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DE69927262T2 - Cd40 bindende antikörper und ctl peptide zur behandlung von tumoren - Google Patents

Cd40 bindende antikörper und ctl peptide zur behandlung von tumoren Download PDF

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DE69927262T2
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Cornelis J. M. Melief
Rienk Offringa
Rene Toes
Stephen P. Schoenberger
Mark De Boer
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Original Assignee
Leids Universitair Medisch Centrum LUMC
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Description

  • Gebiet der Erfindung:
  • Die Erfindung betrifft CD40-bindende Moleküle zusammen mit CTL-aktivierenden Peptiden, einschließlich Tumorantigenen, in einer pharmazeutischen Zusammensetzung.
  • Hintergrund der Erfindung:
  • Viele Tumore entkommen der Überwachung unseres Immunsystems. Bei Krebspatienten liegt offensichtlich ein quantitativer und/oder qualitativer Defekt in bezug auf die spezifischen Mechanismen des Immunsystems vor, Tumorzellen zu zerstören. Einer dieser Mechanismen wird durch cytotoxische T-Zellen (CTL) bereitgestellt, welche Zellen, die durch ein Virus infiziert oder in Krebszellen umgewandelt sind, erkennen und abtöten können. Bislang wurde postuliert, daß dendritische Zellen (DC) T-Helferzellen stimulieren, welche wiederum die Aktivierung von CTL unterstützen. Die vorliegenden Erfinder haben gezeigt, daß die T-Helferzelle Helfersignale nicht direkt für die CTL bereitstellt (durch Freisetzung von IL2), sondern daß die T-Helferzelle ein Signal für die DC bereitstellt, welches bislang nicht beschriebene Zelloberflächen- und/oder lösliche Moleküle induziert, welche CTL in Abwesenheit von T-Helferzellen aktivieren können. Das von der T-Helferzelle in bezug auf die DC bereitgestellte Signal wird durch eine CD40L/CD40-Interaktion vermittelt. Dieses neue Ergebnis hat eine einzigartiges Möglichkeit zur Krebsimmuntherapie bereitgestellt.
  • Das Immunsystem ist imstande, autologe Zellen abzutöten, wenn diese durch ein Virus infiziert oder wenn diese zu Krebszellen umgewandelt werden. Ein derartiger, potentiell gefährlicher Mechanismus muß offensichtlich unter strenger Kontrolle stehen. Die CTL des Immunsystems zirkulieren als inaktive Vorläufer. Um aktiviert zu werden, muß die Vorläufer-T-Killerzelle ihr spezifisches Antigenpeptid erkennen, welches als MHC-Klasse-1-Moleküle auf professionellen APC präsentiert wird. Jedoch müssen die APC das Antigen auch in einem passenden kostimulatorischen Zusammenhang präsentieren, um diese T-Zellen zu primen bzw. zu instruieren, was unter anderem durch die kostimulatorischen Oberflächenmoleküle B7.1 und B7.2 und durch das Lymphokin IL-12 gewährleistet wird.
  • Bis vor kurzem wurde angenommen, daß eine T-Helferzelle, welche dasselbe Antigen auf denselben APC erkennt, benötigt wird, um die CTL vollständig zu aktivieren. Die spezifische T-Helferzelle würde für die Aktivierung der CTL benötigte Cytokine, wie IL-2, bereitstellen. Guerder und Matzinger (J. Exp. Med. 176:553 (1992)) schlugen jedoch das "Lizenzmodel" für die CTL-Aktivierung vor. In diesem Model wurde vorgeschlagen, daß die T-Helferzelle, wenn diese ihr Antigen auf einer professionellen APC erkennt, ein Aktivierungssignal in bezug auf die APC aussenden würde, welches im Ergebnis imstande sein soll, eine CTL ohne zwingende Anwesenheit der T-Helferzelle nachfolgend zu aktivieren. Erst vor kurzem wurde der molekulare Mechanismus des Lizenzmodels aufgeklärt. Schoenberger et al. (Nature 393:480 (1998)) beschrieben die Rolle des CD40L/CD40-Weges innerhalb des Lizenzmodels. Die Interaktion zwischen T-Helferzellen und DC durch die CD40/CD40L-Bindung resultiert in der Aktivierung der DC, wobei es der DC ermöglicht wird, naive CTL in wirksamer Weise zu primen.
  • DC zirkulieren durch die Gewebe unseres Körpers und können auf diese Weise Antigene aufnehmen, verarbeiten und präsentieren. Nach Aufnahme von Antigenen migrieren sie zu den ableitenden Lymphknoten, wo sie den T-Zellen das Antigen präsentieren. Es ist wohlbekannt, daß eine DC aktiviert werden muß, um optimal zu arbeiten. Ruhende DC exprimieren nur geringe Mengen an MHC und kostimulierenden Molekülen und sind schlechte Stimulatoren von T-Zellen. DC können durch inflammatorische Cytokine (Entzündungsmediatoren) und bakterielle Produkte aktiviert werden, was zu einer Hochregulierung von MHC und kostimulierenden Molekülen führt. Die Aktivierung von DC zu vollständig gereiften DC, welche optimale Mengen an MHC-Molekülen, kostimulierenden Molekülen und Lymphokinen, wie IL-12, exprimieren, erfordert ein zusätzliches Ansteuern bzw. eine zusätzliche Triggerung dieser Zellen durch den CD40-Rezeptor. Folglich führt die Kombination von inflammatorischen Cytokinen an der Stelle der Antigenaufnahme und der CD40L/CD40-Interaktion während der Interaktion der T-Helferzellen zu einer optimalen Leistungsfähigkeit, die DC zu einer CTL-Aktivierung zu veranlassen bzw. zu lizenzieren.
  • Viele Tumore entkommen der Immunüberwachung mittels spezifischer CTL-Mechanismen. Wenn DC Tumorantigene unter nichtinflammatorischen bzw. nichtentzündlichen Bedingungen erfaßt bzw. aufnimmt, kann die Anzahl an aktivierten T-Helferzellen zu gering sein, um genügend aktivierte CTL zu induzieren, um eine geeignete Antitumorantwort hervorzurufen. Dieses Konzept veranlaßte Forscher, das Immunsystem durch Verabreichung von Cytokinen, wie IL-2 und IL-12, welche die CTL-Aktivität direkt stimulieren, oder durch Erhöhung der Antigenpräsentation durch Verabreichung von GM-CSF-transfizierten Tumorzellen zu unterstützen. Diese Strategien führten zu unterschiedlichen, jedoch vielversprechenden Ergebnissen.
