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DE69921329T2 - Anti-l7/l12-antikörper zum nachweis von bakterien - Google Patents

Anti-l7/l12-antikörper zum nachweis von bakterien Download PDF

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DE69921329T2
DE69921329T2 DE69921329T DE69921329T DE69921329T2 DE 69921329 T2 DE69921329 T2 DE 69921329T2 DE 69921329 T DE69921329 T DE 69921329T DE 69921329 T DE69921329 T DE 69921329T DE 69921329 T2 DE69921329 T2 DE 69921329T2
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DE
Germany
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antibody
bacteria
ribosomal protein
added
protein
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DE69921329T
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DE69921329D1 (de
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Kenji Matsuyama
Takashi Sunto-gun SHIRAI
Takashi Fuji-shi ETOH
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Asahi Kasei Corp
Asahi Kasei Chemicals Corp
Asahi Chemical Industry Co Ltd
Original Assignee
Asahi Kasei Corp
Asahi Kasei Chemicals Corp
Asahi Chemical Industry Co Ltd
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Publication date
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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörper, die nützlich beim Nachweis von verschiedenen Bakterien sind und ein Verfahren zum Nachweis von Bakterien, Kits von Reagenzien zum Nachweis von Bakterien, die die Antikörper verwenden, und ein Verfahren zur Herstellung von spezifischen Antikörpern zum Nachweis von Bakterien.
  • Außerdem ist die vorliegende Erfindung wertvoll für die Arzneimittelindustrie, insbesondere für die diagnostische Medizin von bakteriellen Infektionen.
  • Stand der Technik
  • Die Diagnose mikrobieller Infektion wird durch Nachweis des verursachenden Pathogens aus dem infizierten Bereich oder durch Nachweis von Antikörpern gegen das verursachende Pathogen im Serum und Körperflüssigkeiten bestätigt. Der Nachweis des verursachenden Pathogens ist besonders wichtig in dem Sinne, dass es die schnelle Behandlung des Patienten ermöglicht.
  • Der Nachweis des verursachenden Pathogens von Infektionen kann im allgemeinen als Kultivierungs- und Identifizierungsverfahren klassifiziert werden, wobei das verursachende Pathogen abgetrennt und kultiviert wird und dann aufgrund seiner biochemischen Eigenschaften identifiziert wird; genetische Diagnose, wobei Amplifikation durch PCR, basierend auf spezifischen Genen des verursachenden Pathogens durchgeführt und somit das verursachende Pathogen nachgewiesen wird; oder immunologischen Verfah ren, wobei das verursachende Pathogen durch Verwendung einer spezifischen Reaktion eines Antikörpers mit Oberflächen-Antigenmarker des verursachenden Pathogens nachgewiesen wird. Jedoch benötigt es Zeit, um Ergebnisse durch Kultivierungs- und Identifizierungsverfahren oder genetische Diagnoseverfahren zu erhalten. Deshalb wird die Diagnose durch immunologische Verfahren allgemein verwendet, weil das verursachende Pathogen innerhalb einer kurzen Zeit mit hoher Empfindlichkeit nachgewiesen werden kann und der Patient schnell und geeignet behandelt werden kann.
  • Abhängig von der bakteriellen Spezies können eine Vielzahl von Markerantigenen und Antikörpern alleine oder in Kombination verwendet werden, um das verursachende Pathogen von Infektionen durch herkömmliche immunologische Verfahren nachzuweisen.
  • Zum Beispiel ist es bekannt, dass Lipopolysaccharid (LPS), welches ein Genus-spezifisches Antigen von Chlamydia ist, als eine Antigen-Determinante anwesend ist (Stephens, R., et al.: J. Immunol., 128:1083-89, 1982, Caldwell, M.D.: Inf. Immun., 44:306-14, 1984) und Antikörper gegen LPS werden als Nachweis-Antikörper in einer Vielzahl von diagnostischen Kits, insbesondere für den Nachweis von Chlamydia trachomatis verwendet.
  • Des Weiteren haben Ellena M. Peterson et al., (Infection and Immunity, 59(11), 4147-4153, 1991) und Byron E. Batteiger et al., (Infection and Immunity, 53(3), 530-533, 1986) über monoklonale Antikörper gegen Major Outer Membrane Protein (MOMP) des Genus Chlamydia berichtet.
  • Die Veröffentlichung der ungeprüften japanischen Patentanmeldung Nr. 298/1988 diskutiert ein Immunnachweisverfahren, das auf einem Western-Blot-Verfahren basiert, welches einen monoklonalen Antikörper gegen ein etwa 43 Kilodalton Membranprotein-Antigen von Mycoplasma pneumoniae verwendet.
  • Des Weiteren werden ein Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen Haemophilus influenzae und ein diagnostisches Verfahren, das den Antikörper verwendet, in der Veröffentlichung der ungeprüften japanischen Patentanmeldung Nr. 148859/1987 (Japanisches Patent Nr. 64065/1994) vorgestellt.
  • Proteine von etwa 20 Kilodalton, isoliert aus dem Natriumcholatextrakt des äußeren Membranvesikels von Neisseria gonorrhoeae Stamm BS4 (NCTC 11922), sind beschrieben und die Herstellung von Hybridomen unter Verwendung der genannten Substanz ist in der Britischen Patentanmeldung Nr. 2,172,704 offenbart. Des Weiteren beschreibt das Europäische Patentdokument Nr. EP 419238 A1 die Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, welcher an ein Protein von etwa 14 Kilodalton, hergestellt durch Verwendung von Neisseria gonorrhoeae als ein Immunogen, binden kann, und ein Verfahren zur Herstellung solch eines monoklonalen Antikörpers. Zusätzlich wird ein Verfahren zum Nachweis desselben Neisseria gonorrhoeae unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen Lipopolysaccharid (LPS) in der Kanadischen Patentanmeldung Nr. 1,220,147 erwähnt.
  • Jedoch gibt es mit den Antikörpern und Nachweisverfahren, basierend auf diesen Antikörpern, dadurch Probleme, dass die Spezifität für eine Spezies von Mikroorganismen für eine geeignete Diagnose unzureichend ist. Die Antikörper weisen nicht alle Serumtypen nach, da mehrere Oberflächenantigene in einer Spezies anwesend sind.
  • Markerantigene, die in diesem Stand der Technik verwendet werden, sind nicht standardisiert, so dass Mikroorganismen unter Verwendung eines gleichen funktionalen Moleküls (z.B. Protein, LPS oder Oberflächenpolysaccharid-Verbindung mit der gleichen Funktion), welches im allgemeinen in Zellen von verschiedenen Mikroorganismen anwesend ist und welches sich im Verlauf der Evolution der Mikroorganismen als ein Marker verändert, nachgewiesen werden können und ein immundiagnostisches Verfahren, welches auf dem Konzept des Nachweises des Unterschiedes bei der Antigenität zwischen bakteriellen Spezies unter Verwendung eines Moleküls als ein Standard basiert, ist nicht bekannt.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Im Kontext dieser Anmeldung soll der Begriff "Mikroorganismus/en" gleich verstanden werden wie der Begriff "Bakterium/en".
  • Die vorliegende Erfindung ist bestrebt, Antikörper gegen das gleiche Molekül für verschiedene Mikroorganismen als ein Standardmarker-Antigen zu offenbaren, um einen idealen Nachweis für Mikroorganismen und eine Immundiagnose zu ermöglichen, insbesondere Antikörper gegen den molekularen Abschnitt in dem gleichen intrazellulären funktionalen Molekülbestandteil für alle Mikroorganismen, die nachgewiesen werden sollen, welches sich im Lauf der Evolution der Mikroorganismen verändert, ein Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen, welches spezifisch für eine Spezies ist und nahezu alle Serumtypen abdecken kann, ein Kit von Reagenzien zum Nachweis von Mikroorganismen, welches den genannten Antikörper verwendet, und ein Verfahren zur Herstellung eines spezifischen Antikörpers, der zum Nachweis von Mikroorganismen verwendet wird.
  • Die gegenwärtigen Erfinder entdeckten ein Protein mit der gleichen Funktion, welches in allen Mikroorganismen als ein nützliches Antigenprotein konserviert ist. Normalerweise wird erwar tet, dass eine strukturelle Änderung eines solchen Proteins extrem gering ist. Jedoch wurde überraschenderweise gefunden, dass das (die) Antigenepitop(e) dieses Proteins eine Spezifität für bestimmte Spezies oder Gattung von Mikroorganismen hat, und dass der Antikörper für dieses Protein nicht nur Potential hat, um zur spezifischen Identifizierung von Spezies oder Gattung von Mikroorganismen verwendet zu werden, sondern auch in der Lage ist, alle Serotypen der Zielmikroorganismen nachzuweisen.
  • Die Erfinder konzentrierten sich auf auf intrazelluläre Moleküle, die in allen mikrobiellen Zellen vorhanden sind und sich zwischen Mikroorganismen hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenz unterscheiden, insbesondere ribosomales Protein L7/L12, welches ein Mitglied von ribosomalen Proteinen ist. Ribosomales Protein L7/L12 ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 13 Kilodalton und ist bekannt, als ein ribosomales Protein zu existieren, welches bei der Proteinsynthese wesentlich ist. Fortschritt wurde beim Verstehen der vollständigen Aminosäuresequenz des Proteins aus einigen Mikroorganismen, umfassend insbesondere Escherichia coli und Baccillus subtilus, gemacht, und 50% bis 65% Homologie der Aminosäuresequenz zwischen den Mikroorganismen wurde bestätigt.
  • Die Erfinder konzentrierten sich auf die Tatsache, dass, obwohl Ähnlichkeiten in dem genannten Molekül zwischen verschiedenen Mikroorganismen vorhanden sind, dieses Molekül auch einen strukturellen Abschnitt hat, das einzigartig für jeden Mikroorganismus ist, und entdeckten, dass es möglich ist, verschiedene Mikroorganismen mit Speziesspezifität nachzuweisen und alle Serotypen innerhalb der selben Spezies durch Verwendung eines Antikörpers gegen das Protein nachzuweisen. Als ein Ergebnis des Versuchs, eine Technologie für die Immundiagnose von Spezies von Mikroorganismen unter Verwendung eines Antikörpers, spezifisch gegen, zum Beispiel, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae und Neisseria gonorrhoeae, zu entwickeln, haben die Erfinder die vorliegende Erfindung nach der Entdeckung, dass ein gegen das genannte Protein spezifischer Antikörper für jede Spezies von Mikroorganismen erhalten werden kann, und dass ein Spezies-spezifischer Nachweis von verschiedenen Bakterien unter Verwendung des genannten Antikörpers möglich ist, vervollständigt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen Antikörper, der zum Nachweis von Bakterien verwendet wird, ein Verfahren zum Nachweis von Bakterien unter Verwendung des Antikörpers, einen Kit von Reagenzien zum Nachweis von Bakterien unter Verwendung des Antikörpers, und ein Verfahren zur Herstellung spezifischer Antikörper zum Nachweis von Bakterien.
    • 1) Antikörper, welche Antikörper gegen ribosomales Protein L7/L12 von Bakterien sind und welche spezifisch mit den Bakterien reagieren.
    • 2) Die oben in 1) beschriebenen Antikörper, wobei die Bakterien Bakterien sind, die eine geschlechtlich übertragbare Krankheit (STD) verursachen.
    • 3) Die oben in 1) beschriebenen Antikörper, wobei die Bakterien Bakterien sind, die eine Infektion der Atemwege verursachen.
    • 4) Der oben in 3) beschriebene Antikörper, wobei die Bakterien, die die Infektion der Atemwege verursachen, Bakterien von Haemophilus influenzae sind.
    • 5) Der oben in 3) beschriebene Antikörper, wobei die Bakterien, die die Infektion der Atemwege verursachen, Bakterien von Streptococcus pneumoniae sind.
    • 6) Der oben in 3) beschriebene Antikörper, wobei die Bakterien, die die Infektion der Atemwege verursachen, Bakterien von Chlamydia pneumoniae sind.
    • 7) Der oben in 3) beschriebene Antikörper, wobei die Bakterien, die die Infektion der Atemwege verursachen, Bakterien von Mycoplasma pneumoniae sind.
    • 8) Der oben in 2) beschriebene Antikörper, wobei die Bakterien, die die geschlechtlich übertragbaren Krankheiten (STD) verursachen, Bakterien von Neisseria gonorrhoeae sind.
    • 9) Der oben in 8) beschriebene Antikörper, welcher der Antikörper gegen ribosomales Protein L7/L12 von Neisseria gonorrhoeae ist und welcher eine zusammenhängende Aminosäuresequenz-Einheit aus 5 bis 30 Aminosäuren erkennt, die das 115. Alanin in der Aminosäuresequenz von Sequenz ID No. 22 der Sequenzliste enthält.
    • 10) Verfahren zum Nachweis von Bakterien, welches durch die Tatsache gekennzeichnet ist, dass irgendein oben in 1) bis 9) beschriebener Antikörper verwendet wird.
    • 11) Kit von Reagenzien zum Nachweis von Mikroorganismen, welcher durch die Tatsache gekennzeichnet ist, dass irgendein oben in 1) bis 9) beschriebener Antikörper verwendet wird.
    • 13) Verfahren zur Herstellung irgendeines in 1) bis 9) oben beschriebenen Antikörpers, gekennzeichnet durch die Tatsache, dass das ribosomale Protein L7/L12 von Mikroorganismen, erhalten durch ein Genmanipulationsverfahren oder durch Isolierung aus Mikroorganismen, eine Peptideinheit davon, oder ein synthetisiertes Peptid, das der Peptideinheit entspricht, als ein Immunogen verwendet wird.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun im Detail beschrieben.
  • Sequenzen No. 1 und No. 2 in der Sequenztabelle sind die DNA-Sequenz des Gens des ribosomalen Proteins L7/L12 von Haemophilus influenzae und der korrespondierenden Aminosäuresequenz. Sequenzen No. 3 und No. 4 sind die DNA-Sequenz des Gens des ribosomalen Protein L7/L12 von Heliobacter pylori und die korrespondierende Aminosäuresequenz. Sequenzen No. 5 und 6 zeigen die DNA-Sequenz des Gens und die korrespondierende Aminosäuresequenz des ribosomalen Proteins L7/L12 von Streptococcus pneumoniae. Sequenzen No. 7 und No. 8 zeigen die DNA-Sequenz des Gens und die korrespondierende Aminosäuresequenz des ribosomalen Proteins L7/L12 von Neisseria gonorrhoeae. Sequenzen No. 9 und No. 10 zeigen die DNA-Sequenz des Gens und die korrespondierende Aminosäuresequenz des ribosomalen Proteins L7/L12 von Neisseria meningitidis. Sequenz No. 11 und Sequenz No. 12 in der Sequenztabelle sind die Primer-DNA für PCR, die verwendet werden, um das Gen des ribosomalen Proteins L7/L12 aus Haemophilus influenzae zu erhalten. Sequenzen No. 13 und No. 14 in der Sequenztabelle sind die Primer-DNA für PCR, die verwendet werden, um das Gen des ribosomalen Proteins L7/L12 aus Streptococcus pneumoniae zu erhalten. Sequenzen No. 15 und No. 16 in der Sequenztabelle sind die Primer-DNA für PCR, die verwendet werden, um das Gen des ribosomalen Proteins L7/L12 aus Neisseria gonorrhoeae zu erhalten. Sequenzen No. 17 und No. 18 zeigen die DNA-Sequenz des Gens und die korrespondierende Aminosäuresequenz des ribosomalen Proteins L7/L12 von Haemophilus influenzae. Sequenzen No. 19 und No. 20 zeigen die DNA-Sequenz des Gens und die korrespondierende Aminosäuresequenz des ribosomalen Proteins L7/L12 von Streptococcus pneumoniae. Sequenzen No. 21 und No. 22 zeigen die DNA-Sequenz des Gens und die korrespondierende Aminosäuresequenz des ribosomalen Proteins L7/L12 von Neisseria gonorrhoeae.
  • Des Weiteren sind die linken und rechten Termini der Rminosäuresequenzen, die in die Sequenztabelle eingetragen sind, Aminogruppen (unten als N-Terminus bezeichnet) bzw. Carboxylgruppen-Termini (unten als C-Terminus bezeichnet) und der linke Terminus und rechte Terminus der Basensequenz ist der 5'-Terminus bzw. der 3'-Terminus.
  • Außerdem können die Serien von biomolekularen Experimenten der Genherstellung, die in diesem Text erwähnt werden, durch Verfahren durchgeführt werden, die in experimentelle Standardhandbücher eingegangen sind. "Molecular cloning: A laboratory manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, J. et al. (1989), ist ein Beispiel für das vorhergenannte experimentelle Standardhandbuch.
  • Der Ausdruck Mikroorganismen in der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf alle Spezies von Bakterien, insbesondere solchen Bakterien, die ein Problem hinsichtlich der Diagnose von mikrobiellen Infektionen darstellen.
  • Der Ausdruck "Antikörper, der spezifisch mit Mikroorganismen reagiert", wie er in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bedeutet einen Antikörper, welcher spezifisch mit einer Spezies oder Gruppe von Mikroorganismen reagiert. Ein Antikörper, der spezifisch mit einer Spezies von Mikroorganismen reagiert, ist insbesondere für die Diagnose von mikrobiellen Infektionskrankheiten nützlich.
  • In der vorliegenden Erfindung umfassen die Mikroorganismen, die STD (geschlechtlich übertragbaren Krankheiten) verursachen, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Candida albicans, Treponema pallidum und Ureaplasma urealyticum, sind aber nicht auf diese beschränkt.
  • In der vorliegenden Erfindung umfassen die Mikroorganismen, die Infektionen der Atemwege verursachen, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus sp. Gruppe A, Mycobacterium tuberculosis, Legionella pneumophila und Aspergillus spp., sind aber nicht auf diese beschränkt.
  • Der Ausdruck Antikörper bedeutet in der vorliegenden Erfindung einen polyklonalen Antikörper oder monoklonalen Antikörper, der unter Verwendung des vollständigen oder nur eines Teilpeptids des ribosomalen Proteins hergestellt werden kann. Obwohl es keine speziellen Beschränkungen für die Peptidlänge für die Herstellung des Antikörpers gibt, sollte der Abschnitt von der Länge sein, die das ribosomale Protein L7/L12 charakterisiert, und ein Peptid von 5 Aminosäuren oder länger, insbesondere 8 Aminosäuren oder länger, ist bevorzugt. Antikörper (polyklonale Antikörper) enthaltendes Antiserum, welches ribosomales Protein L7/L12 identifiziert, kann erhalten werden durch Impfung von Labortieren mit Zusatzstoff und einem Peptid, oder dem Protein mit voller Länge wie es ist, oder, wenn nötig, nachdem es mit einem Trägerprotein, wie z.B. KLH (keyhole-limpet hemocyanin) und BSA (Rinderserumalbumin), kreuzvernetzt wurde und Rückgewinnung des Serums. Außerdem kann der Antikörper verwendet werden, nachdem er aus dem Antiserum gereinigt wurde. Die Labortiere, die geimpft werden, umfassen Schafe, Pferde, Ziegen, Kaninchen, Mäuse, Ratten usw. und Schafe, Kaninchen usw. sind besonders bevorzugt für die Herstellung von polyklonalem Antikörper. Außerdem kann ein monoklonaler Antikörper auch durch konventionelle Verfahren der Herstellung von Hybridomazellen erhalten werden, aber Mäuse sind in diesem Fall bevorzugt. Die Gesamtlänge des Proteins oder seines Teilpeptids, bestehend aus 5 oder mehr Aminosäureresten, bevorzugt 8 oder mehr Reste, welches mit GST (Glutathion S-Transferase), usw. fusioniert wurde, kann gereinigt werden und als Antigen verwendet werden, oder es kann als Antigen verwendet werden, ohne gereinigt worden zu sein. Der Antikörper kann auch der genetisch rekombinante Antikörper sein, der zellulär exprimiert wird unter Verwendung von Immunoglobulingenen, die durch eine Vielfalt von Methoden aus Handbüchern separiert wurden ("Antibodies: A Laboratory manual," E. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Klonierungsmethoden, usw..
