-
Verfahren zur Herstellung von Pteridinen Die therapeutische Wirksamkeit
von Pteroylglutaminsäure oder Folinsäure, der N-rL4'-(:z-Amino-6 - oxy
- 8 - methyl - pyrimidino - 4, 5 - pyrazol)
- aminobenzoyl]-glutaminsäure, bei der Behandlung von mal,rocytischer Anämie,
Sprue und verwandten Blutkrankheiten ist bekannt. Ihre Herstellung durch Synthese
sowie die verwandter Pteridine mit biologischer Wirksamkeit ist in »Science«, Bd.
103, Mai 1946, S. 667 bis 669, beschrieben.
-
. Es wurde nun gefunden, daß man die gleichen wertvollen Pteridine
erhält, wenn man 2, 4, 5-Triamino-6-oxy-pyrimidin mit I, I, 3-Trihalogenaceton und
einer p-Aminobenzoesäure der allgemeinen Formel
worin R gleich OR' oder NR'-R" ist und R' und R" Wasserstoff oder aromatische oder
aliphatische Reste bedeuten, vorzugsweise bei einem pli-Wert zwischen i und
7, beispielsweise zwischen i und 5,
bei geeigneten Temperaturen, vorzugsweise
bei solchen bis zu ungefähr ioo', umsetzt.
-
Als ein Ausgangsstoff des Verfahrens nach der Erfindung dient 2, 4,
5-Triamino-6-oxy-pyrimidin oder seine Tautomeren, z. B. 2, 4, 5-Triamino-pyrimidon-6,
die in bekannter Weise erhältlich sind. Die Verbindung wird gewöhnlich in Form ihres
Sulfats oder Hydrochlorids angewendet, doch kann man gegebenenfalls auch die freie
Base benutzen.
-
Als zweiter Teilnehmer an der Umsetzung sind erfindungsgemäß in bekannter
Weise hergestellie I, I, 3-Trihalogenacetone, deren Halogenatome, wie Chlor, Brom
und Jod, gleicher Art oder voneinander verschieden sein können, zu nennen,
Als
weitere Reaktionsteilnehmer dienen nach der Erfindung p-Aminobenzoesäuren der oben
angegebenen Art. Neben der freien p-Aminobenzoesäure können auch ihre Salze, Ester
oder Amide verwendet werden. Letztere werden erfindungsgemäß bevorzugt, vor allem
die von Aminosäuren, von denen wiederum vor allem Glutaminsäure bevorzugt wird.
Andere verwendbare Aminosäureamide der p-Aminobenzoesäure sind z. B. die des Glykokolls,
der Asparaginsäure, des Leucins, Alanins, Isovalins, Cysteins u. dgl. Als Aminosäure
kann man auch polypeptidartig zusammengesetzte Aminosäuren, z. B. Glutamylglutaininsäure,
Glutamylglutamylglutaminsäure, Glutamylglycylglutaminsäure u. dgl. verwenden. Endlich
kann man auch Salze und Ester dieser Aminosäureamide, z. B. p-Aminobenzoylglutaminsäurediäthylester
verwenden.
-
Diese Ausgangsstoffe werden erfindungsgemäß miteinander nach dem folgenden
allgemeinen Formelschema umgesetzt:
In diesem Formelschema bedeutet X Halogen, R hat die eingangs angegebene Bedeutung.
-
Die Durchführung des Verfahrens erfolgt vorzugsweise in saurer Lösung
bei pli-Werten zwischen i und 7, wobei die besten Ergebnisse bei pli--Werten.
zwischen i und 5 erzielt werden. Die anzuwendenden Temperaturen liegen vorzugsweise
zwischen o und 100'.
