig opløsningsmiddelblanding, eventuelt også som fordelingschromatografi i kun delvis blandbare opløsningsmiddelkomponenter.

Ved højere peptider eller proteiner kan det være fordelagtigt først at foretage rensning efter fraspaltningen af 35 beskyttelsesgrupperne, f.eks. ved isoelektrisk fældning, kry- 145715 o 7 stallisation, modstrømsfordeling, fordelingschromatografi, gelchromatografi eller præparativ elektrophorese.

Fraspaltningen af beskyttelsesgrupperne afhænger af deres natur, og må tage hensyn til stabiliteten af reaktions-5 produkterne med den almene formel IV eller de til grund for disse forbindelser liggende peptider. Den sker på inden for peptidkemien kendt måde (jfr. det ovennævnte litteratursted af Schroder-Liibke).

N-Acyl-peptid-aktivesterne bevirker ved tilsætning af 10 N-hydroxyforbindelserne med den almene formel I ingen stigning af racemiseringen, således som det vises ved racemise-ringsforsøg, kendt fra Chem. Ber. 103 (1970), side 788, i den eksperimentelle del (jfr. tabel II i den eksperimentelle del).

Både ved nitrophenyl- og ved trichlorphenylesteren kunne der 15 ved denne racemiseringsprøve med og uden tilsætning af N-hy-droxyforbindelser ikke iagttages nogen racemisering. Anderledes forholdt sig derimod pentachlorphenylesteren, der gav et til ca. 80% racemiseret tripeptid. Ved tilsætning af 1-hy-droxybenzotriazol kunne denne stærke racemiseringsgrad sænkes 20 med ca. 26 til 54%. Ved tilsætning af 2-hydroxypyridinnatrium-salt iagttoges som allerede nævnt den omvendte effekt, idet racemiseringen forstærkedes yderligere.

Ved tilsætning af de her omhandlede N-hydroxyforbin-delser med den almene formel I kan man overvinde den steriske 25 hindring, der har forhindret mange omsætninger med aktiverede estere, f.eks. ved omsætningen af Nps-isoleucin-aktivestere med H-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH. Omsætningen af Nps-Ile-OTcp med H-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH i dimethylformamid kan ikke føres til ende. Efter 5 ugers forløb blev forsøget afbrudt, da der al-30 lerede foruden slutprodukt og udgangsmateriale kunne påvises flere sønderdelingsprodukter ved tyndtlagschromatografisk undersøgelse. Tilsattes derimod f.eks. 1-hydroxybenzotriazol, 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydroquinazolin eller 1-hydroxy-2-pyri-don, var reaktionen allerede slut efter 15-20 timers forløb 35 (jfr. tabel III i den eksperimentelle del).

δ 145715 ο

Den enorme katalytiske kraft af disse N-hydroxyforbin-delser kan også udnyttes ved fast-fase-peptidkondensationsme-toden. Således kan man ifølge J. Amer. Chem. Soc. 90 (1966), side 2953 ud fra N-beskyttede aminosyrer og en poly-4-hydroxy-5 -3-nitro-styrenharpiks fremstille de tilsvarende uopløselige estere, der derpå reagerer med opløselige aminoforbindelser til de tilsvarende amider eller peptider. Ved anvendelse af de her omhandlede N-hydroxyforbindelser kan reaktionstiderne forkortes stærkt. Også ved den afledte Merrifield-fast-fase-10 -metode, der ofte anvendes ved N-beskyttede aminosyreaktiv-estere, f.eks. nitrophenylesteren, forøger de her omhandlede tilsætninger udbyttet og forkorter reaktionstiden.

Netop stigningen af udbyttet er ved fast-fase-metoden udslagsgivende for det gode resultat af en sådan syntese.

15 Ved syntesen af et sterisk stærkt hindret pentapeptid fra sekvensen fra insulin-A-kæden viser fordelen sig ved de her omhandlede tilsætningsstoffer (jfr. eksempel 16). Hermed er for første gang fundet en metode, ved hvilken den ved fast--fase-syntesen særlig stærkt fremtrædende steriske hindring 20 kan overvindes.

Den hidtil ukendte fremgangsmåde er ikke kun fordel- (Al) agtig ved mindre peptider. Også større peptider såsom N , n(B29)-kis-Boc-insulin (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 352 (1971), side 7), et kompliceret peptid ud fra 51 aminosyrer, 25 kan i løbet af få minutter glat omsættes med N-acylaminosyre (Bl) og N-acylpeptidaktivestere til den tilsvarende N '-N-acylaminosyre eller N^^-N-acylpeptid-N^^ og N -bis-Boc--insuliner.

Forbindelserne med den almene formel III kan også være 30 proteiner, hvis frie aminogrupper helt eller delvis reagerer med forbindelserne med den almene formel II. Ved ekstremt ugunstige opløselighedsforhold egner sig f.eks. dimethylform-amid særlig godt. Egnede proteiner er f.eks. gelatine, der delvis kan være nedbrudt, serumalbumin eller casein.

35

O

9 145715

Efter fraspaltning af beskyttelsesgrupperne har f.eks. reaktionsprodukterne fra forbindelser med den almene formel II medN^A1^f n -bis-Boc-insulin ved højere biologisk virkning ændrede fysisk-kemiske og immunologiske egenskaber, der 5 er fordelagtige for fremstillingen af nye insulintilberedninger. Reaktionsprodukterne ud fra forbindelser med den almene formel II med proteiner kan eventuelt efter fraspaltning af beskyttelsesgrupperne anvendes til fremstilling af antigener over for de til grund for disse forbindelser med formlen II 10 liggende aminosyrer eller peptider.

Som byggestene for de ved den her omhandlede fremgangsmåde fremstillede peptider kommer alle i naturlige forekommende peptider eksisterende aminosyrer på deres L- eller D-form på tale. Også anvendelsen af β-aminosyre, f.eks. β-alanin, el-15 ler andre kun syntetisk eller halvsyntetisk tilgængelige aminosyrer, f.eks. α-methylalanin, a-methyl-3,4-dioxy-L-phenyl-alanin eller Ø-chloralanin, er mulig.

Den her omhandlede fremgangsmåde er særlig fordelagtig.

De lange reaktionstider, der hidtil i mange tilfælde har været 20 nødvendige, nedsættes til nogle få minutter. Dette gælder f.eks. særlig fordelagtig ved nitrophenylestermetoden, der er en af de mest anvendte peptidkondensationsmetoder.

Den her omhandlede fremgangsmåde er frem for alt ved den industrielle fremstilling af peptider et stort fremskridt, da 25 den pr. tidsenhed omsatte mængde kan forøges overordentlig stærkt.

Det er endvidere en særlig fordel ved den her omhandlede fremgangsmåde, at katalysen med de her omhandlede N-hydroxy-forbindelser frem for alt i de ovennævnte stærkt polære opløs-30 ningsmidler kommer helt til sin ret, der på grund af deres gode opløsningsegenskaber alene kommer på tale for syntesen af højere peptider.

De efter denne fremgangsmåde fremstillede peptider kan efter fraspaltning af beskyttelsesgrupperne anvendes som tera-35 peutika eller som mellemprodukter til fremstilling af andre te- ίο o 145715 rapeutisk værdifulde peptider, f.eks. Oxytocin, Vasopressin, Glucagon, Secretin, ACTH, Thyrocalcitonin, Gastrin, Thyroliberin, Luliberin eller Insulin.

I beskrivelsen og i eksemplerne forkortes aminosyrerne 5 efter de internationalt gældende regler. Desuden anvendes følgende forkortelser:

Boc tert.butyloxycarbonyl- Z benzyloxycarbonyl-

Nps o-nitrophenylsulfenyl- 10 OBu*" tert .butyles ter OMe methylester OBzl benzylester ONp p-nitrophenylester OTcp 2,4,5-trichlorphenylester 15 OPcp pentachlorphenylester OSu N-hydroxysuccinimidester

Trt trityl-

Bu^ tert.buty1-

Mbh 4,4'-dimethoxy-benzhydryl- 20 CHA cyclohexylamin

Eksempel 1

Undersøgelsen af halveringstiden ved syntesen af Z-Val--cyclohexylamid ud fra molære mængder Z-Val-ONp og cyclohexyl-25 amin under tilsætning af forskellige N-hydroxyforbindelser og afhængigheden af halveringstiden af pK-værdien af N-hydroxyfor-bindelserne.

a) Fastlæggelse af halveringstiden

Opløsning I: 0,5 pmol cyclohexylamin, 0,5 pmol p-nitrophenol 30 og 1,0 pmol N-hydroxyforbindelse pr. ml dimethyl- formamid.

Opløsning II: 1,0 pmol p-nitrophenol pr. ml dimethylformamid.

Opløsning III: 1,0 umol N-hydroxyforbindelse pr. ml dimethyl- formamid.

35 o 11 U5715 UV-kurven (området 330-300 m) af opløsningerne I, II og III sammenlignes, for at finde frem til de gunstige bølgelængder for målingen af p-nitrophenol. Ved disse bølgelængder måles extinktionen. Til den for opløsningen I bestemte 5 værdi lægges 50% af extinktionen af en opløsning af 1 pmol Z-Val-ONp og 1 pmol triethylamin pr. ml opløsningsmiddel ved de ovenfor valgte bølgelængder. Summen af disse to extinktio-ner repræsenterer extinktionen, ved hvilken halvdelen af Z-Val-ONp har omsat sig med cyclohexylamin.