  • Es ist offensichtlich, daß weiterhin ein großer Bedarf besteht, Wege zu finden, um schützende Antitumorantworten unter Einbezug zellulärer und humoraler Immunität hervorzurufen und/oder zu verstärken. Es wurde gefunden, daß der CD40-Aktivierungsweg einen bedeutenden immunregulatorischen Weg für die Erzeugung von primären humoralen und zellulären Immunantworten darstellt. Wie zuvor beschrieben, ist der CD40-Weg in bezug auf DC verantwortlich für die Induktion von Antitumor-CTL-Antworten. Zusätzlich stimuliert die Aktivierung des CD40-Weges in bezug auf Makrophagen eine starke tumorabtötende Aktivität.
  • Zusammenfassung der Erfindung:
  • Die Erfindung betrifft CD40-bindende Antikörper zusammen mit CTL-aktivierenden Peptiden, einschließlich Tumorantigenen, in einer pharmazeutischen Zusammensetzung. Eine derartige Zusammensetzung ist zur Steigerung der Antitumorwirksamkeit eines peptidischen Tumorimpfstoffes oder andernfalls zur CTL-Aktivierung geeignet, so daß die aktivierten CTL gegen Tumore oder infizierte Zellen wirken können. Die CD40-bindenden Moleküle umfassen Antikörpermoleküle, einschließlich Immunoglobulinfragmente, wie Fab, (Fab')2 und Fv. CTL-aktivierende Peptide umfassen das vom Adenovirus abstammende Peptid E1A mit der Sequenz SGPSNTPPEI (SEQ ID NO: 2) und das vom humanen Papillomavirus Typ 16 abstammende Peptid HPV16 E7 mit der Sequenz RAHYNTVTF (SEQ ID NO: 3).
  • Der CD40-bindende Antikörper und das CTL-aktivierende Peptid können einem Patienten durch geeignete Mitteil verabreicht werden, umfassend Injektion oder Verabreichung eines ein derartiges Moleküls und ein Peptid codierenden Genkonstrukts, wobei das Molekül und das Peptid dabei in vivo oder ex vivo hergestellt werden. Eine derartige Gentherapie wird mittels wohlbekannter Verfahren durchgeführt. Wenn die Transfektion oder Infektion des Genkonstrukts ex vivo durchgeführt wird, können die infizierten oder transfizierten Zellen dem Patienten verabreicht werden; oder diese Schritte können in vivo durchgeführt werden, wobei der Antikörper und das Peptid endogen hergestellt werden. Die Transfektion oder Infektion, sofern ex vivo durchgeführt, kann mittels üblicher Verfahren, umfassend Elektroporation, Calciumphosphat-Transfektion, Mikroinjektion, oder mittels Inkorporation des Genkonstrukts in geeignete Liposomen durchgeführt werden. Vektoren, umfassend einen Retrovirus-, Adenovirus- oder Parvovirusvektor, oder Plasmide, können zur Inkorporation der Genkonstrukte, welche dann in vivo oder ex vivo exprimiert werden, verwendet werden.
  • Es wird hier gezeigt, daß die Unterstützung der T-Zellen für das CTL-Priming bzw. für die CTL-Instruktion durch CD40/CD40Ligand(CD40L)-Interaktionen vermittelt wird und daß ein Fehlen bzw. Mangel an CTL-Priming in Abwesenheit von CD+-T-Zellen durch eine von monoklonalen Antikörpern (mAb) vermittelte CD40-Aktivierung von Knochenmarks-APC in Gegenwart von CTL-aktivierenden Peptiden, umfassend Tumorantigene, zurückgesetzt werden kann. Darüber hinaus führt eine durch CD4+-T-Zellen ausgedrückte bzw. exprimierte Blockade von CD40L zu einem Fehlen des Aufbaus einer CTL-Immunität. Dieser Defekt kann durch eine in vivo-CD40-Triggerung aufgehoben werden. Eine in vivo-Triggerung von CD40 kann die Wirksamkeit von peptidbasierten Antitumorimpfstoffen deutlich erhöhen oder andernfalls CTL aktiveren, um zu einer Antitumorreaktion oder Antireaktion gegenüber infizierten Zellen zu führen.
  • Es ist zudem festgestellt worden, daß CTL-aktivierende Peptide tolerogen werden können, was bedeutet, daß die Wirtsreaktion gegen Zellen, welche ein solches Peptid exprimieren, in Abwesenheit von Anti-CD40 inhibiert ist. Jedoch wandelt ein derartiges Peptid in Kombination mit einem aktivierenden Anti-CD40-Antikörper eine Toleranz in eine starke CTL-Aktivierung um. Darüber hinaus kann, wie zuvor festgestellt, eine CD40-Ligation bzw. CD40-Bindung ei nen bereits schützenden tumorspezifischen Peptidimpfstoff mit der Fähigkeit, eine therapeutische CTL-Immunität in tumortragenden Mäusen hervorzurufen, bereitstellen.
  • Diese Ergebnisse veranschaulichen insgesamt, daß das CD40/CD40Ligand-Paar als ein Schalter fungiert, welcher bestimmt, ob naive peripherale CTL geprimt oder tolerisiert werden. Daher können CD40-bindende Mittel, wie monoklonale Antikörper, und andere stimulatorische Liganden in effektiver Weise in Kombination mit einem CTL-aktivierenden Peptid verwendet werden.