  • Antikörper gegen das ribosomale Protein L7/L12, das als Markerantigen der vorliegenden Erfindung angewendet werden kann, kann durch die folgenden drei Verfahren erhalten werden, wie auch mit anderen, ähnlichen Verfahren. Die Verfahren sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
    • a) Der gewünschte Antikörper kann für Mikroorganismen mit einer bekannten genetischen Sequenz und Aminosäuresequenz von ribosomalem Protein L7/12 durch Synthese eines Peptidfragments, bestehend aus 5 bis 30 Aminosäuren, erhalten werden unter Verwendung des Bereichs mit der geringsten Ähnlichkeit zu der Aminosäuresequenz des Proteins von anderen Mikroorganismen und Herstellung eines polyklonalen Antikörpers oder monoklonalen Antikörpers unter Verwendung dieses Peptidfragments als Immunogen. Außerdem ist es möglich, die gesamte Sequenz des genannten Gens unter Verwendung eines herkömmlichen genetischen Verfahrens zu erhalten, wie zum Beispiel Genamplifikation durch PCR mit der DNA-Sequenz an beiden Termini der genannten bekannten genetischen Sequenz als Sonde oder Hybridisierung unter Verwendung der Sequenz eines homologen Abschnitts als Templatsonde. Dann wird ein fusioniertes Gen mit einem Gen eines anderen Proteins konstruiert und das fusionierte Gen in den Wirt durch herkömmliche Geninsertionsverfahren unter Verwendung von Escherichia coli usw. als Wirt eingefügt und in großen Mengen exprimiert. Das gewünschte Proteinantigen kann dann durch Reinigung des exprimierten Proteins durch Affinitätssäulenverfahren mit Antikörper gegen das Protein, welches als Fusionsprotein verwendet wurde, erhalten werden. In solch einem Fall, sogar wenn Antikörper gegen den Aminosäureabschnitt, der in Mikroorganismen konserviert ist, erhalten werden, stimmt dies nicht mit dem Zweck der vorliegenden Erfindung überein, da die volle Länge des ribosomalen Proteins L7/L12 das Antigen wird. Folglich wird ein Hybridom, das monoklonale Antikörper gegen das Antigen, welches durch dieses Verfahren erhalten wurde, produziert, durch herkömmliche Verfahren erhalten und der gewünschte Antikörper kann durch Auswahl eines Klons, der Antikörper produziert, die nur mit den gewünschten Mikroorganismen reagieren, erhalten werden.
    • b) Erstens, da es eine 50 bis 60%-ige Homologie zwischen bakteriellen Spezies bezüglich ihrer Aminosäuresequenz des ribosomalen Proteins L7/L12 gibt, ist es möglich, die Proteingene für Mikroorganismen mit unbekannter L7/L12-Aminosäuresequenz durch herkömmliche genetische Verfahren einfach zu erhalten, wie zum Beispiel Genamplifikation eines spezifischen Sequenzabschnitts durch PCR-Verfahren basierend auf der Sequenz des homologen Abschnitts der Aminosäuresequenz oder Hybridisierung mit den homo logen Abschnitten als Templatsonde unter Verwendung von Bakterien mit einer bekannten Aminosäuresequenz des ribosomalen Proteins L7/L12. Dann wird ein fusioniertes Gen mit einem Gen eines anderen Proteins konstruiert und das fusionierte Gen in den Wirt durch herkömmliche Geninsertionsverfahren unter Verwendung von Escherichia coli usw. als Wirt insertiert und in großen Mengen exprimiert. Das gewünschte Proteinantigen kann dann durch Reinigung des exprimierten Proteins durch Affinitätssäulenverfahren mit Antikörper gegen das Protein, das als Fusionsprotein verwendet wurde, erhalten werden. In solch einem Fall, sogar wenn der Antikörper gegen den innerhalb von Mikroorganismen konservierten Aminosäureabschnitt erhalten wird, stimmt dies nicht mit dem Zweck der vorliegenden Erfindung überein, da die Gesamtlänge des ribosomalen Proteins L7/L12 das Antigen wird. Folglich wird das Hybridoma, welches monoklonale Antikörper gegen das Antigen produziert, das bei diesem Verfahren erhalten wurde, durch herkömmliche Verfahren erhalten und der gewünschte Antikörper kann durch Auswahl eines Klons, der Antikörper produziert, die nur mit den gewünschten Mikroorganismen reagieren, erhalten werden.
    • c) Ribosomales Protein L7/L12, das auf eine hohe Reinheit gereinigt wurde, kann auch durch eine weitere Methode erhalten werden, in dem Fall, in dem die Aminosäuresequenz des ribosomalen Proteins L7/L12 unbekannt ist, wobei ein Peptid aus 5 bis 30 Aminosäuren, welches zu dem gemeinsamen Sequenzabschnitt korrespondiert, welches in den Mikroorganismen bewahrt wird, aus der bekannten Aminosäuresequenz des ribosomalen Proteins L7/L12 synthetisiert wird, und polyklonaler Antikörper oder monoklonaler Antikörper gegen diese Peptidsequenz durch herkömmliche Methoden gemacht wird. Dann wird das hochgereinigte ribosomale Protein L7/L12 von aufgeschlossenen Mikroorganismen durch Affinitätssäu lenchromatographie unter Verwendung des genannten Antikörpers erhalten.
  • Wenn die Reinheit des Proteins unzureichend ist, kann es durch herkömmliche Methoden gereinigt werden, wie zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Chromatographie, Gelfiltration usw., nach welchen die eluierte Fraktion des ribosomalen Proteins L7/L12 durch Western-Blotting usw. identifiziert wird, unter Verwendung des Antikörpers, der gemacht wurde, um die reine Fraktion zu erhalten. Der gewünschte Antikörper kann durch Erhalten von Hybridoma oder polyklonalem Antikörper durch herkömmliche Verfahren erhalten werden, unter Verwendung des Antigens des reinen ribosomalen Proteins L7/L12, das erhalten wurde, und Auswahl von Hybridoma oder polyklonalem Antikörper, der wie in b)spezifisch mit dem gewünschten Bakterium reagieren wird.
  • Der Antikörper der vorliegenden Erfindung, der spezifisch für eine Vielzahl von Mikroorganismen ist und durch die Verfahren in a) bis c), usw., erhalten wurde, kann in einer Vielzahl von Immunoassayverfahren verwendet werden, um diagnostische Kits von Reagenz zu erhalten, welche spezifisch für eine Vielzahl von Mikroorganismen sind. Zum Beispiel kann dieser Antikörper bei Aggregationsreaktionen verwendet werden, wobei der Antikörper auf Polystyrol-Latexpartikeln adsorbiert ist, ELISA, welches eine herkömmliche Technologie ist, die auf einer Mikrotiterplatte durchgeführt wird, herkömmliche Immunochromatographie-Verfahren, Sandwich-Assay, wobei der Antikörper mit farbigen Partikeln oder Partikeln, die die Fähigkeit zur Färbung haben, oder mit Enzym oder Phosphor markiert wird, und magnetische Mikropartikel, die mit einem Abfang-Antikörper beschichtet sind, usw., werden verwendet, usw.
  • Der Ausdruck Nachweisverfahren für Mikroorganismen unter Verwendung von Antikörper bedeutet Nachweisverfahren, die herkömmliche Immunoassays verwenden, wie zum Beispiel Aggregationsreaktionen, wobei der Antikörper auf Polystyrol-Latexpartikeln adsorbiert ist, ELISA, welches eine herkömmliche Technologie ist, die auf einer Mikrotiterplatte durchgeführt wird, herkömmliche Immunochromatographieverfahren, Sandwich-Assay, wobei der Antikörper mit farbigen Partikeln oder Partikeln, die die Fähigkeit zur Färbung haben, oder mit Enzym oder Phosphor markiert wird, und magnetische Mikropartikel, die mit Abfang-Antikörpern beschichtet sind, usw. werden verwendet, usw.
  • Des Weiteren ist die optische Immunoassay(OIA)-Technologie, die in der Internationalen Patentanmeldung, Japanische Offenlegungsschrift (Toku-Hyou) No. 509565/1995, beschrieben ist, bei welcher Mikroorganismen durch eine optische Interferenz nachgewiesen werden, die durch eine Antikörperreaktion auf dem optischen dünnen Film, der durch Silicon oder Siliziumnitrid gebildet wird, induziert wird, eine nützliche Nachweismethode unter Verwendung eines Antikörpers.
  • Des Weiteren kann eine Behandlung mit einem Extraktionsreagens, das eine Vielzahl von Surfactanten verwendet, beginnend mit Triton X-100 und Tween-20, Enzymbehandlung mit einem geeigneten Enzym, wie zum Beispiel Protease, usw., bekannten Verfahren, bei denen die Zellstruktur zerstört wird, beginnend mit dem Aufschließen des Mikroorganismus durch physikalische Methoden, können verwendet werden, um das intrazelluläre Markerantigen aus dem benötigten Mikroorganismus in dem genannten Nachweisverfahren zu extrahieren. Jedoch ist es bevorzugt, dass die Extraktionsbedingungen unter Verwendung einer Kombination von Surfactanten usw. gestaltet werden, so dass die Bedingungen für die Ex traktion von jedem Mikroorganismus mit Reagenzien optimiert werden.
  • Des Weiteren bedeutet der Ausdruck ein Kit von Reagenzien zum Nachweis von Mikroorganismen unter Verwendung eines Antikörpers ein Kit von Reagenzien, welches das genannte Nachweisverfahren benutzt.
  • Zum Beispiel im Fall des Erhaltens des spezifischen Antikörpers gegen Haemophilus influenzae, das als ein verursachendes Pathogen von Pneumonie, Bronchitis, Meningitis, usw. von extremer diagnostischer Bedeutung ist, wird die Aminosäuresequenz und DNA-Sequenz des ribosomalen Proteins L7/L12 in Datenbanken usw. eingetragen.
  • Die Aminosäure und DNA-Sequenz des ribosomalen Proteins L7/L12 von Haemophilus influenzae sind in "Sequences No. 1 und No. 2" gezeigt.
  • Folglich ist es im Fall dieses Bakteriums möglich, die Aminosäuresequenz des ribosomalen Proteins L7/L12 entsprechend mit demselben Protein von zum Beispiel Heliobacter pylori zu vergleichen, welches in "Sequence No. 3 und 4" gezeigt ist, und ein Peptid von 5 bis 30 Aminosäuren für den Abschnitt mit geringer Homologie herzustellen und unter Verwendung dieses Peptids einen polyklonalen Antikörper oder monoklonalen Antikörper zu machen, der spezifisch gegen Haemophilus influenzae ist.
  • Im Falle eines spezifischen polyklonalen Antikörpers ist es bevorzugt, dass IgG-Fraktion durch Reinigung des Antiserums von immunisierten Labortieren mit einer Protein-A-Säule, usw. erhalten wird und Affinitätsreinigung mit dem synthetischen Peptid durchgeführt wird, das bei der Immunisierung der Labortiere verwendet wurde.
  • Des Weiteren wurden PCR-Primer basierend auf den Sequenzen des N-Terminus und C-Terminus, zum Beispiel die in Sequenzen No. 11 und No. 12 in der Sequenztabelle gezeigten PCR-Primer, aus der DNA-Sequenz des ribosomalen Proteins L7/L12 von Haemophilus influenzae entworfen. Durch Anwendung der Homologie der PCR-Primer können DNA Fragmente, amplifiziert durch das PCR-Verfahren oder ähnliche unter Verwendung von genomischer DNA, die aus kultivierten Haemophilus influenzae extrahiert wird, durch ein herkömmliches Verfahren erhalten werden. Die Gesamtlänge des Gens für ribosomales Protein L7/L12 von Haemophilus influenzae kann durch die Analyse der DNA-Sequenzinformation dieser Fragmente erhalten werden.
  • Das Gen des ribosomalen Proteins L7/L12 von Haemophilus influenzae, das so gewonnen wurde, bildet ein Fusionsprotein-Gen mit zum Beispiel GST usw. und ein Expressionsvektor wird unter Verwendung des geeigneten Expressionsplasmids konstruiert, Escherichia coli wird transformiert und große Mengen des genannten Proteins können exprimiert werden. Eine geeignete Menge des transformierten Escherichia coli wird kultiviert und das zerstoßene bakterielle Fluid, das gewonnen wird, wird durch eine Affinitätssäule unter Verwendung von GST gereinigt, um das ribosomale Protein L7/L12 und GST-Fusionsprotein von Haemophilus influenzae zu erhalten. Es ist außerdem möglich, den Target-spezifischen monoklonalen Antikörper zu erhalten durch Etablierung mehrerer Hybridomen unter Verwendung des Proteins, wie es ist, oder von GST-Fragmenteinheiten, die aus dem Protein durch Protease oder ähnliche geschnitten wurden, als ein Antigenprotein und Auswahl des Antikörpers, welcher eine spezifische Antwort gegen Haemophilus influenzae-Bakterien zeigt, oder ein aufgeschlossenes Fluid der Bakterien, oder ribosomales Protein L7/L12 von Haemophilus influenzae.
  • Des Weiteren sind die Aminosäuresequenz und die DNA-Sequenz des ribosomalen Proteins L7/L12 von Streptococcus pneumoniae, das auch hoch signifikant als ein diagnostisches Agens für Infektionen der Atemwege ist, wie auch Haemophilus influenzae, von Beschreibungen in Datenbanken und ähnlichen bekannt. Die Aminosäure und DNA-Sequenzen des ribosomalen Proteins L7/L12 von Streptococcus pneumoniae sind in den Sequenzen No. 5 und No. 6 der Sequenztabelle gezeigt.
  • Es ist deshalb möglich, einen polyklonalen Antikörper oder monoklonalen Antikörper zu gewinnen, welcher spezifisch gegen Streptococcus pneumoniae ist, durch Entwerfen eines PCR-Primers, der PCR-Primer ist in Sequenz-ID No. 13 oder 14 in der Sequenztabelle gezeigt, z.B., basierend auf den Sequenzen des N-Terminus und C-Terminus der DNA-Sequenz des ribosomalen Proteins L7/L12 von Streptococcus pneumoniae, in der gleichen Weise wie im Fall von Haemophilus influenzae und anschließender Weiterverarbeitung in der gleichen Weise wie im Falle von Haemophilus influenzae.
  • Das Hybridoma AMSP-2, welches den monoklonalen Antikörper produziert, der spezifisch gegen Streptococcus pneumoniae ist, wurde beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, the Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of International Trade and Industry, Japan, am 28. Juli 1999 mit der Hinterlegungs-Nummer FERM BP-6807 hinterlegt.
  • Des Weiteren ist ein Großteil der DNA-Sequenz und Aminosäuresequenz, welche durch das "Neisseria Gonorrhea Genom-Projekt" an der Oklahoma University, USA, bestimmt wurden, im Internet offenbart, obwohl die DNA und Aminosäuresequenzen des ribosomalen Proteins L7/L12 von, zum Beispiel Neisseria gonorrhoeae, welches das verursachende Pathogen von Gonorrhoe ist, und gezeigt hat, dass es als ein typisches verursachendes Pathogen von STD diagnostische Bedeutung hat, unbekannt waren.
  • Wenn ein Teil der bekannten DNA-Sequenz des ribosomalen Proteins L7/L12 verwendet wurde, um die Existenz von DNA-Fragmenten mit einer ähnlichen Sequenz zu sondieren, wurde gefunden, dass die zu dem Gen des ribosomalen Proteins L7/L12 korrespondierende DNA-Sequenz vorhanden ist, und es war möglich, Daten von seiner gesamten DNA-Sequenz zu erhalten. Die gesamte Basensequenz des Gens und korrespondierende Aminosäuresequenz des ribosomalen Proteins L7/L12 dieses Neisseria gonorrhoeae sind in Sequenzen No. 7 und No. 8 der Sequenztabelle gezeigt.
  • Es ist deshalb möglich den Zielantikörper, welcher spezifisch gegen Neisseria gonorrhoeae ist, mit dem gesamten oder teilweisen ribosomalen Protein L7/L12 von Neisseria gonorrhoeae als ein Antigen zu gewinnen, durch Entwerfen eines PCR-Primers, der PCR-Primer ist in Sequenz ID No. 15 oder 16 in der Sequenztabelle gezeigt, zum Beispiel basierend auf den Sequenzen des N-Terminus und C-Terminus der DNA-Sequenz des ribosomalen Proteins L7/L12 von Neisseria gonorrhoeae in der gleichen Weise wie im Falle von Haemophilus influenzae und Streptococcus pneumoniae und anschließender Weiterverarbeitung in exakt der gleichen Weise wie im Fall von Haemophilus influenzae oder Streptococcus pneumoniae.
  • Insbesondere die Gensequenz des ribosomalen Proteins L7/L12 von Neisseria meningitides, welches zur gleichen Neisseria-Gattung wie Neisseria gonorrhoeae gehört, ist im Internet offenbart und ohne weiteres erhältlich. Die gesamte Basensequenz des Gens und die korrespondierende Aminosäuresequenz des ribosomalen Proteins L7/L12 von Neisseria meningitidis sind in "Sequenzen No. 9 und No. 10" gezeigt. Beim Vergleich der gesamten Basensequenz der Gene für ribosomales Protein L7/L12 von Neisseria meningitidis und Neisseria gonorrhoeae, ist der einzige Unterschied in der Aminosäuresequenz, dass Neisseria gonorrhoeae Alanin als 115. Aminosäure vom N-Terminus hat, wohingegen Neisseria meningitidis eine Glutaminsäure hat. Demzufolge kann geschlossen werden, dass der Antikörper für das ribosomale Protein L7/L12 von Neisseria gonorrhoeae, welcher spezifisch Neisseria gonorrhoeae nachweist, der Antikörper ist, welcher das Alanin bei 115 vom N-Terminus identifiziert und den Aminosäurebereich, der das Alanin des ribosomalen Proteins L7/L12 als ein Epitop umfasst.
  • Der auf Basis der vorliegenden Erfindung hergestellte Antikörper kann in allen bekannten Typen von Immunoassays verwendet werden, wie zum Beispiel, Aggregation, wobei der Antikörper auf Polystyrollatex adsorbiert ist, ELISA, welches eine herkömmliche Technologie ist, die auf einer Mikrotiterplatte durchgeführt wird, herkömmliche Immunochromatographie, Sandwichassay, wobei der Antikörper mit farbigen Partikeln oder Partikeln, die die Fähigkeit zur Färbung haben, oder Enzymen oder Phosphor markiert wird, und magnetische Partikel, die mit Einfang-Antikörpern beschichtet sind werden verwendet, usw..
  • Des Weiteren kann ein Antikörper, der basierend auf der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, gleichzeitig in jedem dieser Immunoassay-Verfahren als ein sogenannter Einfang-Antikörper, der das Antigen-Protein in der festen oder flüssigen Phase einfängt und ein sogenannter Enzym-gelabelter Antikörper durch Modifikation unter Verwendung eines Enzyms, wie zum Beispiel Peroxidase und alkalische Phosphatase, usw. durch herkömmliche Verfahren funktionieren.
  • BESTE ART, DIE ERFINDUNG AUSZUFÜHREN
  • Die folgenden Beispiele sind angegeben, um die vorliegende Erfindung unter tatsächlichen Bedingungen zu erklären, wobei die vorliegende Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt ist.
  • Beispiel 1
  • Klonierung der Gene des ribosomalen Proteins L7/L12 aus Haemophilus influenzae
  • Nach Inokulation einer geeigneten Menge von Haemophilus influenzae Stamm ATCC9334 (IID984) (erhalten von der Tokyo University School of Medicine Laboratories) in einem Schokoladenagar Kulturmedium wurde der Stamm für 24 Stunden in einem CO2-Inkubator unter Bedingungen von 37°C und 5,0 CO2 kultiviert. Die Kolonien, die wuchsen, wurden in einem TE-Puffer (hergestellt von Wako Pure Chemical Co., Ltd.) auf eine Endkonzentration von etwa 5 × 109 CFU/ml suspendiert. Etwa 1,5 ml dieser Suspension wurden in ein Mikrozentrifugenröhrchen transferiert und für 2 Minuten bei 10.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Das Sediment wurde in 567 μl TE-Puffer resuspendiert. Dann wurden 30 μl 10% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 3 μl 20 mg/ml Proteinase K-Lösung zugegeben und gründlich gemischt. Die Suspension wurde für eine weitere Stunde bei 37°C inkubiert. Als nächstes, nach der Zugabe von 80 μl 10% Cetyltrimethylammoniumbromid/0,7 M NaCl-Lösung und gründlicher Mischung des Produkts, wurde für 10 Minuten bei 65°C inkubiert. Als nächstes wurden 700 μl Chloroform-Isoamylalkohol-Lösung bei einem Volumenverhältnis von 24:1 zugegeben und gründlich gerührt. Die Lösung wurde für 5 Minuten (während sie bei 4°C gehalten wurde) bei 12.000 rpm unter Verwendung einer Mikrozentrifugations-Vorrichtung zentrifugiert und die wässrige Fraktion wurde in ein neues Mikroröhrchen über führt. Isopropanol wurde mit 0.6-fachem Volumen zu der Fraktion zugegeben und das Röhrchen wurde heftig geschüttelt, um ein Sediment der DNA zu bilden. Das weiße DNA-Sediment wurde mit einem Glasstab abgeschöpft und in ein weiteres Mikrozentrifugenröhrchen, enthaltend 1 ml 70% Ethanol (gekühlt auf –20°C), überführt.