-
Die Umsetzung der genannten Ausgangsstoffe bzw. ihr Zusatz zur Reaktionsmischung
kann in beliebiger Reihenfolge stattfinden. Beispielsweise kann man sie alle gleichzeitig
zugeben, oder man kann erst das 2, 4, 5-Triamino-6-oxy-pyrimidin mit dem I, I, 3-Trihalogenaceton
und darauf das Reaktionsprodukt mit der p-Aminobenzoesäure umsetzen. Auch kann man
zuerst die letztere mit dem Trihalogenaceton und darauf das Umsetzungsprodukt mit
dem Pyrimidinderivat reagieren lassen. -
Gegenüber der bekannten Synthese
unter Verwendung von Dihalogenpropionaldehyden bietet das erfindungsgemäße Verfahren
den Vorteil, daß kein Zusatz eines Oxydationsmittels erforderlich ist und keine
Polymerisation des Trihalogenacetons zu befürchten ist.
-
In den nachfolgenden Beispielen sind alle Teile Gewichtsteile, sofern
nicht anders angegeben. Beispiel i Einer Lösung von 12,2 Teilen Bariumchloriddihydrat
in 350 -Teilen Wasser von 6o' wurden r9,9 Teile 2, 4, 5 - Triamino
- 6 - oxy - pyrimidinsulfat zugesetzt. Nach io Minuten Rühren bei
6o' wurde auf 40' abgekühlt und der Mischung 13,3 Teile p-Aminobenzoylglutaminsäure
zugesetzt. Der pl,-Wert der Lösung wurde durch Zusatz von 2o0/,iger NaOH-Lösung
sofort auf ungefähr 3 bis 3,5 eingestellt.
-
Dann wurde unter Rühren innerhalb von 50 Minuten langsam eine
Lösung von 10,3 Teilen i, i-Dichlor-3-bromaceton in 15 Teilen Eisessig zugesetzt,
wobei eine Temperatur von 40' aufrechterhalten und der p#I-Wert der Lösung durch
weiteren Zusatz von 7,00/,iger Na 0 H-Lösung auf 3 bis 3,5 gehalten
wurde. Danach wurde die Mischung 15 Minuten bei 40' gerührt und hierauf durch Eiszusatz
auf 15' abgekühlt und filtriert. Nach Waschen des Filterrückstandes mit Wasser und
Alkohol betrug dieser -->3,5 Teile eines braunen, aus Bariumsulfat und dem Reaktionsprodukt
bestehenden Produktes.
-
Dieses Produkt enthielt ungefähr io,8 0/" Pteroylglutaminsäure und
kann als Tierfutterzusatz ohne weiteres verwendet werden. Seine Reinigung kann durch
eine Reihe von Verfahren erfolgen; bevorzugt wird folgende Methode: Das Rohprodukt
wird in heißem Kalkwasser in einer Konzentration von etwa einem Teil reiner Pteroylglutaminsäure
auf iooo Teile Lösung gelöst, wobei die Temperatur vorzugsweise etwa 70'
und der pH-Wert ungefähr ii,o beträgt. Nach Filtrieren der heißen Lösung wird abgekühlt
und auf einen p#I-Weft zwischen 3 und 4 eingestellt. Die ausfallende Pteroylglutaminsäure
wird durch Filtrieren gewonnen. Zur weiteren Reinigung wird die mit konzentrierter
Salzsäure in einer Menge von etwa ioo Teilen Salzsäure auf je 5 Teile reine
Pteroylglutaminsäure behandelt. wobei sich der größte Teil zu einer klaren braunen
Lösung
löst. Nach Zusatz von 25 Teilen Aktivkohle wird nach 2o Minuten filtriert.
