DE69932530T2

DE69932530T2 - Verfahren zur überführung von sucrose in glukose

Info

Publication number: DE69932530T2
Application number: DE69932530T
Authority: DE
Inventors: J. Steven Athens CATANI; A. Stephen Gladwyne ROTH; J. Edward Furlong MCGUIRE; L. Juan Athens NAVIA
Original assignee: Neose Technologies Inc
Current assignee: Neose Technologies Inc
Priority date: 1998-11-19
Filing date: 1999-02-05
Publication date: 2007-08-09
Anticipated expiration: 2019-02-06
Also published as: KR20010052148A; ZA997012B; NZ505281A; CA2318340A1; BR9907027A; AR021353A1; HUP0102675A2; US5998177A; EP1129210B1; EP1129210A1; JP2002530116A; IL137072A0; DE69932530D1; ATE334222T1; CN1195866C; WO2000031287A1; TW585920B; CN1288484A; EP1129210A4

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung handelsüblicher Mengen von Glukose aus Sucrose, sowie auf einen Reaktor zur Ausführung des Verfahrens. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung von Glukose aus Sucrose, indem Sucrose mit einer β-2,1-Fructosyltransferase und einer β-2,6-Fructosyltransferase in Kontakt gebracht wird und anschließend Glukose und ein verzweigtes Fructan isoliert werden, wodurch die Herstellungseffizienz erhöht wird.
Beschreibung des Hintergrunds
Glukose ist ein Saccharid, das überall in der Natur vorkommt, entweder als Monosaccharid oder in Polysaccharide eingebettet. Glukose wird klinisch als Flüssigkeits- und Nährstoff-Ergänzung und als Karbonquelle bei der Kultivierung von Mikroorganismen verwendet, und ist als Nahrungsmittelzusatz weit verbreitet.
Glukose wird kommerziell aus Stärke hergestellt (Dean, Gottfried, Advan. Carbohyd. Chem. 5, 127 (1950) sowie durch saure Hydrolyse von Sucrose. Trotz der Verfügbarkeit der Ausgangsmaterialien bei der Herstellung von Glukose sind die Kosten für dieses Material im Vergleich zu den Kosten der Ausgangsmaterialien hoch. Demgemäß können die kommerziellen Synthesen von Glukose verbessert werden.
Fructane sind überall in der Natur vorhanden (Science and Technology of Fructans, 1993 ed. M. Suzuki und N.J. Chatterton, CRS Press, Inc.). In Pflanzen sind vier Fructane beschrieben: 1) Inulin, ein Fructan mit 2,1-Bindung, das man hauptsächlich in Dikotylen wie z.B. Topinambur und Zichorienwurzeln findet; 2) Levan oder Phlein, ein Fructan mit 2,6-Bindung, das man bei einigen Monokotylen wie z.B. Timotheusgras findet; 3) ein 2-1- und 2,6-verzweigtes Fructan, das man in Monokotylen wie z.B. Gerste, blaue Agave und Weizen findet; 4) ein Fructan neoseries, eine Fructose mit 2,1- und 2,6-Bindung an die Glukose. Die Glukose ist in diesen Molekülen innenliegend, statt am Ende. Fructosereste werden dann mit 2,1- und 2,6-Bindung mit der endständigen Fructose verknüpft, so dass eine komplexe Struktur (Spargel) entsteht. Viele Pflanzen erzeugen mehr als eines dieser Fructane.
In Hefe und Pilzen wurden Fructane mit 2,1-Bindung gefunden.
In Bakterien sind zwei Fructane beschrieben: 1) ein Inulin 2,1-Fructan aus Streptococcus mutans und 2) ein Levan 2,6- Fructan aus Bacillus subtilis, Zymomonas mobilis, und vielen anderen.
Inuline bestehen aus Fructoseketten mit β-2,1-Bindung, die mit einem α D-Glukosid verknüpft sind; sie weisen eine lineare Struktur auf und enthalten typischerweise viele β-O-Fructofuranose-Einheiten. Die durchschnittliche Kettenlänge und Molkulargewichtsverteilung hängt ab von der Pflanzenart, der Wachstumsphase und dem Herstellungsverfahren. Durchschnittliche Kettenlängen von 10 bis 25 sind üblich; in diesem Fall umfassen die einzelnen Einheiten ca. 9 bis 24 Fructoseeinheiten.
Verzweigte Inuline wurden berichtet, die eine lineare Kette von Fructoseketten mit β-2,1-Bindung aufweisen, verknüpft mit einem α-D-Glukosid, mit daran verzweigten Fructoseeinheiten mit β-2,6-Bindung. Es wurde berichtet, dass derartiges verzweigtes Inulinmaterial aus dem Saft der blauen Agavenpflanze isoliert wurde (G.O. Aspinall und P.C. Das Gupta, Proceeding of the Chemical Society 1959 718-722 und M.N. Satyanarayana, Indian J. of Biochem and Biophys. (1976) 13: 408-412) sowie aus Gerstenblättern (Simmen et al., Plant Physiol. (1993) 101: 459-468).
Die Eigenschaften eines Inulins können je nach Kettenlänge und Grad der Verzweigung variieren. Zusammensetzungen mit linearen Kurzketten-Inulinen mit einem Polymerisierungsgrad von ca. 3 bis 7 Fructoseeinheiten werden als Zuckerersatz mit reduzierten Kalorien verwendet ( DE 4,003,140 ). Inuline mit längeren Ketten werden als Fett-Nachahmer verwendet, und verzweigte Fructane können für beides verwendet werden.
Coussement et al. offenbaren in U.S. 5,659,028 verzweigte Fructo-Oligosaccharide, die aus einer Kette bestehen, die hauptsächlich Fructoseeinheiten enthält und eine bevorzugte Kettenlänge von 2 bis 15 Einheiten aufweist, an denen eine oder mehrere Seitenketten, die hauptsächlich aus Fructoseeinheiten aufgebaut sind, befestigt sind.
Im Bereich der Glukoseherstellung berichten Nagle et al. in U.S. 4,637,835 über die Herstellung von Glukose und anderen Sacchariden aus einer α-Zellulose unter Verwendung eines Kalziumchlorid-Katalysators und von Wasserstoffionen.
Miyawaki et al. berichten in U.S. 5,524,075 über die Herstellung hochreiner Glukose durch Umwandeln flüssiger Stärke mit einem Enzym in Zucker (saccharifying).
Venkatasubramanian et al. berichten in U.S. 4,299,677 über die direkte Abscheidung von Fructose und Glukose aus einer Mischung von Glukose und Fructose durch Ionenaustauschmembranen.
Harada et al. berichten in U.S. 5,169,679 über die Verwendung von Fructanen, die hauptsächlich aus β-2,1- Bindungen mit einem Molekulargewicht von 2.000 bis 20.000.000 aufgebaut sind, als Nahrungsmittelzusätze, beispielsweise Auflockerungsmittel oder Fettersatzstoffe, bei der Herstellung von Nahrungsmitteln mit wenig Kalorien.
Kurz et al. berichten in U.S. 5,478,732 über ein Verfahren zum Erhalten von Zwischenketten-Inulinen (z.B. mit einem Polymerisierungsgrad von 10–12) durch die Behandlung roher Inulin-Suspensionen mit einem Hydrolase-Enzym. Während der Enzymbehandlung werden Kurzketten-Bestandteile zu Mono- und Disacchariden abgebaut, während Langketten-Inuline abgetrennt werden, und dann in trockene Form umgewandelt.
Adachi et al. berichten in U.S. 4,681,771, dass, wenn Sucrose (G-F) mit einem Enzym in Kontakt gebracht wird, das eine Fructoseüberführungsaktivität (nachfolgend Fructosyltransferase genannt) aufweist, eine Süßstoffrezeptur mit wenig Kalorien und niedriger Kariogenität erhalten wird, die Glukose, Sucrose, das Trisaccharid (GF₂), das Tetrasaccharid (GF₃) sowie kleinere Mengen von Fructose, Pentasaccharid (GF₄) und Hexasaccharid (GF₅) enthält. Die Menge des höheren linearen Inulins fällt dramatisch ab, wobei der Hauptanteil Inulin GF_2-3 ist.
Kono et al. berichten in U.S. 5,314,810, dass die Halbwertszeit einer immobilisierten Fructosyltransferase, die bei der Reaktion mit Sucrose verwendet wird, durch Unterstützung auf einem granulären Träger, z.B. einem Chitosan-Derivativ oder einem Anionenaustauscherharz, erhöht werden kann. Es wird berichtet, dass ein derartiges unterstütztes Enzym die industrielle Herstellung einer Süßstoffrezeptur mit niedriger Kariogenität ermöglicht.
