DE69925371T2

DE69925371T2 - Impfstoff für geflügel

Info

Publication number: DE69925371T2
Application number: DE69925371T
Authority: DE
Inventors: M. Sandra AEHLE
Original assignee: Avant Immunotherapeutics Inc
Current assignee: Celldex Therapeutics Inc
Priority date: 1998-07-24
Filing date: 1999-07-13
Publication date: 2006-01-19
Anticipated expiration: 2019-07-14
Also published as: WO2000004920A2; WO2000004920A3; US20040170639A1; DE69925371D1; CA2338551A1; BR9912409A; ES2243064T3; ATE295720T1; EP1100461B1; US6866847B1; CN1314809A; MXPA01000885A; US20040180062A1; JP2003529529A; US6713073B1; CA2338551C; AU4991599A; EP1100461A2; CN100346825C

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung:
Die vorliegende Erfindung betrifft Vakzinen für Geflügel und insbesondere ein neues Verfahren zum Impfen von Geflügel, das das Besprühen mit einem lebenden avirulenten Derivat einer enteropathogenen Bakterie einbindet. Die Erfindung betrifft die Verwendung eines lebenden avirulenten Derivats einer enteropathogenen Bakterie zur Herstellung eines in den Ansprüchen definierten Medikamentes.
2. Beschreibung verwandter Gebiete:
Infektion von Geflügelfleisch und -eiern durch enterobakterielle menschliche Pathogene, wie beispielsweise Salmonella spp., ist eine bekannte Ursache für Erkrankungen bei Menschen, wenn solche infizierten Produkte konsumiert werden. Die Ansteckung tritt vorwiegend während der Verarbeitung der geschlachteten Tiere durch Kontakt mit dem Inhalt von Innereien auf, die hohe Konzentrationen solcher Enterobakterien enthalten. Die Enterobakterien kolonisieren den Darmtrakt, verursachen jedoch normalerweise keine Erkrankung beim Geflügel. Um die Kontamination von Nahrungsmittel mit Enteropathogenen zu reduzieren, wäre es wünschenswert, die Menge an menschlichen enteropathogenen Bakterien, die im Darmtrakt von Hühnern im Verkaufsalter vorhanden sind, zu vermindern. Anstrengungen, diese Kontamination zu reduzieren, konzentrierten sich auf verbesserte Hygiene während der Produktion und Verarbeitung (J.S. Bailey, Poult. Sci. 72, 1169-1173 (1993)), doch solche Techniken sind zeitaufwendig und kostspielig und außerdem nicht absolut effizient bei der Vermeidung sporadisch auftretender Kontamination (siehe z.B. Food Borne Disease Outlook Annual Summary (1982); und Salmonella Surveillance Annual Survey (1992); beide erhältlich beim Center for Disease Control, U.S. Department of Health and Human Services, Atlanta, GA). Verfahren, die von der Hygiene während der Verarbeitung abhängen, müssen häufig wiederholt werden, da die Vorrichtungen zur Verarbeitung und das verarbeitende Personal durch jedes einzelne infizierte Huhn, das verarbeitet wird, neu infiziert werden können. Verfahren, die von der Hygiene während der Produktion abhängen, erfordern permanente Vorsicht aufgrund der hohen Infektionsgefahr in der Produktionsumgebung. Aus diesem Grund wäre ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zur Kontrolle enteropathogener Mikroben im Geflügel während des Wachstums eine zentrale Verbesserung zur Reduktion der Infektion der geschlachteten Tiere während des Verarbeitungsprozesses.
Promosopone et al., J. Food Protect. 61(2), 176-180 (1998), berichteten, dass S.-typhimurium-Kolonisation des Darmtraktes von Geflügel durch Verabreichung eines Geflügel-spezifischen Probiotikums in Kombination mit S.-typhimurium-spezifischen Antikörpern reduziert werden kann. Lactobacillus-acidophilus-, Streptococcus-faecium- und S.-typhimurium-spezifische Antikörper wurden durch Besprühen der 1 Tag alten Hühner, gefolgt von oraler Verabreichung über das Trinkwasser von Tag 1 bis Tag 3, verabreicht. Die Hühner wurden durch orale Verabreichung von S. typhimurium an Tag 1 gereizt, und signifikant reduzierte Mengen von S. typhimurium wurden aus dem Caecum und dem Colon nach probiotischer Behandlung an den Tagen 31, 38 und 43 entnommen. Obwohl die Verabreichung von Probiotika und Antikörper bereits am 1. Lebenstag einen wichtigen Beitrag zur Reduktion der Kolonisation des Darms durch S. typhimurium lieferte, geht aus diesem Bericht nicht eindeutig hervor, ob die anfängliche Sprüh-Verabreichung von Probiotika und Antikörper oder die üblicherweise verwendete orale Verabreichung im Trinkwasser an den Tagen 1-3 für den Rückgang der S.-typhimurium-Kolonisation verantwortlich war.
Vakzinen zur Verwendung bei der Prävention von Geflügelerkrankungen wurden bereits untersucht, und manche dieser Vakzinen sind für Salmonellen spezifisch (siehe z.B. die US-Patente Nr. 5.294.441, 5.389.368, 5.468.485 und 5.387.744). Die Verfahren zur Verabreichung von Vakzinen an Geflügel variieren je nach der beabsichtigen Wirkungsstelle des Wirkstoffs. Es wird nun allgemein angenommen, dass die Art der Impfung unter Berücksichtigung der vom Mikroorganismus bevorzugten Stelle für Lokalisierung und Replikation ausgewählt werden sollte. Somit wäre beispielsweise im Fall der Newcastle-Krankheit und bei infektiösen Bronchitisviren, die sich im Atmungsapparat fortpflanzen, das bevorzugte Impfverfahren eine Verabreichung über Augentropfen ins Auge, über den Nasengang und das Atmungssystem des Huhns oder mittels Spray (Giambrone, World Poultry-Misset 13, 19-23 (1997)). Da zahlreiche andere wichtigere Geflügelkrankheiten auch über den Atmungsapparat auftreten, wurden in Studien, die über die Verabreichung von Spray-Impfungen gegen diese Krankheiten berichteten, die Verabreichung mittels Spray eingesetzt, da ein Aerosol oder ein Spray vom Vogel leicht inhaliert wird und dadurch die Schleimhäute des oberen Atmungstraktes leicht kontaktieren kann. Die Verabreichung von Vakzinen gegen andere Erkrankungen als Atemwegserkrankungen, wie beispielsweise Erkrankungen der Gewebe, des Blutkreislaufs oder des Darms, erfolgt üblicherweise durch subkutane Injektion oder durch orale Verabreichung, entweder durch Inokulation oder durch Vermischen mit dem Trinkwasser.
Die Quellen, die die Verwendung der Spray-Verabreichung von Vakzinen offenbaren, beschäftigten sich beinahe ausschließlich mit der Immunisierung gegen Viren, die über die Atemwege in das Tier eindringen, wie beispielsweise zur Prävention von Newcastle-Krankheit, aviärer Enzephalomyelitis, Mareksche Krankheit, Laryngotracheitis, infektiöser Bronchitis und dergleichen.
Bakterielle Vakzinen, insbesondere abgeschwächte Lebendmutanten, die aus äußerst virulenten Elternbakterienstämmen stammen, wurden auch bereits für Geflügel verwendet (K. Roland et al., Efficacy of Salmonella typhimurium vaccine strains expressing Escherichia coli 078 lipopolysaccharide to protect against E. coli challenge in chickens, Abstrakt einer Präsentation im Rahmen der Conf. Of Res. Workers in Animal Diseases, Chicago, IL, 10. November 1997). Die Abstammung des abgeschwächten mutierten Stamms von einem äußerst virulenten Elternstamm erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass die abgeschwächte Mutante nicht nur den Darmtrakt kolonisiert, sondern auch das mit dem Darm eng verbundene lymphatische Gewebe ("gut associated lymphoid tissue", GALT) und dadurch Schutzimmunität hervorruft (siehe z.B. Curtiss III et al., in: Colonization Control of Human Bacterial Enteropathogens in Poultry, Blankenship et al. (Hrsg.), Academic Press, Inc., New York, 169-198 (1991)). Dahingegen können Bakterien, die den Darm kolonisieren, jedoch nicht in das GALT eindringen und es kolonisieren, keine Immunreaktion hervorrufen. Beispielsweise zeigten Studien an Mäusen, dass Lipopolysaccharid- (LPS-) O-Antigen-Wiederholungen an der Oberfläche von S. typhimurium nicht nur wichtig sind, um nicht-spezifischen Wirt-Abwehrmechanismen standzuhalten (Microbial Toxins, Bd. V, Roantree et al. (Hrsg.), Academic Press, New York (1971)), sondern auch für effiziente Invasion durch das Mucin und die Glykokalix, die den Darmtrakt bedecken. Dadurch sind rohe Mutanten, denen LPS-O-Antigene fehlen, wenn sie oral verabreicht werden, nicht in der Lage, in das GALT einzudringen und es zu kolonisieren (siehe z.B. Curtiss et al., (1991) s.o.).
Manche Quellen berichteten über die Verabreichung von bakteriellen Vakzinen an Geflügel mittels oraler oder subkutaner Injektion. Beispielsweise umfasst eine im Handel erhältliche Vakzine zur Prävention von Paratyphus bei Tauben getötete S. typhimurium, verabreicht mittels subkutaner Injektion (Vetafarm Paratyphoid Vaccine, Vetafarm Pty. Ltd., Wagga Wagga, Australien). Darüber hinaus berichten Curtiss et al. (1991), s.o., über die Verwendung eines avirulenten Derivats einer pathogenen Salmonelle als eine oral verabreichte Vakzine für Hühner.
Sprühimpfung wurden auch für bakterielle Vakzinen untersucht, die Atemwegserkrankungen verursachen. Hertman et al. berichten über orale und Aerosol-Verabreichung einer Pasteurella-multocida-Vakzine an Hühner und Truthähne zur Prävention von Geflügelcholera, einer Atemwegserkrankung (US-Patent Nr. 4.169.886). Ley et al. berichten über Augentropfen- und Aerosolverabreichung einer Vakzine, die lebendes Mycoplasma gallisepticum enthält, das eine Atemwegserkrankung hervorruft (Ley et al., Avian Diseases 41, 187-194 (1997)). Eine im Handel erhältliche Vakzine empfiehlt die Verabreichung einer Vakzine, die einen avirulenten Stamm von E. coli Serotypus 078 enthält, um gegen die durch den verwandten Wildtyp verursachte Atemwegserkrankung zu immunisieren (siehe Product Bulletin for GARAVAX^®-T, Schering-Plough Animal Health Corp., Omaha, NE). Für all diese Vakzinen würde die Verwendung einer Aerosolverabreichung ausgewählt werden, da die Krankheiten, gegen die das Geflügel geimpft würde, eine Infektion der Atemwege einbinden.
Eine andere Quelle berichtete, dass eine Vakzine, die einen Stamm des nichtpathogenen E. coli K-12, dem O-Antigen fehlt, enthielt, in Form eines Aerosols verabreicht werden könnte (US-Patent Nr. 4.404.186). Nichtsdestoweniger ist der K-12-Stamm ein im Labor adaptierter Stamm und ist kein Enteropathogen, und da diese Mikrobe nicht die Fähigkeit besitzt, in das mit dem Darm eng verbundene lymphatische Gewebe einzudringen und es zu kolonisieren, ist es wahrscheinlich, dass jegliche Immunität, die durch diese Vakzine hervorgerufen wird, durch Immunisierung über die Atemwege erlangt werden muss.
Lokales Sprühen bakterieller Vakzinen wie beispielsweise durch einen Nasenspray oder einen Augenspray wurde ebenfalls in manchen Quellen vorgeschlagen (siehe z.B. das US-Patent Nr. 5.294.441). Weiters wurde von einem Impfverfahren für Hühner berichtet, das die Verabreichung eines lebenden avirulenten Salmonellatyphimurium-Vakzinenstamms entweder über den oralen Weg oder mittels eines groben Sprays umfasst. Die abgeschwächte S.-typhimurium-Vakzine kann genetisch modifiziert sein, um fremde Antigene zu exprimieren, die durch klonierte Gene aus anderen Pathogenen spezifiziert sind (R. Curtiss et al., "Nonrecombinant and recombinant avirulent Salmonella vaccines for poultry", Veterinary Immunology and Immunopathology, Amsterdam, NL, Bd. 54, 365-372, ISSN: 0165-2427 (01.11.1996)). Dennoch schlug keine dieser früheren Arbeiten die Verwendung eine Verabreichung von enteropathogenen bakteriellen Vakzinen mittels Ganzkörpersprays vor.
Während also Arbeiten über mittels Spray verabreichte Vakzinen als nützliche Mittel zur Kontrolle von Atemwegserkrankungen bei Geflügel veröffentlicht wurden, wurde die Verabreichung eines Ganzkörpersprays als Vakzinen für Geflügel zur Bekämpfung menschlicher Pathogene, die häufig in Geflügel zu finden sind und durch Geflügel übertragen werden, die jedoch keine Erreger von Atemwegserkrankungen bei Geflügel sind, noch nicht vorgeschlagen.
Demgemäß wäre es wünschenswert, ein Verfahren zur Reduktion der Infektion von Geflügel durch enteropathogene Mikroben, insbesondere durch Salmonella spp., bereitzustellen, die einfach und unter geringen Kosten unter normalen kommerziellen Geflügelproduktionsbedingungen zu verabreichen sind; die frisch geschlüpften Hühnern ohne individuelle Behandlung verabreicht werden können; und die Infektion von viszeralen und lymphatischen Geweben und des Darmtrakts von Geflügel durch enteropathogene Mikroben reduzieren oder unterbinden könnten.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde erkannt, dass Vakzinen Hausvögeln durch Ganzkörperbesprühen der Vögel mit der Vakzine verabreicht werden können. Die Vakzinen werden über diese Art der Ganzkörperbesprühung in einer Menge verabreicht, die zum Hervorrufen einer Immunantwort, d.h. Antikörper und/oder Zellimmunität, wirksam ist. Während prinzipiell jede Vakzine mittels dieses Verfahrens verabreicht werden kann, ist die Verabreichung mittels Ganzkörperspray überraschend wirksam für Vakzinen, die ein lebendes avirulentes Derivat einer enteropathogenen Bakterie enthalten. Solche enteropathogenen Bakterien sind vorzugsweise Salmonella-Spezies. Diese Spray-Verabreichung von enteropathogenen Bakterien umgeht manche der Nachteile anderer Arten der Verabreichung, und zwar dadurch, dass sie keine individuelle Behandlung der Hühner erfordert, dass sie am Tag des Schlüpfens verabreicht werden kann und dass sie unter den normalerweise vorzufindenden Bedingungen bei kommerzieller Geflügelzucht leicht anzuwenden ist.
