DE69938507T2

DE69938507T2 - Fragment des "connective tissue growth factor" (ctgf)

Info

Publication number: DE69938507T2
Application number: DE69938507T
Authority: DE
Inventors: Gary R. Miami GROTENDORST; Thomas B. Atherton Neff
Original assignee: Fibrogen Inc; University of Miami
Current assignee: Fibrogen Inc; University of Miami
Priority date: 1998-12-14
Filing date: 1999-12-14
Publication date: 2009-06-10
Anticipated expiration: 2019-12-15
Also published as: HK1041005B; DK1140969T3; ATE364617T1; WO2000035939A3; JP4634614B2; MXPA01005949A; EP1140964A4; HK1041268B; ATE391724T1; AU2004205171A1; JP4722290B2; EP1140969A1; US20030180300A1; CN1334820A; AU775391B2; KR20010101207A; CN1334819A; JP2002532084A; HK1041005A1; AU2004205171B2

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Fachgebiet der Wachstumsfaktoren und insbesondere Fragmente des Bindegewebsfaktors („Connective Tissue Growth Factor", CTGF) und Verfahren zu deren Verwendung.
Hintergrund der Erfindung
Wachstumsfaktoren: Wachstumsfaktoren können im weitesten Sinn als multifunktionelle, lokal wirkende, intrazelluläre Signalpolypeptide definiert werden, welche sowohl die Ontogenie als auch die Erhaltung der Form und Funktion von Gewebe steuern. Die Proteinprodukte zahlreicher Proto-Onkogene wurden als Wachstumsfaktoren und Wachstumsfaktor-Rezeptoren identifiziert.
Wachstumsfaktoren stimulieren im Allgemeinen Zielzellen zu proliferieren, sich zu differenzieren und sich zu sich entwickelnden Geweben zu organisieren. Die Wirkung von Wachstumsfaktoren ist von ihrer Bindung an spezifische Rezeptoren abhängig, welche ein signalgebendes Ereignis innerhalb der Zelle stimulieren. Beispiele von Wachstumsfaktoren schließen den Thrombocytenwachstumsfaktor („Platelet Derived Growth Factor", PDGF), insulinartigen Wachstumsfaktor („Insulinlike Growth Factor", IGF), transformierenden Wachstumsfaktor beta „Transforming Growth Factor Beta", TGF-β), transformierenden Wachstumsfaktor alpha „Transforming Growth Factor Alpha", TGF-α), epidermalen Wachstumsfaktor („Epidermal Growth Factor", EGF) und „Connective Tissue Growth Factor" (CTGF) ein. Über jeden dieser Wachstumsfaktoren wurde berichtet, dass er Zellen stimuliert zu proliferieren.
Bindegewebswachstumsfaktor: Der CTGF ist ein Cystein-reiches monomeres Peptid mit einem Molekulargewicht von etwa 38 kD. Wie schon früher berichtet, übt der CTGF sowohl eine mitogene als auch eine chemotaktische Wirkung auf Bindegewebszellen aus. Der CTGF wird durch Zellen ausgeschieden, und man nimmt an, dass er bei Wechselwirkung mit einem spezifischen Zellrezeptor aktiv ist.
Der CTGF ist ein Mitglied einer Familie von Wachstumsregulatoren, welche z. B. den Maus-(fisp-12) und Mensch-CTGF, Cyr61 (Maus), Cef10 (Huhn) und Nov (Huhn) einschließen. Aufgrund von Sequenzvergleichen wurde vorgeschlagen, dass die Mitglieder dieser Familie eine modulare Struktur aufweisen, die typischerweise aus mindestens einem der folgenden Teile besteht: (1) einer insulinartigen Wachstumsfaktor-Domäne, die für die Bindung verantwortlich ist; (2) einer von Willebrand-Faktor-Domäne, die für die Komplexbildung verantwortlich ist; (3) einer Thrombospondin Typ-I-Wiederholungseinheit, die möglicherweise für die Bindung von Matrixmolekülen verantwortlich ist; und (4) einem C-terminalen Baustein, der in Matrixproteinen gefunden wird und für den postuliert wird, dass er für die Rezeptorbindung verantwortlich ist.
Die Sequenz der cDNA für den menschlichen CTGF enthält ein offenes Leseraster von 1047 Nucleotiden, mit einer Initiationsstelle etwa bei Nucleotid 130 und einer TGA-Terminationsstelle etwa bei Nucleotid 1177, und codiert ein Peptid von 349 Aminosäuren. Die cDNA-Sequenz für den menschlichen CTGF wurde schon früher im US-Patent Nr. 5 408 040 offenbart.
Das offene Leseraster des CTGF codiert ein Polypeptid, welches 39 Cysteinreste enthält, dies weist auf ein Protein mit mehreren intramolekularen Disulfidbindungen hin. Der Aminoterminus des Peptids enthält eine hydrophobe Signalsequenz, die auf ein ausgeschiedenes Protein hinweist, und außerdem gibt es zwei N-gekoppelte Glycosylierungsstellen an den Asparaginresten 28 und 225 in der Aminosäuresequenz.
Man nimmt an, dass die Synthese und die Sekretion des CTGF durch TGF-β und BMP-2 und außerdem möglicherweise durch andere Mitglieder der TGF-β-Superfamilie von Proteinen selektiv induziert werden. Wie auf dem Fachgebiet berichtet, kann zwar der TGF-β das Wachstum normaler Fibroblasten in Weichagar stimulieren, jedoch kann der CTGF alleine diese Eigenschaft in Fibroblasten nicht induzieren. Jedoch wurde gezeigt, dass die Synthese und die Wirkung von CTGF für den TGF-β essentiell sind, um ein Verankerungs-unabhängiges Fibroblasten-Wachstum stimulieren zu können. (Vgl. z. B. Kothapalli et al., 1997, Cell Growth & Differentiation 8 (1): 61–68; und Boes et al., 1999, Endocrinology 140 (4): 1575–1580.)
Hinsichtlich der biologischen Aktivität von CTGF wurde berichtet, dass sie hauptsächlich mitogener Natur ist (wobei Zielzellen stimuliert werden können zu proliferieren). Außerdem wurde berichtet, dass der CTGF eine chemotaktische Aktivität besitzt. Bezüglich der Pathologie wurde berichtet, dass das vollständige CTGF-Molekül an Zuständen beteiligt ist, bei denen ein zu starkes Wachstum von Bindegewebszellen und eine zu starke Ablagerung der extrazellulären Matrix vorliegt. Außerdem wurde auf dem Fachgebiet beschrieben, dass der CTGF mit Zuständen assoziiert ist, die mit der Wanderung und Proliferation von Gefäßendothelzellen und der Gefäßneubildung zusammenhängen. Die Krankheiten und Störungen, die mit diesen Zuständen zusammenhängen, schließen z. B. Fibrose der Haut und wichtiger Organe, Krebs und verwandte Krankheiten und Störungen wie systemische Sklerose, Angiogenese, Atherosklerose, diabetische Nephropathie und renalen Bluthochdruck ein. (Vgl. z. B. Toshifumi et al., 1999, Journal of Cellular Physiology 18191): 153–159; Shimo et al., 1999, Journal of Biochemistry 126 (1): 137–145; Murphy et al., 1999, Journal of Biological Chemistry 274 (9): 5830–5834; Wenger et al., 1999, Oncogene 18 (4): 1073–1080; Frzier et al., 1997, International Journal of Biochemistry & Cell Biology 29 (1): 153–161; Oemar et al., 1997, Circulation 95 (4): 831–839.)
Außerdem wurde berichtet, dass der CTGF in der Wundheilung und Reparatur von Bindegewebe, Knochen und Knorpel von Nutzen ist. Unter diesem Aspekt wurde der CTGF als ein Induktor der Knochen-, Gewebe- oder Knorpelbildung bei Störungen wie Osteoporose, Osteoarthritis oder Osteochondritis, Arthritis, Krankheiten des Skeletts, hypertrophe Narbenbildung, Verbrennungen, Gefäßhypertrophie oder Wundheilung beschrieben. Vgl. z. B. US-Patent Nr. 5837258 ; Ohnishi et al., 1998, Journal of Molecular and Cellular Cardiology 30 (11): 2411–2422; Nakanishi et al., 1997, Biochemical and Biophysical Research Communications 234 (1): 206–210; Pawar et al., 1995, Journal of Cellular Physiology 165 (3): 556–565.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass der CTGF mit zahlreichen fibrotischen und kanzerösen Zuständen in Verbindung gebracht wurde und dass seine Beteiligung an der Wundheilung beschrieben wurde. Als Ergebnis hiervon besteht auf dem Fachgebiet ein Bedarf, geeignete Verfahren zum Modulieren der Aktivität des CTGF zu identifizieren, um damit diese verschiedenen Krankheiten und Zustände behandeln zu können. Vor der vorliegenden Erfindung gab es keinen Bericht darüber, dass Regionen oder Domänen von CTGF für die Signalgebung unterschiedlicher biologischer Aktivitäten verantwortlich sind. Außerdem gab es vor der vorliegenden Erfindung noch keine Offenbarung einer Behandlung von Krankheiten und Störungen, die mit der Zellproliferation und/oder der Überproduktion der extrazellulären Matrix assoziiert sind, durch Hemmen der biologischen Aktivität einer spezifischen Region oder Domäne von CTGF.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Ausführungsformen, die in den Patentansprüchen angegeben sind. Die Beschreibung beschreibt neue Zusammensetzungen und Verfahren für die Behandlung von CTGF-assoziierten Krankheiten, Störungen oder Gebrechen, an denen die Induktion der Zellproliferation, z. B. der Fibroblasten-Proliferation, beteiligt ist. Genauer gesagt umfassen die beschriebenen Zusammensetzungen CTGF-Fragmente, welche die C-terminale Region von CTGF umfassen.
In einem Aspekt wird ein Fragment des Bindegewebsfaktors(CTGF)-Polypeptids bereitgestellt, das eine mitogene Aktivität besitzt. Ein hier beschriebenes Fragment schließt einen CTGF ein, der eine Aminosäuresequenz besitzt, welche durch mindestens Exon 4, wie in 2 dargestellt, codiert ist. Ein Fragment kann auch eine Aminosäuresequenz einschließen, die durch mindestens Exon 5, wie in 2 dargestellt, codiert ist. Weiterhin kann ein CTGF-Fragment der Erfindung eine Aminosäuresequenz einschließen, die durch mindestens die Exons 4 und 5, wie in 2 dargestellt, codiert ist. Außerdem stellt die Erfindung Polynucleotidsequenzen, welche solche Fragmente codieren, bereit.
In einem spezielleren Aspekt umfasst das CTGF-Fragment der vorliegenden Erfindung mindestens einen Teil der Exons 4 oder 5 von CTGF, und weiterhin besitzt es eine mitogene Aktivität. In einem weiteren Aspekt umfasst das Fragment der vorliegenden Erfindung zwischen ¼ und ½ der Länge des vollständigen CTGF-Polypeptids.
Die Beschreibung umfasst weiterhin Verfahren, in denen die CTGF-Fragmente der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Zusammensetzungen zu identifizieren, welche die mitogene Aktivität der CTGF-Fragmente modulieren können. Insbesondere können die CTGF-Fragmente eingesetzt werden, um Zusammensetzungen zu identifizieren, welche die Aktivität der CTGF-Fragmente beeinflussen können, z. B. indem sie die mitogene Aktivität der CTGF-Fragmente hemmen, unterdrücken oder steigern.
Die Zusammensetzungen umfassen außerdem CTGF-Modulatoren, z. B. Antikörper, Antisense-Moleküle, kleine Moleküle und andere Verbindungen, die durch die vorstehenden Verfahren identifiziert wurden und die Aktivität der CTGF-Fragmente der vorliegenden Erfindung modulieren können. In einem Aspekt stellt die Beschreibung CTGF-Modulatoren bereit, welche die mitogene Aktivität von CTGF hemmen oder unterdrücken. In einem anderen Aspekt steigern die CTGF-Modulatoren die mitogene Aktivität von CTGF, z. B. bei Indikationen, bei denen die Induktion der CTGF-Aktivität wünschenswert ist, z. B. bei der Wundheilung, der Wiederherstellung von Gewebe oder der Wiederherstellung von Knochen.
In einem anderen Aspekt umfassen die Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge der CTGF-Fragment-Modulatoren, alleine oder in Kombination mit einer oder mehreren Verbindungen, an einen Patienten, bei dem eine Behandlung von solchen Krankheiten, Störungen oder Gebrechen, bei denen die Manipulation der mitogenen Aktivität gewünscht wird, erforderlich ist oder bei dem das Risiko besteht, dass eine solche Behandlung erforderlich ist. Insbesondere betreffen die Verfahren die Verwendung der Verbindungen, die in der Lage sind, die Aktivität der CTGF-Fragmente der vorliegenden Erfindung, die mitogene Aktivität zu kontrollieren, zu modulieren und folglich Störungen zu behandeln, welche mit der im Übermaß auftretenden Zellproliferation in Zusammenhang stehen, einschließlich fibrotischer und kanzeröser Störungen.
Die Beschreibung beschreibt Arzneimittel, welche die CTGF-Fragmente der vorliegenden Erfindung umfassen. Solche Zusammensetzungen können in der Wundheilung, der Wiederherstellung von Knochen und Gewebe eingesetzt werden, wobei die erhöhte Aktivität von CTGF wünschenswert ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine graphische Darstellung, welche zeigt, dass CTGF-Fragmente der vorliegenden Erfindung die Mitogenese in NRK-Zellen stimulieren.
Die 2A und 2B zeigen die Nucleinsäuresequenz (SEQ ID NO: 1) und die Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2) des vollständigen CTGF-Moleküls, wobei die Lage der Exons des CTGF-Moleküls angegeben ist.
3 zeigt die Nucleinsäuresequenz (SEQ ID NO: 3) und die Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 4) der C-terminalen Domäne von CTGF, umfassend Exon 4 und Exon 5 des CTGF-Moleküls.
In 4 sind Daten dargestellt, welche die Hemmung der DNA-Synthese in NRK-Fibroblasten durch anti-CTGF-Antikörper betreffen.
In 5 sind Daten dargestellt, welche die Stimulation der DNA-Synthese in NRK-Fibroblasten durch die C-terminale Domäne von CTGF betreffen.
In 6 sind Daten dargestellt, welche die Effekte von EGF auf die mitogene Aktivität von CTGF betreffen.
7 zeigt die selektive Hemmung der DNA-Synthese durch anti-CTGF-C-Terminus-IgG.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Es ist so zu versehen, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die bestimmte, hier beschriebene Methodik, die bestimmten, hier beschriebenen Protokolle, Zelllinien, Vektoren und Reagenzien usw. beschränkt ist, da diese variieren können. Außerdem ist es so zu verstehen, dass die hier verwendete Terminologie lediglich zum Zweck der Beschreibung bestimmter Ausführungsformen verwendet wird und in keiner Weise den Umfang der vorliegenden Erfindung einschränken soll. Außerdem ist anzumerken, dass die wie hier und in den angefügten Patentansprüchen verwendeten Singularformen „ein, eine" und „der, die, das" den Bezug auf den Plural einschließen, solange der Zusammenhang nicht eindeutig etwas anderes vorgibt. Somit bedeutet z. B. ein Bezug auf „einen Antikörper" einen Bezug auf einen oder mehrere Antikörper und Äquivalente davon, die dem Fachmann bekannt sind, usw..
Sofern es nicht anders definiert ist, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, die auf dem Fachgebiet, zu dem die Erfindung gehört, üblicherweise geläufig ist. Bevorzugte Verfahren, Vorrichtungen und Stoffe sind beschrieben, wobei jedoch beliebige Verfahren und Stoffe, die den hier beschriebenen ähnlich oder gleichwertig sind, bei der Durchführung oder beim Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
Definitionen
Der wie hier verwendete Begriff „CTGF-Fragment" bezieht sich auf ein Fragment, das mindestens einen Teil der C-terminalen Region von CTGF umfasst. In einer Ausführungsform umfasst das Fragment mindestens einen Teil der Exons 4 oder 5 des vollständigen CTGF-Proteins, und es besitzt weiterhin eine mitogene Aktivität. In einer weiteren Ausführungsform liegt das Fragment zwischen etwa ¼ und ½ der Länge des vollständigen CTGF-Proteins. „Mitogene Aktivität" soll die Fähigkeit bedeuten, die Zellproliferation wie die Fibroblasten-Proliferation zu stimulieren oder zu induzieren. Die CTGF-Fragmente können entweder durch Isolation aus natürlichen Quellen, durch synthetische Herstellung, durch gentechnische Rekombinationsverfahren oder andere Techniken, die auf dem Fachgebiet verfügbar sind, erhalten werden.
Der wie hier verwendete Begriff „C-Terminus" bezieht sich auf die Nucleinsäuresequenz, die mindestens einen Teil von Exon 5 und stärker bevorzugt mindestens einen Teil der Exon-4- oder Exon-5-Domänen des vollständigen CTGF-Moleküls umfasst, und auf die dadurch codierten Polypeptide; wie in den 2A und 2B angegeben. Der Begriff „Exon 4" bezieht sich auf die Nucleinsäuresequenz der C-terminalen Domäne des vollständigen CTGF-Moleküls. Der Begriff „Exon 5" bezieht sich auf die Nucleinsäuresequenz der C-terminalen Domäne des vollständigen CTGF-Moleküls und die codierte Aminosäuresequenz.
Der wie hier verwendete Begriff „N-Terminus" bezieht sich auf die Nucleinsäuresequenz, die Exon-2- und Exon-3-Domänen des vollständigen CTGF-Moleküls umfasst, und auf die entsprechende Aminosäuresequenz, wie in den 2A und 2B angegeben.
