DE69936322T2

DE69936322T2 - Polyamideketten von genauer Länge und deren Konjugate mit Proteinen

Info

Publication number: DE69936322T2
Application number: DE69936322T
Authority: DE
Inventors: Keith Rose
Original assignee: Amylin Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Amylin Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1998-08-28
Filing date: 1999-08-23
Publication date: 2008-02-21
Anticipated expiration: 2019-08-24
Also published as: DE1107998T1; WO2000012587A3; ATE364654T1; US20030228274A1; KR20010085742A; ES2170042T1; DE69914611D1; CA2351739A1; CN1330675A; WO2000012587A2; US6552167B1; AU764144B2; ATE258946T1; AU5688399A; WO2000012587A8; HK1043801A1; EP1107998B1; DE69936322D1; JP2002528562A; DE69914611T2

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Polyamidketten mit genauer Länge (d. h. einer genauen Anzahl von Monomereinheiten) und Verfahren zu ihrer Herstellung. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Verfahren zum chemischen Verändern von Zielmolekülen, z. B. Makromolekülen, insbesondere biologisch wichtigen Polypeptiden, und Oberflächen (z. B. Gold oder Glas) mittels kovalenter Bindung bzw. Anlagerung von Polyamidketten mit genauer Länge. Noch genauer gesagt bezieht sich die Erfindung auf Ketten auf Polyethylenglycolbasis mit genauer Länge.
Hintergrund
Es ist bekannt, dass die Eigenschaften von zahlreichen Materialien wie Peptiden, Polypeptiden wie Proteinen, und Biokonjugaten durch Aufpfropfen von Molekülen von der Art einer organischen Kette verbessert werden können. Ein solches Pfropfen kann die Brauchbarkeit eines Materials als Linker zum Verbinden mehrerer Kopien einer Struktureinheit erhöhen, die Abschirmung eines Materials vor dem Immunsystem erhöhen und die Halbwertszeit eines Materials erhöhen. Biosensoroberflächen können ebenfalls verbessert werden, indem zuerst Moleküle von der Art einer organischen Kette auf die Oberfläche (gewöhnlich Gold oder Glas) aufgepfropft werden, bevor eine kovalente Anlagerung von Biomolekülen erfolgt, z. B. die dextranüberzogenen Sensoren, die von Biacore AB (Schweden) verkauft werden.
Die Moleküle von der Art einer organischen Kette, die häufig verwendet werden, um Eigenschaften zu verbessern, sind Ketten auf Polyethylenglycolbasis oder "PEG-Basis", d. h. Ketten, die auf der Wiederholungseinheit -CH₂CH₂O- basieren. Siehe z. B. Tsutsumi et al., Jpn. J. Cancer Res. 85:9–12 (1994), worin gezeigt wurde, dass ein Ester von Monomethoxypolyethylenglycol die Wirkungsstärke des menschlichen Tumornekrosefaktors-α erhöht. Ketten auf PEG-Basis sind flexibel, amphiphil, nicht-immunogen und nicht für eine Spaltung durch proteolytische Enzyme anfällig. Zubereitungen von Materialien, welche durch PEG oder Ketten auf PEG-Basis verändert worden sind, weisen eine verringerte Immunogenität und Antigenität auf. Siehe z. B. Abuchowski et al., Journal of Biological Chemistry 252(11): 3578–3581 (1977), worin gezeigt wurde, dass PEG die immunologischen Eigenschaften von Rinderserumalbumin ändert. PEG dient auch dazu, die Molekülgröße des Materials zu erhöhen, an das es angelagert ist, wodurch seine biologische Halbwertszeit erhöht wird. Diese günstigen Eigenschaften der PEG-veränderten Materialien machen sie in einer Reihe von therapeutischen Anwendungen sehr brauchbar.
Das Pfropfen von PEG-Ketten oder Ketten auf PEG-Basis auf Proteine ist bekannt. Siehe z. B. Zalipsky, US-Patent Nr. 5,122,614 , welches PEG beschreibt, das in sein N-Succinimidcarbonatderivat umgewandelt wird. Ebenfalls bekannt sind PEG-Ketten, die mit reaktiven Gruppen verändert sind, um das Pfropfen auf Proteine zu erleichtern. Siehe z. B. Harris, US-Patent Nr. 5,739,208 , welches ein PEG-Derivat beschreibt, das mit einer Sulfonkomponente für eine selektive Anlagerung an Thiolkomponenten auf Molekülen und Oberflächen aktiviert ist, und Harris, et al., US-Patent Nr. 5,672,662 , welches aktive Ester von PEG-Säuren offenbart, welche eine einzige Propion- oder Butansäurekomponente aufweisen. Eine ausführliche Übersicht über dieses Gebiet gibt Zalipsky, Bioconjugate Chemistry 6:150–165 (1995). Neben der Verwendung von PEG beschreibt Wright, EP 0 605 963 A2 Verknüpfungsreagenzien, welche wasserlösliche Polymere enthalten, die eine Hydrazonbindung mit einer Aldehydgruppe an einem Protein bilden.
Polyamidketten sind ebenfalls als Moleküle von der Art einer organischen Kette zum Verbessern von Eigenschaften brauchbar. Außerdem legt es ein Screening der akuten Toxizität in Nagetieren nahe, dass Polyamide weder toxisch noch immunogen sind (Hai, et al., Bioconj. Chem. 9:645–654 (1998)).
Es treten jedoch Probleme auf, da die Technologie des Standes der Technik keine Synthese von Molekülen von der Art einer organischen Kette mit einer bestimmbaren Länge bereitstellt.
Methoden, die zum Herstellen von PEG-Ketten oder Ketten auf PEG-Basis, selbst solchen mit ziemlich niedrigem Molekulargewicht wie etwa 3400 verwendet werden (siehe z. B. Kramer et al., Nature 395:710 (1998)), umfassen einen schlecht kontrollierten Polymerisationsschritt, welcher zu Zubereitungen führt, die eine Schwankungsbreite von Kettenlängen um einen Mittelwert herum aufweisen, d. h. sie umfassen Polymerzubereitungen von -(CH₂CH₂O)_m-, wobei m keinen diskreten Wert aufweist, sondern statt dessen einen Bereich von Werten um einen Mittelwert herum aufweist. Dies ist deutlich zu sehen in den Massenspektren von PEG-Ketten selbst und von Verbindungen, auf die PEG-Ketten aufgepfropft worden sind. Zum Beispiel führen in Johnson et al., Chemistry & Biology 4:939 (1997) PEG-Ketten mit einer nominellen relativen Molekülmasse 3400 und 5000, wenn sie auf ein kleines Peptid gepfropft werden, zu Produkten mit Massenbereichen von einem Mittelwert ±1000, d. h. einem Bereich von 2000 amu. Dies ist ein typisches Ergebnis der Verfahren des Standes der Technik. Wenn eine ausreichende Massenauflösung zur Verfügung steht, zeigt das Spektrum viele Signale, die voneinander einen Abstand von 44 amu aufweisen. Siehe z. B. Lu et al., Int. J. Peptide Protein Res. 43:127–138 (1994). Dieser große Massenbereich entspricht einem entsprechenden Bereich der Kettenlängen. Entsprechend sind Produkte, die solche PEG-Ketten oder Ketten auf PEG-Basis enthalten, nicht homogen und bestehen aus Molekülen, die kurze, mittlere und lange Ketten besitzen. Die Situation ist noch schlechter für Verbindungen, die zwei PEG-Ketten besitzen, da sie statistisch aus einem Gemisch aus Molekülen bestehen müssen, die zwei kurze Ketten, eine kurze und eine lange Kette und zwei lange Ketten besitzen, so dass die Varianz der Masse größer ist als für Produkte, welche nur eine Kette aufweisen. Da die Kettenlänge die Masse, die biologische Halbwertszeit; die Abschirmung vor dem Immunsystem und den Abstand der Untereinheiten beeinflusst, wenn eine solche Kette dazu verwendet wird, zwei Komponenten zu verbinden (wie in Johnson, et al., Chemistry & Biology, oben), ist die biologische Wirkung einer Verbindung, welche eine oder mehrere herkömmliche PEG-Ketten besitzt, die eines Mittelwerts der Wirkungen der einzelnen vorhandenen Spezies (solche mit kurzen Ketten, solche mit mittleren Ketten und solche mit langen Ketten) und ihrer relativen Konzentrationen (welche sich im Prinzip mit der Zeit ändern, da die biologische Halbwertszeit für eine Gruppe von ähnlichen Verbindungen eine Funktion der Masse ist). Diese komplexe Situation wird toleriert, da PEG sehr nützlich ist.
Eine Festphasenpeptidsynthese ergibt wohl-definierte Polyamide mit der Wiederholungseinheit "-NH-Y-CO-", erfordert aber geschützte Derivate und Schritte zur Entfernung der Schutzgruppen. Polyamide mit der Wiederholungseinheit -NH-Y-NH-CO-X-CO-, wie "-NH-(CH₂)₆-NH-CO-(CH₂)₄-CO-" (z.B. Nylon 66) werden durch Polymerisieren von zweiwertigen Säuren mit Diaminen hergestellt. Diese Synthese ergibt zusammen mit neueren Methoden, welche eine Lösungspolymerisation von zweiwertigen Säuren mit Diaminen umfassen, ein Produkt, das einen breiten Bereich von Kettenlängen aufweist. Die Abwesenheit von Schutzgruppen ist hauptsächlich verantwortlich für die resultierende Heterogenität der Kettenlänge in diesen Polyamiden.
Im Lichte der vielen möglichen Anwendungen von Materialien, die mit Molekülen von der Art einer organischen Kette verändert sind, besteht im Fachgebiet ein Bedarf für verbesserte Ketten zur Verwendung beim Verändern von Zielmakromolekülen oder Materialien wie Oberflächen. Entsprechend gibt es einen Bedarf für ein Verfahren zum Herstellen solcher Polymere, die jedoch eine bestimmbare Länge aufweisen, durch eine automatisierte Festphasensynthese ohne das Erfordernis von Schutzgruppen. Insbesondere besteht ein Bedarf für Ketten auf PEG-Basis mit genauer Länge (z.B. Ketten, die eine -(CH₂CH₂O)_m-Gruppe enthalten, wobei m einen einzigen Wert aufweist), sowie für Verfahren zum Konstruieren solcher Ketten. Auf diese Weise können die Nachteile beseitigt werden, die den derzeit verwendeten PEG-Ketten sowohl für medizinische als auch für nicht-medizinische Anwendungen innewohnen und beobachtet werden. Die Polyamidketten mit genauer Länge und Verfahren, die in der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden, erfüllen diese sowie auch andere Anforderungen.
Die Vorveröffentlichung WO-A-9517886 offenbart demgegenüber Polyamidzusammensetzungen heterogener Längen, die lediglich eine heterogene Natur aufweisen, da sie durch Polykondensation monomerer Einheiten erhalten wurden und zwar entweder durch Lösungs- oder Schmelz-Kondensation. Die Heterogenität wird sogar in den Beispielen und Figuren der Veröffentlichung gezeigt, in denen auf Haupt- und Neben-Reaktionsprodukte verwiesen wird, die jeweils ein "durchschnittliches" Molekulargewicht und kein genaues, eindeutiges und bestimmbares Molekulargewicht aufweisen. Bezugnahmen auf ein "durchschnittliches Molekulargewicht" und auf "Hauptreaktionsprodukte" finden sich beispielsweise auf Seite 20, Zeile 5 bis Seite 21, Zeile 7 unter Verweis auf 1, und auf Seite 23, Zeile 24 bis Seite 25, Zeile 17 unter Verweis auf die 6 und 7.
Auch die WO-A-9412220 beschreibt Polyamidzusammensetzungen, die durch Polykondensation monomerer Einheiten erhalten wurden und daher notwendigerweise heterogen sind. Auf Seite 11, Zeile 18 bis Seite 13, Zeile 14 dieser Veröffentlichung werden beispielsweise drei Verfahren beschrieben, mit denen die Molekulargewichte und der Bereich der Molekulargewichte der Bestandteile der Reaktionsmischung näherungsweise bestimmt werden können.
Im Gegensatz zu den Lehren dieser beiden Vorveröffentlichungen basiert die vorliegende Erfindung auf einem schrittweisen Aufbau der Kette aus monomeren Einheiten, durch den Polyamidzusammensetzungen erzeugt werden, die eine bestimmte Anzahl sich wiederholender Einheiten aufweisen.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Klasse von Polymeren, auf Polyamid basierenden Ketten, die eine bestimmte Anzahl sich wiederholender Monomereinheiten aufweisen (-NH-Y-NH-CO-X-CO-), welche mittels automatischer Festphasensynthese synthetisiert werden, wobei keine Notwendigkeit für Schutzgruppen besteht und wobei X und Y unabhängig voneinander in jedem Schritt verändert werden können. Dimere, verzweigte Konstrukte und multimere Moleküle, die von Phagen abgeleitete Bindungspeptide aufweisen werden mittels der Polyamidketten mit genauer Länge leicht zusammengesetzt, welche Polypeptide und Polyethylenglycol als molekulare Abstandhalter in vorteilhafter Weise ersetzten.
Die vorliegende Erfindung stellt insbesondere eine verzweigte wasser-lösliche Zusammensetzung zur Verfügung, die zwei und mehr wasserlösliche, organische, auf Polyamid basierenden Ketten umfassen, welche eine vorbestimmte Anzahl sich wiederholender Einheiten aufweisen, wobei die auf Polyamid basierende Ketten kovalent über einen multivalenten Linker an eine Gruppe gebunden sind, die aus der Gruppe bestehend aus einem Zielmolekül, einer terminalen Gruppe, einer Schutzgruppe und einer reaktiven Gruppe ausgewählt wurden, wobei die wasser-löslichen, organischen, auf Polyamid basierenden Ketten eine sich wiederholende Einheit der Formel -{NH-Y-NH-CO-X-CO}n aufweisen, in der X und Y divalente organische Radikale, ohne reaktive funktionelle Gruppen sind oder abwesend sind und gleich oder unterschiedlich sein können und sich unabhängig voneinander in jeder der sich wiederholenden Einheiten unterscheiden können; n ist eine ganze Zahl von 2 bis 100; und wobei die wasserlöslichen organischen auf Polyamid basierenden Ketten eine ausreichende Anzahl an wasserlöslichen sich wiederholenden Einheiten aufweisen, um die Zusammensetzung wasserlöslich zu machen.
Anstelle einer Vergrößerung von m in den Ketten, die eine -(CH₂CH₂O)_m-Gruppe enthalten (wodurch Heterogenität erzeugt wird, weil m groß und daher einen Bereich von Werten anstelle eines bestimmten Wertes wird), verknüpft die vorliegende Erfindung eine Reihe von monomeren Einheiten im wesentlichen über Amidbindungen, wobei die Einheiten eine -(CH₂CH₂O)_p-Gruppe enthalten, worin p ausreichend klein ist, um einen einzigen Wert und keinen Bereich darzustellen. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist, Verfahren und Verbindungen zum Verändern eines Makromoleküls (wie etwa eines Proteins, eines Peptids, einer Nukleinsäure, eines Liposoms) oder eines Materials wie einer Oberfläche unter milden Bedingungen mit einer oder mehreren Polyamidketten mit genauer Länge bereitzustellen.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Kette der Formel (III), worin n' 1 ist, durch die folgenden Schritte synthetisiert: (a) Acylieren der Amino- oder Hydroxylgruppe einer Verbindung der Formel Z-Q-Träger, wobei Z H₂N- oder HO- ist; Q ein Linker (welcher ein Aminosäurerest sein kann) oder ein Zielmolekül ist; und der Träger eine feste Phase, Matrix oder Oberfläche ist, mit einem molaren Überschuss eines Reagenzes L-CO-L', wobei L und L' Abgangsgruppen sind und gleich oder ver schieden sind; (b) Aminolysieren des Produkts von Schritt (a) mit einem molaren Überschuss eines Diamins mit der Formel NH₂-Y'-NH₂; (c) Acylieren des Produkts von Schritt (b) mit einem molaren Überschuss eines Derivats einer zweiwertigen Säure mit der Formel HOOC-X-COOH; (d) Aktivieren der freien Carboxylgruppe des Produkts von Schritt (c); (e) Aminolysieren des Produkts von Schritt (d) mit einem molaren Überschuss eines Diamins mit der Formel NH₂-Y-NH₂; und (f) gegebenenfalls Wiederholen der Schritte (c)–(e) unter Verwendung eines Derivats einer zweiwertigen Säure mit der Formel HOOC-X-COOH und eines Diamins mit der Formel NH₂-Y-NH₂, wobei die Substituenten X und Y gleich oder verschieden von den Substituenten X und Y sind, die in einem der vorangehenden Aminolysierungs- und Acylierungsschritte verwendet werden.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Kette der Formel (III), worin n' 0 ist, durch die folgenden Schritte synthetisiert: (a) Acylieren der Amino- oder Hydroxylgruppe einer Verbindung der Formel Z-Q-Träger mit einem molaren Überschuss eines Derivats einer zweiwertigen Säure mit der Formel HOOC-X-COOH, wobei Z H₂N- oder HO- ist; Q ein Linker oder ein Zielmolekül ist; der Träger eine feste Phase, Matrix oder Oberfläche ist; (b) Aktivieren der freien Carboxylgruppe des Produkts von Schritt (a); (c) Aminolysieren des Produkts von Schritt (b) mit einem molaren Überschuss eines Diamins mit der Formel NH₂-Y-NH₂; und (d) gegebenenfalls Wiederholen der Schritte (a)–(c) unter Verwendung von HOOC-X-COOH und NH₂-Y-NH₂, wobei die Substituenten X und Y gleich oder verschieden von den Substituenten X und Y sind, die in einem der vorangehenden Acylierungs- und Aminolysierungsschritte verwendet werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine wasserlösliche organische Zusammensetzung auf Polyamidbasis mit einer genauen Anzahl von Wiederholungseinheiten, wobei die Zusammensetzung die Formel (IV) aufweist: [U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}_n-{NH-Y'-NH}_n']_q-V worin: n eine ganze Zahl von 1–100 ist; n' 0 oder 1 ist; q eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist; X und Y zweiwertige organische Reste ohne reaktive funktionelle Gruppen sind oder abwesend sind und gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander mit jeder der Wiederholungseinheiten variieren können; Y ein zweiwertiger organischer Rest ohne reaktive funktionelle Gruppen ist oder abwesend ist; V ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: einem einwertigen oder mehrwertigen Zielmolekül, dessen Eigenschaften verändert oder verbessert werden und das einen wahlfreien zweiwertigen Spacer oder Linker aufweist; einer Reportergruppe mit einem mehrwertigen Linker; einer reaktiven Gruppe; und einer endständigen Gruppe mit einem mehrwertigen Linker, wobei die endständige Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -OH, -NH₂, -H und -Z-Q-Träger, wobei Z ein zweiwertiger Spacer wie etwa -NH-, -O- ist oder abwesend sein kann, Q ein Linker oder ein Zielmolekül ist, und der Träger eine feste Phase, Matrix oder Oberfläche ist; und U ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: einem Zielmolekül, dessen Eigenschaften verändert oder verbessert werden und das einen wahlfreien zweiwertigen Spacer oder Linker aufweist; einer endständigen Gruppe; einer Peptidkette; einer Schutzgruppe; einem Träger; und einer reaktiven Gruppe.
Noch ein anderer Aspekt der Erfindung ist eine wasserlösliche organische homogene Zusammensetzung auf Polyamidbasis mit einer genauen Anzahl von Wiederholungseinheiten, welche die Formel (IV) aufweist: [U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}_n-{NH-Y'-NH}_n']_q-V worin: n eine ganze Zahl von 1–100 ist; n' 0 oder 1 ist; q eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist; X und Y zweiwertige organische Re ste ohne reaktive funktionelle Gruppen sind oder abwesend sind und gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander mit jeder der Wiederholungseinheiten variieren können; Y' ein zweiwertiger organischer Rest ohne reaktive funktionelle Gruppen ist oder abwesend ist; V ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: einem Zielmolekül, welches ein Peptid mit weniger als 50 Aminosäureresten ist und einen wahlfreien zweiwertigen Spacer oder Linker aufweist; einer Reportergruppe mit einem mehrwertigen Linker; einer reaktiven Gruppe; und einer endständigen Gruppe mit einem mehrwertigen Linker, wobei die endständige Gruppe ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus -OH, -NH₂, -H und -Z-Q-Träger, wobei Z ein zweiwertiger Spacer wie etwa -NH-, -O- ist oder abwesend sein kann, Q ein Linker oder ein Zielmolekül ist, und der Träger eine feste Phase, Matrix oder Oberfläche ist; und U ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: einem Zielmolekül, welches ein Peptid mit weniger als 50 Aminosäureresten ist und einen wahlfreien zweiwertigen Spacer oder Linker aufweist; einer endständigen Gruppe; einer Peptidkette; einer Schutzgruppe; einem Träger; und einer reaktiven Gruppe, wobei mindestens eines von U oder V ein Zielmolekül ist.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt Kits, die Reagenzien enthalten, die zum Synthetisieren der wasserlöslichen organischen Ketten auf Polyamidbasis geeignet sind, und Kits, die entweder solche Reagenzien oder solche Ketten und ein Zielmolekül, dessen Eigenschaften verändert oder verbessert werden sollen und das einen wahlfreien zweiwertigen Spacer oder Linker aufweist, enthalten, bereit.
BESCHREIBUNG VON SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
In der Biochemie und Medizin werden biokompatible Molekülketten benötigt, um bindende Module an ihren Enden vorzuweisen (siehe z. B. Kramer et al., oben; Peters et al., Science 282:1439 (1998); Johnson et al., Chemistry & Biology, oben; und Terskikh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1663–1668 (1997)) sowie für andere Zwecke (Zalipsky, Bioconjugate Chemistry, oben). Idealerweise sollten diese Ketten eine definierte Struktur, d. h. Länge haben und nicht ein Gemisch aus Ketten verschiedener Längen sein. Polypeptidketten bieten eine Möglichkeit, sind aber im Prinzip anfällig für eine proteolytische Spaltung und könnten sich als immunogen erweisen. Polyethylenglycol ("PEG") bietet eine weitere Möglichkeit.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Herstellen einer neuen Klasse von biokompatiblen Polymeren bereit, welche die Vorteile sowohl von Polypeptiden (genaue Länge, bequeme Synthese) als auch von PEG (flexibel, amphiphil, nicht-immunogen, nicht anfällig für Proteasen) kombinieren und somit anstelle von herkömmlichen Polypeptid- oder PEG-Molekülspacern für synthetische und semisynthetische Konstruktionen verwendet werden können.
Durch die Verfahren dieser Erfindung ist man nicht länger auf die wenigen Standardlängen der handelsüblichen PEG-Linker beschränkt und somit kann die Länge ziemlich genau fein eingestellt werden. Dieses Verfahren verwendet auch zweckmäßigerweise im Handel erhältliche Materialien, lässt sich leicht automatisieren und vermeidet Schritte der Einführung und Entfernung von Schutzgruppen. Außerdem sind die Polyamide, die durch die Verfahren der Erfindung hergestellt werden, wie man es für Moleküle auf PEG-Basis erwartet, vollständig in Wasser und in organischen Lösungsmitteln wie Dimethylformamid, aber nicht in Diethylether löslich.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine wasserlösliche organische Kette auf Polymerbasis mit genauer Länge, die auf dem Aufbau einer genauen Anzahl von sich wiederholenden Monomereinheiten durch Bildung einer Amidbindung beruht, zusammen mit einem Verfahren zum Herstellen von solchen Ketten bereit. Es können zahlreiche organische Vorstufen in den Ketten der Erfindung verwendet werden. Für die Zwecke der Veranschaulichung und nicht der Beschränkung kann die Erfindung beschrieben werden durch Bezugnahme auf Monomere, die -CH₂CH₂O-Einheiten enthalten, und die resultierenden Produkte werden als eine Kette auf Polyethylenglycolbasis ("PEG-Basis") bezeichnet. Es versteht sich jedoch, dass die Bezugnahme in der vorliegenden Beschreibung auf Ketten "auf PEG-Basis" jegliche Kette "auf der Basis eines wasserlöslichen Polymers" bzw. "wasserlösliche Kette auf Polymerbasis" oder "wasserlösliche organische" Kette bedeuten soll. Da der Linker oder die Kette durch die Bildung einer Amidbindung aufgebaut wird, versteht es sich ferner, dass die erfindungsgemäßen Ketten auf der Basis eines wasserlöslichen Polymers auch zweckmäßigerweise als Ketten "auf der Basis eines wasserlöslichen organischen Polyamids" bzw. als "wasserlösliche organische Ketten auf Polyamidbasis" bezeichnet werden. Die Begriffe "Linker" und "Kette" werden wechselseitig austauschbar verwendet, da die Ketten dieser Erfindung zum Verbinden von Zielmolekülen miteinander und zur Anlagerung an ein einziges Zielmolekül brauchbar sind.
Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung eine wasserlösliche organische Kette auf Polyamidbasis mit genauer Länge bereit, die auf einer genauen Anzahl von Monomereinheiten beruht. Es werden sehr kurze chemische Ketten mit genauer Länge verwendet, um vorzugsweise auf einer festen Phase diese wasserlöslichen organischen Ketten auf Polyamidbasis mit genauer Länge aufzubauen. Insbesondere verwendet die Erfindung sehr kurze Ketten mit genauer Länge, um Ketten auf PEG-Basis mit genauer Länge aufzubauen. Solche kurze Ketten können von Fachleuten leicht synthetisiert werden. Außerdem sind einige dieser sehr kurzen Ketten im Handel erhältlich und wurden in Lösungssynthesen von kurzen PEG-Linkern verwendet, wie es in Wilbur et al., Bioconjugate Chemistry 8:572–584 (1997) beschrieben ist.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Verfahren zum chemischen Verändern von Zielmolekülen und Oberflächen (z. B. Gold oder Glas) mittels kovalenter Bindung bzw. Anlagerung der Ketten auf Polyamidbasis mit genauer Länge, die in der vorliegenden Beschreibung beschrieben sind. Diese Ketten sind insbesondere nützlich zum Verbessern der Eigenschaften von Zielmolekülen, zum Anlagern von zusätzlichen Molekülen (wie etwa einem Fluorophor, Metallchelator oder einer anderen Reportergruppe oder einem Arzneistoffmolekül) an ein Zielmolekül und zum Anlagern mehrerer kleinerer Zielmoleküle aneinander unter Bildung eines größeren Moleküls mit verbesserten Eigenschaften (Dimer, Trimer, Tetramer und höheres Oligomer). Diese Erfindung zieht auch die Verwendung der wasserlöslichen organischen Ketten auf Polyamidbasis zum Verändern von Oberflächen wie etwa Gold oder Glas oder Kunststoffen für Biosensoranwendungen und andere Anwendungen in Betracht.
Der Begriff "Zielmolekül" bezieht sich auf ein einwertiges oder mehrwertiges Zielmolekül, insbesondere ein Makromolekül, dessen Eigenschaften durch Anlagerung an die wasserlöslichen organischen Ketten auf Polyamidbasis mit genauer Länge, die in der vorliegenden Beschreibung beschrieben sind, verändert oder verbessert werden. Solche Zielmoleküle können organische Moleküle sein (welche Moleküle biologischer Herkunft sowie organische Moleküle mit anorganischen Komponenten einschließen), die ein Molekulargewicht von mindestens 100 und bis zu oder größer als 10000 aufweisen. Typischerweise haben solche organischen Moleküle ein Molekulargewicht von mindestens 1000, noch typischer im Bereich von ungefähr 1000–2000. Typischerweise handelt es sich bei dem Zielmolekül um ein biologisch wichtiges Protein, Polypeptide, Peptide, Aminosäuren, eine Nukleinsäure, ein Liposom oder ein therapeutisches Mittel bzw. Heilmittel. Zu beispielhaften Zielmolekülen gehören Plasmaproteine wie Fibrinogen, Immunglobuline oder Fragmente davon, Hormone wie Insulin, Cytokine wie ein Tumornekrosefaktor und Enzyme wie ein Ge webeplasminogenaktivator, die hier zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung angegeben sind. Das Zielmolekül kann aus natürlichen oder rekombinanten Ausgangsmaterialien gewonnen werden oder kann synthetisch sein wie etwa ein Fluorophor, Metallchelator oder eine andere Reportergruppe. Wenn das Zielmolekül mehrwertig ist, kann es an mehrere Ketten der Erfindung gebunden sein. Um eine weitere Verbesserung oder Veränderung eines Zielmoleküls zu gestatten, kann das Zielmolekül einen mehrwertigen Linker zwischen sich und der Kette aufweisen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ergibt die Reduktion der Polyamidketten mit LiAlH₄ oder Diboran eine neue Klasse von Polyaminen, welche die nützlichen Eigenschaften von Ethylenimin aufweisen können (siehe z. B. Ferrari et al., Gene Ther. 4:1100–1106 (1997)), während auch eine totale Kontrolle über die Struktur (Linearität, Länge, Hydrophobie, Ladungsabstand) ermöglicht wird.
Im Allgemeinen ist das Verfahren der Erfindung ein dreistufiges Festphasenverfahren, das im Handel erhältliche Diamine (oder Derivate), die hier als ein kurzes Diaminmonomer der Formel (I) gezeigt sind: NH₂-Y-NH₂ und im Handel erhältliche zweiwertige Säuren, die hier als ein kurzes Monomer einer zweiwertigen Säure der Formel (II) gezeigt sind: HOOC-X-COOH in einer Form, die aktiviert ist, um eine Acylierung zu gestatten (wie etwa das cyclische Anhydrid), die in der vorliegenden Beschreibung als "ein Derivat einer zweiwertigen Säure" bezeichnet wird, einbezieht.
Die Substituenten X und Y werden unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus zweiwertigen organischen Resten, die keine reaktiven funktionellen Gruppen aufweisen, oder sie sind nicht vorhanden. X und Y können gleich oder verschieden sein. Geeignete zweiwertige organische Reste sind nicht-reaktionsfähige Gruppen wie etwa substituierte oder unsubstituierte, verzweigte oder lineare, aliphatische oder aromatische Gruppen wie Phenyl oder C₁-C₁₀-Alkylenkomponenten, C₁-C₁₀-Alkylgruppen oder eine Kombination davon und können gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome enthalten. Zu beispielhaften zweiwertigen organischen Resten gehören Alkylgruppen wie -(CH₂)₂- und -(CH₂)₆-; und Alkylgruppen, die Heteroatome enthalten, wie -(CH₂)₃-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-, -[(CH₂)₃-O-(CH₂)₂-(CH₂)₂-O-(CH₂)₃]-, -CH₂-O-CH₂- und -CH₂-N(CH₃)-CH₂-, usw., die hier zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung angegeben sind.
So wie hier verwendet wird, bedeutet der Begriff "reaktive funktionelle Gruppe" jegliche freie Amino-, Carboxyl-, Thiol-, Alkylhalogenid-, Hydroxy- oder Aldehydgruppe, die hier zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung angegeben ist. Es ist wichtig, dass die kurzen Monomerausgangsmaterialien keine Funktionalitäten aufweisen, welche die Acylierungs-, Aktivierungs- und Aminolyseschritte der Erfindung stören, wie nachstehend ausführlich beschrieben ist. Solche reaktiven funktionellen Gruppen können jedoch an X oder Y vorhanden sein, wenn sie geschützt sind, wodurch sie reaktionsunfähig werden, z. B. kann eine geschützte Aminogruppe vorhanden sein. Zum Beispiel können die Substituenten X und Y eine Aminogruppe enthalten, die durch tert-Butyloxycarbonyl (Boc) geschützt ist. Man beachte jedoch, dass 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) als Schutzgruppe für eine Aminogruppe in X oder Y nicht gut geeignet ist, da es den Bedingungen der Aminolyse nicht widerstehen kann.
Es ist bevorzugt, dass die Monomere der Formel (I) und (II) und daher die Substituenten X und Y symmetrisch sind, da an dernfalls die Endgruppen (Amino oder Carboxyl) unterscheidbar wären und eine Heterogenität die Folge wäre. Zum Beispiel ist Bernsteinsäure (in Form ihres Anhydrids, wobei der Substituent X der Rest -CH₂CH₂- ist) symmetrisch und ergibt bei einer Acylierung nur ein Amidprodukt, HOOCCH₂CH₂CO-NH- und ist deshalb eine geeignete zweiwertige Säure. Methylbernsteinsäureanhydrid kann zwei Produkte, HOOCCH(Me)CH₂CO-NH- und HOOCCH₂CH(Me)CO-NH, ergeben und ist deshalb weniger geeignet.
Vorzugsweise ist das kurze Monomer der Formel (I) oder (II) ein Monomer für ein wasserlösliches Polymer (water soluble polymer-based monomer), so dass entweder X, Y oder beide Substituenten ein zweiwertiger organischer Rest mit genauer Länge sind, der ungefähr 1 bis 5 Polymergruppen enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform sind entweder X oder Y oder beide zweiwertige organische Reste, die ungefähr 1 bis 5 PEG (-CH₂CH₂O-)Gruppen enthalten. Die Symmetrie wird durch eine sorgfältige Auswahl der endständigen Gruppen gewahrt, z. B. wie in -CH₂CH₂CH₂(OCH₂CH₂)_pCH₂-, wobei p eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist, aber für eine bestimmte Verbindung der Formel (I) oder (II) einen diskreten Wert annimmt. Zahlreiche andere Gruppen sind für die Verwendung in der Erfindung anstelle der PEG-Gruppen geeignet. Dazu gehören Methylen, Propylenglycol und seine Oligomere (d. h. (-CH₂CH₂CH₂O-)_p), definierte Copolymere von -CH₂CH₂O- und -CH₂CH₂CH₂O-Gruppen, definierte Oligomere von Tetrahydrofuran und definierte Oligomere von Vinylpyrrolidon, die hier zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung angegeben sind.
Eines der nützlichsten kurzen symmetrischen Diamine auf PEG-Basis mit genauer Länge ist 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin (Fluka Chemicals, Buchs, Schweiz): NH₂-(CH₂)₃-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-NH₂
4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin ist ein Diaminmonomer der Formel (I), wobei Y drei Polyethylenglkolgruppen enthält (OCH₂CH₂) und die folgende symmetrische Formel aufweist: -(CH₂CH₂CH₂-O-CH₂CH₂)-O-(CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-CH₂)-
Ein wünschenswertes Charakteristikum dieses Materials ist, dass es, wie vorstehend gezeigt, mit drei PEG-Gruppen versehen ist und im Wesentlichen frei von homologen Verbindungen ist, die eine, zwei, vier oder sogar fünf PEG-Gruppen aufweisen. Dies verdeutlicht beispielhaft, was beabsichtigt ist, wenn es heißt, dass eine Monomereinheit eine "genaue Länge" aufweist. Ein Polyamid, das mit einem solchen Material hergestellt wird, wird ebenfalls eine genaue Länge aufweisen, vorausgesetzt, dass es in einer diskreten Anzahl von Schritten und nicht durch eine unkontrollierte Polymerisation mit einer zweiwertigen Säure hergestellt wird, wie es herkömmlicherweise der Fall ist. Es wird als eine Kette oder Linker auf PEG-Basis bezeichnet, wenngleich die PEG-Einheiten (-OCH₂CH₂-) in Intervallen durch Amidbindungen oder andere Gruppen unterbrochen sind.
Monomereinheiten, die 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin ähneln, aber entweder eine, zwei, vier oder sogar fünf PEG-Gruppen aufweisen, können ebenfalls leicht durch Verfahren synthetisiert werden, die im Fachgebiet wohlbekannt sind. Solche Monomere wären im Wesentlichen frei von homologen Verbindungen mit einer unterschiedlichen Anzahl von PEG-Gruppen.
Ein nicht auf PEG-basierendes Diamin mit genauer Länge, welches ebenfalls in der vorliegenden Erfindung brauchbar ist, ist ein 4,9-Dioxa-1,12-dodecandiamin der Formel: NH₂-(CH₂)₃-O(CH₂)₄-O-(CH₂)₃-NH₂ welches in Johnson et al., Bioconjugate Chemistry 8:447–452 (1997) beschrieben ist. Hier weist Y die folgende symmetrische Formel auf: -[(CH₂)₃-O-(CH₂)₂]-[(CH₂)₂-O-(CH₂)₃]-
Der gleiche Artikel veranschaulicht Beispiele von aktivierten Formen der zweiwertigen Säure-Komponente wie etwa die Anhydride von HOOC-CH₂OCH₂-COOH und HOOC-CH₂N(CH₃)CH₂-COOH.
Ein weiteres nicht auf PEG-basierendes Diamin, welches in dem Verfahren der Erfindung brauchbar ist, ist 1,6-Diaminohexan, NH₂-(CH₂)₆-NH₂ ("DAH"). Außerdem gibt es zahlreiche im Handel erhältliche zweiwertige Säuren und Diamine, von denen eine umfangreiche Liste in Hai, et al., oben, beschrieben ist, welches durch Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung aufgenommen ist. Wie nachstehend beschrieben wird, ist es möglich, durch Auswählen einer passenden zweiwertigen Säure und eines Diamins für jeden Schritt Faktoren wie die Hydrophobie entlang der Länge der Kette zu modulieren (in der vorliegenden Beschreibung unter Verwendung von Diaminen wie 1,6-Diaminohexan beschrieben), reaktive Gruppen wie etwa Oxim-bildende Gruppen an die Kettenenden zu addieren und die Kette durch Standardmethoden der Peptidsynthese zu verlängern.
Zu bevorzugten zweiwertigen Säuren der Formel (II) gehört HOOC-CH₂CH₂-COOH, die zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung angegeben ist.
Im Allgemeinen ist das Verfahren der Erfindung ein dreistufiges Festphasenverfahren, das ein Diamin der Formel (I) und ein Derivat einer zweiwertigen Säure miteinbezieht, wobei diese zweiwertige Säure die Formel (II) aufweist, die hier für den Fall eines aminohaltigen Harzes (NH₂-Harz) gezeigt ist. Dieses Verfahren erfordert nicht die Verwendung von Schutzgruppen.
Schritt 1 ist ein Acylierungsschritt, der ein Derivat einer zweiwertigen Säure verwendet: HOOC-X-COOH + NH₂-Harz → HOOC-X-CONH-Harz
Schritt 2 ist ein Aktivierungsschritt, der z. B. Carbonyldiimidazol verwendet: HOOC-X-CONH-Harz + Carbonyldiimidazol → Imidazolyl-CO-X-CO-NH-Harz
Schließlich ist Schritt 3 ein Aminolyseschritt, der ein Diamin verwendet: NH₂-Y-NH₂ + Imidazolyl-CO-X-CO-NH-Harz → NH₂-Y-NH-CO-X-CO-NH-Harz
In den bevorzugten Verfahren der Erfindung ist mindestens einer der Reste X und Y vorhanden und mehr bevorzugt sind beide vorhanden. Die Erfindung zieht jedoch die Verwendung von Verbindungen der Formeln (I) und (II) in Betracht, bei denen X, Y oder beide abwesend sein können. Ein spezieller Fall ist der der zweiwertigen Säure Kohlensäure, worin -CO- -CO-X-CO- ersetzt, die Wiederholungseinheit -NH-Y-NH-CO- wird und das Produkt dann zutreffender als Polyharnstoff bezeichnet wird, welcher eine Art von Polyamid ist. In diesem speziellen Fall werden der Acylierungsschritt und der Aktivierungsschritt zu einem einzigen Schritt kombiniert, wobei Carbonyldiimidazol verwendet wird, welches eine zweckmäßige Form einer zweifach aktivierten Kohlensäure ist: Carbonyldiimidazol + NH₂-Harz → Imidazolyl-CO-NH-Harz
Das Imidazolyl-CO-NH-Harz ist anschließend direkt bereit für eine Aminolyse unter Verwendung eines Diamins: NH₂-Y-NH₂ + Imidazolyl-CO-NH-Harz → NH₂-Y-NH-CO-NH-Harz
Wie vorstehend angegeben ist, werden Monomereinheiten der Formel (I) und (II) verwendet, um Ketten mit genauer Länge, d.h. mit einer genauen Anzahl der sich wiederholenden Monomereinheit -NH-Y-NH-CO-X-CO- aufzubauen. In einem Aspekt der Erfindung verwendet jeder Zyklus der Synthese das gleiche Diamin der Formel (I), NH₂-Y-NH₂, und die gleiche zweiwertige Säure der Formel (II), HOOC-X-COOH. Entsprechend werden in einem Aspekt der Erfindung Monomereinheiten der Formeln (I) und (II) verwendet, um wasserlösliche organische Ketten auf Polyamidbasis mit einer genauen Anzahl von Wiederholungseinheiten aufzubauen, wobei die Ketten die Formel (III) aufweisen: -(NH-Y-NH-CO-X-CO)_n-(NH-Y'-NH)_n'-, wobei: n eine ganze Zahl von 1–100 ist; n' 0 oder 1 ist; X und Y zweiwertige organische Reste ohne reaktive funktionelle Gruppen sind oder abwesend sind und gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander mit jeder der Wiederholungseinheiten variieren können; und Y' ein zweiwertiger organischer Rest ohne reaktive funktionelle Gruppen ist oder abwesend ist.
Es ist wichtig, zu beachten, dass der Substituent X, der Substituent Y oder beide Substituenten unabhängig voneinander in jedem Schritt der Synthese variiert werden können, falls dies gewünscht wird, und nicht die ganze Zeit identisch sein müssen. Es gibt mehrere Gründe zum Variieren von X und/oder Y während der Synthese des Linkers, wobei einer der wertvollsten die Fähigkeit ist, die Hydrophobie entlang der Länge des Linkers zu modulieren, wozu gehört, dass Teile wie etwa ein Ende des Linkers hydrophiler oder hydrophober gemacht werden als andere Teile. Dies wird leicht erreicht durch Verwenden von einem oder mehreren unterschiedlichen Diaminen der Formel (I), NH₂-Y-NH₂, und/oder einer oder mehreren unterschiedlichen zweiwertigen Säuren der Formel (II), HOOC-X-COOH, in aufeinanderfolgen den Zyklen der Kettensynthese, d. h. die Substituenten X und Y können unabhängig voneinander in jedem Acylierungs- und Aminolyseschritt gewählt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält mindestens einer der Substituenten X und Y ungefähr 1 bis 5 -CH₂CH₂O-Gruppen. Dies wird erreicht, indem man dafür sorgt, dass entweder Formel (I) oder (II) oder beide als Monomere auf PEG-Basis vorliegen. Auf diese Weise kann X die Formel -a-(CH₂CH₂O)_p-b- aufweisen und/oder Y kann die Formel -a'-(CH₂CH₂O)_p'-b'- aufweisen, wobei a, a', b und b' zweiwertige organische Reste ohne reaktive funktionelle Gruppen wären oder abwesend wären und gleich oder verschieden sein können. Die Substituenten a, a', b und b' werden vorzugsweise so gewählt, dass die Symmetrie der Monomereinheit, wie vorstehend beschrieben, gewahrt wird. Die ganzen Zahlen p und p' betragen ungefähr 1 bis 5, können aber Null sein. Ein bevorzugter erfindungsgemäßer Linker auf Polyamidbasis würde dann eine der folgenden Variationen der Formel (III) aufweisen: -{NH-Y-NH-CO-a-(CH₂CH₂O)_p-b-CO}_n{NH-Y'-NH}_n'-, -{NH-a'-(CH₂CH₂O)_p'-b'-NH-CO-X-CO}_n-{NH-Y'-NH }_n'-, oder -{NH-a'-(CH₂CH₂O)_p'-b'-NH-CO-a-(CH₂CH₂O)-b-CO}_n-{NH-Y'-NH}_n worin a, a', b, b', p und p' wie vorstehend definiert sind. Wenn der Linker auf Polyamidbasis für einen nicht-pharmazeutischen Zweck verwendet werden soll, können alternativ p und p' 0 sein. Es ist wichtig, zu beachten, dass a, a', b, b', p und p' unabhängig voneinander sowohl für die zweiwertige Säure-Komponente als auch für die Diaminkomponente in jedem Schritt der Synthese des Linkers variiert werden können, falls dies gewünscht wird, wie es vorstehend für Formel (III) beschrieben ist. Auf diese Weise können X, die -a-(CH₂CH₂O)_p-b-Formel, und Y, die -a'-(CH₂CH₂O)_p'-b'-Formel, in zahlreichen Kombinationen entlang der Länge des Linkers der Erfindung erscheinen. Ein Grund zum Einführen einer solchen Variation ist, eine Variation der Hydrophobie und Hydrophilie entlang der Länge des Linkers zu bewirken; ein anderer Grund könnte sein, eine geladene Gruppe einzuführen, wobei z. B. X -CH₂N(CH₃)CH₂- ist.
Die folgenden Ketten mit genauer Länge veranschaulichen die Erfindung und sollen in keiner Weise beschränkend sein. Eine besonders bevorzugte Kette der Erfindung ist eine Kette auf PEG-Basis der Formel (III), wobei Y -a'-(CH₂CH₂O)_p'-b'- ist, wobei a'-CH₂- ist, b'-(CH₂)₃- ist und p' 3 ist, n' 0 ist und X-(CH₂)₂- ist: -{NH-CH₂-(CH₂CH₂O)₃-(CH₂)₃-NH-CO-(CH₂)₂-CO}_n welche auch folgendermaßen geschrieben werden kann: -{NH-(CH₂)₃-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-NH-CO-(CH₂)₂-CO}₃-
Diese Kette kann auch als eine -('PEG'-succ)_n-Kette bezeichnet werden, wobei 'PEG' die Formel -NH-(CH₂)₃-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-NH- bedeutet und succ die Formel -CO-(CH₂)₂-CO- bedeutet. Zu Beispielen für solche Ketten gehören -('PEG'-succ)₃- und -('PEG'-succ)₈-.
Die -('PEG'-succ)_n-Kette ist auch beispielhaft für solche Ketten der Erfindung, bei denen die Substituenten X und Y in jeder sich wiederholenden Monomereinheit die gleichen bleiben. Zu weiteren solchen Ketten gehören beispielsweise -('PEG'-succ)_n-'PEG'-, wie etwa -('PEG'-succ)₁₆-'PEG'-; und -('DAH'-succ)_n-, wobei 'DAH' die folgende Formel bedeutet -NH-(CH₂)₆-NH-.
Zu Beispielen für solche Ketten der Erfindung, bei denen die Substituenten X und Y hinsichtlich der sich wiederholenden Monomereinheiten variieren, gehören beispielsweise -('DAH'-succ-'PEG'-succ)_n- und -('DAH'-succ-'PEG'-succ)_z-'DAH'-succ-'PEG'-, wobei z eine ganze Zahl von 1–49 ist. Wenngleich es zwei Substituenten Y gibt, die in diesen Beispielen verwendet werden, versteht es sich, dass mehr als zwei unterschiedliche Substituenten Y in den Ketten der Erfindung verwendet werden können. Außerdem bleibt in diesen Beispielen X gleich; es versteht sich jedoch, dass X genauso variieren kann, wie es für den Substituenten Y veranschaulicht ist.
Die Polyamidketten der Formel (III) können leicht als eine zentrale Wiederholungseinheit -(NH-Y-NH-CO-X-CO)- in eine wasserlösliche organische Zusammensetzung auf Polyamidbasis oder ein solches Material, d. h. ein "Produkt" eingebaut werden. Entsprechend kann in einer Ausführungsform der Erfindung ein einziger Substituent V oder U (wie nachstehend definiert) durch die Anlagerung von einer oder mehreren Ketten der Erfindung verändert oder verbessert werden. Eine solche wasserlösliche organische Zusammensetzung auf Polyamidbasis mit einer genauen Anzahl von Wiederholungseinheiten weist die Formel (IV) auf: [U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}_n-{NH-Y'-NH)_n']_q-V worin: n eine ganze Zahl von 1–100 ist; n' 0 oder 1 ist; q eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist; X und Y zweiwertige organische Reste ohne reaktive funktionelle Gruppen sind oder abwesend sind und gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander mit jeder der Wiederholungseinheiten variieren können; Y' ein zweiwertiger organischer Rest ohne funktionelle Gruppen ist oder abwesend ist; V ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: einem einwertigen oder mehrwertigen Zielmolekül, dessen Eigenschaften verändert oder verbessert werden und das einen wahl freien zweiwertigen Spacer oder Linker aufweist; einer Reportergruppe mit einem mehrwertigen Linker; einer reaktiven Gruppe; und einer endständigen. Gruppe mit einem mehrwertigen Linker, wobei die endständige Gruppe ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus -OH, -NH₂, -H und -Z-Q-Träger, wobei Z ein zweiwertiger Spacer wie -NH-, -O- ist oder abwesend sein kann, Q ein Linker oder ein Zielmolekül ist und der Träger eine feste Phase, Matrix oder Oberfläche ist; und U ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem Zielmolekül, dessen Eigenschaften verändert oder verbessert werden und das einen wahlfreien zweiwertigen. Spacer oder Linker aufweist; einer endständigen Gruppe; einer Peptidkette; einer Schutzgruppe; einem Träger; und einer reaktiven Gruppe. Wie vorstehend angemerkt wurde, können die Substituenten X und Y während der Synthese der Kette variiert werden.
In ihrer einfachsten Form umfasst die Zusammensetzung der Formel (IV), worin q 1 ist, eine Gruppe U und V, die durch eine Kette der Erfindung verbunden sind: U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}_n-{NH-Y'-NH}_n'-V
Es versteht sich, dass die vorliegende Erfindung Ketten und Verfahren zu ihrer Synthese beschreibt, wogegen die Gruppen U und V lediglich beispielhaft beschrieben werden und nicht in irgendeiner Weise beschränkend sein sollen. V kann ein einwertiges oder mehrwertiges Zielmolekül sein, dessen Eigenschaften verändert oder verbessert werden, und kann einen wahlfreien zweiwertigen Spacer oder Linker wie etwa einen Oximlinker aufweisen. V kann auch eine Reportergruppe wie etwa ein Fluorophor oder Metallchelator mit einem mehrwertigen Linker sein. So wie er hier verwendet wird, soll der Begriff "mehrwertig" bedeuten, dass er eine Wertigkeit größer als Eins aufweist, und schließt den Begriff "zweiwertig" ein.
V kann außerdem eine reaktive Gruppe sein, wie sie im Fachgebiet wohlbekannt ist, z. B. reaktive Gruppen, die sich für die Vernetzung von Polymeren oder die Konjugation von Biomolekülen eignen. Zu Beispielen gehören Bromacetyl, Aminoacyl wie Tyr- oder Ser-, Aminooxyacetyl, Glyoxylyl, Mercaptoacetyl, Mercaptopropionyl, welche zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung angegeben sind. Außerdem werden zahlreiche Gruppen, die für die Konjugation von Biomolekülen brauchbar sind, in Bioconjugate Techniques, Hermanson, G. T, Academic Press, San Diego, 1996 erörtert.
V kann auch eine endständige Gruppe mit einem mehrwertigen Linker sein, wobei die endständige Gruppe ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus -OH, -NH₂, -H und -Z-Q-Träger, wobei Z ein zweiwertiger Spacer wie -NH-, -O- ist oder abwesend sein kann, Q ein Linker oder ein Zielmolekül ist und der Träger eine feste Phase, Matrix oder Oberfläche ist, wie etwa natürliche und synthetische Harze; Zellen und Membranen; Siliciumchips; Sensorchips, Gold, Glas, Kunststoff und andere Biosensoroberflächen; und Gewebekulturplatten, welche nur zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung angegeben sind.
Zu Beispielen für geeignete bivalente und zweiwertige organische Reste als Substituent "Q" oder den Spacer/Linker, der an das Zielmolekül gebunden ist, gehören der Sasrin-Linker -CH₂(C₆H₃(OCH₃))-O-CH₂-, -C(O)O-CH₂(C₆H₃(OCH₃))-O-CH₂-, ein Aminooxyacetyl (NH₂OCH₂CO-) Linker, -COCH₂ON=CH-CO-, -CH=NOCH₂CO- usw., wobei diese zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung angegeben sind.