Die wirksamen Dosen, die eine Immunantwort hervorrufen, sind entgegen den Erwartungen gering und sind ungefähr vergleichbar mit Dosen, die bei oraler Verabreichung wie beispielsweise der Verabreichung im Trinkwasser wirksam sind. Typischerweise betragen die Dosen zur Verabreichung der lebenden Vakzinen der vorliegenden Erfindung etwa 10⁵ bis etwa 10⁸ koloniebildende Einheiten.
Die Verabreichung der Vakzinen mittels Spray ist bei der Impfung von Vögeln wie z.B. Hühnern in jedem beliebigen Alter anwendbar, in dem sie für die positiven Wirkungen der Vakzine empfänglich sind, ist jedoch besonders bei Vögeln im Alter von 3 Wochen oder weniger, und vorzugsweise bei Vögeln im Alter von weniger als 1 Tag, anwendbar.
In manchen Ausführungsformen kann der Spray-Verabreichung eine Verabreichung der Vakzine in zumindest einer Auffrischungsdosis folgen. Vorzugsweise kann eine solche Auffrischungsdosis oral über das Trinkwasser oder durch einen Spray etwa 14 Tage nach der Verabreichung mittels Spray verabreicht werden.
Vorzugsweise ist der Spray ein grober Spray aus Tröpfchen mit einem Durchmesser im Bereich von etwa 50 μm bis etwa 150 μm.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht auch das Reduzieren mikrobieller Infektion von Geflügel durch Immunisieren des Geflügels gegen einen mikrobiellen Erreger mittels Ganzkörperspray-Verabreichung einer immunogenen Zusammensetzung. Der mikrobielle Erreger kann für das Geflügel selbst pathogen sein oder nicht, solche mikrobiellen Erreger können jedoch, sofern sie im Geflügel vorhanden sind, zu Krankheitssymptomen bei Menschen führen, die das Fleisch oder andere Nahrungsmittelprodukte, die aus dem Geflügel hergestellt werden, konsumieren: Der mikrobielle Erreger kann jeder beliebige solcher Erreger, insbesondere Mikroben, sein, die den Magendarmtrakt des Geflügels kolonisieren.
Die immunogene Zusammensetzung wird in einer Menge verabreicht, die zum Hervorrufen einer Immunantwort, d.h. von Antikörpern oder Zellimmunität gegen den mikrobiellen Erreger, wirksam ist. Vorzugsweise umfasst die immunogene Zusammensetzung ein lebendes avirulentes Derivat einer enteropathogenen Bakterie. Solche enteropathogenen Bakterien sind vorzugsweise Salmonella-Spezies.
Die immunologische Zusammensetzung wird in Dosen verabreicht, die zum Hervorrufen einer Immunantwort wirksam sind. Solche Dosen sind ungefähr vergleichbar mit Dosen, die bei oraler Verabreichung wirksam sind. Typischerweise umfassen Dosen zur Verabreichung der lebenden Vakzinen der vorliegenden Erfindung etwa 10⁵ bis etwa 10⁸ koloniebildende Einheiten.
Die Verabreichung mittels Spray der immunogenen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist bei Impfungen von Vögeln in jedem Alter anwendbar, in dem sie auf die positiven Wirkungen der Vakzine empfänglich sind, ist jedoch insbesondere bei Vögeln wie z.B. Hühnern im Alter von 3 Wochen oder weniger, und vorzugsweise bei Vögeln in einem Alter von weniger als 1 Tag, anwendbar.
In manchen Ausführungsformen kann nach Verabreichung des Sprays eine Verabreichung der immunogenen Zusammensetzung in zumindest einer Auffrischungsdosis mittels oraler Verabreichung im Trinkwasser, vorzugsweise etwa 14 Tage nach Verabreichung des Sprays, erfolgen.
Der Spray ist vorzugsweise ein grober Spray aus Tröpfchen mit einem Durchmesser im Bereich von etwa 50 μm bis etwa 150 μm.
Zu den zahlreichen Vorteilen, die dank der vorliegenden Erfindung erreicht werden können, zählen daher die Bereitstellung eines neuen Verfahrens zur Impfung eines Hausvogels unter Verwendung einer enteropathogenen Bakterie; die Bereitstellung eines Verfahrens zur Reduktion des Ausmaßes an Kolonisation des Darmtrakts, der lymphatischen Gewebe und der viszeralen Gewebe durch enteropathogene Mikroben; die Bereitstellung eines Verfahrens zur Reduktion der mikrobiellen Infektion von Geflügel, das für den menschlichen Verzehr bestimmt ist; die Bereitstellung eines Verfahrens, das unter normalen kommerziellen Geflügelproduktionsbedingungen einfach und kostengünstig durchzuführen ist; und die Bereitstellung eines Verfahrens, das die Verabreichung an junge, insbesondere am selben Tag geschlüpfte Küken, ohne individuelle Behandlung ermöglicht.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen:
1 zeigt die Gewinnung von S.-typhimurium-χ3985-Vakzinenstamm aus der Milz und den Bursageweben, dem Kot und den Caecuminhalten von White-Leghorn-Hühnern 7 Tage nach Verabreichung von (a) 10⁵ KBE, (b) 10⁷ KBE oder (c) 10⁹ KBE von χ3985 durch groben Spray oder durch direkte orale Verabreichung am Tag des Schlüpfens;
2 zeigt die Gewinnung von S.-typhimurium-χ3985-Vakzinenstamm aus der Milz und den Bursageweben, dem Kot und den Caecuminhalten von White-Leghorn-Hühnern 20 Tage nach Verabreichung von (a) 10⁵ KBE, (b) 10⁷ KBE oder (c) 10⁹ KBE von χ3985 durch groben Spray oder durch direkte orale Verabreichung an den Tagen 1 und 14; und
3 zeigt die IgM-, IgA- und IgG-Antworten am 20. Lebenstag, nachgewiesen durch Verwendung von gereinigtem S.-typhimurium-LPS in White-Leghorn-Hühnern, die mit (a) 10⁵ KBE, (b) 10⁷ KBE oder (c) 10⁹ KBE von S. typhimurium χ3985 durch groben Spray oder durch direkte orale Verabreichung an den Tagen 1 und 14 immunisiert und geboostet wurden.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen:
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass Ganzkörperspray-Verabreichung verwendet werden kann, um Vakzinen oder immunogene Zusammensetzungen von lebendem avirulentem Derivat einer enteropathogenen Bakterie an Hausvögel zu verabreichen und auf wirksame Weise eine Immunantwort hervorzurufen.
Die Ganzkörperspray-Verabreichung der vorliegenden Erfindung ermöglicht das Zuführen der Vakzine oder immunogenen Zusammensetzung in den Magendarmtrakt des Geflügels. Spray-Verabreichung oder Spray-Impfung wie hierin verwendet bezeichnet die Zufuhr von Tröpfchen einer Flüssigkeit, die eine Vakzine oder immunogene Zusammensetzung umfasst. Ganzkörperspray-Verabreichung bezeichnet somit die Verteilung solcher Tröpfchen der Vakzine oder immunogenen Zusammensetzung über einen großen Teil des gesamten Körpers des Geflügels. Dies steht im Gegensatz zu einer lokalen Spray-Verabreichung wie beispielsweise durch intranasales Sprühen bei Menschen, bei dem die Verabreichung nur an einen spezifischen, kleinen, lokalen Zielbereich erfolgt. Der Ansatz des Ganzkörpersprays zur Verabreichung enteropathogener Bakterien der vorliegenden Erfindung führt die Vakzinenmikrobe ohne zu differenzieren einem Großteil der Körperoberfläche des Geflügels zu, die einen Teil der gesamten Körperfläche ausmacht, die für die Sprühvorrichtung zugänglich ist (siehe z.B. die US-Patente Nr. 4.316.464 und 4.449.968, die hierin durch Verweis aufgenommen sind). Solche Ganzkörperspray-Verabreichung der Vakzinen oder immunogenen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ist besonders gut zur Verabreichung an zahlreiche Hühner zugleich geeignet.
Spray-Verabreichung der vorliegenden Erfindung umfasst vorzugsweise die Verabreichung eines groben Sprays, der die Vakzine oder immunogene Zusammensetzung enthält, an das Huhn. Obwohl hier keine Einschränkung auf eine bestimmte Theorie beabsichtigt ist, wird angenommen, dass die Verabreichung einer Vakzine oder immunogenen Zusammensetzung in Form eines groben Sprays ermöglicht, dass die Spray-Tröpfchen die Körperoberfläche kontaktieren, während die Menge der Vakzine, die in das untere Atemwegssystem inhaliert wird, äußerst gering gehalten wird. Dies stellt den Unterschied zu einem Spray in Form von sehr feinen Tröpfchen oder Nebel dar, der üblicherweise als Aerosol bezeichnet wird, in dem die Tröpfchen einen Durchmesser von weniger als etwa 40 μm aufweisen. Im Gegensatz zu Aerosol-Sprays wird von dem groben Spray der vorliegenden Erfindung angenommen, dass er nicht tief inhaliert wird, was das Verhindern der Entwicklung von Atemwegsinfektionen, wie sie bei manchen Spray-Impfungen zu beobachten ist, erleichtert (siehe beispielsweise das US-Patent Nr. 4.449.968; Clarke et al., Austr. Vet. J. 56, 424-428 (1980)). Ein grober Spray wie hierin verwendet bezeichnet einen Spray, der sich aus flüssigen Tröpfchen mit einem Durchmesser, der ausreichend ist, um das Inhalieren der Tröpfchen in das untere Atemwegssystem des Vogels im Wesentlichen zu verhindern, zusammensetzt, der jedoch trotzdem die flüssigen Tröpfchen mit der Körperoberfläche des Vogels in Kontakt bringt. Die Konsistenz eines solchen groben Sprays wurde als "dunstiger Regen" bezeichnet, und es wird bevorzugt, dass der Spray weniger als etwa 1% der Tröpfchen in einem Größenbereich von weniger als etwa 12 μm aufweist. Vorzugsweise besteht der grobe Spray aus Tröpfchen mit einem mittleren Durchmesser von etwa 40 bis etwa 400 μm; noch bevorzugter von etwa 40 μm bis etwa 200 μm, noch bevorzugter von etwa 50 μm bis etwa 150 μm und am meisten bevorzugt von etwa 50 bis etwa 100 μm. Alternativ dazu kann der grobe Spray etwa 80% der Tröpfchen in einem Bereich von etwa 90 bis etwa 190 μm aufweisen.
Der Typ der Spray-Impfvorrichtung, die zur Verabreichung der Vakzine verwendet wird, ist nicht maßgeblich, und beinahe jeder Typ von Spray-Impfvorrichtung, der in der Lage ist, einen groben Spray zu verteilen, kann verwendet werden (siehe z.B. die US-Patente Nr. 4.316.464, 4.449.968, 4.674 und 5.312.353).
Die Spray-Verabreichung der vorliegenden Erfindung führt eine Vakzine zu, die ein lebendes avirulentes Derivat einer enteropathogenen Bakterie umfasst. Die Vakzinenmikrobe ist eine Enterobakterie, die in der Lage ist, den Darmtrakt und das mit dem Darm eng verbundene lymphatische Gewebe (GALT) des Geflügels zu kolonisieren. Solche Mikroben dienen als die immunogene Komponente der Vakzine oder immunogenen Zusammensetzung und umfassen Mitglieder der Enterobacteriaceae-Familie wie beispielsweise Escherichia, Klebsiella, Proteus, Yersinia und Erwinia. Insbesondere sind Salmonella, Escherichia und Salmonella-Escherichia-Hybride in der vorliegenden Erfindung nützlich, einschließlich vorzugsweise E. coli und Salmonella wie z.B. S. typhimurium, S. typhi, S. paratyphi, S. enteritidis, S. dublin, S. gallinarum, S. pullorum, S. arizona und S. choleraesuis.
Das avirulente Derivat einer enteropathogenen Bakterie kann auch als eine Trägerbakterie dienen, um dem GALT ausgewählte Antigene zuzuführen. Solche Trägerbakterien enthalten und exprimieren ein rekombinantes Gen aus einem pathogenen Organismus, sodass Antikörper und/oder zelluläre Immunität gegen das antigene Genprodukt, das normalerweise durch den pathogenen Organismus produziert wird, hervorgerufen wird. Somit ist es möglich, das avirulente Derivat einer enteropathogenen Bakterie zu verwenden, das mittels eines Sprays verabreicht wird, um einer großen Vielzahl an Mikroben Antigene zuzuführen und eine Immunantwort im Geflügel gegen Mikroben hervorzurufen, die nicht notwendigerweise in der Lage sein müssen, den Magendarmtrakt zu kolonisieren.
Die avirulenten Mikroben können zusätzlich als Vektoren für die Synthese verschiedener Proteine im Geflügel verwendet werden. Da die avirulenten Mikroben dieser Erfindung in der Lage sind, das GALT nach der Spray-Verabreichung zu durchqueren und in den Magendarmtrakt des Geflügels zu gelangen, können die Mikroben verwendet werden, um Genprodukte wie beispielsweise Wachstumsfaktoren oder immunregulierende Produkte oder Substanzen, die verschiedene physiologische Funktionen stimulieren oder unterdrücken, herzustellen und zu liefern. Solche Mikroben enthalten und exprimieren ein Rekombinationsgen, das für das erwünschte Protein kodiert.
Die Bezeichnung enteropathogene Bakterie bezieht sich auf Mikroben, die in der Lage sind, den Darmtrakt und das mit dem Darm eng verbundene lymphatische System des Geflügels zu kolonisieren. Wie hierin verwendet bezieht sich die Bezeichnung Pathogen auf eine Mikrobe, die in der Lage ist, Erkrankungssymptome oder eine Beeinträchtigung normaler physiologischer Funktionen zu verursachen. Die Vakzinen der vorliegenden Erfindung enthalten avirulente Derivate eines enteropathogenen Bakterienstamms. Unter Derivat oder derivatisierter Stamm wird ein Stamm verstanden, der in Bezug auf seinen Elternstamm, von dem er abstammt, genetisch modifiziert wurde. Unter pathogen wird verstanden, dass die Mikrobe in der Lage ist, Krankheit oder Beeinträchtigung normaler physiologischer Funktion zu verursachen. Der Hinweis auf Avirulenz soll bedeuten, dass ein bestimmter Mikrobenstamm nicht in der Lage ist, eine vollständige Reihe an Symptomen des Erkrankungszustandes zu induzieren, die normalerweise mit seinem virulenten pathogenen Gegenstück in Verbindung gebracht werden. Somit schließt Avirulenz einen Zustand von reduzierter Virulenz oder die Fähigkeit, Erkrankungszustände zu produzieren, ein, und den avirulenten Mikroorganismen mangelt es nicht notwendigerweise vollständig an der Fähigkeit, normale physiologische Funktionen des Wirts zu beeinträchtigen. Darüber hinaus ist eine avirulente Mikrobe nicht notwendigerweise unfähig, irgendwann als ein Pathogen zu funktionieren, doch die bestimmte verwendete Mikrobe ist in Bezug auf das bestimmte zu behandelnde Lebewesen avirulent. Vorzugsweise ist die enteropathogene Bakterie, von der die avirulente Mikrobe abgeleitet wird, zumindest für frisch geschlüpfte Vögel pathogen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das lebende avirulente Derivat einer enteropathogenen Bakterie ein S. typhimurium, wie z.B. χ3985, das Δcya-12/Δcrp-11-Mutationen aufweist. Diese Konstruktion dieser und anderer Stämme ist im Detail im US-Patent Nr. 5.294.441 beschrieben.