  • Als nächstes wurde das Produkt für 5 Minuten bei 10.000 rpm zentrifugiert und der Überstand wurde vorsichtig entfernt. Dann wurde 1 weiterer ml 70% Ethanol zugegeben und das Produkt für 5 weitere Minuten zentrifugiert.
  • Sobald der Überstand entfernt war, wurde das Sediment in 100 μl TE-Puffer gelöst, um die DNA-Lösung zu erhalten. Die Konzentration der genomischen DNA-Lösung wurde quantitativ gemäß E5, spektrometrische Bestimmung der Menge von DNA oder RNA "Molecular cloning: A laboratory manual," 1989, Eds. Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, bestimmt.
  • PCR (Polymerase-Kettenreaktion) wurde unter Verwendung von 10 ng dieser genomischen DNA durchgeführt. Taq-Polymerase (Takara Co., Ltd., Code R001A) wurde für die PCR verwendet. Dann wurden 5 μl Puffer, 4 μl dNTP-Mischung und 200 pmol von jeweils synthetischem Oligonucleotid-A, gezeigt in Sequenz No. 11 der Sequenztabelle und synthetischem Oligonucleotid-B, gezeigt in Sequenz No. 12 der Sequenztabelle, zu dem Enzym zugegeben, um das Endvolumen auf 50 μl zu bringen.
  • Diese Mischung wurde 5 Zyklen mit einem TaKaRa PCR Thermal Cycler 480 unterworfen, für 1 Minute bei 95°C, 2 Minuten bei 50°C, und 3 Minuten bei 72°C und dann 25 Zyklen unterworfen, für 1 Minute bei 95°C, 2 Minuten bei 60°C und 3 Minuten bei 72°C. Elek trophorese wurde in 1,5 % Agarosegel unter Verwendung von einigen von diesem PCR-Produkt durchgeführt. Dieses Produkt wurde anschließend mit Ethidiumbromid (Nihon Gene Co., Ltd.) gefärbt und unter ultravioletter Strahlung betrachtet, um die Amplifikation von etwa 400 by cDNA zu bestätigen. Nach Aufschlussbehandlung mit Restriktionsendonukleasen BamHI und XhoI, wurde Elektrophorese in einem 1,5% Agarosegel durchgeführt und Färbung mit Ethidiumbromid wurde durchgeführt. Eine ungefähr 370 bp-Bande wurde aus dem Gel ausgeschnitten. Diese Bande wurde mit Suprec01 (Takara Co., Ltd.) gereinigt und dann in ein pGEX-4T-1 (Pharmacia) eingefügt, welches ein kommerziell erhältlicher Vektor ist. Der gleiche Vektor kann als Expressionsvektor für das gewünschte Molekül funktionieren, welches fusioniertes Protein mit GST-Protein exprimieren kann, durch Einfügung des gewünschten Genfragments in die geeignete Restriktionsendonukleasenstelle.
  • Tatsächlich wurden der Vektor pGEX-4T-1 und die vorhergehende DNA in einem Molverhältnis von 1:3 zusammen gemischt und DNA wurde in den Vektor mit T4-DNA-Ligase (Invitrogen Co.) eingefügt. Der Vektor pGEX-4T-1, in welchen die DNA eingeführt worden war, wurde genetisch in Escherichia coli one-shot competent cells (Invitrogen Co., Ltd.) eingefügt und dann in eine Platte von L-Medium (Takara Co., Ltd.) halbfeste Kulturschale, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin (Sigma) geimpft. Die Platte wurde dann bei 37°C für 12 Stunden beiseite gestellt und die gewachsenen Kolonien wurden zufällig ausgewählt und in 2 ml L-Medium Flüssigkulturmedium, enthaltend die gleiche Konzentration von Ampicillin, geimpft. Kultivierung unter Schütteln wurde bei 37°C für 8 Stunden durchgeführt und die Bakterien wurden gewonnen und das Plasmid wurde abgetrennt unter Verwendung von Wizard Miniprep (Promega) in Übereinstimmung mit der beigefügten Literatur. Das Plasmid wurde mit Restriktionsendonuklease BamHI/XhoI geschnit ten. Die Einfügung des PCR-Produkts wurde durch Ausschneiden von etwa 370 by DNA bestätigt. Die Basensequenz der DNA, die eingefügt worden war, wurde mit dem Klon bestimmt.
  • Die Bestimmung der Basensequenz des eingefügten DNA-Fragments wurde unter Verwendung des Fluorescence Sequencer von Applied Biosystems durchgeführt. Die Sequenzprobe wurde unter Verwendung von PRISM, Ready Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) hergestellt. Zuerst wurden 9,5 μl Reaktionsstocklösung, 4,0 μl T7-Promotorprimer mit 0,8 pmol/μl (Gibco BRL) und 6,5 μl Templat-DNA mit 0,16 μg/μl zur Sequenzierung in ein Mikroröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 0,5 ml gegeben, gemischt und mit 100 μl Mineralöl überschichtet. PCR-Amplifikation wurde für 25 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus aus 30 Sekunden bei 96°C, 15 Sekunden bei 55°C und 4 Minuten bei 60°C bestand. Das Produkt wurde dann bei 4°C für 5 Minuten gehalten. Nachdem die Reaktion beendet war, wurden 80 μl sterilisiertes reines Wasser zugegeben und gerührt. Das Produkt wurde zentrifugiert und die wässrige Schicht 3 mal mit Phenol-Chloroform extrahiert. 10 μl [Mikroliter] 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 300 μl Ethanol wurden zu 100 μl wässriger Schicht zugegeben und gerührt. Das Produkt wurde dann für 15 Minuten bei Raumtemperatur bei 14.000 rpm zentrifugiert und das Sediment wurde gewonnen. Sobald das Sediment mit 75% Ethanol gewaschen war, wurde es unter Vakuum für 2 Minuten getrocknet, um die Sequenzierungsprobe zu erhalten. Die Sequenzierungsprobe wurde in Formamid, enthaltend 4 μl 10 mM EDTA gelöst und für 2 Minuten bei 90°C denaturiert. Dies wurde dann in Eis gekühlt und sequenziert.
  • Einer der 5 erhaltenen Klone hatte Homologie zu der Sequenz mit der Sonde, die für die PCR verwendet wurde. Zusätzlich wurden DNA-Sequenzen mit extremer Ähnlichkeit zu der Gensequenz des Gens des ribosomalen Proteins L7/L12 der anderen Mikroorganis men, zum Beispiel Neisseria gonorrhoeae, entdeckt. Die gesamte Basensequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz der strukturellen Geneinheit sind wie in Sequenz ID No. 17 und No. 18 der Sequenztabelle gezeigt. Dieses Genfragment codiert klar für Haemophilus influenzae ribosomales Protein L7/L12.
  • Beispiel 2
  • Massenexpression in Escherichia coli und Reinigung des ribosomalen Proteins L7/L12 aus Haemophilus influenzae
  • 50 ml Escherichia coli, in welche ein Expressionsvektor eingefügt worden war, wurden über Nacht in LB bei 37°C kultiviert. Dann wurden 500 ml YT-Medium mit einer Konzentration, die doppelt so hoch war wie die der vorher erwähnten Kultur, bei 37°C für 1 Stunde erhitzt. 50 ml der Escherichia coli Lösung, die über Nacht kultiviert worden waren, wurden in 500 ml des vorher erwähnten Mediums gegeben. Eine Stunde später wurden 550 μl 100 mM Isopropyl β-(D)-thiogalactopyranosid (IPTG) zugegeben und für 4 Stunden kultiviert. Das Produkt wurde dann gewonnen und in Zentrifugationsröhrchen von jeweils 250 ml gegeben und für 10 Minuten bei 7.000 rpm zentrifugiert.
  • Der Überstand wurde verworfen und in 25 ml jeweils 50 mM Tris-HCl bei einem pH von 7,4 und Lysis-Puffer, enthaltend 25% Sucrose, gelöst.
  • Weiterhin wurden 1,25 ml 10% Nonidet P-40 (NP-40) und 125 μl 1 M MgCl2 zugegeben und in ein Plastikröhrchen überführt. Ultraschallbehandlung wurde 5 mal für 1 Minute unter Eiskühlung durchgeführt. Das Produkt wurde für 15 Minuten bei 12.000 rpm zentrifugiert und der Überstand wurde gewonnen.
  • Als nächstes wurde der zuvor erwähnte Überstand auf einer Glutathion-Agarosesäule, die mit Phosphat-gepufferter Saline (PBS) konditioniert wurde, adsorbiert.
  • Dann wurde die Säule mit ihrem zweifachen Bettvolumen gewaschen unter Verwendung einer Waschlösung, enthaltend 20 mM Tris-Puffer bei einem pH von 7,4, 4,2 mM MgCl2 und 1 mM Dithiothreithol (DTT). Die Eluierung wurde mit 50 mM Tris-Puffer bei einem pH von 9,6, enthaltend 5 mM Glutathion durchgeführt. Der Proteinanteil in der Fraktion wurde durch die Pigmentbindungsmethode (Bradford method; BioRad Co.) bestimmt und die Hauptfraktion wurde gewonnen.
  • Die Reinheit des gereinigten ribosomalen Proteins L7/L12/GST fusioniertes Protein, das erhalten wurde, wurde mittels Elektrophorese auf etwa 75% bestimmt, was zeigt, dass eine Reinheit garantiert werden kann, die ausreichend für ein Immunogen ist.
  • Beispiel 3
  • Herstellung von monoklonalem Antikörper gegen ribosomales Protein L7/L12 aus Haemophilus influenzae
  • Zuerst wurden 100 μg fusioniertes Proteinantigen von ribosomalem Protein L7/L12/GST aus Haemophilus influenzae in 200 μl PBS gelöst und dann 200 μl Freund's Komplettadjuvas zugegeben und gemischt und Emulgierung wurde durchgeführt. 200 μl wurden intraperitoneal injiziert, um Mäuse zu immunisieren
  • Dann wurde die gleiche Emulsion von Antigen intraperitoneal nach 2 Wochen, nach 4 Wochen und nach 6 Wochen injiziert. Die zweifache Konzentration an Antigenemulsion wurde intraperitoneal nach 10 Wochen und nach 14 Wochen injiziert. Die Milz wurde 3 Tage nach der finalen Immunisierung entfernt und der Zellfusion übergeben.
  • Nach gründlicher Mischung von 2 × 107 Myeloma-Zellen pro 108 Milzzellen von Mäusen, welche aseptisch gewonnen worden waren, in einem Glasröhrchen, wurde die Mischung für 5 Minuten bei 1.500 rpm zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die Zellen wurden gründlich gemischt.
  • Die Myeloma-Zellen, die für die Zellfusion verwendet wurden, wurden durch Kultivierung von Zellinie NS-1 mit einem RPMI 1640-Kulturmedium, enthaltend 10% FCS erhalten, wobei die Kultivierung dieses Produkts 2 Wochen vor der Zellfusion begonnen wurde unter Verwendung eines RPMI 1640-Mediums, enthaltend 0,13 mM Azaguanin, 0,5 μg/ml MC-210 und 10% FCS, für 1 Woche und dann weitere Kultivierung der Zellinie für 1 Woche mit einem RPMI 1640-Medium, enthaltend 10% FCS.
  • Dreißig Milliliter von RPMI 1640-Kulturmedium 50 ml, welche bei 37°C gehalten worden waren, wurden zu der gemischten Zellprobe gegeben und bei 1.500 rpm zentrifugiert. Nach Entfernung des Überstandes wurde 1 ml 50% Polyethylenglycol, welches bei 37°C gehalten worden war, zugegeben und für 2 Minuten gerührt. 10 ml RPMI 1640-Medium, welches bei 37°C gehalten worden war, wurde zugegeben und die Lösung wurde für etwa 5 Minuten durch Einsaugen und Ausblasen einer sterilen Pipette heftig gemischt.
  • Nach Zentrifugation für 5 Minuten bei 1.000 rpm und Entfernung des Überstandes wurden 30 ml HAT Medium zugegeben, um die Zellkonzentration auf 5 × 106 Zellen/ml zu bringen. Diese Mischung wurde gerührt, bis sie gleichförmig war und anschließend je 0,1 ml in eine 96-Well-Kulturplatte geschüttet und bei 37°C un ter 7% CO2 kultiviert. HAT Medium wurde zugegeben, je 0,1 ml am Tag 1 und bei Woche 1 und Woche 2.
  • Dann wurden die Zellen, die den gewünschten Antikörper produziert hatten, durch ELISA gescreent.
  • Lösungen von ribosomalem GST-Fusionsprotein L7/L12 und GST Protein aus Haemophilus influenzae, gelöst in PBS, enthaltend 0,05 Natriumazid, verdünnt auf 10 μg/ml, wurden in separate 96-Well-Platten geschüttet, je 100 μl, und über Nacht bei 4°C adsorbiert.
  • Nach Entfernung des Überstandes wurden 200 μl einer 1% Rinderserumalbumin-Lösung (in PBS) zugegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt und gehemmt. Nach Entfernung des Überstandes wurde das Produkt mit einer Waschlösung (0,02 Tween 20, PBS) gewaschen. 100 μl Kulturlösung der fusionierten Zellen wurden zu diesem zugegeben und für 2 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Der Überstand wurde entfernt und mit Waschlösung gewaschen. Als nächstes wurden 100 μl Peroxidase gelabelte Ziegen-Anti-Maus-IgG-Antikörperlösung bei einer Konzentration von 50 ng/ml zugegeben und die Lösung für 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt. Der Überstand wurde entfernt und das Produkt wurde wiederum mit Waschlösung gewaschen. Dann wurde TMB-Lösung (KPL Co., Ltd.) zugegeben, je 100 μl, und die Mischung wurde für 20 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach Färbung wurden 100 μl 1 N Schwefelsäure zugegeben, um die Reaktion zu stoppen und die Absorption bei 450 nm wurde bestimmt.
  • Als ein Ergebnis wurden positive Wells nachgewiesen, die nur mit ribosomalem GST-Fusionsprotein L7/L12 reagiert hatten und nicht mit GST-Protein reagierten und es wurde geschlossen, dass ein Antikörper gegen ribosomales Protein L7/L12 anwesend ist.
  • Deshalb wurden die. Zellen in den positiven Wells gewonnen und in einer 24-Well-Plastikplatte mit HAT-Medium kultiviert. Das fusionierte Medium, das kultiviert worden war, wurde mit HT-Medium auf eine Zellenzahl von etwa 20 Zellen/ml verdünnt und dann mit 106 sechs Wochen alten Maus-Thyroid-Zellen, suspendiert in HT-Kulturmedium, in einer 96-Well-Kulturplatte gemischt. Kultivierung wurde für 2 Wochen bei 37°C unter Bedingungen von 7% CO2 durchgeführt.
  • Antikörperaktivität in dem Kulturüberstand wurde entsprechend durch das vorher erwähnte ELISA-Verfahren bestimmt und die Zellen, die mit ribosomalem Protein L7/L12 eine positive Reaktion zeigten, wurden gewonnen.
  • Des Weiteren wurde der gleiche Verdünnungstest und des Klonierungsverfahren wiederholt, um eine Gesamtzahl von 5 Klonen von Hybridoma HIRB-1 ∼ 5 zu erhalten.
  • Beispiel 4
  • Reaktion von monoklonalem Antikörper, welcher mit ribosomalem Protein L7/L12 aus Haemophilus influenzae, mit Neisseria gonorrhoeae und anderen Mikroorganismen reagiert
  • Monoklonaler Antikörper wurde in Übereinstimmung mit Standardverfahren unter Verwendung der positiven Hybridomazellen, die wie vorhergehend beschrieben erhalten wurden, hergestellt und gewonnen.
  • Grundsätzlich wurden 5 × 106 Zellen, welche unter Verwendung von RPMI 1640-Kulturmedium abgeimpft wurden (enthaltend 10% FCS) intraperitoneal in Balb/C-Mäuse injiziert, welche 2 Wochen zuvor intraperitoneal mit 0,5 ml Pristan injiziert worden waren. Aszites wurde 3 Wochen später gewonnen und der Zentrifugationsüberstand wurde erhalten.
  • Die Lösung, enthaltend den Antikörper, der erhalten wurde, wurde in einer Protein A-Säule (5 ml Bett, Pharmacia) adsorbiert und mit 3-fachem Bettvolumen an PBS gewaschen. Durch anschließende Eluierung mit Citratpuffer bei pH 3 wurde die Antikörperfraktion gewonnen und der monoklonale Antikörper, der durch jedes Hybridoma hergestellt wurde, wurde erhalten.
  • Der von diesen 5 Linien von Hybridoma gewonnene monoklonale Antikörper wurde im ELISA verwendet.
  • Das Sandwich-Assay-Verfahren wurde verwendet, um den monoklonalen Antikörper zu beurteilen. Der monoklonale Antikörper, der hergestellt wurde, wurde als ein Enzym-gelabelter Antikörper verwendet, indem er chemisch an Peroxidase gebunden wurde.
  • D.h. Enzym-Labeling wurde durchgeführt in Übereinstimmung mit dem Verfahren in "Analytical Biochemistry" 132 (1983), 68-73 mit dem Reagens S-Acetylthioessigsäure N-Hydroxysuccinimid zur Bindung unter Verwendung von Meerrettichperoxidase (Sigma Grade VI). Unter Verwendung der ELISA-Reaktion wurde eine Lösung von kommerziell erhältlichem polyklonalem anti-Haemophilus influenzae Antikörper, welcher in PBS, enthaltend 0,05 Natriumazid (Biodesign, Kaninchen), gelöst war, auf eine Konzentration von 10 μ/ml verdünnt und je 100 μ in eine separate 96 Well-Platte geschüttet und über Nacht bei 4°C adsorbiert.
  • Nach Entfernung des Überstandes wurden 200 μl 1% FCS-Lösung (in PBS) zugegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt und gehemmt. Der Überstand wurde entfernt und das Produkt mit Waschlösung (0,02 Tween 20, PBS) gewaschen. 100 μl Antigenlösung, welche durch Zugabe von Triton X-100 zu Kulturlösungen von jeder Spezies von Mikroorganismen auf eine Konzentration von 0,3% und dann Extraktion der Lösung für 5 Minuten bei Raumtemperatur erhalten wurde, wurden dazu zugegeben und für 2 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Der Überstand wurde entfernt und das Produkt wurde weiter mit Waschlösung gewaschen. Dann wurden 100 μl Peroxidase-gelabelte anti-ribosomales Protein L7/L12-Antikörperlösung mit 5 μg/ml zugegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Der Überstand wurde entfernt und das Produkt wurde mit Waschlösung gewaschen. TMB (KPL Co.)-Lösung wurde zugegeben, je 100 μl, und für 20 Minuten bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Nach Färbung wurden 100 μl 1 N Schwefelsäure zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Die Absorption bei 450 nm wurde bestimmt.
  • Als ein Ergebnis, wie in Tabelle 1 gezeigt, ist klar, dass, wenn monoklonaler Antikörper, erhalten aus Hybridoma HIRB-2, als der Enzym-gelabelte Antikörper verwendet wurde, wurden alle getesteten Linien von Haemophilus influenzae mit einer Empfindlichkeit von 106 Bakterien/ml nachgewiesen, während die Reaktivität von anderen Bakterien, die zur Gattung Neisseria gehören und andere Mikroorganismen nicht nachgewiesen werden konnten, sogar bei hohen Konzentrationen von 108 Bakterien/ml und deshalb kann Antikörper mit spezifischer Reaktivität gegen Haemophilus influenzae erhalten werden unter Verwendung von monoklonalem Antikörper gegen ribosomales Protein L7/L12.