10 UV-kurverne måltes med et "Beckmann TK lA"-apparat ved 21°C. Stofferne blev opløst i dimethylformamid.

b) Måling af halveringstiden

Til den kinetiske måling af halveringstiden t 1/2 måltes en opløsning af 1 pnol X-Val-0Np, 1 pmol cyclohexylamin 15 og 1 pmol N-hydroxyforbindelse pr. ml opløsningsmiddel ved de under a) bestemte bølgelængder. Det tidsrum, i hvilket den under a) fastlagte extinktionshøjde opnås, svarer til halveringstiden for reaktionen.

c) Måling af ρΚ-værdien i en 0,5 molær opløsning (diethylen-20 glycoldimethylether/vand ved 6;4) ved 30°C

0,5 mmol stof opløses i en blanding af 6 ml diethylen-glycoldimethylether, 2,5 ml 0,1 N natriumhydroxidopløsning og 1,5 ml vand og opvarmes i en termostat til 30°C. Ved hjælp af en kombinations-glaselektrode måles pH-værdien potentiometrisk.

25 Efter tilnærmelsesformlen pH - pK = log α/1-α er for α = 0,5: pK = pH.

Den ovenfor målte pH-værdi fremstiller altså pK-værdi-en af denne forbindelse.

d) Tabel I

30 Sammenligning af halveringstiden ved syntesen af Z-Val- -cyclohexylamid ud fra molære mængder Z-Val-ONp og cyclohexylamin med pK-værdierne af de tilsatte N-hydroxyforbindelser.

145715 12

O

Forbindelse pK t^2(min·) uden tilsætning - 112,0 N-Hydroxypiperidin 5,9 125,0 5 1-Hydroxy-4-methyl-6-isopropyl-2-py- ridon 4,14 19,0 3-Hydroxy-2-methyl-4-oxo-3,4-dihydro- quinazolin 4,11 1,9 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-quinazolin 4,10 ca. 0,25 10 l-Hydroxy-3,4,5-trimethyl-2-pyridon 4,09 14,8 l-Hydroxy-4,6-dimethyl-2-pyridon 4,09 5,9 l-Hydroxy-4-methyl-2-pyridon 4,08 3,2 l-Hydroxy-2-pyridon 4,08 1,3 3-Hydroxy-4-methyl-2,3-dihydro-thiazol- 15 -2-thion 4,08 1,5 l-Hydroxy-3,5-dichlor-4,6-dimethyl- -2-pyridon 4,05 4,0 l-Hydroxy-2-oxo-2,3-dihydro-6-chlorindol 4,05 1,5

Eddikesyre (sammenligning) 4,05 60,0 20 N-Hydroxysuccinimid 4,04 4,8 l-Hydroxy-5,6-dimethyl-benzotriazol 4,02 2,1 l-Hydroxy-5-methyl-benzotriazol 4,02 2,8 l-Hydroxy-6-methoxy-benzotriazol 4,00 2,0 l-Hydroxy-5-methoxy-benzotriazol 4,00 3,6 25 l-Hydroxy-4-methyl-benzotriazol 4,00 3,0 1-Hydroxy-benzotriazol 4,00 3,5 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-l,2,3- -benzotriazin 4,00 18,0 l-Hydroxy-6-brom-benzotriazol 3,91 8,9 30 l-Hydroxy-e-chlor-benzotriazol 3,90 10,6 l-Hydroxy-5-chlor-benzotriazol 3,89 13,9 l-Hydroxy-6-trifluormethyl-benzotriazol 3,72 39,0 l-Hydroxy-5,6-dichlorbenzotriazol 3,7 35,0 l-Hydroxy-6-nitro-benzotriazol 3,51 meget 35 langsomt Ο 13

14571B

Eksempel 2

Gaschromatografisk racemiseringsprøve ifølge F. Wey-gang et. al. (Chem. Ber. 9£ (1966), side 1451-1460 og Chem.

Ber. 3Ό3 (1970), side 788-798).

5 I. Fremstilling af udgangsprodukterne a) HBr,H-Phe-0Np 4,2 g Z-Phe-ONp suspenderes i 10 ml iseddike. Hertil sættes 10 ml mættet HBr/iseddike, og der omrøres i 1 time ved stuetemperatur. Derpå udfældes hydrobromidet med ether, og 10 der vaskes godt med ether. Udbyttet andrager 3,5 g, og smeltepunktet andrager 216-219°C.

b) HBr,H-Phe-0Pcp 5,47 g Z-Phe-0Pcp behandles analogt med la. Udbyttet andrager 4,1 g og smeltepunktet andrager 205°C under sønderdeling.

15 c) HBr,H-Phe-0Tcp 4,78 g Z-Phe-0Tcp behandles analogt med la. Udbyttet andrager 4,2 g,og smeltepunktet andrager 220°C under sønderdeling.

d) Boc-Leu-Phe-ONp 2,49 g Boc-Leu-0H,l H20 opløses i eddikesyreester. Ed-20 dikesyreesteren tørres med natriumsulfat, koncentreres, og remanensen tørres i højvakuum. Remanensen opløses i 20 ml absolut tetrahydrofuran, og opløsningen afkøles til -10°C. Under omrøring tildryppes der nu ved isafkøling 1,2 ml N-ethylmorpho-lin og derpå en opløsning af 1,27 g chlormyresyre-isobutylester 25 i lidt koldt tetrahydrofuran. Der omrøres i 10 minutter ved -10°C, hvorpå der tilsættes 3,35 g HBr,Η-Phe-ONp,og der til-dryppes langsomt en opløsning af 1,2 ml N-ethylmorpholin i 5 ml tetrahydrofuran. Der efteromrøres i yderligere 1 time ved 0°C og i 1 time ved stuetemperatur. Bundfaldet fraskilles 30 ved sugning, filtratet koncentreres, og remanensen sammenrives med isopropanol. Udbyttet andrager 3,77 g og smeltepunktet 150-152°C. Efter omkrystallisation fra isopropanol andrager udbyttet 3,10 g, smp. 152-153°C [a]D = -32,2° (c = 1, i dimethyl-acetamid).

35

O

14 145715 e) Boc-Leu-Phe-OPcp

Fra 1,97 g Boc-Leu-OH,1 H20, 0,93 ml N-ethylmorpholin og 1,0 g chlormyresyreisobutylester fremstilles analogt med ld det blandede anhydrid, der omsættes analogt med ld med 5 3,55 g HBr, H-Phe-OPcp og 0,93 ml N-ethylmorpholin. Udbyttet andrager 3,35 g,og smeltepunktet andrager 145-147°C. Efter omkrystallisation fra isopropanol er udbyttet 2,11 g, smp. 163-164°C, [a]D = -29,1° (c = 1, i dimethylacetamid).

f) Boc-Leu-Phe-OTcp 10 Fra 2,3 g Boc-Leu-0H,l ^0, 1,1 ml N-ethylmorpholin og 1,17 g chlormyresyreisobutylester fremstilles analogt med ld det blandede anhydrid, der analogt med Id omsættes med 3.6 g HBr,H-Phe-0Tcp og 1,1 ml N-ethylmorpholin. Udbyttet er 3.7 g, og smeltepunktet er 143-145°C. Efter omkrystallisa- 15 tion fra isopropanol er udbyttet 3,2 g, smp. 150-151°C, [a]D = -48,4° (c = 1, i dimethylacetamid).

II. Almen forskrift til fremstilling af Boc-Leu-Phe-Val-OBu ud fra Boc-Leu-Phe-aktivestere

Til en opløsning af 105 mg (0,5 mmol) HCljH-Val-OBu*1 20 i 2,5 ml 0,2 m N-ethylmorpholin/dimethylacetamid-opløsning sættes den katalyserende tilsætning (1-hydroxybenzotriazol eller 2-hydroxy-pyridin-natriumsalt) og 0,5 mmol af den tilsvarende Boc-Leu-Phe-aktivester (250 mg Boc-Leu-Phe-ONp, 313 mg Boc-Leu-Phe-OPcp og 279 mg Boc-Leu-Phe-OTcp). Blandin-25 gen henstilles i det i tabel II angivne tidsrum, fortyndes med 50 ml eddikesyreester, og eddikesyreesteropløsningen ud-rystes med en natriumhydrogencarbonatopløsning, en kaliumhy-drogensulfatopløsning, en natriumhydrogencarbonatopløsning og en natriumchloridopløsning, tørres med natriumsulfat og kon-30 centreres.

Remanensen partialhydrolyseres, trifluoracetyleres og gaschromatograferes analogt med Chem. Ber. 103 (1970), side 788-798 og Chem. Ber. 99^ (1966), side 1451-1460. Resultaterne fra den gaschromatografiske racemiseringsundersøgelse er sam-35 menfattet i tabel II.