Wie vorstehend angemerkt wurde, kann der Substituent Q ein Zielmolekül sein. Typischerweise ist dies der Fall, wenn das Zielmolekül ein Peptid ist, welches unter Verwendung der wohlbekannten Festphasenmethoden synthetisiert worden ist, und es bildet einen Teil des Z-Q-Trägerreagenzes, das bei der Synthese des Linkers verwendet wurde. Die endständige Gruppe kann eine reaktive Gruppe (wie etwa ein Alkylthiol) enthalten, über welches ein Zielmolekül gekuppelt wird. Diese reaktive Gruppe ist geschützt (oder durch orthogonale Schutzgruppen/Schutzgruppenentfernungsstrategien nach dem Aufbau des Linkers auf PEG-Basis angelagert). Orthogonale Schutzgruppenstrategien sind im Fachgebiet wohlbekannt. Siehe Methods in Enzymology Bd. 289. In einer bevorzugten Ausführungsform ist V ein einwertiges oder mehrwertiges Zielmolekül, z. B. ein Makromolekül, oder eine feste Phase oder Matrix, deren Eigenschaften durch den Linker der Erfindung verändert oder verbessert werden.
U wird ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: einem Zielmolekül, dessen Eigenschaften verändert oder verbessert werden und das einen wahlfreien zweiwertigen Spacer oder Linker wie etwa einen Oximlinker aufweist; einer endständigen Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus H-, HC(O)CO-, NH₂OCH₂CO-, und einer aliphatischen Acylgruppe; einer Peptidkette, welche eine einzelne Peptidkette oder eine Polypeptidkette einschließt; einer Schutzgruppe wie Boc oder Fmoc; einem Träger wie etwa einer festen Phase oder Matrix; und einer reaktiven Gruppe wie sie vorstehend beschrieben ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist mindestens einer von U oder V ein Zielmolekül, dessen Eigenschaften durch Bindung an die Linker auf Polyamidbasis mit genauer Länge verändert oder verbessert werden. Solche "Zielmoleküle", wie sie vorstehend definiert sind, sind organische Moleküle, welche vorzugsweise biologisch wichtige Proteine, Polypeptide, Peptide, Nukleinsäuren, Liposomen oder therapeutische Mittel sind. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist mindestens einer von U oder V ein Zielmolekül, weiches ein Peptid mit weniger als 50 Aminosäureresten ist und einen wahlfreien zweiwertigen Spacer oder Linker aufweist.
Die folgenden Zusammensetzungen veranschaulichen die Erfindung und sollen in keiner Weise beschränkend sein. Zu beispielhaften Zusammensetzungen der Formel (IV) gehören:
H-('PEG'-succ)_n-'PEG'-H, worin U und V endständige Wasserstoffgruppen sind und n z. B. 7 ist;
H-Ser-('PEG'-succ)_n-'PEG'-Ser-H, worin U und V Aminosäuren sind und n z. B. 16 ist;
(Peptid)-oxim-('PEG'-succ)_n-'PEG'-oxim-(peptid), worin U und V Peptide mit einem Oximlinker sind, z. B. erythropoietinmimetische Peptide ("EMP") mit -COCH₂ON=CH-CO-Linkern, wie etwa
Amid-GRLPQCVWTMPGMHCAYLGG -COCH₂ON=CHC(O)-('PEG'-succ)_n-'PEG'-C(O)CH=NOCH₂CO--GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-Amid (SEQ ID NO: 1),
und n ist z.B. 12 oder 16; H-('PEG'-succ)_n-Leu-PAM-Harz, wobei U H ist, und V -Z-Q-Träger ist, wobei Z abwesend ist, Q ein Aminosäurerest (Leu) ist und der Träger PAM-Harz ist;
H-Tyr-('PEG'-succ)n₃-Leu-OH,
wobei U eine Aminoacylgruppe (Tyr-) ist, V ein Aminosäurerest (Leu) ist, n z. B. 3 ist;
Peptid-Lys (NH₂OCH₂CO-('PEG'-succ)_n)-NH₂, wobei U eine Aminooxyacetylgruppe (NH₂OCH₂CO-) ist und V ein Zielpeptid-molekül ist, mit einem Linker, -Lys-Amid, z.B. H-Ser-Val-Trp-Arg-Trp-Leu-Pro-Tyr-Asp-Lys-Tyr-Glu-Lys(NH₂OCH₂CO-('PEG'-succ)₈)-NH₂ (SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 3 plus Lysin als Teil des Linkers), und n z. B. 8 ist;
H-Ser-('PEG'-succ)_n-Abu-OH, wobei U eine Aminoacylgruppe (Ser-) ist, V das Zielmolekül Aminobuttersäure ist und n z.B. 8 ist;
H-('DAH'-succ-'PEG'-succ)_n-'DAH'-succ-'PEG'-H,
wobei U und V beide endständige Wasserstoffgruppen sind und n z. B. 3 ist;
Peptid-('PEG'-succ)_n-Lys(AoA)-amid (SEQ ID NO: 6),
wobei AoA Aminooxyacetyl ist und n z. B. 8 ist. Das Zielmolekül kann z. B. -ADGACRNPWC- (SEQ ID NO: 6) sein; und Wie vorstehend gezeigt ist, können die Ketten der Erfindung verwendet werden, um zahlreiche Zielpeptide, insbesondere Peptide mit weniger als 50 Aminosäureresten, die geeignete endständige Gruppen aufweisen, wie etwa -GGLYACHMGPMTWVCQPLRG- (SEQ ID NO: 1); -SVWRWLPYDKYE- (SEQ ID NO: 3); und -ADGACRNPWC- (SEQ ID NO: 6), die zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung angegeben sind, zu verändern, um homogene Zusammensetzungen bereitzustellen.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können auch verschiedene Ketten zum Bilden einer verzweigten Struktur verwenden. Zum Beispiel ist eine beispielhafte Zusammensetzung eine verzweigte Zusammensetzung der Formel (IV), worin U eine Aminoacylgruppe (Ser-) ist und V ein mehrwertiges Zielmolekül Lys₂Lys-NHCH₂CH₂SH ist. Zuerst wurde ein Lysin-"Baum" synthetisiert, der vier freie Aminogruppen aufweist. Vier Zyklen erzeugten vier Linker der Formel H-Ser-('PEG'-succ)₄-, wobei jeder Linker an eine der vier freien Aminogruppen gebunden ist: (H-Ser-('PEG'-succ)₄)₄Lys₂Lys-NHCH₂CH₂SH.
Ein weiteres Beispiel für eine verzweigte Zusammensetzung ist eine homogene verzweigte Zusammensetzung der Formel (IV), worin U ein Peptid mit einem Oximlinker ist und V eine Aminosäure (Lys) ist: (Peptid)-oxim-('PEG'-succ)_n-Lys((peptid)-oxim-('PEG'-succ)_n)amid, wobei ein beispielhaftes Peptid -GGLYACHMGPMTWVCQPLRG- (SEQ ID NO: 1) ist und n z. B. 2 ist.
Noch ein weiteres Beispiel für eine verzweigte Zusammensetzung ist eine homogene verzweigte Zusammensetzung der Formel [Peptid-('PEG'-succ)_n-Lys(oxim)amid]_qLys₂Lys-NHCH₂CH₂S-CH₂C(O)NH-Reportergruppe, wobei U ein Zielpeptid ist und V eine Reportergruppe mit einem mehrwertigen Linker -Lys(AoA)amid-Lys₂Lys-NHCH₂CH₂S-CH₂C(O)NH-, z. B. [Peptid-('PEG'-succ)₈-Lys(oxim)amid]₄Lys₂Lys-NHCH₂CH₂S-CH₂C(O)NH-fluorescein ist, wobei es vier Kopien des Zielpeptidmoleküls gibt, z. B. -ADGACRNPWC- (SEQ ID NO: 6).
Die Polyamidketten mit genauer Länge der Formel (III), worin n' 0 ist, werden leicht durch eine dreistufige Synthese synthetisiert, die in Schema 1-A gezeigt ist, welche einen Acylierungsschritt, einen Aktivierungsschritt und einen Aminolyseschritt umfasst. Es können Standardmethoden der Festphasensynthese (Fields, Hrsg., Solid Phase peptide synthesis, Meth. Enzymol. 289) sowohl mit einem geeignet programmierten ABI 430A-Gerät als auch mit einer selbst gebauten Maschine verwendet werden. Die Reaktionen können auch ziemlich leicht manuell durchgeführt werden, wenngleich dies zeitraubender und weniger bequem ist. In dem speziellen Fall der zweiwertigen Säure Kohlensäure finden die Acylierungs- und Aktivierungsschritte zusammen statt, wie vorstehend erläutert wurde.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird eine wasserlösliche organische Kette auf Polyamidbasis mit einer genauen Anzahl von Wiederholungseinheiten und mit der Formel (III), worin n' 1 ist: -{NH-Y-NH-CO-X-CO}_n-{NH-Y'-NH} worin: n eine ganze Zahl von 1–100 ist; X und Y zweiwertige organische Reste ohne reaktive funktionelle Gruppen sind oder abwesend sind und gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander mit jeder der Wiederholungseinheiten variieren können; und Y' ein zweiwertiger organischer Rest ohne reaktive funktionelle Gruppen ist oder abwesend ist; durch ein Verfahren synthetisiert, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Acylieren der Amino- oder Hydroxylgruppe einer Verbindung der Formel Z-Q-Träger, wobei Z H₂N- oder HO- ist; Q ein Linker oder ein Zielmolekül ist; und der Träger eine feste Phase, Matrix oder Oberfläche ist, mit einem molaren Überschuss eines Reagenzes L-CO-L', wobei L und L' Abgangsgruppen sind und gleich oder verschieden sind; (b) Aminolysieren des Produkts von Schritt (a) mit einem molaren Überschuss eines Diamins mit der Formel NH₂-Y'-NH₂; (c) Acylieren des Produkts von Schritt (b) mit einem molaren Überschuss eines Derivats einer zweiwertigen Säure mit der Formel HOOC-X-COOH; (d) Aktivieren der freien Carboxylgruppe des Produkts von Schritt (c); (e) Aminolysieren des Produkts von Schritt (d) mit einem molaren Überschuss eines Diamins mit der Formel NH₂-Y-NH₂; und (f) gegebenenfalls Wiederholen der Schritte (c)–(e) unter Verwendung eines Derivats einer zweiwertigen Säure mit der Formel HOOC-X-COOH und eines Diamins mit der Formel NH₂-Y-NH₂, wobei die Substituenten X und Y gleich oder verschieden von den Substituenten X und Y sind, die in einem der vorangehenden Aminolysierungs- und Acylierungsschritte verwendet werden.
Dieses Verfahren umfasst, dass man den Linker an den Träger gebunden sein lässt, z. B. zum Verpacken mit einem geeigneten Träger in einem Kit für die nachfolgende Anlagerung an ein Zielmolekül. Das Verfahren umfasst jedoch auch, dass Q ein Linker ist, der eine spaltbare Komponente enthält, oder ein Zielmolekül ist, das durch einen Linker, der eine spaltbare Komponente enthält, an den Träger gebunden ist, und das Verfahren umfasst außerdem den Schritt des Spaltens der spaltbaren Komponente, um die wasserlösliche organische Kette auf Polyamidbasis mit genauer Länge von dem Träger abzulösen.
So wie er hier verwendet wird, soll der Begriff "spaltbare Komponente" eine Komponente bedeuten, welche selektiv gespalten werden kann, um den Linker auf Polyamidbasis oder das Zielmolekül von der festen Phase abzulösen. Die spaltbare Komponente muss im Stande sein, einer Spaltung unter Bedingungen zu widerstehen, die für die Acylierungs-, Aktivierungs- und Aminolyseschritte der Erfindung geeignet sind. Solche spaltbaren Komponenten sind Fachleuten wohlbekannt.
Die wahlfreien Wiederholungsschritte können zweiwertige Säuren und Diamin verwenden, bei denen die Substituenten X und Y nicht variieren, wobei somit eine Kette aus identischen Wiederholungseinheiten wie etwa: ... -{NH-Y¹-NH-CO-X¹-CO}-{NH-Y¹-NH-CO-X¹-CO}-{NH-Y¹-NH-CO-X¹-CO}- ... erzeugt wird. Wenn jedoch mindestens eine zweiwertige Säure oder mindestens ein Diamin verwendet wird, die bzw. das einen Substituenten Y oder X aufweist, der von den in dem vorangehenden Aminolyse- oder Acylierungsschritt verwendeten Substituenten verschieden ist, erhält man eine Kette, in der die Wiederholungseinheiten variieren, wie etwa ... -{NH-Y¹-NH-CO-X¹-CO}-{NH-Y¹-NH-CO-X²-CO}-{NH-Y²-NH-CO-X²-CO}-{NH-Y²-NH-CO-X³-CO}- ...
Ein bevorzugtes Verfahren der Erfindung ist nachstehend als Schema 1-A dargestellt.
Schema 1-A
Acylierungsschritt
Es wird ein für die Festphasenpeptidsynthese geeignetes Harz verwendet, z. B. Z-Q-Träger, wobei Z NH₂- oder HO- ist und Q wie das vorstehend angegebene Q definiert ist, aber typischerweise ein zweiwertiger organischer Rest ist. Eine akti vierte Form des Derivats der zweiwertigen Säure der Formel (II), HOOC-X-COOH, wird zum Acylieren der Aminogruppen (oder der Hydroxylgruppe), die an den Träger gebunden sind, verwendet. Das cyclische Anhydrid der zweiwertigen Säure Bernsteinsäure, HOOC-CH₂-CH₂-COOH, Formel (II), worin X -CH₂-CH₂- ist, eignet sich besonders gut zur Verwendung in dem Acylierungsschritt. Falls ein cyclisches Anhydrid verwendet wird: NH₂-Q-Träger + cyclisches Anhydrid → HOOC-X-CO-NH-Q-Träger oder HO-Q-Träger + cyclisches Anhydrid → HOOC-X-CO-O-Q-Träger
In einem typischen Acylierungsschritt der Erfindung wird das Harz zunächst in einem geeigneten Lösungsmittel quellen gelassen, dann mit einem Überschuss der aktivierten Form der zweiwertigen Säure (welche in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst ist) durch Vermischen mittels eines Vortex bei Raumtemperatur acyliert. Eine Base wie N,N-Diisopropylethylamin ("DIEA") oder 4-Dimethylaminopyridin ("DMAP") und Additive wie N-Hydroxybenzotriazol ("HOBT") werden gewöhnlich zugegeben, um die Acylierung zu unterstützen, und zwar gemäß Methoden, die Fachleuten auf dem Gebiet der Peptidsynthese bekannt sind (Methods in Enzymology, Bd. 289). Wenn ein Hydroxyharz (z. B. das Sasrinharz von Bachem, Schweiz) acyliert wird, ist DMAP vorzugsweise vorhanden und die Acylierung wird ein zweites Mal wiederholt, um die Acylierung bis zur Vollständigkeit voranzutreiben. Wenn ein Aminoharz acyliert wird (NH₂-Q-Träger), wird empfohlen, dass der Kaiser-Test (Kaiser et al., Analyt. Biochem. 84:595 (1970) oder Methods in Enzymology, Bd. 289, S. 54) durchgeführt wird, um zu überprüfen, dass die Acylierung vollständig ist, bevor mit dem Aktivierungsschritt weitergemacht wird. Ein Überschuss des Acylierungsreagenzes wird verwendet, um die Reaktion bis zur Vollständigkeit voranzutreiben, andern falls würden sich nach mehreren Zyklen Ketten ansammeln, denen eine Anzahl von Wiederholungseinheiten fehlt, wie es bei der Festphasenpeptidsynthese der Fall ist.
Zum Beispiel wird ein Aminoharz wie Boc-Leu-Pam-Harz (0,5 g, ungefähr 0,3 mmol) in Dimethylformamid ("DMF") quellen gelassen und die Schutzgruppe entfernt, so dass H-Leu-Pam-Harz erhalten wird. Das Harz wird dann mit 4 mmol Bernsteinsäureanhydrid ("SA") durch Vermischen mittels eines Vortex bei Raumtemperatur 10 bis 30 Minuten lang acyliert. SA wird in 8 ml DMF (Burdick and Jackson High Purity grade) gelöst, welches eine Konzentration von 0,5 M HOBT aufweist und zu dem 400 μl DIEA zugegeben werden. Nach dem Abtropfenlassen und Waschen des Harzes mit DMF wird der Kaiser-Ninhydrintest durchgeführt, um zu bestätigen, dass die Acylierung vollständig ist. Falls dies nicht der Fall ist, wird der Acylierungsschritt wiederholt.
Wenn ein nacktes Harz verwendet wird (z. B. Sasrin, Bachern), kann 0,5 M DMAP anstelle des HOBT verwendet werden, mit einer Kupplungszeit in der Größenordnung von 30 Minuten (gegenüber 10 Minuten, wenn ein Aminoharz verwendet wird), und der Kupplungsschritt wird einmal wiederholt.
Aktivierungsschritt
Der Aktivierungsschritt umfasst die Aktivierung der freien Carboxylgruppe, d. h. die Aktivierung der Säuregruppe, die nicht an die Kette gebunden ist. Dieser Aktivierungsschritt ist notwendig, wenn ein cyclisches Anhydrid in dem Acylierungsschritt verwendet wird, da die nicht an die Kette gebundene Carboxylgruppe eine freie Carboxylgruppe ist (der Fall, wo eine doppelt aktivierte zweiwertige Säure für den Acylierungsschritt verwendet wird, wird in Schema 11 erörtert). Die Aktivierung lagert eine Abgangsgruppe an die freie Carboxylgruppe an: HOOC-X-CO-NH-Q-Träger + Reagenz → L-CO-X-CO-NH-Q-Träger oder HOOC-X-CO-O-Q-Träger + Reagenz → L-CO-X-CO-O-Q-Träger
Die in diesem Aktivierungsschritt verwendeten Reagenzien sind solche, die im Fachgebiet bekannt sind (Methods in Enzymology Bd. 289 und darin angegebene Literaturstellen), welche eine Abgangsgruppe "L" an die freie Carboxylgruppe anlagern. Es ist bevorzugt, einen Überschuss des Aktivierungsmittels einzusetzen, um im Wesentlichen alle Carboxylgruppen zu aktivieren und somit die Ansammlung von Ketten zu vermeiden, denen eine Anzahl von Wiederholungseinheiten fehlt. Geeignete Reagenzien sind solche, welche ohne Nebenreaktionen in einem Überschuss verwendet werden können und zu ihnen gehören Carbonyldiimidazol ("CDI", welches ein gemischtes Anhydrid Imidazolyl-CO-O-CO-X- usw. oder ein Acylimidazol Imidazolyl-CO-X- usw. erzeugt) und Disuccinimidylcarbonat (welches einen Hydroxysuccinimidylester erzeugt). Aktivierungsmittel wie O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat ("HATU") können ebenfalls erfolgreich verwendet werden und werden in einem nur geringfügigen Überschuss über die freien Carboxylgruppen eingesetzt.
In einem typischen Aktivierungsschritt der Erfindung wird nach dem Abtropfenlassen und Waschen des Harzes mit einem geeigneten Lösungsmittel die freie Carboxylgruppe mit einem Aktivierungsreagenz wie CDI aktiviert, wobei man Vorsicht walten lässt, um sicherzustellen, dass das CDI zweckmäßig gelagert wird, da es gegenüber Feuchtigkeit empfindlich ist. Zum Beispiel wird nach dem Abtropfenlassen und Waschen des Harzes mit DMF die freie Carboxylgruppe mit 8 mmol CDI (Fluka) in 8 ml DMF 30 Minuten lang mit Vermischen mittels eines Vortex aktiviert.
Tatsächlich kann die Aktivierung mit CDI als ein zweistufiges Verfahren angesehen werden, bei dem die Aktivierung der Carbonsäure mit CDI zunächst ein Imidazolylanhydrid bildet (wobei "im" ein Imidazolrest oder Imidazolyl ist): HOOC-X-CO-NH-Q-Träger + im-CO-im → im-CO-O-CO-X-CO-NH-Q-Träger
Dieses Anhydrid kann dann mit verdrängten Imidazolmolekülen reagieren, wobei: im-CO-X-CO-NH-Q-Träger erhalten wird, welches in dem Aminolyseschritt aminolysiert wird unter Erhalt von: NH₂-Y-NH-CO-X-CO-NH-Q-Träger oder das Anhydrid kann direkt aminolysiert werden, wobei das gleiche Produkt erhalten wird: NH₂-Y-NH-CO-X-CO-NH-Q-Träger
Auf beiden Wegen wird das gewünschte Produkt gebildet. Siehe Aslam, et al., Bioconjugation, Seite 387 (Macmillan Reference, 1998).
Aminolyseschritt
Der Aminolyseschritt umfasst die Addition eines Diamins der Formel (I), NH₂-Y-NH₂ mit homogener Länge: NH₂-Y-NH₂ + L-CO-X-CO-NH-Q-Träger → NH₂-Y-NH-CO-X-CO-NH-Q-Träger oder NH₂-Y-NH₂ + L-CO-X-CO-O-Q-Träger → NH₂-Y-NH-CO-X-CO-O-Q-Träger
In einem typischen Aminolyseschritt der Erfindung wird nach dem Abtropfenlassen und Waschen mit einem geeigneten Lösungsmittel, das harzgebundene Material mit einem großen Überschuss eines Diamins der Formel (I) aminolysiert. Nach gründlichem Waschen zeigt der Kaiser-Ninhydrintest die charakteristische blaue Farbe und das Aminoharz ist für den nächsten Acylierungs/Aktivierungs/Aminolyse-Zyklus bereit. Das Diamin 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin eignet sich besonders gut zur Verwendung in dem Aminolyseschritt.
Zum Beispiel wird nach einem kurzen Abtropfen lassen und Waschen mit DMF das harzgebundene Imidazolid mit einem Diamin auf PEG-Basis (z. B. 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin, Fluka, 4 ml Diamin vorvermischt mit 4 ml DMF, welches eine Konzentration von 0,5 M HOBT aufweist) 30 bis 60 Minuten lang mit Vermischen mittels eines Vortex aminolysiert. Nach einem gründlichen Waschen mit DMF zeigt der Kaiser-Test die charakteristische blaue Farbe und das Aminoharz ist für den nächsten Acylierungs/Aktivierungs/Aminolyse-Zyklus bereit, d. h., nach dem Waschen wird die Aminogruppe erneut mit SA acyliert, um die Kette zu verlängern, usw. Es ist wichtig, zu beachten, dass einige hydrophobe Diamine, wie etwa 1,6-Diaminohexan, die Verwendung von N-Methylpyrrolidon anstelle von DMF in allen drei Schritten (Acylierung, Aktivierung und Aminolyse) erfordern können.
Die Acylierungs-, Aktivierungs- und Aminolyseschritte können somit einmal wiederholt werden, um eine zweite -NH-Y-NH-CO-X-CO-Einheit zu addieren, wobei (NH₂-Y-NH-CO-X-CO)-(NH-Y-NH-CO-X-CO)-NH-Q-Träger oder (NH₂-Y-NH-CO-X-CO)-(NH-Y-NH-CO-X-CO)-O-Q-Träger erhalten wird, usw. Ein Zyklus der Acylierungs-, Aktivierungs- und Aminolyseschritte ergibt (NH₂-Y-NH-CO-X-CO)-Z-Q-Träger. Mehrere Wiederholungszyklen der Acylierungs-, Aktivierungs- und Aminolyseschritte ergeben eine Kette der Formel (III), -(NH-Y-NH-CO-X-CO)_n- (worin n' 0 ist) oder ein Produkt der Formel (IV), [U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}_n]_q-V, worin z. B. U H ist und V-Z-Q-Träger ist, n' 0 ist und n die Anzahl der Wiederholungszyklen ist. Wenn der Zyklus der Acylierung, Aktivierung und Aminolyse zweimal unter Verwendung von Bernsteinsäureanhydrid und 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin durchgeführt wird, ergibt die Synthese z. B. einen beispielhaften Linkerauf PEG-Basis: -(NH-CH₂-(CH₂CH₂O)₃-(CH₂)₃-NH-CO-(CH₂)₂-CO)₂- oder das Produkt: U-(NH-CH₂-(CH₂CH₂O)₃-(CH₂)₃-NH-CO-(CH₂)₃-CO)₂-V worin U H ist und V -Z-Q-Träger ist.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird eine wasserlösliche organische Kette auf Polyamidbasis mit einer genauen Anzahl von Wiederholungseinheiten und mit der Formel (III), wobei n' 0 ist: -{NH-Y-NH-CO-X-CO}_n wobei: n eine ganze Zahl von 1–100 ist; X und Y zweiwertige organische Reste ohne reaktive funktionelle Gruppen sind oder abwesend sind und gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander mit jeder der Wiederholungseinheiten variieren können; durch ein Verfahren synthetisiert, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Acylieren der Amino- oder Hydroxylgruppe einer Verbindung der Formel Z-Q-Träger mit einem molaren Überschuss eines Derivats einer zweiwertigen Säure mit der Formel HOOC-X-COOH, wobei Z H₂N- oder HO- ist; Q ein Linker oder ein Zielmolekül ist; der Träger eine feste Phase, Matrix oder Oberfläche ist; (b) Aktivieren der freien Carboxylgruppe des Produkts von Schritt (a); (c) Aminolysieren des Produkts von Schritt (b) mit einem molaren Überschuss eines Diamins mit der Formel NH₂-Y-NH₂; und (d) gegebenenfalls Wiederholen der Schritte (a)–(c) unter Verwendung von HOOC-X-COOH und NH₂-Y-NH₂, wobei die Substituenten X und Y gleich oder verschieden von den Substituenten X und Y sind, die in einem der vorangehenden Acylierungs- und Aminolysierungsschritte verwendet werden.
Wie vorstehend angemerkt, umfasst dieses Verfahren auch, dass man den Linker an den Träger gebunden sein lässt oder ihn von dem Träger mittels einer spaltbaren Komponente spaltet, die als der Linker Q oder in dem Linker, welcher das Zielmolekül Q an den Träger bindet, vorhanden ist. Ferner zieht dieses Verfahren auch in Betracht, die gleichen oder verschiedene Substituenten X und Y während der Schritte der Synthese zu verwenden.
Ein weiteres bevorzugtes Verfahren der Erfindung ist nachstehend als Schema 1-B dargestellt, welches eine Abwandlung von Schema 1-A ist, worin der Acylierungsschritt in dem ersten Zyklus weggelassen wurde, aber in nachfolgenden Zyklen enthalten ist. Auf diese Weise umfasst das Schema 1-B einen Aktivierungsschritt und einen Aminolyseschritt, gefolgt von einem oder mehreren Zyklen der Acylierungs/Aktivierungs/Aminolyseschritte. Die verwendeten Reaktionen und Reagenzien sind die gleichen wie die vorstehend in Schema 1-A beschriebenen.
SCHEMA 1-B
Aktivierungsschritt
Es wird ein für eine Festphasenpeptidsynthese geeignetes Harz verwendet, vorzugsweise eines mit einem passenden säurespaltbaren Hydroxyllinker, z. B. ein Sasrinharz (HO-CH₂-(C₆H₃(OCH₃))-O-CH₂-Harz) oder eines mit einer Aminogruppe. Zuerst wird das Harz in einem geeigneten Lösungsmittel quellen gelassen. Anschließend wird in einem typischen ersten Aktivierungsschritt der Erfindung die Hydroxyl-(oder Amino)gruppe des Harzes mit der Formel Z-Q-Träger aktiviert. Die Aktivierung mit einem Reagenz wie CDI acyliert die Hydroxyl- (oder Amino)gruppen mit einer Gruppe, welche noch immer eine Abgangsgruppe besitzt (HO- wird im-CO-O- und NH₂- wird im-CO-NH-): HO-CH₂(C₆H₃(OCH₃))-O-CH₂-Träger + Reagenz → L-COO-CH₂((C₆H₃ (OCH₃))-O-CH₂-Träger wobei L eine Abgangsgruppe ist.
Nach dem Abtropfenlassen und Waschen kann der Aktivierungsschritt wiederholt werden.
Aminolyseschritt
Der Aminolyseschritt ist wie vorstehend beschrieben, wobei ein Diamin der Formel (I), NH₂-Y'-NH₂, mit homogener Länge zu dem aktivierten Harz zugegeben wird. Zum Beispiel wird nach einem kurzen Abtropfen und Waschen das harzgebundene Material mit einem Diamin auf PEG-Basis wie vorstehend beschrieben aminolysiert, wobei: H-HN-Y'-NH-CO-O-CH₂(C₆H₃(OCH₃))-O-CH₂-Träger erhalten wird.
Acylierungs/Aktivierungs/Aminolyseschritte
Ein Acylierungs/Aktivierungs/Aminolyse-Zyklus würde: H-[HN-Y-NH-CO-X-CO]-HN-Y-NH-CO-O-CH₂(C₆H₃(OCH₃))-O-CH₂-Träger ergeben usw., wobei der aus drei Schritten bestehende Acylierungs/Aktivierungs/Aminolyse-Zyklus wiederholt wird, bis der Linker die gewünschte Länge aufweist. Dies ergibt einen Linker der Formel (III): -{NH-Y-NH-CO-X-CO}_n-{NH-Y'-NH}_n' wobei n' 1 ist, und ein Produkt der Formel (IV): [U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}_n-{NH-Y'-NH}_n']_q-V wobei U H ist und V -Z-Q-Träger ist.