Heady berichtet in U.S. 4,317,880 über die Herstellung neuartiger Fructosepolymere und hoher Fructosesirupe aus Sucrose durch die kombinierte Wirkung eines Fructo syltransferase-Enzyms und eines Glukose-Isomerase-Enzym-Präparats.
Weidenbach et al. beschreiben in U.S. 4,533,633 das Isomerisieren eines Teils eines Glukoseinhalts einer Glukose enthaltenden Lösung unter Verwendung von Glukose-Isomerase, die auf einem SiO₂-Träger immobilisiert ist.
Wrasidlo et al. beschreiben in U.S. 4,956,289 ein Enzymreaktorsystem, das auf dem Einfangen eines Enzyms in einer Hydrogelschicht basiert, die auf einem Stützmittel getragen wird.
Ein Verfahren zur Herstellung von Glukose und/oder Fructose aus Sucrose wird von Catani et al. in U.S. 5,952,205 berichtet.
Die gegenwärtigen Verfahren zur Herstellung von Glukose aus Sucrose leiden jedoch unter schlechter Effizienz, so dass die Herstellung kommerzieller Mengen von Glukose verbessert werden kann.
Außerdem verbleibt ein Bedarf an Verfahren zur Herstellung kommerzieller Mengen von Polysacchariden wie z.B. linearen und verzweigten Inulinen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung kommerzieller Mengen von Glukose aus Sucrose bereitzustellen.
Es ist weitere Aufgabe, ein Verfahren zur Herstellung kommerzieller Mengen von Glukose und eines verzweigten Fructans aus Sucrose herzustellen.
Die oben genannten Aufgaben können durch ein Verfahren zur Herstellung von Glukose gelöst werden, indem Sucrose mit einer β-2,1-Fructosyltransferase und einer β-2,6-Fructosyltransferase in einem Reaktor in Kontakt gebracht wird, um Reaktionsprodukte herzustellen, die Glu kose und ein verzweigtes Fructan enthalten; anschließend werden Glukose und ein verzweigtes Fructan isoliert.
Bei einer anderen Ausführungsform kann ein Verfahren zur Herstellung von Glukose erreicht werden, indem Sucrose nacheinander zunächst mit einer kettenverlängernden β-2,1-Fructosyltransferase und dann mit einer verzweigenden β-2,6-Fructosyltransferase in einem Reaktor in Kontakt gebracht wird, um Reaktionsprodukte zu erzeugen, die Glukose und ein verzweigtes Fructan enthalten, die nahezu frei von Sucrose sind.
Die vorliegende Erfindung basiert teilweise auf der Entdeckung, dass eine Kombination von Fructosyltransferasen verwendet werden kann, um mit höherer Effizienz Glukose aus Sucrose (GF) herzustellen. Außerdem können verzweigte Fructane, die während der Bildung von Glukose durch die Reaktion von Sucrose und zwei Fructosyltransferasen erzeugt werden, in kommerziellen Mengen isoliert werden, um den wirtschaftlichen Wert des vorliegenden Verfahrens noch weiter zu steigern.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Eine vollständigere Würdigung der Erfindung und vieler der damit einhergehenden Vorteile erfolgt ohne weiteres, wenn diese unter Bezug auf die folgende detaillierte Beschreibung in Zusammenhang mit den beigefügten Zeichnungen besser verstanden werden. Es zeigt:
1 ein Flussdiagramm, in dem Sucrose in Glukose und ein verzweigtes Fructan umgewandelt wird;
1a ein Flussdiagramm, in dem Sucrose in einem Reaktorgefäß, das mit einem externen Separator für Glukose ausgestattet ist, in Glukose und ein verzweigtes Fructan umgewandelt wird;
2 ein Flussdiagramm, in dem Sucrose in zwei Reaktorgefäßen in Glukose und ein verzweigtes Fructan umgewandelt wird;
2a ein Flussdiagramm, in dem Sucrose in zwei Reaktorgefäßen, die jeweils mit externen Separatoren für Glukose ausgestattet sind, in Glukose und ein verzweigtes Fructan umgewandelt wird.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Glukose ist ein kommerzielles Massenprodukt und wird zur Verwendung in der Pharmazie und bei Nahrungsmitteln verkauft. Ein verzweigtes Inulin-Fructan hat in organoleptischen Prüfungen gute Leistung gezeigt und besitzt Auflockerungseigenschaften, die für den Nahrungsmittelgebrauch ähnlich denen von Sucrose sind, ebenso wie nichtverzweigte Inuline, jedoch ohne beim Verbrauch übermäßig Gas zu induzieren. Ein verzweigtes Levan-Fructan weist für den Nahrungsmittelgebrauch ebenfalls gute Auflockerungseigenschaften auf.
In der vorliegenden Verwendung bezieht sich der Begriff „β-2,1-Fructosyltransferase" auf jedes Enzym oder alle Enzyme, das/die fähig ist/sind, Fructoseteile von Sucrose als Donor auf Sucrose oder ein anderes Saccharid (z.B. ein Fructan) als Akzeptor zu übertragen und β-2,1-Bindungen zu bilden. Die Fructoseeinheit wird bevorzugt in der Furanoseform übertragen. Außerdem ist es bevorzugt, dass die β-2,1-Fructosyltransferase für Fructose in Furanoseform als Akzeptor selektiv ist. In Pflanzen werden diese Enzymaktivitäten speziell von einer Sucrose:Sucrose-1-Fructosyltransferase (1-SST) und einer Fructan:Fructan-1-Fructosyltransferase (1-FFT) bereitgestellt (siehe Pollock et al. Annu Rev. Plant Physiol.
Plant Mol. Bio. 42, 77-101 (1991). Eine aus S mutans isolierte β-2,1-Fructosyltransferase hat die Aktivität, Fructose sowohl auf Sucrose als auch Fructan zu übertragen. Das Ergebnis der Überführung des Fructoseteils von Sucrose ist die Herstellung einer Glukoseeinheit. Die β-2,1-Fructosyltransferase kann Fructose an die C₁-Position einer endständigen Fructose überführen (z.B. lineare Kettenverlängerungen bilden) oder an die C₁-Position eines linearen Fructans (z.B. eines Levans mit β-2,6-Bindung), indem Verzweigungspunkte gebildet werden. Einige Fructosyltransferasen haben beide Aktivitäten (z.B. Kettenverlängerung und Verzweigung), einige Fructosyltransferasen haben jedoch nur eine Aktivität. Die Auswahl geeigneter Kettenverlängerungs- und/oder Verzweigungs-Fructosyltransferasen liegt im Können eines Durchschnittsfachmanns.
Nicht einschränkende Beispiele geeigneter β-2,1-Fructosyltransferasen können aus Mikroorganismen der Gattung Aspergilus, z.B. A. oryzae ATCC 20498; A. sp. ATCC 20524; A. Awamori, A. sydowi und A. niger ATCC 20611 erhalten werden; aus der Gattung Penicillium, z.B. P. jancezewskii ATCC 10115 und 26546; P. nigricans, aus der Gattung Fusarium, z.B. F. lini IAM 5011; und aus der Gattung Aureobasidium, z.B. A. pullulans ACTT 9348; Streptococcus mutans ATCC 25175; und A. pullulans var. melanigenum A-8 ATCC 20612. Geeignete Enzyme können auch aus Hefen und anderen Mikroorganismen erhalten werden, z.B. der Gattung Saccharomyces, z.B. S. cerevisiae; der Gattung Rhodotorula, z.B. R. lutinis; der Gattung Pichia, z.B. P. miso; der Gattung Hansenula, z.B. H. miso; der Gattung Candida, z.B. C. tropicali; und aus höheren Pflanzen, z.B. Spargel, Dahlienknollen, Zichorienwurzeln und Topi nambur, wie in JP-A-56-154967 und JP-B-59-53834 beschrieben ist.
Ein besonders bevorzugtes Enzym ist eine bakterielle β-2,1-Fructosyltransferase, die aus einem Gen erhalten werden kann, das aus Streptococcus mutans isoliert wird. Insbesondere S. mutans ATCC 25175 kann eine Quelle eines Fructosyltransferase-Gens sein. Die Fructosyltransferase kann als Fusionskonstruktion mit einer heterologen Proteinsequenz erhalten werden. Ein geeignetes Fusionsprotein ist beispielsweise die aus Streptococcus mutans isolierte Fructosyltransferase fusioniert mit dem C-Ende von Glutathion-S-Transferase.
Die Kodierungssequenz der Streptococcus mutans Fructosyltransferase, der die vorhergesagte Signalsequenz fehlt, kann aus dem Streptococcus mutans Bakterienstamm ATCC 25175 durch PCR (Polymerase Chain Reaction; Polymerase Kettenreaktion) isoliert werden, die verwendet werden kann, um einen Transformanten zu bilden, der ein Fructosyltransferase Fusionsprotein expremiert. Eine weitere geeignete Fructosyltransferase Gensequenz aus dem Streptococcus mutans Bakterienstamm GS-5 wird von Shiroza, T. und Kuramitsu, H.K., J. Bacteriol. 170, 810-816 (1988) berichtet.
