DE9209540U1

DE9209540U1 - Vorrichtung zur Kultivierung von Mikroorganismen

Info

Publication number: DE9209540U1
Application number: DE9209540U
Authority: DE
Original assignee: Roehm GmbH Darmstadt
Current assignee: Roehm GmbH Darmstadt
Priority date: 1992-07-16
Filing date: 1992-07-16
Publication date: 1992-09-24
Anticipated expiration: 2002-07-17
Also published as: DK64593A; GB2269391A; JPH0633500U; GB9314801D0; DK64593D0; CH685502A5; FR2693739A1; NL9300957A; FI933192L; FI933192A0

Description

BESCHREIBUNG

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Kultivierung von Mikroorganismen in Mikrotiterplatten, wobei die Mikrotiterplatten durch Membranen verschlossen sind, die einerseits das Austreten von Flüssigkeit verhindern und andererseits permeabel für Sauerstoff sind.

Stand der Technik

Die Verwendung von Mikrotiterplatten zur Kultivierung von Mikroorganismen, wobei viele Kulturen getestet werden, ist bekannt. Eine Reihe von Publikationen beschäftigt sich mit dem qualitativen und quantitativen Nachweis von Mikroorganismen bzw. von Substanzen, die von Mikroorganismen erzeugt werden.

FR-A 2 556 741 beschreibt Mikrotiterplatten, die zur Detektion der Einwirkung bestimmter Substanzen auf Mikroorganismen oder Mischungen von Mikroorganismen verwendet werden, wobei sich die Mikroorganismen in einem lyophilen Medium befinden und die einwirkende Substanz im Kulturmedium zugegeben wird sowie danach die Mikrotiterplatte bei geeigneter Temperatur inkubiert wird.

Mikrotiterplatten für antibiotische Empfindlichkeitstests, die bei tiefen Temperaturen, beispielsweise bei -70 Grad C

gelagert werden, um die Stabilität der Antibiotika zu erhalten, werden von P.L. Kuglin Bailey und M.B. McGuckin in Am. J. Med. Technol 45 (6), Seiten 517 bis 522, 1979 beschrieben.

In DE-OS 33 36 738 werden ebenfalls Mikrotiterplatten für antibiotische Empfindlichkeitstests beschrieben. Die Mikrotiterplatten weisen austauschbare Module mit Kavitäten auf, wobei die Kavitäten bestimmte Volumina, beispielsweise an Suspensionen von Bakterien, aufnehmen können und wobei die Kavitäten Öffnungen zum Gasaustausch aufweisen.

Das deutsche Gebrauchsmuster G 91 07 670.6 stellt modifizierte Mikrotiterplatten an sich bekannter Zusammensetzung vor, die zur Fixierung von biologisch signifikanten, Amino- oder SuIfohydridgruppen enthaltenden Materialien an der Oberfläche, mindestens im Bereich der Kavität, eine transparente Polymerbeschichtung aufweist, die eine Vielzahl an Epoxidgruppen enthält. Im US-Patent 4 680 269 werden Mikrotiterplatten beschrieben, deren Kavitäten mit einer porösen Schicht abgedeckt sind, die mit einer sauren Komponente imprägniert ist. Diese Schicht ist in der Lage, gasförmige, basische Produkte, wie beispielsweise Ammoniak, die beim Wachstum von Bakterienkulturen gebildet werden können, zu neutralisieren. Damit werden Fehler bei pH-sensitiven biochemischen Tests vermieden.

Aufgabe und Lösung

Bei der Kultivierung von Mikroorganismen ist in der Screeningphase oft die Erprobung sehr vieler Kulturen

notwendig. Dabei werden in den einzelnen Kulturen hohe Zelldichten beziehungsweise hohe Biomassekonzentrationen angestrebt, insbesondere wenn die Bildung eines gewünschten Produktes des Zellstoffwechsels, beispielsweise eines Fermentationsproduktes, von der Biomassekonzentration in der Kultur abhängig ist. Die Biomassebildung ist beispielsweise bei aeroben Prozessen primär von der Menge des in die Kultur eingebrachten Sauerstoffs abhängig. Um dies zu erreichen, werden in der Regel Erlenmeyerkolben mit Schikanen verwendet, die auf Schüttlern inkubiert werden. Typischerweise weisen die Schüttelkolben ein Gesamtvolumen von 100 ml auf und werden mit etwa 20 ml Kulturmedium befüllt. Im Vergleich zu einer miniaturisierten Ausführung ist die Herstellung vieler Schüttelkolbenkulturen zeit- und materialaufwendig.