Im Fall eines Hydroxylharzes ergibt die Abspaltung von dem Harz ein Produkt der Formel (IV), wobei U und V H sind, durch Decarboxylierung der endständigen Carbaminsäure: H-{NH-Y-NH-CO-X-CO)_n-{NH-Y'-NH}-H
Im Fall eines Aminoharzes ergibt die Abspaltung von dem Harz ein Produkt der Formel (IV), wobei U H ist und V CONH₂ ist: H-{NH-Y-NH-CO-X-CO}_n-{NH-Y'-NH}-CONH₂
V kann auch als H angesehen werden, das durch einen zweiwertigen Linker -CONH- gebunden ist.
Die in den Schemata 1-A und 1-B beschriebenen Acylierungs/Aktivierungs/Aminolyse-Zyklen können viele Male wiederholt werden, wobei die gleichen oder unterschiedliche zweiwertige Säuren und Diamine verwendet werden. Da die Oligomerisierung rationell, jeweils immer nur ein Schritt, durchgeführt wird, besteht die Gelegenheit, das Diamin und die zweiwertige Säure-Komponente auf einer beliebigen Stufe zu variieren (z. B. durch Verwenden einer anderen zweiwertigen Säure, wobei X-(CH₂)₄- anstelle von -(CH₂)₂- ist) und somit die Hydrophobie und die Länge maßzuschneidern.
Sobald die gewünschte Anzahl von Zyklen durchgeführt worden ist, um die gewünschte Länge des Linkers zu erzielen, kann die Kette anschließend (z. B. mit einem Peptid) verlängert werden, wobei Standardmethoden der Festphasensynthese verwendet werden.
Ein automatisches Peptidsynthesegerät kann programmiert werden, um die Schritte durchzuführen. Sobald die gewünschte Kette zusammengebaut ist, kann ein Peptid an der endständigen Aminogruppe synthetisiert werden. Da bei der Konstruktion der Kette keine Schutzgruppen verwendet werden, kann diese Kettenverlängerung unter Verwendung von standardmäßigen Boc-(tert-Butyloxycarbonyl-) oder Fmoc-(Fluorenyl-methoxycarbonyl)-Methoden vor der Abspaltung von dem Harz auf die übliche Weise (Fields, oben) durchgeführt werden. Alternativ können die endständigen Gruppen entweder vor der Abspaltung von dem Harz oder danach mit einer Aminooxyacetylgruppe oder einer Aldehydvorstufe durch Standardmethoden (Rose, J. Am. Chem. Soc. 116:24 (1994)) verändert werden. Die Kette auf PEG-Basis enthält Ether- und Amidbindungen, die beide mit allgemeinen Peptidschutzgruppenentfernungs- und Spaltungsmethoden, einschließlich flüssigen Fluorwasserstoffs ("HF"), kompatibel sind.
Die Produkte weisen nach der Abspaltung von dem Harz und der Reinigung durch Standardmethoden der Peptidchemie die Formel (IV) auf: [U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}_n-{NH-Y'-NH}_n']_q-V und enthalten eine wasserlösliche organische Kette auf Polyamidbasis mit einer genauen Anzahl von Wiederholungseinheiten der Formel (III): -{NH-Y-NH-CO-X-CO}_n-{NH-Y'-NH}_n'-
Es sollte beachtet werden, dass der Acylierungsschritt und der Aktivierungsschritt des Zyklus der vorliegenden Erfindung dem Acylierungsschritt von herkömmlichen Festphasenpeptidsynthesezyklen entspricht und die gewöhnlichen Schutzgruppen, seien es nun Schutzgruppen auf Boc-, Fmoc-, Butyl- oder Benzylbasis, welche an Substituenten in dem Linker oder Produkt vorhanden sein können, nicht stört. An dem Aminolyseschritt ist jedoch ein Überschuss eines primären Amins beteiligt und er führt somit zu einem Verlust der Fmoc-Schutzgruppen von Aminogruppen und der Formyl-Schutzgruppen von Tryptophan und dies sollte bei der Planung einer Synthese berücksichtigt werden.
Eine weitere Synthesereaktion der vorliegenden Erfindung umfasst zwei Schritte: eine Acylierung und eine Aminolyse. Durch Verwenden eines Überschusses einer doppelt aktivierten zweiwertigen Säure in dem Acylierungsschritt ist es nicht erforderlich, die freie Säuregruppe vor dem Aminolyseschritt zu aktivieren, wie in Schema II gezeigt ist.
SCHEMA II
Acylierungsschritt
Wenn eine zweifach aktivierte zweiwertige Säure (wie das Acylchlorid oder ein aktiver Ester, wiedergegeben durch "L", wenn L eine Abgangsgruppe ist) verwendet wird, um die Aminogruppen zu acylieren, die an ein für eine Festphasenpeptidsynthese geeignetes Harz gebunden sind (NH₂-Q-Träger oder HO-Q-Träger): NH₂-Q-Träger + L-CO-X-CO-L (Überschuss) → L-CO-X-CO-NH-Q-Träger oder HO-Q-Träger + L-CO-X-CO-L (Überschuss) → L-CO-X-CO-O-Q-Träger
Es ist wichtig, einen Überschuss des Acylierungsreagenzes über die vorhandenen Aminogruppen zu verwenden, um die Begünstigung einer "brückenbildenden" Nebenreaktion zu vermeiden, bei der das gleiche zweiwertige Derivat einer zweiwertigen Säure zwei Aminogruppen acyliert. Solche verbrückten Spezies können an der Aminolyse und Kettenverlängerung nicht teilnehmen und stellen eine Verringerung der Ausbeute und das Vorhandensein von Verunreinigungen dar, welche nach der Abspaltung des Produkts von dem Träger entfernt werden müssen.
Ein ganz spezieller Fall liegt vor, wenn die zweiwertige Säure Kohlensäure ist. Carbonyldiimidazol ist eine geeignete zweifach aktivierte Form dieser zweiwertigen Säure. Ihre Verwendung ergibt Imidazolyl-CO-NH-Q-Träger bzw. Imidazolyl-CO-O-Q-Träger.
Aminolyseschritt
Der Aminolyseschritt umfasst die Zugabe eines Diamins der Formel (I), NH₂-Y-NH₂, mit homogener Länge: NH₂-Y-NH₂ + L-CO-X-CONH-Q-Träger → NH₂-Y-NH-CO-X-CONH-Q-Träger
Die Acylierungs- und Aminolyseschritte können anschließend mehrmals wiederholt werden, wie es vorstehend in Schema I beschrieben ist.
Es ist wichtig, dass eine ausreichende Menge an Reagenzlösung in jedem der Reaktionsschritte der Schemata I und II verwendet wird, um zu ermöglichen, dass das Harz eine Aufschlämmung bildet. Da das Harz stark aufquillt, wenn die Anzahl der Zyklen zunimmt, ist es bevorzugt, absolute Konzentrationen zu verwenden, die denjenigen entsprechen, die in den vorstehenden Schemata beschrieben sind, und die Volumina entsprechend anzupassen. Außerdem ist es bevorzugt, mehr als 8 Milliliter Lösung für Synthesen von längeren Ketten zu verwenden, wenn mit ungefähr 0,3 Mol Harz begonnen wird. Der Quellungsgrad hängt von der Art des verwendeten Trägers oder Harzes (Zusammensetzung, Vernetzungsgrad usw.) ab und ist auch substitutionsabhängig (d. h. wie viele mmol/g) sowie längenabhängig. Entsprechend kann nicht ausreichende Flüssigkeit (Lösung) zu einer nicht quantitativen Kupplung führen. Während der Acylierungsschritt durch den Kaiser-Test leicht überwacht werden kann, ist es relativ schwierig, den Aktivierungsschritt zu verfolgen. Wenn der Aktivierungsschritt in einem Zyklus unvollständig ist, kann eine Aktivierung nichtsdestoweniger während eines nachfolgenden Zyklus erfolgen, was somit zu einer Deletion führt, bei der dem Produkt eine Wiederholungseinheit -(CO-X-CO-NH-Y-NH)- fehlen kann. Die Verwendung eines Überschusses der Reagenzien beseitigt dieses Problem. Der Begriff "Überschuss" soll einen molaren Überschuss der zweiwertigen Säure (oder des Derivats), des Aktivierungsmittels und des Diaminreagenzes bedeuten: für die zweiwertige Säure, das Aktivierungsmittel bzw. das Diamin vorzugsweise zwischen dem ungefähr 3–20 fachen, 10–40-fachen, 20–200fachen; mehr bevorzugt zwischen dem ungefähr 4–15 fachen, 15–30 fachen, 40–180 fachen; am meisten bevorzugt zwischen dem ungefähr 5–14fachen, 20–28fachen, 50–150fachen molaren Überschuss.
Es gibt zahlreiche Harze, die sich für die Festphasenpeptidsynthese eignen und somit für die Syntheseschemata der vorliegenden Erfindung gut geeignet sind. Diese Harze können im Handel erhalten werden oder durch Standardmethoden synthetisiert werden und zu ihren gehören z. B. das tert-Butoxycarbo-nyl-Leu-O-CH₂-phenyl(acetamido)harz ("Boc-Leu-PAM"-Harz, Bachern, Bubendorf, Schweiz), das 9-Fluore-nylmethoxycarbonylcysteamin-Sasrinharz ("Fmoc"-cysteamin-Sasrinharz, Bachern), das Fmoc-aminobutter-säure-Sasrinharz (Bachern), das Fmoc-Lys(4-methyltrityl)-methylbenzhydrylaminharz ("Fmoc-Lys(Mtt)-MBHA"-Harz) und dergleichen. Von beliebigen der vorstehend erwähnten Harze können die Aminoschutzgruppen entfernt werden und die Harze für die Acylierung mit einem Derivat einer zweiwertigen Säure verwendet werden.
Entsprechend kann ein Hydroxylharz wie Sasrin (Bachern), Wang oder PAM direkt mit einem Derivat einer zweiwertigen Säure acyliert werden. Alternativ kann ein Hydroxylharz wie Sasrin (Bachern), Wang oder PAM durch CDI aktiviert werden, so dass ein im-CO-O-CH₂-Linker-Harz erhalten wird, wobei im Fall von Sasrin dies im-CO-O-CH₂-(C₆H₃(OCH₃))-O-CH₂-Harz ergibt. Siehe Bethel, et al., J. Biol. Chem. 254:2572–2574 (1979). Ein solches aktiviertes Hydroxylharz kann mit einem Diamin aminolysiert werden, wobei NH₂-Y-NH-CO-O-Q-Träger erhalten wird, wie es von Bethel et al., oben, beschrieben ist.
Im Fall von orthogonal geschützten Diaminoharzen wie Fmoc-Lys(Mtt)-MBHA-Harz wird normalerweise nur von einer Aminogruppe vor der Acylierung die Schutzgruppe entfernt. Andernfalls kann ein Derivat einer zweiwertigen Säure wie SA direkt mit einem Harz wie Sasrin gekoppelt werden, wobei ein Harz mit einer freien Carboxylgruppe erhalten wird, welche für eine Aktivierung verwendet werden kann. Das Harz wird, sobald die Aminoschutzgruppe entfernt ist, durch die Formel NH₂-Q-Träger veranschaulicht, wobei Q ein zweiwertiger organischer Rest, z. B. -CH(R')-CO- (wobei R' eine Aminosäureseitenkette wie im Fall von entschütztem Boc-Leu-), -CH₂-CH₂S- (im Fall von entschütztem Fmoc-cysteamin), -CH₂-CH₂-CH₂CO- (im Fall von entschützter Fmoc-aminobuttersäure), -CH(CH₂-CH₂-CH₂-CH₂NH-Mtt)CO- (im Fall von Fmoc-entschütztem Fmoc-Lys(Mtt)) ist, oder ein an der Seitenkette geschütztes Polypeptid darstellen kann, wobei in diesem Fall die NH₂-Gruppe von NH₂-Q-Träger die freie Aminogruppe des zuvor an dem Träger synthetisierten Polypeptids bedeuten soll. NH₂-Q-Träger kann auch herangezogen werden, um ein MBHA-Harz wiederzugeben. Wenn das Harz durch die Formel HO-Q-Träger veranschaulicht wird, ist Q eine Linkergruppe, die dazu bestimmt ist, bei der Abspaltung der Kette von dem Harz eine endständige Carboxylgruppe von der acylierten (estergebundenen) Kette freizusetzen. Solche Gruppen sind wohlbekannt (Methods in Enzymology Bd. 289) und werden in die PAM-Harze und Sasrin-Harze eingebaut, welche von Bachern und anderen Lieferanten im Handel erhältlich sind. Die Produkte werden dann unter Verwendung einer Standardmethode, die sich für das spezielle verwendete Harz eignet, von dem Harz abgespalten. Der Träger kann z. B. das Polystyrolharz von handelsüblichen PAM-, Sasrin- oder MBHA-Harzen oder andere ähnliche Träger, die für die Festphasenpeptidsynthese verwendet werden und in Methods in Enzymology Bd. 289 erwähnt sind, sein. Es werden jedoch auch andere Materialien und Konfigurationen des Trägers in Betracht gezogen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wurde herausgefunden, dass, sobald ein aktiviertes Harz mit einem Diamin unter Erhalt von NH₂-Y-NH-CO-X-CO-O-Q-Träger aminolysiert ist, die freie Aminogruppe anschließend mit einem Derivat einer zweiwertige Säure acyliert werden kann und der Polyamidverlängerungsvorgang über viele Zyklen ablaufen kann, wobei gute Ausbeuten des gewünschten Produkts erhalten werden. Dies steht im Gegensatz zu der Erwartung, dass bestimmte Nebenreaktionen wie etwa die Verbrückung von zwei aktivierten Gruppen durch. das Diamin die Methode rasch undurchführbar machen würden. Nach der Abspaltung von dem Harz durch Standardmethoden wird das Polyamid mit einer endständigen Aminogruppe freigesetzt, welche für eine Funktionalisierung (z. B. Schaffung von symmetrischen Molekülen) ausgenutzt werden kann.
Wie vorstehend angemerkt sind die erfindungsgemäßen Ketten auf Polyamidbasis nützlich zum Verändern von Zielmolekülen oder Materialien wie etwa Oberflächen. Diese Ketten können an Reste von Makromolekülen, z. B. Aminosäurereste von Polypeptiden gekuppelt werden, ohne die an dem Rest vorhandene Ladung drastisch zu verändern oder ohne Gruppen an Stellen einzuführen, wo sie wahrscheinlich die Bindungseigenschaften der Makromoleküle stören, und sind durch Bindungen angelagert, welche unter einer Reihe von Bedingungen, insbesondere physiologisch relevanten Bedingungen stabil sind. Besonders geeignete Mittel zum Anlagern der Ketten auf PEG-Basis der vorliegenden Erfindung an Polypeptide und Proteine umfassen die Anlagerung durch Hydrazon- und Oximchemie an den Amino- und Carboxyenden der Polypeptidketten, wie es in Rose et al., Europäisches Patent 0243929 , das durch Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung aufgenommen ist, gelehrt wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können Protein und andere organische Zielmoleküle durch Konjugation an die erfindungsgemäßen wasserlöslichen organischen Ketten auf Polymerbasis mit genauer Länge wie etwa. die in der vorliegenden Beschreibung beschriebenen Ketten auf PEG-Basis chemisch verändert werden. Die Herstellung solcher Proteinkonjugate ist wegen der wünschenswerten Eigenschaften interessant, die ihnen durch die Anlagerung der wasserlöslichen Polymere verliehen werden. Zu diesen wünschenswerten Eigenschaften gehören eine erhöhte Löslichkeit in wässrigen Lösungen, eine erhöhte Stabilität während der Lagerung, eine verringerte Immunogenität, eine erhöhte Beständigkeit gegen enzymatischen Abbau, eine Kompatibilität mit einer größeren Vielfalt von Arzneimittelverabreichungssystemen und eine erhöhte in vivo-Halbwertszeit. Diese Eigenschaften, welche durch die Veränderung von Polypeptiden mit PEG oder anderen wasserlöslichen Polymeren herbeigeführt werden, sind insbesondere interessant, wenn das Polypeptid als ein therapeutisches Mittel verwendet werden soll, das in den Körper injiziert wird, oder wenn das Polypeptid in einer nicht medizinischen Anwendung wie etwa in Assays, gewöhnlich Immunoassays, für den Nachweis und/oder die Quantifizierung einer interessierenden Verbindung verwendet werden soll.
Ein "verändertes" Zielmolekül oder Material ist ein Molekül oder Material, welches durch Konjugation an eine oder mehrere erfindungsgemäße Kette(n) auf Polyamidbasis verändert worden ist. Eine "homogene" veränderte Zusammensetzung der Erfindung bezieht sich auf eine chemische Zusammensetzung, in welcher im Wesentlichen alle der veränderten Zielmoleküle oder Materialien im Wesentlichen die gleichen Ketten auf Polyamidbasis aufweisen, d. h. dass ein Bereich des Molekulargewichts des angelagerten Polymers bzw. der angelagerten Polymere nicht existiert. Zum Beispiel kann eine erfindungsgemäße Kette auf PEG-Basis die -(CH₂CH₂O)_p-Gruppe entweder in dem Substituenten X oder in dem Substituenten Y der Formel (III) oder in beiden aufweisen, was zu einer Formel -{NH-Y-NH-CO-a-(CH₂CH₂O)_p-b-CO}_n-{NH-Y'-NH}_n'-, -{NH-a'-(CH₂CH₂O)_p'-b'-NH-CO-X-CO}_n-{NH-Y'-NH}_n'-, oder -{NH-a'-(CH₂CH₂O)_p'-b'-NH-CO-a-(CH₂CH₂O)_p-b-CO}_n-{NH-Y'-NH}_n'- führt.
Eine solche beispielhafte Kette weist die folgende Formel auf PEG-Basis auf: -(NH-CH₂-(CH₂CH₂O)₃-(CH₂)₃-NH-CO-(CH₂)₂-CO)_n-
Die in einer homogenen Zusammensetzung vorhandenen Ketten auf PEG-Basis haben alle dieselben ganzzahligen Werte von p oder p' und die Zusammensetzung ist im Wesentlichen frei von homologen Ketten auf PEG-Basis mit einem unterschiedlichen p oder p'-Wert. Es ist wichtig zu verstehen, dass auf einen konstanten p oder p'-Wert innerhalb einer bestimmten Monomereinheit wie -{NH-Y-NH-CO-a-(CH₂CH₂O)_p-b-CO}_n-{NH-Y'-NH}_n'- oder -(NH-a'-(CH₂CH₂O)_p'-b'-NH-CO-X-CO)- Bezug genommen wird. Es ist auch möglich, eine Monomereinheit mit einem unterschiedlichen p oder p'-Wert in verschiedenen Zyklen auszuwählen und in der Tat ist es auch möglich a, a', b, b', p, p' und X in jedem Zyklus der Synthese zu variieren und dennoch eine homogene Zusammensetzung zu erhalten.
Die erfindungsgemäßen Ketten auf Polyamidbasis werden durch kovalente Konjugation, z. B. durch eine Oximbindung an das Zielmolekül angelagert. "Kovalent konjugiert" oder "konjugiert" bezieht sich auf die Anlagerung einer Kette auf Polyamidbasis an das Zielmolekül durch Standardmethoden der Biokonjugatchemie (Bioconjugate Techniques, oben) und insbesondere durch die in Rose et al., europäisches Patent 0243929 beschriebenen N- und C-terminalen Markierungsmethoden. Zum Beispiel kann eine Kette auf PEG-Basis eine endständige Aminooxyacetyl-(NH₂OCH₂CO-)- Gruppe enthalten, welche mit einer Aldehydgruppe an dem Protein unter Bildung einer Oximbindung reagiert, oder sie kann eine Glyoxylyl-(O=CHCO-)-Gruppe enthalten, welche mit einer Aminooxygruppe an dem Protein reagiert (eingeführt z. B. durch Alkylierung eines Thiols mit BrCH₂CO-NHCH₂CH₂NHCOCH₂ONH₂, wie es von Werlen, et al., Cancer Research 56:809–815 (1996) beschrieben ist) oder sie kann eine Bromacetylgruppe enthalten, welche ein Thiol an dem Protein alkyliert. Alternativ kann eine Konjugation zwischen der Kette auf PEG-Basis und dem Zielmolekül durch Aktivierung (z. B. mit einem Diimid und N-Hydroxysuccinimid) einer terminalen Carboxylgruppe an der Kette (z. B. wenn V -OH ist und n' 0 ist) und Acylierung von Aminogruppen (wie Lysinseitenketten) an dem Zielmolekül erfolgen, oder eine Konjugation kann durch Aktivierung von Carboxylgruppen an dem Zielmolekül (z. B. mit wasserlöslichem Carbodiimid) gefolgt von einer Zugabe einer Kette auf PEG-Basis mit einer freien Aminogruppe (z. B. wenn U H ist) bewirkt werden.
Wenn das veränderte Molekül für antigene oder immunogene Zwecke verwendet werden soll, ist es für einen Fachmann offensichtlich, dass irgendwelche verwendeten Spacergruppen nicht stark immunogen sein sollten. Wenn das konjugierte Polymer für Bindungszwecke verwendet werden soll, sollte eine beliebige Spacergruppe Eigenschaften wie die Bindung, die Avidität, die Produktstabilität oder Löslichkeit verbessern oder zumindest nicht beeinträchtigen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Herstellen von Proteinen bereit, die mit einer oder mehreren Ketten auf Polyethylenglycolbasis mit genauer Länge verändert sind. Genauer gesagt werden Verfahren und Verbindungen zum Verändern eines Makromolekülziels wie etwa eines Proteins, Peptids oder einer anderen organischen Verbindung wie etwa eines Kunststoffs oder einer Oberfläche, die Makromoleküle enthält, mit einer oder mehren Ketten auf Polyethylenglycolbasis mit genauer Länge unter milden Bedingungen beschrieben.
Ein bevorzugtes Verfahren der Konjugation beruhtauf einer Standardchemie, welche auf die folgende Weise durchgeführt wird. Die Kette auf PEG-Basis weist eine Aminooxyacetylgruppe auf, die während der Synthese angelagert wird (z. B. durch Acylierung mit aktivierter Boc-aminooxyessigsäure), die Schutzgruppe wird entfernt und die Kette auf PEG-Basis wird von dem Harz abgespalten, gereinigt und unter Verwendung der Standardmethoden der Festphasenpeptidsynthese (Methods in Enzymology Bd. 289 und die Beispiele) charakterisiert. Das Zielmolekül weist einen endständigen Serin- oder Threoninrest auf, welcher unter milden Bedingungen mit Periodat gemäß Rose, J. Am. Chem. Soc. 116:30–33 (1994) und europäischem Patent 0243929 zu einer Glyoxylylgruppe oxidiert wird. Die Aminooxykomponente und die Aldehydkomponente werden in annähernd gleichen Anteilen in einer Konzentration von 1–10 mM in wässriger Lösung bei schwachsaurem pH (2 bis 5) bei Raumtemperatur vermischt und die Konjugationsreaktion (Oximierung) durch Umkehrphasen-Hochdruckflüssigchromatografie (HPLC) und Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ES-MS) verfolgt. Die Reaktionsgeschwindigkeit hängt von den Konzentrationen, dem pH und sterischen Faktoren ab, ist aber normalerweise innerhalb weniger Stunden im Gleichgewicht und das Gleichgewicht liegt weit auf der Seite des Konjugats (Rose et al., Bioconjugate Chemistry 7:552–556 (1996)). Ein leichter Überschuss (bis zum Fünffachen) einer Komponente treibt die Konjugationsreaktion zur Vollständigkeit. Die Produkte werden wie vorstehend für die Oxime beschrieben isoliert und charakterisiert. Peptide und kleine Proteine (z. B. Insulin) können durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt werden (Rose, J. Am. Chem. Soc., oben und Rose, et al., Bioconjugate Chemistry, supra), wogegen größere Proteine (z. B. Antikörper und ihre Fragmente) am besten durch Ionenaustauschchromatografie oder durch Gelfiltrationsmethoden wie für das Trioxim, das von Wer len et al., Cancer Research 56:8–815 (1996) beschrieben ist, gereinigt werden.
Ein weiteres Verfahren zur Konjugation wird auf die folgende Weise durchgeführt. Die Kette auf PEG-Basis wird an dem Sasrinharz von Bachern synthetisiert. Unter Verwendung des von dem Harzhersteller (Bachern) empfohlenen Verfahrens wird die Kette durch wiederholte Behandlung mit 1 % TFA in Dichlormethan von dem Harz abgespalten und die Lösung der abgespaltenen Kette wird mit Pyridin in Methanol neutralisiert. Nach dem Verdampfen der Lösungsmittel bei Raumtemperatur (es wird keine Wärme angewandt) und der Reinigung der abgespaltenen Kette so, als wäre sie ein Polypeptid, wird die Carboxylgruppe, welche mit dem Harz verbunden wurde, aktiviert (z. B. mit HATU) und an eine nukleophile Gruppe (wie etwa eine Amino-gruppe) an dem Zielmolekül (oder der Oberfläche) durch Standardmethoden der Peptidchemie gekoppelt.
Falls es gewünscht wird, kann das veränderte Zielmolekül oder Material durch eines der zahlreichen Reinigungsverfahren, welche Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt sind, wie etwa Größenausschlusschro-matografie, hydrophobe Interaktionschromatografie, Ionenaustauschchromatografie, präparative isoelektrische Fokussierung usw. aus dem Reaktionsgemisch aufgereinigt werden. Allgemeine Verfahren und Prinzipien für eine Makromolekülaufreinigung, insbesondere Proteinaufreinigung findet man z. B. in "Protein Purification: Principles and Practice" von Scopes, 2. Auflage, Springer-Verlag, New York, NY, (1987), welches durch Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung aufgenommen ist.
Wie vorstehend angemerkt sind die Linker auf PEG-Basis der vorliegenden Erfindung insbesondere nützlich beim Verbessern der Eigenschaften von Zielmolekülen oder Materialien. Zum Beispiel sind die Vorteile der Kupplung von wasserlöslichen Poly meren, insbesondere Polyethylenglycol, an Proteine gut dokumentiert und schließen eine erhöhte Löslichkeit des veränderten Proteins im Vergleich zu dem nativen Protein bei physiologischem pH, wenn das native Protein bei physiologischem pH unlöslich oder nur teilweise löslich ist, eine Abnahme der Immunreaktion, die durch das native Protein erzeugt wird, ein erhöhtes pharmakokinetisches Profil, eine erhöhte Lagerbeständigkeit und eine erhöhte biologische Halbwertszeit ein. Allgemeiner gesagt ist ein wichtiger Vorteil der vorliegenden Erfindung, insbesondere im Fall von biologisch wichtigen Zielmakromolekülen wie Polypeptiden, dass das Makromolekül durch die Anlagerung der Linker auf PEG-Basis oder auf Basis eines wasserlöslichen Polymers verändert werden kann, ohne die biologische Aktivität des Makromoleküls wesentlich zu verringern oder zu beeinträchtigen. Der Begriff "biologische Aktivität" schließt eine enzymatische Aktivität, die Fähigkeit, an Rezeptoren (einschließlich Antikörper) zu binden, die Fähigkeit, Liganden zu binden, die Fähigkeit, eine Immunreaktion auszulösen, die Fähigkeit, eine therapeutische Wirkung hervorzurufen, und dergleichen ein.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass Makromoleküle, z. B. Polypeptide, die durch die erfindungsgemäßen Ketten auf PEG-Basis mit genauer Länge verändert werden, im Wesentlichen homogene Verbindungen sind, im Gegensatz zu solchen, die durch Verbinden von mehreren wasserlöslichen Polymeren mit variierender Länge hergestellt werden, z. B. Polymeren, die eine -(CH₂CH₂O)_m-Gruppe enthalten, wobei der Wert von m unter den Polymeren stark variiert. Somit stellt die vorliegende Erfindung veränderte Ziele bereit, welche die Vorteile aufweisen, die mit der Konjugation von wasserlöslichen Polymeren verbunden sind, während der Verlust an Homogenität minimiert wird, der mit der Veränderung verbunden ist. Homogenität ist für Biopharmazeutika äußerst wichtig, um Variationen von Charge zu Charge zu verringern und die Produktentwicklung, Charakteri sierung, Interpretation der Ergebnisse (einer homogenen Verbindung statt eines Gemisches) zu erleichtern und die behördliche Zulassung zu erhalten.