In der vorliegenden Verwendung bezieht sich „β-2,6-Fructosyltransferase" (auch als Levan-Synthetase bekannt) auf jedes Enzym oder alle Enzyme, das/die fähig ist/ sind, Fructoseteile von Sucrose als Donor auf Sucrose oder ein anderes Saccharid (z.B. ein Fructan) als Akzeptor zu übertragen, unter der Bildung von β-2,6-Bindungen. Die Fructoseeinheit wird bevorzugt in der Furanoseform übertragen. Außerdem ist des bevorzugt, dass die β-2,1-Fructosyltransferase für Fructose in Furanoseform als Akzeptor selektiv ist. Dies beschreibt speziell eine Sucrose:Fructan-6-Fructosyltransferase (6-SFT) (siehe Sprenger et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 92, 11652-11656 (1995)) und eine Fructan:Fructan-6G-Fructosyltransferase (6G-FFT) (siehe Vijn et al., The Plant Journal (1997) 11(3) 387-398). Das Ergebnis der Übertragung des Fructoseteils von Sucrose unter der Einwirkung einer β-2,6-Fructosyltransferase ist die Herstellung einer Glukoseeinheit. Die β-2,6-Fructosyltransferase kann Fructose an die C₆ Position einer endständigen Fructose übertragen (z.B. lineare Kettenverlängerungen bilden) oder an die C₆ Position eines linearen Fructans (z.B. eines Inulins mit β-2,1-Bindung), indem Verzweigungspunkte gebildet werden. Einige Fructosyltransferasen weisen beide Aktivitäten auf (z.B. Kettenverlängerung und Verzweigung), einige Fructosyltransferasen weisen jedoch nur eine Aktivität auf. Die Auswahl geeigneter Kettenverlängerungs- und/oder Verzweigungs-Fructosyltransferasen liegt im Können eines Durchschnittsfachmanns.
Eine geeignete β-2,6-Fructosyltransferase kann aus Pflanzenquellen wie z.B. Gerstenblättern und Gräsern erhalten werden. Eine derartige β-2,6-Fructosyltransferase aus Gerstenblättern ist beschrieben bei Simmen et al., Plant Physiol. (193) 101: 459-468; Duchateau et al., Plant Physiol. (1995) 107: 1249-1255. Levansucrase mit einer β-2,6-Fructosyltransferase-Aktivität ist auch aus Bacillus subtilis (ATCC 6051) und Zymomonas mobilis erhältlich. Reinigung, Klonen und Expremieren einer Sucrose:Fructan 6-Fructosyltransferase aus Gerste ist beschrieben bei Sprenger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA Band 92, S. 11652-11656 (1995) und FEBS Lett 1997 Jan. 6: 400(3): 355-8.
Das vorliegende Verfahren stellt die Reaktion von Sucrose sowohl mit einer β-2,1-Fructosyltransferase als auch mit einer β-2,6-Fructosyltransferase bereit. Es liegt jedoch im Umfang der vorliegenden Erfindung, zu sätzliche Glycosyltransferasen zu verwenden, einschließlich anderer Fructosyltransferasen, die keine Auswirkungen auf die Reaktion von β-2,1-Fructosyltransferase oder β-2,6-Fructosyltransferase haben.
Die folgende Beschreibung von Fructosyltransferasen bezieht sich unabhängig sowohl auf β-2,1-Fructosyltransferase als auch auf β-2,6-Fructosyltransferase.
Die Fructosyltransferasen können auf einem Träger immobilisiert sein, der ein primäres bis quaternäres Amin aufweist, wie in U.S. 5,314,810 beschrieben ist.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die Fructosyltransferasen wenigstens teilweise gereinigt. In der vorliegenden Verwendung bedeutet der Begriff „gereinigt", dass das Enzym wenigstens teilweise von dem Wirtorganismus, aus dem es natürlich hergestellt ist, gereinigt worden ist. Reinigung führt bevorzugt zu der wenigstens teilweisen Entfernung abbauender Enzyme wie z.B. Inulinasen, die das Fructan abbauen würden, und Proteasen, die das Fructosyltransferase-Enzym abbauen können. Das Enzym ist bevorzugt so weit gereinigt, dass keine abbauenden Enzyme mehr vorliegen. Wenn die Quelle des Enzyms ein transfizierter E. coli Mikroorganismus ist, kann ein Rohzellen-Lysat verwendet werden, wenn das transfizierte E. coli keine nativen abbauenden Enzyme aufweist.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform weist jede der gereinigten Fructosyltransferasen ein Verhältnis von synthetischer Aktivität zu Abbauaktivität von ≥ 1.000 zu 1, bevorzugter ≥ 1.500 zu 1, und noch bevorzugter ≥ 2.000 zu 1 auf (z.B. werden für jede Spaltung einer Fructanbindung vorzugsweise wenigstens 1.000 Bindungen von Fructose gebildet). Wenn eine Einheit gleich einem μmol Monosaccharid pro Minute übertragen auf einen Akzeptor ist, enthält ein roher A. niger Wachstumsüberstand ~ 90 Einheiten/mg Protein, und ein DEAE-gereinigtes A. niger Präparat hat ~ 2.000 Einheiten/mg Protein. 10 μg eines DEAE-gereinigten Präparats haben genügend Aktivität, um einen Liter 50%-iger Sucrose bei 50°C in ungefähr einem Tag komplett in Glukose und ein lineares Fructan umzuwandeln. Alternativ kann dasselbe Enzympräparat bei 50°C wenigstens zwei Wochen lang kontinuierlich ohne Effizienzabfall arbeiten, während Sucrose fortgesetzt zugegeben wird.
Eine dritte Fructosyltransferase ist eine 2,6-G-Fructosyltransferase, die Fructose in die C₆ Hydroxylgruppe von Glukose überführt. Eine derartige 2,6-G-Fructosyltransferase verwendet bevorzugt Sucrose als Fructosedonor. Eine geeignete 2,6-G-Fructosyltransferase kann aus natürlichen Quellen mittels herkömmlicher Verfahren, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, isoliert werden. Nicht einschränkende Beispiele geeigneter Quellen umfassen Zwiebeln, Spargel und alle Liliengewächse.
Wenn sie Zusammenhang mit einer linearen β-2,1 kettenverlängernden Fructosyltransferase und einer β-2,6 kettenverlängernden Fructosyltransferase verwendet wird, kann ein Sternfructan (star fructan) gebildet werden, das lineare β-2,1- und β-2,6-Ketten aufweist. Eine derartige Verbindung kann als mehrwertiges Stützmittel, als Auflockerungsmittel für Nahrungsmittel und als Vernetzungsmittel oder Kern für Polymere nützlich sein.
Das Ausgangsmaterial für das vorliegende Verfahren ist Sucrose oder eine Sucrose enthaltende Zusammensetzung. Sucrose bezieht sich auf das Disaccharid in verfeinerter oder roher Form, als Lösung oder trocken, aus einer beliebigen Sucrose-Rohmaterialquelle, z.B. Zuckerrohr oder Zuckerrüben. Die in dem Sucrose-Rohmaterial enthaltene Menge an Sucrose ist bevorzugt ≥ 10 Gew-%, bevorzugter ≥ 20 Gew-%, noch bevorzugter ≥ 50 Gew-% und am bevorzugtesten ≥ 70 Gew-%. Das Ausgangsmaterial kann andere Materialien enthalten, solange sie die Umwandlung von Sucrose in Glukose nicht wesentlich beeinträchtigen (z.B. 1-Kestose (G1-2F1-2F).
Sucrose kann in jeder der oben beschriebenen Formen eingeführt werden. Um die Gesamtionenstärke und -konzentration des Reaktionsmediums beizubehalten, wird jedoch Sucrose kontinuierlich oder mit Unterbrechungen in trockener Form oder in Lösung eingeführt. Die Geschwindigkeit und Frequenz des Hinzufügens von Sucrose zu der Reaktionsmischung sind so, dass eine hohe Produktionsrate von Oligosacchariden beibehalten wird, und hängt teilweise von der Art und der spezifischen Aktivität der Fructosyltransferase, der Reaktionstemperatur und der Entfernungsgeschwindigkeit von Glukose und Fructan ab. Die Bestimmung der optimalen Geschwindigkeit und Frequenz des Hinzufügens von Sucrose kann durch Routineexperimente erreicht werden und liegt im Können des Durchschnittsfachmanns.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt in wässriger Lösung durchgeführt.