Nun wird der Filterkuchen mit ungefähr 3o Teilen konzentrierter Salzsäure gewaschen,
worauf das mit der Waschflüssigkeit vereinigte Filtrat mit ioo Teilen Wasser verdünnt
und auf etwa 5' abgekühlt wird. Dann wird nach i Stunde filtriert und der
Niederschlag mit Wasser und Aceton gewaschen und getrocknet. Das so erhaltene Produkt
enthält über 8o 0/0 Reinsubstanz und ist für die meisten therapeutischen
Verwendungsarten geeignet. Die Methode kann auch für die Reinigung der nach den
folgenden Beispielen erhaltenen Produkte verwendet werden. Beispiel 2 Einer Lösung
von 12,2 Teilen Bariumchloriddihydrat in 35o Teilen Wasser von 6o' wurden 12,9 Teile
2,4,5-Triamino-6-oxy-pyrimidin zugesetzt. Nach io Minuten Rühren bei 6o' wurde auf
40' abgekühlt, worauf der Mischung 13,3 Teile p-Aminobenzoylglutaminsäure zugesetzt
wurden und der PH-Wert der Lösung gleichzeitig durch Zusatz von 2o0/,iger Na
0 H-Lösung auf 3 bis 3,5 eingestellt wurde.
-
Hierauf wurden unter Rühren innerhalb von 50 Minuten tropfenweise
10,3 Teile I, 3-Dichlori-bromaceton, in 15 Teilen Eisessig gelöst, zugesetzt, wobei
der pl,-Wert der Lösung durch weiteren Zusatz von Zoll/,iger NaOH-Lösung auf
3 bis 3,5 gehalten wurde. Danach wurde die Mischung noch 15 Minuten
bei 40' gerührt und durch Eiszusatz schließlich auf 15' abgekühlt und filtriert.
Nach Waschen mit Wasser und Alkohol erhielt man 2o Teile einer braunen Substanz,
die aus Bariumsulfat und dem Pteroylglutaminsäure enthaltenden Reaktionsprodukt
bestand. Aus der Mutterlauge wurden noch 1,5 Teile eines reineren Produktes erhalten.
Beispiel 3
Einer Lösung von 13,3 Teilen p-Aminobenzoylglutaminsäure in 175
Teilen Wasser, welches durch NaOH-Zusatz auf einen PH-Wert von annähernd io gebracht
worden war, wurden 10,3 Teile i, i-Dichlor-3-bromaceton in 15 Teilen Essigsäure
unter Rühren innerhalb von 2o Minuten zugesetzt, wobei die Temperatur durch Eiszusatz
auf 4 bis io' gehalten wurde. Zur Aufrechterhaltung des pII-Wertes wurde NaOH-Lösung
zugesetzt. Danach wurde das Rühren fortgesetzt und die Temperatur der Mischung auf
Zimmertemperatur ansteigen gelassen. Hierauf wurde die Lösung durch Zusatz von verdünnter
Salzsäure neutralisiert.
-
Diese Lösung wurde dann innerhalb von 15 bis 2o Minuten unter Rühren
bei 40' langsam 175 Teilen einer wäßrigen Lösung von 7, o5 Teilen
2, 4, 5-Triamino-6-oxy-pyrimidinhydrochlorid zugesetzt, wobei der prz-Wert
stets auf annähernd 3,5 bis 4 gehalten wurde. Danach wurde die Mischung bei
40' 15 Minuten lang und schließlich nach Abkühlen durch Eiszusatz i Stunde bei 2o'
gerührt. Danach wurde filtriert und mit Wasser und Alkohol gewaschen. Es wurden
8,1 Teile einer dunklen Substanz, die Pteroylglutaminsäure enthielt, erhalten. Beispiel
4 Einer Lösung von 13,3 Teilen p-Aminobenzoylglutaminsäure in ioo Teilen
Alkohol wurden 10,3 Teile i, i-Dichlor-3-bromaceton zugesetzt. Nach Stehen über
Nacht bei Raumtemperatur wurden der dunkelorange gefärbten Mischung 15 Teile
Eisessig zugegeben.