Verwendet man Mikrotiterplatten des Standes der Technik, so wird bei den o.a. aeroben Prozessen die Biomasse zunächst an der Oberfläche des Kulturmediums in den Kavitäten gebildet und damit eine weitere Sauerstoffdiffusion in das Innere des Kulturmediums gehemmt. Diese Diffusionssperre kann teilweise durch Schütteln überwunden werden, wobei bei der üblichen zweidimensionalen Schütteltechnik die Gaspermeation durch die hohen Oberflächenspannungen und durch die Konzentration der spezifisch leichteren Biomasse an der Oberfläche des Kulturmediums nur unwesentlich verbessert wird.

Die daraus resultierende Aufgabe, die in die Kavitäten von Mikrotiterplatten gerichtete Gaspermeation bei der Kultivierung von Mikroorganismen bei gleichzeitiger miniaturisierter Ausführung der Kulturen zu verbessern,

wird durch die erfindungsgemäße Vorrichtung gelöst. Sie dient zur Kultivierung von Mikroorganismen in Mikrotiterplatten (Abb. 1, 1), wobei die Kavitäten der Mikrotiterplatten (2) durch flexible Membranen (4) verschlossen werden, die eine gute Sauerstoffpermeabilität aufweisen und gleichzeitig das Austreten des in den Kavitäten (2) befindlichen flüssigen Kulturmediums verhindern. Mit der in Abb. 2 und Abb. 3 dargestellten Vorrichtung werden die Mikrotiterplatten (1) zur Biomassebildung in den Kulturmedien, die sich in den Kavitäten (2) befinden, bei konstanter Temperatur zur intensiven Durchmischung und damit zur Sauerstoffanreicherung bewegt. Die flexible Membran (4) besteht vorzugsweise aus einem Kunststoff mit einer Sauerstoffpermeabilität, ausgedrückt durch den Gaspermeationskoeffizienten P, von mehr als 10~^ cm³

(■ ^' besonders bevorzugt aus einem

Polymerisat bestehend aus Siloxan-Einheiten (Organopolysiloxan).

Durchführung der Erfindung

In Abb. 1 ist die erfindungsgemäße Mikrotiterplatte (1) dargestellt. Sie besteht aus einer variierbaren Anzahl A Kavitäten (2). Gewöhnlich sind Kavitäten (2) und Grundplatte (2a) aus einem transparenten Material, bevorzugt aus Kunststoff, wobei die Kavitäten (2) nach einer Seite offene Zylinder darstellen. Die Anzahl A der Kavitäten (2) liegt beispielsweise zwischen 12 und 96. Nach Befüllen der Kavitäten (2) mit dem flüssigen Kulturmedium, beispielsweise Mikroorganismen in einer wäßrigen Nährstofflösung, werden die offenen Seiten der ■

bevorzugt zylindrischen Kavitäten mit einer flexiblen Membran (4) abgedeckt, die eine gute Sauerstoffpermeabilität aufweisen muß. Die Sauerstoffpermeabilität kann beispielsweise durch den Gaspermeationskoeffizienten P ausgedrückt werden, der in das Fick'sche Transportgesetz eingeht:

&ngr; -

wobei N = durchgehende Menge des Gases P = Gaspermeationskoeffizient

F = Durchgangsfläche
Ap = Dampfdruckdifferenz des Gases

t = Durchgangszeit
und d = Dicke der Membran (4)
bedeuten.

Vorzugsweise besteht die flexible Membran (4) aus einem Kunststoff mit einem Gaspermeationskoeffizient P von mehr

als 10~⁹ cm³ &Ggr; / wobei besonders bevorzugt

Kunststoffe eingesetzt werden, die gegen das Kulturmedium korrosionsbeständig sind (vgl. hier z.B. Vieweg/Braun, Kunststoff-Handbuch, Band 1, Seiten 936 ff, Carl-Hanser, München, 1975) .

Als Kunststoff werden beispielsweise Polystyrol, Poly(meth)acrylate, Polycarbonat, Polyethylen mit einer Dichte von weniger als 0,94 g/cm³, Styrol-Butadien-Gummi und insbesondere Organopolysiloxane, wie beispielsweise Dimethylpolysiloxan, verwendet.

Die Membran (4) muß so flexibel sein, daß sie kleine Durchstiche, wie sie beim Nachfüttern von Nährlösung

C^ ^ -T -1

in einzelne Kavitäten (2) mit Injektionsnadeln entstehen können, nach dem Herausziehen der Injektionsnadel sofort wieder schließen und damit kein Kulturmedium austreten kann.

Zur Fixierung der Membran (4) wird über diese eine Fixierplatte (3), die gewöhnlich aus dem gleichen Material wie Grundplatte (2a) besteht und um ca. 25 bis 50 % größere Maße besitzt, mit Bohrungen (3a) gelegt, die es ermöglichen, die einzelnen Kavitäten (2) mit Nährflüssigkeit, Kulturen oder anderen Bestandteilen des Kulturmediums per Injektionsnadel zu versorgen. Die Fixierplatte (3) wird mit der Grundplatte (2a) über Verschraubungen (6) verbunden, wobei die Bügel (5) zur zusätzlichen Fixierung von Membran (4) und Fixierplatte (3) auf den Kavitäten (2) verwendet werden.