Die Konzentration von Sucrose in dem Reaktionsmedium ist nicht in besonderer Weise eingeschränkt und kann 50 mM bis zur Sättigung betragen. In Gewichtsprozent ausgedrückt kann die Menge von Sucrose in der Reaktionslösung 1 bis 80 Gew-% basierend auf dem Gesamtgewicht der Reaktionsmischung betragen, typischerweise 40 bis 80 Gew-%, bevorzugt 50 bis 70 Gew-% und bevorzugter ca. 60 Gew-%.
Die verzweigte Fructanstruktur kann je nach den ausgewählten Reaktionsbedingungen variieren. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung können verzweigte Fructane gebildet werden, die zwei wesentliche Bindungen aufweisen: 1) Fructose:Fructose mit β-2,1-Bindung; und 2) Fructose:Fructose mit β-2,6-Bindung. Besondere verzweigte Fructanstrukturen, die vorgesehen sind, umfassen 1) ein lineares β-2,1-Inulin mit β-2,6-Verzweigungen; 2) ein lineares β-2,6-Levan mit β-2,1-Verweigungen; 3) ein lineares β-2,1-Inulin mit β-2,6-Verzweigungen, das β-2,1-Verzweigungen enthält; und 4) ein lineares β-2,6-Levan mit β-2,1-Verzwiegungen, das β-2,6-Verzweigungen enthält. Das Hinzufügen von Verzweigungspunkten zu jeder linearen Kette, die selbst ein Verzweigungspunkt ist, kann fortgesetzt werden. Für den Durchschnittsfachmann ist es offensichtlich, dass das Fructan eine Glukoseeinheit aufweisen kann, das Ergebnis der anfänglichen Überführung von Fructose in Sucrose.
Bei einer Ausführungsform wird ein lineares Inulin-Fructan mit β-2,1-Bindungen unter der Einwirkung einer kettenverlängernden β-2,1-Fructosyltransferase gebildet, gefolgt von Verzweigung mit Fructoseeinheiten unter der Einwirkung einer verzweigenden β-2,6-Fructosyltransferase. Sucrose ist für beide Fructosyltransferasen der Fructosedonor. Sucrose und die endständige Fructose eines Fructans sind Akzeptoren für die β-2,1-Fructosyltransferase, während eine lineare Fructankette der Akzeptor für eine β-2,6-Fructosyltransferase ist. Das lineare Inulin-Fructan, das β-2,1-Bindungen enthält, kann in einer oder mehreren Stufen gebildet werden, wobei die Verwendung eines einstufigen Verfahrens die Bildung einer größeren Anzahl von Inulinketten niedrigen Polymerisationsgrads (degree of polymerisation; DP), die Verwendung eines Verfahrens, das mehr als eine Stufe umfasst, die Herstellung von weniger, jedoch längeren Inulinketten (z.B. höheren Polymerisationsgraden) begünstigt. Um längere Inulinketten zu bilden, wird die Fructanbildung mit einem Teil der umzuwandelnden Sucrose eingeleitet, gefolgt von einem Hinzufügen der verbleibenden Sucrose. Ein solches Verfahren zur Bildung verlängerter linearer Fructane (z.B. höherer Poymerisationsgrade) ist beschrieben bei Catani et al. in der am 6. Februar 1998 eingereichten, ebenfalls anhängigen US-Patentanmeldung Nr. 09/019,709, auf die hier vollinhaltlich Bezug genommen wird.
Bei einer anderen Ausführungsform wird ein lineares Levan-Fructan mit β-2,6-Bindungen unter der Einwirkung einer β-2,6-Fructosyltransferase gebildet, gefolgt von Verzweigung mit Fructoseeinheiten unter der Einwirkung einer β-2,1-Fructosyltransferase. Sucrose ist der Fructosedonor für beide Fructosyltransferasen. Sucrose und die endständige Fructose eines Fructans sind der Akzeptor für die β-2,6-Fructosyltransferase, während eine lineare Fructankette der Akzeptor für eine β-2,1-Fructosyltransferase ist. Das lineare Levan-Fructan mit β-2,6-Bindungen kann in einer oder mehreren Stufen gebildet werden, wobei die Verwendung eines einstufigen Verfahrens die Bildung einer größeren Anzahl von Levanketten niedrigen Polymerisationsgrads, die Verwendung eines Verfahrens, das mehr als eine Stufe umfasst, die Herstellung von weniger, jedoch längeren Levanketten (z.B. höheren Polymerisationsgraden) begünstigt. Um längere Levanketten zu bilden, wird die Fructanbildung mit einem Teil der umzuwandelnden Sucrose eingeleitet, gefolgt von einem Hinzufügen der verbleibenden Sucrose. Ein solches Verfahren zur Bildung verlängerter linearer Levan-Fructane ist ebenso beschrieben wie für die Bildung verlängerter linearer Inulin-Fructane.
Ein lineares Levan-Fructan mit β-2,6-Bindungen, das verzweigende Fructoseeinheiten mit β-2,1-Bindungen enthält, kann als Auflockerungsmittel für Nahrungsmittel und Nahrungsmittelsüßstoffe verwendet werden. Ein derartiges Fructan weist typischerweise ein lineares Levan-Fructan-Rückgrat mit 2 bis 15, bevorzugt 3 bis 10, noch bevorzugter 4 bis 7 Fructoseeinheiten auf, die mit β-2,6-Bindun gen an eine Glukose geknüpft sind. Angehängt hieran ist/ sind eine oder mehrere Fructoseeinheit(en) mit β-2,1-Bindung, die Verzweigungspunkte bilden. Der Verzweigungspunkt kann wahllos an dem linearen Levan-Fructan-Rückgrat auftreten. Das Molekulargewicht eines derartigen Fructans kann von ca. 700 bis 3.600 g/mol reichen. Jeder Verzweigungspunkt kann selbst kettenverlängert sein.
Bei einer anderen Ausführungsform kann die gleichzeitige Einwirkung sowohl von β-2,1-Fructosyltransferase als auch β-2,6-Fructosyltransferase auf Sucrose ein Fructan mit β-2,1- und β-2,6-Bindungen, die sowohl verzweigend als auch linear sind, erzeugen. Jede Fructosyltransferase verwendet Sucrose als Fructosedonor und kann Sucrose und/oder ein Fructan als Akzeptor verwenden. Außerdem kann jede Fructosyltransferase entweder lineare oder verzweigende Bindungen bilden.
Bei einer anderen Ausführungsform wird ein lineares Inulin- oder ein lineares Levan-Fructan unter der Einwirkung sowohl von β-2,1-Fructosyltransferase als auch von β-2,6-Fructosyltransferase verzweigt. Jede Fructosyltransferase verwendet Sucrose als Fructosedonor und ein Fructan als Akzeptor. Außerdem kann jede Fructosyltransferase entweder lineare oder verzweigende Bindungen bilden.
Jedes der oben beschriebenen Fructane kann weiter so vervollkommnet werden, dass es durch die Einwirkung einer Glucosyltransferase, die ein Fructan als Akzeptor und bevorzugt Sucrose als Glukosedonor verwendet, eine oder mehrere Glucoseeinheit(en) aufweist.
Ein Vorteil des Bildens verzweigter Fructane ist, dass die Effizienz der Bildung von Glukose gegenüber der Bildung nur linearer Fructane erhöht wird, da jede aus Sucrose gebildete Verzweigungsgruppe eine Einheit von Glucose hervorbringt. Wenn ein lineares Fructan aus Suc rose gebildet wird, erzeugt das erste Koppeln von Fructose an Sucrose, eine Reaktion, die zwei Einheiten von Sucrose verbraucht, nur eine Einheit von Glucose. Somit bietet die Synthese verzweigter Fructane aus Sucrose ein hocheffizientes Verfahren zum Synthetisieren von Glukose.
Die Reaktion von Sucrose mit Fructosyltransferasen kann über einen weiten Temperaturbereich durchgeführt werden. Die Reaktionstemperatur kann Raumtemperatur, d.h. 18 bis 25°C, sein und bis zu Temperaturen gehen, die gerade unterhalb der Temperatur liegen, bei der eine schnelle Inaktivierung der Fructosyltransferasen eintritt. Ein bevorzugter Temperaturbereich ist 25 bis 60°C. Bevorzugter wird die Reaktion bei einer Temperatur von 35 bis 55°C durchgeführt. Am bevorzugtesten ist die Temperatur 30 bis 50°C.
Die wässrigen Reaktionslösungen können ungepuffert oder mit dem entsprechenden pH-Wert unter Verwendung bekannter Pufferkomponenten, z.B. Citrat-, Phosphat- und TRIS-Puffern, gepuffert sein. Die Verwendung eines Puffers ist bevorzugt, wenn die Reaktion über einen längeren Zeitraum, beispielsweise zwei Wochen, durchgeführt wird.