Die wie hier verwendeten Begriffe „Störungen" und „Krankheiten" beziehen sich auf Zustände, die mit der Expression oder der Aktivität von CTGF assoziiert sind („CTGF-assoziierte Krankheiten oder Störungen"). Krankheiten, Störungen und Zustände, die mit CTGF assoziiert sind, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf übermäßige Narbenbildung, die eine Folge von akuten oder wiederholten Traumata ist, einschließlich Operation oder Strahlentherapie, Fibrose von Organen wie der Niere, Lunge, Leber, den Augen, des Nerzes und der Haut, einschließlich Skleroderma, Keloide und hypertropher Narbenbildung. Eine abnorme Expression von CTGF wurde mit einer allgemeinen Narbenbildung des Gewebes, einem tumorähnlichen Wachstum in der Haut und einer anhaltenden Narbenbildung bei Blutgefäßen assoziiert, die zu einer beeinträchtigten Fähigkeit des Bluttransports, zu Bluthochdruck, Hypertrophie usw. führt. Außerdem sind mit CTGF verschiedene Krankheiten assoziiert, die durch eine Proliferation oder Migration von Gefäßendothelzellen verursacht werden, wie Krebs, einschließlich Dermatofibrome, Zustände, welche mit einer abnormen Expression von Endothelzellen zusammenhängen, Desmoplasie bei Brustkrebs, Angiolipom und Angioleiomyom. Andere verwandte Zustände schließen Atherosklerose und systemische Sklerose, einschließlich atherosklerotischer Plaques, entzündliche Darmerkrankung, Morbus Crohn, Angiogenese und andere proliferative Prozesse, die möglicherweise eine zentrale Rolle bei Atherosklerose, Arthritis, Krebs und anderen Krankheitszuständen spielen, Gefäßneubildung, die am Glaukom beteiligt ist, Entzündung aufgrund einer Erkrankung oder Verletzung, einschließlich Gelenkentzündung, Metastasierung bei Tumorwachstum, Darmerkrankung, dermatologische Krankheiten, Arthritis, einschließlich chronischer rheumatoider Arthritis, Arteriosklerose, Diabetes, einschließlich diabetischer Nephropathie, Bluthochdruck und anderer Nierenstörungen, und Fibrose, welche die Folge einer Chemotherapie, Strahlenbehandlung, Dialyse ist, sowie die Abstoßung eines allogenen Transplantats und eines Transplantats ein.
Die wie hier angegebenen „fibroproliferativen" Störungen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf eine der vorstehend aufgeführten Krankheiten oder Störungen, z. B. Nierenfibrose, Sklerodermie, Lungenfibrose, Arthritis, hypertrophe Narbenbildung und Atherosklerose. Außerdem schließen CTGF-assoziierte fibroproliferative Störungen die diabetische Nephropathie und Retinopathie, Bluthochdruck und andere Nierenerkrankungen, mit Angiogenese zusammenhängende Störungen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Blutgefäße, die mit einer Tumorbildung assoziiert sind, und andere proliferative Prozesse, die möglicherweise eine zentrale Rolle bei der Atherosklerose, Arthritis und anderen Krankheitszuständen, und z. B. bei Haut-, Herz- und Lungen- sowie Nierenfibrose spielen, ein. Im Allgemeinen sind hier schwere Fibrosen eingeschlossen, welche Niere, Leber, Lunge und Herzkreislaufsystem betreffen. Es gibt zahlreiche Beispiele von Fibrose, einschließlich der Bildung von Narbengewebe nach einem Herzanfall, wodurch die Fähigkeit des Nerzes zu pumpen beeinträchtigt wird. Diabetes verursacht häufig eine Schädigung der/Vernarbung in den Nieren, die zu einem fortschreitenden Verlust der Nierenfunktion führt. Auch nach einer Operation kann sich Narbengewebe zwischen inneren Organen bilden, wodurch es zu Kontraktur, Schmerzen und in einigen Fällen zu Unfruchtbarkeit kommen kann. Wichtige Organe wie Herz, Niere, Lunge, Auge und Haut sind für eine chronische Vernarbung anfällig, die üblicherweise mit anderen Krankheiten assoziiert ist. Hypertrophe Narben (nicht-maligne Gewebemasse) sind eine häufige Form von Fibrose, die durch Verbrennungen und andere Traumata verursacht wird. Außerdem gibt es eine Reihe anderer fibroproliferativer Störungen wie Sklerodermie, Keloide und Atherosklerose, die mit einer allgemeinen Narbenbildung, einem tumorartigen Wachstum in der Haut bzw. einer anhaltenden Narbenbildung von Blutgefäßen, welche die Fähigkeit des Bluttransports beeinträchtigt, assoziiert sind. Da CTGF bei fibrotischen Störungen überexprimiert wird, stellt es ein sehr spezifisches Ziel für die Entwicklung von anti-fibrotischen Therapeutika dar. CTGF kann durch die Verwendung kleiner Moleküle und neutralisierender Antikörper gehemmt werden, z. B. bei der Behandlung fibroproliferativer Störungen. Es ist so zu verstehen, dass „fibroproliferativ" sich auf einen der vorstehenden pathologischen Fälle bezieht und nicht auf die Proliferation von Zellen beschränkt sein sollte.
„Extrazelluläre Matrizen (ECM)" sind Multi-Komponenten-Strukturen, die durch verschiedene Zelltypen synthetisiert werden und diese umgeben, einschließlich z. B. Endothel-, Epithel-, Epidermal- und Muskelzellen. Die ECM wird größtenteils aus Kollagen und Heparansulfat-Proteoglycanen gebildet. Die ECM enthält auch h1-Fibronectin-, Vitronectin-, Chondroitinsulfat-Proteoglycane und kleinere Proteine. Wachstumsfaktoren werden in diese Matrizen durch Assoziation mit dem Glycosaminoglycan-Teil der Heparansulfat-Proteoglycane abgesondert. „Heparin-artige" Regionen mit hohem Iduronsäure-Gehalt und hoher Sulfatierung wurden mit der bFGF-Bindungsregion von Heparansulfat aus menschlichen Fibroblasten assoziiert (Turnbull et al., J. Biol. Chem. 267 (15): 10337–10341, 1992). Jedoch wurde die Zusammensetzung von Heparansulfat in der extrazellulären Matrix noch nicht vollständig aufgeklärt.
Die wie hier verwendeten Begriffe „Nucleinsäure" oder „Nucleinsäuresequenz" beziehen sich auf ein Oligonucleotid, Nucleotid, Polynucleotid oder auf ein Fragment von einem dieser Stoffe, auf DNA oder RNA genomischen oder synthetischen Ursprungs, die einzelsträngig oder doppelsträngig sein kann und einen Sense- oder Antisense-Strang darstellen kann, auf Peptid-Nucleinsäure (PNA) oder auf ein beliebiges DNA- oder RNA-artiges Material natürlichen oder synthetischen Ursprungs.
Die wie hier verwendeten Begriffe „Aminosäure" oder „Aminosäuresequenz" beziehen sich auf eine Oligopeptid-, Peptid-, Polypeptid- oder Proteinsequenz oder auf ein Fragment, einen Teil oder eine Untereinheit von einem davon und auf natürlich vorkommende oder synthetische Moleküle.
„Hybridisierung" bezieht sich auf den Prozess, durch welchen ein Nucleinsäurestrang sich mit einem komplementären Strang durch Basenpaarung vereinigt. Hybridisierungsreaktionen können empfindlich und selektiv sein, so dass eine bestimmte Sequenz von Interesse sogar in Proben identifiziert werden kann, in welchen sie in niedrigen Konzentrationen vorliegt. Geeignete stringente Bedingungen können z. B. durch die Konzentrationen von Salz oder Formamid in den Prähybridisierungs- und Hybridisierungslösungen oder durch die Hybridisierungstemperatur definiert werden und sind auf dem Fachgebiet bekannt. Insbesondere kann die Stringenz erhöht werden, indem die Konzentration von Salz reduziert wird, die Konzentration von Formamid erhöht wird oder die Hybridisierungstemperatur erhöht wird.
Z. B. könnte eine Hybridisierung unter hohen Stringenzbedingungen in etwa 50% Formamid bei etwa 37°C bis 42°C erfolgen. Eine Hybridisierung unter reduzierten Stringenzbedingungen könnte in etwa 35% bis 25% Formamid bei etwa 30°C bis 35°C erfolgen. Insbesondere könnte eine Hybridisierung unter hohen Stringenzbedingungen bei 42°C in 50% Formamid, 5 × SSPE, 0,3% SDS und 200 μg/ml gescherter und denaturierter Lachssperma-DNA erfolgen. Eine Hybridisierung unter Bedingungen reduzierter Stringenz könnte, wie vorstehend beschrieben, erfolgen, jedoch in 35% Formamid bei einer niedrigeren Temperatur von 35°C. Der Temperaturbereich, der einem bestimmten Stringenzgrad entspricht, kann noch weiter eingeengt werden, indem das Purin-zu-Pyrimidin-Verhältnis der Nucleinsäure von Interesse berechnet und die Temperatur dann entsprechend eingestellt wird. Variationen der vorstehenden Bereiche und Bedingungen sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Der Begriff „wesentliche Aminosäure-Homologie" bezieht sich auf Moleküle, die eine Sequenzähnlichkeit von etwa 75% oder mehr, vorzugsweise 85% oder mehr und stärker bevorzugt 90 bis 95% zu einer spezifischen Sequenz aufweisen. Die Begriffe „% Ähnlichkeit" oder „% Identität" beziehen sich auf den Prozentsatz von Sequenzähnlichkeit oder -Identität, der bei einem Vergleich von zwei oder mehr Aminosäure- oder Nucleinsäuresequenzen gefunden wird. Die prozentuale Ähnlichkeit kann durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, bestimmt werden.
Die prozentuale Ähnlichkeit zwischen Aminosäuresequenzen kann z. B. unter Verwendung der Clustal-Methode berechnet werden. (Vgl. z. B. Higgins, D. G., und P. M. Sharp, 1988, Gene 73: 237–244.) Der Clustal-Algorithmus gruppiert Sequenzen in Cluster, indem die Entfernungen zwischen allen Paaren untersucht werden. Die Cluster werden zuerst paarweise und dann in Gruppen aneinander ausgerichtet. Der Prozentsatz der Ähnlichkeit zwischen zwei Aminosäuresequenzen, z. B. Sequenz A und Sequenz B, wird berechnet durch Teilen der Länge von Sequenz A, minus die Zahl von Lücken-Resten in Sequenz A, minus die Zahl von Lücken-Resten in Sequenz B, durch die Summe der Reste-Übereinstimmungen zwischen Sequenz A und Sequenz B, mal 100. Lücken mit niedriger oder keiner Homologie zwischen den zwei Aminosäuresequenzen werden beim Bestimmen des Prozentsatzes der Ähnlichkeit nicht aufgenommen. Der Prozentsatz der Ähnlichkeit kann auch durch andere Verfahren berechnet werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, z. B. durch Variieren der Hybridisierungsbedingungen, und er kann unter Verwendung von Programmen wie des Programms MEGALIGN (DNASTAR Inc., Madison, Wisconsin) elektronisch berechnet werden.
Der Begriff „Kollagen-Untereinheit" bezieht sich auf die Aminosäuresequenz von einer Polypeptidkette eines Kollagenproteins, die durch ein einzelnes Gen codiert ist, und außerdem auf beliebige Derivate dieser Sequenz, einschließlich Deletionsderivate, konservativer Substitutionen usw..
Ein „Fusionsprotein" ist ein Protein, in welchem Peptidsequenzen aus unterschiedlichen Proteinen kovalent miteinander verbunden sind.
Eine „Antisense-Sequenz" ist eine beliebige Sequenz, die in der Lage ist, spezifisch mit einer Zielsequenz zu hybridisieren. Die Antisense-Sequenz kann eine DNA, RNA oder ein beliebiger Nucleinsäure-Imitator oder ein beliebiges Analogon sein. Der Begriff „Antisense-Technologie" bezieht sich auf eine beliebige Technologie, welche auf der spezifischen Hybridisierung einer Antisense-Sequenz mit einer Zielsequenz beruht.
Der wie hier verwendete Begriff „funktionelles Äquivalent" bezieht sich auf ein Protein- oder Nucleinsäuremolekül, welches funktionelle oder strukturelle Eigenschaften eines CTGF-Fragments besitzt. Ein funktionelles Äquivalent eines CTGF-Fragments kann Modifikationen enthalten, abhängig davon, ob solche Modifikationen für die Durchführung einer spezifischen Funktion erforderlich sind. Der Begriff „funktionelles Äquivalent" soll Fragmente, Mutanten, Hybride, Varianten, Analoga oder chemische Derivate eines Moleküls einschließen.
Von einem Molekül wird gesagt, dass es ein „chemisches Derivat" eines anderen Moleküls ist, wenn es zusätzliche chemische Einheiten enthält, die normalerweise nicht Teil des Moleküls sind. Solche Einheiten können die Löslichkeit, Absorption, biologische Halbwertszeit und dergleichen des Moleküls verbessern. Die Einheiten können alternativ die Toxizität des Moleküls herabsetzen, eine beliebige unerwünschte Nebenwirkung des Moleküls eliminieren oder abschwächen und dergleichen. Einheiten, die in der Lage sind, solche Effekte zu vermitteln, sind z. B. in Gennaro, A. R., Hrsg., 1990, „Remingtons Phamaceutical Sciences", 18. Auflg., Mack Publishing Co., Easton PA, beschrieben. Verfahren zum Koppeln solcher Einheiten an ein Molekül sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Eine „Variante" bezieht sich in der Verwendung hier auf eine Aminosäuresequenz, die durch eine oder mehrere Aminosäuren verändert ist. Die Variante kann konservative Austausche aufweisen, wobei eine substituierte Aminosäure ähnliche strukturelle oder chemische Eigenschaften besitzt, z. B. den Ersatz von Leucin durch Isoleucin. Seltener kann eine Variante nicht-konservative Austausche, z. B. den Ersatz eines Glycinrestes durch einen Tryptophanrest, aufweisen. Analoge kleinere Variationen können auch Aminosäure-Deletionen oder -Insertionen oder beides einschließen. Anleitungen für die Bestimmung, welche Aminosäurereste substituiert, eingefügt oder deletiert werden können, lassen sich unter Verwendung von Computerprogrammen finden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, z. B. DNASTAR-Software (DNASTAR Inc., Madison, WI).
Verfahren zum Herstellen von CTGF-Fragmenten
Nucleinsäuresequenzen, die CTGF codieren: Gemäß der Erfindung können Nucleotidsequenzen, die CTGF oder funktionelle Äquivalente davon codieren, wie im US-Patent Nr. 5 408 040 beschrieben, in geeigneten Wirtszellen verwendet werden, um rekombinante DNA-Moleküle zu erzeugen, welche die Expression des vollständigen Proteins oder eines funktionellen Äquivalents davon steuern, oder alternativ Nucleotidsequenzen, welche das gewünschte CTGF-Fragment codieren, z. B. ein Fragment, das mindestens einen Teil der Exons 4 oder 5 von CTGF umfasst.
Alternativ können Nucleotidsequenzen, welche unter stringenten Bedingungen mit Teilen der CTGF-Sequenz hybridisieren, auch in Nucleinsäure-Hybridisierungs-Tests, Southern- und Northern-Blot-Analysen usw. eingesetzt werden. In noch einem weiteren Verfahren können DNA-Moleküle, welche CTGF codieren, durch Hybridisierungsverfahren isoliert werden, umfassend Antikörper-Screening von Expressionsbanken zum Nachweis von gemeinsamen Strukturmerkmalen.
Aufgrund der eigenen Degeneration des genetischen Codes können andere DNA-Sequenzen, welche Proteine mit wesentlicher Aminosäure-Homologie oder eine funktionell äquivalente Aminosäuresequenz codieren, isoliert und bei der Durchführung der Erfindung zur Clonierung und Expression von CTGF oder des CTGF-Fragments verwendet werden. Solche DNA-Sequenzen schließen diejenigen ein, die mit der menschlichen CTGF-Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisieren können.
Veränderte DNA-Sequenzen, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, schließen Deletionen, Additionen oder Substitutionen unterschiedlicher Nucleotidreste ein, die zu einer Sequenz führen, welche das gleiche oder ein funktionell äquivalentes Genprodukt codieren. Das Genprodukt selbst kann Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten innerhalb der CTGF-Sequenz enthalten, die zu einem stummen Austausch führen, wodurch ein funktionell äquivalentes Protein produziert wird. Solche Aminosäure-Substitutionen können auf Grundlage von Ähnlichkeit in Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobie, Hydrophilie und/oder der amphipatischen Natur der beteiligen Reste erfolgen. Z. B. schließen negativ geladene Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure ein; positiv geladene Aminosäuren schließen Lysin und Arginin ein; Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen, die ähnliche Hydrophobie-Werte aufweisen, schließen die folgenden Aminosäuren ein: Leucin, Isoleucin, Valin; Glycin, Alanin; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Phenylalanin, Tyrosin.
Die DNA-Sequenzen der Erfindung können gentechnisch bearbeitet werden, so dass die Sequenz des Proteins verändert wird, wobei dies den verschiedensten Zwecken dienen kann, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Änderungen, welche die Prozessierung und Expression des Genprodukts modifizieren. Z. B. können Mutationen unter Verwendung von Verfahren eingeführt werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie ortsgerichtete Mutagenese, um z. B. neue Restriktionsstellen einzuführen. Z. B. können die Wirtszellen in bestimmten Expressionssystemen wie Hefe das Genprodukt überglycosylieren. Wenn man solche Expressionssysteme einsetzt, kann es bevorzugt sein, eine CTGF- oder CTGF-Fragment-codierende Sequenz so zu verändern, dass jegliche N-gekoppelte Glycosylierungsstelle eliminiert wird.