O

15 145715

III. Tabel II

Racemiseringsundersøgelser ved syntesen af Boc-Leu-Phe- t t -Val-OBu ud fra Boc-Leu-Phe-aktivestere og H-Val-OBu under •indflydelse af acyleringskatalysatorer 5

Aktiv- Molækvivalent Reaktions- ester Katalysator_katalysator_tid_% D-Phe-L-Val ONp - - 70 timer <2% ONp 2-Hydroxy- 1,0 1 time 3,7% 10 pyridin-Na ONp 1-Hydroxy- 1,0 5 min. <2% benzotriazol OBp 1-Hydroxy- 0,1 5 min <2% _benzotriazol_ 15 OTcp - 70 timer <2% OTcp 2-Hydroxy- - 1 time <2% pyridin-Na - OTcp 1-Hydroxy- 1,0 5 min. <2% _benzotriazol_ 20 OPcp - - 70 timer 40% OPcp 2-Hydroxy- 1,0 1 time 40% pyridin OPcp 2-Hydroxy- 1,0 5 min. 27% benzotriazol 25 OTcp 3-Hydroxy-4-oxo 1,0 10 min. <2% 3,4-dihydro-quinazolin OTcp 3-Hydroxy-2- 1,0 10 min. <2% -methyl-4-oxo-30 -3,4-dihydro- quinazolin OTcp l-Hydroxy-2- 1,0 10 min. <2% _-pyridon___

O

16 145715

Eksempel 3

Syntese af Nps-Ile-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH

a) Fremstilling af Nps-Ile-aktivesteren

Molære mængder Nps-isoleucin og trichlorphenol eller 5 N-hydroxysuccinimid omsættes i eddikesyreester ved 0°C med et lille overskud af dicyclohexylcarbodiimid (DCC). Der omrøres i 1 time ved 0°C og derpå i 3 timer ved stuetemperatur. Bundfaldet fraskilles ved sugning, og filtratet koncentreres. Remanensen omkrystalliseres fra isopropanol.

10 Nps-Ile-OTcp, smp. 95-97°C Nps-Ile-OSu, smp. 105-108°C.

b) Nps-Ile-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH

2,9 g (5 mmol) H-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH,H20 (fremstillet ifølge Chem. Ber. 103 (1970), side 2039) og 815 mg (5 mmol) 15 l-hydroxy-5,6-dimethyl-benzotriazol opløses i 25 ml dimethyl-formamid. Hertil sættes 2,32 g (5 mmol) Nps-Ile-OTcp, og blandingen henstilles i 15 timer ved stuetemperatur. (Efter dette tidsrum kunne udgangstripeptidet ikke mere påvises ved en tyndtlagschromatografisk bestemmelse). Dimethylformamidet af-20 destilleres i vakuum, og remanensen sammenrives med en na-triumbicarbonatopløsning. Bundfaldet fraskilles ved sugning, og filtratet kastes bort. Bundfaldet opløses i eddikesyreester og udrystes med en kaliumhydrogensulfatopløsning og vand, tørres med natriumsulfat og koncentreres. Remanensen sammen-25 rives med ether. Produktet er amorft. Udbyttet andrager 3,6 g (82%), [a]^=-23,5° (c = 1, i dimethylacetamid) .

c) Tyndtlagschromatografisk undersøgelse af syntesen af Nps--Ile-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH ud fra Nps-Ile-OTcp eller - til sammenligning - Nps-Ile-OSu og H-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH under an- 30 vendelse af forskellige N-hydroxyforbindelser som katalysator Til en opløsning af 116,3 mg (0,2 mmol) H-Cys(Trt)-Ser--Leu-OHj^O i 2 ml dimethylf ormamid sættes 0,2 mmol af N-hy-droxyforbindelsen og 111 mg (0,22) Nps-Ile-OTcp eller 89,2 mg (0,24 mmol) Nps-Ile-OSu. Med forskellige tidsintervaller på-35 føres en dråbe af reaktionsblandingen på en tyndtlagskiselgel- 17 1Λ 5 715 ο plade (Merck, "Kiselgel F254" ®). Som løbeopløsning anvendes en blanding af methylenchlorid/methanol 8:2, og der udvikles med ninhydrin. I tabel III er resultaterne fra denne undersøgelse sammenfattet.

5 d) Tabel III

Syntese af Nps-Ilc-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH ud fra Nps-Ile--OTcp eller Nps-lle-OSu og H-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH under anvendelse af forskellige N-hydroxyforbindelser som katalysatorer.

10 Afslutning af reaktionen

Ester N-Hydroxy forbindelse_____(reaktionstid)_ OSu * - Afbrudt efter 5 uger, da der endnu ikke kunne fastslås nogen fuldstændig om- 15 sætning OSu K 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-di- " hydroquinazolin OTcp - " OTcp 1-Hydroxybenzotriazol ca. 15 timer 20 OTcp 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihy- ca. 15 timer droquinazolin OTcp 3-Hydroxy-2-methyl-4-oxo- ca. 7 dage -3,4-dihydro-quinazolin OTcp 3-Hydroxy-4-oxo-2-phenyl- ca. 7 dage 25 -3,4-dihydro-quinazolin OTcp 1-Hydroxy-5,6-dimethyl- ca. 20 timer -benzotriazol OTcp l-Hydroxy-2-pyridon ca. 20 timer OTcp l-Hydroxy-4-methyl-2-pyridon ca. 20 timer 30 OTcp l-Hydroxy-2,4-dimethyl-2- ca. 4 dage -pyridon

X

Sammenligningsforbindelse

O

18 145715

Eksempel 4

Syntese af Z-Phe-Val-OMe a) Med 1 ækvivalent 1-hydroxybenzotriazol og Z-Phe-OPcp

Til en opløsning af 0,92 g (5,5 mmol) HCl,H-Val-OMe, 5 0,72 ml N-ethylmorpholin og 675 mg (5 mmol) 1-hydroxybenzo- triazol i 10 ml dimethylformamid sættes 2,75 g (5 mmol) Z-Phe-OPcp. Der omrøres i 5 minutter, koncentreres i højvakuum, og remanensen fordeles mellem eddikesyreester og 2 N sodaopløsning, udrystes 1 gang med en kaliumhydrogensulfat-10 opløsning, 3 gange med en 2 N sodaopløsning og 1 gang med vand, tørres med natriumsulfat og koncentreres, og remanensen sammenrives med petroleumsether. Udbyttet andrager 2,08 g, og smeltepunktet 99-104°C. Efter omkrystallisation fra eddi-kesyreester/petroleumsether er udbyttet 1,7 g (83%) , og smells tepunktet er 112-114°C.

b) Med 0,1 ækvivalent 1-hydroxybenzotriazol og Z-Phe-OTcp

Til en opløsning af 0,92 g (5,5 mmol) Hcl,H-Val-0Me, 0,72 ml N-ethylmorpholin og 67,5 mg (0,5 mmol) 1-hydroxybenzotriazol i 10 ml dimethylformamid sættes 2,4 g (5 mmol) 20 Z-Phe-OTcp. Der omrøres i 5 minutter og oparbejdes som under a). Udbyttet er 1,66 g (81%), og smeltepunktet er 112-114°C.

c) Med 1 ækvivalent 1-hydroxybenzotriazol-natriumsalt og Z-Phe-ONp

Til en opløsning af 0,92 g (5,5 mmol) Hcl,H-Val-OMe i 25 10 ml dimethylformamid sættes 865 mg (5,5 mmol) 1-hydroxyben- zotriazol-natriumsalt og 2,1 g (5 mmol) Z-Phe-ONp. Der omrøres i 5 minutter og oparbejdes som under a). Udbyttet andrager 1,65 g (80%), og smeltepunktet andrager 116°C.

30 Eksempel 5

Syntese af Z-Val-Val-OMe

Til en opløsning af 0,92 g (5,5 mmol) HC1,H-Val-0me i 10 ml dimethylformamid sættes 865 mg (5,5 mmol) 1-hydroxyben-zotriazol-natriumsalt og 1,87 g (5 mmol) Z-Val-ONp. Der omrø-35 res i 5 minutter og oparbejdes som i eksempel 4a). Udbyttet andrager 1,66 g (91%), og smeltepunktet er 108-110°C.

O

19 145715

Eksempel 6

Syntese af Z-Leu-Glu (OBu^) -Asn (Mbh) -Tyr (Bu*1) -OH (Sekvens fra insulin-A-kæden) I. Z-Leu-Glu(OBut)-Asn(Mbh)-Tyr(Bu^)-OH 5 Til en opløsning af 1,53 g (2 mmol) H-Glu(OBu^)-Asn- (Mbh)-Tyr (Bu*^-OH og 270 mg 1-hydroxybenzotriazol (2 mmol) i 5 ml dimethylformamid sættes 1,5 g Z-Leu-OPcp (2,2 mmol), blandingen henstilles i 10 minutter og koncentreres i højvakuum. Remanensen sammenrives med 2 N sodaopløsning. Sodaop-10 løsningen afdekanteres, og remanensen sammenrives med vand.

Nu .fraskilles der ved sugning, og filterremanensen fordeles mellem en 2,5%'s kaliumhydrogensulfatopløsning og eddikesyreester. Eddikesyreesteropløsningen tørres og koncentreres. Remanensen sammenrives med ether/petrolumsether (1:1) og frals skilles ved sugning. Udbyttet andrager 1,8 g (89%), og smeltepunktet er 174-176°C.

Denne forbindelse er tyndtlagschromatografisk identisk med en prøve, der er blevet fremstillet analogt med Z-Leu-Osu. Reaktionstiden var 24 timer, og udbyttet 84%.

20 Til det samme resultat når man ved anvendelse af a) 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydroquinazolin b) l-hydroxy-5,6-dimethyl-benzotriazol eller c) 1-hydroxy-2-pyridon i stedet for den ovenfor anvendte 1-hydroxybenzotriazol, men ellers ved samme fremgangsmåde. Smelte- 25 punktet er hver gang ca. 175°C, og udbyttet er hver gang ca.

I, 8 g.

II. Fremstilling af udgangsstoffet H-Glu(OBu^)-Asn(Mbh)-Tyr-(Bufc) -OH

a) Z-Asn(Mbh)-Tyr(Bu^)-OH

30 100 g Z-Asn(Mbh)-Tyr(But)-Ome (0,138 mol) (Chem. Ber.