Die Reaktion von Sucrose mit Fructosyltransferasen wird ausreichend lange durchgeführt, um kommerzielle Mengen von Glukose herzustellen. Die Reaktionszeit kann 2 bis 48 Tage betragen, je nach Größe der Ladung. Wenn sie kontinuierlich durchgeführt wird, kann ein Volumen von 10 ml bei einer Geschwindigkeit von 2,5 g/h ohne wesentlichen Aktivitätsverlust über einen Zeitraum von 2 bis 4 Wochen reagieren.
Der pH-Wert der Reaktion von Sucrose mit Fructosyltransferasen ist nicht in besonderer Weise eingeschränkt, und der optimale pH-Wert der Reaktion kann je nach dem verwendeten spezifischen Enzym variieren. Typi scherweise reicht der pH-Wert von 4,0 bis 8,0, bevorzugt von 5,0 bis 7,5, bevorzugter liegt er bei ca. 6,0.
Das vorliegende Verfahren kann entweder chargenweise oder kontinuierlich durchgeführt werden. Die kontinuierliche Reaktion kann durch Zirkulieren einer Reaktionsmischung durch eine Ultrafiltrationsvorrichtung durchgeführt werden, wodurch das Produkt/die Produkte fortgesetzt als Permeate von Ultrafiltern entfernt wird/werden, wobei ein Transferaseenzym von den Ultrafiltern im Retentat zurückgehalten wird. Frisches Substrat und frisches Enzym können bei Bedarf hinzugefügt werden, um diejenigen zu ersetzen, die inaktiviert worden sind, wobei das Hinzufügen zu der Reaktionsmischung mit derselben Geschwindigkeit stattfindet, mit der die Permeate von den Ultrafiltern entfernt werden.
Die Reaktion von Sucrose mit einer β-2,1-Fructosyltransferase und einer β-2,6-Fructosyltransferase kann in einem Röhrenreaktor durchgeführt werden.
Der Röhrenreaktor weist typischerweise eine Röhrenlänge, eine Pumpe zum Bewegen des Reaktionsstroms durch die Röhre, einen Einlass für Reaktanten und einen Auslass für Reaktionsprodukte auf.
Der Röhrenreaktor kann aus herkömmlichen Reaktormaterialien hergestellt sein, die dem Fachmann bekannt sind. Ein Röhrenreaktor kann beispielsweise aus rostfreiem Stahl, mit Glas überzogenem rostfreiem Stahl oder einem Polymer wie Polyethylen hoher Dichte, Polypropylen, Polyvinylchlorid oder einem Polyester hergestellt sein. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Röhrenreaktor aus Polyvinylchlorid hergestellt.
Der Röhrenreaktor hat typischerweise die Form eines Rohrs, dessen Länge und Durchmesser je nach der spezifischen Reaktion, die durchgeführt wird, variieren können. Im Allgemeinen weist ein Rohr einen Innendurchmesser von 1 bis 24 Inch (25,4 bis 609,6 mm), bevorzugt von 4 bis 20 Inch (101,6 bis 508 mm), bevorzugter von 6 bis 10 Inch (152,4 bis 254 mm) auf.
Eine Pumpe ist vorgesehen, um den Inhalt des Röhrenreaktors entlang der Reaktorlänge zu bewegen. Herkömmliche Pumpen, die dem Fachmann bekannt sind, können verwendet werden. Nicht einschränkende Beispiele geeigneter Pumpen sind:
Typischerweise liefert die Pumpe genügend Kraft, um eine Durchflussgeschwindigkeit von 0,1 bis 2 ft/sec (0,0305 bis 0,61 m/s), bevorzugt von 0,2 bis 1 ft/sec (0,061 bis 0,305 m/s), bevorzugter von 0,3 bis 0,7 ft/sec (0,0914 bis 0,213 m/s) bereitzustellen. Bevorzugt erzeugt die Pumpe einen Durchfluss, der sich wie ein fester Pfropfen (solid plug) verhält .
Der Einlass für den Röhrenreaktor ist nicht in besonderer Weise eingeschränkt und kann einfach eine Öffnung umfassen, die das Einführen von Reaktanten entweder als Anfangscharge oder kontinuierlich während des Betriebslaufs des Reaktors ermöglicht. Die Reaktanten können entweder gravimetrisch oder mittels einer Pumpe in den Reaktor dosiert werden. Die Reaktanten können in fester Form, z.B. als Pulver, oder als Lösung in einem geeigneten Lösungsmittel eingeführt werden.
Der Reaktor kann auch mit zusätzlichen Einlässen ausgestattet werden, wie oben beschrieben ist, die sich entlang der Länge des Reaktors nachgeordnet dem Anfangseinlass befinden. Diese Einlässe können verwendet werden, um an unterschiedlichen Punkten entlang des Reaktionsstroms zusätzliche Reaktanten hinzuzufügen.
Der Auslass für das Produkt ist nicht in besonderer Weise eingeschränkt und kann die Form eines direkten Abzugs des gesamten Reaktorinhalts aus dem Reaktorstrom haben, oder selektives Entfernen eines Reaktionsprodukts bereitstellen. Selektives Entfernen des Produkts kann mittels eines Größenausschlussfilters durchgeführt werden.
Die Reaktorlänge variiert in Abhängigkeit von der spezifischen Reaktion und von den Reaktionsbedingungen, z.B. der Durchflussgeschwindigkeit durch den Reaktor und der Temperatur.
Der Reaktor kann auch mit einem Temperatursteuersystem, beispielsweise einem Erhitzer oder einem Kühler, ausgestattet sein. Die Fähigkeit, die Temperatur einzustellen, ändert sich bevorzugt über die Reaktorlänge hinweg, was unterschiedliche Temperaturzonen über die Reaktorlänge hinweg ermöglicht.
Bei einer Ausführungsform wird Sucrose mit einer β-2,1-Fructosyltransferase in einem ersten Abschnitt eines Röhrenreaktors reagiert, worauf eine Reaktion mit einer β-2,6-Fructosyltransferase in einem nachgeordneten Abschnitt erfolgt. Vor der Reaktion mit der β-2,6-Fructosyltransferase kann die β-2,1-Fructosyltransferase deaktiviert werden durch genügend langes Erhitzen, ca. eine Minute lang, bei ausreichend hoher Temperatur, typischerweise ca. 65 bis 95°C, bevorzugt ca. 75 bis 90°C, noch bevorzugter ca. 85°C. Alternativ kann eine Deaktivierungszone das Entfernen des Wirkstoffs aus dem Fluss des Röhrenreaktors umfassen, z.B. über eine Größenausschlussmembran oder ähnliches. Die Deaktivierung kann auch durch Einführen eines Sulzidsubstrats für den Wirkstoff erreicht werden, das die Wirkstoffaktivität deaktiviert. Bevorzugt wird die Fructosyltransferase durch thermisches Deaktivieren deaktiviert.
Levansucrase mit einer β-2,6-Fructosyltransferase Aktivität mit einem Fructan als Akzeptor, die durch Expremieren aus einem Bacillus subtilis (ATCC 6051) erhalten wird, kann insbesondere verwendet werden, was die ef fiziente Nutzung von Sucrose bei der Bildung der β-2,6-Bindungen von Fructose an die Inulinkette gewährleistet. Eine derartige Fructosyltransferase kann durch herkömmliche Mittel, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, erhalten werden. Wenn Sucrose effizient reagiert wird, wird das Problem des Abscheidens von Glucose von Restsucrose gemildert.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Sucrosekonzentration nach der Einwirkung einer β-2,6-Fructosyltransferase, wenn überhaupt vorhanden, ≤ 20 Gew-%, bevorzugter ≤ 10 Gew-%, noch bevorzugter ≤ 5 Gew-%, und noch bevorzugter ≤ 1 Gew-%.
Die Reaktion kann auch in einem Reaktor oder einer Reihe von Reaktoren durchgeführt werden, der/die mit geeigneten Einlässen für Reaktanten und Auslässen für Produkte versehen sein kann/können. Die Auslässe können für das Entfernen eines spezifischen Produkts selektiv sein. Die Selektivität kann durch Vorsehen geeigneter Separatoren erhalten werden, die das Entfernen des Produkts und die Rückführung anderer Materialien in den Reaktor ermöglichen. Ein Separator kann in Form einer Membran oder einer Chromatographiesäule vorliegen. In einigen Fällen kann ein Separator eine Vielzahl von Membranen und/oder Chromatographiesäulen aufweisen, die das selektive Entfernen des gewünschten Produkts ermöglichen.