  • Tabelle 1
    Figure 00310001
  • Figure 00320001
  • Beispiel 5
  • Klonen von Genen des ribosomalen Proteins L7/L12 aus Streptococcus pneumoniae, Massenexpression in Escherichia coli und Reinigung desselben Proteins und Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen dasselbe Protein
  • Nach Impfung einer geeigneten Menge von Streptococcus pneumoniae-Stamm IID555 (erhalten von Tokyo University School of Medicine Laboratories) in einem Blutagar-Kulturmedium wurde der Stamm für 48 Stunden in einem Inkubator bei 37°C kultiviert. Die Kolonien, die gewachsen sind, wurden in einem TE-Puffer auf eine Endkonzentration von etwa 5 × 109 CFU/ml suspendiert. Etwa 1,5 ml dieser Suspension wurden in ein Mikrozentrifugenrohr über führt und für 2 Minuten bei 10.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Das Sediment wurde in 567 μl TE-Puffer resuspendiert. Dann wurden 30 μl 10% SDS und 3 μl 20 mg/ml Proteinase K-Lösung zugegeben und gründlich gemischt. Die Suspension wurde für eine weitere Stunde bei 37°C inkubiert. Als nächstes, nach Zugabe von 80 μl 10% Cetyltrimethylammoniumbromid/0,7 M NaCl-Lösung und gründlicher Durchmischung des Produkts, wurde für 10 Minuten bei 65°C inkubiert. Als nächstes wurden 700 μl Chloroform-Isoamylalkohollösung bei einem Volumenverhältnis von 24:1 zugegeben und gut gerührt. Die Lösung wurde für 5 Minuten (während sie bei 4°C gehalten wurde) bei 12.000 rpm zentrifugiert unter Verwendung einer Mikrozentrifugationsvorrichtung und die wässrige Fraktion wurde in ein neues Mikrorohr überführt. Isopropanol wurde zu der Fraktion mit 0,6-fachem Volumen zugegeben, und das Rohr wurde heftig geschüttelt, um ein Sediment der DNA zu bilden. Das weiße DNA-Sediment wurde mit einem Glasstab abgeschöpft und in ein weiteres Mikrozentrifugenrohr überführt, enthaltend 1 ml 70% Ethanol (gekühlt auf – 20°C).
  • Als nächstes wurde das Produkt für 5 Minuten bei 10.000 rpm zentrifugiert und der Überstand vorsichtig entfernt. Dann wurde 1 weiterer ml 70 $ Ethanol zugegeben und das Produkt für 5 weitere Minuten zentrifugiert. Sobald der Überstand entfernt war, wurde das Sediment in 100 μl TE-Puffer gelöst, um die DNA-Lösung zu erhalten. Die Konzentration der genomischen DNA-Lösung wurde quantitativ bestimmt in Übereinstimmung mit E5, Spectrophotometric determination of the amount of DNA or RNA, "Molecular cloning: A laboratory manual," 1989, Eds. Sambrook, J., Fritsch, E.F., und Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press.
  • PCR wurde durchgeführt unter Verwendung von 10 ng dieser genomischen DNA. Taq-Polymerase (Takara Co., Ltd., Code R001A) wurde für die PCR verwendet. Dann wurden 5 μl Puffer zu dem Enzym zugefügt, 4 μl dNTP-Mischung zu dem Enzym zugefügt und 200 pmol von jeweils synthetischem Oligonucleotid C, gezeigt in Sequenz No. 13 der Sequenztabelle, und synthetischem Oligonucleotid D, gezeigt in Sequenz No. 14 der Sequenztabelle, zu dem Enzym zugegeben, um das Gesamtvolumen auf 50 μl zu bringen.
  • Diese Mischung wurde 5 Zyklen unterworfen mit einem TaKaRa PCR Thermal Cycler 480 für 1 Minute bei 95°C, 2 Minuten bei 50°C und 3 Minuten bei 72°C und anschließend 25 Zyklen unterworfen für 1 Minute bei 95°C, 2 Minuten bei 60°C und 3 Minuten bei 73°C. Elektrophorese wurde durchgeführt in 1,5% Agarosegel unter Verwendung von einigem dieses PCR-Produkts. Dieses Produkt wurde anschließend mit Ethidiumbromid (Nihon Gene Co., Ltd.) gefärbt und unter ultravioletten Strahlen beobachtet, um die Amplifikation von etwa 400 by cDNA zu bestätigen. Nach der Aufschlussbehandlung mit Restriktionsendonukleasen BamHI und XhoI wurde Elektrophorese in 1,5% Agarosegel durchgeführt und Färbung mit Ethidiumbromid wurde durchgeführt. Eine etwa 370 bp-Bande wurde aus dem Gel ausgeschnitten. Diese Bande wurde mit Suprec01 (Takara Co., Ltd.) gereinigt und dann in pGEX-6P-1 (Pharmacia) eingefügt, welcher ein kommerziell erhältlicher Vektor ist.
  • Derselbe Vektor kann als ein Expressionsvektor für das gewünschte Molekül dienen, welcher fusionierte Proteine mit GST-Protein exprimieren kann durch Insertion des gewünschten Genfragments in die geeignete Restriktions-Endonukleasenstelle. Tatsächlich wurden der Vektor pGEX-6P-1 und die vorhergenannte DNA bei einem Molverhältnis von 1:5 zusammengemischt und DNA wurde in den Vektor mit T4-DNA-Ligase (Invitrogen Co.) eingefügt. Der Vektor pGEX-4T-1, in welchen die DNA eingeführt worden war, wurde genetisch in Escherichia coli One-Shot Comopetent Cells eingefügt (Invitrogen Co., Ltd.) und dann in einer Platte von L-Medium (Takara Co., Ltd.) halbfeste Kulturplatten, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin (Sigma) geimpft. Die Platte wurde dann bei 37°C für 12 Stunden beiseite gestellt und die Kolonien, die gewachsen sind, wurden zufällig ausgewählt und in 2 ml L-Medium Flüssigkulturmedium, enthaltend die gleiche Konzentration an Ampicillin, geimpft. Schüttelkultivierung wurde bei 37°C für 8 Stunden durchgeführt und die Bakterien wurden gewonnen und das Plasmid wurde abgetrennt unter Verwendung von Wizard Miniprep (Promega Co.) in Übereinstimmung mit der beigefügten Literatur. Das Plasmid wurde mit Restriktionsendonuklease BamHI/XhoI geschnitten. Einfügung des genannten PCR-Produkts wurde durch Ausschneiden von etwa 370 pb DNA bestätigt. Die Basensequenz der DNA, die eingefügt worden war, wurde unter Verwendung des genannten Klons bestimmt.
  • Die Bestimmung der Basensequenz des eingefügten DNA-Fragments wurde unter Verwendung des Fluoreszenz-Sequenzers von Applied Biosystems durchgeführt. Die Sequenzprobe wurde unter Verwendung von PRISM, Ready Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) hergestellt. Zuerst wurden 9,5 μl Reaktionsstocklösung, 4,0 μl T7-Promoter-Primer mit 0,8 pmol/μl (Gibco BRL) und 6,5 μl an Templat-DNA mit 0,16 μg/μl zur Sequenzierung in ein Mikroröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 0,5 ml zugegeben, gemischt und mit 100 Mineralöl überschichtet. PCR-Amplifikation wurde für 25 Zyklen durchgeführt, wobei 1 Zyklus aus 30 Sekunden bei 96°C, 15 Sekunden bei 55°C und 4 Minuten bei 60°C bestand. Das Produkt wurde anschließend bei 4°C für 5 Minuten gehalten. Nachdem die Reaktion beendet war, wurden 80 μl sterilisiertes reines Wasser zugegeben und gerührt. Das Produkt wurde zentrifugiert und die wässrige Schicht wurde 3 mal mit Phenol-Chloroform extrahiert. Zehn Mikroliter 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 300 μl Ethanol wurde zugegeben zu 100 μl wässriger Lösung und gerührt. Das Produkt wurde dann für 15 Minuten bei Raumtemperatur und 14.000 rpm zentrifugiert und das Sediment wurde gewonnen. Nachdem das Sediment mit 75% Ethanol gewaschen war, wurde es unter Vakuum für 2 Minuten getrocknet, um die Sequenzierprobe zu erhalten. Die Sequenzierprobe wurde in Formamid, enthaltend 4 μl 10 mM EDTA, gelöst und für 2 Minuten bei 90°C denaturiert. Dies wurde anschließend in Eis gekühlt und der Sequenzierung überführt.
  • Einer der erhaltenen 7 Klone hatte Homologie der Sequenz mit der Probe, die für PCR verwendet wurde. Zusätzlich wurden DNA-Sequenzen mit extremer Ähnlichkeit zu der Gensequenz des Gens des ribosomalen Proteins L7/L12 der anderen Mikroorganismen, z.B. Neisseria gonorrhoeae, entdeckt. Die gesamte Basensequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz der strukturellen Geneinheit waren wie in Sequenz ID No. 19 und No. 20 der Sequenztabelle gezeigt. Dieses Genfragment codiert klar für Streptococcus pneumoniae ribosomales Protein L7/L12.
  • 50 ml Escherichia coli, in welche ein Expressionvektor eingefügt worden war, wurden über Nacht in einem YT-Medium mit zweifacher Konzentration bei 37°C kultiviert. Dann wurden 450 ml des YT-Mediums mit zweifacher Konzentration bei 37°C für 1 Stunde erhitzt. 50 ml der Escherichia coli-Lösung, die über Nacht kultiviert worden war, wurde in 450 ml des vorhergenannten Mediums gegeben. Nach Kultivierung für 1 Stunde bei 37°C wurden 100 μl 500 mM IPTG zugegeben und für 4 Stunden bei 25°C kultiviert. Das Produkt wurde dann gewonnen und je 250 ml in Zentrifugationsröhrchen gegeben und für 20 Minuten bei 5.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und in je 25 ml 50 mM Tris-HCl bei einem pH von 7,4 und einem Lysis-Puffer, enthaltend 25% Sucrose, gelöst.
  • Des Weiteren wurden 1,25 ml 10% NP-40 und 125 μl 1 M MgCl2 zugegeben und in ein Plastikröhrchen überführt. Unter Eiskühlung wurde 5 × für 1 Minute Ultraschallbehandlung durchgeführt. Das Produkt wurde für 15 Minuten bei 12.000 rpm zentrifugiert und der Überstand wurde gewonnen.
  • Als nächstes wurde der Überstand auf einer mit PBS konditionierten Glutathionsepharosesäule (hergestellt durch Pharmacia) adsorbiert. Dann wurde die Säule mit PBS mit dreifachem Bettvolumen gewaschen. Die Eluierung wurde mit 50 mM Tris-HCl bei einem pH von 8,0, enthaltend 10 mM Glutathion durchgeführt. Der Proteinanteil in der Fraktion wurde durch die Pigmentbindungsmethode (Bradford Method; BioRad Co.) bestimmt und die Hauptfraktion wurde gesammelt. Die Hauptfraktion wurde dreimal gegen 3 1 PBS dialysiert.
  • 1 ml eines Spaltungspuffers, enthaltend 500 mM Tris-HCl (pH 7,0), 1,5 M NaCl, 10 mM EDTA und 10 mM DTT wurden zu 10 ml einer 1 mg/ml-Lösung des resultierenden mit GST fusionierten ribosomalen Proteins L7/L12 zugegeben. 100 μl von 2 μ/μl PreScission Protease (hergestellt durch Pharmacia Company) wurden weiter zugegeben und bei 4°C umgesetzt, um die GST-Einheit von dem ribosomalen Protein L7/L12 zu trennen.
  • Die Reaktionslösung wurde durch eine Glutathionsepharosesäule, welche mit PBS konditioniert wurde, durchgeleitet. Die Lösung, die aus der Säule kam, wurde gewonnen. Ein Bettvolumen an PBS wurde durchgeleitet und ebenfalls gewonnen. Die Reinheit des gereinigten ribosomalen Proteins L7/L12, welches erhalten wurde, wurde durch Elektrophorese, auf etwa 90% bestätigt, was zeigt, dass eine ausreichende Reinheit für ein Immunogen garantiert werden konnte.
  • Zuerst wurden 100 μg Proteinantigen von ribosomalem Protein L7/L12 aus Streptococcus pneumoniae in 200 μl PBS gelöst und dann wurden 200 μl Freund's Komplettadjuvans zugegeben und gemischt und Emulgierung wurde durchgeführt. 200 μl wurden intraperitoneal injiziert, um Mäuse zu immunisieren. Dann wurde das gleiche Emulsionsantigen intraperitoneal injiziert nach 2 Wochen, nach 4 Wochen und nach 6 Wochen. Die zweifache Konzentration an Antigenemulsion wurde weiter intraperitoneal injiziert nach 10 Wochen und nach 14 Wochen. 3 Tage nach der finalen Immunisierung wurde die Milz herausgeschnitten und der Zellfusion übergeben.
  • Nach gründlichem Mischen von 2 × 107 Myeloma-Zellen pro 108 Milzzellen von Mäusen, welche aseptisch gewonnen worden waren, in einem Glasröhrchen, wurde die Mischung für 5 Minuten bei 1.500 rpm zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Die Zellen wurden gründlich gemischt.
  • Die Myeloma-Zellen, die für die Zellfusion benutzt wurden, wurden durch Kultivierung von Zellstämmen NS-1 mit einem RPMI 1640-Kulturmedium, enthaltend 10% FCS, erhalten; Kultivierung dieses Produkts begann 2 Wochen vor der Zellfusion unter Verwendung eines RPMI 1640-Mediums, enthaltend 0,13 mM Azaguanin, 0,5 μg/ml MC-210 und 10% FCS für 1 Woche und dann weiterer Kultivierung des Zellstamms für 1 Woche mit einem RPMI 1640-Medium, enthaltend 10% FCS. 30 ml RPMI 1640-Kulturmedium und 50 ml, welche bei 37°C gehalten worden waren, wurden zu der gemischten Zellprobe zugegeben und bei 1.500 rpm zentrifugiert. Nach Entfernung des Überstands wurde 1 ml 50% Polyethylenglykol, welches bei 37°C gehalten worden war, zugegeben und für 2 Minuten gerührt. 10 ml RPMI 1640-Medium, welches bei 37°C gehalten wurde, wurde zugegeben und die Lösung für etwa 5 Minuten durch Einsaugen und Ausblasen mit einer sterilen Pipette heftig gemischt.
  • Nach Zentrifugation für 5 Minuten bei 1.000 rpm und Entfernung des Überstandes wurden 30 ml HAT-Medium zugegeben, um die Zellkonzentration auf 5 × 106 Zellen/ml zu bringen. Die Mischung wurde gerührt, bis sie gleichförmig war, und anschließend in eine Kulturplatte mit 96 Wells geschüttet, je 0,1 ml und bei 37°C unter 7% CO2 kultiviert. HAT-Medium wurde zugeführt, je 0,1 ml an Tag 1 und bei Woche 1 und Woche 2.
  • Dann wurden die Zellen, die den gewünschten Antikörper hergestellt hatten, durch ELISA gescreent. Lösungen von ribosomalem Protein L7/L12 aus Streptococcus pneumoniae, gelöst in PBS, enthaltend 0,05% Natriumazid, verdünnt auf 10 μg/ml, wurden in separate 96-Well-Platten geschüttet, je 100 μ, und über Nacht bei 4°C adsorbiert. Nach Entfernung des Überstandes wurden 200 μl 1% Rinderserumalbuminlösung (in PBS) zugegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt und deaktiviert. Der Überstand wurde entfernt und das Produkt wurde mit einer Waschlösung (0,02% Tween 20, PBS) gewaschen. 100 μl einer Kulturlösung von Fusionszellen wurde zugegeben und für 2 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Der Überstand wurde entfernt und das Produkt wurde weiter mit einer Waschlösung gewaschen. Dann wurden 100 μl einer Peroxidase-gelabelten Ziegen-Anti-Maus-Antikörperlösung mit 50 ng/ml zugegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt. Der Überstand wurde entfernt und das Produkt wurde mit einer Waschlösung gewaschen. TMB (KPL)-Lösung wurde zugegeben, je 100 μl, und für 20 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach der Färbung wurden 100 μl 1 N Schwefelsäure zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Die Absorption bei 450 nm wurde bestimmt.
  • Als ein Ergebnis wurden positive Wells, die mit ribosomalem Protein L7/L12 reagiert hatten, bestimmt, was die Anwesenheit des Antikörpers gegen ribosomales Protein L7/L12 bestätigt.
  • Dafür wurden die Zellen in den positiven Wells gewonnen und mit HAT-Medium in einer 24-Well-Plastikplatte kultiviert. Das fusionierte Medium, welches kultiviert worden war, wurde mit einem HT-Medium auf eine Zellenzahl von etwa 20 Zellen/ml verdünnt und dann mit 106 sechs Wochen alten Mausthyroid-Zellen gemischt, die in einer 96-Well-Kulturplatte in dem HT-Medium suspendiert waren. Die Zellen wurden für 2 Wochen bei 37°C unter den Bedingungen von 7% CO2 kultiviert. Die Antikörperaktivität in dem Kulturüberstand wurde durch die vorher erwähnte ELISA-Methode bestimmt, und die Zellen, die eine positive Reaktion mit ribosomalem Protein L7/L12 zeigten, wurden gewonnen.
  • Des Weiteren wurde das gleiche Verdünnungs- und Klonierungsverfahren wiederholt, um eine Gesamtzahl von 4 Klonen von Hybridoma AMSP-1 bis 4 zu erhalten.
  • Beispiel 6
  • Reaktion von monoklonalem Antikörper, der mit ribosomalem Protein L7/L12 aus Streptococcus pneumoniae, mit Streptococcus pneumoniae und anderen Mikroorganismen reagiert
  • Ein monoklonaler Antikörper wurde hergestellt und gewonnen in Übereinstimmung mit Standardverfahren unter Verwendung der positiven Hybridomazellen, die wie vorher beschrieben erhalten wurden.
  • Genauer, Zellen, subkultiviert in RPMI 1640-Medium (enthaltend 10% FCS), wurden mit einem serumfreien Medium auf etwa 2 × 105 Zellen/ml, 3,3 × 105 Zellen/ml und 5 × 105 Zellen/ml in 25 cm2 Kulturkolben verdünnt und das Gesamtvolumen wurde auf 5 ml gebracht. Nachdem die Zellen für 3 bis 5 Tage in 7% CO2 bei 37°C gewachsen waren, wurde ein Kolben, welcher die geringste Anzahl an Originalzellen enthält, ausgewählt aus den Kolben, in welchen die Zellen gewachsen waren. Das gleiche Verfahren wurde wiederholt, bis die auf 2 × 105 Zellen/ml verdünnten Zellen auf 2 × 106 Zellen/ml in 3 bis 4 Tagen gewachsen waren, wodurch die Zellen auf das serumfreie Medium eingestellt wurden. Als nächstes wurde Klonierung durchgeführt in einer 96-Well-Platte für Bakterienkultivierung, um Zellen auszuwählen, die das schnellste Wachstum zeigen und den höchsten Antikörper-Titer. Die ausgewählten Zellen wurden in einer 24-Well-Platte gezüchtet und mit einem serumfreien Medium in einem 25 cm2 Kulturkolben auf eine Konzentration von etwa 2 × 105 Zellen/ml verdünnt, und das Gesamtvolumen wurde auf 10 ml gebracht. Nach Inkubation für 3 bis 4 Tage in 7% CO2 bei 37°C auf eine Konzentration von 1 × 106 Zellen/ml, wurde das Nährmedium 100 ml, 1 × 106 Zellen/ml, in eine Flasche für Massenkultivierung überführt, welche in der gleichen Weise in einem 75 cm2 Kolben gezüchtet wurden. 100 ml eines serumfreien Mediums wurde zu der Mischung zugegeben, welche bei 37°C für 2 Tage unter Rühren inkubiert wurde. 200 ml des serumfreien Mediums wurden wieder zugegeben und die Mischung wurde für weitere 2 Tage inkubiert. Das Nährmedium wurde in vier Aliquote aufgeteilt, das serumfreie Medium wurde zu jedem Teil zugegeben, gefolgt von Inkubation für 2 Tage. Nach weiterer Zugabe von 400 ml des serumfreien Mediums wurde das Nährmedium für 6 Tage inkubiert. Das Nährmedium wurde gesammelt und bei 10.000 rpm für 15 Minuten zentrifugiert, um einen Kulturüberstand zu erhalten, welcher den Zielantikörper enthält. Nach der Zugabe von Natriumazid auf eine Endkonzentration von 0,1% wurde der Kulturüberstand bei 4°C gelagert. 100 ml der Lösung, enthaltend den Antikörper, die erhalten wurde, wurde mit PBS 5-fach verdünnt und in einer Protein-G-Säule (5 ml-Bett, Pharmacia) adsorbiert und mit 3-fachem Bettvolumen an PBS gewaschen. Dann, eluiert mit Citratpuffer bei pH 3, wurde die Antikörperfraktion gewonnen und mono klonale Antikörper, hergestellt durch jedes Hybridoma, wurden erhalten. Die monoklonalen Antikörper, die von den 4 Hybridoma-Klonen stammen, wurden untersucht gemäß der OIA-Methode, beschrieben in der Publikation der Internationalen Patentanmeldung, Japanische Offenlegungsschrift (Toku-Hyou) No. 509565/1995.