  • Kurze Beschreibung der Figuren:
  • 1: Cross-Priming von E1B-spezifischen CTL erfordert CD4+-T-Helferzellen
  • Splenozyten von normalen (a) oder CD4-depletierten B6- (b) Mäusen, welche mit Ad5E1-BALB/c MEC immunisiert wurden, wurden bei verschiedenen Effektor/Target-Verhältnissen auf Lyse von syngenischen MEC-Targetzellen getestet, welche mit dem E1B192-200-Peptid (durchgezogene Linien), welches vom humanen Adenovirus stammt und die Sequenz VNIRNCCYI (SEQ ID NO: 1) aufweist, oder einem Dd-beschränkten Kontrollpeptid HPV-16 E749-57 (gestrichelte Linien) beladen waren. Jede Linie repräsentiert eine Maus. Die gezeigten Daten repräsentieren ein Experiment von drei Experimenten, die mit denselben Ergebnissen durchgeführten wurden.
  • 2: CD40-Aktivierung ersetzt CD4+-T-Helferzellen
  • Splenozyten wurden CD4-depletierten (a, b) oder Klasse-II-defizienten I-Ab-Knockout (KO) (c, d) B6-Mäusen entnommen, welche mit Ad5E1-BALB/c MEC immunisiert werden, werden entweder mit dem CD40-aktivierenden Antikörper (Ab) FGK45 (a, c) oder einem isotypischen Kontrollantikörper (b, d) behandelt. Diese Splenozyten wurden in bezug auf E1B-spezifische CTL-Aktivität an syngenischen MEC-Targetzellen getestet, welche entweder mit dem E1B192-200-Peptid (durchgezogene Linien) oder dem HPV-16 E749-57-Kontrollpeptid (gestrichelte Linien) beladen waren. Jede Linie repräsentiert eine einzelne Maus. Die dargestellten Daten stammen von zwei unabhängigen Experimenten. E/T-Verhältnis, Effektor/Target(Ziel)-Verhältnis.
  • 3: B-Zellen sind für das Cross-Priming von APC oder für die Anti-CD40-vermittelte Wiederherstellung von Cross-Priming nicht notwendig
  • Splenozyten wurden von unbehandelten (a), CD4-depletierten, B-Zell-defizienten B6 MT-Mäusen (b, c) genommen, welche mit Ad5E1-BALB/c MEC immunisiert waren und welche entweder einen isotypischen Kontrollantikörper (b) oder den CD40-aktivierenden Antikörper FGK45 (c) erhielten. Diese Splenozyten wurden in bezug auf eine E1B-spezifische CTL-Aktivität an syngenischen MEC-Targetzellen getestet, welche entweder mit dem E1B192-200-Peptid (durchgezogene Linien) oder dem HPV E749-57Kontrollpeptid (gestrichelte Linien) beladen waren. Jede Linie repräsentiert eine Maus. Die gezeigten Daten repräsentieren ein Experiment von zwei Experimenten, die mit denselben Ergebnissen durchgeführt wurden.
  • 4: CD40L-Blockade verhindert das Cross-Priming von E1B-spezifischen CTL
  • Splenozyten wurden B6-Mäusen entnommen, die mit Ad5E1-BALB/c MEC immunisiert und mit dem CD40L-blockierenden Antikörper MR-1 (a) oder Kontrollantikörper (b) behandelt wurden, oder von mit dem CD40L-blockierenden Antikörper MR-1 in Kombination mit dem CD40-aktivierenden Antikörper FGK45 (c) behandelten Mäusen 24 Stunden nach Immunisierung entnommen. Diese Splenozyten wurden in bezug auf eine E1B-spezifische CTL-Aktivität an syngenischen MEC-Targetzellen getestet, welche mit dem E1B192-200-Peptid (durchgezogene Linien) oder dem HPV-16 E749-57-Kontrollpeptid (gestrichelte Linien) beladen waren. Jede Linie repräsentiert eine Maus. Die gezeigten Daten repräsentieren ein Experiment von drei Experimenten, die mit denselben Ergebnissen durchgeführt wurden. E/T-Verhältnis, Effektor/Target-Verhältnis.
  • 5: Mäuse. denen das E1A-Peptid s. c. injizierte wurde sind nicht länger im stande, E1A-spezifische CTL auszubilden
  • C57BL/6-Mäusen wurde zweimal (Intervall: eine Woche) 20 μg E1A-Peptid (a, b) oder Kontrollpeptid (c, d) in IFA s.c. injiziert, und die Mäuse wurden einen Tag später mit SAMB7 (b, d), einer Zellinie, welche hohe Mengen an E1A-Peptid exprimiert, i. p. konfrontiert bzw. angeregt. Von diesen Mäusen stammende Bulk-Kulturen wurden in bezug auf eine E1A-spezifische Cytotoxizität an Targetzellen getestet, welche mit dem E1A-Peptid (-∎-) oder dem HPV16 E7-Peptid (-O-) gepulst wurden. Eine spezifische Lyse von repräsentativen Bulk-Kulturen bei verschiedenen Effektor/Target (E/T)-Verhältnissen ist gezeigt. Dieses Experiment wurde viermal mit vergleichbaren Ergebnissen wiederholt.
  • 6: Toleranzauslösendes bzw tolerisierendes E1A-Peptid wird systemisch nach s.c.-Injektion in IFA schnell verteilt
  • Von unbehandelten C57BL/6-Mäusen (-) oder von Mäusen, welchen 16 Stunden zuvor 100 μg E1A- oder HPV16 E7-Peptid in IFA s.c. injiziert wurde, stammende Milzzellen wurden als Stimulatorzellen für einen E1A-spezifischen CTL-Klon verwendet. Die [3H]-Thymidininkorporation (cpm) ± S.E.M. ist für verschiedene Effektor/Stimulator-Konzentrationen ohne Abzug der Hintergrundereignisse gezeigt. Die Ergebnisse sind für fünf unabhängige Experimente repräsentativ.