Zu Polypeptiden von Interesse gehören monoklonale und polyklonale Antikörper; Hormone; Cytokine, einschließlich koloniestimulierender Faktoren wie M-CSF, GM-CSF und G-CSF; Stammzellwachstumsfaktor; Lymphokine; IL-2 und IL-3; Wachstumsfaktoren, einschließlich PDGF, EGF; Peptidhormone, einschließlich hGH und Erythropoietin; Blutgerinnungsfaktoren, einschließlich Faktor VIII; Immunogene; Enzyme und Enzyminhibitoren; Liganden; Impfstoffantigene und dergleichen. Polypeptide von Interesse können aus ihren natürlichen Ausgangsmaterialien oder gentechnisch veränderten Zellen isoliert werden oder durch verschiedene in vitro-Syntheseverfahren hergestellt werden. Die folgenden Patentanmeldungen (welche hiermit durch Bezugnahme aufgenommen sind) beschreiben Veränderungen auf PEG-Basis von verschiedenen biologisch wichtigen Proteinen: US-Patent Nr. 4,179,337 ; 4,609,546 ; 4,261,973 ; 4,055,635 ; 3,960,830 ; 4,415,665 ; 4,412,989 ; 4,002,531 ; 4,414,147 ; 3,788,948 ; 4,732,863 ; und 4,745,180 ; EP Nr. 152,847 ; EP 98110 , veröffentlicht am 11. Januar 1984; und JP 5792435 . Diese Proteine sind in ihrem unveränderten Zustand Zielmakromoleküle für eine Veränderung, wie es hier beschrieben ist.
Die Begriffe "Peptid", "Polypeptid" und "Protein" werden hier wechselseitig austauschbar verwendet und sollen sowohl natürlich vorkommende als auch rekombinante Formen sowie andere nicht in der Natur vorkommende Formen des Peptids oder Proteins bedeuten, welche mit dem natürlich vorkommenden Peptid oder Protein ausreichend übereinstimmen, um den Besitz einer ähnlichen biologischen oder chemischen Aktivität zu gestatten.
Wenngleich die Ketten der vorliegenden Erfindung als "Linker" bezeichnet werden können, zieht die Erfindung die Verwen dung dieser Ketten in Betracht, wobei das Zielmolekül nicht unbedingt mit einem anderen Molekül verbunden ist. Entsprechend kann ein einzelnes Zielmakromolekül an eine einzelne Kette der Formel (III) angelagert sein, wobei ein Produkt der Formel (IV) erhalten wird, wobei q 1 ist: U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}_n-{NH-Y'-NH}_n'-V so dass U (oder V) das Zielmolekül ist und V (oder U) eine endständige Gruppe ist. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung weist ein einzelnes Zielmolekül mehrere Ketten der Formel (III) auf, die an verschiedenen Stellen daran gebunden sind.
Wenn die Kette der Erfindung in der Funktion eines Linkers verwendet wird, werden zwei Zielmoleküle, welche gleich oder verschieden sein können, an eine einzelne Kette der Formel (III) gebunden, so dass in dem Produkt der Formel (IV) die Gruppen U und V gleich oder verschieden sind, aber beide Zielmakromoleküle sind. Diese zuletzt genannte Ausführungsform kann als Ausführungsform mit einer "Hantel"-Konstruktion bezeichnet werden.
Entsprechend werden in einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Zielmoleküle bereitgestellt, die durch eine erfindungsgemäße Kette auf PEG-Basis verändert sind. Diese werden hier als "Polymerkonjugate" bezeichnet. Wie vorstehend erörtert wurde, ist das Zielmolekül vorzugsweise ein Polypeptid, mehr bevorzugt ein Polypeptid mit biologischer Bedeutung.
Die Erfindung zieht auch individuelle Zielmoleküle in Betracht, die durch eine oder mehrere unterschiedliche erfindungsgemäße Ketten auf PEG-Basis mittels einer Reaktion mit unterschiedlichen Ausführungsformen der Ketten auf PEG-Basis verändert werden. Außerdem können individuelle Zielmoleküle mit mehreren Ketten auf PEG-Basis an einer einzelnen Stelle an dem Zielmolekül verändert werden.
Es ist von besonderem Interesse, die erfindungsgemäßen Linker auf PEG-Basis zum Verändern von Polypeptiden zur Verwendung als Arzneimittel und zur Verwendung in Assays zu verwenden. Zu Polypeptiden für die Verwendung in Assays gehören spezifisch bindende Proteine, Polypeptide, die durch spezifisch bindende Proteine erkannt werden, und Enzyme. Mit spezifisch bindenden Proteinen sind Antikörper, Hormonrezeptoren, Lectine und dergleichen gemeint. Der Begriff "Antikörper" soll sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper mit natürlichen Immunglobulinsequenzen, synthetische Antikörperderivate und dergleichen einschließen. Ferner können die Antikörper so verändert sein, dass sie mit beliebigen von einer Vielzahl von Markierungen, z. B. einer Fluoreszenzmarkierung, einer radioaktiven Markierung, einer enzymatischen Markierung, einer Biotip/Avidin-Markierung oder dergleichen verbunden sind. Zu synthetischen Antikörperderivaten gehören natürliche Immunglobulinsequenzen, welche mutiert und auf veränderte Bindungsspezifität selektiert worden sind, verschiedene von einem Immunglobulingen abgeleitete Polypeptide, typischerweise einzelkettig, die durch genetisch veränderte Bakterien hergestellt werden, Antikörper, die so verändert sind, dass sie veränderte konstante Regionen und dergleichen enthalten; ein Überblick über solche synthetischen Antikörperderivate auf der Grundlage der Prinzipien der Antikörperbildung wird in Winter, et al., Nature, 349:293–299 (1991) angegeben. Ein Antikörper ist ein Glycoprotein vom Globulintyp, welches in einem tierischen Organismus als Reaktion auf die Verabreichung eines Antigens gebildet wird und welches im Stande ist, sich mit dem Antigen spezifisch zu verbinden. Diese Substanzen werden auch als Immunglobuline bezeichnet. Antikörperfragmente können eine gewisse Fähigkeit zum selektiven Binden an ihr Antigen oder Hapten beibehalten. Die Fähigkeit, an ein Antigen oder Hapten zu binden, wird durch Antigenbin dungsassays bestimmt (siehe z. B. Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow und Lane, Hrsg., Cold Spring Harbor, New York (1988), welches durch Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung aufgenommen ist). Zu solchen Antikörperfragmenten gehören Fab, Fab' und (Fab')₂, sie sind aber nicht darauf beschränkt. Ein nativer Antikörper ist ein Antikörper, welcher aus einem Tier oder aus einer tierischen oder hybriden tierischen (Hybridom-) Zellinie isoliert wird.
Zielmakromolekülpolypeptide können auch durch einen prokaryotischen Mikroorganismus. oder eine eukaryotische Zelle erzeugt werden, welcher bzw. welche mit einer nativen oder veränderten Polypeptid-kodierenden DNA-Sequenz, vorzugsweise menschlichen Ursprungs, transformiert worden ist. Zielpolypeptide können auch durch Phagenbibliothekmethoden identifiziert und anschließend chemisch synthetisiert werden, wie in den Beispielen. Varianten von in der Natur vorkommenden Polypeptiden, bei denen eine wesentliche Identität der Aminosäuresequenzen beibehalten wurde (d. h. die Sequenzen sind identisch oder unterscheiden sich durch eine oder mehrere Aminosäureveränderungen (Deletionen, Additionen, Substitutionen), welche keine im Wesentlichen nachteilige funktionelle Verschiedenheit zwischen dem durch die Mutation veränderten Protein und dem nativen Protein verursachen), sind in der vorliegenden Erfindung brauchbar.
Salze von einem beliebigen der in der vorliegenden Beschreibung beschriebenen Zielmoleküle, z. B. Polypeptide, wasserlösliche Polymere und Derivate davon, treten natürlich auf, wenn solche Moleküle in wässrigen Lösungen mit verschiedenen pH-Werten vorhanden sind (oder daraus isoliert werden). Alle Salze von Peptiden und anderen Makromolekülen mit der angegebenen biologischen Aktivität werden als innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegend angesehen. Zu Beispielen gehören Alkali-, Erdalkali- und andere Metallsalze von Carbonsäurere sten, Säureadditionssalze (z. B. HCl) von Aminoresten und Zwitterionen, die durch Reaktionen zwischen Carbonsäure- und Aminoresten innerhalb des gleichen Moleküls gebildet werden.
Wie vorstehend angemerkt wurde, kann das Zielmolekül eine Nukleinsäure sein, wozu Nukleotide, Oligonukleotide und lineare oder zirkularisierte, einzel- oder doppelsträngige DNA und RNA gehören, die zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung angegeben sind. Um die Eigenschaften von Nukleinsäuren zu verbessern, z. B. die Mobilität unter Assaybedingungen zu verbessern, ist es häufig erwünscht, eine Polymerkette mit der Nukleinsäure zu verbinden. Dies hat sich als erfolgreich erwiesen, wobei Linker auf Ethylenoxidbasis verwendet wurden (siehe z. B. Grossman et al., US-Patent Nr. 5,777,096 ). Entsprechend wird erwartet, dass Nukleinsäuren, die mit der erfindungsgemäßen Kette auf PEG-Basis mit genauer Länge verändert werden, entsprechend verbesserte Eigenschaften aufweisen.
Das Zielmolekül kann auch ein Liposom sein. Es gibt zahlreiche Anwendungen für Liposome, sie sind aber von besonderem Interesse als Träger für die Arzneimittelverabreichung. Um die Eigenschaften von Liposomen zu verbessern, ist es häufig erwünscht, eine funktionelle Verbindung wie etwa ein Protein, Peptid usw. an die Liposomoberfläche zu binden. Da dies unter Verwendung anderer Linker auf PEG-Basis zu Stande gebracht wurde (siehe z. B. Tagawa et al., US-Patent Nr. 5,556,948 ), wird erwartet, dass ein Liposom, das mit der erfindungsgemäßen Kette auf PEG-Basis mit genauer Länge verändert wurde, entsprechend verbesserte Eigenschaften hat.
Außerdem können die erfindungsgemäßen Ketten auf PEG-Basis auch an eine Matrix oder eine feste Phase wie etwa die Oberfläche eines Silicium- oder Sensorchips oder eine Gold- oder Glasoberfläche oder andere Biosensoroberfläche, eine Gewebekulturplatte, Zelle oder Membran oder ein synthetisches oder natür liches Harz gebunden werden, welche zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung angegeben sind. Man kann eine Kette auf PEG-Basis durch die Verwendung von komplementären funktionellen Gruppen, die in der festen Phase eingeführt sind, mit der festen Phase chemoselektiv verbinden. Solchefesten Phasen können leicht in abwechselnde Bäder eines Diamins der Formel (I) und eines Derivats einer zweiwertigen Säure der Formel (II) eingetaucht werden, mit Aktivierungs- und Waschbädern dazwischen, um die erfindungsgemäßen Ketten auf PEG-Basis an ihre Oberfläche zu binden.
Wenn ein Zielmolekül für human- oder veterinärmedizinzische Verwendungszwecke wie etwa eine Krebstherapie und die Behandlung von Infektionskrankheiten therapeutisch wirksam ist, kann das veränderte Zielmolekül, sobald es hergestellt und gereinigt ist, in eine pharmazeutische Zusammensetzung für die gleichen Verwendungszwecke eingearbeitet werden.
Ein therapeutisches Mittel ist ein beliebiges Molekül, welches, wenn es an ein Tier verabreicht wird, eine Krankheit verhütet oder lindert oder einen Krankheitszustand in dem Tier zum Stillstand bringt oder lindert. Zu therapeutischen Mitteln können Antitumorantibiotika, antivirale Proteine, Radioisotope, Pharmazeutika oder ein Toxin gehören, sie sind aber nicht darauf beschränkt. Es wird erwartet, dass therapeutische Mittel, die mit den in der vorliegenden Beschreibung beschriebenen Ketten auf Polyamidbasis verändert sind, die gleiche oder eine ähnliche biologische Aktivität wie das nicht veränderte Mittel aufweisen, jedoch mit den vorstehend erörterten Verbesserungen der Eigenschaften.
Das veränderte therapeutische Mittel kann in einem ungiftigen, inerten, pharmazeutisch annehmbaren wässrigen Trägermedium formuliert werden. Ein "pharmazeutisch annehmbarer Träger" bedeutet beliebige der üblichen pharmazeutischen Träger wie etwa eine phosphatgepufferte Salzlösung; Wasser; oder eine Emulsion wie etwa eine Öl/Wasser-Emulsion; welche möglicherweise verschiedene Arten von Netzmitteln enthalten. Das veränderte therapeutische Mittel kann in einem ungiftigen, inerten, pharmazeutisch annehmbaren wässrigen Trägermedium formuliert werden, vorzugsweise bei einem pH im Bereich von 3 bis 8, mehr bevorzugt im Bereich von 6 bis 8. Wenn sie für eine in vivo-Therapie verwendet wird, umfasst die sterile Zusammensetzung des veränderten therapeutischen Mittels das veränderte Protein, das nach der Lösung bzw. Verdünnung zur ursprünglichen Konzentration in einem wässrigen Puffer mit einem annehmbaren pH gelöst ist. Das veränderte therapeutische Mittel kann mit einer Reihe von Excipienzien wie Aminosäuren, Polymeren, Polyolen, Zucker, Puffern, Konservierungsmitteln, anderen Proteinen usw. formuliert werden. Zu spezifischen Beispielen gehören: Octylphenoxypolyethoxyethanolverbindungen; Polyethylenglycolmonostearatverbindungen; Polyoxyethy-lensorbitanfettsäureester; Sucrose; Fructose; Dextrose; Maltose; Glucose; Dextran; Mannitol; Sorbitol; Inositol; Galactitol; Xylitol; Lactose; Trehalose; Rinderserumalbumin oder menschliches Serumalbumin; Citrat; Acetat; Ringer- und Hank-Lösungen; Kochsalzlösung; Phosphat; Cystein; Arginin; Carnitin; Alanin; Glycin; Lysin; Valin; Leucin; Polyvinylpyrrolidon; Polyethylenglycol; usw. Vorzugsweise ist diese Formulierung mindestens 6 Monate bei 4°C stabil.
Als eine Zusammensetzung kann das veränderte therapeutische Mittel durch im Fachgebiet bekannte Verfahren dem Subjekt verabreicht werden, wobei "verabreicht" das Bereitstellen einer wirksamen Menge der Verbindung oder pharmazeutischen Zusammensetzung für das Subjekt bedeutet. Zu Verabreichungsverfahren gehören eine orale, intravenöse, transdermale und parenterale Verabreichung, sie sind aber nicht darauf beschränkt. Die Verabreichung kann kontinuierlich oder mit Unterbrechungen während der Dauer von anderen Behandlungen erfolgen. Verfahren zum Bestimmen der wirksamsten Mittel und Dosierung der Verabreichung sind Fachleuten wohlbekannt und variieren mit der Verbindung oder Zusammensetzung für die Behandlung, dem Zweck der Therapie und dem behandelten Tier oder Patienten. Diese Zusammensetzung kann andere Verbindungen enthalten, welche die Wirksamkeit erhöhen oder die erwünschten Eigenschaften des speziellen Zielmoleküls fördern. Die Zusammensetzung muss für die Verabreichung über den gewählten Weg sicher, steril und wirksam sein. Um die Sterilität aufrechtzuerhalten und die Stabilität des veränderten therapeutischen Mittels zu erhöhen, kann die Zusammensetzung lyophilisiert und vor der Verwendung zur ursprünglichen Konzentration verdünnt werden.
Vorzugsweise eignet sich die Formulierung für eine parenterale Verabreichung an Menschen oder Tiere in therapeutisch wirksamen Mengen. Diese Mengen können durch die in vivo-Wirksamkeitsdaten, die nach vorklinischen Tests unter Verwendung von Tiermodellen des interessierenden Krankheitszustands erhalten wurden, oder in vitro-Assays bestimmt werden, von denen allgemein anerkannt ist, dass sie mit der in vivo-Wirksamkeit korrelieren.
Es ist auch von Interesse, die erfindungsgemäßen Ketten auf Polyamidbasis in Form eines Kits zu liefern, um die bequeme und reproduzierbare Veränderung von interessierenden Zielmolekülen zu ermöglichen. In Frage kommende Kits können Lösungen, welche die erfindungsgemäßen Ketten auf Polyamidbasis umfassen, Puffer, Reaktionsindikatorverbindungen, eine Gebrauchsanleitung, Reagenzien zur Messung der Proteinkonzentration, z. B. für Bradford-Assays, und dergleichen enthalten. Reagenzlösungen werden vorzugsweise in vorher abgemessenen Mengen geliefert. Alternativ können die Kits eine Lösung, die eine zweiwertige Säure als ein Derivat umfasst, und eine Lösung, die ein Diamin für die Synthese der Ketten auf Polyamidbasis umfasst, zusammen mit den vorstehend angegebenen Materialien enthalten. Die Kits können auch das Zielmolekül enthalten, dessen Eigenschaften verändert oder verbessert werden.
Die Kits können eine Reihe von einzelnen Lösungen (oder die pulverförmige Form) von Ketten auf Polyamidbasis mit bekannter Zusammensetzung, Molekulargewicht und Konfiguration (monopolymer, bipolymer oder multipolymer) enthalten, die an Zielmoleküle mit bekanntem Molekulargewicht und bekannter Zusammensetzung gebunden sind, welche als Standardsubstanzen verwendet werden können, z. B. um die Vollständigkeit und/oder Ausbeute von Konjugationsreaktionen abzuschätzen oder um Molekulargewichtsstandards zu ergeben.
Ein bevorzugter Kit, der zum Synthetisieren einer wasserlöslichen organischen Kette auf Polyamidbasis mit einer genauen Anzahl von Wiederholungseinheiten brauchbar ist, wobei die Kette die Formel: -{NH-Y-NH-CO-X-CO}_n-{NH-Y'-NH}_n' aufweist, worin: n eine ganze Zahl von 1–100 ist; n' 0 oder 1 ist; X und Y zweiwertige organische Reste ohne reaktive funktionelle Gruppen sind oder abwesend sind und gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander mit jeder der Wiederholungseinheiten variieren können; Y' ein zweiwertiger organischer Rest ohne reaktive funktionelle Gruppen ist oder abwesend ist; umfassend: (a) Z-Q-Träger, wobei Z H₂N- oder HO- ist; Q ein Linker oder ein Zielmolekül ist; und der Träger eine feste Phase, Matrix oder Oberfläche ist; (b) eine zweiwertige Säure mit der Formel HOOC-X-COOH oder ein Derivat davon; und (c) ein. Diamin mit der Formel NH₂-Y-NH₂.
Ein weiterer beispielhafter Kit der Erfindung ist ebenfalls zum Verbessern oder Verändern eines Zielmoleküls brauchbar und umfasst: (a) Reagenzien zum Synthetisieren einer wasserlösli chen organischen Kette auf Polyamidbasis mit einer genauen Anzahl von Wiederholungseinheiten, wobei die Kette die Formel: -{NH-Y-NH-CO-X-CO}_n-{NH-Y'-NH}_n' aufweist, wobei: n eine ganze Zahl von 1–100 ist; n' 0 oder 1 ist; X und Y zweiwertige organische Reste ohne reaktive funktionelle Gruppen sind oder abwesend sind und gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander mit jeder der Wiederholungseinheiten variieren können; und Y' ein zweiwertiger organischer Rest. ohne reaktive funktionelle Gruppen ist oder abwesend ist; umfassend: (i) Z-Q-Träger, wobei Z H₂N- oder HO- ist; Q ein Linker oder ein Zielmolekül ist; und der Träger eine feste Phase, Matrix oder Oberfläche ist; (ii) eine zweiwertige Säure mit der Formel HOOC-X-COOH oder ein Derivat davon; wobei X ein zweiwertiger organischer Rest ohne reaktive funktionelle Gruppen ist oder abwesend ist; und (iii) ein Diamin mit der Formel NH₂-Y-NH₂, wobei Y ein zweiwertiger organischer Rest ohne reaktive funktionelle Gruppen ist oder abwesend ist; und (b) ein Zielmolekül dessen Eigenschaften verändert oder verbessert werden und das einen wahlfreien zweiwertigen Spacer oder Linker aufweist.
Die vorstehend erwähnten Kits können außerdem einen oder mehrere der folgenden Bestandteile umfassen: mindestens eine weitere zweiwertige Säure mit der Formel HOOC-X-COOH, worin der Substituent X von dem Substituenten Y in der ersten zweiwertigen Säure verschieden ist, oder ein Derivat davon; mindestens ein weiteres Diamin mit der Formel NH₂-Y-NH₂, worin der Substituent Y von dem Substituenten Y in dem ersten Diamin verschieden ist; und ein Aktivierungsmittel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Carbonyldiimidazol, Disuccinimidylcarbonat und O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphat.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Kit, der zum Verbessern oder Verändern eines Zielmoleküls brauchbar ist, welcher umfasst: (a) eine wasserlösliche organische Kette auf Polyamidbasis mit einer genauen Anzahl von Wiederholungseinheiten, wobei die Kette die Formel aufweist: -{NH-Y-NH-CO-X-CO}_n-{NH-Y'-NH}_n' worin: n eine ganze Zahl von 1–100 ist; n' 0 oder 1 ist; X und Y zweiwertige organische Reste ohne reaktive funktionelle Gruppen sind oder abwesend sind und gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander mit jeder der Wiederholungseinheiten variieren können; und Y' ein zweiwertiger organischer Rest ohne reaktive funktionelle Gruppen ist oder abwesend ist; und (b) ein Zielmolekül, dessen Eigenschaften verändert oder verbessert werden und das einen wahlfreien zweiwertigen Spacer oder Linker aufweist.
Veränderte Zielmoleküle oder Materialien der Erfindung können in verbesserten Kits für diagnostische Zwecke oder als verbesserte Reagenzien für Assays, z. B. in Bindungsassays, wie Immunoassays, verwendet werden. Zum Beispiel ergeben veränderte Zielmolekülzusammensetzungen, die Antigenpeptide tragen, eine erhöhte Nachweisempfindlichkeit in Festphasenimmunoassays. Die größeren; zweiwertigen oder mehrwertigen veränderten Materialien können leichter an Oberflächen, wie die Multiwellplatten, die in Immunoassays verwendet werden, anhaften. Mehrwertige Spezies können stark verbesserte Bindungsaviditäten aufweisen (z. B. Terskikh et al, oben) und Ketten auf PEG-Basis können zum Zusammenbauen von synthetischen mehrwertigen Konstruktionen verwendet werden (siehe Beispiele). Veränderte Zielmoleküle, insbesondere Zielmoleküle, die mehrere Ketten auf PEG-Basis enthalten, finden Verwendung in in vitro-Assays, welche einen Signalamplifikationsschritt für den Nachweis eines Analyten verwenden, wie z. B. in einem Assay auf der Basis von verzweig ter DNA. Eine Amplifikation wird durch die Anlagerung von mehreren Ketten auf PEG-Basis (statt einer einzelnen Kette auf PEG-Basis) an ein einzelnes Analytmolekül erzielt, worin eine an jede Kette auf PEG-Basis gebundene Reportergruppe zu einem nachweisbaren Signal in einem anschließenden Assayschritt beiträgt. Therapeutische Mittel, welche den Hämatokrit erhöhen, können durch Verbinden von zwei erythropoietinmimetischen Peptiden durch erfindungsgemäße Polyamidlinker auf PEG-Basis hergestellt werden (Beispiele 11 und 12).
Die vorliegende Erfindung sieht außerdem die in vitro-Verwendung von Ketten auf PEG-Basis vor. Eine Kette auf PEG-Basis kann verwendet werden, um ein Zielmolekül zu "markieren" und somit den anschließenden Nachweis des Moleküls oder seine quantitative Bestimmung auf verschiedene Weise zu ermöglichen. Am einfachsten ermöglicht es die angelagerte Kette auf PEG-Basis, eine einfache Trennung nach Größe durchzuführen, welche das mit der Kette auf PEG-Basis markierte Zielmolekül von anderen Molekülen in einem Gemisch abtrennt. Es ist nun klar ersichtlich, dass verschiedene physikalisch-chemische Eigenschaften von organischen Polymeren auf diese Weise ausgenutzt werden können, indem einfach das Polymer gewechselt wird. Zum Beispiel würde eine leicht hydrophobe Kette auf PEG-Basis eine Trennung auf der Basis der Hydrophobie ermöglichen oder man kann eine polymerbindende Säule verwenden, welche dann je nach Wunsch für oder gegen die Kette auf PEG-Basis selektiert. Außerdem kann die Kette auf PEG-Basis so gewählt oder verändert werden, dass sie direkt nachgewiesen werden kann. Dies bringt den Vorteil mit sich, dass die Kette auf PEG-Basis mehrere nachweisbare Stellen (oder Wiederholungseinheiten) enthalten kann, so dass jede in dem Polymer vorhandene Stelle bindet oder durch ein Nachweissystem erkannt wird, was somit zur Amplifikation des Nachweissignals führt.
BEISPIELE
Abkürzungen

