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Verfahren zur Herstellung von Reinthrombin Die Erfindung betrifft
die Herstellung von Reinthrombin aus Prothrombin.
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Es ist bereits bekannt, in Lösung befindliches Prothrombin dadurch
in Thrombin überzuführen, daß eine geeignete Menge einer wäßrigen Calciumchloridlösung
und etwas Kinase zugesetzt werden. Kinase und Ca-Ionen wirken hierbei als biologische
Aktivatoren.
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Weiterhin ist bekannt, isoliertes Prothrombin ohne Zusatz biologischer
Aktivatoren durch vielstündiges Stehenlassen in konzentrierten Salzlösungen, z.
B. in 25°/oiger Natriumcitratlösung, bei Raumtemperatur in Thrombin von, gutem Reinheitsgrad
zu überführen (vgl. W. H. Seegers in »Proc. Soc. exp. Biol. Med.« 72, S. 677 LI9491)-Es
wurde nun gefunden, daß die Überführung von Prothrombin auch ohne Anwendung biologischer
Aktivatoren und ohne die Anwendung konzentrierter Salzlösungen, gelingt, wenn eine
wäßrige Lösung von Prothrombin mit kleinen Mengen von Trypsin versetzt wird und
die Lösung zweckmäßig in Gegenwart einer niedermolekularen Polyoxyverbindung, wie
Glycerin, oder eines körpereigenen oder eines nicht antigenen Proteins bis zum Erreichen
der maximal gebildeten. :Menge an Thrombin stehengelassen wird. Nach Erreichen,
des Maximums der Thrombinbildung wird die Fermentaktivität des Trypsins durch Zusatz
einer adäquaten Menge Antitrypsins aufgehoben und die Thrombinlösung gegebenenfalls
weiterverarbeitet. Unter kleinen Mengen an Trypsin werden solche von I bis 2o y
Reintrypsin je Milligramm Prothrombin verwendet.
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Zur Vermeidung einer Denaturierung des gebildeten Thrombins in der
Reaktionslösung werden gemäß der
Erfindung die obengenannten Stabilisatoren
verwendet. Diese Stabilisatoren selbst haben keine umwandlungsfördernde Wirkung.
Sie vermögen jedoch das sich unter dem Einfluß des Trypsins gegenüber bekannten
Verfahren besonders schnell bildende Thrombin zu stabilisieren.
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Es ist bereits bekannt, Kohlehydratverbindungen, nämlich Pentosen,
Hexosen, Hexose-Disaccharide und Methyl- oder Äthylglycoside von Pentosen oder Hexosen
als Stabilisatoren zu verwenden. Diese Verbindungen sind jedoch keine reinen Polyoxyverbindungen
; sie enthalten vielmehr auch noch Oxogruppen. Im Rahmen dieser Erfindung wird ein
Anspruch auf Kohlehydrate, die zugleich Polyoxy- und Polyoxogruppen enthalten, nicht
gestellt.
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Bei der Verwendung von mehrwertigen Alkoholen als Stabilisatoren können
diese nach Beendigung der Umsetzung durch Dialyse entfernt werden. Bei Verwendung
von Glycerin ist die Dialyse in 3 bis 4 Stunden beendigt, während die dialytische
Entfernung der nach dem Salzverfahren anzuwendenden Salze ein Vielfaches dieser
Zeit erfordert und überdies mit erheblichen Verlusten an Thrombinaktivität verbunden
war.
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Die wäßrige, glycerinfreie Lösung des Thrombins läßt sich in bekannter
Weise sterilisieren und in gefrorenem Zustand ohne wesentliche Einbuße an Thrombinaktivität
im Hochvakuum zur Trockne bringen. i mg eines so erhaltenen schneeweißen und in
Wasser spielend löslichen Thrombins enthält etwa 7oo NIH-Einheiten (unter NIH-Einheiten
versteht man die vom National Institut of Health in Washington vorgeschlagenen Einheiten).
Es ist jedoch nicht nötig, wäßrige, vom Glycerin befreite Lösungen des Thrombins
in trockenes Reinthrombin überzuführen. Vielmehr kann die glycerinhaltige Ansatzlösung
auch nach Einstellung auf gewünschte Konzentrationen gegebenenfalls zur Verwendung
gelangen.
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Als Stabilisator kann weiterhin ein, körpereigenes Protein oder ein,
nicht antigenes Protein verwendet werden. Außer Gelatine und Casein ist insbesondere
das menschliche Serumalbumin, geeignet, das nach entsprechender Reinigung frei von
Antitrypsin und Antithrombin ist und in hohen Konzentrationen und bei Anwesenheit
von Trypsin sowohl auf Prothrombin umwandlungsfördernd wie auf Thrombin stabilisierend
wirkt. Die Herstellung eines unmittelbar in der Ansatzlösung anwendbaren Thrombinpräparates
ist bei Anwendung der genannten Proteine in besonders einfacher Weise durchführbar,
weil nach erfolgter Thrombinbildung, die durch die Bestimmung in kleinen Ansatzmengen
laufend kontrolliert werden kann und nach Neutralisierung des Trypsins durch eine
ausreichende Menge reinen Trypsinhemmstoffs unter Verzicht auf die Entfernung des
zur Reaktionslösung zugegebenen arteigenen bzw. nicht antigenen Eiweißes, der gesamte
Reaktionsansatz nach Vornahme geeigneter Sterilisierungsmaßnahmen unmittelbar zur
lokalen Blutstillung angewandt werden kann. Es ist selbstverständlich auch möglich,
das eiweißhaltige Thrombin aus dem Lösungszustand in ein Trockenerzeugnis überzuführen.
