DE956952C - Verfahren zur Herstellung von oxydierten Steroiden - Google Patents

Description

• Verfahren zur Herstellung von oxydierten Steroider3 Gegenstand der Erfindung ist ein neues Verfahren zur Herstellung von Oxydationsprodukten der Steroidreihe, insbesondere zum Abbau der Seitenkette von Pregnanverbindungen und zur Herstellung von -ungesättigten Verbindungen der Androstanreihe auf biochemischem Wege.
• Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man auf gesättigte oder ungesättigte Androstane oder Pregnane, die in der 3- und der 17- bzw. in der 2o-Stellung eine freie oder geschützte Oxy- oder Oxogruppe aufweisen, Kulturen von Fusarium solani, Fusarium caucasicum, Rhizopus suinus, Venturia chlorospora oder Venturia linicerae bzw. darin enthaltene Enzyme einwirken läßt. Zur Kultur der genannten Pilze eignen sich die an sich hierfür bekannten Nährböden, z. B. solche mit Zuckern, wie Glucose oder Lactose, mit Peptonen, Maisquellwasser oder Sofaprodukten sowie mit Mineralsalzen, oder aber synthetische Nährlösungen. Man ,.rbeitet insbesondere unter aeroben Bedingungen, beispielsweise in einer Schüttelkultur oder bei untergetauchtem Wachstum unter Rühren und Luftzufuhr. Die Eumyceten unterscheiden sich von anderen Mikroorganismen, z. B. den Bakterien, durch gutes Wachstum unter verhältnismäßig einfachen Zuchtbedingungen. Die verfahrensgemäße Reaktion findet in der beschriebenen Pilzkultur bzw. mit den darin enthaltenen, gegebenenfalls angereicherten oder abgetrennten Enzymen statt, im einfachsten Fall also in einer Aufschlämmung des abgetrennten Pilzmyzels, des homogenisierten Pilzmyzels oder in dessen Filtraten bzw. wasserhaltigen Extrakten.
• Als Ausgangsstoffe für das neue Verfahren verwendet man gesättigte oder ungesättigte Verbindungen der Pregnan- und Androstanreihe, z. B. Progesteron, ii-Dehydroprogesteron, ii-Ketoprogesteron, 11-, 12- oder i4-Oxyprogesterone, 5- oder 4-Pregnen-3-ol-2o-one, 5-Pregnen-3, 2o-diole, ii-Desoxycorticosteron, Corticosteron, ii-Dehydrocorticosteron, 4- oder 5-Androsten-3, 17-dion, Testosteron, 5-Androsten-3-01-17-on, Adrenosteron, Pregnan-3, 2o-dion, Pregnan-3-ol-2o-on, Androstan-3, 17-dion, Allopregnan-3, 2o-dion, 3 ß-Acetoxyallopregnan-2o-on bzw. entsprechende Verbindungen mit geschützten Oxy- oder Oxogruppen. In den Ausgangsstoffen stellt die geschützte Oxygruppe z. B. eine mit einer aliphatischen, aromatischen oder heterocyclischen Carbonsäure, beispielsweise Essigsäure, Propionsäure, Benzoesäure oder Furancarbonsäure, veresterte oder eine verätherte Oxygruppe dar, z. B. die Tetrahydropyranyloxy-, Benzyloxy- oder Triphenylmethoxygruppe. Die geschützte Oxogruppe ist vorteilhaft eine ketalysierte Oxogruppe, abgeleitet insbesondere von einem zweiwertigen Alkohol, wie die Äthylendioxygruppe. Im übrigen können die Ausgangsstoffe Doppelbindungen enthalten, z. B. in 4-1 5-, 6-, 7-, 8-, 9 (11)-, 11- oder i4-Stellung, oder zusätzliche Substituenten aufweisen, wie freie oder geschützte Oxy-, Oxo- oder Carboxylgruppen, ferner Epoxygruppen oder Halogenatome; beispielsweise in 4-, 5-, 6-, 7-1 8-1 9-, 11-, i2-, i4-, 15- oder 2i-Stellung. Die vorstehend genannten Ausgangsstoffe sind von beliebiger sterischer Konfiguration. Das Verfahren läßt sich auch mit Gemischen durchführen, die einen oder mehrere der vorstehend genannten Ausgangsstoffe enthalten. So erhält man z. B., ausgehend von dem bei der Cholesterinoxydation gebildeten Neutralteil, insbesondere nach anschließender Dehydrierung der 3-ständigen Oxygruppe unter anderem das i, 4-Androstadien-3, i7-dion.