Abu

Aminobuttersäure

amu

Atommasseneinheiten

AoA

Aminooxyacetyl

Boc

tert-Butoxycarbonyl

2BrZ

2-Brombenzyloxycarbonyl

Bzl

Benzyl

CDI

Carbonyldiimidazol

DAH

1,6-Diaminohexan, H₂N(CH₂)₆-NH₂

'DAH'

ein Rest von DAH

DCM

Dichlormethan

DIEA

Diisopropylethylamin

DMAP

4-Dimethylaminopyridin

DMF

Dimethylformamid

EMP

erythropoietinmimetisches Peptid

EPO

Erythropoietin

Fmoc

9-Fluorenylmethoxycarbonyl

HATU

O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylu roniumhexafluorphosphat

HF

Fluorwasserstoff

HOBT

N-Hydroxybenzotriazol

MALDI-TOF

matrixunterstützte Laser-Desorptions/Ionisations-

MBHA

Flugzeit

Mtt

Methylbenzhydrylamin

NMP

4-Methyltrityl

OSu

N-Methylpyrrolidon der N-Hydroxysuccinimidester einer Carbonsäure oder der Fmoc-Schutzgruppe

PAM

Phenyl(acetamido)methyl, d. h. genaugenommen -C₆H₄CH₂CONHCH₂C₆H₄- (Polystyrol), z. B. Boc-Leu-OCH₂- PAM

PEG

Polyethylenglycol, Oligomere von -CH₂CH₂O-

'PEG'

-NH-CH₂CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)₃-CH₂NH- welche ein Rest des Diamins auf PEG-Basis, NH₂CH₂CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)₃-CH₂NH₂ ist