Die CTGF- oder CTGF-Fragment-Sequenz kann an eine heterologe Sequenz gekoppelt werden, so dass ein Fusionsprotein codiert wird. Z. B. kann es zum Durchmustern von Peptidbanken günstig sein, ein chimäres CTGF-Protein zu codieren, welches ein heterologes Epitop exprimiert, das durch einen kommerziell verfügbaren Antikörper erkannt wird. Ein Fusionsprotein kann auch so gentechnisch bearbeitet werden, dass es eine Spaltstelle enthält, die zwischen der CTGF- oder CTGF-Fragment-Sequenz und der heterologen Proteinsequenz liegt (z. B. eine Sequenz, welche einen mit PDGF verwandten Wachstumsfaktor codiert), so dass der CTGF oder ein CTGF-Fragment von der heterologen Einheit abgespalten werden kann. Solche Verfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Die codierende Sequenz von CTGF oder eines CTGF-Fragments kann auch im Ganzen oder als Teil synthetisiert werden, indem chemische Verfahren eingesetzt werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. (Vgl. z. B. Caruthers et al., 1980, Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 7: 215–233; Crea und Horn, 1980, Nucleic Acids Res. 9 (10): 2331: Matteucci und Caruthers, 1980, Tetrahedron Letters 21: 719; und Chow und Kempe, 1981, Nucleic Acids Res. 9 (12): 2807–2817.) Alternativ könnte das Protein selbst unter Verwendung chemischer Verfahren produziert werden, wodurch die CTGF-Aminosäuresequenz im Ganzen oder als Teil produziert wird. Z. B. können Peptide durch Festphasen-Verfahren synthetisiert, vom Harz abgespalten und durch präparative Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt werden. Vgl. z. B. Creighton, 1983, „Proteins Structures And Molecular Prinicples", W. H. Freeman und Co., NY, S. 50–60. Die Zusammensetzung der synthetischen Peptide kann durch Aminosäureanalyse oder Sequenzierung bestätigt werden. Vgl. z. B. für das Verfahren des Edman-Abbaus: Creighton, 1983, „Proteins, Structures And Molecular Prinicples", W. H. Freeman und Co., NY, S. 34–49.
Expression von CTGF oder eines CTGF-Fragments: Um ein biologisch aktives CTGF-Fragment zu exprimieren, wird die Nucleotidsequenz, welche das vollständige Protein oder ein funktionelles Äquivalent davon, wie vorstehend beschrieben, das CTGF-Fragment, codiert, in einen geeigneten Expressionsvektor eingefügt, d. h. einen Vektor, der die erforderlichen Elemente für die Transkription und Translation der eingefügten codierenden Sequenz enthält.
Genauer gesagt können Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, eingesetzt werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, welche die CTGF- oder CTGF-Fragment-Sequenz und geeignete Transkriptions-/Translations-Kontrollsignale enthalten. Diese Verfahren schließen in vitro-DNA-Rekombinations-Techniken, Syntheseverfahren und eine in vivo-Rekombination/genetische Rekombination ein. Vgl. z. B. die Verfahren, die in Maniatis et al., 1989, „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY; und Ausubel et al., 1989, „Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY, beschrieben sind.
Eine Vielzahl von Wirts-Expressionssystemen kann verwendet werden, um die CTGF- oder CTGF-Fragment-codierende Sequenz zu exprimieren. Diese schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Mikroorganismen wie Bakterien, die mit rekombinanten Bakteriophagen-DNA-, Plasmid-DNA- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren, welche die CTGF- oder CTGF-Fragment-codierende Sequenz enthalten, transformiert sind; Hefen, einschließlich Pichia pastoris und Hansenula polymorpha, die mit rekombinanten Hefe-Expressionsvektoren, welche die CTGF- oder CTGF-Fragment-codierende Sequenz enthalten, transformiert sind; Insektenzellsysteme, die mit rekombinanten Virus-Expressionsvektoren (z. B. Baculovirus), welche CTGF- oder CTGF-Fragment-codierende Sequenz enthalten, infiziert sind; Pflanzenzellsysteme, welche mit rekombinanten Virus-Expressionsvektoren (z. B. Blumenkohlmosaikvirus, CaMV; Tabakmosaikvirus, TMV), infiziert oder mit rekombinanten Plasmid-Expressionsvektoren (z. B. Ti-Plasmid), welche die CTGF- oder CTGF-Fragment-codierende Sequenz enthalten, transformiert sind; oder tierische Zellsysteme, die mit rekombinanten Virus-Expressionsvektoren (z. B. Adenovirus, Vacciniavirus, menschlichen Tumorzellen (einschließlich HT-1080)) infiziert sind, einschließlich Zelllinien, die gentechnisch so verändert sind, dass sie mehrere Kopien der CTGF-DNA entweder stabil amplifiziert (CHO/dhfr) oder instabil amplifiziert in Doppel-minute-Chromosomen enthalten (z. B. murine Zelllinien). Der hier verwendete Begriff „Wirts-Expressionsvektorsysteme" und allgemeiner der Begriff „Wirtszellen" schließt jegliche Nachkommen der Wirtszelle oder des Wirts-Expressionsvektorsystems ein. Außerdem ist es so zu verstehen, dass solche Nachkommen auch dann im Umfang der Erfindung enthalten sind, auch wenn möglicherweise nicht alle Nachkommen zur parentalen Zelle identisch sind, da während der Replikation Mutationen auftreten können.
Die Expressionselemente dieser Systeme variieren in ihrer Stärke und in ihren spezifischen Eigenschaften. Abhängig vom verwendeten Wirts-/Vektorsystem können beliebige von einer Anzahl von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen, einschließlich konstitutiver und induzierbarer Promotoren, im Expressionsvektor eingesetzt werden. Bei einer Clonierung in bakteriellen Systemen können z. B. induzierbare Promotoren wie pL des Bakteriophagen Lambda, plac, ptrp, ptac (der Hybridpromotor ptrp-lac) und dergleichen verwendet werden; bei einer Clonierung in Insektenzellsysteme können Promotoren wie der Polyhedrin-Promotor von Baculovirus eingesetzt werden; bei einer Clonierung in Pflanzenzellsystemen können Promotoren verwendet werden, die hergeleitet sind von dem Genom von Pflanzenzellen (z. B. Hitzeschockpromotoren; der Promotor für die kleine Untereinheit von RUBISCO; der Promotor für das Chlorophyll-a/b-bindende Protein) oder von Pflanzenviren (z. B. der 35S-RNA-Promotor von CaMV; der Hüllprotein-Promotor von TMV); bei einer Clonierung in Säugerzellsystemen können Promotoren eingesetzt werden, die hergeleitet sind von dem Genom von Säugerzellen (z. B. Metallothionein-Promotor) oder von Säugerviren (z. B. der späte Promotor von Adenovirus; der 7.5K-Promotor von Vacciniavirus); für die Herstellung von Zelllinien, die mehrere Kopien der CTGF- oder CTGF-Fragment-DNA enthalten, können SV40-, BPV- und EBV-basierte Vektoren zusammen mit einem geeigneten selektierbaren Marker eingesetzt werden.
In bakteriellen Systemen kann eine Reihe von Expressionsvektoren als vorteilhaft ausgewählt werden, abhängig davon, für welchen Zweck der exprimierte CTGF oder das exprimierte CTGF-Fragment vorgesehen ist. Z. B. schließt ein geeigneter Vektor für die Expression in Bakterien den T7-basierten Vektor ein, wie in Rosenberg et al., 1987, Gene 56: 125, beschrieben. Als weiteres Beispiel, wenn große Mengen von CTGF oder eines CTGF-Fragments produziert werden sollen, um Peptidbanken durchzumustern, können Vektoren wünschenswert sein, welche die Expression von großen Mengen von Proteinprodukten, die einfach gereinigt werden können, steuern. Solche Vektoren schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf den E. coli-Expressionsvektor pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2: 1791), in welchem die CTGF- oder CTGF-Fragment-codierende Sequenz in den Vektor im Raster mit der lacZ-codierenden Region so ligiert werden kann, dass ein hybrides AS-lacZ-Protein produziert wird; pIN-Vektoren (Inouye und Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101–3109; Van Heeke und Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264: 5503–5509); und dergleichen. Außerdem können pGEX-Vektoren eingesetzt werden, um fremde Polypeptide wie CTGF oder ein CTGF-Fragment zusammen mit Glutathion-S-Transferase (GST) zu exprimieren. Im Allgemeinen sind solche Fusionsproteine löslich und können aus lysierten Zellen einfach gereinigt werden, indem eine Adsorption an Glutathion-Agarose-Perlen durchgeführt wird und hierauf eine Elution in Gegenwart von freiem Glutathion folgt. Die pGEX-Vektoren werden so konstruiert, dass sie Thrombin- oder Faktor-Xa-Protease-Spaltstellen enthalten, so dass das clonierte Polypeptid von Interesse von dem GST-Rest abgespalten werden kann.
Allgemeiner gesagt, wenn der Wirt ein Prokaryont ist, können kompetente Zellen, die in der Lage sind DNA aufzunehmen, aus Zellen hergestellt werden, die nach exponentiellem Wachstum geerntet und anschließend durch das CaCl₂-Verfahren oder alternativ MgCl₂- oder RbCl-Verfahren behandelt wurden, wobei Verfahren verwendet werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind.
Wenn die Wirtszelle ein Eukaryont ist, können verschiedene Verfahren der DNA-Übertragung eingesetzt werden. Diese schließen eine Transfektion von DNA durch Calciumphosphat-Niederschläge, herkömmliche mechanische Verfahren, einschließlich Mikroinjektion, Insertion eines Plasmids, eingeschlossen in Liposomen, oder die Verwendung von Virusvektoren ein. Eukaryontische Zellen können auch mit DNA-Sequenzen, die das Polypeptid der Erfindung codieren, und einem zweiten fremden DNA-Molekül, welches einen selektierbaren Phänotyp codiert, wie das Thymidinkinase-Gen von Herpes simplex, gemeinsam transfiziert werden. Ein weiteres Verfahren besteht darin, einen eukaryotischen Virusvektor zu verwenden, wie Affenvirus 40 (SV40) oder Rinderpapillomvirus, um eukaryontische Zellen transient zu infizieren oder zu transformieren und ein Protein zu exprimieren. Vgl. „Eukaryotic Viral Vectors", 1992, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman, Hrsg.). Eukaryontische Wirtszellen schließen Hefen, Säugerzellen, Insektenzellen und Pflanzenzellen ein.
Bei Hefen können verschiedene Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, eingesetzt werden. Eine Übersicht findet sich z. B. in „Current Protocols in Molecular Biology", Bd. 2, 1988, Ausubel et al., Hrsg., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Kap. 13; Grant et al., 1987, Methods in Enzymology, Wu & Grossman, Hrsg., Acad. Press, NY, 153: 516–544; Glover, 1986, DNA Cloning, Bd. II, IRL Press, Wash., D. C., Kap. 3; Bitter, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Berger & Kimmel, Hrsg., Acad. Press, NY, 152: 673–684; und „The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces", 1982, Strathern et al., Hrsg., Cold Spring Harbor Press, Bd. I und II. Z. B. wurden verschiedene Pendelvektoren für die Expression fremder Gene in Hefe beschrieben. Heinemann et al., 1989, Nature 340: 205: Rose et al., 1987, Gene 60: 237.
In den Fällen, in denen Pflanzen-Expressionsvektoren verwendet werden, kann die Expression der CTGF- oder CTGF-Fragment-codierenden Sequenz durch einen beliebigen von verschiedenen Promotoren gesteuert werden. Z. B. können Viruspromotoren wie die 35S-RNA- und 19S-RNA-Promotoren von CaMV (Brisson et al., 1984, Nature 310: 511–514) oder der Hüllprotein-Promotor von TMV (Takamatsu et al., 1987, EMBO J. 6: 307–311) eingesetzt werden; alternativ können Pflanzen-Promotoren wie die kleine Untereinheit von RUBISCO (Coruzzi et al., 1984, EMBO J. 3: 1671–1680; Broglie et al., 1984, Science 224: 838–843); oder Hitzeschock-Promotoren, z. B. Sojabohnen-hsp17.5-E oder -hsp17.3-B (Gurley et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6: 559–565), verwendet werden. Diese Konstrukte können in Pflanzenzellen unter Verwendung von Ti-Plasmiden, Ri-Plasmiden, Pflanzenvirus-Vektoren, direkter DNA-Transformation, Mikroinjektion, Elektroporation usw. eingeführt werden. Eine Übersicht über diese Techniken findet sich z. B. in Weissbach und Weissbach, 1988, „Methods for Plant Molecular Biology", Academic Press, NY, Abschnitt VIII, S. 421–463; Grierson und Corey, 1988, „Plant Molecular Biology", 2. Auflg., Blackie, London, Kap. 7 bis 9.
In einem Insektensystem könnte ein alternatives Expressionssystem verwendet werden, um CTGF oder ein CTGF-Fragment zu exprimieren. In einem solchen System wird Baculovirus als Vektor für die Expression fremder Gene eingesetzt. Anschließend wächst das Virus in den Insektenzellen. Die CTGF- oder CTGF-Fragment-codierende Sequenz kann in nicht-essentielle Regionen (z. B. das Polyhedrin-Gen) des Virus cloniert und unter die Kontrolle eines Baculovirus-Promotors gestellt werden. Diese rekombinanten Viren können sodann für die Infektion von Insektenzellen verwendet werden, in welchen das eingefügte Gen exprimiert wird. Vgl. z. B. Smith et al., 1983, J. Virol. 46: 584; Smith, US-Patent Nr. 4 215 051 .
In Säuger-Wirtszellen können verschiedene Virus-basierte Expressionssysteme eingesetzt werden. In den Fällen, in denen ein Adenovirus als Expressionsvektor verwendet wird, kann die CTGF- oder CTGF-Fragment-codierende Sequenz an einen Transkriptions-/Translations-Kontrollkomplex des Adenovirus, z. B. den späten Promotor und die dreiteilige Leadersequenz, ligiert werden. Dieses chimäre Gen kann sodann durch eine in vitro- oder in vivo-Rekombination in das Adenovirus-Genom eingefügt werden. Durch die Insertion in eine nicht-essentielle Region des Virusgenoms (z. B. Region E1 oder E3) wird ein rekombinantes Virus entstehen, welches lebensfähig ist und in der Lage ist, den CTGF oder ein CTGF-Fragment in infizierten Wirtszellen zu exprimieren. Vgl. z. B. Logan und Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81: 3655–3659. Alternativ kann der 7.5K-Promotor von Vaccinia verwendet werden. Vgl. z. B. Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79: 7415–7419; Mackett et al., 1984, J. Virol. 49: 857–864; Panicali et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79: 4927–4931.
In einer anderen Ausführungsform wird die CTGF- oder CTGF-Fragment-Sequenz in menschlichen Tumorzellen wie HT-1080 exprimiert, welche mit Calciumphosphat-Niederschlag und einem Neomycin-Resistenzgen stabil transfiziert wurden. In einer weiteren Ausführungsform wird der Expressionsvektor pMSXND oder dergleichen für eine Expression in verschiedenen Säugerzellen, einschließlich COS-, BHK 293- und CHO-Zellen, eingesetzt; vgl. Lee und Nathans, 1988, J. Biol. Chem. 263: 3521.
Außerdem kann es sein, dass spezifische Initiationssignale für eine effiziente Translation von eingefügten CTGF- oder CTGF-Fragment-codierenden Sequenzen erforderlich sind. Diese Signale schließen das ATG-Initiations-Codon und angrenzende Sequenzen ein. In den Fällen, in denen das gesamte CTGF-Gen, einschließlich seines eigenen Initiations-Codons und angrenzender Sequenzen, in den geeigneten Expressionsvektor eingefügt wird, kann es sein, dass keine weiteren Translations-Kontrollsignale erforderlich sind. Jedoch müssen in den Fällen, in denen nur ein Teil der CTGF-codierenden Sequenz eingefügt wird, exogene Translations-Kontrollsignale, einschließlich des ATG-Initiations-Codons, bereitgestellt werden. Weiterhin muss das Initiations-Codon in Phase mit dem Leseraster der CTGF- oder CTGF-Fragment-codierenden Sequenz vorliegen, um eine Translation der gesamten Insertion sicherzustellen. Diese exogenen Translations-Kontrollsignale und Initiations-Codons können verschiedenen, sowohl natürlichen als auch synthetischen, Ursprungs sein. Die Effizienz der Expression kann gesteigert werden, indem geeignete Transkriptions-Enhancerelemente, Transkriptions-Terminatoren usw. eingebaut werden. Vgl. z. B. Bitter et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 516–544. Zusätzliche Sequenzen, d. h. Leader-Sequenzen usw., können angefügt werden, um die Sekretion von CTGF-Fragmenten über verschiedene sekretorische Stoffwechselwege zu steuern. Dies kann in einer Reihe von Expressionssystemen unter Verwendung verschiedener Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, erreicht werden.
Außerdem kann ein Wirtszellstamm gewählt werden, welcher die Expression der eingefügten Sequenzen moduliert oder modifiziert und das Genprodukt in der spezifischen gewünschten Weise prozessiert. Es kann sein, dass solche Modifikationen (z. B. Glycosylierung) und eine solche Prozessierung (z. B. Spaltung) der Proteinprodukte für die Funktion des Proteins wichtig sind. Unterschiedliche Wirtszellen weisen charakteristische und spezifische Mechanismen für die posttranslationale Prozessierung und Modifikation von Proteinen auf. Geeignete Zelllinien oder Wirtssysteme können so ausgewählt werden, dass die korrekte Modifikation und Prozessierung des exprimierten fremden Proteins sichergestellt werden. Hierfür können eukaryontische Wirtszellen eingesetzt werden, welche die zelluläre Maschinerie für die richtige Prozessierung des primären Transkripts, Glycosylierung und Phosphorylierung des Genprodukts besitzen. Solche Säuger-Wirtszellen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, WI38, HT-1080 usw..