103, (1970), side 2041-2051) suspenderes i en blanding af 770 ml dioxan og 200 ml vand. Ved 37°C tildryppes der langsomt 138 ml 1 N natriumhydroxidopløsning (thymolphthalein som indikator). Efter afsluttet reaktion gøres det surt med 35 300 ml 2 N citronsyre. Det udfældede produkt fraskilles ved 0 20 145715 sugning og vaskes med vand. Der omfældes fra methanol/vand.

Udbyttet andrager 88 g, (90%),smp. 212-213°C, [α]β = +7/6° (ο=1, i dimethylformamid).

b) H-Asn(Mbh)-Tyr(Bu^)-OH

5 Gennem en opløsning af 87,5 g (0,123 mol) Z-Asn(Mbh)- -Tyr-(But)-OH i iseddike, der tilsættes noget Pd(OH)2/BaSO^--katalysator, tilledes der hydrogen, indtil der ikke mere kan fastslås nogen CO2-udvikling. Der koncentreres, og remanensen sammenrives grundigt med en mættet natriumacetatopløs-10 ning. Der fraskilles ved sugning, tørres over phosphorpent-oxid og udfældes fra tetrahydrofuran/petroleumsether. Udbyttet er 63,5 g (90%), smp. 207-209°C, [a]D = +11,1° (c = 1, i iseddike).

c) Z-Glu (0Bu*~) -Asn (Mbh) -Tyr (But) -OH

15 Til en opløsning af 63 g (0,109 mol) H-Asn(Mbh)-Tyr- +· (Bu )-OH i 250 ml dimethylformamid sættes ved stuetemperatur 47,4 g (0,109 mol) Z-Glu(OBu^)-OSu, og der henstilles i 20 timer ved stuetemperatur. Derpå udfældes stoffet med vand, tørres over phosphorpentoxid og omfældes fra eddikesyreester/-20 petroleumsether. Udbyttet 75,5 g (77%), smp. 166-170°C, [a)D = +1,8° (c = 1, i dimethylformamid).

d) H-Glu (Obu1') -Asn (Mbh) -Tyr (Bu1') -OH

74,7 g (83,3 mmol) Z-Glu(OBut)-Asn(Mbh)-Tyr(But)-OH opløses i en blanding af 400 ml iseddike og 400 ml methanol 25 og hydrogeneres katalytisk som under b) og oparbejdes. Til rensning opkoges stoffet 1 gang med vand, fraskilles ved sugning og tørres. Ved opkogning med eddikesyreester kan stoffet renses yderligere. Udbyttet er 53,4 g (84%), smp. 221-223°C, [a]D = +33,1° (c = 1, i iseddike).

30

Eksempel 7

Syntese af Z-Gln-Gly-Leu-Val-NH2 (Sekvens fra Secretin) a) Z-Leu-Val-NH2 35 Til en opløsning af 13 g HBr,H-Val-NH2 (66 mmol) i 180 ml dimethylformamid sættes 8,91 g 1-hydroxybenzotriazol,

O

21 145715 8,6 ml N-ethylmorpholin og 30,8 g (60 mmol) Z-Leu-OPcp. Der omrøres i 10 minutter ved stuetemperatur og koncentreres derpå i højvakuum. Remanensen sammenrøres efter hinanden med en 2 N sodaopløsning, vand, en 2,5%'s kaliumhydrogenopløsning og 5 vand, fraskilles ved sugning og tørres ved 50°C over phosphor-pentoxid. Udbyttet er 21,3 g (98%).

Til det samme resultat når man ved anvendelse af a) 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydroquinazolin b) l-hydroxy-5,6-dimethyl-benzotriazol eller 10 c) af l-hydroxy-2-pyridon i stedet for den ovenfor anvendte 1-hydroxybenzotriazol, men ved ellers samme fremgangsmåde. Udbytte og smeltepunkt er i hvert tilfælde henholdsvis ca. 95% og ca. 236°C.

b) HCL-H-Leu-Val-NH2 15 Til en suspension af 21 g (57,8 mmol) Z-Leu-Val-NH2 i en blanding af 200 ml dimethylformamid og 200 ml methanol sættes en Pd(OH)2/BaS04-katalysator. Under omrøring ledes der gennem denne reaktionsblanding hydrogen, hvorved pH-værdien holdes på 5 ved tildrypning af en 1 N methanolisk hydrogenchlorid-20 opløsning ved hjælp af en autotitrator. Efter at der ikke optages mere hydrogenchloridopløsning, fraskilles katalysatoren ved sugning, og filtratet koncentreres. Remanensen sammenrives med ether, fraskilles ved sugning og tørres ved 50°C. Udbyttet er 15,4 g (100%), og smeltepunktet er 138-140°C. Stoffet er 25 tyndtlagschromatografisk ensartet.

c) Z-Gly-Leu-Val-NH2 15,4 g (57,8 mmol) Hcl,H-Leu-Val-NH2 opløses med 7,52 ml N-ethylmorpholin og 7,88 g 1-hydroxybenzotriazol i 120 ml di-methylformamid. Hertil sættes 22,5 g Z-Gly-0Tcp, blandingen hen-30 stilles i 5 minutter og koncentreres i højvakuum. Remanensen sammenrives med en 2 N sodaopløsning, fraskilles ved sugning og vaskes godt med vand. Der tørres over phosphorpentoxid, og opkoges derpå med eddikesyreester. Til rensning kan der omfældes fra tetrahydrofuran/petroleumsether. Udbyttet er 21,8 g 35 (90%), smp. 184-186°C, [a]^ = -12,8° (c = 1, i dimethylacetamid).

O

22 145715 d) HC1,H-Gly-Leu-Val-NHj 20,0 g (47,6 mmol) Z-Gly-Leu-Val-NH2 hydrogeneres katalytisk og oparbejdes som under b) i en 200 ml methanol/di-methylformamid-blanding (1:1). Stoffet er noget hygroskopisk 5 og omfældes til rensning fra methanol/ether. Der tørres over phosphorpentoxid og paraffinspåner. Udbyttet er 13,5 g (88%), smp. 209-211°C.

e) Z-Gln-Gly-Leu-Val-NH2

Til en opløsning af 3,23 g (10 mmol) HCl,H-Gly-Leu-Val-10 -NH2, 1,3 ml N-ethylmorpholin og 1,35 g (10 mmol) 1-hydroxyben-zotriazol i 20 ml dimethylformamid sættes 4 g (10 mmol) Z-Gln-—ONp, og blandingen henstilles i 10 minutter. Der udfældes en gele. Der fortyndes med ether, og det udfældede stof fraskilles ved sugning. Nu tørres der i kort tid og sammenrøres med 15 en 2 N sodaopløsning. Der vaskes med vand, en kaliumhydrogen-sulfatopløsning og vand, og tørres over phosphorpentoxid og opkoges med eddikesyreester. Blandingen henstilles til afkøling ved stuetemperatur, frasuges og vaskes med eddikesyreester og petroleumsether. Der tørres ved 40-50°C over phos-20 phorpentoxid og paraffinspåner. Udbyttet er 5 g (91%), smp. 242-244°C. [a]22 = -25,2° (c = 1, i iseddike).

Samme resultat opnås ved anvendelse af a) 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydroquinazolin b) l-hydroxy-5,6-dimethyl-benzotriazol eller 25 c) af l-hydroxy-2-pyridon i stedet for den ovenfor anvendte 1-hydroxybenzotriazol, men ved ellers samme fremgangsmåde.

Udbytte og smeltepunkt er i hvert tilfælde henholdsvis ca.

90% og 242-244°C.

30 Eksempel 8

Syntese af Z-Pro-Ile-Gly-NH2 a) Z-Ile-Gly-NH2 44,4 g (0,1 mol) Z-Ile-0Tcp og 11 g (0,1 mol) HC1,H--Gly-NH2 opløses sammen med 1,6 g (10 mmol) 3-hydroxy-4-oxo-35 -3,4-dihydroquinazolin og 130 ml N-ethylmorpholin i 700-800 ml

14571S

O

23 dimethylformamid. Derpå koncentreres der i højvakuum, og remanensen sammenrives med en natriumbicarbonatopløsning, fraskilles ved sugning, vaskes med vand, tørres og opløses til yderligere rensning i dimethylformamid og fældes med en blan-5 ding af ether/petroleumsether (1:1). Udbyttet er 28,5 g, smp.

202°C, [a]Q = +8,1° (c = 1, dimethylacetamid).

C16H23N3°4 (321'4) Beregnet C 59,80 H 7,21 N 13,08

Fundet 59,6 7,2 12,8 b) Z-Pro-Ile-Gly-NH2 10 Til en opløsning af 20 g (62,2 mmol) Z-Ile-Gly-NH2 i 600 ml methanol/dimethylformamid (3:1) sættes lidt Pd(0H)2/-BaSO^-katalysator. Under omrøring ledes der hydrogen gennem denne reaktionsblanding, hvorved pH-værdien holdes på 4,5 ved tildrypning af 1 N methanolisk hydrogenchlorid ved hjælp af 15 en autotitrator. Efter at der ikke optages mere hydrogenchlo-ridopløsning, fraskilles katalysatoren ved sugning, og filtratet koncentreres. Remanensen opløses i 100 ml dimethylformamid. Hertil sættes 23 g (62 mmol) Z-Pro-ONp, 8,1 ml N-ethyl-morpholin og 1,5 g (9,4 mmol) 3-hydroxy-4-oxo-3,4~dihydroquin-20 azolin. Der omrøres i 15 minutter og koncentreres derpå i højvakuum. Remanensen optages med eddikesyreester og afkøles.