Die solcherart zusammengesetzte Mikrotiterplatte (1) wird in einem Medium konstanter Temperatur so bewegt, daß es in den Kavitäten (2) zu einer intensiven Durchmischung der flüssigen Kulturmedien kommt. Bevorzugt wird als Temperiermedium Luft verwendet, die mit einem Heizthermostaten auf die erforderliche Temperatur, bevorzugt zwischen 30 und 60 Grad C, aufgeheizt und im Brutschrank umgewälzt wird. Der Brutschrank besteht bevorzugt aus einem transparente Gehäuse, das vorzugsweise aus Kunststoff und besonders vorzugsweise aus Polymethylmethacrylat (Plexiglas®) aufgebaut ist. Die Mikrotiterplatten (1) sind auf einem Haltegestell , das auf einer motorgetriebenen Welle sitzt, angebracht. Die intensive Durchmischung des flüssigen Kulturmediums in den Kavitäten (2) kommt durch eine rotierende Bewegung der Mikrotiterplatten (1) um die Welle zustande.

Vorteile der Erfindung

Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Kultivierung von Mikroorganismen werden gleichbleibend hohe Sauerstoffkonzentrationen im flüssigen Kulturmedium, das sich in den Kavitäten (2) befindet, durch intensive Durchmischung des Kulturmediums und durch den ständigen Ersatz des verbrauchten Sauerstoffs durch die flexible Membran (4) hindurch gewährleistet. Darüber hinaus verhindert die intensive Durchmischung ein Absetzen der Biomasse an der Oberfläche der Kulturflüssigkeit, was ebenfalls ein Grund für eine Hemmung des Sauerstoff-Transports und damit der Biomasse-Bildung ist. Bei Screening-Versuchen ist das kleine Volumen der Kavitäten (2) der Mikrotiterplatten (1) von Vorteil, weil dadurch die Menge an Kulturmedium deutlich reduziert werden kann. Darüber hinaus ist die Herstellung von vielen Schüttelkolbenkulturen in Vergleich zu der erfindungsgemäßen miniaturisierten Ausführung sehr zeit- und materialaufwendig.
Das folgende Beispiel soll die Erfindung erläutern.

BEISPIEL

Die verwendeten Mikrotiterplatten (1) bestehen aus Polystyrol (Costar ^R, Fa. Falcon) und weisen 12 bis 96 Kavitäten (2) auf. Die Membran (4) besteht aus einer Folie aus vernetzten! Polydimethylsiloxan und weist eine Dicke von 1 mm auf. Die Fixierplatte (3) und die Grundplatte (2a) sind Polymethylmethacrylat-Platten von 5 mm Dicke mit ca. um 25 % größeren Maßen (Länge, Breite) wie die Mikrotiterplatte (1), wobei die Anzahl und Lage der Bohrungen (3a) derjenigen der Kavitäten (2) auf der Mikrotiterplatte (1) entspricht.

Die Welle (7) auf der die Mikrotiterplatte (1) befestigt ist, wird von einem Elektromotor angetrieben. Der Brutschrank (8, vgl. Abb. 2 und 3) besteht aus transparentem Polymethylmethacrylat (Plexiglas ®) , wobei die erforderliche Temperatur im Brutschrank (8), die zwischen 30 und 60 Grad C, bevorzugt zwischen 35 und 40 Grad C betragen soll, mittels eines Heizthermostaten (9) mit Luftumwälzung eingestellt wird.

Claims

SCHUTZANSPRUCHE

1. Vorrichtung zur Kultivierung von Mikroorganismen in Mikrotiterplatten,

dadurch gekennzeichnet,

daß die Kavitäten der Mikrotiterplatten durch flexible Membranen verschlossen werden, die eine gute Sauerstoffpermeabilität aufweisen und das Austreten der flüssigen Kulturmedien verhindern.

2. Vorrichtung zur Kultivierung von Mikroorganismen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Bewegung der Mikrotiterplatten zur intensiven Durchmischung der flüssigen Kulturmedien bei konstanter Temperatur erfolgt.

3. Vorrichtung zur Kultivierung von Mikroorganismen gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die flexible Membran aus einem Kunststoff mit einer Sauerstoffpermeabilität, ausgedrückt durch den Gaspermeationskoeffizienten für Sauerstoff P, von mehr als 10"⁹ cm³ C J besteht.

4. Vorrichtung zur Kultivierung von Mikroorganismen gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der die flexible Membran bildende Kunststoff ein Organopolysiloxan ist.