  • 7: CTL-Toleranzinduktion wird in ein CTL-Priming nach CD40-Triggerung in vivo umgewandelt
  • Wildtyp-C57BL/6-Mäusen (a, b) und H-2b CD40-/--Mäuse (c, d) wurden 20 μg E1A-Peptid in IFA allein (c), in Kombination mit einem Ratte-IgG2a-Kontrollantikörper (a) oder in Kombination mit dem Anti-CD40 mAb FGK-45 (b, d) s.c. injiziert. Bulk-Kulturen von diesen Mäusen wurden in bezug auf eine E1A-spezifische Cytotoxizität an Targetzellen, welche mit dem E1A-Peptid (-∎-), dem HPV16 E7-Peptid (-O-) gepulst waren, oder an Ad5E1-transformierten Tumorzellen (-♦-) getestet. Spezifische Lyse von repräsentativen Bulk-Kulturen bei verschiedenen E/T-Verhältnissen sind gezeigt. Dieses Experiment wurde 18mal (B6-Mäuse) bzw. zweimal (CD40-/--Mäuse) mit vergleichbaren Ergebnissen wiederholt. In (e) ist die prozentuale spezifische Lyse von 23 bzw. 37 Bulk-CTL-Kulturen, welche von B6-Mäusen stammen, die mit dem E1A-Peptid in IFA allein (links) oder in Kombination mit dem Anti-CD40 mAb (rechts) stammen, bei einem E/T von 60 dargestellt. Mittelwerte und Standardabweichungen von jeder Gruppe sind gezeigt (E1A gegen E1A + Anti-CD40: p<0,01, Student t-Test).
  • 8: Therapie von HPV16 E6 und E7 transformierten Zellen durch Kombinationsbehandlung mit Peptid zusammen mit einer in vivo CD40-Triggerung
  • Mäusen wurden 25.000 HPV16 transformierte syngenische Zellen (TC-1) s.c. injiziert. C57BL/6-Mäuse wurden unbehandelt belassen (-O-) oder erhielten 6 Tage später 100 μg HPV16 E7-Peptid i.p. in IFA (-☐-), 100 μg HPV16 E7-Peptid i.p. in IFA in Kombination mit dem Anti-CD40 mAb FGK-45 (-∎-) oder ein Kontrollpeptid i.p. in IFA in Kombination mit dem Anti-CD40 mAb FGK-45 (-⦁-). Der Prozentwert an tumortragenden Mäusen ist für verschiedene Behandlungsgruppen (n=10) in (a) gezeigt. Die Unterschiede zwischen der Gruppe, welche mit dem HPV16-Peptid plus dem Anti-CD40 mAb behandelt wurde und den anderen drei Gruppen waren statistisch signifikant (p<0,01) (Log-Rank Test). In (b) ist der Prozentwert der überlebenden Tiere gezeigt (E7-Peptid-behandelte Gruppe gegen E7-Peptid plus Anti-CD40 behandelte Gruppe: p = 0,002, Log-Rank Test).
  • Durchführung und Verwendung der Erfindung:
  • Die CD40-bindenden Antikörper nach der Erfindung können mittels herkömmlicher Herstellungs- und Screeningverfahren erhalten werden. Ein von der Ratte und ein vom Hamster stammender monoklonaler Anti-Maus-CD40-Antikörper ("Mabs") sind jeweils in Nature 393: 474-77 (1998) beschrieben und kommerziell erhältlich (Pharmingen, Inc., CA). Der Anti-Maus-CD40 MAb, bezeichnet als FGK45, welcher im Rahmen der nachfolgend beschriebenen Experimente verwendet wird, ist von Rolink A. et al., Immunity 5, 319-330 (1996) beschrieben. Anti-humane CD40 MAb können entsprechend wohlbekannter Techniken hergestellt werden und sind von G. Köhler und C. Milstein (Nature, 1975: 256: 495-497) beschrieben. MAb können durch Immunisierung von Nagetieren (z. B. Mäusen, Ratten, Hamstern und Meerschweinchen) entweder mit nativem CD40, wie es auf Zellen exprimiert wird oder aus menschlichem Plasma oder Urin aufgereinigt wird, oder mit rekombinantem CD40 oder seinen Fragmenten, welche in einem eukaryotischen oder prokaryotischen System exprimiert werden, erhalten werden. Andere Tiere können für die Immunisierung verwendet werden, z. B. nichthumane Primaten, transgene Mäuse, welche humane Immunoglobuline exprimieren, und Mäuse mit Schwerem Kombiniertem Immundefekt (SCID), welchen humane B-Lymphozyten transplantiert sind. Hybridomas können mittels üblicher Verfahren hergestellt werden, indem B-Lymphozyten von immunisierten Tieren mit Myelomzellen (z. B. Sp2/0 und NS0) fusioniert werden, wie von G. Köhler und C. Milstein ld. beschrieben. Zusätzlich können Anti-CD40 MAb mittels Screening von rekombinanten Einzelketten-Fv- oder -Fab-Banken von humanen B-Lymphozyten in Phage/Display-Systemen hergestellt werden. Die Spezifität von MAb zu CD40 kann mittels Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Western-Immunoblotting oder anderen immunochemischen Verfahren getestet werden. Die Aktivierungsaktivität der Antikörper auf CTL in Kombination mit einem CTL-aktivierenden Peptid kann unter Verwendung der in den nachfolgenden Beispielen beschriebenen Assays bzw. Untersuchungen bestimmt werden.
  • Zur Behandlung von Menschen würden die Anti-CD40 MAb vorzugsweise als chimäre, deimmunisierte, humanisierte oder humane Antikörper verwendet. Derartige Antikörper können die Immunogenizität verringern und somit eine humane Anti-Maus-Antikörper (HAMA)-Antwort vermeiden. Es ist bevorzugt, daß der Antikörper ein IgG4, IgG2 oder ein anderes genetisch mutiertes IgG oder IgM ist, was die antikörperabhängige zelluläre Cytotoxizität nicht erhöht (S.M. Canfield und S.L. Morrison, J. Exp. Med., 1991: 173: 1483-1491) und eine vermittelte Cytolyse ergänzt (Y. Xu et al., J. Biol. Chem., 1994: 269: 3468-3474; V.L. Pulito et al., J. Immunol., 1996; 156: 2840-2850).