SA

C₄H₄O₃, Bernsteinsäureanhydrid

succ

-COCH₂CH₂CO-, ein Rest von Bernsteinsäure

t-Bu

tert.-Butyl

TFA

Trifluoressigsäure

TFMSA

Trifluormethansulfonsäure

BEISPIEL 1
Synthese von H-('PEG'-succ)₃-Leu-PAM-Harz
Es wurden drei Zyklen von -'PEG'-succ- an einem H-Leu-PAM-Harz (Bachem) durchgeführt, wobei: H-[NHCH₂CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)₃-CH₂NH-CO-CH₂CH₂CO]₃-Leu-PAM-Harz erhalten wurde.
0,5 g (ungefähr 0,3 mmol)Boc-Leu-PAM-Harz (Bachem, Schweiz) wurde an einem ABI 430A-Peptidsynthesegerät in DMF quellen gelassen und die Schutzgruppen wurden mit TFA entfernt. Das TFA wurde ablaufen gelassen und das Harz mit DMF auf die übliche Weise gewaschen. Dies ergab das H-Leu-PAM-Harz (als sein TFA-Salz), das für die Acylierung bereit war. Manchmal werden solche Produkte als H-Leu-OCH₂-PAM-Harz und manchmal als H-Leu-PAM-Harz niedergeschrieben, aber beide Bezeichnungen beziehen sich auf ein standardmäßiges PAM-Peptidsyntheseharz.
Da "Leu" ein Rest von Leucin (-NH-CH(C₄H₉)-CO-) ist, wird das Produkt korrekt als "H-Leu-PAM"-Harz niedergeschrieben, wenngleich "Leu-PAM" häufig verwendet wird. Auf ähnliche Weise und wie in dem Abschnitt "Abkürzungen" angemerkt, ist 'PEG' ein Rest (-NHCH₂CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)₃-CH₂NH-) und entsprechend sollte, wenn es endständig ist, die endständige Gruppe (hier ein Wasserstoff) gezeigt werden.
Acylierung: H-Leu-PAM-Harz, das wie vorstehend hergestellt wurde, wurde in DMF quellen gelassen, abtropfen gelassen und mit 4 mmol SA durch Vermischen mittels eines Vortex bei Raumtemperatur 30 Minuten acyliert. SA wurde in 8 ml DMF (Burdick and Jackson High Purity grade) gelöst, welches eine Konzentration von 0,5 M HOBT (Fluka) aufweist und zu dem 400 μl DIEA zugegeben wurde. Nach dem Abtropfenlassen und Waschen des Harzes mit DMF bestätigte der Kaiser-Ninhydrintest, dass die Acylierung vollständig war.
Aktivierung: Die freie Carboxylgruppe wurde mit 8 mmol CDI (Fluka) in 8 ml DMF 30 Minuten aktiviert.
Aminolyse: Nach einem kurzen Abtropfen lassen und Waschen mit DMF wurde das harzgebundene Imidazolid mit dem Diamin auf 'PEG'-Basis, NH₂CH₂CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)₃-CH₂NH₂, (4 ml Diamin, vorvermischt mit 4 ml DMF, welches eine Konzentration von 0,5 M HOBT aufweist) 60 Minuten aminolysiert. Nach gründlichem Waschen mit DMF zeigte der Kaiser-Test die charakteristische blaue Farbe und das Aminoharz war für den nächsten Acylierungs/Aktivierungs/Aminolyse-Zyklus bereit.
Der Acylierungs-, Aktivierungs- und Aminolyse-Zyklus wurde noch zweimal wiederholt, um H-('PEG'-succ)₃-Leu-PAM-Harz zu erhalten. Das Produkt wurde durch eine weitere Kettenverlängerung, gefolgt von einer Spaltung, wie in Beispiel 2 beschrieben, charakterisiert.
BEISPIEL 2
Synthese von H-Tyr-('PEG'-succ)₃-Leu-OH
Die harzgebundene Aminogruppe des dritten 'PEG' des H-('PEG'-succ)₃-Leu-PAM-Harzes von Beispiel 1 wurde mit Boc-Tyr(2BrZ) an dem ABI 430A acyliert, wobei eine standardmäßige HBTU-Aktivierung und DIEA als Base verwendet wurden, anschließend wurde das Harz zur Entfernung der Schutzgruppen/Spaltung auf die normale Weise behandelt (TFA, um Boczu entfernen, HF 60 min bei 0°C in Gegenwart von 5 para-Cresol, um die Seitenkettenschutzgruppe auf Benzylbasis 2BrZ zu entfernen und von dem Harz abzuspalten). Nach dem Abdampfen des HF wurde para-Cresol mit Diethylether mit einer Temperatur von –20°C extrahiert. Der resultierende Kuchen aus Harz und Produkt wurde in 50% Acetonitril aufgenommen und das Harz abfiltriert. Das Produkt wurde aus dem Filtrat durch Lyophilisierung isoliert. Eine Umkehrphasen-HPLC (Nucleosil 300 Å 5 μm C8-Säule, 250 × 4 mm Innendurchmesser, 0,6 ml/min, Lösungsmittel A war 1 g TFA in 1 Liter Wasser, Lösungsmittel B war 1 g TFA gelöst in 100 ml Wasser und anschließend mit Acetonitril auf 1 Liter gebracht, Gradient von 100% A bis 100% B) zeigte nur eine Hauptkomponente, welche als das erwartete H-Tyr-('PEG'-succ)₃-Leu-OH durch Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie identifiziert wurde (gefundene Masse 1201,5, berechnet 1201,6).
BEISPIEL 3
Synthese von H-Ser-('PEG'-succ)₈-Abu-OH
Es wurden acht Zyklen von PEG-succ an einem Abu-Sasrin-Harz auf eine Weise durchgeführt, die der in Beispiel 1 beschriebenen Weise entsprach, wobei: H-[NHCH₂CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)₃-CH₂NH-CO-CH₂CH₂CO]₈-Abu-Sasrin-Harz erhalten wurde.
Die harzgebundene Aminogruppe des 8. 'PEG' wurde mit Fmoc-Ser(t-Bu) acyliert. Von einem Teil des Harzes wurde die Fmoc-Schutzgruppe mit Piperidin entfernt und dann wurde er mit TFA behandelt, um die Butyl-Seitenketten-Schutzgruppen zu entfernen und von dem Harz abzuspalten. Ein weiterer Teil wurde unter Verwendung von 1% TFA in DOM gemäß den Empfehlungen des Herstellers (Bachem) von dem Harz abgespalten, wobei Fmoc- und Butyl-Schutzgruppen intakt blieben. Es ist bekannt (siehe die Broschüre über das Sasrin-Harz, die von Bachern verteilt wird), dass das Harz für eine langsame (24stündige) Aminolyse durch Diamine anfällig ist, was zu der Ablösung der wachsenden Kette als ein Amid und der Freisetzung einer Hydroxylgruppe an dem Harz führt. Wenngleich eine solche Reaktion während der beschriebenen Aminolyse in geringem Umfang stattfinden kann, wird jede abgelöste Kette während der nachfolgenden Schritte weggewaschen und verunreinigt somit nicht das Produkt.
Beide Produkte ergaben überaus reine Chromatogramme und die erwarteten Massen durch Massenspektrometrie: Fmoc-Ser(But)-('PEG'-succ)₈-Abu-OH ergab Signale bei m/z 722,9 und 963,5, entsprechend M + 4H+ bzw. M + 3H+, was zu einer Masse von 2887,5, berechnet 2887,5 führt; H-Ser-('PEG'-succ)8-Abu-OH ergab Signale bei m/z 523,0, 653,6 und 871,0, entsprechend M + 5H+, M + 4H+ bzw. M + 3H+, was zu einer Masse von 2609, 3, berechnet 2609,2 führt. In dem Massenspektrum, welches eine ausreichende Intensität aufwies, um Verunreinigungen bis herab zu dem 1%-Niveau zu zeigen, war keine Spur eines Materials sichtbar, dem ein -CH₂CH₂O- (44 amu) fehlte.
Das vollständig geschützte Produkt war in dem Wasser/Acetonitril/TFA-HPLC-Lösungsmittelsystem vollkommen lös lich. Dies ist eine erwartete Eigenschaft von Polyethylenglycolen, aber vollständig geschützte Peptide sind charakteristischerweise in den meisten Lösungsmitteln unlöslich. Wie man weiß ist, sind vollständig geschützte Produkte mit einer endständigen freien Carbonsäure für eine Aktivierung und Kupplung in Segmentkondensationen (konvergenten Synthesen) brauchbar. Nach der Entfernung der Schutzgruppe von der Ser-Gruppe kann sie unter sehr milden Bedingungen mit Periodat oxidiert werden, wobei eine Aldehydgruppe erhalten wird, die sich zur Bildung von Nichtpeptidbindungen (z. B. Oximen) eignet. Eine solche Oxidation und Oximierung ist in Rose, J. Am. Chem. Soc, oben, beschrieben.
BEISPIEL 4
Synthese von (H-Ser-('PEG'-succ)₄)₄Lys,Lys-NHCH₂CH₂SH
Von Fmoc-Cysteamin-Sasrin-Harz (Bachem, 200 mg, 0,51 mmol/g)wurde die Fmoc-Schutzgruppe entfernt (es wurde weniger Harz als üblich genommen, da die Anzahl der Aminogruppen wie beschrieben vermehrt werden sollte). Es wurden zwei Zyklen von Fmoc-Lys(Fmoc) gekoppelt, um einen Lysin-"Baum" mit vier freien Aminogruppen anstelle von jeder ursprünglichen zu erzeugen.
Es wurden vier Zyklen von 'PEG'-succ wie in Beispiel 1 beschrieben an dem Harz durchgeführt. Das Harz wurde dann mit Fmoc-Ser(t-Bu) acyliert, die Fmoc-Schutzgruppe entfernt, dann mit TFA in Gegenwart von Triisopropylsilan behandelt, um das Butyl zu entfernen und von dem Harz zu spalten. Das erwartete Produkt (H-Ser-('PEG'-succ)₄)₄Lys₂Lys-NHCH₂CH₂SH wurde durch HPLC isoliert und durch Massenspektrometrie identifiziert (Masse 5647,9). Das Thiol wurde in Phosphatpuffer pH 7 mit 5-iodacetaminofluorescein (Fluka) alkyliert, wobei das erwartete alkylierte vierfach verzweigte Produkt erhalten wurde, welches das Fluorophor trägt. Das Produkt wurde durch HPLC isoliert und durch Massenspektrometrie charakterisiert. Es ergab Signale bei m/z 671,9, 755,7, 863,5, 1007,1 und 1208,2, die M + 9H+, M +8H+, M + 7H+, M + 6H+ bzw. M + 5H+ entsprechen und eine Masse von 6037,0, berechnet 6037,2 ergeben. Die Ser-Reste können durch eine milde Periodatbehandlung (welche das Fluorophor nicht beeinflusst) oxidiert werden und ein Tetraoxim mit Peptiden oder anderen Molekülen, die Aminooxygruppen tragen, gebildet werden, wie es in Rose, J. Am. Chem. Soc, oben, beschrieben ist.
Die Ausbeute des verzweigten Produkts (H-Ser-('PEG'-succ)₄)₄Lys₂Lys-NHCH₂CH₂SH war viel geringer als die Ausbeuten, die mit linearen 'PEG'-succ-Oligomeren, selbst solchen, die acht Wiederholungseinheiten besitzen, erhalten werden, wahrscheinlich aufgrund der erhöhten Neigung zur Verbrückung von in geringem Abstand voneinander befindlichen aktivierten Carboxylgruppen durch Diamin im Fall der verzweigten Struktur. Aus diesem Grund kann es bevorzugt sein, bei der Konstruktion von verzweigten Strukturen durch Oximierung z. B. die lineare 'PEG'-succ-haltige Verbindung (Peptid)-('PEG'-succ)_n-'PEG'-COCH₂ONH₂ mit dem verzweigten (O=CHCO-)₄Lys₂-Lys-NH₂ anstelle von (Peptid)-COCH₂ONH₂ und der verzweigten 'PEG'-succ-haltigen Verbindung (O=CHCO-('PEG'-succ)₄)₄Lys₂Lys-NH₂ zu kondensieren.
BEISPIEL 5
Synthese von Peptiddimeren: (Peptid)-oxim-('PEG'-succ)₁₆-'PEG'-oxim-(peptid)
In diesem Beispiel wurde unverändertes Sasrin-Harz (0,25 mmol, Bachem) verwendet. Die harzgebundenen Hydroxylgruppen wurden mit SA (10 mol) in 5 ml DMF, das 1 mmol DMAP enthielt, 40 min acyliert. Diese Acylierungsreaktion wurde wiederholt, um einen hohen Acylierungsgrad der Hydroxylgruppen des Sasrin-Harzes zu gewährleisten. Das Produkt ist auf dieser Stufe HOOC-CH₂CH₂-CO-O-CH₂(C₆H₃(OCH₃))-O-CH₂-Polystyrol, welches eine Form von HOOC-X-CO-O-Q-Träger, wie in Schema 1 beschrieben, ist, wobei Q der Sasrinlinker -CH₂(C₆H₃(OCH₃))-O-CH₂- ist, der Träger das Polystyrol der Sasrin-Perlen ist und X -CH₂CH₂- ist.
Nach dem Waschen mit DMF wurde die freie Carboxylgruppe der Säure mit 8 mmol CDI in 8 ml DMF 30 Minuten aktiviert.
Das aktivierte Harz wurde mit 'PEG' wie in Beispiel 1 beschrieben aminolysiert. Sieben weitere Zyklen von 'PEG'-succ wurden wie in Beispiel 1 hinzugefügt (in einem anderen Fall wurden fünf weitere Zyklen anstelle von sieben verwendet).
Dann wurde die endständige Aminogruppe mit Boc-Ser(Bzl) acyliert, wobei HBTU/DIEA unter Standardbedingungen verwendet wurde. Die Kette wurde durch mehrfache Behandlungen mit 1 % TFA in DCM von dem Harz entfernt, wobei jedes Aliquot mit Pyridin in Methanol gemäß den Empfehlungen des Sasrin-Herstellers neutralisiert wurde. Das Produkt auf dieser Stufe Boc-Ser(Bzl)-('PEG'-succ)₇-'PEG'-COCH₂-CH₂CO-OH, oder einfacher Boc-Ser(Bzl)-('PEG'-succ)₈-OH, wurde durch Rotationsverdampfung bei Raumtemperatur isoliert und durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt. (In dem anderen Fall wurde Boc-Ser(Bzl)-('PEG'-succ)₆-OH hergestellt). Die Carboxylgruppe wurde 10 min unter Standardbedingungen mit HATU (ein Äquivalent) in NMP aktiviert und die aktivierte Verbindung zwei Tage mit 'PEG' aminolysiert (ein halbes Äquivalent, um die Acylierung von beiden Aminogruppen des 'PEG' zu begünstigen). Das Produkt wurde durch Umkehrphasen-HPLC isoliert und durch Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie als die symmetrische Verbindung charakterisiert:
Boc-Ser(Bzl)-('PEG'-succ)₈-'PEG'-(succ-'PEG')₈-Ser(Bzl)Boc welche auch niedergeschrieben werden kann als:
Boc-Ser(Bzl)-('PEG'-succ)₁₆-'PEG'-Ser(Bzl)Boc
In der vorstehenden Struktur versteht sich, dass beide endständigen Aminogruppen des symmetrischen zentralen 'PEG' mit Boc-Ser(Bzl)-('PEG'-succ)₈- acyliert worden sind: das Ser(Bzl) auf der rechten Seite ist somit -CO-CH(CH₂OBzl)NH- und nicht das geläufigere -NH-CH(CH₂OBzl)CO-, so dass der Ser-Rest kursiv geschrieben ist, um dies anzudeuten. Die gefundene Masse betrug 5613 gefunden (5612,9 berechnet). Indem anderen Fall war das Produkt die symmetrische Verbindung:
Boc-Ser(Bzl)-('PEG'-succ)₆-'PEG'-(succ-'PEG')₆-Ser(Bzl)BOc
welche auch niedergeschrieben werden kann als:
Boc-Ser(Bzl)-('PEG'-succ)₁₂-'PEG'-Ser(Bzl)Boc
und die gefundene Masse betrug 4403,4 (4403,4 berechnet).
Die Schutzgruppen (Boc, Bzl) wurden auf die übliche Weise durch 4 min lange Behandlung mit TFA (20 μl TFA pro mg), gefolgt von einer Zugabe von Trifluormethansulfonsäure (2 μl pro mg) während 25 min bei Raumtemperatur entfernt. Das Material, von dem die Schutzgruppen entfernt worden waren, wurde gefällt und dreimal mit zuvor auf –20°C gekühltem Diethylether gewaschen, wobei die symmetrische Verbindung:
H-Ser-('PEG'-succ)₈-'PEG'-(succ-'PEG')₈-Ser-H
oder
H-Ser-('PEG'-succ)₁₆-'PEG'-Ser-H
erhalten wurde, welche durch Umkehrphasen-HPLC isoliert und durch Elektrospray-Ionisations-Massenspek-trometrie isoliert wurde: gefundene Masse 5232, berechnet 5232,4.
Die ungeschützten Seringruppen können mit HIO₄ oxidiert werden, wie es von Rose, J. Am. Chem. Soc, oben, beschrieben ist, wobei endständige Aldehydgruppen erhalten werden: NH₂-CH(CH₂OH)-C(O)-('PEG'-succ)₈-'PEG'-(succ-'PEG')₈-C(O)CH(CH₂OH)NH₂ + HIO₄ → O=CH-C(O)-('PEG'-succ)₈-'PEG'-(succ-'PEG')₈-C(O)CH=O:
Die Zugabe von NH₂OCH₂C(O)-Peptid unter Standard-Oximierungsbedingungen ergibt das Hantel-Dioxim: Peptid-COCH₂ON=CHC(O)-('PEG'-succ)₈-'PEG'-(succ-'PEG'-)₈-C(O)CH=NOCH₂CO-Peptid welches auch niedergeschrieben werden kann als: Peptid-COCH₂ON=CHC(O)-('PEG'-succ)₁₆-'PEG'-C(O)CH=NOCH₂CO-Peptid oder (Peptid)-oxim-('PEG'-succ)₁₆-'PEG'-oxim-(Peptid) welches durch HPLC isoliert und durch Massenspektrometrie charakterisiert werden kann.
Ein Beispiel für eine geeignete Peptidsequenz zur Verwendung ist die von Johnson et al., Chemistry & Biology, oben beschriebene:
Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala-Cys-His-Met-Gly-Pro-Met-Thr-Trp-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Arg-Gly- (SEQ ID NO: 1).
Es wurde gezeigt, dass eine Dimerisierung dieses Peptides mit einem Linker mit einem Molekulargewicht von ungefähr 3400 zu einer ungefähr 1000fachen Zunahme der biologischen Aktivität führte. Beispiel 7 beschreibt, wie dieses Peptid in einer geeigneten Form (Aminooxyacetylgruppe und Disulfidbindung vorhanden) für die Oximierung zu dem oxidierten PEG-Linker hergestellt wurde.
BEISPIEL 6
Synthese von Peptiden, die an PEG-Linker gebunden sind: (Peptid)-Lys(NH₂OCH₂CO-('PEG'-succ)₈-)-amid
MBHA-Harz (0,5 mmol, Novabiochem, Schweiz) wurde in diesem Beispiel verwendet. Die harzgebundenen Aminogruppen wurden mit Fmoc-Lys(Mtt) unter Standardbedingungen acyliert. Nach der Entfernung der Fmoc-Gruppe (20% Piperidin in DMF, 20 min) wurden acht Zyklen von 'PEG'-succ unter den Bedingungen von Beispiel 1 hinzugefügt. Die endständige Aminogruppe der achten 'PEG'-Gruppe wurde mit Boc-Glu(Ochxl) acyliert. Die Mtt-Gruppe (aber nicht die Boc-Gruppe) wurde anschließend mit Aliquots mit 1 % TFA in DCM entfernt, bis keine gelbe Farbe mehr freigesetzt wurde. Die freie Aminogruppe wurde mit Fmoc-O-Su acyliert (1 mmol in 4 ml DMSO enthaltend 0,4 ml N-Methylmorpholin, 1 Stunde; Überprüfen mit dem Kaiser-Test und Wiederholen der Acylierung, falls erforderlich, wobei aber beim zweiten Mal nur 0,2 ml N-Methylmorpholin verwendet wird), bevor die Peptidkette unter Verwendung einer Standard-Boc-Chemie mit der folgenden Sequenz verlängert wurde:
H-Ser-Val-Trp-Arg-Trp-Leu-Pro-Tyr-Asp-Lys-Tyr- (SEQ ID NO: 2)
Die Sequenz H-Ser-Val-Trp-Arg-Trp-Leu-Pro-Tyr-Asp-Lys-Tyr-Glu- (SEQ ID NO: 3) wurde in Terskikh et al., oben beschrieben. Fünf Kopien dieses Peptids ergaben, wenn sie in einem zweckmäßigen Abstand angeordnet waren, eine um fünf Größenordnungen bessere Bindung an eine pathologische Zelllinie.
Die Fmoc-Gruppe (und die Formylgruppe an der Seitenkette von Tryptophan) wurde mit Piperidin in DMF entfernt und die freie Aminogruppe wurde mit Boc-NHOCH₂CO-OSu acyliert (genauso wie die gerade beschriebene Fmoc-O-Su-Kupplung). Die Boc-Gruppe wurde mit TFA entfernt, das Harz wurde mit 10% DIEA in DMF neutralisiert, mit DMF gefolgt von DCM, gefolgt von DCM : MeOH 1 : 1 gewaschen und unter Hochvakuum getrocknet. Die Spaltung mit HF und die Produktisolierung wurde wie in Beispiel 2 durchgeführt. Das durch Umkehrphasen-HPLC isolierte Produkt wurde durch Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie charakterisiert: H-Ser-Val-Trp-Arg-Trp-Leu-Pro-Tyr-Asp-Lys-Tyr-Glu-Lys (NH₂OCH₂CO-('PEG'-succ)₈)-NH₂ (SEQ ID NO: 4), gefundene Masse 4261,9, berechnet 4261,1.
Eine Verbindung mit einem kürzeren Linker wurde wie oben hergestellt, wobei aber nur 4 Zyklen von 'PEG'-succ verwendet wurden. Diese Verbindung ergab eine Masse von 3051,5 gefunden, 3051,6 berechnet.
Diese Peptide mit Linkern auf PEG-Basis und Aminooxyacetylgruppen (NH₂OCH₂CO-) werden in Oximierungsreaktionen zum Herstellen von Dimeren und Polyoximen höherer Ordnung verwendet, wobei die in Rose, J. Am. Chem. Soc., oben beschriebene Chemie verwendet wird.
BEISPIEL 7
Synthese von Peptiddimeren: (Peptid)-oxim-('PEG'-succ)₂-Lys((peptid)-oxim-('PEG'-succ)₂)amid
MBHA-Harz (0,5 mmol, Novabiochem, Schweiz) wurde in diesem Beispiel verwendet. Die Sequenz: Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala-Cys-His-Met-Gly-Pro-Met-Thr-Trp-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Arg-Gly- (SEQ. ID NO: 1) (beschrieben von Johnson et al., Chemistry & Biology, oben), gefolgt von Boc-Aminoessigsäure, wurde durch Standard-Boc-Chemie an dem ABI 430A-Gerät an das Harz gekoppelt. Die Dinitrophenylgruppe wurde von der Seitenkette von His durch zwei 30minütige Behandlungen mit 10 ml-Volumina eines Gemisches aus Mercaptoethanol (6 ml) und DIEA (3 ml) in DMF (21 ml) entfernt. Nach dem Waschen des Harzes mit DMF wurde die Boc-Gruppe mit TFA auf die übliche Weise entfernt, dann wurde die Formylgruppe von Tryptophan durch zwei Behandlungen mit 10 ml-Portionen eines Gemisches aus Wasser (2 ml) und Ethanolamin (2,4 ml) in DMF (35,6 ml) entfernt. Das Harz wurde mit DMF, gefolgt von DCM und anschließend DCM/Methanol (1:1) gründlich ge-waschen, abtropfen gelassen und anschließend unter Hochvakuum getrocknet. Die Spaltung und Entfernung der Schutzgruppen mit Fluorwasserstoff und die Produktisolierung war wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie zeigte, dass das Produkt die erwartete Masse (2250,8 gefunden, 2249,7 berechnet) für:
NH₂OCN₂CO-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala-Cys-His-Met-Gly-Pro-Met-Thr-Trp-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Arg-Gly-NH₂ (SEQ ID NO: 1) aufwies.
Die Disulfidbindung wurde wie folgt gebildet. 48 mg des vorstehenden Peptids (ungefähr 21,3 Mikromol) wurden in 48 ml Wasser gelöst und der pH mit Ammoniumhydroxidlösung auf 7,0 (Glaselektrode) eingestellt. 25 Äquivalente einer Stammlösung von 0,92 M Wasserstoffperoxid wurden zugegeben. Nach 30 min bei Raumtemperatur wurde die Lösung mit 0,5 ml Essigsäure angesäuert und sofort auf eine präparative Umkehrphasen-HPLC injiziert. Die Bildung der Disulfidbindung wurde durch den Verlust von zwei Masseneinheiten bestätigt: gefunden 2247,8, berechnet 2247,7.
MBHA-Harz (0,5 mmol, Novabiochem, Schweiz) wurde in diesem Beispiel verwendet. Die harzgebundenen Aminogruppen wurden mit Fmoc-Lys(Fmoc) unter Standardbedingungen acyliert. Nach der Entfernung der Fmoc-Gruppen (20% Piperidin in DMF, 20 min) wurden zwei Zyklen von 'PEG'-succ unter den Bedingungen von Beispiel 1 zugegeben. Die terminalen Aminogruppen der 'PEG'-Gruppen wurden dann mit Boc-Ser(Bzl) acyliert. Nach der Entfernung der Boc-Gruppen mit TFA und dem Waschen und Trocknen des Harzes wurde das Harz mit flüssigem Fluorwasserstoff behandelt und das Produkt wie in Beispiel 2 isoliert. Eine Umkehrphasen-HPLC zeigte ein einziges Hauptprodukt, welches durch Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (gefunden 1529,4, berechnet 1528,8) als das erwartete Produkt charakterisiert wurde: H-Ser-'PEG'-succ-'PEG'-succ-Lys(H-Ser-'PEG'-succ-'PEG'-succ)NH₂.
Die Ausbeute betrug 180 mg gereinigtes Produkt. Die endständigen Serinreste wurden mit Periodat in einem Gemisch aus Imidazolpuffer (340 mg in 100 ml Wasser, mit 6 M HCl auf pH 6,95 eingestellt) und Acetonitril, 7 : 2, bezogen auf das Volumen, unter den von Gaertner et al., Bioconjugate Chemistry 3:262–268 (1992) beschriebenen Bedingungen oxidiert. Nach der Isolierung des oxidierten (Dialdehyd-)Produkts durch Umkehrphasen-HPLC wurde es durch Massenspektrometrie charakterisiert: gefundene Massen 1466,9, 1484,9 und 1502,9, entsprechend dem erwarteten Dialdehyd, dem Monohydrat bzw. dem Dihydrat (berechnet 1466,8, 1484,8 bzw. 1502,8):
O=CH-CO-'PEG'-succ-'PEG'-succ-Lys(O=CH-CO-'PEG'-succ-'PEG'-succ)NH₂
Nach der präparativen HPLC in 0,1% TFA mit einem Gradienten von 0,1% TFA in 90% Acetonitril wird der Dialdehyd durch Rotationsverdampfung bei Raumtemperatur bis zu einer Konzentration von ungefähr 10 mM gewonnen (die Oxidation ist quantitativ).
Die Oximierung (gemäß Rose, K., 1994) des Dialdehyds mit einem zweifachen Überschuss von NH₂OCH₂CO-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala-Cys-His-Met-Gly-Pro-Met-Thr-Trp-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Arg-Gly-NH₂ (SEQ ID NO: 1) (mit einer Disulfidbindung) während 18 Stunden bei Raumtemperatur führte zur Bildung des erwarteten Dioxims zwischen diesem Peptid und dem Dialdehyd. Das Dioxim wurde durch Umkehrphasen-HPLC isoliert und durch Massenspektrometrie charakterisiert: Masse gefunden 5926,0, berechnet 5926,0.
BEISPIEL 8
Synthese von H-('PEG'-succ)₇-'PEG'-H
Nach dem Quellen in DMF wurde Sasrin-Harz (0,3 mmol) mit CDI (8 mmol in 8 ml NMP, welches eine Konzentration von 0,5 M 4-Dimethylaminopyridin aufwies) 30 Minuten aktiviert, abtropfen gelassen und die Aktivierung einmal wiederholt. Dieses aktivierte Harz wurde mit 'PEG' aminolysiert, dann mit SA acyliert und zum Herstellen von H-('PEG'-succ)₇'PEG'-CO-O-CH₂-C₆H₃(OCH₃)-Harz wie vorstehend beschrieben verwendet, mit der Ausnahme, dass, abgesehen von den Waschschritten, NMP anstelle von DMF verwendet wurde. Das Produkt wurde mit TFA 30 Minuten von dem Harz abgespalten und mit kaltem Diethylether (an seinem Gefrierpunkt) gefällt. Das Produkt wurde durch praparative Umkehrphasen-HPLC isoliert. Die Elektrospray-Massenspektrometrie zeigte eine Masse von 2437,18 ± 0,81. Die berechnete Masse für das symmetrische H-('PEG'-succ)₇-'PEG'-H betrug 2436,98.
BEISPIEL 9
Synthese von H-('DAH'-succ-'PEG'-succ)₃-'DAH'-succ-'PEG'-H
Dieses Beispiel befolgt eine ähnliche Arbeitsweise wie die in Beispiel 8 angegebene, mit der Ausnahme, dass 'DAH' anstelle von 'PEG' in alternierenden Aminolysezyklen verwendet wurde. Auf diese Weise wurde ('DAH'-succ-'PEG'-succ)₃-'DAH'-succ-'PEG' an Sasrin-Harz hergestellt. Die Verwendung von NMP anstelle von DMF in den Verfahren der Beispiele 1 und 5–7 ist vorteilhaft, wenn mit einem hydrophoben Diamin wie DAH gearbeitet wird, wenngleich DMF bevorzugt ist, wenn mit dem stärker hydrophilen 'PEG'-Diamin gearbeitet wird. Nach der Abspaltung von dem Harz mit TFA und der Ausfällung mit kaltem Diethylether (an seinem Gefrierpunkt) wurde das Produkt durch Umkehrphasen-HPLC isoliert. Die Elektrospray-Massenspektrometrie zeigte eine Masse von 1920,78 ± 0,59. Die berechnete Masse für H-('DAH'-succ-'PEG'-succ)₃-'DAH'-succ-'PEG'-H betrug 1920,49.
BEISPIEL 10
Bewertung der Polyamidstabilität
Die in den Beispielen 8 und 9 hergestellten Verbindungen wurden separat in einer Konzentration von 1 mg/ml in einer 1% Ammoniumhydrogencarbonatlösung gelöst. In separaten Röhrchen wurden diese Lösungen mit Trypsin, Chymotrypsin und Elastase behandelt (Enzym : Substrat-Verhältnis 1 : 100, 37°C). In Intervallen wurden Aliquots (20 μl) entnommen und durch HPLC analysiert. Selbst nach 24 Stunden fand kein Abbau statt, wogegen Kontrollinkubationen von Insulin mit den Enzymen unter den gleichen Bedingungen einen umfassenden Abbau nach lediglich 4 Stunden aufwiesen. Die Polyamide sind somit gegenüber einem Angriff durch Proteasen viel stabiler als Polypeptide. Im Gegensatz dazu wurde das Peptidamid H-Pro-Gln-Pro-Gln-Pro-Lys-Pro- Gln-Pro-Gln-Pro-Gln-Pro-Gln-Pro-Lys-Pro-Gln-Pro-Lys-Pro-Glu-Pro-Glu-NH₂ (SEQ ID NO: 5) aus der Scharnierregion von Kamel-Antikörpern, die von Terskikh et al, oben, verwendet wurden, durch Trypsin im Lauf von 24 Stunden umfassend abgebaut, wenngleich es gegenüber Chymotrypsin und Elastase stabil war.
BEISPIEL 11
A. Synthese eines EMP-Dimers (handelsübliches PEG) und HPLC/Massenspektrometrie-Analyse
Ein EMP-Dimer, das in der vorliegenden Beschreibung als das "handelsübliche EMP-Dimer" bezeichnet wird, wurde unter Verwendung des handelsüblichen PEG-Dialdehydlinkers mit der mittleren relativen Molekülmasse 3400 (Shearwater Polymers) hergestellt, das in der vorliegenden Beschreibung als das "handelsübliche EMP-Dimer" bezeichnet wird und als O=CH-handelsübliches PEG-CH=O wiedergegeben wird. Das monomere Peptid (Johnson et al., Chemistry & Biology, oben), das eine AoA-Gruppe trägt, NH₂OCH₂CO-GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-Amid (SEQ ID NO: 1) und eine Disulfidbindung wurden unter Verwendung von Standardmethoden durch Boc-Chemie an MBHA-Harz synthetisiert (Fields, oben, und Rose, J. Am. Chem. Soc, oben und Beispiel 7). Das Peptid wurde dann von dem Harz abgespalten und mit HF (enthaltend 5% p-Cresol, 0°C während 60 min) von den Schutzgruppen befreit, mit Diethylether ausgefällt und durch praparative HPLC gereinigt. Anschließend wurde eine Oximierung mit dem handelsüblichen PEG-Linker durchgeführt, wobei das Dimer: Amid-GRLPQCVWTMPGMHCAYLGG-COCH₂ON=CH-handelsübliches PEG-CH=NOCH₂CO-GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-Amid (ein Dimer of SEQ ID NO: 1) erhalten wurde. Kursive Buchstaben werden verwendet, um anzudeuten, dass eines der Peptide in der ungewöhnlichen Richtung wiedergegeben ist (C zu N-Ende statt der herkömmlichen N zu C-Ende). Die Oximierung wurde wie folgt durchgeführt: 2,4 mg EMP-Peptid (1,06 μmol; 1,2facher Überschuss über die Aldehydgruppen) wurde in 0,2 ml Wasser gelöst und zu 1,5 mg (0,44 μmol) PEG-Dialdehyd, gelöst in 0,45 ml Acetatpuffer (0,15 M, Gegenion Natrium, 6 M in Guanidinhydrochlorid), zugegeben. Nach 16 Stunden im Dunklen bei Raumtemperatur wurde das Produkt durch präparative HPLC isoliert und durch analytische HPLC und MALDI-TOF-Massenspektrometrie charakterisiert.
Das Umkehrphasen-HPLC-Chromatogramm und die massenspektrometrische Analyse dieses EMP-Dimers verwendete die MALDI-TOF-Methode (welche zu einfach protonierten Spezies führt), da das Spektrum für eine Analyse an der Elektrospray-Quadrupolmaschine (welche zu mehrfach protonierten Spezies führt) zu komplex war.
Frühere Arbeiten mit solchen Dimeren (Johnson et al., Chemistry & Biology, oben), die mit handelsüblichem PEG von dem gleichen Lieferanten durchgeführt wurden, zeigten eine ED50 von 0,1 nM in einem EPO-abhängigen Zellproliferationsassay, 1000fach niedriger als die des Peptidmonomers. Trotz seines reinen Chromatogramms zeigte das Massenspektrum mehr als 40 Komponenten, die sich jeweils durch die PEG-Wiederholungseinheit, -CH₂CH₂O-, einen Abstand von 44 amu unterschieden. Es war nicht möglich, die einzelnen Komponenten durch HPLC zu trennen. Der Massenpeak im Zentrum der Verteilung (8024 amu) entsprach einem Molekül mit 78 -CH₂CH₂O-Gruppen, was mit der erklärten relativen Molekülmasse des PEG übereinstimmt (3400, d. h. 77 Wiederholungseinheiten, 231 Bindungen, wobei hier festgestellt wurde, dass ±20 Wiederholungseinheiten oder 60 Bindungen vorhanden sind).
B. Synthese eines EMP-Dimers (PEG mit genauer Länge) und HPLC/Massenspektrometrie-Analyse
Ein EMP-Dimer, das in der vorliegenden Beschreibung als das "EMP-Dimer mit genauer Länge" bezeichnet wird, wurde unter Ver wendung einer der erfindungsgemäßen Polyamidketten auf PEG-Basis mit genauer Länge hergestellt (in der vorliegenden Beschreibung als das "EMP-Dimer mit genauer Länge" bezeichnet). Das EMP-Dimer mit genauer Länge hatte eine Länge, die länger war als die des handelsüblichen EMP-Dimers.
Das EMP-Dimer mit genauer Länge basierte auf dem symmetrischen Polyamidlinker, -('PEG'-succ)₆-'PEG'-(succ-'PEG')₆-, und wurde wie folgt synthetisiert.
Der PEG-Polyamidlinker, Boc-Ser(Bzl)-('PEG'-succ)₆-OH wurde an Sasrin-Harz (Bachem) unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Methoden hergestellt. Das Material wurde mit 1% TFA in DCM, wie von dem Harzhersteller empfohlen, von dem Harz abgespalten und durch präparative HPLC gereinigt. Zu einer Lösung von Boc-Ser(Bzl)-(PEG-succ)₆-OH (9,7 mg, 4,4 μmol) in NMP wurden HATU-Reagens (1,6 mg, 4,4 μmol) und eine Lösung von DIEA, 10fach verdünnt in NMP (15 μl, 8,8 μmol) unter Rühren zugegeben. Nach 5 min, welche der Voraktivierung der Carbonsäuregruppe entsprachen, wurde der aktive Ester mit dem Diamin auf PEG-Basis (4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin, 'PEG', 100fach mit NMP verdünnt, 24 μl, 1,15 μmol) über Nacht aminolysiert. Das resultierende symmetrische Boc-Ser(Bzl)-('PEG'-'succ')₆-'PEG'-(succ-'PEG')₆-Ser(Bzl)-Boc wurde direkt durch praparative HPLC gereinigt (Ausbeute 7 mg, 1,6 μmol, 73%). Die zwei Boc-Gruppen und Benzylgruppen wurden mit der standardmäßigen TFMSA-Spaltungsprozedur entfernt (300 μl TFA während 4 min, gefolgt von der Zugabe von 30 μl TFMSA während 25 min). Das Produkt wurde mit kaltem Diethylether (an seinem Schmelzpunkt, ein wenig fester Ether war vorhanden) ausgefällt, dreimal mit kaltem Ether gewaschen und in einem Exsikkator getrocknet. Die Ser-Reste des Linkers Ser-('PEG'-succ)₆-'PEG'-(succ-'PEG')₆-Ser, von dem die Schutzgruppen entfernt worden waren, wurden zu Glyoxylylfunktionen (O=CH-CO-) oxidiert, wie es in Rose, J. Am. Chem., Soc, oben, beschrieben ist. Das zweite Ser ist in kursi ver Schrift gezeigt, um die Tatsache anzudeuten, dass der Linker symmetrisch ist: das erste Ser ist NH₂-CH(CH₂OH)CO- und das zweite Ser ist -CO-CH(CH₂OH)-NH₂, d. h. in der ungewöhnlichen Richtung gezeigt.
Der resultierende Dialdehydlinker wurde durch HPLC wieder aufgereinigt. Eine Lösung des Aminooxyacetyl-EMP-peptidderivats mit seiner gebildeten Disulfidbindung, (96 μl, 21,3 mM in 0,1 M Acetatpuffer, pH 4,0, Gegenion Natrium; ein 1,5facher Überschuss über die Aldehydgruppen) wurde mit dem Dialdehyd (200 μl, 3,5 mM in Wasser) vermischt und bei Raumtemperatur 48 Stunden reagieren gelassen. Das dimere Produkt: Amid-GRLPQCVWTMPGMHCAYLGG-COCH₂ON=CH-CO-('PEG'-succ)₁₂-'PEG'-CH=NOCH₂CO-GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-amid (ein Dimer von SEQ ID NO: 1) wurde durch Umkehrphasen-HPLC mit einer Ausbeute von 1,2 mg (20%) isoliert und durch analytische HPLC und Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie charakterisiert. Kursive Schrift wird verwendet, um anzudeuten, dass eines der Peptide in der ungewöhnlichen Richtung (C zu N-Ende statt der herkömmlichen N zu C-Ende) abgebildet ist.
Wenngleich das EMP-Dimer mit genauer Länge mehr Bindungen als das handelsübliche EMP-Dimer (243 gegenüber 231) und 42 -CH₂CH₂O-Einheiten aufwies, war das EMP-Dimer mit genauer Länge viel homogener. In dem Massenspektrum gab es kein Anzeichen für ein Material mit einer -CH₂CH₂O-Wiederholung zu wenig (44 Masseneinheiten). Die Signale, welche etwas stärker waren als das Hauptsignal, waren auf eine Kationisierung mit Natrium und Kalium zurückzuführen, ein übliches Merkmal von Elektrospray-Ionisations-Massenspektren. Die gefundene Masse (8417) lag nahe an dem theoretischen Wert von 8420. Es erwies sich als möglich, Dimere mit längeren und kürzeren Ketten: 16 und 4-'PEG'-succ- Wiederholungseinheiten herzustellen. Es wurden ausgezeichnete Chromatogramme und Massenspektren unter Verwendung von Spacern bis zu -('PEG'-succ)₈-'PEG'-(succ-'PEG')₈- erhalten.
BEISPIEL 12
EMP-Dimere mit genauer Länge mit Linkern von unterschiedlichen Längen wurden hinsichtlich der EPO-Aktivität in einem Zellkulturassay (menschliche leukämische UT-7 EPO-abhängige Zelllinie) getestet. Rekombinantes EPO und die EMP-Monomerpeptide wurden als Kontrollen eingeschlossen, wobei das Monomer in Tabelle 1 als "mono" bezeichnet wird.
Der kurze Linker in dem EMP-Dimer mit genauer Länge (in Tabelle 1 mit "s" bezeichnet) war -('PEG'-succ)₂-'PEG'-(succ-'PEG')₂-. Der mittlere Linker (in Tabelle 1 mit "m" bezeichnet) war -('PEG'-succ)₆-'PEG'-(succ-'PEG')₆- und der lange Linker (in Tabelle 1 mit "1" bezeichnet) war -('PEG'-succ)₈-'PEG'-(succ-'PEG')₈-.