Eine immunologische Reaktion auf eine Zusammensetzung oder Vakzine ist die Entwicklung einer zellulären und/oder Antikörper-vermittelten Immunantwort im Wirt auf die Zusammensetzung oder Vakzine von Interesse. Üblicherweise besteht eine solche Reaktion darin, dass das Lebewesen Antikörper, B-Zellen, Helfer-T-Zellen, Suppressor-T-Zellen und/oder zytotoxische T-Zellen produziert, die spezifisch gegen ein Antigen oder Antigene, das/die in die Zusammensetzung oder Vakzine von Interesse eingebunden ist/sind, gerichtet sind.
Als Vakzine wird ein Mittel bezeichnet, das verwendet wird, um das Immunsystem eines Lebewesens zu stimulieren, sodass Schutz gegen ein Antigen gewährt wird, das vom Immunsystem nicht als ein Selbst-Antigen erkannt wird. Immunisierung bezieht sich auf das Verfahren der Induktion einer kontinuierlich hohen Antikörper- und/oder zellulärer Immunantwort, worin T-Lymphozyten entweder die einfallende Mikrobe töten und/oder andere Zellen (z.B. Phagozyten) dazu aktivieren, dies in einem Lebewesen zu tun, die gegen eine Mikrobe oder ein Antigen gerichtet ist, der/dem der Organismus davor ausgesetzt wurde. Die Bezeichnung Immunsystem bezieht sich auf die anatomischen Eigenschaften und Mechanismen, durch die ein Lebewesen Antikörper gegen ein antigenes Material produziert, das in die Zellen des Lebewesens oder die extra-zelluläre Flüssigkeit des Lebewesens eindringt, und soll auch zelluläre Immunantwort einschließen. Im Fall von Antikörperproduktion kann der so produzierte Antikörper zu jeder beliebigen immunologischen Gruppe, wie z.B. zu den Immunglobulinen A, D, E, G oder M, gehören. Von besonderem Interesse sind Vakzinen, die die Produktion von Immunglobulin A (IgA) stimulieren, da dies das Hauptimmunglobulin ist, das durch das Sekretionssystem von warmblütigen Tieren produziert wird, obwohl Vakzinen der Erfindung nicht auf jene, die IgA-Produktion stimulieren, eingeschränkt sind. Beispielsweise neigen Vakzinen von hierin beschriebener Beschaffenheit dazu, zusätzlich zur IgA-Bildung eine breite Palette an Immunantworten, beispielsweise zelluläre und humorale Immunität, zu produzieren. Immunantworten auf Antigene wurden bereits ausführlich untersucht und in Arbeiten erwähnt. Eine Immunologiestudie wird in Klaus D. Elgert, Immunology, Wiley Liss, Inc. (1996); Stites et al., Basic & Clinical Immunology; 7. Auflage, Appleton & Lange (1991), die in ihrer Gesamtheit hierin durch . Verweis aufgenommen sind, bereitgestellt.
Die Bezeichnung Lebewesen, das mit einer Vakzine der vorliegenden Erfindung behandelt wird, bezieht sich auf eine Vogelspezies, einschließlich Hausvögel, insbesondere jene von landwirtschaftlicher Bedeutung. Hausvögel oder Geflügel wie hierin verwendet schließt jede Art domestizierter Vogelspezies oder Lebewesen dieser Spezies ein, wie z.B. Hühner, Truthähne, Enten, Gänse, Tauben, Perlhühner, Strauße, Emus und dergleichen, und insbesondere jene domestizierten Vogelarten oder Lebewesen, die zur Produktion von Eiern und Fleisch gehalten werden.
Die Vakzine kann durch Züchten des Vakzinenstamms in geeignetem Wachstumsmedium hergestellt und dann wie sie ist als Vakzinenzusammensetzung verwendet oder durch Kombinieren der Zuchtkultur oder der Zelle daraus mit einem geeigneten Verdünnungsmittel zu einer Vakzinenzusammensetzung gebildet werden. Geeignete Verdünnungsmittel sind vorzugsweise Flüssigkeiten und noch bevorzugter eine Flüssigkeit, die die Stabilität und Lebensfähigkeit der Vakzinenkultur nicht negativ beeinflusst und die eine Viskosität aufweist, die ähnlich jener von Wasser ist, sodass sie leicht die Tröpfchen eines groben Sprays bilden kann. Das Verdünnungsmittel weist vorzugsweise kein Chlor, keine Antibiotika, keine antimikrobiellen Mittel oder andere Mittel auf, die für die lebenden Vakzinenorganismen schädlich sein könnten. Die Vakzine sollte im Verdünnungsmittel dispergierbar sein, sodass keine festen Klümpchen oder Bröckchen aus Vakzine zurückbleiben, und das Verdünnungsmittel sollte eine Temperatur aufweisen, die den lebenden Vakzinenmikroben nicht schadet. Beispiele für geeignete Verdünnungsmittel umfassen Wasser, destilliertes Wasser entionisiertes Wasser, Magermilch, Wasser, das Marekschen Vakzinenstabilisator enthält, gepufferte Salzlösung mit Gelatine und ähnliche Zusammensetzungen, die Fachleuten bekannt sind. Die Vakzine wird vorzugsweise in das Verdünnungsmittel eingeführt, wenn das Verdünnungsmittel eine Temperatur von etwa Raumtemperatur oder kühler, noch bevorzugter von etwa 34°C bis etwa 15°C, aufweist.
In einer Ausführungsform wird die Vakzine aus S. typhimurium UK-1 Δcya Δcrp χ3985 hergestellt. Wie hierin verwendet kann diese Vakzine als χ3985 bezeichnet werden, oder als Chi3985 oder als χ3985, Produktionscode 19C1.01. Der Vakzinenstamm kann wie oben beschrieben frisch hergestellt werden, oder er kann aus einer Kultur gewonnen werden, die beispielsweise als gefriergetrocknete Kultur, in gefrorener Form (z.B. bei -70°C, Arbeits-Impfstamm) oder auch anders gelagert wurde. Ein Inokulum aus solch einer Kultur wird dann zu einer späten log-Phasen-Kultur in Luria-Nährmedium bei 37°C gezüchtet. Zum Beispiel kann ein -70°C Impfstamm verwendet werden, um 50 ml Luria-Nährmedium in einem sterilen 250-ml-Kolben, der leicht mit einer Folie abgedeckt ist, zu inokulieren. Der Kolben wird als eine statische Kultur bei 37°C über Nacht inkubiert. Nach etwa 12 – 24 h werden 50 ml der statischen Über-Nacht-Kultur in 450 ml vorgewärmtes Luria-Nährmedium in einem 1-l-Kolben ohne Prallflächen bei 37°C pipettiert und in einen Inkubatorschüttler von New Brunswick bei 150 U/min platziert. Nachdem die Kultur eine OD₆₀₀ ≥ 1,0 erreicht hatte, werden die Zellen durch Zentrifugation (4.400 U/min, 15 min in einer Centra-MP4-Zentrifuge, IEC-Ausschwing-3224-Rotor) bei Raumtemperatur pelletiert. Die Zellen werden in 40 ml gepufferter Salzlösung (Raumtemperatur) mit Gelatine (BSG) resuspendiert. Der Titer der Vakzinenzusammensetzung kann durch Reihenverdünnen der Zellsuspension um das 10fache in BSG und Verteilen von 100 μl von 10^–6- und 10^–7-Verdünnungen auf MacConkey-Agar + 1% Maltose zum Plattieren bestimmt werden. Der Titer des Vakzinenstamms wird dann durch Zählen von Kolonien, die sich im Laufe der Inkubation der Platten entwickeln, bestimmt werden. Der Titer wird ausgedrückt als koloniebildende Einheiten der Vakzinenmikrobe (KBE) pro Einheit Volumen der Vakzinenzusammensetzung.
Die Vakzine zur Verwendung bei Geflügel wird wie zuvor beschrieben hergestellt, und die Kultur wird auf die erwünschte Dosierungsdichte oder den erwünschten Titer in einem geeigneten Verdünnungsmittel verdünnt. Der Puffer des Verdünnungsmittels wird, sofern verwendet, so eingestellt, dass pH und Ionenstärke erreicht werden, die für die Aufrechterhaltung der Stabilität und Lebensfähigkeit des Vakzinenstamms erforderlich sind. Die Vakzine ist dann fertig, um in den Sprayer geladen und dem Geflügel verabreicht zu werden.
Spray-Verabreichung kann auch so durchgeführt werden, dass jedem Vogel eine bestimmte Dosierung zukommt. Eine Vorgehensweise, die verwendet werden kann, um eine exakte Vakzinendosierung zuzuführen, ist das Besprühen der Vögel in einem geschlossenen Raum über eine berechnete Zeitspanne und bei einer bekannten volumetrischen Freisetzungsgeschwindigkeit. Sofern die Anzahl der zu impfenden Vögel, die erwünschte Dosierung der Vakzine pro Vogel, der Titer der Vakzine und die Freisetzungsgeschwindigkeit der Sprühvorrichtung bekannt sind, können Fachleute leicht die erforderliche Sprühdauer berechnen, um die erforderliche Dosierung pro Vogel bereitzustellen. Weiters ermöglichen manche Modelle von im Handel erhältlichen Sprühvorrichtungen die Vorauswahl des Flüssigkeitsvolumens, das einer bekannten Anzahl an Vögeln verabreicht wird.
Die Vakzine oder immunogene Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird in einer wirksamen Dosis oder einer wirksamen Menge verabreicht. Wie hierin verwendet bezeichnet eine wirksame Menge jene Menge an Vakzine oder immunogener Zusammensetzung, die ausreichend ist, um eine Immunantwort gegen eine Zielmikrobe oder ein Antigen hervorzurufen, gegen die/das das Geflügel geimpft werden soll. Solch eine Immunantwort umfasst die Produktion von Antikörpern und/oder Zellimmunität. In einem signifikanten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann die Vakzine oder die immunogene Zusammensetzung in einer Dosis verabreicht werden, die ungefähr gleich ist wie jene Dosis, die bei oraler Verabreichung, beispielsweise bei Verabreichung im Trinkwasser, wirksam ist.
Vorzugsweise erfolgt die Spray-Verabreichung bei Vögeln, wenn sie weniger als einen Tag alt sind, d.h. am Tag des Schlüpfens. Auch ist es oft wünschenswert, eine oder mehrere Auffrischungsdosen der Vakzine etwas nach der anfänglichen Spray-Verabreichung zu verabreichen. Solche Auffrischungsanwendungen können zu jedem Zeitpunkt während der Lebenszeit des Vogels verabreicht werden, zu dem der Vogel für die positiven Wirkungen der Vakzine aufnahmefähig ist. Vorzugsweise werden solche Auffrischungen zwischen den Lebenstagen 5 und 21, noch bevorzugter zwischen den Lebenstagen 6 und 15 und noch bevorzugter zwischen den Lebenstagen 7 und 14, am meisten bevorzugt am 7. Lebenstag oder am 14. Lebenstag oder sowohl am 7. als auch am 14. Lebenstag, verabreicht.
Die Auffrischungsdosen werden typischerweise oral im Trinkwasser verabreicht, obwohl die Auffrischungsdosis über jeden beliebigen Weg, einschließlich Sprayverabreichung, verabreicht werden kann. Die Verabreichung der Vakzine im Trinkwasser kann mittels zahlreicher Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, erfolgen. Beispielsweise kann die Verabreichung im Trinkwasser unter Verwendung des folgenden Verfahrens erfolgen. Zuerst werden alle Desinfektionsmittel, Sterilisationsmittel und antimikrobiellen Mittel aus dem Trinkwasser entfernt, das den Vögeln 24 Stunden vor der Vakzinenverabreichung gegeben wird. Solches Wasser, das frei von Desinfektionsmitteln, Sterilisationsmitteln und antimikrobiellen Mitteln ist, wird auch 24 Stunden nach der Impfung verabreicht. Die Vakzine kann dann in das saubere Wasser gemischt werden, das keine Sterilisationsmittel oder antimikrobiellen Mittel enthält. Fünfzig Liter von Vakzine-hältigem Wasser können für 500 Vögel wie z.B. Hühner verwendet werden, und es sollte dafür gesorgt werden, dass alle Vögel ausreichend Platz haben, um gut trinken zu können. Wasser, das die Vakzine enthält, sollte in 2 Stunden oder weniger konsumiert werden. Um sicherzustellen, dass alle Vögel trinken, sollte eine oder zwei Stunden vor der Verabreichung des Trinkwassers den Vögeln kein Wasser gegeben werden.
Da die Dosierungsmenge der Spray-Verabreichung der Vakzine oder immunogenen Zusammensetzung etwa dieselbe ist wie die orale Dosis im Trinkwasser, sind beide Dosierungsmengen vorzugsweise etwa dieselben. Werden also z.B. 10⁷ koloniebildende Einheiten pro Vogel durch Spray-Verabreichung zugeführt, so werden vorzugsweise etwa 10⁷ koloniebildende Einheiten pro Vogel im Trinkwasser verabreicht. Vorzugsweise unterscheiden sich die anfängliche Spray-Verabreichungsdosis und die darauf folgende Auffrischungsdosis, die im Trinkwasser verabreicht wird, um weniger als das 100fache, noch bevorzugter um weniger als das 10fache, noch bevorzugter um weniger als das dreifache und am meisten bevorzugt um weniger als 10%.
Es wird bevorzugt, dass das zu impfende Geflügel ein Alter aufweist, in dem es für die positiven immunogenen Wirkungen der Vakzine empfänglich ist. Während dies zwischen den Spezies variieren kann, wurde erkannt, dass solche positiven Wirkungen bei Geflügel, das etwa 104 Wochen (nach dem Schlüpfen) alt ist, erzielt werden. Es wird bevorzugt, dass das Geflügel am Tag des Schlüpfens bis zum Alter von 52 Wochen, noch bevorzugter am Tag des Schlüpfens bis zum Alter von 3 Wochen, sogar noch bevorzugter am Tag des Schlüpfens bis zum Alter von 2 Wochen, sogar noch bevorzugter am Tag des Schlüpfens bis zum Alter von 1 Woche und am meisten bevorzugt am Tag des Schlüpfens geimpft werden. Wie hierin verwendet kann die Bezeichnung "am Tag des Schlüpfens" synonym mit "weniger als 1 Tag alt" verwendet werden.