Für eine langfristige Produktion von rekombinanten Proteinen mit großen Ausbeuten ist eine stabile Expression bevorzugt. Z. B. können Zelllinien gentechnisch hergestellt werden, die den CTGF oder ein CTGF-Fragment stabil exprimieren. Anstatt Expressionsvektoren zu verwenden, die virale Replikationsursprünge enthalten, können Wirtszellen mit einer CTGF- oder CTGF-Fragment-DNA, die durch geeignete Expressions-Kontrollelemente kontrolliert wird (z. B. Promotor-, Enhancer-Sequenzen, Transkriptions-Terminatoren, Polyadenylierungsstellen usw.), und einem selektierbaren Marker transformiert werden. Nach der Einführung der fremden DNA kann man die gentechnisch veränderten Zellen ein bis zwei Tage in einem angereicherten Medium wachsen lassen, und danach werden sie in ein selektives Medium überführt. Der selektierbare Marker in dem rekombinanten Plasmid verleiht eine Resistenz gegen die Selektion und macht es den Zellen möglich, das Plasmid stabil in ihre Chromosomen einzubauen und so zu wachsen, dass Foci gebildet werden, die ihrerseits dann cloniert und zu Zelllinien expandiert werden können.
Verschiedene Selektionssysteme können verwendet werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf das Gen der Thymidin-Kinase von Herpes-simplex-Virus (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), der Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase (Szybalska und Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026) und der Adenin-Phosphoribosyl-Transferase (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817), die in tk^–-, hgprt^–- bzw. aprt^–-Zellen eingesetzt werden können.
Außerdem kann eine Antimetabolit-Resistenz eingesetzt werden als Grundlage der Selektion für dhfr, welches eine Resistenz gegenüber Methotrexat verleiht (Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77: 3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78: 1527); gpt, das eine Resistenz gegenüber Mycophenolsäure verleiht (Mulligan und Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78: 2072); neo, das eine Resistenz gegenüber dem Aminoglycosid G-418 verleiht (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1); und hygro, das eine Resistenz gegenüber Hygromycin verleiht (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147). Kürzlich wurden zusätzliche selektierbare Gene beschrieben, nämlich trpB, das es den Zellen möglich macht, Indol anstelle von Tryptophan zu verwenden; hisD, das es den Zellen möglich macht, Histinol anstelle von Histidin zu verwenden (Hartmann und Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 8047); und ODC (Ornithin-Decarboxylase), das eine Resistenz gegenüber dem Ornithin-Decarboxylase-Inhibitor 2-(Difluormethyl)-DL-ornithin, DFMO, verleiht (McConlogue, 1987, in: „Current Communications in Molecular Biology", Cold Spring Harbor Laboratory).
Die Isolierung und Reinigung von Wirtszellen-exprimierten Polypeptiden der Erfindung kann durch beliebige konventionelle Verfahren erfolgen, z. B. präparative chromatographische Trennverfahren und immunologische Trennverfahren wie diejenigen, bei denen eine Verwendung von monoclonalen oder polyclonalen Antikörpern beteiligt ist.
Identifizierung von Transfektanten oder Transformanten, welche CTGF oder ein CTGF-Fragment exprimieren: Die Wirtszellen, welche die codierende Sequenz enthalten und welche das biologisch aktive Genprodukt exprimieren, können durch mindestens vier allgemeine Vorgehensweisen identifiziert werden: (a) DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung; (b) Vorliegen oder Abwesenheit von „Marker"-Genfunktionen; (c) Feststellen der Transkriptionsrate, gemessen durch die Expression von CTGF- oder CTGF-Fragment-mRNA-Transkripten in der Wirtszelle; und (d) Nachweis des Genprodukts, gemessen durch einen Test oder durch seine biologische Aktivität.
In der ersten Vorgehensweise kann das Vorliegen der CTGF- oder CTGF-Fragment-codierenden Sequenz, eingefügt in den Expressionsvektor, durch DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung nachgewiesen werden, wobei Sonden eingesetzt werden, die Nucleotidsequenzen umfassen, welche zu der CTGF- bzw. CTGF-Fragment-codierenden Sequenz oder Teilen oder Derivaten davon homolog sind.
In der zweiten Vorgehensweise kann das rekombinante Expressionsvektor-/Wirtssystem aufgrund des Vorliegens oder der Abwesenheit bestimmter „Marker"-Genfunktionen identifiziert und selektiert werden (z. B. Resistenz gegenüber Antibiotika, Resistenz gegenüber Methotrexat, Transformations-Phänotyp, Bildung von Einschlusskörpern in Baculovirus usw.). Z. B. wird in einer bevorzugten Ausführungsform die CTGF-codierende Sequenz innerhalb einer Neomycin-Resistenz-Markergensequenz des Vektors eingefügt, und können die Rekombinanten, welche die CTGF-codierende Sequenz enthalten, durch das Fehlen der Marker-Genfunktion identifiziert werden. Alternativ kann ein Markergen zusammen mit der CTGF-Sequenz in Tandemanordnung unter die Kontrolle des gleichen oder eines anderen Promotors gestellt werden, der für die Kontrolle der Expression der CTGF-codierenden Sequenz verwendet wird. Die Expression des Markers als Reaktion auf die Induktion oder Selektion zeigt dann die Expression der CTGF-codierenden Sequenz an.
In der dritten Vorgehensweise kann die Transkriptions-Aktivität für die CTGF- oder CTGF-Fragment-codierende Region durch Hybridisierungstests festgestellt werden. Z. B. kann die RNA isoliert und durch Northern-Blot unter Verwendung einer Sonde analysiert werden, die zu der CTGF- oder CTGF-Fragment-codierenden Sequenz oder bestimmten Teilen davon homolog ist. Alternativ können die gesamten Nucleinsäuren der Wirtszelle extrahiert und auf Hybridisierung mit solchen Sonden getestet werden.
Die vierte Vorgehensweise umfasst den Nachweis des biologisch aktiven oder immunologisch reaktiven CTGF- oder CTGF-Fragment-Genprodukts. Verschiedene Tests können eingesetzt werden, um die CTGF-Aktivität nachzuweisen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf diejenigen Tests, die im US-Patent Nr. 5 408 040 beschrieben sind.
Spaltung des vollständigen CTGF-Proteins zur Herstellung eines CTGF-Fragments: Nach der Expression des vollständigen CTGF-Proteins kann das Protein durch eines von verschiedenen proteolytischen Enzymen, die dem Fachmann bekannt sind, gespalten werden, wodurch die CTGF-Fragmente der vorliegenden Erfindung erhalten werden. Z. B. ist die Cystein-freie Brücke zwischen der N-terminalen und der C-terminalen Hälfte von CTGF für Chymotrypsin empfindlich, wobei Verfahren verwendet werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind.
Verfahren zum Modulieren und Hemmen der Aktivität von CTGF-Fragmenten
Wie vorstehend beschrieben, stellen die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen CTGF-Fragmente eine kritische Determinante der Zellproliferation, insbesondere der Proliferation von Fibroblasten, und folglich der Ablagerung der extrazellulären Matrix dar. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren für die Verhinderung und Behandlung von CTGF-assoziierten Krankheiten bereit, indem die mitogene Aktivität der CTGF-Fragmente der vorliegenden Erfindung reguliert, moduliert und/oder gehemmt wird. Insbesondere stellen die Verfahren der vorliegenden Erfindung die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Mittels bereit, welches die mitogene oder zellproliferative Aktivität der C-terminalen Fragmente von CTGF reguliert, moduliert und/oder hemmt.
Antikörper. In einer Ausführungsform umfasst ein Verfahren die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Antikörpers, der spezifisch mit den CTGF-Fragmenten der vorliegenden Erfindung reagiert. Antikörper, die spezifisch mit CTGF reagieren können, sind im US-Patent Nr. 5 783 187 und in der PCT-Veröffentlichung WO 9638172 beschrieben. CTGF-Antikörper können unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, erzeugt werden. Solche Antikörper können einschließen, sind jedoch nicht beschränkt auf polyclonale, monoclonale, chimäre, einzelkettige Antikörper, außerdem Fab-Fragmente, einschließlich F(ab')₂- und F_v-Fragmente. Fragmente können z. B. durch eine Fab-Expressionsbank produziert werden. Neutralisierende Antikörper, d. h. diejenigen, welche die Dimer-Bildung hemmen, sind für die therapeutische Verwendung besonders bevorzugt.
Ein Ziel-Polypeptid wie CTGF oder ein Mittel, welches die Aktivität und/oder die Expression von CTGF moduliert, kann untersucht werden, wobei hierdurch Regionen hoher Immunogenität bestimmt werden. Verfahren zur Analyse und Epitop-Selektion sind auf dem Fachgebiet bekannt. Vgl. z. B. Ausubel et al., Hrsg., 1988, „Current Protocols in Molecular Biology". Außerdem kann die Analyse und Selektion z. B. anhand verschiedener Software-Pakete erfolgen, wie LASERGENE NAVIGATOR-Software (DNASTAR, Madison WI). Die Peptide oder Fragmente, die zur Induktion von Antikörpern eingesetzt werden, sollten antigen sein, sie müssen jedoch nicht biologisch aktiv sein. Vorzugsweise hat ein antigenes Fragment oder Peptid eine Länge von mindestens fünf Aminosäuren, stärker bevorzugt eine Länge von mindestens zehn Aminosäuren und am stärksten bevorzugt eine Länge von mindestens 15 Aminosäuren. Vorzugsweise ist das Antikörper-induzierende Fragment oder Peptid mindestens zu einem Teil der Aminosäuresequenz des Ziel-Polypeptids, z. B. CTGF, identisch. Auch kann ein Peptid oder Fragment, welches mindestens einen Teil der Sequenz des natürlich vorkommenden Ziel-Polypeptids nachahmt, mit einem anderen Protein, z. B. KLH („keyhole limpet hemocyanin (KLH), fusioniert sein, und Antikörper können gegen das chimäre Molekül produziert werden.
Verfahren zum Herstellen von Antikörpern sind auf dem Fachgebiet bekannt. Z. B. können verschiedene Wirte, einschließlich Ziegen, Kaninchen, Ratten, Mäuse, Menschen und andere, durch Injektion mit dem Ziel-Polypeptid oder einem immunogenen Fragment oder Peptid davon immunisiert werden. Abhängig von der Wirtsart können verschiedene Adjuvantien verwendet werden, um die immunologische Antwort zu steigern. Solche Adjuvantien schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Freundsches Adjuvans, Mineralgele wie Aluminiumhydroxid, und grenzflächenaktive Substanzen wie Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, KLH und Dinitrophenol. Von den Adjuvantien, die in Menschen verwendet werden, sind BCG (Bacille Calmette Guerin) und Cotynebacterium parvum besonders bevorzugt.
Monoclonale und polyclonale Antikörper können unter Verwendung eines beliebigen Verfahren hergestellt werden, wodurch die Produktion von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur bereitgestellt wird. Verfahren zur in vivo- und in vitro-Produktion sind auf dem Fachgebiet bekannt. Vgl. z. B. Pound, J. D., 1998, „Immunochemical Protocols", Humana Press, Totowa NJ; Harlow, E., und D. Lane, 1988, „Antibodies. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Auch die Produktion von chimären Antikörpern ist bekannt, wie auch die Produktion von einzelkettigen Antikörpern. Vgl. z. B. Morrison, S. L., et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6851–6855; Neuberger, M. S., et al., 1984, Nature 312: 604–608; Takeda, S., et al., 1985, Nature 314: 452–454. Antikörper mit verwandter Spezifität, jedoch unterschiedlicher Idiotyp-Zusammensetzung können z. B. durch Mischen von Ketten („chain shuffling") aus zufälligen kombinatorischen Immunglobulin-Banken erzeugt werden. Vgl. z. B. Burton, D. R., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 11120–11123.
Außerdem können Antikörper durch Induktion einer in vivo-Produktion in der Lymphocyten-Population oder durch Durchmustern von Immunglobulin-Banken oder Anordnungen („panels") hoch-spezifischer Bindungsreagenzien produziert werden. Vgl. z. B. Orlandi, R., et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833–3837; Winter, G., und C. Milstein, 1991, Nature 349: 293–299). Auch können Antikörperfragmente erzeugt werden, die spezifische Bindungsstellen für das Ziel-Polypeptid enthalten. Solche Antikörperfragmente schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf F(ab')₂-Fragmente, welche durch Pepsin-Spaltung des Antikörpermoleküls produziert werden können, und Fab-Fragmente, welche durch Reduktion der Disulfidbrücken der F(ab')₂-Fragmente erzeugt werden können. Alternativ können Fab-Expressionsbanken konstruiert werden, die eine schnelle und einfache Identifizierung von monoclonalen Fab-Fragmenten mit der gewünschten Spezifität möglich machen. Vgl. z. B. Huse, W. D., et al., 1989, Science 254: 1275–1281.
Antikörper können auf anti-Ziel-Polypeptid-Aktivität getestet werden, wobei verschiedene Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, eingesetzt werden können. Mehrere Techniken können für das Durchmustern verwendet werden, wobei Antikörper identifiziert werden, welche die gewünschte Spezifität aufweisen, einschließlich verschiedener Immuntests wie enzymverbundener Immunadsorptionstests (ELISAs), einschließlich direkter und Ligand-Einfang-ELISAs, Radioimmuntests (RIAs), Immunblot-Verfahren und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS). Auf dem Fachgebiet sind zahlreiche Protokolle für eine kompetitive Bindung oder für immunradiometrische Tests unter Verwendung polyclonaler oder monoclonaler Antikörper mit nachgewiesenen Spezifitäten bekannt. Vgl. z. B. Harlow und Lane. Solche Immuntests umfassen typischerweise die Messung der Komplexbildung zwischen dem Ziel-Polypeptid und einem spezifischen Antikörper. Bevorzugt ist ein zweiseitiger, monoclonal-basierter Immuntest unter Verwendung monoclonaler Antikörper, die mit zwei sich nicht beeinträchtigenden Epitopen auf dem Ziel-Polypeptid reaktiv sind, jedoch können auch andere Tests wie ein kompetitiver Bindungstest durchgeführt werden. Vgl. z. B. Maddox, D. E., et al., 1983, J. Exp. Med. 158: 1211.
Die Beschreibung betrifft die Verwendung von Antikörpern, welche spezifisch mit einem CTGF-Polypeptid oder Fragmenten davon reaktiv sind und welche die biologische Aktivität der CTGF-Fragmente der vorliegenden Erfindung neutralisieren. Der in dem Verfahren verabreichte Antikörper kann der intakte Antikörper oder Antigen-bindende Fragmente davon sein, wie Fab-, F(ab')₂- und F_v-Fragmente, die in der Lage sind, die Epitop-Determinante zu binden. Die in dem Verfahren verwendeten Antikörper können polyclonale oder stärker bevorzugt monoclonale Antikörper sein. Monoclonale Antikörper mit unterschiedlichen Epitop-Spezifitäten werden aus Antigen-enthaltenden Fragmenten des Proteins durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, hergestellt. Vgl. z. B. Köhler et al., 256: 494; Ausubel et al., vorstehend.
In einem Aspekt schließen therapeutische Anwendungen diejenigen ein, bei denen „menschliche" oder „humanisierte" Antikörper verwendet werden, die gegen CTGF oder Fragmente davon gerichtet sind. Humanisierte Antikörper sind Antikörper oder Antikörper-Fragmente, welche die gleiche Bindungsspezifität wie ein parentaler Antikörper (d. h., der typischerweise von der Maus stammt) und außerdem noch menschliche Merkmale aufweisen. Humanisierte Antikörper können z. B. durch das Mischen von Ketten („chain shuffling") oder durch die Verwendung der Phagen-Display-Technik hergestellt werden. Z. B. wird ein Polypeptid, das eine variable Domäne einer schweren oder leichten Kette eines nicht-menschlichen Antikörpers, der für einen CTGF spezifisch ist, umfasst, mit einem Repertoire von variablen Domänen von menschlichen komplementären (leichten oder schweren) Ketten kombiniert. Hybridpaarungen, die für das Antigen von Interesse spezifisch sind, werden ausgewählt. Sodann können menschliche Ketten aus den ausgewählten Paarungen mit einem Repertoire von menschlichen komplementären variablen Domänen (schweren oder leichten) kombiniert werden, und humanisierte Antikörper-Polypeptid-Dimere können entsprechend der Bindungsspezifität für ein Antigen ausgewählt werden. Verfahren, welche für die Erzeugung von humanisierten Antikörpern beschrieben sind, die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind z. B. in den US-Patenten Nr. 5 565 332 , 5 585 089 , 5 694 761 und 5 693 762 offenbart. Weiterhin sind Techniken, die für die Herstellung menschlicher Antikörper in transgenen Mäusen beschrieben sind, z. B. in den US-Patenten Nr. 5 545 806 und 5 569 825 offenbart.
Antisense-Oligonucleotide: Die Beschreibung stellt eine therapeutische Vorgehensweise dar, welche die Translation von CTGF-Botschaften und insbesondere die Botschaften des vollständigen CTGF (wobei das vollständige Protein dann gespalten wird, so dass ein CTGF-Fragment der vorliegenden Erfindung erzeugt wird) oder des Fragments von CTGF (insgesamt „CTGF-mRNA") zu dem Protein direkt stört. Genauer gesagt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit, in welchem Antisense-Nucleinsäure oder Ribozyme verwendet werden, um CTGF-mRNA zu binden oder zu spalten. Antisense-RNA- oder DNA-Moleküle binden spezifisch an die RNA-Botschaft eines Ziel-Gens, wodurch die Expression des Genprodukts dieses Gens unterbrochen wird. Das Antisense-Molekül bindet an die RNA-Botschaft, wodurch ein doppelsträngiges Molekül gebildet wird, das durch die Zelle nicht translatiert werden kann. Außerdem können chemisch reaktive Gruppen wie Eisen-gekoppelte Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA-Fe) an ein Antisense-Oligonucleotid angehängt werden, wodurch die Spaltung der RNA an der Stelle der Hybridisierung ausgelöst wird. Auf dem Fachgebiet sind diese und andere Anwendungen von Antisense-Verfahren zur Hemmung der Translation von Genen bekannt. Vgl. z. B. Marcu-Sakura, 1988, Anal. Biochem. 177: 278.