• Die Abtrennung der Verfahrensprodukte läßt sich nach bekannten Methoden durchführen. Sie kann z. B. durch Extraktion des Reaktionsgemisches mit einem organischen Lösungsmittel, z. B. Methylenchlorid oder Essigester, erfolgen. Für die weitere Reinigung des so erhaltenen Extraktes eignen sich besonders chromatographische Methoden, z. B. Adsorption an Aluminiumoxyd oder Silicagel, Anwendung von Verteilungsmethoden, z. B. dem Gegenstromverfahren, oder die Trennung mit den sogenannten »Girard-Reagenzien«, wie Trimethylammonium- oder Pyridinium-essigsäurehydrazid. Anschließend an die Reinigung oder an-ihrer Stelle wird schließlich vorzugsweise aus organischen oder wäßrigorganischen Lösungsmitteln. umkristallisiert.
• Mit dem neuen biochemischen Verfahren lassen sich z. B. das Progesteron wie auch das 5-Pregnen-3 ß-ol 2o-on, ii-Desaxy-corticosteron oder 4-Androsten-3, 17-dion unter Verwendung z. B. von Fusarium solani in nur einer Verfahrensstufe und mit hoher Ausbeute in das i, 4-Androstadien-3, i7-dion überführen. Diese Umwandlung ist auf chemischem Wege nur in einem vielstufigen Verfahren mit wesentlich niedrigerer Gesamtausbeute möglich. Das i, 4-Androstadien-3, i7-dion stellt ein wichtiges Ausgangsmaterial für die Synthese des Oestrons dar, das daraus in einer einzigen Verfahrensstufe erhältlich ist. Aus den in der 4 (g)- und 5 (6)-Stellung gesättigten, in 3-Stellung eine freie oder geschützte Oxy- oder Oxogruppe aufweisenden Pregnanverbindungen lassen sich je nach der Dauer der Bebrütung die entsprechenden gesättigten 17-Ketone oder deren im Ring A dehydrierten Derivate, beispielsweise die i, 4-Androstadien-3,, i7-dione gewinnen. Analog erhält man aus den entsprechenden gesättigten Androstanverbindungen deren im Ring A dehydrierten Abkömmlinge. Bei längerer Bebrütung wird aus Progesteron, aus dem i, 4-Androstadien-3, 17-dion und aus anderen genannten Ausgangsstoffen eine neue Verbindung, das i, 2-Dehydrotestolacton vom F. = Zig bis 22o° und der spezifischen Drehung [a] ö = 49 3- 3° (c = 1,025 in CHC13), erhalten. Dieses weist im Ultraviolettspektrum bei 242 mu ebenfalls eine starke Bande auf (ioga = 4,23) und enthält 75,70 0 o Kohlenstoff und 8,o50% Wasserstoff (berechnet für C10Ha40s C 75,97; H 8,05 %). Mit anderen Pilzen, z. B. Rhizopus suinus, erhält man an Stelle dieser Verbindung auch das bekannte Testolacton.
• Die Verfahrensprodukte können als Heilmittel oder als Zwischenprodukte zu deren Herstellung dienen. Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert. Beispiel i 41 einer Nährlösung, bestehend aus 3o cm3 Maisquellwasser, 50 g Pepton, Zoo mg Rohglucose und Leitungswasser, werden gleichmäßig in 13 Erlenmeyerkolben je 11 Fassungsvermögen verteilt und sterilisiert. Das' p$ dieser Lösungen beträgt 6, 4. Sie werden mit einer Kultur des Pilzes Fusarium solani beimpft und bei 25° mechanisch geschüttelt. Nach 48 Stunden hat sich der Pilz stark vermehrt. Auf die 13 Erlenmeyerkolben verteilt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung aus i g Progesteron in 45 cm3 Aceton. Man schüttelt noch weitere 48 Stunden bei der vorstehend genannten Temperatur und filtriert dann vom Myzel ab. Das p$ des Kulturfiltrates beträgt jetzt 7,9.