  • Chimäre Antikörper werden mittels wohlbekannter Rekombinationsverfahren hergestellt und haben eine tierische variable Region und eine humane konstante Region. Humanisierte Antikörper haben einen höheren Grad bzw. Gehalt an humanen Peptidsequenzen als chimäre Antikörper. In einem humanisierten Antikörper stammen nur die Complementarity Determining Regions (CDR), welche für die Antigenbindung und die Spezifität verantwortlich sind, von Tieren; und sie weisen eine Aminosäuresequenz auf, welche dem tierischen Antikörper entspricht; und im wesentlichen sämtliche der verbleibenden Bereiche des Moleküls (mit Ausnahme kleiner Bereiche der framework-Region bzw. Gerüstregion innerhalb der variablen Region bei einigen Fällen) sind humanen Ursprungs und entsprechen in bezug auf die Aminosäuresequenz einem menschlichen Antikör per. Siehe L. Riechmann et al., Nature, 1988; 332: 323-327; G. Winter, U.S.-Patent Nr. 5,225,539; C. Queen et al., U.S.-Patent Nr. 5,530,101.
  • Deimmunisierte Antikörper sind Antikörper, in denen die T- und B-Zellepitope eliminiert worden sind, wie in der internationalen Patentanmeldung PCT/GB 98/01473 beschrieben. Sie weisen eine reduzierte Immunogenizität auf, wenn sie in vivo appliziert werden.
  • Humane Antikörper können auf verschiedene Weise hergestellt werden, umfassend die Verwendung von humanen Immunoglobulinexpressionsbanken (Strategene Corp., La Jolla, Kalifornien), um Fragmente menschlicher Antikörper (VH, VL, Fv, Fd, Fab oder (Fab')2 herzustellen, wobei diese Fragmente verwendet werden, um vollständige humane Antikörper unter Verwendung von Verfahren, welche denen zur Herstellung von chimären Antikörpern entsprechen, herzustellen. Humane Antikörper können gleichermaßen in transgenen Mäusen mit einem humanen Immunoglobulingenom hergestellt werden. Solche Mäuse sind erhältlich von Abgenix, Inc., Fremont, Kalifornien und Medarex, Inc., Annandale, New Jersey.
  • Man kann gleichermaßen bindende Einzelpeptidkettenmoleküle herstellen, in welchen die schwere Kette- und leichte Kette-Fv-Regionen verbunden sind. Einzelkettenantikörper ("ScFv") und das Verfahren zu ihrer Herstellung sind in dem U.S.-Patent Nummer 4,946,778 beschrieben. Alternativ kann Fab mit denselben Mitteln konstruiert und exprimiert werden (M.J. Evans et al., J. Immunol. Meth., 1995; 184: 123-138). Sämtliche der vollständigen und partiellen humanen Antikörper sind weniger immunogen als vollständig mausartige Mab Auch die Fragmente und Einzelkettenantikörper sind gleichermaßen weniger immunogen. Sämtliche Typen dieser Antikörper führen daher mit geringerer Wahrscheinlich zu einer Immun- oder allergischen Antwort. Folglich eignen sie sich besser für die in vivo-Verabreichung beim Menschen als vollständig tierische Antikörper, insbesondere wenn eine wiederholte oder Langzeitverabreichung notwendig ist. Zusätzlich kann die geringere Größe des Antikörperfragments die Bioverfügbarkeit im Gewebe verbessern, welche in bezug auf eine bessere Dosisakkumulation bei akuten Krankheitsindikationen, wie einer Tumorbehandlung, kritisch ist.
  • Auf Basis der molekularen Strukturen der variablen Regionen der Anti-CD40 mAb oder der bekannten CTL-aktivierenden Peptide könnte man eine Molekularmodellierung und ein rationales Molekulardesign einsetzen, um Moleküle zu entwickeln und zu screenen, welche die molekularen Strukturen der Bindungsregion des Antikörpers bzw. der Peptide nachahmen und CTL aktivieren. Diese kleinen Moleküle können Peptide, Peptidmimetika, Oligonukleotide oder andere organische Verbindungen sein. Die nachahmenden Moleküle können zur Behandlung von Krebs und Infektionen verwendet werden. Alternativ kann man großtechnische Screening-Verfahren, welche üblicherweise in diesem Bereich verwendet werden, einsetzen, um geeignete Moleküle aus Verbindungs- bzw. Substanzbanken zu isolieren.
  • Die Dosierung des CD40-bindenden Antikörpers gemäß der Erfindung kann bereits mittels Extrapolation von in vitro-Tests und nachfolgend beschriebenen Assays bzw. Untersuchen oder von Tierexperimenten oder von menschlichen klinischen Untersuchungen bzw. Studien abgeleitet bzw. bestimmt werden. Die erfindungsgemäßen Antikörper werden vorzugsweise mittels Injektion verabreicht. Die Assays und Tests, welche die Wirksamkeit der Erfindung zeigen, werden nachfolgend beschrieben.
  • Beispiel 1: Signalgebung durch CD40 kann CD4+-T-Helferzellen in Bezug auf ein CTL-Priming ersetzen
  • Ein etabliertes Modelsystem wurde zur Untersuchung des Mechanismus der Unterstützung von T-Zellen in bezug auf die Primäraktivierung von in vivo-CD8+ CTL-Antworten verwendet. C57BL/6 (mit dem Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) H-26)-Mäuse, welche mit allogenen BALB/c (H-2d) Mäusembryozellen (MEC), die die frühe Region 1 des humanen Adenovirus Typ 5 (Ad5E1-BALB/c MEC) exprimieren, immunisiert wurden, entwickelten starke CTL-Antworten gegen H-2Db-beschränkte Epitope des Adenovirus-EIB-Proteins (EIB192-200) (1a). Da die allogenen H-2d MHC-Moleküle, welche durch die Ad5EI-BALC/c MEC exprimiert worden sind, keine H-2b-beschränkte Wirts-CTL primen können, erfordert die Entwicklung von E1B-spezifischen CTL ein Cross-Priming, also die Aufnahme und H-2b-beschränkte Repräsentation des Antigens durch Wirts-APC. Cross-Priming von EIB-spezifischen CTL ist grund sätzlich helferabhängig (1b), da vor Immunisierung CD4+-T-Helferzellen (Th)-depletierte Mäuse keine E1B-spezifische CTL-Antwort durchführen.