Genauer gesagt kann in einem Aspekt die Sequenz eines Antisense-Polynucleotids, das zum Hemmen der Expression der CTGF-mRNA geeignet ist, erhalten werden, indem die Sequenzen von orthologen Genen (Sequenzen, die zwischen Arten konserviert sind) oder die Transkripte von orthologen Genen verglichen und hoch-konservierte Regionen innerhalb solcher Sequenzen identifiziert werden. Eine Ähnlichkeit bei Nucleinsäuresequenzen kann durch Verfahren und Algorithmen bestimmt werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Solche Verfahren und Algorithmen umfassen z. B. ein BLAST-Programm (Basic Local Alignment Search Tool am National Center for Biological Information), ALIGN, AMAS (Analysis of Multiple Aligned Sequences) und AMPS (Protein Multiple Sequence Alignment).
Beim Auswählen der bevorzugten Länge für ein bestimmtes Polynucleotid sollten verschiedene Faktoren berücksichtigt werden, um die günstigsten Eigenschaften zu erhalten. In einem Aspekt haben Polynucleotide der vorliegenden Erfindung eine Länge von mindestens 15 Basenpaaren (bp) und vorzugsweise eine Länge von etwa 15 bis etwa 100 bp. Stärker bevorzugt haben die Polynucleotide eine Länge von etwa 15 bp bis etwa 80 bp, und noch stärker bevorzugt haben die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung eine Länge von etwa 15 bis etwa 60 bp. Kürzere Polynucleotide, wie solche mit 10 bis unter 15 Nucleotiden, bieten zwar eine bessere Zellpenetration, haben jedoch eine niedrigere Genspezifität. Im Gegensatz dazu bieten längere Polynucleotide von 20 bis etwa 30 bp eine bessere Spezifität und zeigen einen erniedrigte Aufnahmekinetik in die Zellen. Vgl. Stein et al., „Oligodesoxynucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression", Cohen, Hrsg., McMillan Press, London (1988). Außerdem ist die Zugänglichkeit zu Transkript-RNA-Zielsequenzen von Wichtigkeit, wobei schleifenbildende Regionen und orthologe Sequenzen in Ziel-RNAs vielversprechende Ziele bieten. In dieser Beschreibung umfasst der Begriff „Polynucleotid" sowohl oligomere Nucleinsäureeinheiten des Typs, der in der Natur gefunden wird, wie Desoxyribonucleotid- und Ribonucleotid-Strukturen von DNA und RNA, als auch durch den Menschen hergestellte Analoga, die in der Lage sind, an die in der Natur vorkommende Nucleinsäure zu binden. Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können auf Ribonucleotid- oder Desoxyribonucleotid-Monomeren basieren, welche durch Phosphodiester-Bindungen gekoppelt sind, oder Analoga, welche durch Methylphosphonat, Phosphorothionat oder andere Bindungen gekoppelt sind. Sie können auch Monomereinheiten umfassen, die veränderte Basenstrukturen oder andere Modifikationen aufweisen, jedoch immer noch die Fähigkeit beibehalten, an natürlich vorkommende Transkript-RNA-Strukturen zu binden. Solche Polynucleotide können durch Verfahren hergestellt werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, z. B. unter Verwendung kommerziell erhältlicher Apparaturen und Reagenzien, wie sie von Perkin-Elmer/Applied Biosystems (Foster City, CA) verfügbar sind. Z. B. werden Polynucleotide, die für ein Ziel-Transkript spezifisch sind, gemäß Standardverfahren synthetisiert. Phosphorothionat-modifizierte DNA-Polynucleotide werden typischerweise auf automatischen DNA-Synthesegeräten synthetisiert, die von verschiedenen Herstellern verfügbar sind. Diese Apparaturen sind in der Lage, Nanomol-Mengen von Polynucleotiden mit einer Länge von 100 Nucleotiden zu synthetisieren. Kürzere Polynucleotide, die durch moderne Apparaturen synthetisiert werden, sind häufig ohne weitere Reinigung für die Verwendung geeignet. Falls es erforderlich ist, können Polynucleotide durch Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese oder Umkehrphasen-Chromatographie gereinigt werden. Vgl. Sambrook et al., „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Bd. 2, Kapitel 11, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989).
Phosphodiester-gekoppelte Polynucleotide sind besonderes empfindlich gegenüber der Wirkung von Nucleasen im Serum oder innerhalb von Zellen, und deshalb handelt es sich in einer bevorzugten Ausführungsform bei den Polynucleotiden der vorliegenden Erfindung um Phosphothionat- oder Methylphosphonat-gekoppelte Analoga, für die gezeigt wurde, dass sie Nucleaseresistent sind. Der Fachmann ist in der Lage, andere Bindungen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung einfach auszuwählen. Diese Modifikationen können auch so gestaltet werden, dass die Aufnahme in die Zelle und die Stabilität der Polynucleotide verbessert werden.
Ein geeigneter Träger für die Verabreichung eines Polynucleotids kann z. B. Vektoren, Antikörper, pharmakologische Zusammensetzungen, Bindungs- und Homing-Proteine oder virale Abgabesysteme einschließen, mit denen die Sequenz in der Zielzelle oder im Zielgewebe angereichert werden kann. Ein Polynucleotid kann z. B. an ein Bindungsprotein gekoppelt werden, welches Endothelzellen oder Tumorzellen erkennt. Nach der Verabreichung kann ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung zielgerichtet zu einer Empfängerzelle oder zu einem Empfänger-Gewebe hingesteuert werden, so dass eine gesteigerte Expression von z. B. Cytokinen, Transkriptionsfaktoren, G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, Tumorsuppressor-Proteinen und Apoptoseinitiations-Proteinen erfolgen kann.
Die Verabreichung von Antisense-Molekülen und dergleichen kann erreicht werden, indem ein rekombinanter Expressionsvektor wie ein chimäres Virus oder ein kolloidales Dispersionssystem verwendet wird. Verschiedene Virusvektoren, die für eine Gentherapie, wie hier beschrieben, verwendet werden können, schließen Adenovirus, Herpesvirus, Vacciniavirus oder vorzugsweise ein RNA-Virus wie ein Retrovirus ein. Verschiedene der bekannten Retroviren können ein Gen für einen selektierbaren Marker übertragen oder einbauen, so dass die transduzierten Zellen identifiziert und erzeugt werden können. Durch Einfügen einer Polynucleotidsequenz von Interesse in den viralen Vektor, zusammen mit einem anderen Gen, welches z. B. den Liganden für einen Rezeptor auf einer spezifischen Zielzelle codiert, wird der Vektor zielspezifisch gemacht. Retrovirus-Vektoren können zielspezifisch gemacht werden, indem z. B. ein Polynucleotid eingefügt wird, welches einen Zucker, ein Glycolipid oder ein Protein codiert. Eine bevorzugte Zielsteuerung („Targeting") wird erreicht, indem ein Antikörper verwendet wird, mit welchem der Retrovirus-Vektor zielgerichtet gesteuert wird. Der Fachmann wird spezifische Polynucleotidsequenzen kennen, oder er kann sie einfach ohne übermäßige Experimente ermitteln, welche in das Retrovirus-Genom eingefügt werden können, wodurch eine zielspezifische Abgabe des Retrovirus-Vektors, der das Antisense-Polynucleotid enthält, ermöglicht wird.
Da rekombinante Retroviren defekt sind, benötigen sie eine Unterstützung, um infektiöse Vektorpartikel produzieren zu können. Diese Unterstützung kann z. B. bereitgestellt werden, indem Helfer-Zelllinien eingesetzt werden, welche Plasmide enthalten, die alle Strukturgene des Retrovirus unter der Kontrolle von regulatorischen Sequenzen innerhalb der LTR codieren. Diesen Plasmiden fehlt eine Nucleotidsequenz, welche den Verpackungsmechanismus in die Lage versetzt, ein RNA-Transkript für die Einkapselung zu erkennen. Helfer-Zelllinien, welche Deletionen des Verpackungssignal aufweisen, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf ψ2, PA317 und PA12. Diese Zelllinien produzieren leere Virionen, da kein Genom verpackt wird. Wenn ein Retrovirus-Vektor in solche Zellen eingeführt wird, in welchen das Verpackungssignal intakt ist, jedoch die Strukturgene durch andere Gene von Interesse ersetzt sind, kann der Vektor verpackt und ein Vektor-Virion produziert werden.
Alternativ können NIH-3T3- oder andere Gewebekultur-Zellen mit Plasmiden, welche die Retrovirus-Strukturgene gag, pol und env codieren, durch eine herkömmliche Calciumphosphat-Transfektion direkt transfiziert werden. Diese Zellen werden anschließend mit dem Vektorplasmid transfiziert, welches die Gene von Interesse enthält. Die resultierenden Zellen setzen dann den Retrovirus-Vektor ins Kulturmedium frei.
Ein weiteres zielgerichtetes Abgabesystem für Antisense-Moleküle stellt das kolloidale Dispersionssystem dar. Kolloidale Dispersionssysteme schließen Makromolekülkomplexe, Nanokapseln, Mikrokügelchen, Perlen und Lipid-basierte Systeme ein, einschließlich Öl-in-Wasser-Emulsionen, Micellen, gemischter Micellen und Liposomen. Das bevorzugte kolloidale System der vorliegenden Erfindung ist ein Liposom. Liposomen sind künstliche Membranvesikel, die als Abgabesysteme in vivo und in vitro eingesetzt werden können. Es wurde gezeigt, dass große unilamellare Vesikel (LUV), deren Größe im Bereich von 0,2 bis 0,4 μm liegt, einen wesentlichen Prozentsatz eines wässrigen Puffers, der große Makromoleküle enthält, einkapseln können. RNA, DNA und intakte Virionen können innerhalb des wässrigen Inneren eingekapselt und dann in einer biologisch aktiven Form an Zellen verabreicht werden. Damit es sich bei einem Liposom um ein wirksames Gentransfervehikel handelt, sollten die folgenden Eigenschaften vorliegen: (1) Einkapselung der Gene von Interesse mit hoher Effizienz, ohne dass ihre biologische Aktivität aufs Spiel gesetzt wird; (2) bevorzugte und wesentliche Bindung an eine Zielzelle im Vergleich zu Nicht-Zielzellen; (3) Verabreichung der wässrigen Inhalte des Vesikels an das Cytoplasma der Zielzelle mit hoher Effizienz; und (4) genaue und effektive Expression der genetischen Information.
Kleine Molekül-Inhibitoren: Weiterhin stellt die Beschreibung ein Verfahren bereit, in welchem kleine Moleküle identifiziert und verwendet werden, welche die Aktivität des CTGF-Fragments der vorliegenden Erfindung hemmen.
Das Identifizieren kleiner Moleküle, welche die Aktivität des CTGF-Fragments hemmen, kann anhand verschiedener Screening-Verfahren durchgeführt werden. Das Durchmustern der Verbindungen erfolgt, indem der Test ein nachweisbares Signal bereitstellt, welches mit der Bindung der Verbindung an ein Protein- oder zelluläres Ziel assoziiert ist. Abhängig von der Struktur des Tests kann das nachweisbare Signal eine Licht-Absorption oder -Emission, eine Plaque-Bildung oder ein anderes herkömmliches Signal sein. Das Ergebnis kann qualitativ oder quantitativ sein.
Zum Durchmustern der Verbindungen auf eine spezifische Bindung können verschiedene Immuntests eingesetzt werden, wobei menschliche (oder Primaten-)Antikörper, die an die Zellen gebunden sind, nachgewiesen werden. So kann man markierte anti-hlg, z. B. anti-hlgM, -hlgG oder Kombinationen davon, einsetzen, um spezifisch gebundenen menschlichen Antikörper des Galactosyl-Epitops nachzuweisen. Verschiedene Markierungen können verwendet werden, wie Radioisotope, Enzyme, fluoreszierende Substanzen, chemilumineszierende Substanzen, Partikel usw.. Es gibt zahlreiche kommerziell verfügbare Kits, die markierte anti-hlg bereitstellen, welche gemäß dem Protokoll des Herstellers eingesetzt werden können.
Verschiedene Protokolle können verwendet werden, um eine Bank chemischer Verbindungen durchzumustern. Die Auswahl des geeigneten Protokolls wird in einem gewissen Ausmaß von der Natur der Zubereitung der Verbindungen abhängen. Z. B. können die Verbindungen an einzelne Partikel, Stifte, Membranen oder dergleichen gebunden sein, wobei jede der Verbindungen abgetrennt werden kann. Außerdem wird die Menge der verfügbaren Verbindung variieren, abhängig von dem Verfahren, das zum Erzeugen der Bank verwendet wurde. Weiterhin kann es, abhängig von der Natur der Kopplung der Verbindung an den Träger, möglich sein, Aliquots der Verbindung freizusetzen, so dass eine Reihe von Tests durchgeführt werden kann. Außerdem wird die Art und Weise, wie die Verbindungen getestet werden, durch beeinflusst die Fähigkeit zur Identifizierung der Verbindung, für die gezeigt wurde, dass sie eine Aktivität besitzt, beeinflusst.
Wenn die Verbindungen einzeln auf einer Oberfläche in gitterförmiger Anordnung vorliegen, so dass man die Zusammensetzung an jeder Stelle des Gitters kennt, kann man einen Zellrasen bereitstellen, der ähnlich organisiert ist wie ein Gitter und in Übereinstimmung mit den an die feste Oberfläche gebundenen Verbindungen plaziert werden kann. Sobald der Rasen und das feste Substrat übereinstimmend angeordnet sind, kann man die Verbindungen abhängig der Art und Weise, wie die Verbindungen gekoppelt sind, von der Oberfläche freisetzen. Nach einer ausreichenden Zeitspanne, in der die Verbindungen an die Proteine an der Zelloberfläche binden können, kann man den Zellrasen waschen und auf diese Weise die nicht spezifisch gebundenen Verbindungen entfernen. Ein oder mehrere Waschgänge können erforderlich sein, wobei durch die Waschgänge ein variierendes Ausmaß an Stringenz bereitgestellt werden kann, abhängig davon, welches Ausmaß an Affinität gewünscht wird. Nachdem die Waschgänge vollständig durchgeführt wurden, kann anschließend Säugerblut oder Plasma zugefügt werden und das Ganze sodann eine für Cytotoxizität ausreichende Zeitspanne inkubiert werden. Danach kann das Plasma oder Blut entfernt werden, und anschließend können Plaques festgestellt werden, wobei anhand der Position im Gitter bestimmt werden kann, um welche Verbindung es sich handelt. Natürlich sollte das Plasma oder Blut frei von jeglichen Komponenten sein, welche die Zellen des Rasens in der Natur abtöten würden.
Da der präparative Prozess wiederholt werden kann, könnte man mehrere feste Substrate herstellen, bei denen die gleichen Verbindungen an den vergleichbaren Stellen präpariert werden, so dass die Durchmusterung mit den gleichen oder mit anderen Zellen wiederholt werden könnte, um die Aktivität der einzelnen Verbindungen zu bestimmen.
In einigen Fallen kann die Identität der Verbindung durch einen Nucleinsäure-Marker bestimmt werden, wobei die Polymerase-Kettenreaktion für die Amplifikation des Markers eingesetzt wird. Vgl. z. B. WO93/20242 . In diesem Fall können die Verbindungen, die aktiv sind, bestimmt werden, indem das Lysat genommen wird und sodann das Lysat in ein Polymerase-Kettenreaktions-Medium eingeführt wird, welches Primer, die für den Nucleinsäure-Marker spezifisch sind, umfasst. Nach der Expansion kann man den Nucleinsäure-Marker sequenzieren oder seine Sequenz durch andere Verfahren ermitteln, welche das zur Herstellung der Verbindung verwendete Syntheseverfahren bestimmen werden.
Alternativ kann man mit Marker versehene Partikel verwenden, wobei die Marker von den Partikeln freigesetzt werden können und einen binären Code bereitstellen, welcher das Syntheseverfahren für die an das Partikel gebundenen Verbindungen beschreibt. Vgl. z. B. Ohlmeyer et al., PNAS USA (1993) 90: 10922. Diese Marker können im günstigen Fall eine homologe Reihe von Alkylenverbindungen sein, die durch Gaschromatographie-Elektroneneinfang nachgewiesen werden können. Abhängig von der Art der Bindungsgruppe ist eine partielle Freisetzung von den Partikeln möglich, so dass die Partikel zwei- oder dreimal verwendet werden können, bevor die bestimmte Verbindung identifiziert wird.
Zwar wurden meistens Banken angesprochen, jedoch kann auch jede beliebige große Gruppe von Verbindungen analog durchgemustert werden, so lange das CTGF-Epitop an jede der Verbindungen gekoppelt werden kann. Somit können auch Verbindungen unterschiedlicher Herkunft, sowohl natürliche als auch synthetische Verbindungen, einschließlich Makrolide, Oligopeptide, Ribonucleinsäuren, Dendrimere usw., in analoger Weise durchgemustert werden.
In dem Test zeigt die Bildung eines Plaque an, dass die Bindung des Mitglieds der Bank an die Zelle, üblicherweise an ein Oberflächenprotein, die Bindung des CTGF-Epitops an einen Antikörper nicht stört, dass der Immunkomplex ausreichend stabil ist, um die Komplementkaskade in Gang zu setzen, und dass das Mitglied eine hohe Affinität für das Ziel hat.