Ein Vorteil des vorliegenden Verfahrens ist, dass es unter Bedingungen zum Einsatz kommen kann, die normalerweise bei kommerzieller Geflügelzucht vorherrschen. Typischerweise sind große kommerzielle Hühner- oder Truthahnzuchten gekennzeichnet durch große Geflügelhäuser mit mehr oder weniger automatischen Fütterungs- und Trinkwasserversorgungssystemen und durch die Haltung von über 1.000 Vögeln pro Haus, häufig über 5.000 Vögeln pro Haus und manchmal sogar über 20.000 Vögeln pro Haus.
Das vorliegende Verfahren kann in der Brutstätte oder in der Geflügelfarm an frisch geschlüpften Küken durch Besprühen der Küken in den Kükenschachteln oder anderen Schalen oder Schachteln vor dem Freilassen der Küken in das Bruthennenhaus oder das Geflügelhaus verwendet werden. Alternativ dazu können auch junge oder ältere Hühner nach dem Freilassen in das Haus besprüht werden. (Siehe z.B. Grieve, Poultry Times, 18 (22. September 1997); und Giambrone, (1997) s.o.)
Aufgrund der Einfachheit der Anwendung des vorliegenden Verfahrens können die Kosten von Geflügelimpfung sehr gering sein. Die hohen Kosten individueller Hühnerbehandlung werden durch die Möglichkeit umgangen, Dutzende an Hühner zugleich und innerhalb weniger Sekunden zu impfen. Darüber hinaus minimiert die exakte Verabreichung der Dosierung der Vakzine an jedes Huhn Überdosierungen und ineffiziente Anwendung der Vakzine.
Die folgenden Beispiele beschreiben bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung. Andere Ausführungsformen innerhalb des Schutzumfangs der beiliegenden Ansprüche werden Fachleuten durch Betrachtung der Beschreibung oder durch die praktische Durchführung der Erfindung, wie sie hierin offenbart ist, offensichtlich sein. Die Beschreibung einschließlich der Beispiele sind nur als beispielhafte Darstellung gedacht, wobei der Schutzumfang der Erfindung durch die an die Beispiele anschließenden Ansprüche definiert ist.
BEISPIEL 1
Dieses Beispiel veranschaulicht, dass Sprühimpfung junger Küken mit einer S.-typhimurium-Lebendvakzine bezüglich des Hervorrufens von Serumimmunität und der Herstellung von Kolonisation des Darmtraktes und der viszeralen Gewebe durch die Vakzinenmikrobe und bezüglich des Hervorrufens von Serumimmunität gleich wirksam war wie direkte orale Verabreichung der Vakzine.
Um die Effizienz von Kolonisation und Hervorrufen von Immunität durch eine lebende avirulente Δcya-Δcrp-mutierte S.-typhimurium-Vakzine zu bestimmen, wurde im Rahmen der vorliegenden Untersuchung die Verwendung eines groben Sprays als ein Mittel zur Verabreichung der primären und Auffrischungsimpfungen an 1 Tag alte Küken untersucht. Parallelgruppen an Vögeln wurde die Vakzine oral verabreicht. Weiters wurde zwei kleineren Gruppen an Vögeln S. typhimurium vom Wildtyp, UK-1 MGN-054s, durch orale oder Spray-Inokulationsverfahren verabreicht, und LD₅₀'s wurden bestimmt. Kolonisation der Milz, der Bursa, des Darmtrakts und des Caecums durch den Vakzinenstamm an den Tagen 7 und 20 wurde für die Vogelgruppen bestimmt, die den Vakzinenstamm über den groben Spray und mittels direkter oraler Verabreichung zugeführt bekamen. Serumantikörper-Reaktionen wurden durch ELISA für Seren gemessen, die aus 20 Tage alten geimpften Vögeln entnommen wurden.
Ziel:
Die Ziele der Studie waren: 1) zu bestimmen, ob junge Küken, die unter Verwendung eines Impfverfahrens mit grobem Spray geimpft wurden, ebenso effizient durch den Vakzinenstamm kolonisiert werden wie Küken, die mittels direkter oraler Impfung geimpft wurden, und 2) die Serumimmunität zu bewerten, die durch steigende Vakzinendosen, verabreicht mittels groben Sprays oder oraler Zufuhr, hervorgerufen wird. Da ein tödlicher Endpunkt an 1 Tag alten Küken bestimmt werden kann (aber nicht an 3 Tage alten oder älteren Küken), wurde der Wildtyp-S.-typhimurium-Elternstamm eingebunden, um zu bestimmen, ob beide Verabreichungsverfahren wirksam und vergleichbar einen Krankheitszustand auslösen können.
Materialien und Verfahren:
S. typhimurium UK-1 Δcya-12 Δcrp-11 χ3985 ist ein abgeschwächter Vakzinenstamm (siehe Curtiss III et al., in: Colonization Control of Human Bacterial Enteropathogens in Poultry, Blankenship et al. (Hrsg.), Academic Press, New York, 169-198 (1991)). Dieser Stamm wurde als eine frische Luria-Nährmediumkultur der späten log-Phase gezüchtet und daraufhin in gepufferter Salzlösung mit Gelatine auf die erwünschte Dosendichte verdünnt. Die Vakzine wurde so hergestellt, dass steigende Dosen von etwa 10⁵, 10⁷ und 10⁹ KBE (koloniebildende Einheiten) Gruppen von 4 1 Tag alten White-Leghorn-Küken zugeführt wurden. Die Küken wurden entweder mit grobem Spray (Tröpfchen mit etwa 140 μm Durchmesser) unter Verwendung einer Sprühimpfvorrichtung (Preval Power Unit, Precision Valve Corporation, Yonkers, NY, 10703) oder durch direkte orale Impfung, die mit einer Nummer-18 × 7,5 mm Zufuhrnadel mit einem an das Ende gebundenen 3-mm-Ball verabreicht wurde, behandelt. Die Vögel wurden mit "Purina Start and Grow"-Futter ohne Kokzidiostatika oder Antibiotika weitergefüttert.
Gleichzeitig wurden steigende Dosen des Wildtyp-S.-typhimurium-Elternstamms MGN-054s in gepufferter Salzlösung mit Gelatine aus einer frischen Luria-Nährmediumkultur der späten log-Phase hergestellt und Gruppen von 3 am selben Tag geschlüpften White-Leghorn-Küken durch entweder groben Spray oder direkte orale Verabreichung zugeführt.
Allen Vogelgruppen, die den Vakzinenstamm am Tag des Schlüpfens erhalten hatten, wurde eine Auffrischungsimpfung am Tag 14 über denselben Weg und mit derselben Dosierung verabreicht, wie sie in den einzelnen Gruppen für die erste Impfung verwendet wurden. An 7. und 20. Lebenstag wurden die Vogelgruppen mittels CO₂-Erstickung getötet, und Nekropsien wurden durchgeführt, um unter aseptischen Bedingungen Proben aus Milz und Bursa, Exkrementen und Caecuminhalt für die Liste der Vakzinenstämme zu entnehmen.
Serum wurde vom Blut getrennt, das im Rahmen der 20-Tag-Nekropsie gesammelt wurde, und 1:200 für ELISA verdünnt. Kurz zusammengefasst wurde gereinigtes LPS aus S. typhimurium als Testantigen verwendet. Ziege-Anti-Huhn-IgA-, -IgM- und -IgG-affinitätsgerreinigte polyklonale Antikörper EC2-001, EC2-005 bzw. EC2-0011 (von Immunovision, Springdale, AR) wurden in einer Verdünnung von 1:5.000 verwendet, um Huhn-IgM, -IgA oder -IgG, gebunden an gereinigtes LPS-Antigen auf ELISA-Platten (Dynatech Laboratories Inc., Alexandra, VA) nachzuweisen. Ein Konjugat aus Kaninchen-Anti-Ziegen-IgG (ganzes Molekül) und alkalischer Phosphatase (Sigma, St. Louis, MO) wurde in einer Verdünnung von 1:3.000 mit P-Nitrophenylsphosphat (Sigma, St. Louis, MO) (1mg/ml) in Diethanolaminpuffer pH 9,8 als Substrat verwendet. Die Reaktion wurde nach 30 min Inkubation mit 50 μl von 3M Natriumhydroxid gestoppt. Absorptionswerte wurden bei 405 nm unter Verwendung eines automatisierten Mikroplattenlesers (Bio-Tek, Winooski, VT) abgelesen. Die ELISA-Resultate wurden als mittlere Absorption (405 nm) von vier Hühnern innerhalb einer Behandlungsgruppe ausgedrückt. Der Cut-off-Punkt wurde als 2 × der Absorptionsmittelwert von Seren aus nicht infizierten Hühnern angenommen, der als Basislinie zur Detektion von Hühnerimmunglobulin-Isotypen durch ELISA diente.
Ergebnisse und Schlussfolgerungen:
Keine Mortalität wurde in Vogelgruppen beobachtet, die Dosen der Vakzine bis zu 10⁹ KBE, verabreicht an den Tagen 1 und 14, erhielten. Die in den Gruppen von 1 Tag alten Küken, die steigende Dosen des virulenten Wildtyp-Elternstamms durch Verabreichung mittels groben Sprays oder oraler Zufuhr erhielten, beobachteten LD₅₀'s betrugen etwa 10³ KBE, beliefen sich also auf denselben Wert, der davor bei oraler Impfung von 1 Tag alten Küken bestimmt wurde.
1 (a, b und c) zeigt die Gewinnung des Vakzinenstamms aus der Milz und den Bursageweben, aus Exkrementen und Caecuminhalt von Vögeln 7 Tage nach Verabreichung des Vakzinenstamms am Tag des Schlüpfens. 2 (a, b und c) zeigt die Gewinnung des Vakzinenstamms aus der Milz und den Bursageweben, aus Exkrementen und Caecuminhalt von Vögeln 20 Tage nach Verabreichung des Vakzinenstamms an den Tagen 1 und 14. Der Vakzinenstamm kolonisierte effizient in 100% der untersuchten Vögel viszerale und lymphatische Gewebe sowie den Darmtrakt. In einer anderen Studie, die diese zwei Verfahren der Vakzinenverabreichung verglich, wurden ähnliche Ergebnisse bei Hühnerküken beobachtet, die mit "Purina Start and Grow"-Futter, ergänzt mit den empfohlenen Konzentrationen an Bacitracin (BMD-50) und einem Kokzidiostatikum (Coban-100), gefüttert wurden. In einem Vergleich aller Dosierungskonzentrationen zeigten die Daten im Allgemeinen keine signifikanten Unterschiede zwischen der Verwendung des groben Sprays oder der direkten oralen Impfung zur Verabreichung des S.-typhimurium-χ3985-Vakzinenstamms an Leghorn- oder Hühnervögel.
Die durch ELISA nachgewiesenen Konzentrationen an Salmonella-spezifischem IgM, IgA und IgG gegenüber S.-typhimurium-LPS in Hühnern, denen die Vakzine χ3985 verabreicht wurde, sind in 3 dargestellt. Dosen im Bereich von 10⁵ bis 10⁹ KBE induzierten bei der Verwendung beider getesteten Verfahren signifikante humorale Antikörper. Die höchste Dosis von 10⁹ KBE induzierte im Vergleich mit den niedrigeren Dosen die stärkste Antikörperreaktion. IgM war das vorherrschende Immunglobulin am 20. Lebenstag in allen Vögeln, die in allen Dosierungsgruppen getestet wurden. Es wurde berichtet, dass IgM auch das vorherrschende Isotop 3 Wochen nach Impfung mittels oraler Verabreichung ist (Hassan & Curtiss, Res. Microbiol. 141, 839-850 (1990)). Verglichen mit Vögeln, die 10⁷ oder 10⁹ KBE über direkte orale Verabreichung erhielten, wurden in der vorliegenden Studie gesteigerte Antikörperreaktionen, die sich in höheren OD₄₀₅-Messungen widerspiegeln, an Vögeln beobachtet, die 10⁷ oder 10⁹ KBE über Sprayimpfung erhielten.
BEISPIEL 2
Dieses Beispiel zeigt die Wirksamkeit von Sprayimpfung einer lebenden avirulenten S.-typhimurium-Vakzine zur Prävention von Kolonisation des Magendarmtrakts und der Darmorgane durch S. typhimurium vom Wildtyp.
55 1 Tag alten SPF-White-Leghorn-Küken wurden zur Verwendung in diesem Versuch die Flügel zusammengebunden. Am Tag des Schlüpfens wurden 30 Vögel mittels groben Sprays mit 1 × 10⁷ KBE pro Dosis S.-typhimurium-Vakzine, die in etwa 0,3 ml pro Vogel eingebunden war, unter Verwendung einer Preval-Power-Unit-Sprühvorrichtung von Precision Valve Corp., Yonkers, NY 10703, geimpft. Die Vakzine war χ3985, Produkt-Code 19C1.01 (Maine Biological Laboratories, Inc., Waterville, ME). Zwanzig Vögel erhielten 0,3 ml destilliertes Wasser pro Vogel, verabreicht mittels groben Sprays, und dienten als Kontrolle. Fünf zusätzliche Vögel wurden als gleichzeitige Kontrolle (ohne Impfung) gehalten. Geimpfte Vögel und Kontrollvögel wurden getrennt voneinander in Horsfal-Isolationseinheiten gehalten. Nach zwei Lebenswochen wurden die geimpften Tiere mit Trinkwasser, das 1 × 10⁷ KBE pro Dosis derselben Vakzine enthielt, geboostet. Nach sechs Lebenswochen wurden alle Vögel in beiden Behandlungsgruppen einzeln mit einer oralen Dosis von 1 × 10⁶ KBE in 0,1 ml von Wildtyp-S.-typhimurium provoziert.
Bei jedem Vogel aus beiden Behandlungsgruppen wurden vor dem Challenge (der Provokation) und zum Zeitpunkt der Tötung Kloakenabstriche gemacht, um diese auf Salmonella sp. zu untersuchen. Die Abstriche wurden in 5 ml TBGH-Nährmedium gegeben und 24-36 Stunden lang bei 42°C inkubiert. Nach etwa 36 Stunden wurde das Nährmedium auf Brillantgrün-Agar + 35 μg/ml Novobiocin (BGAN) ausgestrichen und bei 42°C inkubiert.