  • Insbesondere umfasst die OIA-Methode die Herstellung eines reaktiven Substrats durch Reaktion eines Antikörpers zum Einfangen auf einem Siliconwafer mit einer dünnen Filmschicht von Siliziumnitrid, welches dieses Substrat dazu bringt, mit einem Antigen zu reagieren, welches ein Extrakt von Mikroorganismen ist, für eine vorherbestimmte Zeitspanne, welches das abgefangene Antigen dazu bringt, mit dem Antikörper zu reagieren (ein Amplifikationsreagens), welches ein Enzym-gelabelter Antikörper ist, und schließlich Zugabe einer Substratlösung, um ein dünnes Filmpräzipitat herzustellen. Die Antigen-Antikörper-Reaktion kann visuell eingeschätzt werden durch das Maß an Lichtinterferenzfarbe, welches in dem Präzipitat produziert wird.
  • Die Herstellung des monoklonalen Antikörpers wurde verwendet und bewertet als ein Einfang-Antikörper, der immobilisiert werden soll auf einem Siliziumwafer, welcher eine dünne Filmschicht von Siliziumnitrid hat, mit dem OIA-Verfahren. Des Weiteren wurde monoklonaler Peroxidase-gelabelter AMGC-1- Antikörper, welcher unspezifisch mit ribosomalen Proteinen L7/L12 Protein von einer Vielzahl von Mikroorganismen, beschrieben im Referenzbeispiel, reagiert, wurde als Nachweis-Antikörper verwendet. Das heißt, Enzym-Labeln wurde durchgeführt in Übereinstimmung mit dem Verfahren in "Analytical Biochemistry" 132 (1983), 68-73 mit dem Reagens S-Acetylthioessigsäure-N-hydroxysuccinimid zur Bindung unter Verwendung von Meerrettichperoxidase (Sigma Grade VI).
  • Bei der OIA-Reaktion wurde monoklonaler Antikörper in PBS, enthaltend 0,05% Natriumazid, mit 0,1 M HEPES (pH 8,0) auf eine Konzentration von 10 μg/ml verdünnt und auf einen Siliziumwafer gegeben, welcher eine dünne Filmschicht von Siliziumnitrid hat, je 50 μl, um für 30 Minuten bei Raumtemperatur zu reagieren, gefolgt von Waschen mit destilliertem Wasser und Verwendung.
  • 15 μl Antigenlösung, welche durch Zugabe von 0,5% Triton X-100 zu Kulturlösungen von verschiedenen Spezies von Mikroorganismen und anschließender Extraktion der Lösung für 5 Minuten bei Raumtemperatur erhalten worden war, wurde zu den Proben, erhalten bei dem oben beschriebenen Verfahren, zugegeben und für 10 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt. Dann wurden 15 μl von 20 μg/ml Peroxidase-gelabeltem AMGC1-Antikörper zugegeben und für 10 Minuten umgesetzt. Nach Waschen mit destilliertem Wasser wurde eine Substratlösung (KPL) zugegeben, je 15 μl, und für 5 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt. Das Produkt wurde mit destilliertem Wasser gewaschen, um die Konzentration von Detektionssignalen als eine Intensität von Lichtinterferenz mit bloßem Auge abzuschätzen.
  • Als ein Ergebnis, wie in Tabelle 2 gezeigt, ist klar, dass, wenn monoklonaler Antikörper, erhalten aus Hybridoma AMSP-2, als Capture-Antikörper verwendet wurde, wurden alle Stämme von Streptococcus pneumoniae, die getestet wurden, mit einer Empfindlichkeit von 106 Bakterien/ml nachgewiesen, während die Reaktivität von anderen Bakterien bei einer höheren Konzentration von 108 Bakterien/ml nicht nachgewiesen werden konnte. Demzufolge wurde durch Verwendung des monoklonalen Antikörpers gegen ribosomales Protein L7/L12 bestätigt, dass der Antikörper mit spezifischer Reaktivität gegen Streptococcus pneumoniae erhalten wurde. Das Hybridoma AMSP-2, welches den monoklonalen Antikörper produziert, der spezifisch gegen Streptococcus pneumoniae ist, wurde hinterlegt beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, the Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of International Trade and Industry, Japan, am 28. Juli 1999 mit der Hinterlegungs-Nummer FERM BP-6807.
  • Tabelle 2
    Figure 00440001
  • Beispiel 7
  • Klonierung von Genen des ribosomalen Proteins L7/L12 von Neisseria gonorrhoeae, Massenexpression in Escherichia coli und Reinigung desselben Proteins und Herstellen eines monoklonalen Antikörpers gegen dasselbe Proteins
  • Nach Animpfung einer geeigneten Menge von Neisseria gonorrhoeae-Stamm IID821 (erhalten von Tokyo University School of Medicine Laboratories) in einem Schokoladeagar Kulturmedium wurde der Stamm für 24 Stunden in einem CO2-Inkubator unter Bedingungen von 37°C und 5,0% CO2 kultiviert. Die Kolonien, die gewachsen sind, wurden in einem TE-Puffer auf eine Endkonzentration von etwa 5 × 109 CFU/ml suspendiert. Etwa 1,5 ml dieser Suspension wurden in ein Mikrozentrifugationsröhrchen überführt und für 2 Minuten bei 10.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Das Sediment wurde in 567 μl TE-Puffer resuspendiert. Dann wurden 30 μl 10% SDS und 3 μl 20 mg/ml Proteinkinase K-Lösung zugegeben und gründlich gemischt. Die Suspension wurde für eine weitere Stunde bei 37°C inkubiert.
  • Als nächstes, nach der Zugabe von 80 μl 10% Cetyltrimethylammoniumbromid/0,7 M NaCl-Lösung und gründlicher Durchmischung des Produkts wurde es für 10 Minuten bei 65°C inkubiert. Als nächstes wurden 700 μl Chloroform/Isoamylalkohollösung bei einem Volumenverhältnis von 24:1 zugegeben und gut gerührt. Die Lösung wurde für 5 Minuten bei 12.000 rpm (während sie bei 4°C gehalten wurde) unter Verwendung einer Mikrozentrifugationsvorrichtung zentrifugiert und die wässrige Fraktion wurde in ein neues Mikroröhrchen überführt. Isopropanol wurde zu der Fraktion mit 0,6 -fachem Volumen zugegeben und das Röhrchen wurde heftig geschüttelt, um ein Sediment der DNA zu bilden. Das weiße DNA-Sediment wurde mit einem Glasstab abgeschöpft und in ein weiteres Mikro zentrifugationsröhrchen überführt, enthaltend 1 ml 70% Ethanol (gekühlt auf –20°C).
  • Als nächstes wurde das Produkt für 5 Minuten bei 10.000 rpm zentrifugiert und der Überstand vorsichtig entfernt. Dann wurde 1 weiterer ml 70% Ethanol zugegeben und das Produkt für 5 weitere Minuten zentrifugiert.
  • Sobald der Überstand entfernt worden war, wurde das Sediment in 100 μl TE-Puffer gelöst, um die DNA-Lösung zu erhalten. Die Konzentration der genomischen DNA-Lösung wurde quantitativ bestimmt in Übereinstimmung mit E5, spektrophotometrischer Bestimmung der Menge von DNA oder RNA, "Molecular cloning: A laboratory manual," 1989, Eds. Sambrook, J., Fritsch, E.F., und Maniatis, qT., Cold Spring Harbor Laboratory Press.
  • PCR wurde durchgeführt unter Verwendung von 10 ng dieser genomischen DNA. PCR wurde durchgeführt unter Verwendung von Taq-Polymerase (Takara Co., Ltd., Code R001A). Dann wurden 5 μl eines Puffers zu dem Enzym zugegeben, 4 μl einer dNTP-Mischung zu dem Enzym zugegeben und 200 pmol von jeweils synthetischem Oligonucleotid E, gezeigt in Sequenz No. 15 der Sequenztabelle, und synthetischem Oligonucleotid F, gezeigt in Sequenz No. 16 der Sequenztabelle, welche entworfen wurden, basierend auf der DNA-Sequenz des ribosomalen Proteins L7/L12 aus Neisseria gonorrhoeae, erhalten aus Internet Information (Oklahoma University, N. Gonorrhoeae Genome Project, disclosed Genomic DNA data), wurden wegen der Ähnlichkeit der DNA-Sequenz des ribosomalen Proteins L7/L12 von anderen Bakterien, zu dem Enzym zugegeben, um das Endvolumen auf 50 μl zu bringen.
  • Diese Mischung wurde 5 Zyklen mit einem TaKaRa PCR Thermal Cycler 480 unterworfen, für 1 Minute bei 95°C, 2 Minuten bei 50°C und 3 Minuten bei 72°C und wurde dann 25 Zyklen unterworfen für 1 Minute bei 95°C, 2 Minuten bei 60°C und 3 Minuten bei 72°C. Elektrophorese wurde durchgeführt in 1,5% Agarosegel unter Verwendung von einigem von diesem PCR-Produkt. Dieses Produkt wurde anschließend mit Ethidiumbromid (Nihon Gene Co., Ltd.) gefärbt und unter ultravioletten Strahlen beobachtet, um die Amplifikation von etwa 400 by cDNR zu bestätigen. Nach Verdauungsbehandlung mit Restriktionsendonukleasen BamHI und XhoI wurde Elektrophorese in 1,5% Agarosegel durchgeführt und Färbung mit Ethidiumbromid wurde durchgeführt. Eine etwa 370 bp-Bande wurde aus dem Gel ausgeschnitten. Diese Bande wurde mit Suprec01 (Takara Co., Ltd.) gereinigt und dann in ein pGEX-4T-1 (Pharmacia) eingeführt, welches ein kommerziell erhältlicher Vektor ist. Tatsächlich wurden der Vektor pGEX-4T-1 und die DNA bei einem Molverhältnis von 1:3 zusammengemischt und DNA wurde in den Vektor eingeführt mit T4-DNA-Ligase (Invitrogen Co.). Der Vektor p-GEX-4T-1, in welchen die DNA eingeführt worden war, wurde genetisch in Escherichia coli One-Shot Competent Cells (Invitrogen Co., Ltd.) eingeführt und anschließend in einer Platte von L-Nährmedium (Takara Co., Ltd.) halbfester Kulturplatte, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin (Sigma), angeimpft. Die Platte wurde dann bei 37°C für 12 Stunden beiseite gestellt und die Kolonien, die gewachsen waren, wurden zufällig ausgewählt und in 2 ml L-Nährmedium flüssiges Kulturmedium, enthaltend die gleiche Konzentration von Ampicillin, angeimpft. Schüttelkultivierung wurde bei 37°C für 8 Stunden durchgeführt und das Bakterium wurde gewonnen und das Plasmid wurde abgetrennt unter Verwendung von Wizard Miniprep in Übereinstimmung mit der beigefügten Literatur. Das Plasmid wurde geschnitten mit Restriktionsendonuklease Bam-HI/XhoI. Die Einfügung des PCR-Produkts wurde durch Ausschneiden von etwa 370 by DNA bestätigt. Die Basensequenz der DNA, die eingefügt worden war, wurde unter Verwendung des genannten Klons bestimmt.
  • Bestimmung der Basensequenz des eingefügten DNA-Fragments wurde durchgeführt unter Verwendung des Fluoreszenz-Sequenzers von Applied Biosystems. Die Sequenzprobe wurde hergestellt unter Verwendung von PRISM, Ready Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). Zuerst wurden 9,5 Reaktionsstocklösung, 4,0 μl T7 Promoter-Primer mit 0,8 pmol/μl (Gibco BRL) und 6,5 μl Templat-DNA mit 0,16 μg/μl zur Sequenzierung in ein Mikroröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 0,5 ml zugegeben und gemischt. Nach Überschichtung mit 100 μl Mineralöl, wurde PCR-Amplifikation für 25 Zyklen durchgeführt, wobei 1 Zyklus aus 30 Sekunden bei 96°C, 15 Sekunden bei 55 °C und 4 Minuten bei 60°C bestand. Das Produkt wurde für 5 Minuten bei 4°C gehalten. Nachdem die Reaktion beendet war, wurden 80 μl sterilisiertes reines Wasser zugegeben und gerührt. Das Produkt wurde abzentrifugiert und die wässrige Lösung wurde dreimal mit Phenol-Chloroform extrahiert. 10 μl 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 300 μl Ethanol wurden zu 100 μl wässriger Schicht zugegeben und gerührt. Das Produkt wurde dann für 15 Minuten bei Raumtemperatur und 14.000 rpm zentrifugiert und das Sediment wurde gewonnen. Sobald das Sediment mit 75% Ethanol gewaschen war, wurde es unter Vakuum für 2 Minuten getrocknet, um die Sequenzierungsprobe zu erhalten. Die Sequenzierungsprobe wurde in Formamid, enthaltend 4 μl 10 mM EDTA gelöst und für 2 Minuten bei 90°C denaturiert. Dies wurde dann in Eis gekühlt und dem Sequenzieren überführt. Einer der 5 Klone, die erhalten wurden, hatte Homologie zu der Sequenz mit der Probe, die für PCR verwendet wurde. Zusätzlich wurden DNA-Sequenzen mit extremer Ähnlichkeit zu der Gensequenz des Gens des ribosomalen Proteins L7/L12 der anderen Mikroorganismen, zum Beispiel Haemophilus influenzae, entdeckt. Die gesamte Basensequenz und die korrespondierende Aminosäuresequenz der strukturellen Geneinheit sind wie in Sequenz No. 21 und No. 22 der Sequenztabelle gezeigt. Dieses Genfragment co diert klar für das Gen des ribosomalen Proteins L7/L12 aus Neisseria gonorrhoeae.
  • Ribosomales Neisseria gonorrhoeae-GST-Fusionsprotein L7/L12, hergestellt durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 2, wurde unter Verwendung des ribosomalen Neisseria gonorrhoeae-GST-Fusionsprotein L7/L12-Expressionsvektors, der auf diese Art konstruiert wurde, erhalten.
  • Des Weiteren wurde Hybridomastamm GCRB-3, welcher monoklonalen Antikörper gegen ribosomales Protein L7/L12 aus Neisseria gonorrhoeae produziert, in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Beispiel 3 erhalten.
  • Beispiel 8
  • Reaktion von monoklonalem Antikörper, welcher mit ribosomalem Protein L7/L12 von Neisseria gonorrhoeae, mit Neisseria gonorrhoeae und anderen Mikroorganismen reagiert
  • Monoklonaler Antikörper wurde in Übereinstimmung mit Standardmethoden unter Verwendung der positiven Hybridomazellen GCRB-3, die wie vorher beschrieben erhalten wurden, hergestellt und gewonnen.
  • Im wesentlichen wurden 5 × 106 Zellen (in PBS), welche unter Verwendung von RPMI 1640-Kulturmedium (enthaltend 10% FCS) subkultiviert worden waren, wurden intraperitoneal in Balb/C-Mäuse injiziert, welche 2 Wochen zuvor 0,5 ml Pristan intraperitoneal injiziert bekamen. Aszites wurde 3 Wochen später gewonnen und der Zentrifugationsüberstand wurde erhalten.
  • Die Lösung, enthaltend den Antikörper, die erhalten wurde, wurde auf einer Protein-A-Säule (5 ml Bett, Pharmacia) adsorbiert und mit dem 3-fachen Bettvolumen an PBS gewaschen. Anschließend, eluiert mit Citratpuffer bei pH 3, wurde die Antikörperfraktion gewonnen und der monoklonale Antikörper, der durch jedes Hybridoma produziert wurde, wurde erhalten. Der monoklonale Antikörper, erhalten aus dem GCRB-3-Hybridoma, wurde im ELISA verwendet.
  • Das Sandwich-Assay-Verfahren wurde verwendet, um den monoklonalen Antikörper zu bewerten. Der monoklonale Antikörper, welcher hergestellt wurde, wurde durch chemische Bindung an Peroxidase als ein Enzym-gelabelter Antikörper verwendet. D.h., Enzym-Labeling wurde durchgeführt in Übereinstimmung mit dem Verfahren aus "Analytical Biochemistry" 132 (1983), 68-73 mit dem Reagens S-Acetylthioessigsäure-N-hydroxysuccinimid zur Bindung unter Verwendung von Meerrettichperoxidase (Sigma Grade VI). Unter Verwendung der ELISA-Reaktion wurde eine Lösung von kommerziell erhältlichem polyklonalem anti-Neisseria gonorrhoeae Antikörper in PBS, enthaltend 0,05% Natriumazid (Virostat, Kaninchen) auf eine Konzentration von 10 μg/ml verdünnt und je 100 μl in eine separate 96-Well-Platte geschüttet und über Nacht bei 4°C adsorbiert.
  • Nach Entfernung des Überstands wurden 200 μl 1% Rinderserumalbumin-Lösung (in PBS) zugegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt und blockiert. Der Überstand wurde entfernt und das Produkt wurde mit Waschlösung (0,02 Tween 20, PBS) gewaschen. 100 μl Antigenlösung, welche durch Zugabe von Triton X-100 zu Kulturlösungen von jeder Spezies von Mikroorganismen auf eine Konzentration von 0,3% und anschließender Extraktion der Lösung für 5 Minuten bei Raumtemperatur erhalten wurde, wurden zu dieser zugegeben und für 2 Stunden bei Raumtemperatur umge setzt. Der Überstand wurde entfernt und das Produkt wurde weiter mit Waschlösung gewaschen. Dann wurden 100 μl Peroxidasegelabeltes anti-ribosomales Protein L7/L12-Antikörperlösung mit 5 μg/ml zugegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt. Der Überstand wurde entfernt und das Produkt wurde mit Waschlösung gewaschen. TMB (KPL)-Lösung wurde zugegeben, je 100 μl, und für 20 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach Färbung wurden 100 μl 1 N Schwefelsäure zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Absorption bei 450 nm wurde bestimmt.
  • Als ein Ergebnis, wie in Tabelle 3 gezeigt, ist es klar, dass, wenn monoklonaler Antikörper, erhalten aus Hybridoma GCRB-3, als der Enzym-gelabelte Antikörper verwendet wurde, alle Stämme von Neisseria gonorrhoeae, die getestet wurden, bei einer Empfindlichkeit von 106 Zellen/ml nachgewiesen wurden, während die Reaktivität von anderen Spezies, die zu der Gattung Neisseria und anderen Mikroorganismen gehören, nicht nachgewiesen werden konnten, sogar bei hohen Konzentrationen von 108 Zellen/ml und deshalb kann Antikörper mit spezifischer Reaktivität gegen Neisseria gonorrhoeae durch Verwendung von monoklonalem Antikörper gegen ribosomales Protein L7/L12 erhalten werden.
  • Tabelle 3
    Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • Beispiel 9
  • Gewinnung von monoklonalem anti-ribosomalem Protein L7/L12 Antikörper spezifisch gegen Gattung Neisseria
  • Nach Animpfung einer geeigneten Menge von Neisseria gonorrhoeae-Stamm IID821 (erhalten von Tokyo University School of Medicine Laboratories) in einem Schokolade-Agar Kulturmedium wurde der Stamm für 24 Stunden in einem CO2-Inkubator unter Bedingungen von 37°C und 5,0% CO2 kultiviert. Die gewachsenen Kolonien wurden in einem TE-Puffer auf eine Endkonzentration von etwa 5 × 109 CFU/ml suspendiert. Etwa 1,5 ml dieser Suspension wurden in ein Mikro zentrifugationsröhrchen überführt und für 2 Minuten bei 10.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Das Sediment wurde in 567 TE-Puffer resuspendiert. Dann wurden 30 μl 10% SDS und 3 μl 20 mg/ml Proteinase K-Lösung zugegeben und gründlich gemischt. Die Suspension wurde für eine weitere Stunde bei 37°C inkubiert. Als nächstes, nach der Zugabe von 80 μl 10% Cetyltrimethylammoniumbromid/0,7 M NaCl-Lösung und gründlicher Mischung des Produkts wurde für 10 Minuten bei 65°C inkubiert. Als nächstes wurden 700 μl Chloroform-Isoamylalkohol-Lösung bei einem Volumenverhältnis von 24:1 zugegeben und gut gerührt.