Nach der Reaktion zur Herstellung von Glukose können die Fructosyltransferasen durch 10- bis 15-minütiges Erhitzen einer Reaktionsmischung auf ca. 100°C inaktiviert werden. Wenn erwünscht, können die Enzyme entweder vor oder nach der Wärme-Inaktivierung mittels Ultrafiltrieren durch ein Filter geeigneter Größe aus der Reaktionsmischung entfernt werden.
Typischerweise hat das Fructan ein lineares Rückgrat von Fructoseeinheiten in der β-O-Fructofuranose Form mit β-2,1-Bindungen. Die Anzahl von β-O-Fructofuranose-Einheiten reicht typischerweise von 4 bis 20, bevorzugt von 4 bis 15, bevorzugter von 4 bis 8. Aufgepfropft auf das lineare Fructan-Rückgrat ist/sind eine oder mehrere β-O-Fructofuranose-Einheit(en) mit β-2,6-Bindung an das Rückgrat. Die Anzahl und Dichte der auf das Rückgrat aufgepfropften Fructoseeinheiten können variieren, jedoch gibt es typischerweise wenigstens 1 Propf-Fructose für jeweils 5 lineare Fructoseeinheiten mit β-2,1-Bindung, bevorzugt wenigstens 1 für jeweils 4, bevorzugter wenigstens 1 für jeweils 3, noch bevorzugter wenigstens 1 für jeweils 2. Diese Verhältnisse beziehen sich nur auf die Anzahl von an dem linearen Rückgrad gefundenen Verzweigungspunkten.
Bei einer anderen Ausführungsform kann das verzweigte Fructan kettenverlängert werden an verzweigende Fructose mit β-O-Fructofuranose-Einheiten mit β-2,1-Bindung auf die verzweigende Fructoseeinheit kettenverlängert werden, so dass eine verzweigte Fructanstruktur mit einer kammartigen Struktur bereitgestellt wird. Die Anzahl von β-O-Fructofuranose-Einheiten mit β-2,1-Bindung an die verzweigende Fructose kann je nach Reaktionsbedingungen variieren und reicht typischerweise von 2 bis 20, bevorzugter von 2 bis 10, noch bevorzugter von 2 bis 8 Fruktoseeinheiten, die an einzelne verzweigende Fructoseeinheiten angehängt werden. Es ist nicht notwendig, dass jede verzweigende Fructoseeinheit dieselbe Anzahl von kettenverlängernden Fructoseeinheiten trägt. Der Begriff Kammpolymer ist auf dem Gebiet der Polymerchemie bekannt, so dass die hier beschriebene Struktur verzweigten Fructans für den Durchschnittsfachmann klar ist.
Es liegt auch im Umfang der vorliegenden Erfindung, Verzweigungen und kettenverlängerte Verzweigungen an einzelnen Kammketten zu bilden, die selbst auf ein lineares Fructan mit β-2,1-Bindung aufgepfropft sind. Die Anzahl und Dichte von auf die einzelnen Kammketten aufgepfropften Fructoseeinheiten kann variieren, typischerweise gibt es jedoch durchschnittlich wenigstens 1 Pfropf-Fructose für jeweils 5 lineare Fructoseeinheiten mit β-2,1-Bindung, bevorzugt wenigstens 1 für jeweils 4, bevorzugter wenigstens 1 für jeweils 3, noch bevorzugter wenigstens 1 für jeweils 2. Diese Verhältnisse beziehen sich nur auf die Anzahl von an der linearen Kammkette gefundenen Verzweigungspunkten. Die Anzahl von β-O-Fructofuranose-Einheiten mit β-2,1-Bindung an die verzweigende Fructose an der Kammkette kann je nach Reaktionsbedingungen variieren und reicht typischerweise von 2 bis 20, bevorzugter von 2 bis 10, noch bevorzugter von 2 bis 8 Fruktoseeinheiten, die an einzelne verzweigende Fructoseeinheiten angehängt werden. Es ist nicht notwendig, dass jede verzweigende Fructoseeinheit dieselbe Anzahl von kettenverlängernden Fructoseeinheiten trägt.
Zu Illustrationszwecken werden für die Herstellung von Glukose aus Sucrose mittels wenigstens einer β-2,1-Fructosyltransferase und einer β-2,6-Fructosyltransferase besondere Einzelheiten dargestellt.
Sucrose und eine β-2,1-Fructosyltransferase werden in einem Reaktor reagiert. Der Reaktor kann einen Einlass für Sucrose und einen Auslass für Glukose aufweisen. Mit Erhöhung des Polymerisationsgrads erhöht sich auch die Glukosekonzentration, so dass es möglich ist, dass die Geschwindigkeit der glukosebildenden Reaktion abnimmt. Demgemäß wird bei einer bevorzugten Ausführungsform Glukose während der Reaktion aus dem Reaktionsmedium entfernt. Die Glukose kann mittels herkömmlicher Verfahren, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, entfernt werden, beispielsweise mittels Membranfiltration oder Chromatographie. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfin dung umfasst Chromatographie Ionenaustausch- und Gelausschluss-Techniken, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind. Eine Pumpe kann verwendet werden, um den Druck gegen die Membran oder Chromatographiesäule zu erhöhen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform weist der Auslass für Glukose eine Membran auf, die den Fluss von Glukose aus dem Reaktionsmedium ermöglicht, ohne Sucrose, Fructan oder Fructosyltransferase durchtreten zu lassen.
Eine β-2,6-Fructosyltransferase wird dann hinzugefügt, die bei Reaktion mit Sucrose Verzweigungen der linearen Kette bereitstellt.
Glukose kann kontinuierlich, chargenweise oder halbchargenweise entfernt werden; bei einer bevorzugten Ausführungsform wird Glukose jedoch kontinuierlich aus dem Reaktionsmedium entfernt.
Die Glukose kann mittels herkömmlicher Verfahren, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, isoliert und gereinigt werden, beispielsweise durch Filtrieren, dem auch Kristallisation folgen kann.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Fructan ebenfalls aus der Reaktionsmischung entfernt, bevorzugter wird das Fructan kontinuierlich aus der Reaktionsmischung entfernt. Ein Fructan kann mittels herkömmlicher Methoden, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, entfernt werden, beispielsweise durch Membranfiltration oder Chromatographie, z.B. Ionenaustausch oder Gelausschluss. Bei einer bevorzugten Ausführungsform weist ein Auslass für Fructan eine Membran auf, die den Fluss von Fructan aus dem Reaktionsmedium ermöglicht, ohne Sucrose, Glukose oder Fructosyltransferase durchtreten zu lassen. Alternativ kann das Fructan aus der Reaktionsmischung abgeschieden werden, und Sucrose und Glukose werden in das Reaktionsmedium zurückgeführt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Menge des hergestellten Fructans, basierend auf dem Ausgangsgewicht von Sucrose, ≥ 10 Gew-%, bevorzugt ≥ 20 Gew-%, bevorzugter ≥ 30 Gew-%, noch bevorzugter ≥ 40 Gew-%, und am bevorzugtesten ≥ 50 Gew-%.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform reicht der Ertrag der hergestellten Glukose, basierend auf dem reagierten Gewicht von Sucrose, von 25 bis 50 Gew-%, ist bevorzugt ≥ 25 Gew-%, bevorzugt ≥ 33 Gew-%, bevorzugter ≥ 37 Gew-%, noch bevorzugter ≥ 40 Gew-%, und am bevorzugtesten ca. 50 Gew-%.
Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung sind kommerzielle Mengen definiert als Produktionsrate von Glukose von 10³ bis 10⁵ kg/Tag und liegen bevorzugt bei einer Menge von ≥ 1.000 kg/Tag, bevorzugt ≥ 2.000 kg/Tag, noch bevorzugter ≥ 5.000 kg/Tag. Außerdem ist die Produktionsrate kommerzieller Mengen relativ zu der Menge des Sucrose-Ausgangsmaterials. Daher basieren die oben genannten Produktionsraten auf einer Verarbeitungseinheit von 6.000 kg Sucrose. Demgemäß bezieht sich der Begriff „kommerzielle Mengen" nicht auf eine absolute Menge, sondern vielmehr auf eine kommerziell akzeptable Produktionsrate.