• Die Lösung wird einmal mit 1500 cm3, zweimal mit je iooo cm3 und schließlich zweimal mit je 5oo cm3 Methylenchlorid ausgeschüttet. Der Extrakt wird zweimal mit je 390 cm3 o,i n-Salzsäure, zweimal mit je 300 cm3 10%iger Natriumbicarbonatlösung und dreimal mit je 3oo cm' Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Den teilweise kristallinen Rückstand (1,14 g) chromatographiert man an einer mit 30 g Aluminiumoxyd bereiteten Säule in einer Benzol-Petroläther-(6 : 4)-Lösung nach der Durchlaufrnethode.
• Die Benzol Petroläther- und die Benzol-Eluate werden vereinigt und aus Aceton-Petroläther umkristallisiert. Man erhält papierchromatographisch einheitliche farblose, rhombische Platten vom F. =1q.5 bis 146°; [a]v = -1-11o° :L4° (CHC13), -r112° :L4° (Alkohol). Diese Verbindung stellt das bekannte 1, 4-Androstadien-3, 17-dion dar. Ausbeute etwa 8o %.
• Wird an Stelle der Progesteronlösung eine Lösung aus i g ii-Desoxycorticosteron oder aus i g 4-Androsten-3; i7-dion in 45 cm3 Aceton einer entsprechenden Kultur von Fusarium solani zugesetzt, die Kultur in der oben beschriebenen Weise behandelt und aufgearbeitet, so erhält man das i, 4-Androstadien-3, 17-dion ebenfalls in hoher Ausbeute.
• Ersetzt man im obigen Beispiel die Kultur von Fusarium solani durch eine auf gleichem Nährboden hergestellte Kultur von Fusarium caucasicum, so wird Progesteron mit gleich hoher Ausbeute in i, 4-Androstadien-3, i7-dion übergeführt.
• Beispiel 2 Zu 41 einer Kultur von Fusarium solani, die, wie im Beispiel i beschrieben, hergestellt wurde, gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung aus 1 g 5-Pregnen-3ß-01-2o-on in 37 cm3 Methanol. Die Kultur wird weitere 48 Stunden bei 26° geschüttelt, das Myzel darauf abfiltriert und das Kulturfiltrat, wie im Beispiel i beschrieben, mit Methylenchlorid extrahiert.
• Den Extraktionsrückstand chromatographiert man an einer mit 30g Aluminiumoxyd bereiteten Säule in einer Benzol-Petroläther-(8:2)-Lösung nach der Durchlaufmethode. Die ersten Benzol-Petroläther-Fraktionen werden vereinigt (etwa 140m9) und aus Aceton-Petroläther umkristallisiert. Die erhaltenen rhombischen Platten vom F. = 145 bis 146° stellen das i, 4-Androstadien-3, 17-dion dar. Einzelne weitere Fraktionen des Chromatogramms enthalten in kleiner Menge das 5-Androsten-3ß-ol-i7-on.
• Beispiel 3 Eine Lösung aus 2o g des bei der Chromsäureoxydation des Cholesterylacetatdibromids gebildeten, entbromten, hydrolysierten und anschließend nach der Methode von Oppenauer dehydrierten Neutralteils in 700 cm3 Aceton gibt man zu 401 einer Kultur von Fusarium solani, dargestellt nach Beispiel i, in einem üblichen Kulturansatz unter Rühren und Belüften. Nach der im Beispiel i beschriebenen Bebrütung und Aufarbeitung gewinnt man 5,2 g 1, 4-Androstadien-3, 17-dion.
• Beispiel 4 Zu 41 einer nach Beispiel i bereiteten Kultur von Fusarium caucasicum gibt man die Lösung aus i g 1, 4-Androstadien-3, i7-dion in 35 cm3 Aceton. Nach 7tägiger Bebrütung wird, wie im Beispiel i beschrieben, aufgearbeitet und der erhaltene Extrakt nach der Entmischungsmethode gereinigt. Durch Umkristallisieren aus Aceton erhält man schließlich etwa 6o % der neuen Verbindung i, 2-Dehydrotestolacton vom F. = 219 bis 22o° und der spezifischen Drehung [aj ö = -49 zL3° (c = 1,025 in CHC13); Ultraviolettspektrum: Amax = 242m,; 1091 = 4,23. Mikroanalyse: C = 75,7o, H = 8,o5 0%.