  • Die Lösung wurde für 5 Minuten bei 10.000 rpm unter Verwendung einer Mikrozentrifugationsvorrichtung zentrifugiert (während sie bei 4°C gehalten wurde) und die wässrige Fraktion wurde in ein neues Mikroröhrchen transferiert. Isopropanol wurde zu der Fraktion mit 0,6-fachem Volumen zugegeben, und das Röhrchen wurde heftig geschüttelt, um ein Sediment der DNA zu bilden. Das weiße DNA-Sediment wurde mit einem Glasstab abgeschöpft und in ein weiteres Mikrozentrifugationsröhrchen überführt, enthaltend 1 ml 70% Ethanol (gekühlt auf –20°C).
  • Als nächstes wurde das Produkt für 5 Minuten bei 10.000 rpm zentrifugiert und der Überstand wurde vorsichtig entfernt. Dann wurde 1 weiterer ml 70% Ethanol zugegeben und das Produkt für 5 weitere Minuten zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt wurde, wurde das Sediment in 100 μl TE-Puffer gelöst, um die DNA-Lösung zu erhalten. Die Konzentration der genomischen DNA-Lösung wurde quantitativ bestimmt in Übereinstimmung mit E5, Spectrophotometric determination of the amount of DNA oder RNA, "Molecular cloning: A laboratory manual," 1989, Eds. Sambrook, J., Fritsch, E.F., und Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press.
  • PCR wurde durchgeführt unter Verwendung von 10 ng dieser genomischen DNA. Taq-Polymerase (Takara Co., Ltd., Code R001A) wurde für PCR verwendet. Dann wurden 5 μl Puffer zu dem Enzym zugegeben, 4 μl dNTP-Mischung zu dem Enzym zugegeben und 200 pmol von jeweils synthetischem Oligonucleotid E, gezeigt in Sequenz No. 15 der Sequenztabelle, und synthetischem Oligonucleotid F, gezeigt in Sequenz No. 16 der Sequenztabelle, welche entworfen wurden, basierend auf der DNA-Sequenz des ribosomalen Proteins L7/L12 aus Neisseria gonorrhoeae, erhalten aus Internet Information (Oklahoma University, N. Gonorrhoeae Genome Project, disclosed genome DNA data), wegen der Ähnlichkeit der DNA-Sequenz des mit ribosomalen Proteins L7/L12 mit anderen Bakterien, wurden zu dem Enzym zugegeben, um das Endvolumen auf 50 μl zu bringen.
  • Diese Mischung wurde 5 Zyklen mit einem TaKaRa PCR Thermal Cycler 480 unterworfen, für 1 Minute bei 95°C, 2 Minuten bei 50°C und 3 Minuten bei 72°C und dann 25 Zyklen unterworfen für 1 Minute bei 95°C, 2 Minuten bei 60°C und 3 Minuten bei 72°C. Elektrophorese wurde in 1,5% Agarosegel unter Verwendung von einigen von diesem PCR-Produkt durchgeführt. Dieses Produkt wurde dann mit Ethidiumbromid (Nikon Gene Co., Ltd.) gefärbt und unter ul-travioletten Strahlen beobachtet, um die Amplifikation von etwa 400 by cDNA zu bestätigen. Nach Verdauungsbehandlung mit Restriktionsendonukleasen BamHI und XhoI wurde Elektrophorese in 1,5% Agarosegel durchgeführt und Färben mit Ethidiumbromid wurde durchgeführt. Eine etwa 370 bp-Bande wurde aus dem Gel ausgeschnitten. Diese Bande wurde mit Suprec01 (Takara Co., Ltd.) gereinigt und dann in pGEX-6P-1 (Pharmacia) eingefügt, welches ein kommerziell erhältlicher Vektor ist. Der gleiche Vektor kann als ein Expressionsvektor für das gewünschte Molekül dienen, welches fusioniertes Protein mit GST-Protein exprimieren kann, durch Einfügung des gewünschten Genfragments in die geeignete Restriktionsendonukleasenregion. Tatsächlich wurde Vektor pGEX-6P-1 und die vorhergenannte DNA bei einem Molverhältnis von 1:5 zusammengemischt und DNA wurde in den Vektor mit T4 DNA-Ligase (Invitrogen Co.) eingefügt. Der Vektor pGEX-6P-1, in welchen DNA eingefügt worden war, wurde genetisch in Escherichia coli One-Shot-Competent Cells (Invitrogen Co., Ltd.) eingefügt und dann in einer Platte von L-Kulturmedium (Takara Co., Ltd.) eingeimpft, welche 50 μg/ml Ampicillin (Sigma) enthält. Diese Platte wurde dann bei 37°C für 12 Stunden beiseite gestellt und die Kolonien, die wuchsen, wurden zufällig ausgewählt und in 2 ml L-Nährmedium Flüssigkulturmedium, enthaltend die gleiche Konzentration an Ampicillin, eingeimpft. Schüttelkultivierung wurde bei 37°C für 8 Stunden durchgeführt und die Bakterien wurden gewonnen und das Plasmid wurde abgetrennt unter Verwendung von Wizard Miniprep in Übereinstimmung mit der beigefügten Literatur. Das Plasmid wurde mit Restriktionsendonuklease BamHI/XhoI geschnitten. Die Einfügung des genannten PCR-Produkts wurde durch Ausschneiden von etwa 370 by DNA bestätigt. Die Basensequenz der DNA, welche eingefügt worden war, wurde unter Verwendung des Klons bestimmt.
  • Bestimmung der Basensequenz des eingefügten DNA-Fragments wurde durchgeführt unter Verwendung des Fluoreszenz-Sequenzers von Applied Biosystems. Die Sequenzprobe wurde hergestellt unter Verwendung von PRISM, Ready Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). Zuerst wurden 9,5 μl Reaktionsstocklösung, 4,0 μl T7 Promoter-Primer bei 0,8 pmol/μl (Gibco BRL) und 6,5 μl Templat-DNA mit 0,16 μg/μl zur Sequenzierung zu einem Mikroröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 0,5 ml zugegeben und gemischt. Nach Überschichtung mit 100 μl Mineralöl wurde PCR-Amplifikation durchgeführt für 25 Zyklen, wobei ein Zyklus aus 30 Sekunden bei 96°C, 15 Sekunden bei 55°C und 4 Minuten bei 60°C bestand. Das Produkt wurde dann bei 4°C für 5 Mi nuten gehalten. Nachdem die Reaktion beendet war, wurden 80 μl sterilisiertes reines Wasser zugegeben und gerührt. Das Produkt wurde zentrifugiert und die wässrige Schicht wurde 3 mal mit Phenol-Chloroform extrahiert. 10 μl 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 300 μl Ethanol wurden zu 100 μl der wässrigen Lösung zugegeben und gerührt. Das Produkt wurde dann für 15 Minuten bei Raumtemperatur und 14.000 rpm zentrifugiert und das Sediment wurde gewonnen. Sobald das Sediment mit 75% Ethanol gewaschen war, wurde es unter Vakuum für 2 Minuten getrocknet, um die Sequenzierungsprobe zu erhalten. Die Sequenzierungsprobe wurde in Formamid, enthaltend 4 μl 10 mM EDTA, gelöst und für 2 Minuten bei 90°C denaturiert. Die wurde dann in Eis gekühlt und der Sequenzierung übergeben.
  • Einer der 4 Klone, die erhalten wurden, hatte Homologie mit der Sequenz mit der Sonde, die für PCR verwendet wurde. Zusätzlich wurden DNA-Sequenzen mit extremer Ähnlichkeit zu der Gensequenz des Gens des ribosomalen Proteins L7/L12 der anderen Mikroorganismen, zum Beispiel Haemophilus influenzae, entdeckt. Die gesamte Basensequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz der strukturellen Geneinheit sind wie in Sequenz ID No. 21 und No. 22 der Sequenztabelle gezeigt. Dieses Genfragment codiert deutlich für Neisseria gonorrhoeae ribosomales Protein L7/L12.
  • 50 ml Escherichia coli, in welche Expressionsvektor eingefügt worden war, wurden über Nacht in einer zweifachen Konzentration YT-Medium bei 37°C kultiviert. Dann wurden 450 ml der zweifachen Konzentration YT-Medium bei 37°C für 1 Stunde erhitzt. 50 ml der Escherichia coli-Lösung, welche über Nacht kultiviert worden war, wurde in 450 ml des vorher genannten Mediums gegeben. Nach Kultivierung für 1 Stunde bei 37°C wurden, 100 μl 500 mM IPTG zugegeben und für 4 Stunden bei 25°C kultiviert. Das Produkt wurde dann gewonnen und jeweils 250 ml in ein Zentrifugations röhrchen gegeben und für 20 Minuten bei 5.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und in je 25 ml 50 mM Tris-HCl bei einem pH von 7,4 und Lysis-Puffer, enthaltend 25% Sucrose, gelöst.
  • Weiterhin wurden 1,25 ml 10% NP-40 und 125 μl 1 M MgCl2 zugegeben und in ein Plastikröhrchen überführt. Ultraschallbehandlung wurde unter Eiskühlung 5 mal für 1 Minute durchgeführt. Das Produkt wurde für 15 Minuten bei 12.000 rpm zentrifugiert und der Überstand wurde gewonnen.
  • Als nächstes wurde der Überstand auf einer Glutathionsepharosesäule (hergestellt durch Pharmacia), die mit PBS konditioniert wurde, adsorbiert. Dann wurde die Säule mit dreifachem Bettvolumen PBS gewaschen. Die Eluierung wurde mit 50 mM Tris-HCl bei einem pH von 8,0, enthalted 10 mM Glutathion durchgeführt. Der Proteingehalt in der Fraktion wurde durch die Pigmentbindungsmethode (Bradford Method; BioRad Co.) bestimmt und die Hauptfraktion wurde gesammelt. Die Hauptfraktion wurde dreimal gegen 3 1 PBS dialysiert.
  • 1 ml eines Spaltungspuffers enthaltend 500 mM Tris-HCl (pH 7,0), 1,5 M NaCl, 10 mM EDTA und 10 mM DTT wurden zu 10 ml einer 1 mg/ml-Lösung des resultierenden ribosomalen GST-Fusionsproteins L7/L12 zugegeben. 100 μl von 2 u/μl PreScission Protease (hergestellt durch Pharmacia Company) wurden weiter zugegeben und bei 4°C umgesetzt, um die GST-Einheit von dem ribosomalen Protein L7/L12 abzutrennen.
  • Die Reaktionslösung wurde durch eine Glutathion-Sepharosesäule geleitet, welche mit PBS konditioniert worden war. Die Lösung, die aus der Säule kam, wurde gewonnen. Ein Bettvolumen PBS wurde durchgeleitet und ebenfalls gewonnen. Die Reinheit des gereinig ten ribosomalen Proteins L7/L12, das erhalten wurde, wurde durch Elektrophorese auf etwa 90% bestätigt, was zeigt, dass eine ausreichende Reinheit für ein Immunogen garantiert werden konnte.
  • Zuerst wurden 100 μg Proteinantigen von ribosomalem Protein L7/L12 aus Neisseria gonorrhoeae in 200 μl PBS gelöst und dann wurden 200 μl Freund's Komplettadjuvans zugegeben und gemischt und Emulgierung wurde durchgeführt. 200 μl wurden intraperitoneal injiziert, um Mäuse zu immunisieren. Dann wurde das gleiche Emulsionsantigen nach 2 Wochen, nach 4 Wochen und nach 6 Wochen intraperitoneal injiziert. Eine zweifache Konzentration Antigenemulsion wurde weiter nach 10 Wochen und nach 14 Wochen intraperitoneal injiziert. Die Milz wurde 3 Tage nach der letzten Immunisierung herausgeschnitten und der Zellfusion unterzogen.
  • Nach gründlichem Mischen von 2 × 108 Myeloma-Zellen pro 108 Milzzellen aus Mäusen, welche aseptisch gewonnen worden waren, in einem Glasrohr, wurde die Mischung für 5 Minuten bei 1.500 rpm zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Die Zellen wurden gründlich gemischt.
  • Die Myeloma-Zellen, die für die Zellfusion verwendet wurden, wurden durch Kultivierung von Zellstamm NS-1 mit einem RPMI 1640-Kulturmedium, enthaltend 10% FCS erhalten, Kultivierung dieses Produkts begann 2 Wochen vor der Zellfusion unter Verwendung eines RPMI 1640 Mediums, enthaltend 0,13 mM Azaguanin, 0,5 μg/ml MC-210 und 10% FCS für 1 Woche und dann weitere Kultivierung des Zellstamms für 1 Woche mit einem RPMI 1640-Medium, enthaltend 10% FCS. 30 ml RPMI 1640-Kulturmedium, 50 ml, welches bei 37°C gehalten worden war, wurde zu der gemischten Zellprobe gegeben und bei 1.500 rpm zentrifugiert. Nach Entfernung des Überstandes wurden 1 ml 50% Polyethylenglycol, welches bei 37°C gehalten worden war, zugegeben und für 2 Minuten gerührt. 10 ml RPMI 1640-Medium, gehalten bei 37°C, wurde zugegeben und die Lösung wurde für etwa 5 Minuten durch Einsaugen und Ausblasen aus einer sterilen Pipette heftig gemischt.
  • Nach Zentrifugation für 5 Minuten bei 1.000 rpm und Entfernung des Überstandes wurden 30 ml HAT-Kulturmedium zugegeben, um die Zellenkonzentration auf 5 × 106 Zellen/ml zu bringen. Diese Mischung wurde gerührt, bis sie gleichmäßig war, und dann je 0,1 ml in eine 96-Well-Kulturplatte geschüttet und bei 37°C unter 7% CO2 kultiviert . HAT-Medium wurde zugegeben, je 0,1 ml, an Tag 1 und bei Woche 1 und Woche 2.
  • Dann wurden die Zellen, die den gewünschten Antikörper produziert hatten, durch ELISA bewertet. Lösungen von ribosomalem Protein L7/L12 aus Neisseria gonorrhoeae, gelöst in PBS, enthaltend 0,05% Natriumazid, wurden auf 10 μg/ml verdünnt und je 100 μl in separate 96-Well-Platten geschüttet und über Nacht bei 4°C adsorbiert. Nach Entfernung des Überstandes wurden 200 μl 1% Rinderserumalbuminlösung (in PBS) zugegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt und blockiert. Der Überstand wurde entfernt und das Produkt wurde mit einer Waschlösung (0,02 Tween 20, PBS) gewaschen. 100 μl einer Kulturlösung von Fusionszellen wurde zugegeben und für 2 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Der Überstand wurde entfernt und das Produkt wurde weiter mit einer Waschlösung gewaschen. Dann wurden 100 μl einer Peroxidase-gelabelten Ziegen-anti-Maus-Antikörperlösung mit 50 ng/ml zugegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt. Der Überstand wurde entfernt und das Produkt wurde mit einer Waschlösung gewaschen. TMB (KPL)-Lösung wurde zugegeben, je 100 μl, und für 20 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach der Färbung wurden 100 μl 1 N Schwefelsäure zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Die Absorption bei 450 nm wurde bestimmt.
  • Als ein Ergebnis wurden positive Wells, die mit ribosomalem Protein L7/L12 reagiert hatten, nachgewiesen, was die Anwesenheit des Antikörpers gegen ribosomales Protein L7/L12 bestätigt.
  • Dafür wurden die Zellen in den positiven Wells gewonnen und mit HAT-Medium in einer 24-Well-Plastikplatte kultiviert. Das fusionierte Medium, das kultiviert worden war, wurde mit einem HT-Medium auf eine Zellenzahl von etwa 20 Zellen/ml verdünnt. Dann wurden 50 μl des Mediums mit 106 sechs Wochen alten Maus-Thyroid-Zellen, suspendiert in dem HT-Medium, in einer 96-Well-Kulturplatte gemischt. Die Zellen wurden für 2 Wochen bei 37°C unter der Bedingungen von 7% CO2 kultiviert. Der Antikörper-Titer in dem Kulturüberstand wurde durch das vorhergenannte ELISA-Verfahren bestimmt und die Zellen, die eine positive Reaktion mit ribosomalem Protein L7/L12 zeigten, wurden gewonnen. Weiter wurden dasselbe Verdünnungs- und Klonierungsverfahren wiederholt, um eine Gesamtzahl von 4 Klonen von Hybridoma-AMGC-5 bis AMGC-8 zu erhalten.
  • Ein monoklonaler Antikörper wurde gemäß Standard-Verfahren hergestellt und gewonnen unter Verwendung der, wie vorher beschrieben, erhaltenen positiven Hybridoma-Zellen,.
  • Spezieller wurden in RPMI 1640-Medium (enthaltend 10% FCS) subkultivierte Zellen in serumfreien Medium auf etwa 2 × 105 Zellen/ml, 3,3 × 105 Zellen/ml und 5 × 105 Zellen/ml in 25 cm2 Kulturkolben verdünnt und die Gesamtmenge wurde auf 5 ml gebracht. Nachdem die Zellen für 3 bis 5 Tage in 7% CO2 bei 37°C gewachsen waren wurden Kolben, die die geringste Anzahl an Originalzellen enthielten, unter den Kolben ausgewählt, in welchen Zellen gewachsen waren. Das gleiche Verfahren wurde wiederholt, bis die auf 2 × 105 Zellen/ml verdünnten Zellen in 3 bis 4 Tagen auf 2 × 106 Zellen/ml gewachsen waren, wodurch die Zellen an das serum freie Medium angepasst wurden. Als nächstes wurde Klonierung in einer 96-Well-Platte für Bakterienkultivierung durchgeführt, um Zellen auszuwählen, die das schnellste Wachstum aufweisen und den höchsten Antikörper-Titer. Die ausgewählten Zellen wurden in einer 24-Well-Platte gezüchtet und mit einem serumfreien Medium in einem 25 cm2-Kulturkolben auf eine Konzentration von etwa 2 × 105 Zellen/ml verdünnt und das Gesamtvolumen wurde auf 10 ml gebracht. Nach Inkubation für 3 bis 4 Tage in 7% CO2 bei 37°C auf eine Konzentration von 1 × 106 Zellen/ml, wurde die Nährlösung, 100 ml, 1 × 106 Zellen/ml, in eine Flasche zur Massenkultivierung überführt, welche in der gleichen Weise in einem 75 cm2 Kolben gezüchtet wurden. 100 ml eines serumfreien Mediums wurde zu der Mischung zugegeben und bei 37°C für 2 Tage unter Rühren inkubiert. 200 ml des serumfreien Mediums wurden wiederum zugegeben, und die Mischung wurde für weitere 2 Tage inkubiert. Die Nährlösung wurde in 4 Aliquote aufgeteilt, ein Volumenteil serumfreies Medium wurde zu jeder Portion zugegeben, gefolgt von Inkubation für 2 Tage. Nach weiterer Zugabe von 400 ml des serumfreien Mediums wurde die Nährlösung für 6 Tage inkubiert. Die Nährlösung wurde gesammelt und bei 10.000 rpm für 15 Minuten zentrifugiert, um einen Kulturüberstand, enthaltend den Zielantikörper, zu erhalten. Nach Zugabe von Natriumazid auf eine Endkonzentration von 0,1% wurde der Kulturüberstand bei 4°C gelagert. 100 ml des Überstandes, enthaltend den Antikörper, wurden 5-fach mit PBS verdünnt und auf einer Protein-G-Säule (5 ml Bett, Pharmacia) adsorbiert und mit dem dreifachen Bettvolumen an PBS gewaschen. Nach Eluierung mit Citratpuffer, bei pH 3, wurde die Antikörperfraktion gewonnen und monoklonaler Antikörper, hergestellt durch jedes Hybridoma, wurde erhalten.
  • Die monoklonalen Antikörper, die auf die vier Hybridoma-Klone zurückgehen, wurden gemäß dem OIA-Verfahren, beschrieben in In ternationaler Patentanmeldung Japanische Offenlegungsschrift No. 509565/1995 bewertet.
  • Spezieller umfasst das OIA-Verfahren die Herstellung eines reaktiven Substrats durch Reaktion eines Antikörpers, zum Einfangen auf einem Siliconwafer mit einer dünnen Filmschicht von Siliziumnitrid, was dieses Substrat dazu bringt, mit einem Antigen zu reagieren, welches ein Extrakt von Mikroorganismen ist, für einen vorherbestimmten Zeitraum, was das eingefangene Antigen dazu bringt, mit einem Antikörper zu reagieren (ein Amplifizierungsreagens), welches ein Enzym-gelabelter Antikörper ist und schließlich Zugabe einer Substratlösung, um ein dünnes Filmpräzipitat zu produzieren. Die Antigen-Antikörper-Reaktion kann visuell bewertet werden durch ein Maß an Lichtinterferenzfarbe, hergestellt in dem Präzipitat.