Andere Durchmusterungsverfahren zum Erhalten kleiner Moleküle, welche die Aktivität von CTGF-Fragmenten der vorliegenden Erfindung modulieren, sind in der PCT-Veröffentlichung WO 9813353 beschrieben.
Pharmazeutische Formulierungen und Verabreichungsrouten
Um kleine Moleküle und andere Mittel zu identifizieren, die in den vorliegenden Verfahren zum Behandeln oder Verhindern einer Nierenstörung durch Modulieren der Aktivität und Expression von CTGF eingesetzt werden können, können der CTGF und biologisch aktive Fragmente davon zum Durchmustern therapeutischer Verbindungen in einem beliebigen von zahlreichen Screening-Verfahren eingesetzt werden. Fragmente, die in solchen Screening-Tests verwendet werden, können frei in Lösung vorliegen, an einen festen Träger fixiert sein, auf einer Zelloberfläche vorliegen oder intrazellulär lokalisiert sein. Das Blockieren oder Abschwächen der biologischen Aktivität oder die Bildung von Bindungskommplexen zwischen CTGF und dem Mittel, das getestet wird, kann durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet verfügbar sind, gemessen werden.
Andere Verfahren eines Arzneistoffscreenings, welche eine Durchmusterung von Verbindungen mit hohem Durchsatz bereitstellen, wobei die Verbindungen eine geeignete Bindungsaffinität für CTGF oder für ein anderes Ziel-Polypeptid, das zum Modulieren, Regulieren oder Hemmen der Expression und/oder der Aktivität von CTGF geeignet ist, aufweisen, sind auf dem Fachgebiet bekannt. Z. B. können Mikroarrays, welche Testverbindungen tragen, hergestellt, verwendet und analysiert werden, wobei Verfahren eingesetzt werden, die auf dem Fachgebiet verfügbar sind. Vgl. z. B. Shalon, D., et al., 1995, PCT-Anmeldung Nr. WO95/35505 ; Baldeschweiler et al., 1995, PCT-Anmeldung Nr. WO95/251116 ; Brennan, T. M., et al., 1995, US-Patent Nr. 5 474 796 ; Heller, M. J., et al., 1997, US-Patent Nr. 5 605 662 .
Die Identifizierung kleiner Moleküle, welche die CTGF-Aktivität modulieren, kann auch durch verschiedene andere Screening-Verfahren durchgeführt werden, die auch dazu dienen können, Antikörper und andere Verbindungen zu identifizieren, welche mit CTGF interagieren und welche in den vorliegenden Verfahren als Arzneistoffe und Therapeutika eingesetzt werden können. Vgl. z. B. Enna, S. J., et al., Hrsg., 1998, „Current Protocols in Pharmacology", John Wiley and Sons. Die Tests stellen typischerweise nachweisbare Signale bereit, die mit der Bindung der Verbindung an ein Protein oder ein zelluläres Ziel assoziiert sind. Die Bindung kann z. B. durch Fluorophore, Enzymkonjugate und andere nachweisbare Markierungen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, nachgewiesen werden. Vgl. z. B. Enna et al.. Die Ergebnisse können qualitativ oder quantitativ sein.
Zum Durchmustern der Verbindungen auf eine spezifische Bindung können verschiedene Immuntests angewendet werden, wobei z. B. menschliche oder Primaten-Antikörper nachgewiesen werden, die an die Zellen gebunden sind. Hierbei kann man markierte anti-hlg, z. B. anti-hlgM, -hlgG oder Kombinationen davon, einsetzen, um spezifisch gebundenen menschlichen Antikörper des Galactosyl-Epitops nachzuweisen. Verschiedene Markierungen können verwendet werden, wie Radioisotope, Enzyme, fluoreszierende Substanzen, chemilumineszierende Substanzen, Partikel usw.. Es gibt zahlreiche kommerziell verfügbare Kits, die markierte anti-hlg bereitstellen, welche gemäß dem Protokoll des Herstellers eingesetzt werden können.
Zum Durchmustern der Verbindungen auf cytotoxische Effekte kann eine große Vielzahl von Protokollen verwendet werden, so dass sichergestellt werden kann, dass man die gewünschte Aktivität erhält. Normalerweise wird man Zellen verwenden, die natürlich vorkommende oder modifizierte Zelllinien oder dergleichen sein können. Die Zellen können prokaryontische oder eukaryontische Zellen sein. Wenn man z. B. an einem Pathogen interessiert ist, wobei es egal ist, an welches Epitop das Verbindungskonjugat bindet, kann man die pathogenen Zellen mit jeder der Verbindungen in Gegenwart eines Antikörper-abhängigen cytotoxischen Systems kombinieren, um die cytotoxische Wirkung zu bestimmen. Man kann diesen Test durchführen, bevor die Wirkung der verschiedenen Verbindungskandidaten auf die Zellen des Wirts, an den die Verbindung verabreicht werden soll, bestimmt wird oder danach. Auf diese Weise würde man eine differenzierende Analyse zwischen der Affinität für das pathogene Ziel und der Affinität für Wirtszellen, die aufgrund der Verabreichungsart betroffen sein könnten, erhalten.
In einigen Fällen wäre man vielleicht an einem bestimmten Zustand der Zelle interessiert, etwa einem aktivierten Zustand, wie er bei T-Zellen bei Autoimmunleiden, Transplantation und dergleichen vorliegen kann. In dieser Situation würde man zuerst die Verbindungen durchmustern, um diejenigen zu bestimmen, die an die ruhende Zelle binden, und bezüglich derjenigen Verbindungen, die nicht an die ruhenden Zellen binden, würde man dann die restlichen Kandidaten der Verbindungen auf Cytotoxizität gegenüber den aktivierten Zellen durchmustern. Danach kann man nach anderen Zellen durchmustern, die in dem Wirt vorliegen und die möglicherweise durch die Verbindungen beeinflusst werden, wobei die cytotoxische Wirkung der Verbindungen bestimmt wird. Alternativ könnte man Krebszellen und normale Zellen verwenden, um zu bestimmen, ob eine der Verbindungen eine höhere Affinität für die Krebszellen als für die normalen Zellen aufweist. Wieder könnte man die Bank von Verbindungen auf eine Bindung an normale Zellen durchmustern und die Wirkung bestimmen. Diejenigen Verbindungen, die gegen normale Zellen nicht cytotoxisch sind, könnte man dann auf ihre cytotoxische Wirkung gegen Krebszellen durchmustern. Auch wenn eine gewisse Cytotoxizität gegen normale Zellen vorliegt, könnte man im Fall von Krebszellen, wenn eine ausreichende Differenzierung in der cytotoxischen Aktivität vorhanden ist, gewillt sein, die niedrigere Cytotoxizität gegen normale Zellen zu tolerieren, wenn für die Verbindung ansonsten gezeigt wurde, dass sie bei Krebszellen wirksam ist.
Anstatt Zellen zu verwenden, die natürlich erhalten wurden, kann man auch Zellen einsetzen, die durch Rekombinationsverfahren modifiziert wurden. So kann man Zellen verwenden, die in Kultur gezüchtet werden können, und die durch Hochregulieren oder Niederregulieren eines bestimmten Gens modifiziert werden können. Auf diese Weise würde man Zellen erhalten, die sich in einem einzelnen Protein auf der Oberfläche unterscheiden. Dann könnte man die Bank differenzierend hinsichtlich der Wirkung der Mitglieder der Bank auf die Zellen testen, bei denen das bestimmte Protein vorliegt oder fehlt. Auf diese Weise könnte man bestimmen, ob die Verbindung eine spezifisch Affinität für ein bestimmtes Oberflächen-Membranprotein aufweist, und zwar unterschiedlich von jedem der anderen Proteine, die auf der Oberflächenmembran vorliegen.
Man kann zwischen Zellen unterscheiden, indem man Antikörper verwendet, die an ein bestimmtes Oberflächen-Membranprotein binden, wobei diese Antikörper jedoch nicht den Komplement-abhängigen cytotoxischen Effekt in Gang setzen, dies kann z. B. unter Verwendung unterschiedlicher Spezies, Isotypen oder Kombinationen davon erfolgen. Wenn die Antikörper, die blockierenden Antiseren oder monoclonalen Antikörper zu einem Teil der Zellen zugegeben werden, ist bei diesen Zellen das Zellprotein nicht mehr verfügbar, das für die Bindung an das Mitglied der Bank erforderlich ist. Auf diese Weise erzeugt man Vergleichszellen, welche sich in ihrer Antwort unterscheiden, und zwar aufgrund der Nicht-verfügbarkeit eines einzelnen Proteins in der einen Gruppe. Zwar sind Antikörper üblicherweise die Reagenzien, die für die Verwendung am besten geeignet sind, jedoch können auch andere spezifische Bindungseinheiten verwendet werden, welche die gleiche Funktion bereitstellen.
In dem Test zur Bestimmung der Bindung kann man ein Antikörper-abhängiges cytotoxisches System einsetzen. Man könnte synthetische Gemische der Bestandteile verwenden, wobei nur diejenigen Komponenten, die für die cytotoxische Wirkung erforderlich sind, vorliegen. Dies kann dann wünschenswert sein, wenn Komponenten von Blut oder Plasma möglicherweise die Ergebnisse des Tests negativ beeinflussen würden.
Außerdem stellt zwar ein Zellrasen eine extrem günstige Art und Weise zum Durchmustern einer großen Zahl von Kandidaten dar, jedoch können auch andere Verfahren Verwendung finden. Diese Verfahren schließen die Verwendung von Platten mit vielen Vertiefungen und der verschiedenen Vorrichtungen ein, die für die Herstellung der kombinatorischen Bank eingesetzt werden, wie Stifte, Teebeutel usw.. Man kann die Zellen getrennt züchten, je nach Art der verschiedenen Vorrichtungen, wobei die Vorrichtung dann mit den Zellen in Kontakt gebracht werden kann, oder man kann die Zellen auf der Vorrichtung züchten. Die Vorrichtung kann in eine geeignete Kultur eingetaucht werden, die Zellen können darauf angesät werden, oder der Kontakt zwischen den Zellen und dem Verbindungskandidaten kann auf andere Weise hergestellt werden. Nach Zugabe des cytotoxischen Mittels kann man dann auf verschiedene Art und Weise analysieren, ob eine Lyse erfolgt ist. Z. B. kann eine FACS verwendet werden, um zwischen lebenden und toten Zellen zu unterscheiden, eine sup-⁵¹Cr-Freisetzung kann verwendet werden, oder der Nachweis einer intrazellulären Verbindung im Überstand kann dazu dienen, aktive Verbindungen nachzuweisen.
Außerdem kann es wünschenswert sein zu wissen, ob die Verbindung eine Agonist- oder Antagonist-Aktivität besitzt. Die vorliegenden Testverfahren stellen ein schnelles Verfahren bereit, mit dem diejenigen in der Bank vorliegenden Verbindungen bestimmt werden können, die an das Zielprotein binden. Sobald man die Zahl von Verbindungskandidaten wesentlich eingeengt hat, kann man verfeinertere Tests zum Nachweis der Aktivität der Verbindung selbst einsetzen. Auf diese Weise kann man eine schnelle Durchmusterung durchführen, um die Bindungsaffinität und Spezifität zu bestimmen, und hierauf folgt dann eine gründlichere Durchmusterung, um die Aktivität zu bestimmen. Es gibt verschiedene Techniken, mit denen die Aktivität bestimmt werden kann, wobei die Zellen so modifiziert werden können, dass ein Markergen aktiviert wird, welches dann ein nachweisbares Signal bereitstellt. Günstig ist, wenn das Signal assoziiert ist mit der Produktion eines Farbstoffs, mit der Produktion eines Oberflächen-Membranproteins, das mit markierten Antikörpern nachgewiesen werden kann, oder mit der Sekretion eines Proteins, das im Überstand durch eines von verschiedenen Verfahren nachgewiesen werden kann. Z. B. kann das Gen, das exprimiert wird, Luciferase-modifiziert sein, wobei es eine Leader-Sequenz aufweist, so dass es ausgeschieden wird, wodurch der Überstand sodann unter Verwendung eines geeigneten Substrats auf die Erzeugung von Licht durchgemustert werden kann.
Für die Durchmusterung der Bank können verschiedenen Protokolle eingesetzt werden. Dies wird in einem gewissen Ausmaß von der Art der Zubereitung der Verbindungen abhängen. Z. B. können die Verbindungen an einzelne Partikel, Stifte, Membranen oder dergleichen gebunden sein, wobei jede der Verbindungen abgetrennt werden kann. Außerdem wird die Menge der Verbindung, die verfügbar ist, variieren, abhängig von dem verwendeten Verfahren, das zum Erzeugen der Bank eingesetzt wird. Außerdem kann es möglich sein, abhängig von der Art der Kopplung der Verbindung an den Träger, Aliquots einer Verbindung freizusetzen, so dass eine Reihe von Tests durchgeführt werden kann. Außerdem wird die Art und Weise, wie die Verbindungen getestet werden, durch die Fähigkeit zur Identifizierung der Verbindung, für die gezeigt wurde, dass sie eine Aktivität besitzt, beeinflusst.
Wenn die Verbindungen einzeln auf einer Oberfläche in gitterförmiger Anordnung vorliegen, so dass man die Zusammensetzung an jeder Stelle des Gitters kennt, kann man einen Zellrasen bereitstellen, der ähnlich organisiert ist wie ein Gitter und in Übereinstimmung mit den an die feste Oberfläche gebundenen Verbindungen plaziert werden kann. Sobald der Rasen und das feste Substrat übereinstimmend angeordnet sind, kann man die Verbindungen entsprechend der Art und Weise, wie die Verbindungen gekoppelt sind, von der Oberfläche freisetzen. Nach einer ausreichenden Zeitspanne, in der die Verbindungen an die Proteine an der Zelloberfläche binden können, kann man den Zellrasen waschen und auf diese Weise die nicht spezifisch gebundene Verbindungen entfernen. Ein oder mehrere Waschgänge können nötig sein, wobei durch die Waschgänge ein variierendes Ausmaß an Stringenz bereitgestellt werden kann, abhängig davon, welches Ausmaß an Affinität gewünscht wird. Nachdem die Waschgänge vollständig durchgeführt wurden, kann anschließend Säugerblut oder -Plasma zugefügt werden und das Ganze sodann eine für Cytotoxizität ausreichende Zeitspanne inkubiert werden. Danach kann das Plasma oder Blut entfernt werden, und anschließend können Plaques festgestellt werden, wobei anhand der Position im Gitter bestimmt werden kann, um welche Verbindung es sich handelt. Das Plasma oder Blut kann frei von beliebigen Komponenten sein, welche die Zellen des Rasens in der Natur abtöten würden.
Da der präparative Prozess wiederholt werden kann, könnte man mehrere feste Substrate herstellen, bei denen die gleichen Verbindungen an den vergleichbaren Stellen präpariert werden, so dass die Durchmusterung mit den gleichen oder mit anderen Zellen wiederholt werden könnte, um die Aktivität der einzelnen Verbindungen zu bestimmen. In einigen Fällen kann die Identität der Verbindung durch einen Nuleinsäure-Marker bestimmt werden, wobei die Polymerase-Kettenreaktion für die Amplifikation des Markers eingesetzt wird. Vgl. z. B. die PCT-Anmeldung Nr. WO93/20242 . In diesem Fall können die Verbindungen, die aktiv sind, bestimmt werden, indem das Lysat genommen wird und sodann das Lysat in ein Polymerase-Kettenreaktions-Medium eingeführt wird, welches Primer, die für den Nucleinsäure-Marker spezifisch sind, umfasst. Nach der Expansion kann man den Nucleinsäure-Marker sequenzieren oder seine Sequenz durch andere Verfahren bestimmen, welche die Auswahl des zur Herstellung der Verbindung verwendeten Verfahrens bestimmen werden.
Alternativ kann man mit Marker versehene Partikel verwenden, wobei die Marker von den Partikeln freigesetzt werden können und einen binären Code bereitstellen, welcher das Syntheseverfahren für die an das Partikel gebundenen Verbindungen beschreibt. Vgl. z. B. Ohlmeyer et al., 1993, PNAS 90: 10922. Diese Marker können im günstigen Fall eine homologe Reihe von Alkylenverbindungen sein, die durch Gaschromatographie-Elektroneneinfang nachgewiesen werden können. Abhängig von der Art der Bindungsgruppe ist eine partielle Freisetzung von den Partikeln möglich, so dass die Partikel zwei- oder dreimal verwendet werden können, bevor die bestimmte Verbindung identifiziert wird.
Zwar wurden meistens Banken angesprochen, jedoch kann auch jede beliebige große Gruppe von Verbindungen analog durchgemustert werden, so lange das CTGF-Epitop an jede der Verbindungen gekoppelt werden kann. Somit können auch Verbindungen unterschiedlicher Herkunft, sowohl natürliche als auch synthetische Verbindungen, einschließlich Makrolide, Oligopeptide, Ribonucleinsäuren, Dendrimere usw., in analoger Weise durchgemustert werden.
In dem Test zeigt die Bildung eines Plaque an, dass die Bindung des Mitglieds der Bank an die Zelle, üblicherweise an ein Oberflächenprotein, die CTGF-Epitop-Bindung an einen Antikörper nicht stört, dass der Immunkomplex ausreichend stabil ist, um die Komplementkaskade in Gang zu setzen, und dass das Mitglied eine hohe Affinität für das Ziel hat.