Der udfældes et bundfald, der fraskilles ved sugning og efter hinanden sammenrives med en natriumbicarbonatopløsning, 2 N saltsyre og vand. Nu tørres der og sammenrives til yderligere 25 rensning omhyggeligt med eddikesyreester, fraskilles ved sugning og tørres. Udbyttet er 20,7 g (80%), smp. 182-184°C, [a]D = -63,2° (c = 1, methanol).

Til det samme resultat når man ved anvendelse af a) l-hydroxy-4-methyl-2-pyridon 30 b) l-hydroxy-6-methoxy-benzotriazol eller c) l-hydroxy-5-methyl-benzotriazol for det ovenfor anvendte quinazolinderivat, men ved ellers samme fremgangsmåde. Udbyttet er i hvert tilfælde ca. 90%, og smeltepunktet er uforandret 182-184°C.

35 o 24 145715

Eksempel 9 t t t

Syntese af Z-Asp(OBu ) -Phe-Val-Gln-Trp-I.eu-Ile-Asn-Thr (Bu )-OBu I. Fremstilling af udgangsstoffet ΟΗ,ΟΟΟΗ,Η-Ρίιε-νηΙ-ΟΙη-ΤΓρ-ΕΒη- -Ile-Asn-Thr (Bu^) -OBu** 5 a) Z-Asn-Thr (Bu^) -OB^ 42,85 g (161 mmol) Z-Asn-OH, 43 g (161 mmol) olieagtig t t HCl,H-Thr(Bu )-OBu (fremstillet ved katalytisk hydrogenering t t af Z-Thr(Bu )-OBu under tilsætning af methanolisk saltsyre ved en pH-værdi på 4,5), og 21,75 g (161 mmol) 1-hydroxybenzotria-10 zol opløses i 325 ml dimethylformamid. Hertil sættes 21 ml N- -ethylmorpholin og ved 0°C en kold opløsning af 35,45 g dicyclo-hexylcarbodiimid i 80 ml dimethylformamid. Blandingen omrøres i 1 time ved 0°C og i 1 time ved stuetemperatur, bundfaldet fraskilles ved sugning, og filtratet koncentreres i højvakuum.

15 Remanensen fordeles mellem eddikesyreester og en natriumhydro-gencarbonatopløsning. Den organiske fase udrystes med en 2,5%'s kaliumhydrogensulfatopløsning, en mættet natriumhydrogenopløs-ning og vand, tørres med natriumsulfat og koncentreres. Der sammenrives med petroleumsether og fraskilles ved sugning. Ud-20 byttet ér 65,8 g, og smeltepunktet er 110-115°C. Der omkrystalliseres fra eddikesyreester/petroleumsether. Udbyttet er 52,4 g (68%), smp. 120-122°C, [a]£° = -7,6° (c = 1, methanol). b) HCl-H-Asn-Thr(BU^)-0But

Til en opløsning af 44,7 g (93,2 mmol) Z-Asn-Thr(Bufc)-25 -0But i 300 ml methanol sættes noget Pd(0H)2/BaS04-katalysator. Under omrøring ledes der hydrogen gennem denne reaktionsblanding, hvorved pH-værdien holdes på 4,5 ved tildrypning af 1 N methanolisk saltsyre ved hjælp af en autotitrator. Efter at der ikke optages mere hydrogenchloridopløsning, fraskilles ka-30 talysatoren ved sugning, og filtratet koncentreres. Remanensen opløses i ether, filtreres fra lidt uopløste bestanddele og henstilles natten over i køleskab.

På andendagen fraskilles det udfældede bundfald ved sugning og vaskes med vand. Udbyttet er 33,65 g (95,6%), smp.

35 110-113°C, [a]^° = -2,6° (c = 1, methanol).

O

25 145715 C16H32N3°5C1 (382) Bere9net c 50,32 H 8,45 N 11,01

Fundet 50,0 9,0 10,9.

c) Z-Ile-Asn-Thr- (Βύ^) -OBu11

Til en opløsning af 21,8 g (82 xnmol) Z-Ile-OH, 31,3 g 5 (82 mmol) HC1 ,H-Asn-Thr (Bu11)-OBu11, 11,1 g 1-hydroxybenzotria- zol og 10,7 ml N-ethylmorpholin i 150 ml dimethylformamid sættes ved 0°C en kold opløsning af 18,1 g dicyclohexylcarbodi-imid i 70 ml dimethylformamid. Der omrøres i 1 time ved 0°C og i 1 time ved stuetemperatur, bundfaldet fraskilles ved 10 sugning, og filtratet koncentreres. Der oparbejdes som under a). Det fremkomne produkt opløses i 150 ml eddikesyreester, filtreres fra uopløste bestanddele og irøres i 750 ml petro-leumsether. Udbyttet er 42,37 g (87%), smp. 144-146°C, [a]20 = -20,5°C (c = 1, methanol).

15 C30H48N4°8 (592/75) Beregnet C 60,82 H 8,15 N 9,46

Fundet 60,9 8,4 9,2.

d) HCl,H-Ile-Asn-Thr(But)-OBut 38,6 g (65,2 mmol) Z-Ile-Asn-Thr (Bu11) -OBu11 hydrogeneres katalytisk som under b) i methanol. Stoffet er opløseligt 20 i ether og giver i højvakuum et amorft produkt. Udbyttet er 33,2 g (100%), [a]30 = +5,9° (c = 1, methanol).

C22H43C1N4°6 (495'07) Beregnet C 53,37 H 8,76 N 11,31

Fundet 53,0 9,0 10,9.

e) Z-Leu-Ile-Asn-Thr (Bu11) -OBu*1 25 Til en opløsning af 16,4 g (61,8 mmol) Z-Leu-OH, 30,6 g (61,8 mmol) HC1,H-Ile-Asn-Thr (Bu11) -OBu11, 8,34 g 1-hydroxyben-zotriazol og 8,1 ml N-ethylmorpholin i 150 ml dimethylformamid sættes ved 0°C en kold opløsning af 13,6 g dicyclohexyl-carbodiimid i 60 ml dimethylformamid. Der omrøres i 1 time ved 30 o°C og i 1 time ved stuetemperatur og oparbejdes som under a). Stoffet sammenrives med petroleumsether og fraskilles ved sugning. Udbyttet er 39,3 g, og smeltepunktet er 173-176°C. Der omfældes fra eddikesyreester/petroleumsether. Udbyttet er 37,5 g (86%), smp. 173-176°C, [a]30 = -34,3° (c = 1, methanol).

35 C36H59N5°9 (7o5'9) Beregnet C 61,26 H 8,42 N 9,92

Fundet 61,4 8,7 9,9.

o 26 145715 f) HCl ,H—Leu-Ile-Asn-Thr (Bufc) -OB^ 35.2 g (50 mmol) Z-Leu-Ile-Asn-Thr (Bu*^-OBu11 hydrogeneres katalytisk i methanol som under b). Stoffet krystalliserer ved sammenrivning med ether. Udbyttet er 28,5 g (94%), 5 smp. 192-193°C sønderdeling, [a]= -17,9° (c = 1, methanol). C28H54C1:N507 i608'2) Beregnet C 55,26 H 8,96 N 11,51

Fundet 55,3 9,0 11,4.

g) Z-Trp-Leu-Ile-Asn-Thr (BU^) -OBu^

Til en opløsning af 26,2 g (43,1 mmol) Hel,H-Leu-Ile-10 -Asn-Thr(Bu*") -OBu^", 14,6 g (43,1 mmol) Z-Trp-OH, 5,82 g 1-hy- droxybenzotriazol og 5,6 ml N-ethylmorpholin i 150 ml dime-thylformamid sættes ved 0°C en kold opløsning af 9,5 g dicy-clohexylcarbodiimid i 60 ml dimethylformamid. Der omrøres i 1 time ved 0°C og i 1 time ved stuetemperatur. Bundfaldet 15 fraskilles ved sugning, og filtratet koncentreres. Remanensen sammenrives med en natriumhydrogencarbonatopløsning og fraskilles ved sugning og tørres. Der omkrystalliseres fra iso-propanol. Udbyttet er 33,8 g (88%), smp. 228-229°C,[a]^° = -39,5° (c = 1, methanol).

20 C47H69N7°10 C892'1) Beregnet C 63,28 H 7,79 N 10,99

Fundet 63,0 7,8 10,7.

h) HCl,Η-Trp-Leu-Ile-Asn-Thr(Bu^)-OBu1 t t 31.2 g (35 mmol) Z-Trp-Leu-Ile-Asn-Thr(Bu )-0Bu hydrogeneres katalytisk i 200 ml dimethylformamid/methanol (1:1) 25 som under b). Remanensen sammenrives med ether. Udbyttet er 27,2 g (98%) , og smeltepunktet er 215°C under sønderdeling.

[a]p° = -28,0° (c = 1, methanol).

En prøve omfældes fra methanol/ether, hvorved smeltepunktet andrager 217°C under sønderdeling, [a]^ = -28,4°C 30 (c = 1, methanol) .

C39H64W70gCl (794,45) Beregnet C 58,97 H 8,12 N 12,34

Fundet 57,2 8,2 11,8.

i) Z-Phe-Val-OH

10,7 g Z-Phe-Val-Ome opløses i 200 ml dioxan/vand 35 (68:2). Der titreres med i alt 27 ml 1 N natriumhydroxid

O

27 145715 mod thymolphthalein. Der neutraliseres med 2 N saltsyre, og opløsningen koncentreres. Remanensen fordeles mellem eddikesyreester og 2 N saltsyre. Eddikesyreesterfasen vaskes med vand, tørres med natriumsulfat og koncentreres. Remanensen 5 sammenrives med ether og fraskilles ved sugning. Udbyttet er 9,45 g (92%), og smeltepunktet er 148-149°C. Der omfældes fra eddikesyreester/petroleumsether, hvorved udbyttet andrager 9,2 g, og smeltepunktet andrager 148-150°C, [a]^0 = ”8,8° (c = 1, methanol).