  • Die Zubereitung des monoklonalen Antikörpers wurde als Capture-Antikörper verwendet zur Immobilisierung auf einem Siliziumwafer mit einer dünnen Filmschicht von Siliziumnitrid mit dem OIA-Verfahren. Außerdem wurde monoklonaler Peroxidase-gelabelter AMGC-1-Antikörper, welcher nicht-spezifisch mit ribosomalen Proteinen L7/L12-Protein von einer Vielzahl von Mikroorganismen reagiert, beschrieben im Referenzbeispiel, als der Nachweisantikörper verwendet. Das heißt, Enzym-Labeln wurde durchgeführt in Übereinstimmung mit dem Verfahren in "Analytical Biochemistry" 132 (1983), 68-73 mit dem Reagens S-Acetylthioessigsäure-N-hydroxysuccinimid zum Binden unter Verwendung von Meerrettichperoxidase (Sigma Grade VI).
  • Bei der OIA-Reaktion wurde ein monoklonaler Antikörper in einem PBS, enthaltend 0,05 Natriumazid, mit 0,1 M HEPES (pH 8,0) auf eine Konzentration von 10 μg/ml verdünnt und auf einen Siliziumwafer gebracht, welcher eine dünne Filmschicht von Siliziumni trid hat, je 50 μl, um für 30 Minuten bei Raumtemperatur zu reagieren, gefolgt von Waschen mit destilliertem Wasser und Verwendung. 15 μl Antigenlösung, welche durch Zugabe von 0,5% Triton X-100 zur Nährsuspension von verschiedenen Spezies von Mikroorganismen und anschließender Extraktion der Suspension für 5 Minuten bei Raumtemperatur erhalten worden war, wurde zu der Probe, die bei dem oben beschriebenen Verfahren erhalten wurde, zugegeben und für 10 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt. Dann wurden 15 μl von 20 μg/ml Peroxidase-gelabeltem AMGC-1 zugegeben und für 10 Minuten umgesetzt. Nach Waschen mit destilliertem Wasser wurde eine Substratlösung (KPL Co.) zugegeben, je 15 μl, und für 5 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt. Das Produkt wurde mit destilliertem Wasser gewaschen, um die Konzentration von Nachweissignalen als eine Intensität von Lichtinterferenz mit bloßem Auge zu beurteilen.
  • Als ein Ergebnis, wie in Tabelle 4 gezeigt, ist es klar, dass, wenn monoklonale Antikörper, stammend aus Hybridoma AMGC-8, als Capture-Antikörper verwendet wurden, alle Stämme der Gattung Neisseria, die getestet wurden, bei einer Empfindlichkeit von 108 Zellen/ml nachgewiesen wurden, während die Reaktivität von anderen Mikroorganismen nicht nachgewiesen werden konnte. Demzufolge wurde durch Verwendung des monoklonalen Antikörpers gegen ribosomales Protein L7/L12 bestätigt, dass der Antikörper mit spezifischer Reaktivität gegen die Gattung Neisseria erhalten wurde.
  • Tabelle 4
    Figure 00640001
  • Beispiel 10
  • Gewinnung eines polyklonalen Antikörpers, welcher spezifisch mit ribosomalem Protein L7/L12 aus Haemophilus influenzae reagiert, unter Verwendung einer Affinitätssäule mit immobilisiertem ribosomalen Protein L7/L12 Protein
  • Ein Zentrifugationsüberstand von Haemophilus influenzae Zellextrakt, welcher mit 0,5% Triton X-100 behandelt wurde, wurde als Antigen verwendet. Etwa 1,2 ml einer physiologischen Kochsalzlösung, enthaltend 100 μg Antigen, wurde durch Zugabe von 1,5 ml Freund's Adjuvans emulgiert. Die Emulsion wurde subkutan in vier SPF Japanische Weiße Kaninchen injiziert, um die Tiere zu immu nisieren. Die Kaninchen wurden 5 bis 6 mal immunisiert, einmal alle zwei Wochen, und der Antikörper-Titer wurde bestätigt.
  • Der Antikörper-Titer wurde durch das ELISA-Verfahren bestätigt. Lösungen von ribosomalem Protein L7/L12 aus Haemophilus influenzae, gelöst in PBS, enthaltend 0,05% Natriumazid, verdünnt auf 10 μg/ml, wurden in 96-Well-Platten geschüttet, je 100 μl, und über Nacht bei 4°C adsorbiert. Nach Entfernung des Überstandes wurden 200 μl 1% Rinderserumalbuminlösung (in PBS) zugegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt und blockiert. Der Überstand wurde entfernt und das Produkt wurde mit einer Waschlösung (0,02% Tween 20, PBS) gewaschen. 100 μl einer durch Verdünnung von normalem Kaninchenserum und immunisiertem Kaninchen-Antiserum erhaltenen Lösung wurden zugegeben und für 2 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Der Überstand wurde entfernt und das Produkt wurde weiter mit einer Waschlösung gewaschen. Dann wurden 100 μl einer Peroxidase-gelabelten Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörperlösung mit 50 ng/ml zugegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt. Der Überstand wurde entfernt und das Produkt wurde mit einer Waschlösung gewaschen. OPD-Lösung (Sigma Co.) wurde zugegeben, je 100 μl, und für 20 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach Färbung wurden 100 μl 1 N Schwefelsäure zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Absorption bei 492 nm wurde bestimmt.
  • Nach Bestätigung, dass der Antikörper-Titer zugenommen hatte, wurde eine große Menge von Blut gesammelt. Das Blut wurde von der Ohr-Arterie in einem Zentrifugationsröhrchen aus Glas gesammelt, für 1 Stunde bei 37°C und dann über Nacht bei 4°C stehengelassen. Die Mischung wurde bei 3.000 rpm für 5 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde gewonnen. Die resultierenden 4 Chargen an Antiserum wurden bei 4°C gelagert.
  • Als nächstes wurde eine Affinitätssäule mit immobilisiertem ribosomalen Protein L7/L12 aus Haemophilus influenzae und Neisseria gonorrhoeae hergestellt. HiTrap NHS-aktivierte Säule (1 ml, hergestellt von Pharmacia) wurde verwendet. Sofort nach dem Austausch der Säule mit 6 ml 1 mM HCl wurde 1 ml einer PBS-Lösung von ribosomalem Protein L7/L12, eingestellt auf 1 mg/ml geladen. Die Säule wurde für 15 Minuten bei 25°C stehengelassen. Die Prozedur wurde 5 mal wiederholt, wobei eine Gesamtmenge von 5 ml der PBS-Lösung von ribosomalem Protein L7/L12 zugegeben wurde. Dann wurden 6 ml Puffer A (0,5 M Ethanolamin, 0,5 M NaCl, pH 8,3), 6 ml Puffer B (0,1 M Essigsäure, 0,5 M NaCl, pH 4) und 6 ml Puffer A als Blockierungsreagens geladen. Nach Stehenlassen für 15 Minuten bei 25°C wurden weiter 6 ml Puffer B, 6 ml Puffer A und 6 ml Puffer B zugegeben. Die Mischung wurde dann mit 6 ml PBS äquilibiert.
  • Unter Verwendung der Affinitätssäule mit immobilisiertem ribosomalen Protein L7/L12 aus Haemophilus influenzae wurde der polyklonale Antikörper des resultierenden Antiserums gereinigt unter Verwendung des Überstandes von mit Triton X-100 behandelten Bakterien von Haemophilus influenzae als ein Antigen. Dieses Antiserum wurde zuerst mit PBS auf 5-faches Volumen verdünnt, durch einen 0,45 μm Filter geleitet, und dann dazu gebracht, auf der Säule absorbiert zu werden, die mit ribosomalem Protein L7/L12 aus Haemophilus influenzae immobilisiert wurde, bei einer Flussrate von 0,5 ml pro Minute. Nach Elution von der Säule mit 0,1 M Glycin (pH 2,1) und sofortiger Neutralisation mit 1 M Tris-HCl (pH 9,0) wurden die eluierten Fraktionen des Zielantikörpers mit dem ELISA-Verfahren gewonnen, dem gleichen wie dem Anti-Titer-Messverfahren. Diese Fraktionen wurden durch die Affinitätssäule geleitet, die mit dem ribosomalen Protein L7/L12 aus Neisseria gonorrhoeae immobilisiert war, welche mit PBS äquilibriert war, wodurch der Antikörper, der mit dem ribosomalen Protein L7/L12 aus Neisseria gonorrhoeae reagiert, adsorbiert wurde und die Fraktion, welche ohne Adsorption durchlief, gewonnen wurde.
  • Der polyklonale Antikörper, der auf diese Weise gereinigt wurde, wurde durch das gleiche OIA-Verfahren, wie in Beispiel 6, bewertet.
  • Der gereinigte Antikörper wurde als ein Capture-Antikörper für das OIA-Verfahren verwendet. Außerdem wurde der im Referenzbeispiel beschriebene monoklonale Peroxidase-gelabelte AMGC-1-Antikörper als der Nachweis-Antikörper verwendet. Das heißt, Enzym-Labeln wurde in Übereinstimmung mit dem Verfahren in "Analytical Biochemistry" 132 (1983), 68-73 mit dem Reagens S-Acetylthioessigsäure-N-hydroxysuccinimid für Bindung unter Verwendung von Meerrettichperoxidase (Sigma Grade VI) durchgeführt.
  • Bei der OIA-Reaktion wurde der gereinigte polyklonale Antikörper in einem PBS, enthaltend 0,05% Natriumazid, mit 0,1 M HEPES (pH 8,0), auf eine Konzentration von 10 μg/ml verdünnt und auf einen Siliziumwafer gegeben, je 50 μl, um für 30 Minuten bei Raumtemperatur zu reagieren, gefolgt von Waschen mit destilliertem Wasser und Verwendung.
  • 15 μl Antigenlösung, welche durch Zugabe von 0,5% Triton X-100 zu Kultursuspension von verschiedenen Spezies von Mikroorganismen und anschließender Extraktion der Suspension für 5 Minuten bei Raumtemperatur erhalten worden war, wurde zu den Proben, die bei dem oben beschriebenen Verfahren erhalten wurden, zugegeben und für 10 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt. Dann wurden 15 μl von 20 μg/ml Peroxidase-gelabeltem AMGC1 zugegeben und für 10 Minuten umgesetzt. Nach Waschen mit destilliertem Wasser wurde eine Substratlösung (KPL) zugegeben, je 15 μl, und für 5 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt. Das Produkt wurde mit de stilliertem Wasser gewaschen, um die blaue Farbkonzentration mit bloßem Auge zu beobachten.
  • Als ein Ergebnis, wie gezeigt in Tabelle 5, ist es klar, dass, wenn der gereinigte polyklonale Antikörper aus APHI2-2 als Capture-Antikörper verwendet wurde, Haemophilus influenzae, untersucht bei einer Empfindlichkeit von 108 Bakterien/ml, nachgewiesen wurde, während die Reaktivität von anderen Mikroorganismen nicht nachgewiesen werden konnte. Folglich wurde durch Verwendung des polyklonalen Antikörpers, gereinigt durch eine Affinitätssäule, die mit dem ribosomalen Protein L7/L12 aus Haemophilus influenzae immobilisiert war, bestätigt, dass der Antikörper mit spezifischer Reaktivität gegen Haemophilus influenzae erhalten wurde.
  • Tabelle 5
    Figure 00680001
  • Figure 00690001
  • Referenz-Beispiel 1
  • Gewinnung von monoklonalem Antikörper, der unspezifisch mit ribosomalem Protein L7/L12 aus verschiedenen Bakterien reagiert
  • Ein sogenannter Sandwich-Assay, bei welchem ein Antigen zwischen einen Capture-Antikörper und einen gelabelten Antikörper geschichtet ist, ist nützlich zum Nachweis von Mikroorganismen, durch optischen Immunoassay und das ELISA-Verfahren, wegen seiner hohen Nachweisempfindlichkeit. In diesem Fall wird nicht nur ein Antikörper, welcher spezifisch mit Antigenen, stammend aus dem betreffenden Mikroorganismus, reagiert, sondern auch ein anderer Antikörper, welcher ein Antigen-Epitop erkennt, welches verschieden ist von dem des spezifischen Antikörpers, benötigt.
  • Antikörper, welche unspezifisch mit ribosomalem Protein L7/L12, stammend aus verschiedenen Mikroorganismen reagieren, sind sehr nützlich als Antikörper, welche einen Sandwich-Assay aufbauen können, mit einem Antikörper, welcher spezifisch mit ribosomalem Protein L7/L12 reagiert.
  • Glücklicherweise haben ribosomale Proteine L7/L12 Proteine von einer Vielzahl von Mikroorganismen einen Bereich, worin die Aminosäuresequenz homolog ist. Hier waren die Erfinder erfolgreich bei der Gewinnung eines monoklonalen Antikörpers, welcher eine Kreuzreaktion mit ribosomalen Proteinen L7/L12-Protein von verschiedenen Spezies von Mikroorganismen aus Neisseria gonorrhoeae zeigt. Es wurde entdeckt, dass ein Antikörper gegen antiribosomales Protein L7/L12 ohne Spezifität, welcher aus einer Spezies von Mikroorganismen erhalten wurde, für Sandwich-Assay von verschiedenen Arten von Mikroorganismen verwendet werden kann.
  • Klonierung von Genen des ribosomalen Proteins L7/L12 aus Neisseria gonorrhoeae, Massenexpression in Escherichia coli und Reinigung desselben Proteins und Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen dasselbe Protein wurden durchgeführt.
  • Nach Animpfung einer geeigneten Menge von Neisseria gonorrhoeae-Stamm IID821 (erhalten von Tokyo University School of Medicine Laboratories) in einem Schokoladeagar-Kulturmedium wurde der Stamm für 24 Stunden in einem CO2-Inkubator unter Bedingungen von 37°C und 5,0% CO2 kultiviert. Die Kolonien, die wuchsen, wurden in einem TE-Puffer auf eine Endkonzentration von etwa 5 × 109 CFU/ml suspendiert. Etwa 1,5 ml dieser Suspension wurden in ein Mikrozentrifugationsröhrchen überführt und für 2 Minuten bei 10.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Das Sediment wurde in 567 μl TE-Puffer resuspendiert. Dann wurden 30 μl 10% SDS und 3 μl 20 g/ml Proteinase-K-Lösung zugegeben und gründlich gemischt. Die Suspension wurde für eine weitere Stunde bei 37°C inkubiert. Als nächstes, nach Zugabe von 80 μl 10% Cetyltrimethylammoniumbromid/0,7 N NaCl Lösung und gründlicher Mischung des Produkts wurde es für 10 Minuten bei 65°C inkubiert. Als nächstes wurden 700 μl Chloroform-Isoamylalkohollösung bei einem Volumenverhältnis von 24:1 zugegeben und gut gerührt. Die Lösung wurde für 5 Minuten (während sie bei 4°C gehalten wurde) bei 12.000 rpm unter Verwendung einer Mikrozentrifugen-Vorrichtung zentrifugiert und die wässrige Fraktion wurde in ein neues Mikroröhrchen überführt. Isopropanol wurde zu der Fraktion bei 0,6-fachem Volumen zugegeben und das Röhrchen wurde heftig geschüttelt, um ein Sediment der DNA zu bilden. Das weiße DNA-Sediment wurde mit einem Glasstab abgeschöpft und in ein ver schiedenes Mikrozentrifugationsröhrchen überführt, enthaltend 1 ml 70% Ethanol (gekühlt auf –20°C).
  • Als nächstes wurde das Produkt für 5 Minuten bei 10.000 rpm zentrifugiert und der Überstand vorsichtig entfernt. Dann wurde 1 weiterer ml 70% Ethanol zugegeben und das Produkt für 5 weitere Minuten zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt wurde, wurde das Sediment in 100 μl TE-Puffer gelöst, um die DNA-Lösung zu erhalten. Die Konzentration der genomischen DNA-Lösung wurde quantitativ bestimmt in Übereinstimmung mit E5, spektrophotometrische Bestimmung der Menge an DNA oder RNA, "Molecular cloning: A laboratory manual," 1989, Eds. Sambrook, J., Fritsch, E.F., und Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press.
  • PCR wurde unter Verwendung von 10 ng dieser genomischen DNA durchgeführt. Taq-Polymerase (Takara Co., Ltd., Code R001A) wurde für die PCR eingesetzt. Dann wurden 5 μl eines Puffers zu dem Enzym zugegeben, 4 μl dNTP-Mischung zu dem Enzym zugegeben und jeweils 200 pmol von synthetischem Oligonucleotid E, gezeigt in Sequenz No. 15 der Sequenztabelle, und synthetischem Oligonucleotid F, gezeigt in Sequenz No. 16 der Sequenztabelle, welche entworfen wurden, basierend auf der DNA-Sequenz des ribosomalen Proteins L7/L12 aus Neisseria gonorrhoeae, erhalten aus Internet Information (Oklahoma University, N. Gonorrhoeae Genome Project, disclosed Genomic DNA data) wegen der Ähnlichkeit mit ribosomaler Protein L7/L12-DNA Sequenz von anderen Bakterien, zu dem Enzym zugegeben, um das Endvolumen auf 50 μl zu bringen.
  • Diese Mischung wurde 5 Zyklen mit einem TaKaRa PCR Thermal Cycler 480 unterworfen, für 1 Minute bei 95°C, 2 Minuten bei 50°C und 3 Minuten bei 72°C und dann 25 Zyklen unterzogen, für 1 Minute bei 95°C, 2 Minuten bei 60°C und 3 Minuten bei 72°C. Elektrophorese wurde in 1,5% Agarosegel unter Verwendung von eini gen von diesem PCR-Produkt durchgeführt. Dieses Produkt wurde dann mit Ethidiumbromid (Nihon Gene Co., Ltd.) gefärbt und unter ultravioletten Strahlen beobachtet, um die Amplifikation von etwa 400 by cDNA zu bestätigen. Nach Verdauungsbehandlung mit Restriktionsendonukleasen BamHI und XhoI wurde Elektrophorese in 1,5% Agarosegel durchgeführt und Färbung mit Ethidiumbromid wurde durchgeführt. Eine etwa 370 bp-Bande wurde aus dem Gel ausgeschnitten. Diese Bande wurde mit Suprec01 (Takara Co., Ltd.) gereinigt und dann in pGEX-4T-1 (Pharmacia) eingeführt, welches ein kommzeriell erhältlicher Vektor ist. Tatsächlich wurde der Vektor pGEX-4T-1 und die vorherige DNA bei einem Molverhältnis von 1:3 zusammengemischt und die DNA wurde mit T4-DNA-Ligase (Invitrogen Co.) in den Vektor eingeführt. Der Vektor pGEX-4T-1, in welchen die DNA eingeführt worden war, wurde genetisch in Escherichia coli One-Shot Competent Cells (Invitrogen Co., Ltd.) eingefügt und dann in eine Platte von L-Nährmedium (Takara Co., Ltd.) halbfeste Kulturplatte, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin (Sigma), eingeimpft. Die Platte wurde dann bei 37°C für 12 Stunden beiseite gestellt und die Kolonien, die wuchsen, wurden zufällig ausgewählt und in 2 ml L-Nährmedium Flüssigkulturmedium eingeimpft, enthaltend die gleiche Konzentration an Ampicillin. Schüttelkultivierung wurde bei 37°C für 8 Stunden durchgeführt und das Bakterium wurde gewonnen und das Plasmid wurde abgetrennt unter Verwendung von Wizard Miniprep in Übereinstimmung mit der beigefügten Literatur. Das Plasmid wurde mit Restriktionsendonuklease BamHI/XhoI geschnitten. Die Einfügung von dem genannten PCR-Produkt wurde durch Ausschneiden von etwa 370 by DNA bestätigt. Die Basensequenz der DNA, die eingeführt worden war, wurde unter Verwendung des genannten Klons bestimmt.