Um die Effizienz der Glukoseherstellung zu erhöhen, umfasst bei einer bevorzugten Ausführungsform für chargenweise Kettenverlängerung jede Charge 20 bis 25 Gew-% des Produkts der vorhergehenden Reaktion. Demgemäß werden, nachdem eine Anfangscharge der Kettenverlängerung fertig ist, 75 bis 80 Gew-% der Reaktanten entfernt, und die restlichen 20 bis 25 Gew-% verbleiben als Reaktant für eine zweite Charge der Kettenverlängerung. Daher werden die 20 bis 25 Gew-% des ersten Reaktionsprodukts in einen Reaktor mit Sucrose und β-2,1-Fructosyltransferase geladen. Auf diese Weise findet der Übergang von Fructose aus Sucrose mit der β-2,1-Fructosyltransferase in Anwesenheit einer höheren Konzentration von höheren Fructanen statt, so dass die Bildung zusätzlicher höherer Fructane eher als die Bildung von Trisacchariden (F-F-G) begünstigt wird. Da die Herstellung höherer Fructane Glukose effizienter herstellt, ist dies ein noch effizienteres Verfahren zur Bildung von Glukose.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die Effizienz des Verfahrens durch Zurückgewinnen eventueller nicht reagierter Sucrose aus dem Produkt der Kettenverlängerung (β-2,1-Fructosyltransferase) oder der Verzweigung (β-2,6-Fructosyltransferase) weiter erhöht werden. Typischerweise ergibt die Einwirkung einer Fructosyltransferase mit Sucrose eine Reaktionsmischung, die Glukose, nicht reagierte Sucrose, Fructan und Fructose enthält. Das Entfernen nicht reagierter Sucrose und ihr Recyceln als Ausgangsmaterial für eine Fructosyltransferase erhöht die Effizienz der Glukoseherstellung außerordentlich.
Sucrose kann beispielsweise mittels herkömmlicher Chromatographietechniken, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, entfernt werden. Als spezielles Beispiel können simulierte Bewegtbett-Techniken verwendet werden, um Glukose, höhere Fructane (DP₅ und höher) und Sucrose abzuscheiden. Der Sucroseanteil weist typischerweise des Weiteren niedrigere Fructane DP₃ und DP₄ und Glukose auf, die jeweils zu einer Fructosyltransferase-Reaktion zurückgeführt werden können, was die Effizienz der Glukoseherstellung erhöht.
Typischerweise verwendet eine Bewegtbett-Technik als Stützmittel ein Salz eines anionischen Austauscherharzes, z.B. das Natriumsalz eines Styrol Divinyl Benzol Sulfonsäure Harzes, das einen Vernetzungsgrad von 4 bis 6 aufweist. Wenn der Vernetzungsgrad des Harzes über 6% liegt, verringert sich die Effizienz der Abscheidung. Wenn der Vernetzungsgrad des Harzes unter 4% liegt, ist die mechanische Intaktheit des Harzes unerwünscht. Ein geeignetes Harz ist als DOWEX^® Ionenaustauscherharz von Dow Chemical erhältlich.
Die Abscheidung von Glukose kann auch durch Größenausschlus-Techniken erreicht werden, die herkömmliche Hohltypmembranen verwenden, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind. Die aufeinander folgende Kombination der kommerziell erhältlichen Größenausschlussmembranen G₁₀ und G₅ ermöglicht die effektive Isolierung von Glukose sowie eines Anteils, der Sucrose und niedrigere Fructane enthält, der in den Reaktor recycelt werden. kann.
In 1 bezeichnet 1 einen Reaktor, 2 einen Einlass für Sucrose, 3 einen Auslass für Glukose, 4 einen Auslass für ein Fructan und 5 einen Separator, der für Glukose durchlässig ist, jedoch nicht durchlässig ist für Sucrose, eine Fructosyltransferase oder ein Fructan. Sucrose wird über den Einlass 2 einem Abschnitt des Reaktors 1 zugeführt, der eine β-2,1-Fructosyltransferase und eine β-2,6-Fructosyltransferase enthält. In einer derartigen Konfiguration wird eine Aufteilung derart vorgenommen, dass Fructane an einer Seite des Separators konzentriert werden. Der Reaktor ist mit einem Glukose-Auslass 3 ausgestattet, der sich auf der Glukose-Seite des Separators 3 befindet. Der Auslass für Fructan 4 kann mit einem (nicht gezeigten) Separator ausgestattet sein, der den Durchtritt von Fructan erlaubt, jedoch nicht den Durchtritt von Sucrose, Glukose oder Fructosyltransferasen. Wenn ein Membransystem verwendet wird, um Fructan zu isolieren, erlaubt die Membran typischerweise den Durchtritt von Glukose und Sucrose, nicht jedoch den Durchtritt des verzweigten Fructans. Daher wird Fructan effektiv abgeschieden.
In 1a bezeichnet 1 einen Reaktor, 1a einen getrennten Reaktorabschnitt, 2 einen Einlass für Sucrose, 3 einen Auslass für Glukose, 4 einen Auslass für ein Fructan und 5 einen Separator für Glukose. Sucrose wird über den Einlass 2 einem Reaktorabschnitt 1a des Reaktors 1 zugeführt, der eine β-2,1-Fructosyltransferase und eine β-2,6-Fructosyltransferase enthält. Bei einer derartigen Konfiguration wird Glukose mittels eines Separators 5 von dem Reaktionsmedium abgeschieden, bevor sie über den Glukose-Auslass 3 entfernt wird. Während der Abscheidung von Glukose können die verbleibenden Materialien in den Reaktorabschnitt 1a recycled werden. Der Auslass für Fructan 4 kann mit einem (nicht gezeigten) Separator ausgestattet sein, der den Durchtritt von Fructan erlaubt, jedoch nicht den Durchtritt von Sucrose, Glukose oder Fructosyltransferasen.
Bei einer anderen Ausführungsform ist ein Reaktor, der einen Einlass für Sucrose aufweist, mit einem externen Separator ausgestattet, der sowohl Glukose als auch ein Fructan von Sucrose abscheidet. Nicht reagierte Sucrose kann, wenn vorhanden, an den Reaktor zurückgeführt werden.
In 2 bezeichnet 1 einen ersten Reaktor, 2 und 11 bezeichnen Einlässe für Sucrose, 3 und 8 bezeichnen Auslässe für Glukose, 4 bezeichnet einen Auslass für ein lineares Fructan, 5 und 10 bezeichnen Separatoren, die für Glukose durchlässig sind, jedoch nicht für Sucrose, eine Fructosyltransferase oder ein höheres Fructan, 6 bezeichnet einen zweiten Reaktor, 7 bezeichnet einen Einlass für ein lineares Fructan, und 9 bezeichnet einen Auslass für ein verzweigtes Fructan. Es werden zwei Reaktoren werden verwendet, die jeweils mit Separatoren 5 und 10 untergliedert sind, die für Glukose durchlässig, jedoch für Sucrose, Fructosyltransferasen oder für lineare oder verzweigte Fructane undurchlässig sind. In dem ersten Reaktor 1 ist die Konzentration von Sucrose derart, dass sie die Synthese linearer β-2,1-Inulin-Fructane ermöglicht; daraufhin wird das Produkt über den Einlass für ein lineares Fructan an den zweiten Reaktor 6 weitergeleitet. Bei einer bevorzugten Ausführungsform erlaubt entweder der Auslass für lineares Fructan 4 oder der Einlass für lineares Fructan 7 nicht den Durchtritt einer aktiven Fructosyltransferase. Dies kann durch Ausstatten entweder des Auslasses 4 oder des Einlasses 7 mit einer Membran erfolgen, die den Durchtritt einer Fructosyltransferase nicht erlaubt. Alternativ kann entweder der Auslass 4 oder der Einlass 7 mit einer Deaktivierungszone aus Fructosyltransferase ausgestattet sein, beispielsweise durch genügend langes Erhitzen, ca. eine Minute lang, bei ausreichend hoher Temperatur, typischerweise ca. 65 bis 95°C, bevorzugt ca. 75 bis 90°C, noch bevorzugter ca. 85°C. In dem zweiten Reaktor 6 ist eine β-2,6-Fructosyltransferase in einem Abschnitt des zweiten Reaktors 6 enthalten, und ein lineares Fructan wird mit Sucrose reagiert. Glukose darf durch den Separator 10 hindurchtreten und wird über den Glukose-Auslass 8 entfernt. Während der Abscheidung von Glukose können die verbleibenden Materialien in den Reaktorabschnitt 6 recycled werden. Das verzweigte Fructan kann über den Auslass für verzweigtes Fructan 9 entfernt werden. Der Auslass für verzweigtes Fructan 9 kann mit einem (nicht gezeigten) Separator ausgestattet sein, der den Durchtritt verzweigter Fructane erlaubt, nicht jedoch den Durchtritt von Sucrose, Glukose oder Fructosyltransferasen.