Tabelle gibt die mittleren OD-Werte für jede Peptidprobe wieder. Tabelle 1

Konzentration (μM)	CD m	CD s	CD 1	CD mono
1 × 10^-1	0,884	0,930	0,891	0,878
3,33 × 10^-2	0,902	0,925	0,890	0,673
1,11 × 10^-2	0,876	0,935	0,906	0,373
3,70 × 10^-3	0,888	0,919	0,931	0,210
1,24 × 10^-3	0,916	0,798	0,838	0,078
4,12 × 10^-4	0,805	0,756	0,848	0,078
1,37 × 10^-4	0,760	0,534	0,835	0,089
4,57 × 10^-5	0,637	0,299	0,695	"
1,52 × 10^-5	0,597	0,194	0,632	"
5,08 × 10^-6	0,712	0,171	0,525	"
1,69 × 10^-6	0,641	0,298	0,614	"
5,65 × 10^-7	0,469	0,163	0,547	"
1,88 × 10^-7	0,363	0,117	0,502	"
6,27 × ^10-8	0,350	0,114	0,356	"
2,09 × 10^-8	0,287	0,088	0,231	"
6,97 × 10^-9	0,280	0,089	0,193	"
2,32 × 10^-9	0,246	0,083	0,217	"
7,74 × 10^-10	---	0,099	0,194	"
2,58 × 10^-10	---	0,129	0,170	"
negative Kontrolle	0,089	0,076	0,074	0,090

Tabelle 2 gibt die mittleren CD-Werte für die rekombinante EPO-Probe wieder. Tabelle 2

EPQ (ng/ml) OD

50 0,917

16,7 0,920

5,56 0,885

1,85 0,878

0,617 0,650

0,206 0,362

0,0686 0,179

0,0229 0,124

0,00762 0,108

0,00254 0,101

negative Kontrolle 0,078
Aus den vorstehend wiedergegebenen Ergebnissen ging hervor, dass die ED₅₀-Werte (effektive Dosis, die 50% der maximalen Reaktion ergibt) wie in Tabelle 3 wiedergegeben waren. Tabelle 3

Material ED₅₀ (pM)

EMP-Monomer 20000

Rekombinantes EPO 25

EMP-s (kurzes Dimer) 100

EMP-m (mittleres Dimer) 1

EMP-l (langes Dimer) 0,1
Tabelle 3 zeigt, dass die EMP-Dimere, die mit mittleren und langen Polyamidketten verbunden sind, in dem Zellassay viel aktiver waren als der rekombinante Proteinstandard.
BEISPIEL 13
Das folgende Experiment untersuchte die Verwendung von verzweigten Strukturen mit anderen Polymeren als PEG, welche bei ihrer Konstruktion verwendet wurden.
Die erfindungsgemäßen Polyamide auf PEG-Basis wurden verwendet, um eine chemische Version des Peptabodys (Terskikh, et al., oben) zu synthetisieren, welche in der vorliegenden Beschreibung als ein "Chemobody" bezeichnet wird. Das monomere Peptid, das eine AoA-Gruppe trägt, H-ADGACRN-PWC-('PEG'-succ)₈-Lys(AoA)-Amid (SEQ ID NO: 6), wurde an Fmoc-Lys(Mtt)-MBHA-Harz (0,5 mmol) durch Standardmethoden (Fields, oben, und Rose, J. Am. Chem. Soc, oben) synthetisiert. Kurz gesagt, wurde die Fmoc-Schutzgruppe entfernt, es wurden 8 Zyklen von 'PEG'-succ durchgeführt, dann wurde Boc-Cys(4-MeBzl) an die endständige Aminogruppe gekoppelt. Die Mtt-Schutzgruppe wurde entfernt (mehrere Runden von 1% TFA in DON, bis die Lösung nicht länger gelb war) und die Aminogruppe mit Fmoc-OSu acyliert (2 mmol in 5 ml DMF mit N-Methylmorpholin als Base). Die Peptidkette wurde durch Boc-Chemie bis zum N-Ende verlängert. Die Fmoc-Schutzgruppe wurde mit 10% Piperidin in DMF 7 Minuten lang entfernt, da härtere Bedingungen zu einer Succinimidbildung bei Asp-Gly führten. Diese Piperidinbehandlung entfernt die Formylschutzgruppe von dem Trp-Indol. Die Aminogruppe wurde mit Boc-AoA-OSsu acyliert (0,6 mmol in 5 ml trockenem DMSO mit N-Methylmorpholin als Base, keine härteren Bedingungen oder eine Acylierung von Trp oder von dem N von Boc-NHOCH₂CO-findet statt). Nach der Abspaltung von dem Harz und der Entfernung der Schutzgruppen mit HF, der Reinigung durch HPLC, der Bildung einer Disulfidbindung mit Wasserstoffperoxid, wie es für das EMP-Peptid beschrieben ist, wurde das Produkt durch HPLC isoliert und durch analytische HPLC und Elektrospray-Ionisations- Massenspektrometrie charakterisiert: Masse gefunden 3709,1, theoretisch 3709,4.
Ein. vierwertiges Templat Ser-Lys(Ser)-Lys(Ser-Lys(Ser))-NHCH₂-CH₂SH wurde durch Standardmethoden, ausgehend von Fmoc-Cysteamin-Sasrin-Harz (Bachem) und Kuppeln von zwei Runden von Fmoc-Lys(Fmoc) und anschließend Boc-Ser(t-Bu) hergestellt. Nach der Entfernung der Schutzgruppen und Spaltung (270 mg Harz, 2,7 ml TFA, 30 min, filtriert, unter einem Stickstoffstrom bis zu einem kleinen Volumen eingedampft, mit kaltem Diethylether ausgefällt) wurde das Produkt durch HPLC gereinigt. Die Thiolgruppe wurde wie folgt alkyliert: zu einer Lösung von Phosphatpuffer (2,5 ml, 0,25 M Phosphat pH 7,0, 1 mM in EDTA) wurde zuerst 1 ml gereinigtes Templat (10 mM in Wasser) und unmittelbar danach 5-Iodacetaminofluorescein (Fluka, 1 ml, 10 mM in DMF) hineingemischt. Nach 90 min im Dunkeln wurde das Fluorescein-markierte Templat durch HPLC gereinigt: Ausbeute 7,8 mg, 66%. Nach der Oxidation der Ser-Reste und der Isolierung durch HPLC wurde das Tetra-glyoxylylfluorescein-markierte Templat (28 μl, 3,4 mM in Wasser) mit H-ADGACRN-PWC-('PEG'-succ)₈-Lys(AoA)-Amid (SEQ ID NO: 6) (Disulfidform, 66 μl, 6 mM in 0,1 M Acetatpuffer, pH 4,0, Gegenion Natrium, 1,04facher Überschuss über jede vorhandene Aldehydgruppe) bei Raumtemperatur 48 Stunden oximiert. Das Produkt wurde durch HPLC gereinigt und durch analytische HPLC und Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie charakterisiert: [Peptid-('PEG'-succ)₈-Lys(oxim)amid]₄Lys₂-Lys-NHCH₂CH₂S-CH₂C(O)NH-fluorescein, wobei das "Peptid" -ADGACRNPWC- (SEQ ID NO: 6) ist.
Analog zu dem Peptabody von Terskikh et al., oben, wird dieses tetramere Produkt als ein tetramerer Chemobody bezeichnet. Das HPLC-Chromatogramm und Massenspektrum dieses tetrameren Chemobodys zeigte vier Kopien des von einem Phagen abgeleiteten Peptids ADGACRNPWC- (SEQ ID NO: 6) (mit einer Disulfidbindung zwischen den Cysteinen), welche an die BCL₁- Tumorzelllinie banden (Terskikh, et al., oben). Im Vergleich zu dem Peptabody von Terskikh, welcher fünf Peptide, eine Linkerlänge von 72 Bindungen und keine Reportergruppe für eine relative Molekülmasse von 85000 aufweist, hat der Chemobody 4 bindende Peptide, eine PEG-Polyamid-Spacerlänge von 167 Bindungen und eine Fluorescein-Reportergruppe für eine relative Molekülmasse von 15858 (gefunden; nahe am theoretischen Wert 15839). Ein kleines Signal bei der Masse 15521 entsprach einer sehr geringfügigen Komponente mit einer einzigen -'PEG'-succ-- Wiederholungseinheit, die von den vorhandenen 32 fehlte.
Solche Deletionen sind in der Festphasenpeptidsynthese üblich und wie es bei einer standardmäßigen Peptidchemie der Fall ist, kann man annehmen, dass eine Optimierung der Kupplungsschritte (höhere Konzentrationen, längere Zeiten, höhere Temperaturen, bessere Lösungsmittel, Additive wie 4,4'-Dimethylaminopyridin) noch längere Ketten ergeben würden, insbesondere, da es bei diesen sterisch ungehinderten und sehr löslichen Verbindungen keine der schwierigen Sequenzen geben sollte, die bei Peptiden vorkommen und im Allgemeinen mit der Bildung der beta-Struktur verbunden sind.
Von einem Phagen abgeleitete Peptide können somit ohne die mit der rekombinanten Expression und Rückfaltung verbundenen Probleme auf einem vollkommen synthetischen Molekül an den Enden von biokompatiblen Ketten präsentiert werden. Durch das vorstehend beschriebene Verfahren wurden Chemobodies mit ADGACRNPWC (SEQ ID NO: 6) sowie mit dem Phagenpeptid SVWRWLPYDKYE (SEQ ID NO: 3) leicht hergestellt, wogegen die entsprechenden Peptabodies mit der entsprechenden Sequenz in löslicher Form nicht hergestellt werden konnten (Terskikh, et al., oben). Ein breiter Bereich von genau hergestellten Polymeren und mehrwertigen Strukturen, wie etwa der Chemobody, können nun durch die in der vorliegenden Beschreibung beschriebenen Verfahren ohne Weiteres synthetisiert werden.

Claims

Verzweigte wasserlösliche Polyamidzusammensetzung, umfassend zwei oder mehr wasserlösliche organische auf Polyamid basierende Ketten mit einer vorherbestimmten Anzahl sich wiederholender Einheiten, wobei die auf Polyamid basierenden Ketten durch einen multivalenten Linker mit einer Einheit verbunden sind, die ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus einem Zielmolekül, einer terminalen Gruppe, einer Schutzgruppe und einer reaktiven Gruppe, wobei die wasserlöslichen organischen auf Polyamid basierenden Ketten eine sich wiederholende Einheit der Formel: -{NH-Y-NH-CO-X-CO}_n aufweisen, wobei X und Y divalente organische Radikale ohne reaktive funktionelle Gruppen sind oder abwesend sind, und gleich oder unterschiedlich sein können, und sich unabhängig voneinander in jeder der sich wiederholenden Einheiten unterscheiden können; n eine ganze Zahl von 2 bis 100 ist; und wobei die wasserlöslichen organischen auf Polyamid basierenden Ketten eine ausreichende Anzahl an wasserlöslichen sich wiederholenden Einheiten aufweisen, um die Zusammensetzung wasserlöslich zu machen.
Verzweigte wasserlösliche Polyamidzusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der multivalente Linker einen oder mehrere divalente Linker oder Platzhalter umfasst.
Verzweigte wasserlösliche Polyamidzusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere der wasserlöslichen Polyamidketten durch den divalenten Linker oder Platzhalter kovalent mit dem multivalenten Linker verbunden ist.
Verzweigte wasserlösliche Polyamidzusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere. von dem Zielmolekül, der terminalen Gruppe, der Schutzgruppe und der reaktiven Gruppe durch den divalenten Linker oder Platzhalter kovalent mit dem multivalenten Linker verbunden sind.
Verzweigte wasserlösliche Polyamidzusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die wasserlöslichen Polyamidketten eine terminale Endgruppe umfassen, welche eine Einheit ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Zielmolekül, einer terminalen Gruppe, einer Schutzgruppe und einer reaktiven Gruppe aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die divalenten organischen Radikale ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus -(CH₂)₂-, (CH₂)₆, -(CH₂)₃-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-, -[(CH₂)₃-O-(CH₂)₂-(CH₂)₂-O-(CH₂)₃]-, -CH₂-O-CH₂- und -CH₂-N(CH₃)-CH₂-.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kette die Formel: -{NH-Y-NH-CO-X-CO}_n-{NH-Y'-NH}- aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Kette die Formel: -{NH-(CH₂)₃-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-NH-CO-(CH₂)₂-CO}_n-{NH-(CH₂)₃-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-NH}- aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Kette die Formel: -{NH-(CH₂)₆-NH-CO-(CH₂)₂-CO-NH-(CH₂)₃-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-NH-CO-(CH₂)₂-CO}_z-NH-(CH₂)₆-NH-CO-(CH₂)₂-CO-NH-(CH₂)₃-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-NH- aufweist, wobei z eine ganze Zahl zwischen 1 und 49 ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kette die Formel: -{NH-Y-NH-CO-X-CO}_n- aufweist.
Kette nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Kette die Formel: -{NH-CH₂-(CH₂CH₂O)₃-(CH₂)₃-NH-CO-(CH₂)₂-CO}_n- aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Kette die Formel: -{NH-(CH₂)₆-NH-CO-(CH₂)₂-CO}_n aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Kette die Formel: -{NH-(CH₂)₆-NH-CO-(CH₂)₂-CO-NH-(CH₂)-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-NH-CO-(CH₂)₂-CO}_n- aufweist.
Verzweigte wasserlösliche Polyamidzusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung die Formel (U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}_n-{NH-Y'-NH}_n')_q-V aufweist, wobei Y' ein divalentes organisches Radikal ohne reaktive funktionelle Gruppen ist oder abwesend ist und verglichen mit den Substituenten X und Y gleich oder unterschiedlich ist, und sich unabhängig voneinander in jeder der Ketten unterscheiden kann; n' 0 oder 1 ist; q eine ganze Zahl von 2 bis 10 ist; U und V ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einem Zielmolekül, einer terminalen Gruppe, einer Schutzgruppe und einer reaktiven Gruppe, und wobei V den multivalenten Linker umfasst.
Verzweigte wasserlösliche Polyamidzusammensetzung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass U einen divalenten Linker oder Platzhalter umfasst, der die auf Polyamid basierende Kette mit einem oder mehreren von dem Zielmolekül, der terminalen Gruppe, der Schutzgruppe und der reaktiven Gruppe verbindet.
Verzweigte wasserlösliche Polyamidzusammensetzung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der divalente Linker oder Platzhalter eine wasserlösliche organische auf Polyamid basierende Kette umfasst, welche eine bestimmte Anzahl sich wiederholender Einheiten aufweist.
Verzweigte wasserlösliche Polyamidzusammensetzung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass V ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: einem monovalenten oder multivalenten Zielmolekül mit einem optionalen divalenten Platzhalter oder Linker; einer Peptidkette; einer Reportergruppe mit einem multivalenten Linker; einer reaktiven Gruppe; und einer terminalen Gruppe mit einem multivalenten Linker, wobei die terminale Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus OH, -NH₂, -H und -Z-Q-Träger, wobei Z ein divalenter Linker oder Platzhalter ist oder abwesend sein kann, Q ein Linker oder ein Zielmolekül ist und der Träger eine Festphase, Matrix oder Oberfläche ist.
Verzweigte wasserlösliche Polyamidzusammensetzung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass Z ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -NH- und -O-.
Zusammensetzung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die divalenten organischen Radikale ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: -(CH₂)₂-, -(CH₂)₆, -(CH₂)₃-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-, -[(CH₂)₃-O-(CH₂)₂-(CH₂)₂-O-(CH₂)₃]-, -CH₂-O-CH₂- und -CH₂-N(CH₃)-CH₂-.
Zusammensetzung nach Anspruch 14 mit der Formel: [U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}_n{NH-Y'-NH}]_q-V.
Zusammensetzung nach Anspruch 20 mit der Formel: [U-{NH-(CH₂)₃-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-NH-CO-(CH₂)₂-CO}_n-{NH-(CH₂)₃-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-NH}]_q-V.
Zusammensetzung nach Anspruch 20 mit der Formel: [U-{NH-(CH₂)₆-NH-CO-(CH₂)₂-CO-NH-(CH₂)₃-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-NH-CO(CH₂)₂-CO}-NH-(CH₂)₆-NH-CO-(CH₂)₂-CO-NH-(CH₂)₃-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-NH]_q-V, wobei z eine ganze Zahl von 1 bis 49 ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 14 mit der Formel: [U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}_n]_q-V.
Zusammensetzung nach Anspruch 23 mit der Formel: [U-{NH-CH₂-(CH₂CH₂O)₃-(CH₂)₃-NH-CO-(CH₂)₂-CO}]_q-V.
Zusammensetzung nach Anspruch 23 mit der Formel: [U-{NH-(CH₂)₆-NH-CO-(CH₂)₂-CO}_n]_q-V.
Zusammensetzung nach Anspruch 23 mit der Formel [U-{NH-(CH₂)₆-NH-CO-(CH₂)₂-CO-NH-(CH₂)₃-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-NH-CO-(CH₂)₂-CO}_n]_q-V.
Zusammensetzung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Zielmolekül ausgewählt ist aus der Gruppe beste hend aus Proteinen, Polypeptiden, Peptiden, Nukleinsäuren, Liposomen und therapeutischen Agenzien.
Zusammensetzung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Zielmolekül ein Peptid ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -GGLYACHMGPMTWVCQPLRG- (SEQ ID NO: 1); -SVWRWLPYDKYE- (SEQ ID NO. 3); und -ADGACRNPWC- (SEQ ID NO: 6).
Verzweigte wasserlösliche Polyamidzusammensetzung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Zielmolekül ein Peptid von weniger als 50 Aminosäureresten mit einem optionalen divalenten Platzhalter oder Linker ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die divalenten organischen Radikale ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus -(CH₂)₂-, (CH₂)₆, -(CH₂)₃-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-, -[(CH₂)₃-O-(CH₂)₂-(CH₂)₂-O-(CH₂)₃]-, -CH₂-O-CH₂- und -CH₂-N(CH₃)-CH₂-.
Zusammensetzung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass der optionale divalente Linker -COCH₂ON=CH-CO- ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass das Zielmolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -GGLYACHMGPMTWVCQPLRG- (SEQ ID NO: 1); -SVWRWLPYDKYE- (SEQ ID NO. 3); und -ADGACRNPWC- (SEQ ID NO: 6).
Zusammensetzung nach Anspruch 29 mit der Formel: (Peptid)-Oxim-("PEG"-succ)_n-"PEG"-Oxim-(Peptid), dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid die Sequenz -GGLYACHMGPMTWVCQPLRG- (SEQ ID NO: 1) aufweist; Oxim -COCH₂ON=CHC(O)- ist; "PEG" die Formel -NH-(CH₂)₃-(OCH₂CH₂)₃- CH₂-NH- darstellt; succ die Formel -CO-(CH₂)₂-CO- darstellt und n 12 oder 16 ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 29 mit der Formel: Peptid-Lys(NH₂OCH₂CO-("PEG"-succ)₈)-NH₂, wobei das Peptid die Sequenz -SVWRWLPYDKYE- (SEQ ID NO. 3) aufweist; "PEG" die Formel -NH-(CH₂)₃-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-NH- darstellt und succ die Formel -CO-(CH₂)₂-CO- darstellt.
Zusammensetzung nach Anspruch 29 mit der Formel: (Peptid)-Oxim-("PEG"-succ)₂-Lys((Peptid)-Oxim-("PEG"-succ)₂)Amid, wobei das Peptid die Sequenz -GGLYACHMGPMTWVCQPLRG- (SEQ ID NO: 1) aufweist; Oxim -COCH₂ON=CHC(O)- ist; "PEG" die Formel -NH-(CH₂)₃-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-NH- darstellt und succ die Formel -CO-(CH₂)₂-CO- darstellt.
Zusammensetzung nach Anspruch 29 mit der Formel: (Peptid)-("PEG"-succ)₈-Lys(Aminooxyacetyl)-Amid, wobei das Peptid die Sequenz -ADGACRNPWC- (SEQ ID NO: 6) aufweist; "PEG" die Formel -NH-(CH₂)₃-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-NH- darstellt und succ die Formel -CO-(CH₂)₂-CO- aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 29 mit der Formel: Peptid-("PEG"-succ)₈-Lys(Oxim)Amid]₄Lys₂Lys-NHCH₂CH₂S-CH₂C(O)NH-Fluorescein, wobei das Peptid die Sequenz -ADGACRNPWC- (SEQ ID NO: 6) aufweist, Oxim -COCH₂ON=CHC(O)- ist, "PEG" die Formel -NH-(CH₂)₃-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-NH- darstellt und succ die Formel -CO-(CH₂)₂-CO- darstellt.
Wasserlösliche organische auf Polyamid basierende homogene Zusammensetzung mit der Formel: die Sequenz -GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-(SEQ ID NO: 1) aufweist; Oxim-COCH₂ON=CHC(O)- ist; "PEG" die Formel -NH-(CH₂)₃- (OCH₂CH₂)₃-CH₂-NH- darstellt; succ die Formel -CO-(CH₂)₂-CO- darstellt und n 12 oder 16 ist.
Wasserlösliche organische auf Polyamid basierende homogene Zusammensetzung mit der Formel: Peptid-Lys (NH₂OCH₂CO-("PEG"-succ)₈)-NH₂, wobei das Peptid die Sequenz -SVWRWLPYDKYE- (SEQ ID NO. 3) aufweist; "PEG" die Formel -NH-(CH₂)₃-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-NH- darstellt und succ die Formel -CO-(CH₂)₂-CO- darstellt.
Wasserlösliche organische auf Polyamid basierende homogene Zusammensetzung mit der Formel: (Peptid)-Oxim-("PEG"-succ)₂-Lys((Peptid)-Oxim-("PEG"-succ)₂)amid, wobei das Peptid die Sequenz -GGLYACHMGPMTWVCQPLRG- (SEQ ID NO: 1) aufweist; Oxim -COCH₂ON=CHC(O)- ist; "PEG" die Formel -NH-(CH₂)₃-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-NH- darstellt und succ die Formel -CO-(CH₂)₂-CO- darstellt.
Wasserlösliche organische auf Polyamid basierende homogene Zusammensetzung mit der Formel: (Peptid)-("PEG"-succ)₈-Lys(Aminooxyacetyl)-Amid, wobei das Peptid die Sequenz -ADGACRNPWC- (SEQ ID NO: 6) aufweist; "PEG" die Formel -NH-(CH₂)₃-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-NH- darstellt und succ die Formel -CO-(CH₂)₂-CO- darstellt.
Wasserlösliche organische auf Polyamid basierende homogene Zusammensetzung mit der Formel: Peptid-("PEG"-succ)₈-Lys(Oxim)Amid]₄Lys₂Lys-NHCH₂CH₂S-CH₂C(O)NH-Fluorescein, wobei das Peptid die Sequenz -ADGACRNPWC- (SEQ ID NO: 6) aufweist, Oxim -COCH₂ON=CHC(O)- ist, "PEG" die Formel -NH-(CH₂)₃-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-NH- darstellt und succ die Formel -CO-(CH₂)₂-CO- darstellt.
Verzweigte wasserlösliche Polyamidzusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die terminale Endgruppe einen divalenten Linker oder Platzhalter umfasst, und ein oder mehrere von dem Zielmolekül, der terminalen Gruppe, der Schutzgruppe und der reaktiven Gruppe durch den divalenten Linker oder Platzhalter kovalent mit einer oder mehreren der wasserlöslichen Polyamidketten verbunden sind.
Verzweigte wasserlösliche Polyamidzusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die wasserlöslichen organischen auf Polyamid basierenden Ketten homogen sind.
Verzweigte wasserlösliche Polyamidzusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung homogen ist.
Verzweigte wasserlösliche Polyamidzusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der multivalente Linker ein oder mehrere Lysinreste umfasst oder der multivalente Linker einen Lysin-Baum umfasst oder der Lysin-Baum ein Radikal der Formel -Lys₂-Lys- umfasst, wobei Lys Lysin ist.
Verzweigte wasserlösliche Polyamidzusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere der divalenten Radikale symmetrische Radikale sind, oder die divalenten organischen Radikale ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus substituierten, unsubstituierten, verzweigten und linearen, aliphatischen und aromatischen Gruppen, und optional Heteroatome enthalten können, oder die divalenten organischen Radikale ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Phenyl, einem Heteroatom enthaltenden Phenyl, einer C1- bis C10-Alkylgruppe, einer Heteroatom enthaltenden C1- bis C10-Alkylgruppe und eine Kombination daraus, oder die divalenten organischen Radikale ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus -(CH₂)₂-, (CH₂)₆, -(CH₂)₃-(OCH₂CH₂)₃-CH₂-, -(CH₂)₃-O-(CH₂)₂-(CH₂)₂-O-(CH₂)₃)-, -CH₂-O-CH₂- und -CH₂-N(CH₃)-CH₂-.
Verzweigte wasserlösliche Polyamidzusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die sich wiederholenden Einheiten auf Polyethylenglykol basierende monomere Einheiten sind, oder die auf Polyethylenglykol basierenden monomeren Einheiten ein divalentes organisches Radikal der Formel -a-(OCH₂CH₂)_p-b- umfassen, wobei a und b divalente organische Radikale ohne reaktive funktionelle Gruppen sind, die gleich oder unterschiedlich und anwesend oder abwesend sein können, und wobei p eine ganze Zahl ist, die klein genug ist, so dass die monomere Einheit einen diskreten p-Wert anstelle eines Bereichs aufweist.
Verzweigte wasserlösliche Polyamidzusammensetzung nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass ein p eine ganze Zahl ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 1 bis 5 ist, oder das divalente organische Radikal ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -(CH₂)₃-(OCH₂CH₂)₃-CH₂- und -(CH₂)₃-O-(CH₂)₂-(CH₂)₂-O-(CH₂)₃-. Verzweigte wasserlösliche Polyamidzusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Zielmolekül ein monovalentes oder multivalentes Zielmolekül ist, dessen Eigenschaften modifiziert oder verbessert sind, oder das Zielmolekül ein modifiziertes Zielmolekül umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem festen Träger, einer Aminosäure, einer Reportergruppe, einem Peptid, einem Polypeptid, einem Protein, einer Nukleinsäure, einem therapeutisches Agens und einem Liposom.
Verzweigte wasserlösliche Polyamidzusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Schutzgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Boc- und Fmoc-, Butyl- und auf Benzyl basierenden Schutzgruppen.
Verzweigte wasserlösliche Polyamidzusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die reaktive Gruppe eine reaktive funktionelle Gruppe ist, oder die reaktive funktionelle Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Amino, Carboxyl, Thiol, Alkylhalid, Hydroxy und Aldehyd, oder die reaktive Gruppe für die Kreuzvernetzung von Polymeren oder die Verbindung von Biomolekülen geeignet ist, oder die für die Kreuzvernetzung von Polymeren oder die Verbindung von Biomolekülen geeignete reaktive Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkylthiol, Bromoacetyl, Aminoacyl, Aminooxyacetyl, Glyoxylyl, Mercaptoacetyl und Mercaptopropionyl, oder die reaktive Gruppe eine reaktive Gruppe einer Aminosäure umfasst.
Verzweigte wasserlösliche Polyamidzusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, das die terminale Gruppe einen multivalenten Linker umfasst, oder die terminale Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -OH, -NH₂, -H und -Z-Q-Träger, wobei Z ein divalenter Linker oder Platzhalter ist oder abwesend ist, Q ein Linker oder ein Zielmolekül ist und der Träger eine Festphase, Matrix oder Oberfläche ist, oder die terminale Gruppe eine reaktive Gruppe umfasst, oder die reaktive Gruppe geschützt ist, oder die reaktive Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glyoxyl, Aldehyd, Aminooxyacetyl, Amino, Hydroxyl, Thiol und einer aliphatischen Acylgruppe, oder die terminale Gruppe. einer Aminosäure umfasst, oder die terminale Aminosäure-Gruppe orthogonal geschützt ist.
Verzweigte wasserlösliche Polyamidzusammensetzung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, das U ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: einem Zielmolekül, dessen Eigenschaften modifiziert oder verbessert werden und welches einen optionalen divalenten Platzhalter oder Linker aufweist; einer terminalen Gruppe; einer Peptidkette, einer Schutzgruppe; einem Träger und einer reaktive Gruppe.
Verzweigte wasserlösliche Polyamidzusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 oder 54, wobei der optionale divalente Linker ein Oximlinker ist, oder wobei der optionale divalente Linker ein Oximlinker mit der Formel -COCH₂ON=CH-CO ist.
Verzweigte wasserlösliche Polyamidzusammensetzung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, das Q ein Linker ist, enthaltend eine spaltbare Einheit oder ein Zielmolekül, das mit einem Linker an den Träger gebunden ist, der eine spaltbare Einheit enthält, oder wobei Q ein Linker ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -CH₂(C₆H₃(OCH₃))-O-CH₂-, -C(O)O-CH₂(C₆H₃(OCH₃)-O-CH₂-, einem Aminoacetyl, -CO-CH₂ON=CH-CO und -CH=NOCH₂-CO-.