Die vorliegende Methodik kann in einer beliebigen Situation eingesetzt werden, in der man ein zelluläres Ziel hat, das abgetötet werden soll, insbesondere diejenigen zellulären Ziele, die wenige oder kein CTGF-Epitop aufweisen. So kann das zelluläre Ziel ein Prokaryot sein, der pathogen ist. Verschiedene Organismen schließen z. B. Microbacterium, Yersinia, Pseudomonas, Bordetella pertussis, Treponema pallidum, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus, Haemophilus influenzae usw. ein. Andere Krankheitserreger schließen Eukaryonten, insbesondere Pilze wie Candida, Histoplasma usw. und Protozoen, z. B Giardia, ein. Außerdem können auch Viren, die Oberflächen-Membranproteine in infizierten Zellen bereitstellen, das Ziel der vorliegenden Verbindungen sein, wobei die Zellen, die durchgemustert werden, vital infiziert wurden.
Auch Wirtszellen können als Ziele dienen, wobei die Zellen entweder abnorm sind oder auf den Wirt oder die Behandlungen des Wirts in negativer Weise wirken. Z. B. können Krebsgewebe, die sich von dem natürlichen Gewebe unterscheiden lassen, als ein Ziel für die vorliegenden Verbindungen dienen. Auch T- und B-Zellen, die mit Autoimmunkrankheiten assoziiert sind oder die mit GVHD oder einer Transplantat-Abstoßung in Zusammenhang stehen, können als Ziele dienen. Weiterhin können abnorme Zellen als Ziele dienen, und zwar unabhängig von ihrer Natur, so lange sie von normalen Zellen unterschieden werden können. So können psoriatische Läsionen, Lymphomzellen, Bakterien-, Pilz-, Parasiten-, Virus-infizierte Zellen als Ziele für die vorliegenden Produkte dienen. Auch wenn man einen Teil von Zellen entfernen will, ohne dass alle Zellen entfernt werden, wie Zellen, die einen Differenzierungsmarker exprimieren, wie Untergruppen von T-Zellen, aktivierte Thrombocyten, Endothelzellen, Hormon- oder Cytokin-Rezeptor-exprimierende Zellen, können die vorliegenden Verbindungen eingesetzt werden.
Andere Screening-Verfahren zum Erhalt kleiner Moleküle, welche die Aktivität von CTGF modulieren, finden sich z. B. in der PCT-Anmeldung Nr. WO 9813353 .
Verbindungen/Moleküle: Die Beschreibung stellt Verfahren zum Behandeln und Verhindern von Störungen, CTGF-assoziierten Erkrankungen und Störungen durch Modulieren, Regulieren oder Hemmen der Aktivität von CTGF oder CTGF-Fragmenten der vorliegenden Erfindung bereit. Diese Verfahren können die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung umfassen, welche die Bindungs-Wechselwirkungen blockiert oder Enzyme blockiert, die an dem Signalübertragungsweg von CTGF beteiligt sind. Insbesondere stellt die Beschreibung ein Verfahren zum Hemmen der Aktivität von CTGF durch Verabreichen von Verbindungen, welche die Induktion von CTGF blockieren, bereit.
Verbindungen, welche die Expression des CTGF-Gens und/oder die CTGF-Aktivität in dem Verfahren der Erfindung modulieren, schließen Mittel ein, die eine Erhöhung der cyclischen Nucleotide in der Zelle bewirken. Andere Verbindungen, welche die Induktion von CTGF gemäß den hier beschriebenen Verfahren blockieren können, können unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Screening-Verfahren identifiziert werden.
In einer Ausführungsform stellt die Beschreibung ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung oder eines Mittels bereit, welche/s die mitogene Aktivität eines CTGF-Fragments, z. B. eines durch die Exons 4 und 5 codierten Fragments, wie in 2 dargestellt, moduliert. Das Verfahren schließt das Inkontaktbringen eines Mittels von Interesse wie eines Peptids, kleinen Moleküls, Polypeptids, Peptidomimetikums mit den Zellen (z. B. Fibroblasten) und einem CTGF-Fragment, von dem bekannt ist, dass es eine mitogene Aktivität besitzt, und das Messen der Fähigkeit der Zellen zu proliferieren durch Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, ein (vgl. Beispiele). Anschließend wird die Fähigkeit der Zellen zu proliferieren mit der Fähigkeit einer geeigneten Kontrollpopulation von Zellen in Abwesenheit des Mittels oder der Verbindung zu proliferieren verglichen.
Der wie hier verwendete Begriff „Mittel" oder „Verbindung" beschreibt ein beliebiges Molekül, z. B. ein Protein, Polypeptid oder Pharmazeutikum, mit der Fähigkeit, das Wachstum einer Zelle zu beeinflussen. Das Mittel kann ein beliebiges Mittel sein, von dem bekannt ist oder von dem vermutet wird, dass es in der Lage ist, das Wachstum von Zellen zu beeinflussen. Das Mittel schließt Peptidfragmente des CTGF-Polypeptids ein. Die Mittel schließen synthetische chemische Mittel, biochemische Mittel, Zellen, Extrakte, Homogenisate und ein konditioniertes Medium ein. Das Testmittel kann auch eine kombinatorische Bank für das Screening einer Vielzahl von Verbindungen sein. Verbindungen, die in dem Verfahren der Erfindung identifiziert wurden, können noch weiter getestet, nachgewiesen, cloniert, sequenziert und dergleichen werden, entweder in Lösung oder nach Bindung an einen festen Träger, und zwar durch ein beliebiges Verfahren, das üblicherweise zum Nachweis einer spezifischen DNA-Sequenz verwendet wird, wie PCR, Oligomer-Restriktion (Saiki et al., Bio/Technology 3: 1008–1012, 1985), Allel-spezifische Oligonucleotid(ASO)-Sondenanalyse (Conner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 278, 1983), Oligonucleotid-Ligierungstests (OLAs) (Landegren et al., Science 241: 1077, 1988) und dergleichen. Molekulare Verfahren für die DNA-Analyse wurden beschrieben (Landegren et al., Science 242: 229–237, 1988).
Mögliche Kandidaten für die Mittel umfassen zahlreiche chemische Klassen. Dabei kann es sich um organische Moleküle handeln, vorzugsweise kleine organische Verbindungen mit einem Molekulargewicht von mehr als 50 und weniger als etwa 2.500 Dalton. Kandidaten für die Mittel umfassen funktionelle Gruppen, die für eine strukturelle Interaktion mit Proteinen erforderlich sind, insbesondere Wasserstoffbindung, und schließen typischerweise mindestens einen Amino-, Carbonyl-, Hydroxyl- oder Carboxylrest, vorzugsweise mindestens zwei funktionelle chemische Gruppen ein. Die Kandidaten für die Mittel umfassen häufig cyclische Kohlenstoffreste oder heterocyclische Strukturen und/oder aromatische oder polyaromatische Strukturen, die mit einer oder mehreren der vorstehenden funktionellen Gruppen substituiert sind. Kandidaten für die Mittel finden sich auch unter Biomolekülen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Peptide, Saccharide, Fettsäuren, Steroide, Purine, Pyrimidine, Derivate, Strukturanaloga oder Kombinationen davon. Kandidaten für die Mittel können Polypeptide oder solche Polypeptide, die durch eine ortsgerichtete oder zufällige Mutagenese einer synthetischen oder natürlich vorkommenden Nucleinsäuresequenz hergestellt wurden, sein.
In einem weiteren Aspekt stellt das Verfahren die Verabreichung von Molekülen bereit, welche die post-translationale Modifikation des vollständigen CTGF unterbrechen oder die Aktivierung eines inaktiven Vorläufers von CTGF blockieren. Wie hier besprochen, führte die Exposition von Mesangiumzellen gegenüber TGF-β zu einem deutlichen Auftreten von zusätzlichen Banden bei 28 bis 30 kDa, welche in der Größe den carboxy- und aminoterminalen Hälften des vollständigen CTGF-Moleküls entsprechen. Wie vorstehend beschrieben, kann eine Behandlung mit TGF-β zur Produktion von Proteasen oder anderen Faktoren führen, die in der Lage sind, das vollständige Molekül zu spalten. Moleküle, welche die CTGF-Aktivität hemmen, können unter Verwendung der hier bereitgestellten Screening-Verfahren identifiziert werden.
Pharmazeutische Formulierungen und Verabreichungsrouten
Verabreichungsrouten: Die Zusammensetzungen, welche CTGF-Modulatoren, d. h. Antikörper, Antisense-Oligonucleotide, kleine Moleküle und andere Verbindungen, wie hier beschrieben, umfassen, können an einen menschlichen Patienten per se oder in Arzneimitteln, welche gegebenenfalls geeignete Träger oder Excipienten umfassen, verabreicht werden. Die Beschreibung betrifft Behandlungsverfahren, wobei Mittel, welche die Expression oder Aktivität von CTGF oder von Fragmenten davon modulieren oder regulieren, an einen Patienten, der sie benötigt, in Mengen verabreicht werden, die für die Behandlung oder Verhinderung der Aktivität oder der Expression des CTGF-Fragments geeignet sind. Die vorliegenden Verfahren der Behandlung und Verhinderung können die Verabreichung einer wirksamen Menge des Mittels an ein Individuum umfassen, das vorzugsweise ein Säuger-Individuum und am stärksten bevorzugt ein menschliches Individuum ist. In einer bevorzugten Ausführungsform sind das Säuger-Individuum und das verabreichte Mittel homologen Ursprungs. Am stärksten bevorzugt sind das Individuum und das verabreichte Mittel menschlichen Ursprungs.
Eine wirksame Menge kann einfach durch Routineexperimente bestimmt werden, wie auch die wirksamste und am besten geeignete Verabreichungsroute und die am besten geeignete Formulierung. Verschiedene Formulierungen und Arzneistoff-Verabreichungssysteme sind auf dem Fachgebiet verfügbar. Vgl. z. B. Gennaro, A. R., Hrsg., 1990, „Remington's Pharmaceutical Sciences", 18. Auflg., Mack Publishing Co., Easton PA. Geeignete Verabreichungsrouten können z. B. eine orale, rektale, Schleimhaut- oder intestinale Verabreichung und parentale Gabe, einschließlich intramuskuläre, subkutane, intramedulläre Injektionen sowie intrathekale, direkte intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale, intranasale oder intraokulare Injektionen einschließen. Die Zusammensetzungen können eher in lokaler als in systemischer Form verabreicht werden.
Die hier beschriebenen Arzneimittel können durch ein beliebiges der Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie durch herkömmliche Prozesse von Mischen, Lösen, Granulieren, Herstellen von Dragees, Zerreiben, Emulgieren, Einkapseln, Einschluss oder Lyophylisieren hergestellt werden. Wie vorstehend angegeben, können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung einen oder mehrere physiologisch verträgliche Träger wie Excipienten und Hilfsstoffe enthalten, welche die Prozessierung aktiver Moleküle zu Präparaten für die pharmazeutische Verwendung erleichtern. Die richtige Formulierung ist von der gewählten Verabreichungsroute abhängig.
Für die Injektion kann die Zusammensetzung z. B. in wässrigen Lösungen formuliert werden, vorzugsweise in physiologisch kompatiblen Puffern wie Hanks-Lösung, Ringer-Lösung oder physiologischer Salzlösungspuffer. Für eine Verabreichung über die Schleimhaut werden in der Formulierung penetrationsfördernde Mittel, welche für die Grenzschicht, die durchdrungen werden soll, geeignet sind, eingesetzt. Solche penetrationsfördernden Mittel sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt. Für eine orale Verabreichung können die Verbindungen einfach formuliert werden, indem die Wirkstoffe mit pharmazeutisch verträglichen Trägern, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, kombiniert werden. Solche Träger machen es dann möglich, dass die Verbindungen der Erfindung als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirupe, Aufschlämmungen, Suspensionen und dergleichen für die orale Einnahme durch ein Individuum formuliert werden können. Die Verbindungen können auch zu rektalen Zusammensetzungen formuliert werden, wie Suppositorien oder Retentionseinläufe, die z. B. herkömmliche Grundlagen für Suppositorien wie Kakaobutter oder andere Glyceride enthalten.
Arzneimittel für die orale Verwendung können als feste Excipienten erhalten werden, wobei gegebenenfalls ein resultierendes Gemisch zermahlen wird und das Gemisch von Granula, nach Zusatz geeigneter Hilfsstoffe, sofern erwünscht, prozessiert wird, wodurch Tabletten oder Drageekerne erhalten werden. Geeignete Excipienten sind insbesondere Füllstoffe wie Zucker, einschließlich Lactose, Saccharose, Mannit oder Sorbit; Cellulose-Präparate wie z. B. Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Tragantgummi, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP). Falls gewünscht können Zerfallshilfsmittel zugegeben werden, wie das vernetzte Polyvinylpyrrolidon, Agar oder Alginsäure oder ein Salz davon wie Natriumalginat.
Drageekerne werden mit geeigneten Beschichtungen versehen. Für diesen Zweck können konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, die gegebenenfalls Gummi arabicum, Talkum, Polyvinylpyrrolidon, Carbopol-Gel, Polyethylenglykol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organischen Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische enthalten können. Außerdem können Farbstoffe oder Pigmente zu den Tabletten oder Drageeüberzügen zugegeben werden, um eine Identifizierung oder Charakterisierung unterschiedlicher Kombinationen von Wirkstoffdosen zu ermöglichen.
Arzneimittel für die orale Verabreichung schließen Push-fit-Kapseln ein, die aus Gelatine bestehen, sowie weiche, verschlossene Kapseln aus Gelatine und einem Weichmacher wie Glycerin oder Sorbit. Die Push-fit-Kapseln können die Wirkstoffe als Gemisch mit einem Füllstoff wie Lactose, Bindemitteln wie Stärken und/oder Gleitmitteln wie Talkum oder Magnesiumstearat und gegebenenfalls Stabilisatoren enthalten. In weichen Kapseln können die Wirkstoffe in geeigneten Flüssigkeiten wie fetten Ölen, flüssigem Paraffin oder flüssigen Polyethylenglykolen gelöst oder suspendiert sein. Außerdem können Stabilisatoren zugegeben werden. Alle Formulierungen für die orale Verabreichung sollten in Dosierungen vorliegen, die für eine solche Verabreichung geeignet ist.
Für eine Verabreichung durch Inhalation werden die Verbindungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung zweckmäßig in Form eines Aerosolspray-Präparats aus Verpackungen, die unter Druck stehen, oder in Form eines Verneblers verabreicht, wobei ein geeignetes Treibmittel, z. B. Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder ein anderes geeignetes Gas, verwendet wird. Im Fall eines unter Druck stehenden Aerosols kann die geeignete Dosierungseinheit bestimmt werden, indem ein Ventil verwendet wird, welches eine bestimmte Menge verabreicht. Kapseln und Kartuschen aus z. B. Gelatine können zur Verwendung in einem Inhalator oder Insufflationsapparat formuliert werden. Diese enthalten typischerweise ein Pulvergemisch der Verbindung und eine geeignete Pulvergrundlage wie Lactose oder Stärke.
Zusammensetzungen, die für eine parenterale Verabreichung durch Injektion, z. B. durch Bolus-Injektion oder durch kontinuierliche Infusion, formuliert werden, können in einer Einheits-Dosierungsform, z. B. in Ampullen oder in Multi-Dosis-Behältern, unter Zusatz eines Konservierungsmittels dargeboten werden. Die Zusammensetzungen können Formen wie Suspensionen, Lösungen und Emulsionen in öligen oder wässrigen Trägern darstellen und können Formulierungsmittel wie Suspendiermittel, Stabilisatoren und/oder Dispergiermittel enthalten. Formulierungen für eine parenterale Verabreichung schließen wässrige Lösungen von Mitteln, welche die Aktivität von CTGF oder Fragmenten davon auslösen, in wasserlöslicher Form ein.
Suspensionen der aktiven Verbindungen können als geeignete ölige Injektionssuspensionen hergestellt werden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Träger schließen fette Öle wie Sesamöl und synthetische Fettsäureester wie Ethyloleat oder Triglyceride oder Liposomen ein. Wässrige Injektionssuspensionen können Substanzen enthalten, welche die Viskosität der Suspension erhöhen, wie Natriumcarboxylmethylcellulose, Sorbit oder Dextran. Gegebenenfalls kann die Suspension auch geeignete Stabilisatoren oder Mittel enthalten, welche die Löslichkeit der Verbindungen steigern, so dass hoch konzentrierte Lösungen hergestellt werden können. Alternativ kann der Wirkstoff in Pulverform vorliegen, die dann vor der Verwendung mit einem geeigneten Träger, z. B. sterilem pyrogenfreiem Wasser, konstituiert wird.
Die hier beschriebenen Zusammensetzungen können auch als Depotpräparat formuliert werden. Solche lange wirkenden Zusammensetzungen können durch Implantation (z. B. subkutane oder intramuskuläre) oder durch intramuskuläre Injektion verabreicht werden. Z. B. können die Verbindungen mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Stoffen (z. B. als Emulsion in einem verträglichen Öl) oder Ionenaustauscher-Harzen oder als begrenzt lösliche Derivate, z. B. als ein begrenzt lösliches Salz, formuliert werden.
Pharmazeutische Träger für die hydrophoben Moleküle könnten Co-Lösungsmittel-Systeme einschließen, umfassend z. B. Benzylalkohol, ein nichtpolares grenzflächenaktives Mittel, ein wassermischbares organisches Polymer und eine wässrige Phase. Das Co-Lösungsmittel-System kann das Co-Lösungsmittel-System VPD sein. VPD ist eine Lösung von 3% (Gew./Vol.) Benzylalkohol, 8% (Gew./Vol.) des nichtpolaren grenzflächenaktiven Mittels Polysorbat 80 und 65% (Gew./Vol.) Polyethylenglykol 300, aufgefüllt mit absolutem Ethanol. Das Co-Lösungsmittel-System VPD (VPD:5W) besteht aus VPD, verdünnt 1:1 mit einer 5% Dextrose-in-Wasser-Lösung. Dieses Co-Lösungsmittel-System eignet sich zum Lösen hydrophober Verbindungen und ergibt bei einer systemischen Verabreichung eine geringe Toxizität. Natürlich können die Mengenanteile eines Co-Lösungsmittel-Systems deutlich variiert werden, ohne dass seine Eigenschaften bezüglich Löslichkeit und Toxizität zerstört werden. Außerdem kann die Identität der Co-Lösungsmittel-Komponenten variiert werden. Z. B. können andere nichtpolare grenzflächenaktive Mittel mit geringer Toxizität anstelle von Polysorbat 80 eingesetzt werden, die Größe des Anteils von Polyethylenglykol kann variiert werden, andere biokompatible Polymere können statt Polyethylenglykol verwendet werden, z. B. Polyvinylpyrrolidon, und andere Zucker oder Polysaccharide können anstelle von Dextrose eingesetzt werden.