  • Zur Untersuchung, ob eine Signalgebung durch CD40 die CD4+-T-Helferzellen beim CTL-Priming ersetzen kann, wurden Mäuse in bezug auf CD4+-T-Zellen in vivo depletiert, bevor sie mit Ad5E1BALB/c MEC immunisiert wurden. Einen Tag nach Immunisierung erhielten die Mäuse eine einzelne Injektion des aktivierenden Antikörpers Anti-Maus CD40 mAb FGK45 oder eines Isotyp-passenden Kontrollantikörpers. Die Verabreichung von FGK45 an CD4-depletierten, immunisierten Mäusen resultierte in einer wirksamen Wiederaufnahme der E1B-spezifischen CTL-Antworten (2a), wohingegen die Behandlung mit dem Kontrollantikörper nicht hierzu führte (2b). Das Primen von E1B-spezifischen CTL wurde in naiven Mäusen, welche nur mit FGK45 behandelt wurden, nicht ermittelt (nicht gezeigt). Zur Bestimmung der Wahrscheinlichkeit, ob der Effekt von FGK45 durch verbliebene D4+-Zellen vermittelt wurde, welche durch Behandlung mit dem Anti-CD4-Antikörper nicht depletiert wurden, wurden B6 I-Ab Knockout-Mäuse, welche keine gereiften, funktionalen peripheralen CD4+-T-Zellen aufweisen, mit Ad5EI-BALB/c MEC immunisiert. Die Antwort auf die Immunisierung in diesen Mäusen spiegelt das wieder, was in den CD4-depletierten Mäusen beobachtet wurde, nämlich daß E1B-spezifische CTL nur in Mäusen ermittelt werden könnten, welche den CD40-aktivierenden Antikörper (2c) erhielten und nicht in jenen, welche den Kontrollantikörper erhielten (2d).
  • Es wurde gleichermaßen untersucht, ob die Erfordernis von Anti-CD40-Antikörpern in bezug auf das Primen von CTL in CD4-depletierten Mäusen durch bakterielle Lipopolysaccharide (LPS) (50 μg, intravenös), einem wirksamen Induktionsmittel für proinflammatorische Cytokine, oder durch Verabreichung von IL-2 (1 × 105 Einheiten in einem unvollständigen Freund-Zusatz, subkutan), gefolgt von einer Immunisierung mit Ad5EI-BALB/c MEC, ersetzt werden kann. Während CD4-depletierte Mäuse, welche mit FGK45 behandelt wurden, eine starke E1B-spezifische CTL-Aktivität zeigten, führten weder die LPS- noch die IL-2-Behandlung zu einem meßbaren CTL-Priming (nicht gezeigt).
  • Die Ligation von CD40 auf B-Zellen hält die kostimulatorischen Aktivität aufrecht, was eine Rolle dieser Zellen in der Wiedererlangung des CTL-Primens durch Behandlung mittels CD40-aktivierenden Antikörpern nahelegt. Um diese Frage zu beantworten, wurden B6 MT-Mäuse, welche keine gereiften B-Zellen aufweisen, mit allogenen Ad5EI-BALB/c MEC immunisiert. Das Cross-Priming von E1B-spezifischen CTL erforderte keine gereiften B-Zellen (3a), wenn CD4+-Zellen jedoch depletiert wurden, entwickelten die B-Zellen-defizienten Mäuse keine E1B spezifische CTL-Antwort (3b). Eine Aktivierung mittels CD40 mit dem monoklonalen Antikörper FGK45 führte zu einer vollständigen Wiedererlangung der Fähigkeit von CD4-depletierten MT-Mäusen, E1B-spezifische CTL zu primen (3c). Somit werden B-Zellen weder als APC oder zusätzliche Zellen für das Cross-Priming in diesem Modelsystem für die CD40-vermittelte Wiedererlangung von Cross-Priming von CTL in Abwesenheit von CD4+-T-Helferzellen benötigt. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Aktivierung von Knochenmarks-APC durch CD40 die Erfordernis von CD4+-T-Helferzellen in bezug auf das Cross-Priming von E1B-spezifischen CTL überbrücken kann.
  • Beispiel 2: Die Blockierung der Fähigkeit von CD4+-T-Helferzellen, mit APC durch den CD40L/CD40-Weg zu interagieren, verhindert antigensezifische CTL-Antworten in herkömmlichen Mäusen
  • Wenn die CD40L/CD40-Interaktion den physiologischen Weg darstellt, welcher durch CD4+-T-Helferzellen verwendet wird, um CTL zu unterstützen, ist anzunehmen, daß die Blockierung der Fähigkeit der CD4+-T-Zellen, mit APC durch CD40L/CD40-Interaktion zu interagieren, zu einer Verringerung des Primens von E1B-spezifischen CTL-Antworten in herkömmlichen Mäusen führt. B6-Mäuse wurden mit Ad5E1-BALB/c MEC immunisiert und dann entweder mit dem CD40L-blockierenden Antikörper MR1 oder einem Kontrollantikörper behandelt. Die Blockierung von CD40L führt zu drastisch reduzierten E1B-spezifischen CTL-Antworten (4a) im Vergleich zu dem wirksamen CTL-Priming für die Mäuse, welche die Kontrollantikörper erhielten (4b). Der durch die CD40L-Blockade induzierte Defekt in bezug auf das Priming wurde vollständig nach CD40-Signalgebung durch FGK45 wiederhergestellt (4c). Somit ist der durch CD40L-Blockade induzierte Defekt in dem CTL-Priming mit dem Ausfall der TH-Zellen, CD40L vermittelte Signale weiterzuleiten, begründet und nicht damit, diese nicht zu empfangen.