Nach sieben Lebenswochen wurden alle Vögel getötet, und die Gewebe wurden entnommen und für S. typhimurium vom Wildtyp wie folgt kultiviert: Etwa 5 g jeweils von Milz, Leber, Niere und jedem Organ, das sichtbare Läsionen aufwies, wurden unter aseptischen Bedingungen aus jedem Vogel entnommen. Milz-, Leber- und Nierengewebe, das aus einem Vogel erhalten wurde, wurde gesammelt. Jedes Organ, das sichtbare Läsionen aufwies, wurde gesammelt und separat verarbeitet. Weiters wurde eine 10-mm-Probe des Duodenum-, Ileum- und Dickdarmgewebes mit Inhalt unter aseptischen Bedingungen aus jedem Vogel entnommen und einzeln verarbeitet. Darüber hinaus wurde jedem Vogel 1 g des Caecums mit Inhalt entnommen und ähnlich verarbeitet.
Um für Salmonella sp. zu kultivieren, wurden die Gewebe in einen sterilen Whirl^®pak-Beutel gegeben, in einem Stomacher-Mischer aufgeschlossen, und 5 ml Tetrathionat-Brillantgrün-Hajna- (TBGH-) Nährmedium wurde jedem Beutel zugesetzt. Die Gewebebeutel wurden 24 – 36 Stunden lang bei 42°C inkubiert, wonach eine Schlaufe voll aus jeder Kultur auf BGAN ausgestrichen wurde. Die Platten wurden nach 36 Stunden Inkubation bei 42°C auf charakteristische KBE auf BGAN-Agar untersucht. Nachdem der Beutel etwa 48 Stunden lang inkubiert worden war, wurde 1 ml aus dem TBGH aus der Beutelkultur in ein Röhrchen mit 4 ml frischem TBGH-Nährmedium übertragen, das Röhrchen wurde 5 Tage lang inkubiert und der Inhalt dann auf BGAN-Agar ausgestrichen. Die Platten wurden nach 36 Stunden Inkubation bei 42°C untersucht. Ein Agglutinierungstest mit Salmonella-Serum der Gruppe B wurde an zumindest einer Kolonie pro Platte von allen Platten durchgeführt, um die Gegenwart des Wildtyp-Challenge-Stamms S. typhimurium F98 zu bestätigen.
Tabelle 1. Versuchsmodell für Impfung mit avirulenter S. typhimurium und Challenge mit S. typhimurium vom Wildtyp bei Hühnern.
Ergebnisse:
Nach keiner Impfung wurde eine klinische Reaktion auf die Vakzine beobachtet. Der Vakzinenstamm wurde aus einem der dreißig Vögel 8 Tage nach der Impfung isoliert, wurde hiernach jedoch von keinem der Vögel bis zum Tag des Challenge gewonnen. Kein Vogel starb während der Versuchsdauer.
Die Kulturresultate aus allen Kloakenabstrichen vor und nach dem Challenge sind in der nachstehenden Tabelle 2 dargestellt. Der Vakzinenorganismus wurde an Tag 8 nach der Impfung aus einem der 30 Vögel isoliert; alle geimpften Vögel waren kulturnegativ, als ihnen an Tag 42 nach der ersten Impfung neuerlich Proben entnommen wurden. Sieben Tage nach dem Challenge war Wildtyp-S.-typhimurium aus den Kloakenabstrichen von 13% der geimpften Vögel kultiviert, im Vergleich zu 40% der nicht geimpften Vögel, die nur destilliertes Wasser erhalten hatten.
Tabelle 2. Anzahl an kulturpositiven Kloakenabstrichen von behandelten und nicht behandelten Vögeln vor und nach dem Challenge mit Wildtyp-S.-typhimurium.
Die geimpften und nicht geimpften Vögel unterschieden sich auch im Ausmaß der Kolonisation des Magendarmtrakts und der Milz, Leber bzw. Niere (siehe Tabelle 3). Wildtyp-S.-typhimurium wurden aus gesammelten Organgeweben von 85% der nicht geimpften Kontrollvögel kultiviert, im Vergleich zu 13% der geimpften Vögel (P ≤ 0,05). Eine signifikante Reduktion der Anzahl an kulturpositiven Ileum- und Dickdarmproben wurde bei geimpften und nicht geimpften Vögeln erkannt (P ≤ 0,05).
Eine signifikante Reduktion wurde auch bei der Anzahl von kulturpositiven Caecumproben von geimpften und nicht geimpften Vögeln erkannt (P ≤ 0,05). Keine Unterschiede konnten zwischen der Anzahl an kulturpositiven Duodenumproben von geimpften und nicht geimpften Vögeln festgestellt werden.
Tabelle 3. Kultur von S. typhimurium bei erwachsenen Vögeln, mit avirulenter lebender S. typhimurium geimpft und mit Wildtyp-S.-typhimurium provoziert.
Die modifizierte lebende S.-typhimurium-Vakzine verlieh geimpften Vögeln Schutz gegen künstlichen Challenge mit invasiver S. typhimurium vom Wildtyp. Dieser Challenge-Versuch zeigte, dass Vögel, die an den Lebenstagen 1 und 14 mit der lebenden S.-typhimurium-Vakzine geimpft wurden, gegenüber Kontrollvögeln einen statistisch signifikanten Vorteil hatten. Es gab eine signifikante Reduktion der Anzahl an erwachsenen Vögeln in beiden Behandlungsgruppen, die Kolonisation der inneren Organe durch Wildtyp-S.-typhimurium aufwiesen (P ≤ 0,05). Der Schutz der Viscera war offensichtlich, da weniger Vögel aus den geimpften Gruppen auf Grundlage der Tests an Ileum-, Dickdarm- und Caecumproben kulturpositiv waren als nicht-geimpfte Vögel, deren Gewebe ebenfalls untersucht worden waren (P ≤ 0,05). Das Duodenum scheint kein Zielgewebe für S. typhimurium zu sein, da nur 10% der nicht geimpften Kontrollvögel durch den Wildtyp kolonisiert waren. Weiters wurde im Vergleich zu den nicht behandelten Vögeln eine signifikante Reduktion der Anzahl an Vögeln, die positive Kloakenkulturabstriche für den Wildtyp-Challenge-Organismus aufwiesen, bei den Vakzinen-behandelten Tieren verzeichnet.
Die Daten aus dieser Studie zeigen, dass die S.-typhimurium-Vakzine, die Hühnern an Tag 1 mittels groben Sprays und an Tag 14 im Trinkwasser verabreicht wurde, Kolonisation des Magendarmtrakts und Invasion und Kolonisation der viszeralen Organe durch Wildtyp-S.-typhimurium bei erwachsenen Hühnern signifikant reduziert.
BEISPIEL 3
Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirksamkeit der Spray-Verabreichung einer lebenden avirulenten S.-typhimurium-Vakzine bei der Prävention von Kolonisation innerer Organe nach oralem Challenge mit entweder S. enteritidis oder S. heidelberg vom Wildtyp.
Tabelle 4 zeigt das Versuchsmodell der Sprayimpfungsstudien, in denen Hühner mit entweder S. heidelberg oder S. enteritidis provoziert wurden.
Tabelle 4. Versuchsmodell für Impfung mit S.-typhimurium-Vakzine und Challenge mit S. heidelberg oder S. enteritidis bei Hühnern.
S.-heidelberg-Studie:
36 1 Tag alten SPF-White-Leghorn-Küken (SPAFAS Inc., Storrs, CT) wurden zur Verwendung in diesem Versuch die Flügel zusammengebunden. Am ersten Lebenstag wurden 33 Vögel (Gruppe 1) durch groben Spray mit 1 × 10⁷ KBE pro Dosis an Vakzine χ3985, Produkt-Code 19C1.01, geimpft, die in etwa 0,35 ml Volumen pro Vogel unter Verwendung einer Preval-Power-Unit-Sprühvorrichtung (Precision Valve Corp., Yonkers, NY) zugeführt wurde. Zwanzig Vögel (Gruppe 2) erhielten 0,3 ml destilliertes Wasser pro Vogel durch groben Spray und dienten als Kontrolltiere, zehn zusätzliche Vögel (Gruppe 3) wurden als nicht geimpfte und nicht provozierte Kontrollen gehalten. Geimpfte Vögel und Kontrollvögel wurden getrennt voneinander in Horsfal-Isolationseinheiten gehalten.
Nach 2 Lebenswochen wurden die geimpften Tiere mit Trinkwasser, das 9,6 × 106 KBE pro Dosis derselben Vakzine enthielt, geboostet, wobei pro Vogel 5,1 ml Vakzine-hältiges Wasser zum Trinken bereitgestellt wurden. Serumproben wurden vor dem Challenge von sechs Wochen alten Vögeln in den Gruppen 1 und 2 entnommen, um Salmonella-Antikörper mittels ELISA zu bewerten. Kloakenabstriche wurden auch von jedem Vogel zu diesem Zeitpunkt genommen, um auf die Gegenwart von Salmonella sp. zu kultivieren. Nach sechs Lebenswochen wurden alle Vögel der Gruppen 1 und 2 einzeln mit einer oralen Dosis von 1,6 × 10⁸ KBE in 1,0 ml Nalidixinsäure-resistenter S. heidelberg vom Wildtyp provoziert. Vier Tage später wurden bei allen Vögeln Abstriche genommen, sie wurden getötet, und Gewebeproben wurden entnommen und für den Wildtyp-S.-heidelberg-Stamm wie folgt kultiviert. Etwa 10 g jeweils von Milz, Leber, Niere und jedem Organ, das sichtbare Läsionen aufwies, wurden unter aseptischen Bedingungen jedem Vogel entnommen. Milz-, Leber- und Nierengewebe, das von einem Vogel entnommen wurde, wurde gepoolt. Jedes Organ, das sichtbare Läsionen aufwies, wurde gesammelt und separat verarbeitet. Darüber hinaus wurde eine 10-mm-Probe von Duodenum, Ileum und Dickdarm unter aseptischen Bedingungen jedem Vogel entnommen und ähnlich verarbeitet. Zusätzlich wurde jedem Vogel eine 10-mm-Probe des Caecums mit Inhalt entnommen und ähnlich verarbeitet.
Um für Salmonella sp. zu kultivieren, wurden die Gewebe in einen sterilen Whirl-Pak-Beutel gegeben, 25 ml Tetrathionat-Brillantgrün-Hajna- (TBGH) Nährmedium wurden jedem Beutel zugesetzt, und die Probe wurde in einem Stomacher-Mischer aufgeschlossen. Die Gewebebeutel wurden 40 h lang bei 42°C inkubiert, woraufhin eine 10-μl-Impföse aus jeder Kultur auf Brillantgrün-Agar + 35 μg/ml Novobiocin (BGAN) und Xylose-Lysin-Tergitol-4-Agar + 100 μg/ml Nalidixinsäure (XLT4-Nal) ausgestrichen wurde. Die Platten wurden nach 24 Stunden Inkubation bei 42°C auf charakteristische Kolonien auf XLT4-Nal- und BGAN-Agar untersucht. Die Anreicherungs-Kulturmedien wurden neuerlich auf XLT4-Nal und BGAN. ausgestrichen, bei 42°C 24 Stunden lang inkubiert und auf charakteristische Kolonien beobachtet. Ein Agglutinierungstest mit Salmonella-O-Gruppenspezifischem (Gruppe B) Antiserum wurde an zumindest einer Kolonie pro Platte aus allen Platten durchgeführt, um die Gegenwart des Wildtyp-Challenge-Stamms S. heidelberg zu bestätigen.
Kloakenabstriche wurden von jedem Vogel aus allen Behandlungsgruppen vor dem Challenge und zum Zeitpunkt der Tötung abgenommen, um sie auf Salmonella sp. zu beobachten. Die Abstriche wurden in 5 ml TBGH-Nährmedium gegeben und 24-40 Stunden lang bei 42°C inkubiert. Nach etwa 40 Stunden wurde das Nährmedium auf BGAN ausgestrichen und bei 42°C inkubiert. Ein Agglutinierungstest mit Salmonella-O-Gruppen-spezifischem (Gruppe B) Antiserum wurde an zumindest einer Kolonie pro Platte aus allen Platten durchgeführt, um die Gegenwart des Wildtyp-Challenge-Stamms S. heidelberg zu bestätigen.
Ergebnisse:
Nach keiner Impfung wurden klinische Reaktionen auf die Vakzine beobachtet. Keine Vögel starben durch die Vakzine während der Testdauer. Ein Vogel in der Impfungsgruppe starb durch eine Verletzung an Tag 49 des Versuchs. Keine der Vakzinen aus den Vögeln der Gruppe 1, die an Tag 42 nach der Impfung entnommen wurden, zeigten positive Kloakenkulturen.
Alle Kulturresultate für Kloakenabstriche vor und nach dem Challenge sind nachstehend in Tabelle 5 gezeigt. Der Vakzinenorganismus wurde aus keinem der Vögel in Gruppe 1 vor dem Challenge gewonnen. Vier Tage nach Erhalt des Wildtyp-Challenge-Organismus zeigten 50% der geimpften Vögel positive Kloakenkulturen des Wildtyp-Organismus, während 70% der nicht geimpften Kontrollvögel kulturpositiv waren. Diese Daten zeigen keinen statistischen Unterschied zwischen den zwei Gruppen bezüglich positiver Kloakenkulturen für den Wildtyp-Organismus.
Tabelle 5. Anzahl an kulturpositiven Kloakenabstrich-Proben von behandelten und nicht behandelten Vögeln vor und nach dem Challenge mit Wildtyp-S.-heidelberg.
Gruppen von geimpften und nicht behandelten Vögeln wurden nach 6 Lebenswochen mit einer oralen Dosis von lebendem Wildtyp-S.-heidelberg provoziert, um den Schutz gegen Invasion der Gewebe der inneren Organe und Kolonisation des Verdauungstrakts zu bewerten (siehe Tabelle 6). Ein signifikanter Unterschied wurde zwischen den geimpften und nicht geimpften Gruppen gefunden, die mit Wildtyp-S.-heidelberg provoziert wurden; 25% der geimpften Vögel, die mit Wildtyp provoziert wurden, waren kulturpositiv in gesammelten Organgeweben, im Vergleich zu 70% der nicht geimpften Kontrollvögel (P ≤ 0,05). Ein signifikanter Rückgang der Anzahl an gesammelten kulturpositiven Verdauungstraktproben wurde unter den geimpften Vögeln im Vergleich zu nicht geimpften Vögeln festgestellt (P ≤ 0,05). Keine Unterschiede wurden bezüglich der Anzahl an kulturpositiven Caecumproben zwischen geimpften und nicht geimpften Vögeln festgestellt. Nicht behandelte, nicht provozierte Kontrollvögel waren frei von Salmonella sp.
Tabelle 6. Schutz von erwachsenen Vögeln, die mit lebender avirulenter S. typhimurium geimpft und mit Wildtyp-S.-heidelberg provoziert wurden.