In 2a bezeichnet 1 einen ersten Reaktor und 1a einen getrennten Reaktorabschnitt, 2 und 11 bezeichnen Einlässe für Sucrose, 3 und 8 bezeichnen Auslässe für Glukose, 4 bezeichnet einen Auslass für ein lineares Fructan, 5 und 10 bezeichnen externe Separatoren, die für Glukose durchlässig sind, jedoch für Sucrose, Fructosyltransferasen oder lineares oder verzweigtes Fructan undurchlässig, 6 bezeichnet einen zweiten Reaktor und 6a bezeichnet einen getrennten Reaktorabschnitt, 7 bezeichnet einen Einlass für ein lineares Fructan und 9 bezeichnet einen Auslass für ein verzweigtes Fructan. Es werden zwei Reaktoren verwendet, die mit externen Separatoren 5 und 10 ausgestattet sind, die für Glukose durchlässig sind, für Sucrose, Fructosyltransferasen oder lineare oder verzweigte Fructane jedoch undurchlässig. In dem ersten Reaktorabschnitt 1a ist die Konzentration von Sucrose derart, dass sie die Synthese linearer Fructane mit β-2,1-Bindung ermöglicht; daraufhin wird das Produkt über den Einlass für ein lineares Fructan 7 an den zweiten separaten Reaktorabschnitt 6a weitergeleitet. Bei einer bevorzugten Ausführungsform erlaubt entweder der Auslass für lineares Fructan 4 oder der Einlass für lineares Fructan 7 nicht den Durchtritt einer aktiven Fructosyltransferase. Dies kann durch Ausstatten entweder des Auslasses 4 oder des Einlasses 7 mit einer Membran erfolgen, die den Durchtritt einer Fructosyltransferase nicht erlaubt. Alternativ kann entweder der Auslass 4 oder der Einlass 7 mit einer Deaktivierungszone aus Fructosyltransferase ausgestattet sein, beispielsweise durch genügend langes Erhitzen, ca. eine Minute lang, bei ausreichend hoher Temperatur, typischerweise ca. 65 bis 95°C, bevorzugt ca. 75 bis 90°C, noch bevorzugter ca. 85°C. In dem zweiten Reaktor 6 ist eine β-2,6-Fructosyltransferase in dem getrennten Reaktorabschnitt 6a enthalten, und ein lineares Fructan wird mit Sucrose reagiert. Glukose kann durch den Separator 10 hindurchtreten und wird über den Glukose-Auslass 8 entfernt. Das verzweigte Fructan kann über den Auslass für verzweigtes Fructan 9 entfernt werden. Der Auslass für verzweigtes Fructan 9 kann mit einem (nicht gezeigten) Separator ausgestattet sein, der den Durchtritt verzweigten Fructans erlaubt, jedoch nicht den Durchtritt von Sucrose, Glukose oder β-2,6-Fructosyltransferase. Die beiden Separatoren 5 und 10 sind mit einer Recycle-Leitung dargestellt, um andere Materialien als Glukose, beispielsweise Sucrose und niedrigeres Fructan, bei Bedarf zurückzuführen.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt in einem Reaktor durchgeführt, der zur Herstellung kommerzieller Mengen verzweigten Fructans geeignet ist. Der Reaktor weist bevorzugt einen oder mehrere Einlässe zum Einführen von Sucrose und/oder der Fructosyltransferase auf, sowie eine Einrichtung zum Isolieren kommerzieller Mengen von verzweigtem Fructan aus dem Reaktor. Der Reaktor kann, wie in den 2 und 2a gezeigt ist, mehrere Gefäße umfassen, die als Reaktorsystem funktionieren.
Es liegt auch im Umfang der vorliegenden Erfindung, zusätzliche Modifikationen der enzymatisch erzeugten verzweigten Fructane zu tätigen, entweder durch herkömmliche chemische Modifikation oder. durch zusätzliche enzymatische Modifikation. Nicht einschränkende Beispiele chemischer Modifikation können Alkylierung, Veresterung, Dehydration, Zyklisierung und Teilhydrolyse umfassen. Nicht einschränkende Beispiele enzymatischer Modifikation können Glykosylation umfassen.
Ein verzweigtes Fructan kann als Auflockerungsmittel für Nahrungsmittel und Nahrungsmittelsüßstoffe, das selbst Süße aufweist, verwendet werden.
Nachdem die vorliegende Erfindung α-allgemein beschrieben worden ist, kann ein weitergehendes Verständnis durch Bezugnahme auf bestimmte spezifische Beispiele erhalten werden, die rein zu Illustrationszwecken hier dar gelegt werden und, wenn nicht anders angegeben, nicht einschränkend zu verstehen sind.
Klonen und Expremierverfahren:
Die Kodierungssequenz der Streptococcus mutans Fructosyltransferase, der die vorhergesagte Signalsequenz fehlt, kann aus dem Streptococcus mutans Bakterienstamm ATCC 25175 durch PCR (Polymerase Chain Reaction; Polymerase-Kettenreaktion) isoliert werden. Zwei Primer wurden entworfen und synthetisiert. Der erste, ein 5'-TCTGCGGGATCCCAGGCAGATGAAGCCAATTCAAC-3', enthielt eine BamHI Restriktionsstelle, der eine Sequenz folgt, die zu der Sequenz identisch ist, die dem Ende der vorhergesagten Signalsequenz in der Streptococcus-mutans-Fructosyltransferase-Kodierungssequenz unmittelbar folgt. Der zweite, ein 5'-TCTGCGAAGCTTTTATTTAAAACCAATGCTTACACA-3', enthielt eine HindIII Restriktionsstelle, der die umgekehrte Komplementsequenz entsprechend dem C-terminalen Ende der Streptococcus-mutans-Fructosyltransferase-Kodierungssequenz folgt. Beide Primer wurden mit genomischer DNA kombiniert, die aus dem Streptococcusmutans-Stamm ATCC 25175 isoliert wurde, und bei der PCR verwendet. Das resultierende DNA-Fragment wurde mit BamHI und HindIII verdaut und an BamHI-HindIII verdautes Plasmid, pGEX-KT-ext, ligiert. Diese Ligation führte zu der oben beschriebenen Streptococcus-mutans-Fructosyltransferase-Kodierungssequenz, die im Frame unmittelbar nachgeordnet zu der Kodierungssequenz von Glutathion-S-Transferase (GST) platziert wurde. Das pGEX-KT-ext Streptococcus-mutans-Fructosyltransferase-Plasmid wurde in E. coli BL21 Zellen transformiert. Die Proteinexpremierung aus dem resultierenden Transformanten führte zu einer intrazellulären Akkumulation eines GST- ext Streptococcus-mutans-Fructosyltransferase-Fusionsproteins.
Selbstverständlich sind angesichts der oben genannten Lehren zahlreiche Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung möglich. Es ist daher so zu verstehen, dass die Erfindung im Umfang der beigefügten Ansprüche auch anders als hier speziell beschrieben praktiziert werden kann.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Glukose aus Sucrose enthaltend die folgenden Schritte: i) man bringt Sucrose mit einer β-2,1-Fructosyltransferase und β-2,6-Fructosyltransferase zur Herstellung von Glukose in Kontakt und ii) man isoliert Glukose hieraus.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die genannte β-2,1-Fructosyltransferase erhalten wird aus einem Organismus der Gruppe: Aureobasidium pullulans, Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori, Aspergillus sydowi, Aureobasidium sp., Aspergillus niger, Penicillium roquefortii, Streptococcus mutans, Penicillium jancezewskii und höhere Pflanzen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei wenigstens eine der Verbindungen β-2,1-Fructosyltransferase oder β-2,6-Fructosyltransferase erhalten wird durch Expremieren in einem Wirt eines Fructosyltransferasegens, das für den Wirt nicht nativ ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Glukose halbchargenweise isoliert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reaktionsprodukt weiterhin ein verzweigtes Fructan enthält und das Verfahren weiterhin die Isolierung des verzweigten Fructans umfasst.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das verzweigte Fructan kontinuierlich isoliert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Glukose durch Membranfiltration oder Chromatographie isoliert wird.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das verzweigte Fructan durch Membranfiltration oder Chromatographie isoliert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die β-2,1-Fructosyltransferase eine kettenverlängernde Fructosyltransferase ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die β-2,6-Fructosyltransferase eine verzweigende Fructosyltransferase ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die β-2,1-Fructosyltransferase eine verzweigende Fructosyltransferase ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die β-2,6-Fructosyltransferase eine kettenverlängernde Fructosyltransferase ist.
Reaktor zur Herstellung von handelsüblichen Mengen von Glukose, enthaltend: (a) ein Reaktorgefäß; (b) einen Einlass für Sucrose; (c) einen Auslass für Glukose; und (d) eine β-2,1-Fructosyltransferase und eine β-2,6-Fructosyltransferase.
Reaktor nach Anspruch 13, enthaltend einen Auslass für ein verzweigtes Fructan.
Reaktor nach Anspruch 13, wobei der Einlass für Sucrose ein kontinuierlicher Einlass ist.
Reaktor nach Anspruch 13, wobei der Auslass für das verzweigte Fructan ein kontinuierlicher Auslass ist.
7. Reaktor nach Anspruch 13, wobei der Auslass für Glukose ein kontinuierlicher Auslass ist.