-
Danach wurde eine Lösung von 12,9 9 2, 4, 5-Triamino-6-oxy-pyrimidinsulfat
zusammen mit 12,2 Teilen Bariumchloriddihydrat in 375 ccm Wasser bei 6o'
hergestellt und diese mit io Teilen Essigsäure und genügend 200/,iger NaOH-Lösung,
um einen pl,-Wert von etwa 4 zu erzielen, behandelt. Die obenerwähnte alkoholische
Lösung wurde nun unter Rühren bei 40' innerhalb 30 Minuten langsam zugesetzt,
wobei der p.H-Wert der Lösung durch Zusatz verdünnter Na 0 H-Lösung annähernd
konstant gehalten wurde. Hierauf wurde 15 Minuten bei 40' gerührt und dann durch
Eiszusatz auf 15' abgekühlt. Nun wurde filtriert und der Filterrückstand mit Wasser
und Alkohol gewaschen. Erhalten wurden 24,5 Teile einer braunen festen Substanz
aus Bariumsulfat und dem Reaktionsprodukt, deren biologische Untersuchung einen
Gehalt von 7J5 0/, Pteroylglutaminsäure ergab. Beispiel 5
Einer Lösung von
12,2 Teilen Bariumchloriddihydrat in 35o Teilen Wasser von 6o' wurden 12,9 Teile
2, 4, 5-Triamino-6-oxy-pyrimidinsulfat zugesetzt. Nach io Minuten Rühren bei 6o'
und Abkühlen der Mischung auf 40' wurden 13,3 Teile p-Aminobenzoylglutaminsäure
zugesetzt und die Lösung durch Zusatz von 3o Teilen 5 n-Salzsäure stark sauer
gemacht. Darauf wurden unter Rühren innerhalb von 40 Minuten tropfenweise 10,3 Teile
I, 3-Dichlor-i-bromaceton, in 15 Teilen Eisessig gelöst, zugesetzt, wobei eine Temperatur
von 40' ohne weitere Zusätze aufrechterhalten wurde. Danach wurde die citrönengelbe
Lösung auf 2o' durch Eiszusatz abgekühlt und ihr pl,-Wert durch Zugabe 200/,iger
Na 0 H-Lösung auf ungefähr 3,5 bis 4 eingestellt, worauf ein brauner Niederschlag
auszufallen begann. Nach einstündigem Rühren bei 2o bis 25' wurde filtriert.
Eine kleine Menge des Produktes wurde aus der Mutterlauge nach Stehen über Nacht
erhalten. Nach Waschen des gesamten Produktes betrug dessen Gewicht :z,6 Teile,
es bestand aus Bariumsulfat und dem Pteroylglutaminsäure enthaltenden Reaktionsprodukt.
Beispiel 6
Einer Lösung von 1?"2 Teilen Bariumchloriddihydrat in 35o Teilen
Wasser von 6o' wurden 12,9 Teile 2,4,5-Triamino-6-oxy-pyrimidinsulfatzugesetzt.
Nach io Minuten Rühren bei 6o' wurde die Mischung au' 40' abgekühlt und ihr 13,3
Teile p-Aminobenzoylglutaminsäure zugesetzt. Sofort wurde dann der pli-Wert der
Lösung mittels 2o0/,iger NaOH-Lösung auf 3 bis 3,5 eingestellt.
-
Der Lösung wurde nun unter Rühren tropfenweise innerhalb von
25 Minuten eine i,:r, 3-Tribromacetonmischung
zugesetzt,
die io,3 Teile I, I, 3-Tribromaceton enthielt, wobei eine Temperatur von 40' aufrechterhalten
und der pli-Wert durch Zusatz von 200/,iger NaOH-Lösung apf 3 bis 4 gehalten
wurde. Danach wurde 15 Minuten bei 40' gerührt und durch Eiszusatz auf 15' abgekühlt
und filtriert. Nach Waschen des Filterrückstandes mit Wasser und Alkohol wurden
23,o Teile einer braunen Substanz erhalten, die Bariumsulfat und das Pteroylglutaminsäure
enthaltende Reaktionsprodukt enthielt. B'eisPiel 7
Einer Lösung von 12,2 Teilen
Bariumchloriddihydrat in 25o Teilen Wasser von 6o' wurden iz,9 Teile 2,4,5-Triamino-6-oxy-pyrimidinsulfatzugesetzt.