S.-enteritidis-Studie:
Tabelle 4 zeigt das Versuchsmodell der S.-enteritidis-Wirksamkeitsstudie. 36 1 Tag alten SPF-White-Leghorn-Küken (SPAFAS Inc., Storrs, CT) wurden zur Verwendung in diesem Versuch die Flügel zusammengebunden. Am ersten Lebenstag wurden 33 Vögel (Gruppe 4) durch groben Spray mit 1 × 10⁷ KBE pro Dosis an Vakzine χ3985, Produkt-Code 19C1.01, geimpft, die in etwa 0,35 ml Volumen pro Vogel unter Verwendung einer Preval-Power-Unit-Sprühvorrichtung (Precision Valve Corp., Yonkers, NY) zugeführt wurde. Zwanzig Vögel (Gruppe 5) erhielten 0,3 ml destilliertes Wasser pro Vogel durch groben Spray und dienten als Kontrolltiere, zehn zusätzliche Vögel (Gruppe 6) wurden als nicht geimpfte und nicht provozierte Kontrollen gehalten. Geimpfte Vögel und Kontrollvögel wurden getrennt voneinander in Horsfal-Isolationseinheiten gehalten.
Nach 2 Lebenswochen wurden die geimpften Tiere mit Trinkwasser, das 9,6 × 10⁶ KBE pro Dosis derselben Vakzine enthielt, geboostet, wobei pro Vogel 5,1 ml Vakzine-hältiges Wasser zum Trinken bereitgestellt wurden. Serumproben wurden vor dem Challenge von sechs Wochen alten Vögeln in den Gruppen 4, 5 und 6 entnommen, um Salmonella-Antikörper mittels ELISA zu bewerten. Kloakenabstriche wurden auch von jedem Vogel zu diesem Zeitpunkt genommen, um auf die Gegenwart von Salmonella sp. zu kultivieren. Nach sechs Lebenswochen wurden alle Vögel der Gruppen 4 und 5 einzeln mit einer oralen Dosis von 4,5 × 10⁷ KBE in 1,0 ml Nalidixinsäure-resistenter S. enteritidis vom Wildtyp provoziert. Sieben Tage später wurden bei allen Vögeln Abstriche genommen, sie wurden getötet und gemäß dem zuvor in der S.-heidelberg-Wirksamkeitsstudie beschriebenen Verfahren für den Wildtyp-S.-enteritidis-Stamm kultiviert, mit der Ausnahme, dass die Agglutinierungstests mit Salmonella-O-Gruppen-spezifischem (Gruppe D) Antiserum und nicht mit Gruppe-B-Antiserum durchgeführt wurden.
Ergebnisse
Nach keiner der Impfungen wurde eine klinische Reaktion auf die Vakzine beobachtet. Kein Testtier starb im Laufe des Tests aufgrund der Vakzine. Ein Vogel der mit Vakzine behandelten Gruppe starb, wahrscheinlich aufgrund einer Verletzung, die er nach der Herzpunktion zur Abnahme von Blut zur Serumantikörperbewertung erlitt.
Kulturergebnisse für alle Kloakenabstriche vor und nach dem Challenge sind nachstehend in Tabelle 7 dargestellt. Der Vakzinenorganismus wurde aus keinem der Vögel aus Gruppe 4 vor dem Challenge gewonnen. Sieben Tage nach Erhalt des Wildtyp-Challenge-Organismus zeigten 41% der geimpften Vögel positive Kloakenkulturen für den Wildtyp-Organismus, während 63% der nicht geimpften Kontrollvögel kulturpositiv waren. Diese Daten zeigen, dass zwischen den zwei Gruppen bezüglich der positiven Kloakenkulturen für den Widltyp-Organismus kein statistischer Unterschied besteht.
Tabelle 7. Anzahl von kulturpositiven Kloakenabstrichproben aus geimpften und nicht-geimpften Vögeln vor und nach dem Challenge mit Wildttyp-S.-enteritidis.
Die geimpften und nicht geimpften Vögel unterschieden sich auch im Ausmaß der Kolonisation des Magendarmtrakts und der Milz, Leber und Niere zusammen, wie in Tabelle 8 gezeigt ist. Ein signifikanter Unterschied wurde zwischen den geimpften und nicht geimpften Gruppen, die mit Wildtyp-S.-enteritidis provoziert wurden, festgestellt; 9% der geimpften Vögel, die mit Wildtyp provoziert wurden, waren kulturpositiv in gesammelten Geweben der inneren Organe, im Vergleich zu 58 der nicht geimpften Vögel (P ≤ 0,05). Eine signifikante Reduktion der Anzahl von gesammelten kulturpositiven Verdauungstraktproben wurde bei geimpften und nicht geimpften Vögeln erkannt (P ≤ 0,05). Keine Unterschiede konnten hinsichtlich der Anzahl an kulturpositiven Caecumproben zwischen geimpften und nicht geimpften Vögeln festgestellt werden. Nicht behandelte, nicht provozierte Kontrollvögel waren frei von Salmonella sp.
Tabelle 8. Schutz von erwachsenen Vögeln, die nach oralem Challenge mit Wildtyp-S.-enteritidis mit einer modifizierten Lebend-S.-typhimurium-Vakzine geimpft wurden.
Serumproben wurden auf IgG-Antikörper gegen S.-typhimurium-Lipopolysaccharid (-LPS) mittels ELISA gescreent. Die Proben wurden 1:100 verdünnt und zu Doppel-Wells, die mit kommerziell hergestelltem S.-typhimurium-LPS beschichtet waren, zugesetzt. HRP-konjugiertes Kaninchen-Anti-Huhn-IgG zu 1:30.000 wurde zur Detektion verwendet. Von den mit S.-typhimurium-Vakzine geimpften Vögeln entwickelten 52% eine starke Reaktion auf die Vakzine, mit OD₄₉₀-Messungen über 0,3; 9% reagierten positiv im Mittelbereich von 0,2-0,3, und 39% wurden im Niederbereich von 0,05-0,1 gemessen. Kontrollvögeln entnommene Seren wiesen einen Mittelwert der OD₄₉₀-Messungen von 0,005 ± 0,009 auf, also weit unter allen Messungen, die für Seren aus geimpften Vögeln erhalten wurden.
Schlussfolgerung:
Sprayimpfung am Tag des Schlüpfens mit der lebenden avirulenten S.-typhimurium-Vakzine, χ3985, Produkt-Code 19C1.01, gefolgt von oraler Verabreichung der Vakzine im Trinkwasser an Tag 14, rief keinerlei negative Reaktion bei den Hühnern hervor. Der Vakzinenstamm wurde aus Kloakenabstrichen von sprühgeimpften Vögeln nicht gewonnen, wenn nach der sechsten Lebenswoche oder kurz vor dem Challenge mit den Wildtyp-S.-enteritidis- oder -S.-heidelberg-Organismen Proben entnommen wurden. Alle geimpften Vögel, die getestet wurden, brachten im Vergleich zu nicht geimpften Vögeln eine serologische Reaktion hervor, wenn sie der S.-typhimurium-Vakzine ausgesetzt wurden.
Die aus diesem Versuch gewonnenen Daten zeigen, dass die S.-typhimurium-Vakzine signifikanten Schutz zur Reduktion des Ausmaßes der Kolonisation innerer Organe entweder durch Salmonella heidelberg oder durch Salmonella enteritidis gewährte. Obwohl keine Unterschiede im Ausmaß von Kolonisation durch Wildtyp-Challenge-Stämme im Caecum bei geimpften und nicht geimpften Vögeln festgestellt werden konnte, wurde signifikanter Schutz vor S.-heidelberg- oder S.-enteritidis-Kolonisation des Verdauungstrakts durch die Impfung gewährt.
BEISPIEL 4
Dieses zeigt die Wirksamkeit von Sprayimpfung unter Verwendung einer lebenden avirulenten S.-typhimurium-Vakzine zum Schutz von erwachsenen Vögeln gegen Kolonisation der inneren Organe nach dem Challenge mit Wildtyp-S.-enteritidis.
55 1 Tag alten SPF-White-Leghorn-Küken (HyVac, Adel, IA) wurden zur Verwendung in diesem Versuch die Flügel gebunden. Am Tag des Schlüpfens wurden 30 Vögel (Gruppe 1) mittels groben Sprays mit etwa 1 × 10⁷ KBE pro Dosis χ3985-Vakzine, Produkt-Code 19C1.01 (hergestellt von Maine Biological Laboratories, Inc., Waterville, ME), eingebunden in etwa 0,3 ml pro Vogel, unter Verwendung einer Preval-Power-Unit-Sprühvorrichtung (Precision Valve Corp., Yonkers, NY) geimpft. Zwanzig Vögel (Gruppe 2) erhielten 0,3 ml destilliertes Wasser pro Vogel, verabreicht mittels groben Sprays, und dienten als Kontrolle, fünf zusätzliche Vögel (Gruppe 3) wurden als gleichzeitige Kontrolle gehalten. Geimpfte Vögel und Kontrollvögel wurden getrennt voneinander in Horsfal-Isolationseinheiten gehalten.
Tabelle 9. Versuchsmodell für Impfung mit S.-typhimurium-Vakzine und Challenge mit Salmonella enteritidis.
Nach zwei Lebenswochen wurden die geimpften Tiere mit Trinkwasser, das etwa 1 × 10⁷ KBE pro Dosis derselben Vakzine enthielt (eine Dosis in 15 ml Wasser pro Vogel), geboostet. Nach sechs Lebenswochen wurden alle Vögel der mit Vakzine behandelten und der Kontrollgruppen einzeln mit einer oralen Dosis von 4 × 10⁷ KBE in 0,5 ml von Wildtyp-S.-enteritidis provoziert. Kloakenabstriche wurden auch 5 Tage nach dem Challenge von jedem Vogel gesammelt, um die Anzahl an Wildtyp-Kloakenabstrichen zu bemessen. Alle Vögel wurden 5 Tage nach dem Challenge getötet, obduziert, und Gewebeproben wurden für die Wildtyp-S. enteritidis wie in Beispiel 2 beschrieben kultiviert.
Ergebnisse:
Keine klinische Reaktion auf die Vakzine wurde während der Impfphase beobachtet. In keiner der Behandlungsgruppen starb während der Versuchsdauer ein Versuchstier.
Gruppen von geimpften und nicht behandelten Vögeln wurden nach sechs Lebenswochen mit einer oralen Dosis von Wildtyp-S.-enteritidis provoziert, um Schutz gegen Invasion von Geweben der inneren Organe und Kolonisation des Magendarmtrakts zu bewerten (siehe Tabelle 10). Ein signifikanter Unterschied wurde zwischen den geimpften und den nicht geimpften Gruppen erkannt, die mit Wildtyp-S.-enteritidis provoziert wurden; 95% der nicht geimpften Kontrollvögel, die mit Wildtyp provoziert wurden, waren kulturpositiv in den gesammelten Organgeweben nach dem Challenge, im Vergleich zu 20% der geimpften Vögel (P ≤ 0,01). Eine signifikante Reduktion der Anzahl an kulturpositiven Duodenumproben wurde innerhalb der Vakzine-behandelten Gruppe und der Kontrollgruppe beobachtet (P ≤ 0,01). Keine Unterschiede konnten bezüglich der Anzahl an S.-enteritidis-positiven Ileum-, Dickdarm- oder Caecumproben von geimpften und nicht geimpften Vögeln festgestellt werden.
Tabelle 10. Schutz von erwachsenen Vögeln, geimpft mit einer modifizierten S.-typhimurium-Lebendvakzine nach oralem Challenge mit Wildtyp-S.-enteritidis.
86% der mit Vakzine behandelten Vögel zeigten positive Kloakenkulturen für den Wildtyp-Challenge-Organismus im Vergleich zu 100% der Vögel in den nicht geimpften Kontrollgruppen.
Schlussfolgerung:
Sprayimpfung am Tag des Schlüpfens mit der Lebendvakzine χ3985, Produkt-Code 19C1.01, gefolgt von oraler Verabreichung der Vakzine im Trinkwasser an Tag 14, führte zu keinen negativen Reaktionen bei Hühnern.
Obwohl Schutz vor Wildtyp-Kolonisation in den Darmtrakt- und Caecumproben von geimpften Vögeln nicht augenscheinlich war, wurde im Vergleich zu nicht geimpften, provozierten Vögeln signifikanter Schutz gegen Kolonisation innerer Organe durch Wildtyp-S.-enteritidis in den inneren Organen von Vakzine-behandelten, provozierten Vögeln bewiesen.
BEISPIEL 5
Dieses Beispiel veranschaulicht, dass Sprayimpfung von Küken mit modifizierter S.-typhimurium-Lebendvakzine unter vorliegenden Bedingungen bei normaler, großtechnischer, kommerzieller Geflügelzucht ein sicheres und effizientes Mittel zur Reduktion von Salmonella-Infektion ist.
Zweck:
Zweck dieses Versuches ist, die Sicherheit und das Potential der Vakzine χ3985, Produkt-Code 19C1.01, Salmonella-Infektion unter normalen, großtechnischen, kommerziellen Geflügelproduktionsbedingungen zu reduzieren, zu bewerten. Die Sicherheit der Vakzine wurde durch Messen der Verteilungsfähigkeit des Produkts und des Überlebens der Hühner während der Wachstumsphase bewertet. Die Wirksamkeit des Produkts wurde durch bakteriologische Analysen von Spülflüssigkeiten, mit denen die Tierkörper nach dem Verarbeiten nach dem Kühlen gespült wurden, durch das mittlere Gewicht und den Prozentsatz an Infektion bei der Verarbeitung bewertet.
Materialien und Verfahren:
Drei geographisch unterschiedlich gelegene Hühnerfarmen mit zwei nebeneinander gelegenen Häusern wurden so ausgewählt, dass in jedem Geflügelhaus zumindest 16.000 Vögel untergebracht waren. Dies ermöglichte einen dreifach wiederholten Versuch unter Verwendung von mehr als 115.000 Vögeln, zu denen Kontrollvögel und Vögel, die mit der modifizierten S.-typhimurium-Lebendvakzine behandelt wurden, gehörten. Es wurde versucht, Versuchs-Hühnerfarmen zu finden, von denen bekannt war, dass sie mit stetiger Salmonella-Infektion zu kämpfen hatten. Tabelle 11 beschreibt die Orts- und Studienparameter der drei Versuche.
Tabelle 11. Beschreibung von Vakzinensicherheits-Feldversuchen.
Produktion von vorlizenzierten Serien:
Die vorlizenzierten Serien modifizierter Lebend-χ-3985-Vakzine, Produkt-Code 19C1.01, wurden gemäß dem Produktionsentwurf, eingereicht und zugelassen am 20. März 1995, härgestellt.
Testverfahren:
An allen Hühnerfarmorten wurden die normalen handelsüblichen Impfungs-, Fütterungs- und Wasserversorgungspläne dieses bestimmten Geflügelunternehmens befolgt. Geschlüpfte Küken erhielten Mareksche Vakzine entweder in ovo oder am Tag des Schlüpfens und Newcastlel/Bronchitis-Vakzine mittels Spray am Tag des Schlüpfens. Eine Boost-Bronchitisimpfung wurde in beiden Häusern an jedem Farmenort an den Tagen 16-18 der Studie verabreicht.