10 C22H26N2°5 (398'5) Beregnet C 66,32 H 6,58 N 7,02

Fundet 66,6 6,7 7,2.

k) Z-Phe-Val-Gln-OBut

Til en opløsning af 8,0 g (20 mmol) Z-Phe-Val-OH, 4,8 g HCl,H-Gln-OBu^, 2,7 g 1-hydroxybenzotriazol og 2,6 ml N-ethyl-15 morpholin i 40 ml dimethylformamid sættes ved 0°C en kold opløsning af 4,2 g dicyclohexylcarbodiimid. Der omrøres i 1 time ved 0°C og i 1 time ved stuetemperatur, Bundfaldet fraskilles ved sugning, og filtratet koncentreres. Remanensen sammenrives med en natriumhydrogencarbonatopløsning, fraskilles ved sug-20 ning og vaskes med vand. Udbyttet andrager 11,65 g (100%), og smeltepunktet andrager 219-221°C under sønderdeling, [a]^ = -35,7° (c = 1, methanol).

C31H42N4°7 (582'7) Beregnet C 63,91 H 7,27 N 9,60

Fundet 64,2 7,7 9,7.

25 1) Z-Phe-Val-Gln-OH

11,1 g (19 mmol) Z-Phe-Val-Gln-OBu*" opløses i trifluor-eddikesyre. Efter 30 minutter ved stuetemperatur koncentreres der, og remanensen sammenrives med ether og fraskilles ved sugning. Produktet opkoges til yderligere rensning i eddikesyre-30 ester, der tilsættes petroleumsether, fraskilles ved sugning og tørres. Udbyttet er 8,45 g (85%), smp. 225-227°C, [a]^5 = -10,7° (c = 1, dimethylacetamid).

C27H34N40? (526,6) Beregnet C 61,59 H 6,51 N 10,64

Fundet 61,6 6,7 10,4.

35

O

28 145715 m) Z-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Asn-Thr(Bu^)-OBu^

Til en opløsning af 7,95 g (10 mmol) HC1,H-Trp-Leu-11 e --Asn-Thr (Bu^) -OBu*" og 5,27 g (10 mmol) Z-Phe-Val-Gln-OH i 100 ml dimethylformamid sættes 1,3 ml N-ethylmorpholin, 1,35 g 5 1-hydroxybenzotriazol og ved 0°C under omrøring en kold opløsning af 2,2 g dicyclohexylcarbodiimid i 20 ml dimethylformamid.

Der omrøres i 1 time ved 0°C og i 1 time ved stuetemperatur. Bundfaldet fraskilles ved sugning, og filtratet koncentreres. Remanensen sammenrives med natriumhydrogencarbonatopløsning og 10 fraskilles ved sugning. Filterremanensen opkoges med 1 liter ethanol. Der fås en tungt opløselig remanens på 5,6 g og med et smeltepunkt på 253-255°C under sønderdeling, [a]^ = -15,3° (c = 1, dimethylacetamid). Fra alkohol udkrystalliserer yderligere 2,8 g med et smp. på 251-254°C under sønderdeling. Det 15 samlede udbytte andrager 8,4 g (66,5%).

C66H95N11°14 t1266'6) Beregnet C 62,6 H 7,56 N 12,16

Fundet 62,2 7,9 11,9.

n) CHgCOOI^H-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Asn-Thr (Bu*") -OBu1"

Gennem en opløsning af 7,6 g (6 mmol) Z-Phe-Val-Gln-t t 20 -Trp-Leu-Ile-Asn-Thr(Bu )-0Bu i 250 ml iseddike, der er til sat lidt Pd(0H)^/BaSO^-katalysator, ledes der hydrogen, indtil der ikke udvikles mere end C02· Katalysatoren fraskilles ved sugning, filtratet koncentreres, og remanensen sammenrives med ether. Udbyttet er 7,4 g, og smeltepunktet er 247-250°C 25 under sønderdeling. Produktet opkoges med eddikesyreester og fraskilles koldt ved sugning. Udbyttet andrager nu 6,78 g (95%), og smp. 248-251°C under sønderdeling.

II. Z-Asp(OBu^)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Asn-Thr(Bu*~)-OBu^

Til en suspension af 6,32 g (5,3 mmol) CH-.C00H,H-Phe- t t 30 -Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Asn-Thr(Bu )-OBu i 150 ml dimethylformamid sættes 0,86 g (5,3 mmol) 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-quinazolin og 2,66 g (5,3 mmol) Z-Asp(OBu^)-OTcp. Efter omrøring i 5 minutter koncentreres der, og remanensen sammenrives med en 2 N sodaopløsning, fraskilles ved sugning og vaskes 35 med vand. Filterremanensen udkoges med ethanol. Der fås en·

O

29 145715 tungt opløselig remanens på 5,3 g med et smeltepunkt på 246-248°C under sønderdeling. Fra filtratet fås 0,5 g med o 25 et smeltepunkt på 244-246 C under sønderdeling, [a]^ = -15,0° (c = 1, dimethylacetamid). Samlet udbytte 5,8 g 5 (76,4£).

C74H108N12°17 (1437'7) Beregnet C 61,8 H 7,57 N 11,69

Fundet 61,1 7,6 11,7.

Til samme resultat når man ved anvendelse af a) l-hydroxy-4-methyl-2-pyridon, 10 b) l-hydroxy-6-methoxy-benzotriazol eller c) l-hydroxy-5-methyl-benzotriazol i stedet for det ovenfor anvendte quinazolinderivat, men ved ellers samme fremgangsmåde. Udbyttet er i hvert tilfælde 75-78%, og smeltepunktet er uforandret 224-246°C.

15

Eksempel 10 Z-Tyr-pro insulin,,- (31-63) -triacontatripeptid 40 mg (10 mmol) triacontatripeptid-trifluoracetat, fremstillet ifølge Z. Naturforsch. 24 b (1969), side 999, omsættes 20 i 1,8 ml 90%' s dimethylformamid med 26 mg (60 mmol) Z-Tyr-0Np 1 nærværelse af 1,35 mg (10 jimol) 1-hydroxybenzotriazol. Efter 15 minutters forløb udfældes der med ether, og bundfaldet fraskilles ved filtrering. Efter vask med ether og methylen-chlorid fås 36 mg reaktionsprodukt. Tyrosinindhold ifølge ami- 25 nosyreanalyse for tyrosin: 1,1 mol ækvivalent. R^: 0,72 i n-bu-tanol/pyridin/eddikesyreester/vand (30:6:20:24), papirchroma-tografi, opstigende. R^-værdi af triacontapeptid: 0,22.

Eksempel 11 30 N(B1)-(Boc-Leu-Phe)-N(Al),N(B29)-Bis-Boc-insulin 120 mg Boc2~insulin (20 pmol), fremstillet efter Hoppe--Seyler's Z. physiol. Chem. 352 (1971), side 7, tilsættes i 2 ml dimethylformamid 16,7 mg (30 pmol) Boc-Leu-Phe-OTcp og 2,7 mg (20 pmol) 1-hydroxybenzotriazol. Der omrøres i 10 mi- 35 nutter ved stuetemperatur, fældes med ether, bundfaldet fra- 0 30 145715 skilles ved sugning og vaskes med ether. Udbyttet er 117 mg. Aminosyreanalyse: Leu Beregnet 7, fundet 6,98

Phe Beregnet 4, fundet 3,96.

Vandringsstrækning ved papirelektrophorese ved pH-vær-5 di på 2,2: 0,76 x insulin (B0C2-insulin: 0,84 x insulin).

Efter fraspaltning af beskyttelsesgrupperne med 1 times behandling med trifluoreddikesyre og udfældning med ether vandrer forbindelsen ved papirelektrophorese lige som insulin. Reaktionstiden uden tilsætning af 1-hydroxybenzotriazol 10 andrager 3 timer og fører til delvis tværbinding.

Til samme resultat når man ved anvendelse af a) l-hydroxy-4-methyl-2-pyridon, b) l-hydroxy-6-methoxy-benzotriazol eller c) l-hydroxy-6-methyl-benzotriazol 15 i stedet for det ovenfor anvendte 1-hydroxybenzotriazol, men ved ellers samme fremgangsmåde. Aminosyreanalysen er i hvert tilfælde identisk indenfor fejlgrænserne.

Eksempel 12 20 Boc-gAla-Tyr-Ser-Met-Glu(0But)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-OH,4Hn0 — 2.— 5,36 g (4 mmol) H-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu )-His-Phe-Arg--Trp-Gly-0H,4H20, fremstillet ifølge Liebigs Ann. Chem. 726 (1969), side 183, omsættes i 50 ml dimethylformamid med 1,84 g (5 mmol) Βοο-β-Ala-OTcp i nærværelse af 540 mg (4 mmol) 1-hy-25 droxybenzotriazol. Efter 15 minutters forløb udfældes der med eddikesyre/ether (1:1) 5,65 g (94%) af et næsten chromatogra-fisk rent reaktionsprodukt, der til fuldstændig rensning omkrystalliseres fra 200 ml 60%'s methanol. Udbyttet er 4,92 g (81%). Forbindelsen er identisk med den efter ovennævnte lit-30 teratursted fremstillede forbindelse uden tilsætning af 1-hydroxybenzotriazol, men reaktionstiden forkortes fra 20 timer til 15 minutter.