Nach io Minuten Rühren bei 6o' wurde vom Bariumsulfat abfiltriert, dem Filtrat ioo
Teile Essigsäure zugegeben und der PH-Wert unter Rühren bei 4o bis 45' auf annähernd
4 eingestellt. Darauf wurden innerhalb von 35 Minuten 10,3 Teile i:, i-DichlOr-3-bromaceton,
in 15 Teilen Essigsäure gelöst, zugesetzt und -.o Minuten bei 40' zusätzlich
gerührt. Hierauf wurde durch Eiszusatz die Temperatur auf 15' herabgesetzt und filtriert.
Nach Waschen mit Wasser und Alkohol ergaben sich 5 Teile einer dunklen Substanz.
-
Die feingepulverte Substanz wurde nun in 2oo Teilen Wasser suspendiert,
worauf verdünnte Salzsäure bis zu einem pil-Wert von etwa i zugesetzt wurde. Hierauf
wurden bei 35 bis 40' 5 Teile p-Aniinobenzoylglutamin-'säure eingerührt,
wonach die Mischung mittels 2o0/,)iger Na 0 H-Lösung alkalisch gemacht (pji
8) und i Stunde bei 4o' gerührt wurde. Dann wurde durch Eiszusatz auf 15'
abgekühlt und bei dieser Temperatur nach Zusatz von verdünnter Salzsäure auf einen
pjl-Wert von 4 15 Minuten gerührt. Danach wurden 2 Teile Diatomeenerde zugesetzt,
worauf filtriert und der Rückstand mit Wasser und Alkohol gewaschen wurde. Erhalten
wurden 7,5 Teile einer festen Substanz, die aus 2 Teilen Diatomeenerde und
dem Pteroylglutaminsäure enthaltenden Reaktionsprodukt bestand. Beispiel
8
12,9 Teile 2,4,5-Trian-iino-6-oxy-pyrimidinsulfat wurden zu einer Lösung
von 12,-- Teilen Bariumchloriddihydrat in 2oo Teilen Wasser bei 6o' zugesetzt und
io Minuten bei dieser Temperatur gerührt. Nach Ab-
kühlung der Lösung auf
40' wurden io Teile Essigsäure und iz Teile 2o0/,iger Na 0 H-Lösung unter
Einstellung des pH-Wertes auf annähernd 3,5 zugegeben.
-
Darauf wurden 13,3 Teile p-Aminobenzoylglutaminsäure in 2oo Teilen
Wasser gelöst und dieser Lösung 5 Teile 5 n-Salzsäure und
5 Teile Eisessig zugesetzt. Durch Zusatz von 2o0/,iger NaOH-Lösung wurde
der pli-Wert auf 3 bis 3,5 eingestellt, worauf bei 4o' unter Zusatz
von etwas Eis innerhalb von 20 Minuten unter Rühren 10,3 Teile i, i-Dichlor-3-bromaceton
eingetragen wurden. Nun wurde bei 40' 15 Minuten weitergerührt und die Mischung
dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Nach Zusatz von 15 Teilen Essigsäure
wurde diese Lösung innerhalb von 3o Minuten bei 40' langsam unter Rühren der oben
beschriebenen 2, 4,5-Triamino-6-oxy-pyhrnidin-Lösung zugesetzt, wobei der p11-Wert
durch Zusatz 2o0/,iger NaOH-Lösung auf etwa 3,5 gehalten wurde. Nach 15 Minuten
weiterem Rühren bei 40' wurde durch Eiszusatz abgekühlt und 15 Minuten bei 15' gerührt.
Hierauf wurde filtriert und der Filterrückstand mit Wasser und Alkohol gewaschen.