  • Beispiel 3: E1A-spezifische CTL-Unempfindlichkeit nach Peptidverabreichung
  • Es wurde ein bereits beschriebenes Modelsystem verwendet (Toes et al., J. Immunol., 156:3911 (1996)). Es wurde gezeigt, daß eine s.c.-Impfung mit dem von Ad5E1A-stammenden CTL-Epitop SGPSNTPPEI (SEQ ID NO: 2) in IFA die Mäuse daran hindert, das Auswachsen von Ad5EIA-exprimierenden Tumoren zu kontrollieren. Dies zeigt, daß der E1A/IFA-Impfstoff eher eine Supression bzw. Unterdrückung als eine E1A-spezifische CTL-Immunität induziert. Darüber hinaus unterdrückt eine Verabreichung des E1A/IFA-Impfstoffes an T-Zell-rezeptor (TCR)-transgenen Mäusen, welche die TCR α- und β-Ketten eines E1A-spezifischen CTL-Klons exprimieren, die tumorspezifische CTL-vermittelte Immunität stark. Diese Experimente untersuchten die Wirkung einer Peptidverabreichung an einer monoklonalen CTL-Population. Um zu ermitteln, ob eine s.c. E1A-Peptidimpfung gleichermaßen eine E1A-spezifische CTL-Toleranz auf dem polyklonalen CTL-Level hervorruft, wurde Wildtyp (wt)-C57BL/6-Mäusen entweder E1A-Peptid (5a und 5b) oder ein Kontrollpeptid (5c und 5d) injiziert. Einen Tag später wurden die Mäuse mit einer snygenischen Zellinie konfrontiert, welche hohe Mengen des E1A-Peptids an ihrer Oberfläche exprimiert bzw. aufzeigt (5b und 5d). Die Injektion dieser Zellinie in Mäuse, welche mit dem Kontrollpeptid instruiert bzw. geprimed wurden, induziert bereits eine E1A-spezifische Immunität (5d). Jedoch war die Fähigkeit der Mäuse E1A-spezifische CTL-Antworten aufzuzeigen nach Injektion des E1A/IFA-Impfstoffs aufgehoben (5b). Diese Ergebnisse zeigen, daß die Injektion des E1A-Peptids nicht nur zu einer E1A-spezifischen Toleranz in TCR-transgenen Mäusen führte, sondern auch in Mäusen, die ein polyklonales E1A-spezifisches T-Zellrepertoire exprimieren.
  • Da die s.c.-Injektion des E1A/IFA-Impfstoffs zu einer systemischen CTL-Toleranz führt, wurde untersucht, ob das E1A-Peptid systemisch verteilt und dem Vorläufer-CTL in der Peripherie präsentiert wurde. Daher wurde Mäusen das E1A-Peptid oder ein vom humanen Papillomavirus (HPV) 16 E7 stammendes Kontrollpeptid, emulgiert in IFA, injiziert. Von diesen Mäusen wurden Milzzellen 16 Stunden später isoliert und als Stimulatorzellen für einen E1A-spezifischen CTL-Klon in vitro verwendet. Splenozyten von Mäusen, welchen das E1A-Peptid s.c. injiziert wurde, induzierten eine spezifische Proliferation, wohingegen Splenozyten von Mäusen, welchen das E7-Peptid s.c. injiziert wur de, dies nicht vermochten (6). Darüber hinaus proliferierte ein Kontroll-CTL-Klon nicht auf Milzzellen, welche von E1A-injizierten Mäusen stammten (Ergebnisse nicht gezeigt). Somit zeigen diese Ergebnisse, daß das s.c. injizierte E1A-Peptid in IFA systemisch unter anderem durch Splenozyten in der Peripherie präsentiert wird.
  • Im Hinblick auf die oben beschriebenen Toleranzeffekte des E1A-Peptidimpfstoffes, ergab sich die Frage, ob eine in vivo-CD40-Triggerung ausreicht, um eine peripherale Tolerisierung der CTL zu verhindern und ein CTL-Priming wieder hervorzurufen. Daher wurde untersucht, ob die Injektion tolerisierender Peptide in Kombination mit der in vivo-CD40-Triggerung die Induktion einer peripheralen CTL-Toleranz verhindert, was zu einer tumorspezifischen CTL-Immunität führt.
  • In den Beispielen 1 und 2 wurde gezeigt, daß die in vivo-CD40-Triggerung die Erfordernis von CD4+-T-Helferzellen in bezug auf das Primien von helferabhängigen CTL-Antworten ersetzen kann. Da die von CD4+-T-Zellen vermittelte Helferaktivität in bezug auf die Prävention der Induktion peripheraler CTL-Toleranz einbezogen ist, haben die Erfinder die Frage gestellt, ob eine in vivo-CD40-Triggerung ausreicht, eine peripherale E1A-spezifische CTL-Tolerisierung zu verhindern. Zu diesem Zweck wurde Mäusen der E1A/IFA-Impfstoff in Kombination mit dem aktivierenden Anti-CD40 MAb FGK-45 injiziert. Mäuse, welche diese Kombination erhielten, zeigten starke E1A-spezifische CTL-Antworten (7b und 7e), wohingegen Mäuse, welche den E1A/IFA-Impfstoff (7e) oder MAb allein erhielten, dies nicht zeigten (nicht dargestellt). Die Kombination von E1A/IFA-Impfstoff und Anti-CD40 mAb konnte CTL in CD40-defizienten Mäusen nicht hervorrufen bzw. auslösen (7c und 7d). Weiterhin konnte die Koinjektion des E1A/IFA-Impfstoffs mit einem isotypisch aufgebauten Kontroll-mAb (6a) oder IL-2 nicht die durch den E1A/IFA-Impfstoff hervorgerufene CTL-Toleranz in ein CTL-Priming umwandeln (nicht gezeigt). Der Bereich und die Variation der Antworten auf die E1A-Epitope in bezug auf die mit E1A-Peptid allein oder mit E1A-Peptid plus Anti-CD40 geimpften Tieren ist in 7e gezeigt. Somit kann die systemische CD40-Aktivierung eine peptidinduzierte peripherale CTL-Toleranz in eine peptid- und tumorspezifische CTL-vermittelte Immunität umwandeln.