Alternativ können andere Verabreichungssysteme für hydrophobe Moleküle eingesetzt werden. Bekannte Beispiele von Verabreichungsvehikeln oder Trägern für hydrophobe Arzneistoffe sind Liposomen und Emulsionen. Auch bestimmte organische Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid können verwendet werden, wobei dies jedoch üblicherweise auf Kosten einer größeren Toxizität geht. Weiterhin können die Verbindungen unter Verwendung von Systemen mit langanhaltender Freisetzung verabreicht werden, wie semipermeablen Matrizen von festen hydrophoben Polymeren, welche die wirksame Menge der Zusammensetzung, die verabreicht werden soll, enthalten. Verschiedene Stoffe für eine langanhaltende Freisetzung sind eingeführt und für den Fachmann verfügbar. Kapseln für eine langanhaltende Freisetzung können, abhängig von ihrer chemischen Natur, die Verbindungen einige wenige Wochen bis zu über 100 Tage lang freisetzen. Abhängig von der chemischen Natur und der biologischen Stabilität des therapeutischen Reagens können zusätzliche Strategien für die Stabilisierung eines Proteins eingesetzt werden.
Wirksame Dosierung: Für eine beliebige Zusammensetzung, die in den vorliegenden Behandlungsverfahren eingesetzt wird, kann eine therapeutisch wirksame Dosis anfangs unter Verwendung verschiedener Techniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, bestimmt werden. Z. B. kann in einem Zellkulturtest eine Dosis in Tiermodellen so formuliert werden, dass eine Konzentration im Kreislauf in dem Bereich erreicht wird, der den in der Zellkultur bestimmten IC₅₀-Wert einschießt. Wenn z. B. eine Hemmung der CTGF-Aktivität gewünscht wird, kann die Konzentration der Testverbindung bestimmt werden, welche die halbmaximale Hemmung der CTGF-Aktivität bewirkt. Dosierungsbereiche, die für menschliche Individuen geeignet sind, können unter Verwendung der aus Zellkulturtests oder anderen Studien mit Versuchstieren erhaltenen Daten bestimmt werden.
Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich auf diejenige Menge des Moleküls, die zu einer Besserung von Symptomen oder einer Verlängerung der Überlebenszeit eines Individuums führt. Die Toxizität und die therapeutische Wirksamkeit solcher Moleküle können durch pharmazeutische Standardverfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren bestimmt werden, z. B. durch Bestimmen des LD₅₀-Werts (die Dosis, welche für 50% der Population letal ist) und des ED₅₀-Werts (die Dosis, welche in 50% der Population therapeutisch wirksam ist). Das Dosisverhältnis von toxischer Wirkung zu therapeutischer Wirkung ist der therapeutische Index, der als Verhältnis LD₅₀/ED₅₀ ausgedrückt werden kann. Bevorzugt sind Moleküle, welche hohe therapeutische Indizes zeigen.
Bevorzugt fallen Dosierungen in einen Bereich von Kreislaufkonzentrationen, welcher den ED₅₀ einschließt und wobei eine geringe oder keine Toxizität vorliegt. Dosierungen können innerhalb dieses Bereichs variieren, abhängig von der verwendeten Dosierungsform und der für die Verabreichung genutzten Route. Die genaue Formulierung, Verabreichungsroute und Dosierung wird dann unter Berücksichtigung der spezifischen Merkmale des Zustands des Individuums gewählt.
Die Menge und Intervalle der Dosierung können individuell eingestellt werden, so dass Plasmaspiegel des Wirkstoffs bereitgestellt werden, die ausreichend sind, um die CTGF-Aktivität wie gewünscht zu modulieren oder zu regulieren, d. h. die minimale wirksame Konzentration (MEC). Die MEC wird für jede Verbindung variieren, sie kann jedoch z. B. aus in vitro-Daten geschätzt werden, wie die Konzentration, die erforderlich ist, um eine Aktivität von CTGF von 50 bis 90% zu erreichen, um Knochenwachstum zu induzieren, wobei die hier beschriebenen Tests verwendet werden.
Dosierungen, die zum Erreichen der MEC erforderlich sind, werden von individuellen Merkmalen und der Verabreichungsroute abhängig sein. Zusammensetzungen sollten unter Verwendung eines Schemas verabreicht werden, welches Plasmaspiegel über der MEC für etwa 10 bis 90% der Behandlungsdauer, vorzugsweise etwa 30 bis 90% der Behandlungsdauer und am stärksten bevorzugt zwischen 50 und 90% aufrechterhält. In Fällen einer örtlichen Verabreichung oder einer selektiven Aufnahme kann es sein, dass die wirksame lokale Konzentration des Arzneistoffs nicht mit der Plasmakonzentration in Beziehung steht.
Die verabreichte Menge der Zusammensetzung wird natürlich von einer Reihe von Faktoren abhängig sein, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf das jeweilige Gewicht des Individuums, die Schwere des Leidens, die Art der Verabreichung und die Beurteilung des verschreibenden Arztes.
Verpackung: Die Zusammensetzungen können, sofern es gewünscht wird, in einer Packung oder in einem Spendergerät dargereicht werden, welche/s eine oder mehrere Einheits-Dosierungsformen, die den Wirkstoff umfassen, enthalten kann. Die Packung kann z. B. eine Metall- oder Kunststofffolie wie eine Blisterpackung umfassen. Der Packung oder dem Spendergerät können Anweisungen für die Verabreichung beigelegt werden. Außerdem können Zusammensetzungen, umfassend eine Verbindung der Erfindung, formuliert in einem verträglichen pharmazeutischen Träger, hergestellt, in einen geeigneten Behälter platziert und für die Behandlung eines indizierten Zustands beschriftet werden. Geeignete Zustände, die auf der Beschriftung angegeben sind, können die Behandlung von Störungen oder Krankheiten umfassen, wobei Knorpel- oder Knocheninduktion, Wundheilung, Neuroprotektion, Nierenfibrose, Diabetes oder dergleichen wünschenswert ist.
Beispiele
Die folgenden Beispiele werden lediglich zur Erläuterung der beanspruchten Erfindung bereitgestellt. Die vorliegende Erfindung soll jedoch in keiner Weise durch die als Beispiele angegebenen Ausführungsformen, welche lediglich als Erläuterungen einzelner Aspekte der Erfindung dienen sollen, in ihrem Umfang eingeschränkt werden, und Verfahren, die funktionell äquivalent sind, liegen im Umfang der Erfindung. Für den Fachmann werden aus der vorstehenden Beschreibung und den beiliegenden Zeichnungen noch verschiedene Modifikationen der Erfindung ersichtlich sein, welche zusätzlich zu den hier beschriebenen Ausführungsformen möglich sind. Solche Modifikationen sollen innerhalb des Umfangs der beigefügten Patentansprüche liegen.
Beispiel 1: CTGF-Fragmente stimulieren DNA-Synthese
Für die Herstellung von CTGF-Fragmenten wurde ein menschlicher rekombinanter CTGF (vollständige Länge) durch Chymotrypsin gespalten, um ein CTGF-Fragment herzustellen. Außerdem wurden rekombinante CTGF-Fragmente produziert, indem entweder eines oder beide von Exon 4 und Exon 5 von CTGF exprimiert wurden. Eine kontinuierliche Linie von gezüchteten normalen Rattennieren(NRK)-Fibroblasten, die als Clon NRK-49F bezeichnet wurde, wurde von der American Type Culture Collection (ATCC) bezogen, und hieraus wurden Zellkulturen hergestellt. Menschliche Vorhaut-Fibroblasten wurden aus Explantatkulturen etabliert. Die Zellkulturen wurden in Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DME), das 2,5% fetales Rinderserum und 2,5% Nu-Serum I (Collaborative Biomedical Products, Redford, MA) enthielt, gehalten und vor Erreichen der Konfluenz wurden Passagen durchgeführt.
Um die Rolle von CTGF-Fragmenten in der Mitogenese und DNA-Synthese zu untersuchen, wurden wachstumsgehemmte Einzelzellschichten von NRK und menschlichen Vorhaut-Fibroblasten hergestellt, indem 10.000 Zellen/Vertiefung in Platten mit 48 Vertiefungen eingesät wurden und sodann das Wachstum der Zellen bis zur Konfluenz in fünf bis sieben Tagen in DME und 2,5% fetalem Rinderserum/Nu-Serum zugelassen wurde. Danach wurde die Fibroblasten-Einzelzellschichten für einen bis acht Tage in DME-Medium, das 25 mM HEPES und ITS-Premix (Collaborative Biomedical) enthielt, an Serum ausgehungert. Anschließend wurden Ascorbinsäure (50 mg/ml) und biologische Mittel (0,5 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor plus CTGF-Fragmente) zugegeben. Die Kulturen wurden die letzten 24 Stunden der 48-stündigen Behandlungsperiode mit ³H-Thymidin markiert, und danach wurde die DNA-Synthese durch Fällung mit kalter Trichloressigsäure ermittelt. Die Ergebnisse wurden unter Verwendung eines quantitativen Tests als ZpM/Vertiefung ± SEM angegeben.
Wie in 1 dargestellt, induzierten die CTGF-Fragmente, welche rekombinant durch die Expression von nur Exon 4 und Exon 5 und durch Spaltung des vollständigen CTGF erzeugt wurden, in NRK-Fibroblasten mit 1 ng/ml etwa genauso wirksam die DNA-Synthese wie 1 ng/ml des intakten vollständigen CTGF oder 5 ng/ml TGF-β. Es ist anzumerken, dass N-terminale CTGF-Fragmente die NRK-Fibroblasten-Mitogenese nicht stimulierten.
Beispiel 2: Neutralisierende anti-CTGF-Antikörper blockieren die TGF-β-induzierte DNA-Synthese, Kollagen-Synthese und Myofibroblasten-Induktion
Spezifische anti-CTGF-Antikörper wurden gegen einen biologisch aktiven rekombinanten menschlichen CTGF hervorgebracht, der in einem Baculovirus-Expressionssystem produziert wurde, wobei auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren verwendet wurden. Diese Antikörper wurden in Ziegen hergestellt und auf eine neutralisierende Aktivität von CTGF entweder direkt oder auf die TGF-induzierte DNA- oder Kollagen-Synthese in NRK-Fibroblasten getestet. Die Ziegen-Antikörper zeigten in den Tests der Neutralisation der TGF-β-Wirkung eine Aktivität. In diesen Tests waren die Ziegen-anti-CTGF-Antikörper in der Lage, die DNA-Synthese, wie in 4 dargestellt, die Kollagen-Synthese und die Myofibroblasten-Bildung, die durch TGF-β induziert worden waren, zu blockieren. Dabei wurde festgestellt, dass die Antikörpermenge, die für die Blockierung der Kollagen-Synthese erforderlich war, signifikant kleiner war als die Menge, die für die Blockierung der DNA-Synthese erforderlich war. Sowohl der Western-Blot-Test als auch die Kompetitions-ELISA-Tests zeigten, dass der größte Teil der Antikörper in diesem Präparat gegen die N-terminale Domäne von CTGF gerichtet war. Dies legte nahe, dass die zwei Domänen möglicherweise für die Stimulation unterschiedlicher biologischer Aktivitäten verantwortlich sein könnten.
Beispiel 3: Anti-CTGF-Antikörper, die für die C-terminale Domäne von CTGF spezifisch sind, blockieren selektiv die DNA-Synthese
Domäne-spezifische anti-CTGF-Antikörper wurden durch Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung gereinigter C-terminaler oder N-terminaler CTGF-Domänen hergestellt. Diese Domänen wurden aus einem intakten CTGF durch eine limitierte Spaltung mit Chymotrypsin zubereitet. Die Domänen wurden durch Affinitätschromatographie auf Heparin-Sepharose voneinander getrennt. Die N-terminale Domäne bindet nicht an Heparin, während die C-terminale Domäne von CTGF die Heparin-Bindungsaktivität enthält und auf der Heparin-Sepharose zurückgehalten wird. Diese Domänen waren rein, wobei sie weniger als 0,1% Verunreinigung mit dem intakten CTGF aufwiesen, wie durch Western-Blot-Analyse bestimmt wurde. Danach wurden die einzelnen Domänen bei einer Konzentration von etwa 0,5 mg/ml Gel an Affigel-10 gekoppelt. Anschließend wurde ein Gesamt-anti-CTGF-IgG (Ziege) an das Affinitätsharz absorbiert und die spezifisch gebundenen Antikörper wurden eluiert. Diese Antikörper wurden sodann in Western-Blots getestet, wobei die Spezifität ihrer Reaktivität bestimmt wurde. IgGs, die nur mit der N-terminalen oder der C-terminalen Domäne von CTGF reaktiv waren, wurden aus dem Gesamtpool unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, isoliert. Danach wurden die Antikörper in Neutralisationstests unter Verwendung von CTGF getestet. Die Ergebnisse dieser Studien zeigten, dass Antikörper, die gegen die C-terminale Domäne von CTGF gerichtet waren, selektiv die DNA-Synthese, nicht jedoch die Kollagen-Synthese hemmten. Im Gegensatz dazu hemmte die N-terminale Domäne von CTGF selektiv die Kollagen-Synthese, nicht jedoch die DNA-Synthese. Diese Ergebnisse zeigten, dass verschiedene Regionen des CTGF-Moleküls möglicherweise für die Signalisierung unterschiedlicher biologischer Aktivitäten verantwortlich sind. Um diese Ergebnisse zu bestätigen und noch auszubauen, wurden die biologischen Aktivitäten der isolierten Domänen mit denen des intakten CTGF und des TGF-β verglichen, wie nachstehend angegeben.
Beispiel 4: Die C-terminale Domäne von CTGF stimuliert DNA-Synthese und Zelle
Proliferation
Die C-terminalen und N-terminalen Domänen von CTGF wurden unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, hergestellt. Zuerst wurden, wie vorstehend beschrieben, reine C-terminale und N-terminale Domänen durch proteolytische Spaltung des biologisch aktiven, intakten CTGF unter Verwendung von Chymotrypsin hergestellt, wodurch fast ausschließlich intakte C-terminale Domänen und N-terminale Domänen und keine kleineren Fragmente produziert wurden. Ein zweites Verfahren zur Erzeugung reiner C-terminaler und N-terminaler Domänen umfasste die Expression von nur begrenzten Regionen des offenen Leserasters von CTGF, welche nur die C-terminale Domäne oder nur die N-terminale Domäne codierten. Dies wurde erreicht, indem Teile des offenen Leserasters durch PCR amplifiziert wurden und entweder ein Stopp-Codon in die Cystein-freie Region eingeführt wurde, um nur die N-terminale Domäne zu produzieren, oder der Teil des offenen Leserasters, welcher nur die C-terminale Domäne codiert, beginnend an der Sequenz AYRLED in der Cystein-freien Region, in den Baculovirus-Pendelvektor GP67 cloniert wurde. Dadurch wurde ein chimäres Protein erzeugt, das ein Signalpeptid aus dem GP67-Virusgen enthielt, welches die Synthese des gewünschten rekombinanten Proteins (oder Fragments) zum endoplasmatischen Retikulum hinsteuerte, wodurch die Sekretion sichergestellt wurde. Nach der Reinigung wurden die isolierten Domänen, die durch die verschiedenen Verfahren hergestellt worden waren, in einem Bioassay mit NRK-Fibroblasten verglichen. Die Ergebnisse dieser Studien bestätigten die früheren Beobachtungen mit den Domäne-spezifischen anti-CTGF-Antikörpern. Die durch beide Verfahren produzierten C-terminalen Domänen waren im DNA-Synthese-Test vollständig aktiv, wie vorstehend beschrieben und wie in 5 dargestellt. Umgekehrt waren die entweder durch proteolytische Spaltung des intakten CTGF oder durch direkte rekombinante Expression produzierten N-terminalen Domänen vollständig aktiv als Induktoren der Kollagen-Synthese und in der Myofibroblasten-Induktion. Diese Ergebnisse zeigten, dass die einzelnen Domänen von CTGF die vollständige biologisch Aktivität beibehielten und dass sie unabhängig voneinander wirken können, so dass sie auf den Zielzellen spezifische biologische Effekte stimulieren. Bei optimalen Konzentrationen induzierten die einzelnen Domänen eine biologische Antwort, die mit dem intakten CTGF oder TGF-β vergleichbar war. Dies zeigt deutlich, dass mitogene (DNA-Synthese, Zell-Proliferation) und matrigene (Synthese der extrazellulären Matrix wie Kollagen-Synthese) Aktivitäten von TGF-β über CTGF und seine entsprechenden Domänen vermittelt werden.
Andere Wachstumsfaktoren können eingesetzt werden, um die mitogene Aktivität von CTGF-Fragmenten der vorliegenden Erfindung zu steigern, einschließlich z. B. des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF). Wie in 6 dargestellt, steigert EGF die mitogene Aktivität von CTGF auf NRK-Zellen.
Sequenzprotokoll

Claims

CTGF-Fragment bestehend aus der Aminosäuresequenz von Rest 4 bis Rest 172 der 3.
Polynukleotid kodierend für das CTGF-Fragment aus Anspruch 1.