• Die gleiche Verbindung wird unter den Bedingungen des Beispiels i aus Progesteron, 5-Pregnen-3, 2o-dion, 5-Pregnen-3ß-ol-2o-on, ii-Desoxy-corticosteron oder-4-Androsten-3, 17-dion gewonnen, wenn man an Stelle von 2 Tagen 6 bis io Tage bebrütet. Beispiel 5 Drei Erlenmeyerkolben von je Zoo cm3 Fassungsvermögen, die je 50 cm3 der im Beispiel i beschriebenen sterilen Nährlösung enthalten, werden mit Fusarium solani beimpft und 48 Stunden bei 26° mechanisch geschüttelt. Dann gibt man zu jeder Kultur eine Lösung aus je iomg Allopregnan-3, 2o-dion in 0,5 cm3 Aceton und schüttelt weiter bei 26°. Nach 24 und 48 Stunden sowie nach 7 Tagen wird je eine Kultur filtriert und, wie im Beispiel i beschrieben, extrahiert. Die drei Extraktionsrückstände i bis 3 werden papierchromatographisch untersucht. Die Extrakte i und 2 enthalten das Androstan-3,17-dion, während im Extrakt 3 das Z, 4-Androstadien-3, i7-dion vorhanden ist.
• Ersetzt man im vorstehenden Beispiel das Allopregnan-3, 2o-dion durch eine entsprechende 3ß-Acetoxy-allopregnan-2o-on-lösung, so findet man in den Extrakten ebenfalls nach 24- bzw. 48stündiger Bebrütung das Androstan-3, i7-dion und nach 7tägiger Bebrütung das i, 4-Androstadien-3, 17-dion. Ersetzt man im vorstehenden Beispiel das Allopregnan-3, 2o-dion durch das Androstan-3, 17-dion, so findet man in den Extrakten nach 24- bzw. 48stündiger Bebrütung nur unverändertes Ausgangsmaterial und nach 7tägiger Bebrütung das i, 4-Androstadien-3, 17-dion.
• Beispiel 6 41 einer sogenannten Czapek-Dox-Nährlösung (Zusammensetzung: 2 g NaN03, i g K,HB4, 0,5 g KCl, 0,5 g M9S04, 0,o2 g FeS04, 50 g Glucose in 11 Wasser) werden gleichmäßig in zwei Schüttelgefäße verteilt, sterilisiert und mit einer Kultur des Pilzes Rhizopus suinus beimpft. Nach 2tägigem Schütteln bei 26° hat sich der Pilz gut entwickelt, und man gibt unter sterilen Bedingungen in jedes Gefäß eine Lösung aus 500 mg ii-Desoxycorticosferon in 15 cm3 Aceton. Man schüttelt noch weitere 4 Tage bei der vorstehend beschriebenen Temperatur und filtriert dann vom Myzel ab. Das Kulturfiltrat wird wie beschrieben ausgeschüttelt und der Extrakt gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand (i g) wird im Gegenstromverfahren aufgetrennt. Dazu löst man ihn in 50 cm3 absolutem Äthanol und x50 cm3 Wasser und zieht mit Zoo cm3 Benzol aus. Die untere Schicht wird abgetrennt und durchläuft vier weitere Scheidetrichter, die mit -je 200 cm3 mit 25o/oigem Äthanol gesättigtem Benzol beschickt sind. Diese Prozedur wird viermal mit je Zoo cm3 mit Benzol gesättigtem 25o/oigem Äthanol wiederholt, so daß schließlich fünf Benzol- und fünf wäßrige Alkohollösungen vorliegen. Sie werden im Vakuum eingedampft. Die papierchromatographische Untersuchung zeigt, daß in den wäßrig-alköholischen Lösungen nur wenig hochpolare Nebenprodukte vorhanden sind, während die ersten drei Benzollösungen 650 mg einer Verbindung enthalten, die etwas höherpolar als das Ausgangsmaterial ist und kein Reduktionsvermögen besitzt. Durch Umkristallisieren aus Acetonpetroläther erhält man das Testolacton in Nadeln vom F. = 203 bis 2o6°; [a]n = -I- 40° (c = io65 in Chloroform) Absorptionsbanden im Infrarot bei 5,81, 5,98 und 7,17 ,c' (Nujol = besonders gereinigtes Paraffinöl).