Verfahren zur Anwendung der S.-typhimurium-Vakzine:
1. Sprayanwendung am Tag des Schlüpfens:
Eine tragbare Sprayschachtelvorrichtung (hergestellt und betrieben von Merial Select, Atlanta, GA) wurde im Bruthaus so eingerichtet, dass ankommende Schachteln mit Vögeln geimpft wurden, bevor die Küken auf den Boden des Hauses gesetzt wurden. Die Vakzine wurde als eine gefriergetrocknete Formulierung in einer Glasphiole bereitgestellt. Die Vakzine wurde gemäß der Gebrauchsanleitung in sauberes, chlorfreies Wasser gemischt. Die Sprayausstattung wurde vor dem Einsatz händisch kalibriert, um etwa 700 ml bis 1 l über 10.000 Küken unter einem Druck von 1 bar (15 psi) unter Verwendung von 4 ambossförmigen Fächersprühdüsen mit groben Öffnungen zur Abgabe von 50-100 μm großen Tröpfchen zu verteilen. Dies ergab eine Dosis von etwa 0,07-0,1 ml pro Küken.
2. Trinkwasser-Anwendung nach zwei Lebenswochen
Zwei Wochen alten Vögeln wurde zwei bis vier Stunden lang kein Wasser zu trinken gegeben, bevor den Vögeln in den Behandlungshäusern auf jeder Farm Zugang zum Vakzinenwasser gewährt wurde. Das Merial-Select-Bag-Boost-System wurde für eine kalibrierte Zufuhr der Vakzine eingesetzt. Die erforderliche Menge der S.-typhimurium-Vakzine wurde gemäß der Packungsanleitung zu einem Endvolumen an Verdünnungsmittel gemischt, das ausreichend war, um eine Dosis pro Vogel über eine Zeitspanne von zwei Stunden über die gesamten Wasserleitungen des Hauses zu verabreichen. Dieses Vakzinenwasser war in diesen zwei Stunden die einzige Wasserquelle für die Vögel, um sicherzustellen, dass alle Vögel die Gelegenheit hatten, über das Wasser ausreichend Vakzine zu sich zu nehmen. Das in den Häusern aller Farmen verwendete Quellwasser wurde vor der Impfung getestet, wobei kein Chlor im Wasser gefunden wurde und der pH in einem Bereich von 6,0 bis 7,0 lag.
Probenentnahme und Anreicherungskulturverfahren während des Versuchs:
Um die Gegenwart von lokaler Wildtyp-Salmonella spp. in der Umgebung und im Küken zu beobachten, wurden Ausgangsproben von Mekonium aus Kükenpapier im Bruthaus gesammelt, während Streuabstriche, Futter und Wasser in den Häusern für bakteriologische Analyse wie nachstehend beschrieben gesammelt wurden. Abstriche von Streu-, Futter- und Wasserproben wurden periodisch im Lauf der gesamten Versuchsdauer an jeder Teststelle gesammelt.
1. Kükenpapier und Abstriche:
Eine nach dem Zufallsprinzip ausgewählte Probe von 12 – 18 Kükenpapieren und Abstrichen aus jeder Gelegeschar wurde aus den einzelnen Küken-Transportschachteln gesammelt, bevor die Vakzine verabreicht wurde. Jedes ausgewählte Kükenpapier, das Mekonium enthielt, wurde in einzelne Plastiktüten gegeben, die versiegelt und beschriftet wurden. Sterile Gaze-Tupfer, befeuchtet mit steriler Magermilch, wurden verwendet, um zusätzliche Kükenpapiere abzutupfen, wurden dann in Kunststoff-Whirl^®Pak-Tüten gegeben, versiegelt und beschriftet. Alle Proben wurden unverzüglich auf Eis gekühlt in das Labor zur Analyse auf Salmonella spp. transportiert, um ein Grundniveau an Infektion im Bruthaus schlüpfender Küken zu bestimmen.
2. Futter- und Wasserproben:
Bevor die Studie begonnen wurde, wurde eine 40-g-Probe vom Futter aus der Futteranlage von jeder Farm entnommen. Diese Proben wurden in Whirl^®Pak-Tüten gegeben und beschriftet. Weiters wurden 100 ml Wasser an der Quelle nach dem Filter und 100 ml Wasser vom Sauger des Wasserspenders aus jedem Haus gesammelt. Das gesammelte Wasser wurde sofort auf Chlorrückstand und pH-Wert analysiert. Proben von Futter und Wasser wurden alle zwei Wochen während der gesamten Versuchsdauer von jeder Farm gesammelt, markiert und auf Eis gekühlt in das Labor zur bakteriologischen Analyse transportiert.
3. Abstrichproben von Hausstreu:
Vor Beginn eines jeden Versuchs wurden Abstrichproben von der Streu aus jedem Haus von jeder Farm gesammelt, um Grundniveaus von Salmonella-Infektion zu bestimmen. Zusätzliche Abstrichproben aus jedem Haus von jeder Farm wurden alle zwei Wochen während der gesamten Versuchsdauer gesammelt. Abstrichanordnungen wurden gemäß dem "National Poultry Improvement Plan and Auxiliary Provisions" (National Poultry Improvement Plan and Auxiliary Provisions manual. United States Department of Agriculture, Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS 92-55-017), April 1993) konstruiert. Die Tüten wurden versiegelt, beschriftet und auf Eis gekühlt für bakteriologische Analysen in das Labor transportiert.
4. Kulturverfahren:
Gepuffertes Peptonwasser (International Bioproducts Inc., Redman, WA; Difco Inc., Detroit, MI) wurde verwendet, um Futter, Wasser, Kükenabstriche, Kükenpapier und Abzugsabstriche zuvor anzureichern, und diente als die Spüllösung zur Bewertung der bakteriellen Belastung in Tierkörpern. Tetrathionat-Brillantgrün-Hajna-Nährmedium (Northeast Laboratories Inc., Waterville, ME) wurde als selektives Medium zur Anreicherung von Salmonella sp. oder der Vakzine verwendet. Tetrathionat-Brillantgrünagar, ergänzt mit 35 μg Novobiocin/ml (Sigma, St. Louis, MO), wurde verwendet, um charakteristisches Wachstum von Salmonella sp. oder der Vakzine zu identifizieren. Der Nachweis von Salmonella erfolgte gemäß den Verfahren, die in den "FSIS Sample Collection Guidelines and Procedure for Isolation and Identification of Salmonella from Raw Meat and Poultry Products" (Richtlinien und Verfahren für Probensammlung zur Isolation und Identifikation von Salmonella aus rohen Fleisch- und Geflügelprodukten) beschrieben werden. Alle positiven Kulturen wurden an das National Veterinary Laboratory (Ames, IA) zur Feststellung der Serotypen gesandt.
5. Bakteriologische Bewertung ganzer Tierkörper:
Fünfzig Tierkörper wurden nach dem Zufallsprinzip nach Kühlen und Verarbeitung aus jedem Haus ausgewählt. Es wurde gemäß den "FSIS Sample Collection Guidelines and Procedure for Isolation and Identification of Salmonella from Raw Meat and Poultry Products" (Food Safety Inspection Service Sample Collection Guidelines and Procedure for Isolation and Identification of Salmonella from Raw Meat and Poultry Products, Federal Register Bd. 61, Nr. 144, 38923 (25.07.1996)) vorgegangen, um Spülflüssigkeiten von ganzen Tierkörpern zu sammeln und die Gegenwart oder Abwesenheit von Salmonella sp. und/oder Vakzinenresten zu bewerten. Weiters wurde PCR (BACS System, Qaulicom, Wilmington, DE) verwendet, um Proben zu überprüfen, die bezüglich Agglutinierung durch Antiseren an spezifische Salmonella-O-Antigengruppen (Difco Inc., Detroit, MI) positive Ergebnisse ergaben, wobei jedoch keine reinen Kulturen erhalten werden konnten.
Statistische Verfahren:
Der χ²-Test wurde verwendet, um parametrische Resultate zwischen Vakzinebehandelten und Kontrollhäusern zu vergleichen.
Ergebnisse und Diskussion:
Versuch an Ort Nr. 1:
1. Analysen von Ausgangsproben:
Analysen von Ausgangsproben, die aus Kükenpapieren und Papierabstrichen, Wasser, Futter und Abzugsabstrichen der Hausstreu bestanden und vor Beginn des Versuchs gesammelt wurden, zeigten auf, dass das Futter aus dem Kontrollhaus positiv für Salmonella mbandaka war, und Küken aus zwei von drei Gelegescharen zeigten positive Kloakenkulturen für Salmonella heidelberg. Küken aus einer der Gelegescharen zeigten positive Kloakenkulturen für Organismen, von denen angenommen wird, dass sie einem O-Antigen Gruppe C₃ entstammen, wobei jedoch kein reines Isolat gewonnen werden konnte. Keine anderen Salmonella-sp.- oder Vakzinenorganismen konnten aus Futter, Wasser oder den Abzugsabstrichen der Streu aus irgendeinem der Häuser der Farm in der übrigen sechswöchigen Wachstumsphase des Versuchs gewonnen werden.
2. Lebensfähigkeit:
Daten zur Lebensfähigkeit wurden wöchentlich vom Züchter für jedes Haus der Farm gesammelt. Tabelle 12 zeigt die Anzahl an Vögeln, die im Laufe der Wachstumsphase des Versuchs starben. Es konnte kein Unterschied hinsichtlich des Verlusts an Vögeln zwischen dem Kontrollhaus und dem Haus der behandelten Vögel festgestellt werden, da sich der Prozentsatz des Verlusts für beide Häuser auf 2,8% belief. Der durchschnittliche Mortalitätsprozentsatz für eine Zeitspanne, die mit jener des Versuchs übereinstimmt, für die Region des Landes, in dem Ort Nr. 1 angesiedelt war, betrug 4,4 – 4,7% (The Poultry Informed Professional, Department of Avian Medicine, University of Georgia, Athens, GA (Jänner 1998)).
Tabelle 12. Mortalität von Vögeln während der Wachstumsphase für den Versuch an Ort Nr. 1.
Der in den Aufzeichnungen vorhandene Prozentsatz zur Lebensfähigkeit für Ort Nr. 1. lag im Bereich von 95,5 bis 99,6 in den Jahren 1996-1997. Der Lebensfähigkeits-Prozentsatz von 97,2 sowohl für Kontroll- als auch für behandelte Vögel lag innerhalb dieses Bereichs. Auf Grundlage dieser Daten hatte also die Vakzine keine negativen Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Vögel.
3. Ausschlussbericht des Prüfers des FSIS (Food Safety and Inspection Service) bei der Verarbeitung:
Der Ausschlussbericht des Prüfers des US-Landwirtschaftsministeriums ist in Tabelle 13 für jedes Haus dargestellt. Der Bericht des Prüfers gab eine höhere Anzahl an Fällen von Luftsackentzündung und Entzündungsprozessen in den Tierkörpern aus dem behandelten Haus gegenüber dem Kontrollhaus an. Mittlere Werte für die Region wurden aus dem Magazin The Poultry Informed Professional erhalten – für eine Woche während des Versuchs.
Tabelle 13. Prozentsätze für Ausschlussfälle bei der Verarbeitung im Versuch an Ort Nr. 1.
Die von den Mitarbeitern zur Verfügung gestellten, älteren Daten zeigen, dass diese Testfarm zyklisches Auftreten von Atemwegserkrankungen in den vergangenen zwei Jahren erlebt hatte, da die Prozentsätze für Luftsackentzündung während der Wintermonate erhöht waren. Die Hühnerschar, die vor dieser geimpften Testschar auf der Farm war, wies Prozentsätze für Luftsackentzündungen von 1,71 auf, verglichen zu 0,51 der Vögel in dem behandelten Haus aus diesem Versuch. Es gibt keine dokumentierten Fälle für Salmonella spp., die Luftsackentzündung oder Entzündungsprozesse verursacht. Darüber hinaus war das Tierkörperinspektionsverfahren kein Blindverfahren, da der verantwortliche Prüfer des US-Landwirtschaftsministeriums Identifikation der behandelten Vögel verlangte. Die Prozentsätze für Luftsackentzündung und Entzündungsprozesse unterschieden sich in zwei aufeinanderfolgenden Tests, die in diesem Bericht beschrieben werden, nicht zwischen den Kontroll- und den Vakzinen-behandelten Vögeln. Aufgrund dessen kann die Ursache für diese Erkrankungszustände nicht der Verwendung des Vakzinenprodukts zugeschrieben werden.
4. Bewertung des Tierkörpergewichts bei der Verarbeitung.
Das mittlere Gewicht des Vogels bei der Verarbeitung ist ein Indikator für die Leistung des Vogels während seiner Wachstumsphase. Eine Untersuchung von acht Wachstumszyklen an Ort Nr. 1 zeigte mittlere Vogelgewichte im Bereich von 4,36 bis 4,79 Pfund für Vögel bis zum 49. Lebenstag; die Gewichte der behandelten Vögel fielen in diesen Bereich mit einem Mittel von 4,84 Pfund, verglichen mit 4,85 Pfund für die Kontrollvögel bei 48 Lebenstagen. Auf Grundlage dieser mittleren Gewichtsdaten kann geschlossen werden, dass die Vakzine die Fähigkeit der Vögel, ein von den Produzenten erwartetes Leistungsniveau zu halten, nicht beeinflusst.
5. Bewertung der Tierkörper-Spülflüssigkeit
Die Ergebnisse der Bewertung der Tierkörper-Spülflüssigkeit sind in Tabelle 14 gezeigt. Die Anzahl an Salmonella-positiven Proben, identifiziert mittels PCR, und O-Antigen-Antiseren-Agglutinierung aus Tierkörper-Spülflüssigkeiten war signifikant niedriger in der Behandlungsgruppe als in der Kontrollgruppe (P ≤ 0,05). Weder die modifizierten Lebend-S.-typhimurium-Organismen noch irgendeine lokale Salmonella sp. wurden in den 50 Tierkörper-Spülflüssigkeitsproben aus der behandelten Gruppe, analysiert im Labor, identifiziert. 8% der Spülflüssigkeitsproben jedoch, die von den 50 Tierkörpern aus der Kontrollgruppe entnommen wurden, waren positiv für Gruppe-C-Salmonella, was darauf hinweist, dass die Vakzine wirksam lokale Salmonella aus dem Fleischprodukt eliminierte.
Tabelle 14. Bewertung der Tierkörper-Spülflüssigkeiten von Ort Nr. 1.