U571B

o 31

Eksempel 13 „ (al, £15 ,£26 ,£41,6.46) . ,T . ........

N ’_' ' ' -penta- (Leu-Phe) -trypsin-kallikrem- inhlbitor 90 mg trypsin-kallikrein-inhibitor fra okseorganer 5 (jfr. Hoppe-Seyler1 s Z. Physiol. Chem. 350 (1969), side 1531) suspenderes i 2 ml dimethylformamid. Hertil sættes 56 mg Boc--Leu-Phe-OTcp og 13 mg 1-hydroxybenzotriazol. Nu tilsættes der under omrøring vand (i alt 0,51 ml), til alt er gået i opløsning. Der omrøres i yderligere 15 minutter, koncentre-10 res i højvakuum, og remanensen sammenrives med absolut tetra-hydrofuran. Bundfaldet fraskilles ved sugning og tørres. Udbyttet er 110 mg.

95,7 mg af stoffet opløses i 2 ml trifluoreddikesyre. Blandingen henstilles i 30 minutter ved stuetemperatur, kon-15 centreres, og remanensen fordeles mellem vand og ether, den vandige fase sammenrøres med "Amberlite IR 45" ® (acetatform) og frysetørres. Udbyttet er 86 mg.

Aminosyreanalyse: Leu, beregnet 7, fundet 7,3

Phe, beregnet 9, fundet 9,2 20

Eksempel 14

Syntese af H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-OH (insulin A 1-5) I. Fremgangsmåde ifølge fast-fase-peptidsyntesemetoden under anvendelse af 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydroquinazolin 25 a) Nps-Gln(Mbh)-polymerforbindelse

En opløsning af 12,3 g Nps-Gln(Mbh)-OH og 3,2 ml tri-ethylamin i 60 ml dimethylformamid sættes til 20 g af en efter Merrifield, Biochemistry 3 (1964) , side 1358 chlormethy-leret, med 2% divinylbenzen tværbundet polystyrenharpiks,der 30 har et chlorindhold på 1,15 milliækvivalent/g. Blandingen omrystes i 48 timer ved 80°C og filtreres derpå, og harpiksen vaskes med dimethylformamid, ethanol og methanol flere gange. Udbyttet er efter tørring i vakuum ved 80°C over phosphorpent-oxid 19,3 g. Aminosyreindholdet af den således fremkomne acyl-35 aminosyrekunstharpiksforbindelse andrager 1,15 mmol/g.

O

32 145715 b) Boc-Gly-Ile-Val-Glu(OBzl)-Gin(Mbh)-polymerforbindelse 6 g Nps-Gln(Mbh)-kunstharpiksforbindelse underkastes i en reaktionsbeholder med en glasfritte ifølge Merrifield (jfr. ovenfor) følgende reaktionscyclus: 5 b^: Vask med tre 50 ml portioner eddikesyre.

b2: Fraspaltning af N-beskyttelsesgrupperne ved 1/2 times omrystning med en 1 N opløsning af vandfri hydrogenchlo-rid i eddikesyre, og filtrering, bg· Vask med iseddike som beskrevet under b^.

10 b^: Tre gange vask med hver gang 50 ml ethanol.

bcji Tre gange vask med hver gang 50 ml dimethylformamid. bg: Neutralisation af de ved frigørelsen af a-aminogrupper-ne i harpiksen tilstedeværende hydrochloridgrupper ved 10 minutters omrystning med 50 ml af en 10%1s opløsning 15 af triethylamin i dimethyl formamid.

b^: Fornyet vask med dimethylformamid som beskrevet under bg. bg: Tilsætning til dimethylformamidopløsningen af 3,6 mmol af den tilsvarende Boc-aminosyretrichlorphenylester i 40 ml . dimethylformamid sammen med 0,57 g (3,6 mmol) 3-hydroxy-20 -4-OXO-3,4-dihydroquinazolin, der derpå omrystes i 2 ti mer og filtreres.

bg: Vask med dimethylformamid som beskrevet under bg. bio* Vask med absolut ethanol som beskrevet under b^.

25 De ovenfor beskrevne vaskeoperationer varer hver gang 3 minutter. Derpå fjernes opløsningsmidlet ved trykfiltrering (trykluft 0,3 ato) gennem reaktionsbeholderens glasfritte.

Til tilføjelse af en aminosyre gennemføres hver gang 30 den ovenfor beskrevne cyclus b^-b^Q én gang. Herved anvendes efter hinanden følgende Boc-aminosyre-2,4,5-trichlorphenyl-ester hver gang i trin bg af det beskrevne skema: Boc-Glu-(OBzl)-OTcp, Boc-Val-OTcp, Βοσ-Ile-OTcp og Boc-Gly-OTcp.

Udbytte af Boc-Gly-Ile-Val-Glu(OBzl)-Gin(Mbh)-polymer-35 forbindelse efter tørring over phosphorpentoxid i højvakuum o 33 145715 ved 80°C er 5,3 g med et peptidindhold på 8,2% (bestemt ved sur hydrolyse og kvantitativ aminosyrebestemmelse). c) Frigørelse af peptidet 3 g af den ifølge b) fremstillede acylpeptidpolymer-5 forbindelse suspenderes i den beskrevne reaktionsbeholder i 20 ml vandfrit trifluoreddikesyre, hvorpå der i 90 minutter under udelukkelse af fugtighed tilledes en langsom strøm vandfri hydrogenbromidsyre fra neden gennem glasfritten i beholderen og gennem suspensionen, der befinder sig her over. Her-10 på filtreres suspensionen og harpiksen vaskes tre gange med hver gang 10 ml trifluoreddikesyre. De forenede trifluored-dikesyrefiltrater og vaskeopløsningerne koncentreres i vakuum, og remanensen digereres to gange under dekantering med hver gang 50 ml absolut ether. Tørringen i højvakuum over 15 phosphorpentoxid giver 396 mg, smp. fra 225°C under sønderde-ling, [alp = -51,4° (c = 0,25, vand). Fra 200 mg af dette råprodukt fås der ved fordelingschromatografi på "Sephadex LH 20" ® i opløsningssystemet butanol/eddikesyre/vand (2:1:10)

114 mg af et farveløst amorft stof med et smeltepunkt på 240°C

22 q 20 under sønderdeling, [a]D = -71,4 (c = 0,25, vand).

Aminosyreanalysen fremgår af tabel IV.

II. Fremstillingsmetode efter fastfasé-peptidsyntesemetoden uden tilsætning af 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydroquinazolin

Ved dette kontrolforsøg var den samlede fremgangsmåde 25 kvalitativt og kvantitativt identisk med fremgangsmåden beskrevet under I, men tilsætningen af 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihy-droquinazolin ifølge trin bg foretoges ikke. I enkeltheder opnås ved dette sammenligningsforsøg følgende resultater: Råudbytte 420 mg, smp. under sønderdeling fra 96°C, [a]= -27° 30 (c = 0,25, vand). Ved fordelingschromatografi på "Sephadex LH 20" ® isoleredes der fra 206 mg af råproduktet kun 84 mg af et produkt med de fysiske data: Smeltepunkt under sønderdeling fra 165°C og [a]^ = -34,9°,(c = 0,25, vand). Det var ikke tyndtlagschromatografisk ensartet. Aminosyreanalysen 35 fremgår af tabel IV.

o 34 145715 III. Fremstilling ifølge konventionelle metoder

a) Boc-Gly-Ile-OH,CHA

Til en opløsning af 35 g (0,2 mol) Boc-Gly-OH, 38,4 g (0,2 mol) HCl,H-Ile-OMe og 27 g (0,2 mol) 1-hydroxybenzotria-5 zol i 350 ml dimethylformamid sættes 26 ml N-ethylmorpholin og ved 0°C en opløsning af 44 g dicyclohexylcarbodiimid i 50 ml iskold dimethylformamid. Der omrøres i 1 time ved 0 C og i 1 time ved stuetemperatur, bundfaldet fraskilles ved sugning, og filtratet koncentreres. Remanensen fordeles mel-10 lem eddikesyreester og natriumbicarbonatopløsning. Eddike- syreesterfasen udrystes med en kaliumhydrogensulfatopløsning, en natriumhydrogensulfatopløsning og vand, tørres med natriumsulfat og koncentreres. Udbyttet er 61,1 g olie. Olien opløses i eddikesyreester og chromatograferes over en søjle af 15 185 g basisk Al20g (Woelm, aktivitetstrin I). Eddikesyre- estereluatet koncentreres. Udbyttet er 55,8 g.

Den ovenfor udvundne olie opløses i 250 ml af en blanding af dioxan og vand (8:2), og der tilsættes lidt thymol-phthalein. Nu titreres der med en 1 N natriumhydroxidopløs-20 ning, indtil opløsningen forbliver blå i længere tidsrum.

Der forbruges 179 ml 1 N natriumhydroxidopløsning. Derpå neutraliseres der med en kaliumhydrogensulfatopløsning, og reaktionsblandingen koncentreres . Remanensen opløses nu i vand.

Der belægges med eddikesyreester og ved isafkøling gøres der 25 sur med 2 N svovlsyre til en pH-værdi på 2-3 og omrøres godt. Eddikesyreesterfasen fraskilles, vaskes 1 gang med vand, tørres over natriumsulfat og koncentreres. Remanensen opløses i ether, og der tilsættes cyclohexylamin til basisk reaktion. Blandingen anbringes i is, der fraskilles ved sugning, va-30 skes med ether og tørres. Udbyttet andrager 55,6 g (71,8%), og smeltepunktet andrager 198-200°C.