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Der Verlauf der Bildung von Thrombin aus Prothrombin in Gegenwart
des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Umwandlungsmittels Trypsin geht aus nachstehenden
Umwandlungskurven in den Abb. i und 2 in allen Einzelheiten hervor. Die Kurven geben
an, welche Einheiten Thrombin pro Milligramm angewandtes Prothrombin unter dem Einfluß
der verschiedenen Reaktionsmedien entstehen.
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Abb. i der Zeichnung zeigt den Einfluß steigender Trypsinmengen auf
die Thrombinbildung in 25°/oiger Citratlösung bei einem pH-Wert von 7,2.
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Die gestrichelte Linie hat folgende Bedeutung: Prothrombin Nr. 2851
(90o SE) i°/oig in 25°/oiger Citratlösung von pH 7,2.
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Die ausgezeichnete Linie hat folgende Bedeutung: Prothrombin Nr. 2851
(90o SE) i°/°ig in 25°/oiger Citratlösung von pH 7,2 mit Mengen von 2 bis ?,o
y
krist. Armour-Trypsin (65,6 °/o Trypsin, 34,4 % Mg S 04) versetzt.
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Abb.2 zeigt den Einfluß von Trypsin auf die Thrombiabildung in verschiedenen
Reaktionsmedien. Prothrombin Nr. 26 (9oo SE) + 8 y krist. Armour-Trypsin je i mg.
Hierin haben die Kurven i bis 4a folgende Bedeutung:
| i = Prothrombin i°/oig in 25°/oiger Citratlösung, p$ 7,2 |
| 2 = - 5°/oig in 5o°/oigem Glyzerin, p$ 7,2 |
| 2a= - i°/oig in 5o°/oigem Glyzerin, p$ 7,2 |
| 3 = - i°/oig in 2o°/°igem Humanalbumin, |
| PH 7,- |
| 4 = - 5°/°ig in dest. H20, pH 7,2 |
| 4a= - i°/oig in dest. H20, PH 7,2 |
Die Eifindung wird an Hand nachstehender Beispiele erläutert.
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Beispiel i i g Prothrombin (iooo Einheiten nach Seegers in i mg) wird
in 2o ccm einer auf PH 7,2 eingestellten 5o°/oigen wäßrigen Glycerinlösung aufgelöst,
mit 8 mg krist. Trypsin, 65,6010 Reintrypsin, 34,404 M9S 04 versetzt und im Thermostaten
auf 28° erwärmt. Die Umwandlung des Prothrombins inThrombinwird durch Bestimmung
des freigelegten Thrombins in kleinen Ansatzproben, die im Abstand von etwa
30 Minuten entnommen werden, verfolgt. Nach 21/2 Stunden, d. h. zum Zeitpunkt
optimaler Thrombinausbeute, werden i2 mg reines Antitrypsin aus Sojabohnen zugefügt
und das im Ansatz enthaltene Glycerin durch eine 31/2stündige Dialyse gegen neutrales
Wasser entfernt. Nach Gefriertrocknung der dialysierten Lösung erhält man schließlich
850 mg eines leichtlöslichen Thrombinpräparates, das 75o NIH-Einheiten im
Milligramm enthält. Ist das Thrombin für die Anwendung als Hämostyptikum beim Menschen
bestimmt, so wird das geschilderte Verfahren unter sterilen Bedingungen durchgeführt
oder die erhaltene Thrombinlösung vor der Trocknung, die in sterilen Gefäßen vorgenommen
wird, durch ein Entkeimungsfilter filtriert.
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Beispiel 2 i g Prothrombin (iooo SE je Milligramm) wird in 2o ccm
einer auf p$ 7,2 eingestellten sterilen 2o°/oigen wäßrigen Auflösung reinen menschlichen
Serumalbumins in einem sterilen Gefäß gelöst, mit 8 mg krist. Trypsin versetzt und
der Verlauf der Thrombinbildung
bei 28' wie im Beispiel i kontrolliert.
Nach 3 Stunden nimmt, wie durch einen Testversuch nach 3'/4 Stunden ermittelt wird,
die Thrombinausbeute nicht weiter zu. Es wird daher zu dem letztgenannten Zeitpunkt
eine Menge von 12 mg krist. Trypsininhibitor aus Sojabohnen dem Reaktionsansatz
zugefügt. Derselbe enthält gooooo NIH-Einheiten Thrombin und wird, gegebenenfalls
nach Verdünnung mit steriler wäßriger Human.albuminlösung, einer erneuten Sterilisation
durch Filtration unterzogen oder mit einem Konservierungsmittel versetzt und auf
kleine Behälter für den Gebrauch als Hämostyptikum abgefüllt.