Versuch an Ort Nr. 2
1. Analysen von Ausgangsproben.
Analysen von gesammelten Ausgangsproben zeigten, dass das Futter vom Kontrollhaus und das Mekonium vom Kükenpapier Organismen enthielt, von denen angenommen wurde, dass sie dem O-Antigen Gruppe C₃ entstammen, wobei jedoch keine reinen Isolate gewonnen werden konnten. Im Futter, Wasser oder in Abstrichen von der Streu aus beiden Häusern der Farm konnten für die restliche Zeit der sechswöchigen Wachstumsphase des Versuchs keine anderen Salmonella sp. oder Vakzinenorganismen identifiziert werden.
2. Lebensfähigkeit
Daten zur Lebensfähigkeit wurden regelmäßig vom Züchter für jedes Haus der Farm gesammelt. Tabelle 15 zeigt die Mortalitätsdaten während der Wachstumsphase des Versuchs. Weniger Vögel starben im Kontrollhaus als im behandelten Haus während der ersten Woche des Versuchs. Keine Unterschiede bezüglich der Anzahl an Vögel, die starben, wurden zwischen den Gruppen nach der ersten Woche des Versuchs beobachtet. Der durchschnittliche Mortalitätsprozentsatz für eine Woche während der Versuchsdauer betrug 5,0 – 6,2% für die Region des Landes, in dem der Versuch stattfand (The Poultry Informed Professional, Februar 1998). Die Mortalität in jedem Haus fiel unter den regionalen Mittelwert für diese Zeitspanne.
Tabelle 15. Mortalität unter Vögeln während der Wachstumsphase für den Versuch an Ort Nr. 2.
Die Unterschied von 0,6% bei der Mortalität zwischen den behandelten und den Kontrollvögeln in der ersten Woche liegt im erwarteten Abweichungsbereich, der bei frisch geschlüpften Küken beobachtet wird. Es gab keinen Unterschied hinsichtlich der Anzahl an Mortalitäts-Kopfzählungen nach der ersten Woche bis zum Ende des Versuchs. Dieser Unterschied in der Mortalität der ersten Woche wurde in zwei der drei Versuche, die mit dem Vakzinenprodukt durchgeführt wurden, nicht beobachtet. Faktoren, die das Überleben von frisch geschlüpften Küken beeinflussen können, können Unterschiede des Alters der Legehennen, die Qualität der Legehennen- und Gelegeaufsicht und die verlängerte Aussetzung bei einer Temperatur unter 85°F einschließen. Überlebensprozentsätze für 40-42 Tage alte Vögel, die vorher auf dieser Testfarm im Laufe desselben Jahres, in dem auch der Versuch stattfand, gezüchtet wurden, lagen im Bereich von 94,7 bis 97,5. Der Überlebensprozentsatz für die Kontroll- und behandelten Vögel fiel mit 96,3 bzw. 95,7% in diesen Bereich.
3. Ausschlussbericht des FSIS-Prüfers bei der Verarbeitung
Der Ausschlussbericht des Prüfers des US-Landwirtschaftsministeriums ist in Tabelle 16 dargestellt. Die Daten für den mittleren Prozentsatz für dieselbe Region des Landes für Ort Nr. 2 wurden aus dem Magazin Poultry Informed Professional (Februar 1998) erhalten. In diesem Versuch wurde kein Unterschied hinsichtlich der Anzahl an Vögeln, die in der Kontroll- und der behandelten Gruppe ausgeschlossen wurden, beobachtet.
Tabelle 16. Prozent an Ausschussfällen im Versuch an Ort Nr. 2.
4. Bewertung des Tierkörpergewichts bei der Verarbeitung.
Das mittlere Gewicht der Vögel während neun Wachstumszyklen an Ort Nr. 2 lag im Bereich von 3,35 bis 3,93 Pfund; die behandelten Vögel lagen mit ihrem Gewicht in diesem Bereich und wiesen ein mittleres Gewicht von 3,7 Pfund nach 42 Lebenstagen auf. Bei der Verarbeitung lag das Gewicht der Vögel aus dem behandelten Haus 6,1% unter dem mittleren Gewicht der Kontrollvögel. Das Gewicht der behandelten Vögeln kann jedoch nicht mit dem Gewicht der Kontrollvögel verglichen werden, da erkannt werden musste, dass während der vierten Woche des Versuchs zwei der vier Wasserversorgungslinien im Behandlungshaus blockiert waren. Laut Zuchtleiter kann dieser Gewichtsunterschied teilweise oder vollständig diesem Problem zuzuschreiben sein.
5. Bewertung der Tierkörperspüllösungen
Tabelle 17 zeigt Salmonella-positive Proben, die von Tierkörperspüllösungen aus der Behandlungsgruppe stammen. In keiner der 100 Spüllösungsproben aus beiden Gruppen wurden Vakzinenorganismen oder Salmonella sp. vom Wildtyp identifiziert.
Tabelle 17. Bewertung der Tierkörperspüllösungen von Ort Nr. 2.
Versuch an Ort Nr. 3:
1. Analysen von Ausgangsproben
Analysen von gesammelten Ausgangsproben zeigten, dass die Streu-Abzugsabstriche, die aus dem Kontrollhaus stammen, Organismen enthielten, von denen angenommen wird, dass sie von einem O-Antigen Gruppe C₃ stammen, wobei jedoch kein reines Isolat gewonnen werden konnte. Die Küken aus zwei Gelegescharen waren kulturnegativ bezüglich lokaler Salmonella spp. Aus keinem der Häuser konnte im Laufe der restlichen 64 Tage Wachstumsphase des Versuchs eine andere Salmonella spp. oder ein anderer Vakzinenorganismus aus Futter, Wasser oder von den Abzugsabstrichen von der Streu identifiziert werden.
2. Lebensfähigkeit
Daten zur Lebensfähigkeit wurden wöchentlich aus jedem Haus gesammelt. Tabelle 18 zeigt die Mortalitätsdaten, die während der Wachstumsphase des Versuchs gesammelt wurden.
Tabelle 18. Vogelmortalität während der Wachstumsphase aus Versuch an Ort Nr. 3.
Es gilt zu beachten, dass ein Unterschied in der Mortalität zwischen Kontroll- und behandelten Gruppen nur auf eine Abweichung von fünf Vögeln zurückzuführen ist. Die Vermutung der Erfinder ist, dass eine Standardabweichung wegen der signifikanten Anzahl an Fehlern vorhanden sein müsste, die in den täglichen Mortalitätslisten gefunden wurden. Unter Berücksichtigung dieser Unsicherheit der tatsächlichen Kopfzählungen könnte man von einer Fehlergrenze von nur 0,03% ausgehen, die einen signifikanten Beitrag zu den letztendlichen statistischen Unterschieden beitragen würde. Wurden jedoch die Überlebenswerte am Ende des Versuchs mit den Wachstumszyklen der vorangehenden sechs Monate des Versuchsjahres verglichen, so lagen die Prozentsätze im Bereich von 90 bis 95. Die Prozentsätze zur Lebensfähigkeit der Kontroll- und behandelten Vögel aus diesem Versuch betrugen 93,2 bzw. 92,7 und fielen somit in diesen Bereich.
3. Ausschlussbericht des FSIS-Prüfers bei der Verarbeitung.
Die Ausschlussdaten für die Tierkörper der zwei behandelten Gruppen von Ort Nr. 3 wurden vom Prüfer des US-Landwirtschaftsministeriums versehentlich zusammengefasst. Der Ausschlussbericht des Prüfers für beide Häuser ist in Tabelle 19 dargestellt. Die mittleren Werte für die Region einschließlich Ort Nr. 3 beziehen sich auf ein 6 Wochen altes Gelege für dieselbe Zeitspanne wie der Versuch (The Poultry Informed Professional, April 1998). Die Ausschlussraten für den vorliegenden Versuch in den fünf in Tabelle 19 spezifizierten Kategorien sind gleich hoch wie oder niedriger als jene für die Region des Landes, in der Ort Nr. 3 angeordnet war, die für den Zeitraum von einer Woche während der Versuchsphase gemessen wurden. Die Behandlung der Vögel mit der Vakzine beeinflusste in keiner der untersuchten Kategorien die Ausschlussprozentsätze in negativer Weise.
Tabelle 19. Ausschlussprozentsätze bei der Verarbeitung an Ort Nr. 3.
4. Bewertung der Tierkörpergewichte bei der Verarbeitung.
Eine Untersuchung von drei vorangehenden Wachstumszyklen von Ort Nr. 3 zeigte, dass die Körpergewichte der Vögel in einem Bereich von 6,67 bis 7,2 Pfund lagen. Bei dieser Studie lag das mittlere Körpergewicht der Vögel bei der Verarbeitung bei 7,33 Pfund. Es gilt anzumerken, dass, wenn auch dieser Produzent im Laufe des letzten Jahres eine Abnahme der Qualität der Hühner erlebte, die er von dem Züchter erhalten hatte (wie auch bereits bezüglich der hohen Mortalität während der ersten zwei Wochen des Versuchs angemerkt), unerwartete ausgezeichnete Leistung und hohes Endgewicht der Vögel bei der Verarbeitung für diesen Versuch erzielt wurden. Diese mittleren Gewichtsdaten lassen darauf schließen, dass die Vakzine die Fähigkeit der Vögel, ein vom Produzenten erwartetes Leistungsniveau zu halten, nicht beeinflusste.
5. Bewertung der Tierkörperspülflüssigkeit
Tabelle 20 zeigt die Ergebnisse der Analysen von Tierkörperspülflüssigkeitsproben für jede Gruppe. Weder die modifizierten Lebend-S.-typhimurium-Organismen noch irgendeine lokale Salmonella sp. wurden aus den 50 Tierkörperspülflüssigkeitsproben des behandelten Hauses gewonnen. 12% der Spülflüssigkeitsproben von den 50 Tierkörpern aus der Kontrollgruppe waren jedoch PCR- und kulturpositiv für S. heidelberg und S. hadar.
Tabelle 20. Bewertung der Tierkörperspülflüssigkeiten von Ort Nr. 3.
Schtussfolgerungen:
Sprühimpfung mit der S.-typhimurium-Lebendvakzine, χ3985, Produkt-Code 19C1.01, wurde für die Verwendung an kommerziellen gezüchteten Hühnern als sicher beurteilt. Die Vögel hielten, nachdem sie dem Vakzinenprodukt ausgesetzt worden waren, vom Produzenten erwartete Gesundheits- und Leistungsniveaus. Die unmittelbare Testumgebung war frei von Vakzinenresten. Die Vakzine wurde als wirksam erkannt, da in zwei von drei Versuchen durch ihre Verwendung im Vergleich zu den Kontrollgruppen eine völlige Elimination lokaler Salmonella sp. von den Tierkörpern aus der behandelten Gruppe erreicht werden konnte. Diese Ergebnisse bestätigen, dass die Vakzine in den Versuchen, die in Zusammenarbeit mit drei kommerziellen Hühnerzuchtbetrieben durchgeführt wurden, sowohl als sicher als auch als wirksam bewertet werden konnte.
Alle in dieser Beschreibung zitierten Verweise sind hierin durch Verweis aufgenommen. Die Besprechung der hierin zitierten Verweise dient lediglich einer Zusammenfassung der Behauptungen der Autoren, es wird nicht eingeräumt, dass einer dieser Verweistexte Teil des Standes der Technik darstellt. Die Anmelder behalten sich das Recht vor, die Exaktheit und Sachdienlichkeit der zitierten Verweise in Frage zu stellen.
Angesichts der obigen Beschreibung kann erkannt werden, dass anhand der Erfindung mehrere Vorteile und vorteilhafte Ergebnisse erzielt werden können.
Da verschiedene Änderungen an den zuvor beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen gemacht werden können, ohne den Schutzumfang der Erfindung zu überschreiten, gilt der gesamte Inhalt der obigen Beschreibung und der beiliegenden Zeichnungen als Veranschaulichung und nicht als Einschränkung verstanden zu werden.

Claims

Verwendung eines lebenden avirulenten Derivats einer enteropathogenen Bakterie bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung als Vakzine für Hausvögel, wobei die Vakzine in Form eines Ganzkörpersprays verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die enteropathogene Bakterie eine Salmonelle ist.
Verwendung nach Anspruch 2, worin der Spray in einer Dosis von etwa 10⁵ bis etwa 10⁸ koloniebildenden Einheiten des lebenden avirulenten Derivats einer pathogenen Bakterie verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 3, worin die Salmonelle S. typhimurium ist.
Verwendung nach Anspruch 4, worin die S. typhimurium χ3985 ist.
Verwendung nach Anspruch 3, worin der Vogel 3 Wochen alt oder jünger ist.
Verwendung nach Anspruch 6, worin der Vogel jünger als einen Tag ist.
Verwendung nach Anspruch 7, worin der Vogel ein Huhn ist.
Verwendung nach Anspruch 7, worin auf die Verabreichung mittels Spray die Verabreichung zumindest einer Auffrischungsdosis der Vakzine folgt.
Verwendung nach Anspruch 9, worin die Auffrischungsdosis der Vakzine im Trinkwasser verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 10, worin eine Auffrischungsdosis 14 Tage nach der Verabreichung mittels Spray verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 1, worin der Spray ein grober Spray aus Tröpfchen mit einem Durchmesser im Bereich von 50 μm bis 150 μm ist.
Verwendung eines lebenden avirulenten Derivats einer enteropathogenen Bakterie bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung als Vakzine für Geflügel, wobei die Vakzine in Form eines Ganzkörpersprays verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 13, worin die enteropathogene Bakterie eine Salmonelle ist.
Verwendung nach Anspruch 14, worin der Spray in einer Dosis von etwa 10⁵ bis etwa 10⁸ koloniebildenden Einheiten des lebenden avirulenten Derivats einer pathogenen Bakterie verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 15, worin die Salmonelle S. typhimurium ist.
Verwendung nach Anspruch 16, worin die S. typhimurium χ3985 ist.
Verwendung nach Anspruch 16, worin das Geflügel weniger als 104 Wochen als ist.
Verwendung nach Anspruch 16, worin das Geflügel 3 Wochen alt oder jünger ist.
Verwendung nach Anspruch 19, worin das Geflügel jünger als einen Tag ist.
Verwendung nach Anspruch 20, worin das Geflügel Hühner sind.
Verwendung nach Anspruch 18, worin auf die Verabreichung mittels Spray die Verabreichung zumindest einer Auffrischungsdosis der Vakzine im Trinkwasser folgt.
Verwendung nach Anspruch 22, worin eine Auffrischungsdosis 14 Tage nach der Verabreichung mittels Spray verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 13, worin die Verabreichung mittels Spray Sprühtröpfchen mit einem Durchmesser im Bereich von 50 μm bis 150 μm umfasst.
Verwendung eines lebenden avirulenten Derivats einer enteropathogenen Bakterie, wobei die Bakterie ein rekombinantes Gen umfasst, das für die Expression eines Proteins kodiert, bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung als Abgabesystem für das Protein an einen Hausvogel, wobei das Derivat in Form eines Ganzkörpersprays verabreicht wird.