  • Die Induktion von E1A-spezifischer Immunität korrelierte stark mit der Gegenwart von CD8+-T-Zellen in der Milz von geimpften Mäusen, welche mit PE-konjugierten H-2-Db-Tetrameren, welche das E1A-Peptid (Db/E1A) beinhalten, markiert wurden. Zehn Tage nach Impfung konnten CD8+-T-Zellen, welche mit Db/E1A-Tetrameren markiert wurden, mittels Durchflußcytometrie in Mäusen, welchen das E1A-Peptid und das Anti-CD40 mAb injiziert wurde, entdeckt werden, aber nicht in Mäusen, welchen das E1A-Peptid allein injiziert wurde (nicht gezeigt). In Mäusen, welchen das E1A-Peptid injiziert wurde, betrug der Prozentwert der CD8+-Zellen, welche mit den Db/E1A-Tetrameren markiert wurden, etwa 3 %. In Mäusen, welche mit dem gesamten Adenovirus, der eine potente E1A-spezifische Immunität induziert, geimpft wurden, wurden vergleichbare Gehalte an Db/E1A-Tetramer-reaktiven CD8+-Milzzellen ermittelt. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Expansion von E1A-spezifischen CD8+-T-Zellen in Mäusen, welche den E1A/IFA-Impfstoff in Kombination mit dem Anti-CD40 mAb erhielten, substantiell und äquivalent war zu derjenigen, welche in Virus-geimpften Tieren gefunden wurde.
  • Beispiel 4: CD40-Triggerung steigert die Wirksamkeit von peptidbasierten Antikrebsimpfstoffen deutlich
  • Obwohl die oben beschriebenen Ergebnisse zeigen, daß die Bereitstellung einer Unterstützung durch CD40-Triggerung ausreichend ist, eine CTL-Toleranzausbildung nach Verabreichung eines tolerogenen Peptidimpfstoffs zu verhindern, beantworten diese nicht die Frage, ob die Wirksamkeit von Antikrebsimpfstoffen, welche üblicherweise eine Schutzimmunisierung anstelle einer Toleranz hervorrufen, durch Aktivierung mittels CD40 gesteigert werden kann. Es wurde untersucht, ob eine in vivo-CD40-Triggerung in bezug auf das Ergebnis einer Impfung mit einem HPV16 E7-abstammenden Peptid förderlich ist. Eine Impfung mit diesen Peptid induziert eine CTL-vermittelte Schutzimmunität gegen eine Konfrontation bzw. Herausforderung mit HPV16-transformierten Tumorzellen. Darüber hinaus kann dieses Peptid in einem therapeutischen Ansatz verwendet werden, wenn es auf in vitro-aktivierte DC beladen wird, was darauf hindeutet, daß die Stärke der Antitumorantwort vergrößert wird, wenn es durch aktivierte DC präsentiert wird.
  • Mäuse, welche das E7-Peptid in Kombination mit einer CD40-Triggerung erhielten, zeigten eine stärkere CTL-Antwort im Vergleich zu Mäusen, welche nur mit dem E7-Peptid behandelt wurden (Ergebnisse nicht gezeigt), was darauf hindeutet, daß eine CD40-Triggerung gleichermaßen die Wirksamkeit des HPV16 E7-Peptidimpfstoffs verstärkt und die oben beschriebenen Ergebnisse mit dem E1A-Peptid bestätigt werden. Darüber hinaus sind Mäuse, welche 6 Tage nach s.c.-Injektion von CD40-negativen HPV16 E6/E7-transformierten Tumorzellen mit dem HPV16 E7-Peptid allein (offene Rechtecke) imstande, das Tumorwachstum zu verlangsamen, jedoch erliegen schließlich die meisten Tiere dem Tumor (8). Wenn jedoch eine HPV16 E7-Peptidimpfung mit der Injektion von Anti-CD40 mAb kombiniert wurde, wurde das Tumorwachstum erheblich reduziert und 7 von 10 Mäusen wiesen den Tumor zurück, wohingegen Tiere, welchen ein Kontrollpeptid und der Anti-CD40-mAb injiziert wurde, nicht in der Lage waren, das Auswachsen des Tumors zu kontrollieren. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Wirksamkeit der Impfstoffsysteme deutlich gesteigert werden kann, wenn eine Immunisierung mit einer in vivo-CD40-Triggerung kombiniert wird. Diese Ergebnisse stellen die Basis für die Entwicklung von extrem wirksamen und neuen Antitumorimpfstoffen für Krebspatienten dar. Sequenzprotokoll
    Figure 00180001

Claims (11)

  1. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend einen CD40-bindenden Antikörper und ein CTL-aktivierendes Peptid.
  2. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der CD40-bindende Antikörper ein Fragment des Antikörpers, ausgewählt aus der Gruppe der VH-, VL-, Fv-, Fd-, Fab-, (Fab)2- und scFv-Fragmente, ist.
  3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei der modifizierte CD40-bindende Antikörper human, humanisiert, chimär oder deimmunisiert ist.
  4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das CTL-aktivierende Peptid das vom Adenovirus abstammende Peptid E1A mit der Sequenz SGPSNTPPEI (SEQ ID NO: 2) oder das vom humanen Papillomavirus Typ 16 abstammende Peptid HPV16 E7 mit der Sequenz RAHYNIVTF (SEQ ID NO: 3) ist.
  5. Verwendung eines CD40-bindenden Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und eines CTL-aktivierenden Peptids, wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Tumoren oder Infektionskrankheiten.
  6. Verwendung nach Anspruch 5, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zur direkten Applikation auf den Tumor geeignet ist.
  7. Verwendung von Genkonstrukten, welche für einen CD40-bindenden Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und ein CTL-aktivierendes Peptid, wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert, codieren, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Tumoren oder Infektionskrankheiten.
  8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Genkonstrukte in einen Retrovirus-, Adenovirus- oder Parvovirusvektor inkorporiert werden oder wobei die gegebenenfalls in einen viralen Vektor oder Plasmidvektor inkorporierten Genkonstrukte in ein geeignetes Liposom inkorporiert werden.
  9. Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, wobei das CTL-aktivierende Peptid das vom Adenovirus abstammende Peptid E1A mit der Sequenz SGPSNTPPEI (SEQ ID NO: 2) oder das vom humanen Papillomavirus Typ 16 abstammende Peptid HPV16 E7 mit der Sequenz RAHYNIVTF (SEQ ID NO: 3) ist.
  10. Isolierte Zelle, enthaltend die in einem der Ansprüche 7 bis 9 definierten Genkonstrukte.
  11. Verwendung einer Zelle, wie in Anspruch 10 definiert, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Tumoren oder Infektionskrankheiten.
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