• Mikroanalyse für C"Hzs0a: berechnet . . . . . . . . . . . . . . . C 75,46 °/o, H 8,67 °/o; gefunden . . . . . . . . . . . . . . . C 75,26°/0, H 8,8o °/0. Beispiel 7 Vier Erlenmeyerkolben von je Zoo cm3 Fassungsvermögen, die je 50 cm3 der im Beispiel i beschriebenen sterilen Nährlösung enthalten, werden mit Fusarium solani beimpft und 48 Stunden bei 26° mechanisch geschüttelt. Dann trennt man das Myzel der vier Kulturen einzeln ab und wäscht es mit Wasser. Die Myzele von zwei Kulturen werden direkt in zwei Erlenmeyerkolben in je 50 cm3 destilliertem Wasser suspendiert, während die andern zwei Myzele einzeln zuerst in einem Homogenisator mit 50 cm3 destilliertem Wasser zerkleinert und erst dann in je einen Erlenmeyerkolben übergeführt werden. Zu den zwei Myzelaufschlämmungen und den zwei Mycelhomogenaten gibt man je eine Lösung von io mg Progesteron in 0,5 cm3 Aceton und läßt die mit Watte verschlossenen Erlenmeyerkolben bei 26° mechanisch schütteln. Nach 36 Stunden werden eine Myzelaufschlämmung und ein Mycelhomogenat filtriert und, wie im Beispiel i beschrieben, extrahiert. Die papierchromatographische Untersuchung zeigt, daß die Extraktionsrückstände neben wenig Progesteron zur Hauptsache i, 4-Androstadien-3, i7-dion enthalten. Nach 7 Tagen werden die zweite Myzelsuspension und das zweite Myzelhomogenat in gleicher Weise aufgearbeitet und untersucht. In den so erhaltenen Extrakten ist einzig i, 2-Dehydrotestolacton vorhanden.
• Beispiel 8 Wird im Beispie16 an Stelle der Kultur von Rhizopus suinus eine solche von Venturia chlorospora oder Venturia linicerae verwendet und wird im übrigen ii-Desoxycorticosteron in gleicher Weise inkubiert, so erhält man nach analoger Aufarbeitung Testolacton vom F. = 203 bis 2o6°.

Claims (3)

1. PATENT AN SPRCCHE: i. Verfahren zur Herstellung von oxydierten Steroiden durch Bebrütung der zu oxydierenden Steroide mit einer Kultur eines niederen Pilzes oder den daraus erhältlichen Enzymen und Abtrennung der Oxydationsprodukte, dadurch gekennzeichnet, da.ß man Androstane oder Pregnane, die in 3- und 17- bzw. in 2o-Stellung eine freie oder geschützte Oxy- oder Oxogruppe enthalten, mit Kulturen von Fusarium solani, Fusarium caucasicum, Rhizopus suinus, Venturia chlorospora oder Venturia linicerae biologisch oxydiert.
2. 2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß man Verbindungen der Pregnan-oder Androstanreihe mit einer q.(5)- oder 5(6)-ständigen Doppelbindung, insbesondere Progesteron, 5-Pregnen-3ß-ol-2o-on, ii-Desoieycorticosteron, 4-Androsten-3, i7-dion, 5-Androsten-3ß-oli7-on, ferner den bei der Chromsäureoxydation des Cholesterylacetatdibromids gebildeten, entbromierten, hydrolysierten und anschließend nach der Methode von Oppenauer dehydrierten Neutralteil sowie Allopregnan-3, 2o-dion oder 3ß-Acetoxy-allopregnan-2o-oii als Ausgangsstoffe verwendet.
3. 3. Verfahren nach Anspruch i und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultur des Pilzes bzw. darin enthaltene Enzyme i bis :z Tage oder 6 bis 15 Tage auf das Ausgangssteroid einwirken läßt. In Betracht gezogene Druckschriften: USA.-Patentschrift Nr. 2 6o2 769; Experientia, Bd.8, 1952, S.422; Research (London), Bd.6, 1953, S.309.