Erhalten wurden 24,4 Teile einer lichtbraunen festen Substanz, die aus Bariumsulfat
und ungefähr 11,9 0/, Pteroylglutanünsäure bestand. Beispiel 9
Einer
Lösung von ig,7, Teilen Bariumehloriddihydrat in 35o Teile " n Wasser von
6o' wurden 12,9 Teile 2,4,-5-Triamino-6-oxypyrimidinsulfat zugesetzt. Nach io Minuten
Rühren bei 6o' wurde die Mischung auf 40' abgekühlt und mit 13,3 Teilen p-Aminobenzoylglutaminsäure
versetzt. Ihr pu-Wert wurde durch Zusatz von 2o0/,iger NaOH-Lösung auf
3 bis 3,5 eingestellt.
-
Dann wurde eine Lösung von 7,3 Teilen (o,o5 Mol) I, I, 3-Trichloraceton
in 15 Teilen Essigsäure innerhalb i Stunde tropfenweise bei 40' unter Rühren zugesetzt,
wobei der pH-Wert durch Zusatz ?o0/,)iger NaOH-Lösung auf 3 bis
3,5 gehalten wurde. Hierauf wurde die Mischung weitere 15 Minuten bei 40'
gerührt und nun durch Eiszusatz auf 15' abgekühlt. Nach weiteren io Minuten Rühren
wurden durch Filtrieren und Waschen des Filterrückstandes mit Wasser und Alkohol
?,o,o Teile einer festen braunen Substanz gewonnen, die aus Bariumsulfat und roher
Folinsäure bestand. Beispiel io Zu 4oo Teilen Wasser wurden 2o,6 Teile 2, 4, 5-Triamino-6-oxy-pyrimidinsulfat
und 21 Teile Bariumchloriddihydrat zugesetzt und die Mischung 2o Minuten auf 6o'
erhitzt. Ihr wurden dann 21,1 Teile p-Aminobenzoyl-y - glutamyl
-y -glutamyl - glutaminsäure, in 44o Teilen Wasser gelöst, zugesetzt
und der PH-Wert mittels 2o0/,iger Na0 H-Lösung auf 3 bis 3,5 eingestellt.
Nach Erreichung einer Temperatur von 75 bis 8o' wurden 4o Teile I, I, 3-Tribiomaceton
innerhalb von 5 Minuten zusammen mit 2o0/,iger Na 0 H-Lösung zugesetzt,
wobei der pil-Wert auf 3 bis 3,5 gehalten wurde. Das Gemisch wurde
dann i Stunde auf 75 bis 8o' erhitzt, wobei der pl,-Wert durch Zusatz 2o"/,iger
NaOH-Lösung gehalten wurde. Nach Abkühlen auf io' wurde die dunkelrotbraune Lösung
filtriert und der Rückstand mit einer kleinen Menge Eiswasser gewaschen. Der nasse
Filterkuchen enthielt 8 Teile Pteroyl-y-glutamyl-y-glutamyl-glutaminsäure,
also 3o,60/0 der Theorie, bezogen auf die angewandte p-Aminobenzoyl-y-glutamyl-y-glutamyl-glutan-linsäure.
-
Zur Reinigung wurde eine Menge des Produktes, die io,6 Teile Pteroyl--y-glutamyl-,y-glutamyl-glutaminsäure
enthielt, in io 6oo Teilen einer oj n-Natronlauge aufgeschlemmt. Die Temperatur
wurde nun auf 6o' und das Volumen der Lösung auf io 7oo Teile erhöht, worauf bei
5o bis 55' 26o Teile einer 300/,igen Calciumchloridlösung sowie ioo Teile
Diatomeenerde zugesetzt -vvurden. Nach Filtrieren wurde ein Filtrat von 11350
Volumteilen erhalten, das 5,99 Teile Pteroyl-,y-glutamyl-,y-glutainyl-glutaminsäure
größerer Reinheit enthielt. Das Produkt wurde durch Bildung des Zinksalzes bei einem
pR von io bis io,8, Entfernung
der unlöslichen Stoffe und Einstellen
auf pil 6,7 bis 6,9
und Ausfällung weiter gereinigt.