Til yderligere rensning opløses stoffet i 100 ml methanol og irøres i 1,5 ml ether og afkøles. Efter 1 times forløb fraskilles ved sugning. Udbyttet er 45,5 g (59%), smp-35 204-205°C, [a]22 = +17,4° (c * 1, methanol).

O

35 145715

b) Z-Val-Glu(OBut)-Gln(Mbh)-OH

65,2 g (81 mmol) af den ifølge Chem. Ber. 103 (1970), side 2038 fremstillede Z-Val-GluiOBu1") -Gin (Mbh)-OMe suspenderes i ca. 400 ml dioxan/vand (8:2) og titreres med 1 N natrium-5 hydroxidopløsning mod thymolphthalein som indikator. Efter at opløsningen i længere tid er forblevet blå, gøres den sur med en kaliumhydrogensulfatopløsning, og bundfaldet fraskilles ved sugning. Filterremanensen opkoges med acetone, fraskilles ved sugning og omfældes fra dimethylformamid/vand. Ud-10 byttet er 59 g (92%) , smp. 216-218°C.

C42H54N4°11 (790'9) Beregnet C 63,72 H 6,85 N 7,05

Fundet 63,3 7,1 8,1.

c) H-Val-Glu(0But)-Gin(Mbh)-OH

Gennem en suspension af 52 g (65,7 mmol) Z-Val-Glu-15 -(0But)-Gin(Mbh)-OH og noget Pd/BaS04-katalysator i 500 ml iseddike ledes der hydrogen, indtil der ikke mere undviger C02· Katalysatoren fraskilles nu ved sugning, og filtratet koncentreres. Remanensen sammenrives med ether og fraskilles ved sugning. Bundfaldet omrøres med en mættet natriumacetat-20 opløsning i ca. 5 timer, fraskilles ved sugning og tørres.

Til slut udkoges der endnu en gang med methanol. Udbyttet er 27 g (62,6%), smp. 226-228°C, [a]22 = +9,0° (c = 1, iseddike) .

C34H48N4°9 (656,8) Beregnet C 62,20 H 7,35 N 8,53 25 Fundet 61,4 7,3 8,5.

d) Boc-Gly-Ile-Val-Glu (OBu^ -Gin (Mbh) -OH

7,8 g (20 mmol) Boc-Gly-Ile-0H,CHA omrøres ved 0°C med 100 ml ether og 40 ml 2 N citronsyre. Den etheriske fase fraskilles, vaskes med vand, tørres med natriumsulfat og koncen-30 treres. Udbyttet andrager 4,6 g olie. Til en opløsning af 3,9 g af det ovenfor udvundne olieagtige stof (Boc-Gly-Ile-0H) i 35 ml dimethylacetamid sættes 2,09 g 3-hydroxy-4-oxo-3,4--dihydro-1,2,3-benzotriazin og ved 0°C 2,76 g dicyclohexyl-carbodiimid. Der omrøres i 1 time ved 0°C og i 1 time ved t 35 stuetemperatur. Det udfældede bundfald fraskilles ved sug-

O

36 145715 ning og vaskes med lidt dimethylacetamid. Til filtratet sættes nu 5,85 g fint formalet H-Val-Glu(OBu*") -Gin(Mbh) -OH, og der omrøres i 5 timer ved stuetemperatur. Herved udfældes et tykt bundfald. Blandingen henstilles natten over, og på 5 andendagen udfældes stoffet fuldstændigt med 300 ml vand.

Det udfældede stof fraskilles ved sugning, vaskes med vand og opkoges med 200 ml ethanol. Blandingen afkøles til stuetemperatur, og der fraskilles ved sugning. Der vaskes godt med alkohol. Udbyttet er 6,7 g (81,3%), smp. 253-255°C, 22 o 10 [a]^ = -2,1° (c = 1, dimethylacetamid).

C47H70N6013 (927,1) Beregnet C 60,90 H 7,61 N 9,07

Fundet 61,0 7,6 9,2.

e) H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-OH

200 mg Boc-Gly-Ile-Val-Glu(OBu*") -Gin(Mbh) -OH og 0,5 ml 15 anisol opløses i 5 ml trifluoreddikesyre og koges i 10 minutter under tilbagesvaling. Derpå koncentreres der, og remanensen sammenrives med ether. Nu fraskilles der ved sugning, og remanensen opløses i vand. Den vandige fase sammenrøres med "Amberlite IR 45"® (acetatform) , indtil der nås en pH-20 -værdi på 3-4. Ionbytteren fraskilles ved sugning, og filtratet klares med aktivt kul. Den klare vandige opløsning frysetørres. Udbyttet er 50 mg,[a]^ = -75° (c = 0,25, vand), og stoffet er tyndtlagschromatografisk ensartet. Aminosyre-analysen fremgår af tabel IV.

O

37 145715

IV. Tabel IV

Sammenligning af aminosyreanalyse og fysiske data af den ifølge metoderne I, II og III fremstillede H-Gly-Ile-Val--Glu-Gln-OH

5 ifølge I (fastfa- ifølge II (fastfa- ifølge III

semetode med 3- semetode som ved (konventio- -hydroxy-4-oxo- I, dog uden kata- nel metode) -3,4-dihydrogui- lysator) _nazolin)_________ 10 [0}“ (c = 0,25, vand) -71,-34,9° -75,0°

Sønderdelingspunkt fra 240°C fra 165°C fra 255°C

TL-chromatogram ensartet og iden- 3 pletter, deraf ensartet tisk med III en identisk med

15 III

Aminosyreanalyse Glu 2,6 Glu 2,74 Glu 2,2 , .._o Gly 1,0 Gly 1,0 Gly 1,0 (72 timer ved 110 C)

Val 0,9 Val 0,445 Val 0,9 _Ile 0,87_Ile 0,33_Ile 0,9 20 De i tabel IV angivne resultater viser tydéLigt overlegen heden af den her omhandlede fremgangsmåde også ved fast-fase-metoden. Efter sædvanlige metoder under anvendelse af trichlor-phenylestere uden tilsætning af de her omhandlede katalysatorer var det ikke muligt at fremstille selv et tilnærmelsesvist ens-25 artet materiale.

Fremstilling af nogle katalysatorer:

Eksempel 15 3-Hydroxy-4-methyl-2,3-dihydro-thiazol-2-thion 30 a) 5-Thioxo-6-oxa-4-thia-2-octanon

En opløsning af 185 g (2 mol) chloracetone i 300 ml me-thylenchlorid belægges med 300 ml vand. Ved 10-20°C tilsættes der under omrøring 320,5 g (2 mol) C2HJ.0-CSSK i portioner. Der efteromrøres i yderligere 2 timer ved stuetemperatur. Lagene 35 skilles, og den organiske fase vaskes endnu en gang med 100 ml Ο 38 14571 δ vand, tørres med natriumsulfat og destilleres. Kp. 92-99°C/-0,05 mm Hg, udbytte 305 g. bl5-Thioxo-6-oxa-4-thia-2-octanonoxim

Til en opløsning af 56,0 g hydroxylaminhydrochlorid i 5 400 ml methanol sættes 65,6 g natriumacetat og 137 g af den ifølge a) fremstillede 5-thioxo-6-oxa-4-thia-2-octanon. Efter omrøring i 18 timer ved stuetemperatur fjernes opløsningsmidlet i vakuum, og der sættes vand til remanensen. Der ekstra-heres med methylenchlorid, og den organiske fase tørres med 10 natriumsulfat og befries for opløsningsmiddel. Remanensen optages i diisopropylether. Ved afkøling udvindes der herfra i flere fraktioner i alt 101 g af oximet med et smeltepunkt på 64°C.

c) 3-Hydroxy-4-methyl-2,3-dihydro-thiazol-2-thion 15 Til en opløsning af 104,4 g natriumhydroxid i 200 ml vand dryppes under afkøling og god omrøring i løbet af 15 minutter 125,3 g af det ifølge b) udvundne oxim, opløst i 300 ml methylenchlorid, og der efteromrøres i yderligere 5 minutter.

Derpå tilsættes der yderligere 500 ml vand, lagene skilles, 20 den vandige fase udrystes to gange ved hver gang 100 ml hexan og gøres sluttelig sur med koncentreret saltsyre til en pH--værdi på 2. Der omrøres i 1 time på isbad. Bundfaldet fraskilles godt ved sugning og vaskes yderligere to gange grundigt med hver gang 300 ml vand. Udbyttet er 61,5 g, og smel-25 tepunktet er 90°C. Yderligere 12 g af det samme produkt kan udvindes ved ekstraktion af den vandige opløsning med methylenchlorid.

Eksempel 16 30 l-Hydroxy-4,6-dimethyl-3,5-dichlor-2-pyridon 20 g l-hydroxy-4,6-dimethyl-2-pyridon opløses i en blanding af 75 ml koncentreret saltsyre og 60 ml vand, og der tilledes 21,6 g chlor ved 10-15°C, efteromrøres i yderligere 1 time, fraskilles ved sugning, vaskes med vand og tørres i vakuum.

35 Udbyttet andrager 22,9 g, og smeltepunktet andrager 213°C. Omkrystallisation fra acetonitril forøger smeltepunktet til 216°C.

Claims (1)

1. 30 V-(N-CH-C) 1 - N-CH-C-N-CH-C-(N-CH-C-)m2 W (IV) kendetegnet ved, at der som N-heterocyclisk katalysator anvendes en forbindelse med den almene formel /*\ \ N-OH (I) **» v ·* 35. hvilken X betyder en af grupperne> C=0,> C=S eller -N=, og