  • Die Bestimmung der Basensequenz des eingefügten DNA-Fragments wurde unter Verwendung des Fluoreszenz-Sequenzers von Applied Biosystems durchgeführt. Die Sequenzprobe wurde unter Verwendung von PRISM, Ready Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) hergestellt. Zuerst wurden 9,5 μl Reaktionsstocklösung, 4,0 μl T7-Promoter-Primer mit 0,8 pmol/μl (Gibco BRL) und 6,5 μl Templat-DNA mit 0,16 μg/μl zur Sequenzierung in ein Mikroröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 0,5 ml gegeben und gemischt. Nach Überschichtung mit 100 ml Mineralöl wurde, PCR-Amplifikation für 25 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus aus 30 Sekunden bei 96°C, 15 Sekunden bei 55°C und 5 Minuten bei 60°C bestand. Das Produkt wurde dann bei 4°C für 4 Minuten gehalten. Nachdem die Reaktion beendet war, wurden 80 μl sterilisiertes reines Wasser zugegeben und gerührt. Das Produkt wurde zentrifugiert und die wässrige Schicht wurde dreimal mit Phenol-Chloroform extrahiert. Zehn Mikroliter 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 300 μl Ethanol wurden zu 100 μl wässriger Schicht zugegeben und gerührt. Das Produkt wurde dann für 15 Minuten bei Raumtemperatur und 14.000 rpm zentrifugiert und das Sediment wurde gewonnen. Nachdem das Sediment mit 75% Ethanol gewaschen war, wurde es unter Vakuum für 2 Minuten getrocknet, um die Sequenzierungsprobe zu erhalten. Die Sequenzierungsprobe wurde in Formamid, enthaltend 4 μl 10 mM EDTA gelöst, und für 2 Minuten bei 90°C denaturiert. Dies wurde dann in Eis gekühlt und dem Sequenzieren ausgesetzt. Einer der 5 Klone, die erhalten wurden, hatte Homologie mit der Sequenz mit der Sonde, die für die PCR verwendet wurde. Zusätzlich wurden DNA-Sequenzen mit extremer Ähnlichkeit zu der Gensequenz des Gens des ribosomalen Proteins L7/L12 der anderen Mikroorganismen, zum Beispiel Haemophilus influenzae, entdeckt. Die gesamte Basensequenz und die korrespondierende Aminosäuresequenz der strukturellen Geneinheit sind wie in Sequenz No. 21 und No. 22 der Sequenztabelle gezeigt. Dieses Genfragment codiert klar für Neisseria gonorrhoeae ribosomales Protein L7/L12.
  • Neisseria gonorrhoeae GST-fusioniertes Ribosomprotein L7/L12, hergestellt durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 2, wurde unter Verwendung des Neisseria gonorrhoeae ribosomalem GST-Fusionsprotein L7/L12 Expressionsvektors erhalten, der auf diese Art hergestellt wurde. Des Weiteren wurde Hybridoma-Stamm AMGC1, welcher monoklonalen Antikörper gegen ribosomales Protein L7/L12 von Neisseria gonorrhoeae produziert, in Übereinstimmung mit dem Verfahren erhalten, das ähnlich zu dem Verfahren von Beispiel 3 ist. Monoklonaler Antikörper wurde in Übereinstimmung mit Standardverfahren hergestellt und gewonnen unter Verwendung der positiven Hybridoma-Zellen von AMGC1-Stamm, erhalten wie vorhergehend beschrieben.
  • Spezifisch wurden Zellen, die in RPMI 1640-Medium (enthaltend 10% FCS) subkultiviert wurden, mit einem serumfreien Medium auf etwa 2 × 105 Zellen/ml, 3,3 × 105 Zellen/ml und 5 × 105 Zellen/ml in 25 cm2 Kulturkolben verdünnt und die Gesamtmenge wurde auf 5 ml gebracht. Nachdem die Zellen für 3 bis 5 Tage in 7% CO2 bei 37°C gezüchtet wurden, wurde ein Kolben, welcher die geringste Anzahl an Originalzellen enthält, unter den Kolben ausgewählt, in welchen Zellen gezüchtet wurden. Dasselbe Verfahren wurde wiederholt, bis die auf 2 × 105 Zellen/ml verdünnten Zellen auf 2 × 106 Zellen/ml gewachsen waren, in 3 bis 4 Tagen, wodurch die Zellen an das serumfreie Medium angepasst wurden. Als nächstes wurde Klonierung in einer 96-Well-Platte zur Bakterienkultivierung durchgeführt, um Zellen auszuwählen, die das schnellste Wachstum aufwiesen und den höchsten Antikörper-Titer. Die ausgewählten Zellen wurden in einer 24-Well-Platte gezüchtet und mit einem serumfreien Medium in einem 25 cm2 Kulturkolben auf eine Konzentration von etwa 2 ×105 Zellen/ml verdünnt und das Gesamtvolumen wurde auf 10 ml gebracht. Nach Inkubation für 3 bis 4 Tage in 7% CO2 bei 37°C auf eine Konzentration von 1 × 106 Zellen/ml, wurde das Kulturnährmedium, 100 ml, 1 × 106 Zellen/ml, in eine Flasche zur Massenkultivierung überführt, welche in der gleichen Weise in einem 75 cm2 Kolben gezüchtet wurden. 100 ml eines serumfreien Mediums wurden zu der Mischung zugegeben, welche bei 37°C für 2 Tage unter Rühren inkubiert wurde. 200 ml des serumfreien Medium wurden nochmals zugegeben und die Mischung wurde für weitere 2 Tage inkubiert. Das Kulturnährmedium wurde in 4 Teile geteilt, das serumfreie Medium wurde zu jedem Teil zugegeben, gefolgt von Inkubation für 2 Tage. Nach weiterer Zugabe von 400 ml des serumfreien Mediums wurde das Kulturnährmedium für 6 Tage inkubiert. Das Kulturnährmedium wurde gesammelt und bei 10.000 rpm für 15 Minuten zentrifugiert, um einen Kulturüberstand, enthaltend den Zielantikörper, zu erhalten. Nach der Zugabe von Natriumazid auf eine Endkonzentration von 0,1% wurde der Kulturüberstand bei 4°C gelagert. 100 ml der Lösung, enthaltend den Antikörper, die erhalten wurde, wurden 5-fach mit PBS verdünnt und auf einer Protein A-Säule (5 ml Bettvolumen, Pharmacia) adsorbiert und mit dreifachem Bettvolumen an PBS gewaschen. Dann wurde mit Citratpuffer bei pH 3 eluiert, die Antikörperfraktion gewonnen und monoklonaler Antikörper, hergestellt durch jedes Hybridom, wurde erhalten. Der monoklonale Antikörper, stammend von dem Hybridoma, wurde beim ELISA verwendet.
  • Um den Antikörper zu bewerten, wurden mit ribosomalen Proteinen L7/L12 von verschiedenen Mikroorganismen sensibilisierte 96-Well-Platten als ein Antigen verwendet. Der monoklonale Antikörper, der hergestellt wurde, wurde umgesetzt, gefolgt von der Reaktion mit Meerrettich-Peroxidase-gelabeltem anti-Maus IgG (hergestellt durch MBL, Code 330) als ein Sekundär-Antigen und als letztes wurde der Antikörper unter Verwendung eines Enzymreaktionsfärbereagenzes nachgewiesen. Bei der ELISA-Reaktion wurden Lösungen von rekombinantem ribosomalem Protein L7/L12 aus Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae und Streptococcus pneumoniae in PBS, enthaltend 0,05 Natriumazid, gelöst, auf 1 μg/ml verdünnt, je 100 μl in getrennte 96-Well-Platten geschüttet und über Nacht bei 4°C adsorbiert. Nach Entfernung des Überstandes wurden 200 μl 1% Rinderserumalbuminlösung (in PBS) zugegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt und blockiert. Der Überstand wurde entfernt und das Produkt wurde mit einer Waschlösung (0,02 Tween 20, PBS) gewaschen. Lösungen von AMGC1-Antikörper bei Konzentrationen von 0,1 bis 1 μg/ml in einer Menge von je 100 μl, wurden zugegeben und für 2 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Der Überstand wurde entfernt und das Produkt wurde weiter mit einer Waschlösung gewaschen. Dann wurden 100 μl einer Lösung von 5 μg/ml Meerrettich-Peroxidase gelabeltem anti-Maus IgG (hergestellt durch MBL, Code 330) zugegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt. Der Überstand wurde entfernt und das Produkt wurde mit einer Waschlösung gewaschen. TMB (KPL) Lösung wurde zugegeben, je 100 μl, und für 20 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach Färbung wurden 100 μl 1 N Schwefelsäure zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Die Absorption bei 450 nm wurde bestimmt.
  • Als ein Ergebnis, wie in Tabelle 6 gezeigt, wurde bestätigt, dass, wenn der monoklonale Antikörper, stammend aus Hybridoma AMGC1, verwendet wurde, dieser Antikörper mit ribosomalen Proteinen L7/L12 von allen Bakterien reagieren kann, wie z.B. Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae und Streptococcus pneumoniae.
  • Tabelle 6
    Figure 00760001
  • Der hier erhaltene AMGC1-Antikörper ist sehr nützlich als ein Antikörper, der verwendet wird für den Nachweis von Mikroorganismen bei dem sogenannten Sandwich-Assay durch optischen Immuno-Assay und ELISA-Verfahren, in Kombination mit einem antiribosomalen Protein L7/L12-Antikörper, welcher für jeden Mikroorganismus spezifisch ist.
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung können nicht nur Mikroorganismen gemäß ihrer Spezies spezifisch nachgewiesen werden, sondern auch Mikroorganismen von allen Serotypen in derselben Spezies können mit hoher Genauigkeit nachgewiesen werden unter Verwendung von Antikörpern gegen intrazelluläre Moleküle derselben Funktion.
  • Durch Verwendung von Antikörpern gegen ribosomale Proteine L7/L12 von verschiedenen Mikroorganismen als solche Antikörper, können Haemophilus influenzae und Neisseria gonorrhoeae genau nachgewiesen werden.
  • Des Weiteren können spezifische Antikörper, die für den Nachweis von verschiedenen Arten von Mikroorganismen verwendet werden, durch Verwendung von intrazellulären Molekülen, die dieselben Funktionen in verschiedenen Mikroorganismen zeigen, als ein Antigen, hergestellt werden.
  • BEMERKUNGEN ZU HINTERLEGTEN MIKROORGANISMEN
  • Die Organisation, bei welcher die Mikroorganismen hinterlegt wurden:
    National Institute of Bioscience and Human Technology, the Agency of Industrial Science and Technology
    Adresse: 1-1-3, Higashi, Yatabe-cho, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan (Postleitzahl: 305).
    Datum der Hinterlegung: 28. Juli 1999
    Hinterlegungsnummer, die durch die Hinterlegungsstelle vergeben wurde: FERM BP-6807 SEQUENZLISTE
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Claims (12)

  1. Antikörper, die auf das ribosomale Protein L7/L12 von Bakterien gerichtet sind, welche spezifisch mit dem ribosomalen Protein L7/L12 von Bakterien reagieren, aus denen das ribosomale Protein L7/L12 isoliert wird, und welche die Bakteriengattungen oder Spezies von anderen Bakteriengattungen beziehungsweise Spezies unterscheiden können.
  2. Antikörper gemäß Anspruch 1, wobei die Bakterien Bakterien sind, die eine geschlechtlich übertragbare Krankheit (STD) verursachen.
  3. Antikörper gemäß Anspruch 1, wobei die Bakterien Bakterien sind, die eine Infektion der Atemwege verursachen.
  4. Antikörper gemäß Anspruch 3, wobei die Bakterien, die die Infektion der Atemwege verursachen, Bakterien von Haemophilus influenzae sind.
  5. Antikörper gemäß Anspruch 3, wobei die Bakterien, die die Infektion der Atemwege verursachen, Bakterien von Streptococcus pneumoniae sind.
  6. Antikörper gemäß Anspruch 3, wobei die Bakterien, die die Infektion der Atemwege verursachen, Bakterien von Chlamydia pneumoniae sind.
  7. Antikörper gemäß Anspruch 3, wobei die Bakterien, die die Infektion der Atemwege verursachen, Bakterien von Mycoplasma pneumoniae sind.
  8. Antikörper gemäß Anspruch 2, wobei die Bakterien, die die geschlechtlich übertragbaren Krankheiten (STD) verursachen, Bakterien von Neisseria gonorrhoeae sind.
  9. Antikörper gemäß Anspruch 8, welcher der Antikörper für das ribosomale Protein L7/L12 von Neisseria gonorrhoeae ist und der eine zusammenhängende Aminosäuresequenz-Einheit aus 5 bis 30 Aminosäuren erkennt, die das 115. Alanin in der Aminosäuresequenz von Sequenz ID No. 22 der Sequenzliste enthält.
  10. Verfahren zum Nachweisen von Bakterien, dadurch gekennzeichnet, dass irgendein Antikörper gemäß den Ansprüchen 1 bis 9 verwendet wird.
  11. Kit von Reagenzien zum Nachweis von Bakterien, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 umfasst.
  12. Verfahren zur Herstellung irgendeines Antikörpers, der in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 beschrieben ist, dadurch gekennzeichnet, dass ribosomales Protein L7/L12 von Bakterien, erhalten durch ein Genmanipulationsverfahren oder durch Isolierung aus Bakterien, oder eine Peptideinheit davon, oder ein synthetisiertes Peptid, das der Peptideinheit entspricht, als ein Immunogen verwendet wird.
DE69921329T 1998-07-31 1999-07-30 Anti-l7/l12-antikörper zum nachweis von bakterien Expired - Lifetime DE69921329T2 (de)

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Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001057089A1 (en) * 2000-01-31 2001-08-09 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Antibody for detecting chlamydia pneumoniae
JP2004201605A (ja) * 2002-12-26 2004-07-22 Asahi Kasei Corp レジオネラ属菌リボソームｌ７／ｌ１２タンパク質をコードするｄｎａ
JP2010248129A (ja) * 2009-04-16 2010-11-04 Asahi Kasei Corp レジオネラ菌検出用抗体
CN102947341B (zh) 2010-01-19 2018-07-06 哈佛大学校长及研究员协会 用于病原体检测和治疗的工程化调理素
JP5693938B2 (ja) * 2010-12-10 2015-04-01 旭化成株式会社 乳汁中の特定物質を検出する方法
SG10201608671SA (en) * 2011-07-18 2016-12-29 Harvard College Engineered Microbe-Targeting Molecules and Uses Thereof
BR112014029814B1 (pt) 2012-06-13 2020-12-08 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha método para detecção de substância especifica em leite
US10551379B2 (en) 2013-03-15 2020-02-04 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for improving detection and/or capture of a target entity
AU2014268603B2 (en) 2013-05-21 2018-03-22 President And Fellows Of Harvard College Engineered heme-binding compositions and uses thereof
WO2015093544A1 (ja) 2013-12-18 2015-06-25 旭化成株式会社 乳汁中のブドウ球菌を検出する方法
WO2015093546A1 (ja) 2013-12-18 2015-06-25 旭化成株式会社 乳汁中のストレプトコッカス属の菌を検出する方法
US10345299B2 (en) 2013-12-18 2019-07-09 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Method for detecting coliform bacteria contained in milk
WO2015095604A2 (en) 2013-12-18 2015-06-25 President And Fellows Of Harvard College Methods and assays relating to circulating tumor cells
TWI521063B (zh) 2015-03-10 2016-02-11 國立交通大學 生物感測裝置及分離生物分子的方法
EP3763378A1 (de) 2015-08-06 2021-01-13 President and Fellows of Harvard College Verbesserte mikrobenbindende moleküle und verwendungen davon
JP6831643B2 (ja) * 2016-05-17 2021-02-17 旭化成株式会社 細菌を検出する方法及びキット
CA3065928A1 (en) * 2017-06-06 2018-12-13 Northwestern University Trans-interfacial magnetic separation
KR102053749B1 (ko) 2018-01-24 2020-01-22 강원대학교산학협력단 임질균 특이적 항체 및 이의 용도
JP6806934B2 (ja) 2018-08-31 2021-01-06 旭化成株式会社 検体中の被分析物質を検出するための増感剤、及び検体中の被分析物質の検出方法
WO2020069002A2 (en) * 2018-09-26 2020-04-02 Adaptive Phage Therapeutics, Inc. Monitoring host cell contamination of virus-based biological products
US12066438B2 (en) 2018-11-30 2024-08-20 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Method for detecting causative bacterium of mastitis
WO2020111272A1 (ja) * 2018-11-30 2020-06-04 旭化成株式会社 細菌感染による急性副鼻腔炎の起炎菌の検出方法
JP6964644B2 (ja) * 2019-11-01 2021-11-10 旭化成株式会社 検体中の肺炎球菌を検出するための抗体、並びに斯かる抗体を用いて肺炎球菌を検出するための方法、試薬、及びキット
JP6964117B2 (ja) * 2019-11-01 2021-11-10 旭化成株式会社 検体中のインフルエンザ菌を検出するための抗体、並びに斯かる抗体を用いてインフルエンザ菌を検出するための方法、試薬、及びキット
JP6964645B2 (ja) * 2019-11-01 2021-11-10 旭化成株式会社 検体中の緑膿菌を検出するための抗体、並びに斯かる抗体を用いて緑膿菌を検出するための方法、試薬、及びキット
JP6964118B2 (ja) * 2019-11-01 2021-11-10 旭化成株式会社 検体中の黄色ブドウ球菌を検出するための抗体、並びに斯かる抗体を用いて黄色ブドウ球菌を検出するための方法、試薬、及びキット
JP7491679B2 (ja) * 2019-11-01 2024-05-28 旭化成株式会社 検体中のサルモネラ菌を検出するための抗体、並びに斯かる抗体を用いてサルモネラ菌を検出するための方法、試薬、及びキット
JP2021156799A (ja) * 2020-03-27 2021-10-07 旭化成株式会社 検体中のインフルエンザ菌と肺炎球菌の免疫学的同時検出方法、及びイムノクロマトグラフィー装置
JP7521922B2 (ja) * 2020-04-06 2024-07-24 旭化成株式会社 検体中の淋菌を検出するための抗体、並びに斯かる抗体を用いて淋菌を検出するための方法、試薬、及びキット
JP6964161B2 (ja) * 2020-04-06 2021-11-10 旭化成株式会社 検体中のモラクセラ・カタラーリス菌を検出するための抗体、並びに斯かる抗体を用いてモラクセラ・カタラーリス菌を検出するための方法、試薬、及びキット
JP6964704B2 (ja) * 2020-04-06 2021-11-10 旭化成株式会社 検体中の大腸菌を検出するための抗体、並びに斯かる抗体を用いて大腸菌を検出するための方法、試薬、及びキット
US20240069021A1 (en) 2021-01-15 2024-02-29 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Method and kit for detecting presence and/or amount of bacteria in food/drink sample, environmental sample, or biological sample
JP7626621B2 (ja) 2021-01-15 2025-02-04 旭化成株式会社 対象が患う感染症が細菌由来か否かを判別するための検査方法及び検査キット
US20240069022A1 (en) 2021-01-15 2024-02-29 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Method and kit for detecting presence and/or amount of bacteria of enterobacteriaceae in food/drink sample, environmental sample, or biological sample
JP7506251B2 (ja) * 2021-03-29 2024-06-25 旭化成株式会社 淋菌検出キット及び淋菌検出方法
EP4439065A4 (de) 2021-11-24 2025-03-12 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Immunchromatografievorrichtung und herstellungsverfahren dafür sowie verfahren zum nachweis eines zielbakteriums damit
CN117957306A (zh) 2021-11-24 2024-04-30 旭化成株式会社 溶菌方法和细菌检测方法
WO2024111665A1 (ja) 2022-11-24 2024-05-30 旭化成株式会社 溶菌方法、溶菌助液、及び細菌の有無の判定方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE104355T1 (de) * 1986-05-01 1994-04-15 Washington Res Found Nachweis eines mit atmungskrankheiten verbundenen einzelstammes von chlamydia.
WO1988003957A1 (en) * 1986-11-24 1988-06-02 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes for detection and/or quantitation of non-viral organisms
WO1992004445A1 (en) * 1990-09-11 1992-03-19 The Western Australian Research Institute For Child Health Ltd. Cloning and sequencing of allergens of dermatophagoides (house dust mite)
DE4128454A1 (de) * 1991-08-28 1993-03-04 Riedel De Haen Ag Monoklonaler antikoerper, der mit pseudomonas aeruginosa reagiert
JPH06125784A (ja) * 1992-01-17 1994-05-10 Takeda Chem Ind Ltd モノクローナル抗体，ハイブリドーマ，その製造法および用途
JPH07316194A (ja) * 1993-02-26 1995-12-05 Takeda Chem Ind Ltd Ｐａｃａｐレセプター蛋白質、その製造法および用途
AU3355095A (en) * 1994-09-02 1996-03-27 Meiji Milk Products Company Limited Diagnostic drug for chlamydia infection
JPH0931097A (ja) * 1995-07-24 1997-02-04 Yuka Medeiasu:Kk クラミジア・トラコマティス抗体の測定法
JP3708210B2 (ja) * 1996-04-03 2005-10-19 協和醗酵工業株式会社 抗線維芽細胞増殖因子−８モノクローナル抗体

Also Published As

Publication number Publication date
AU767270B2 (en) 2003-11-06
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CA2338989A1 (en) 2000-02-10
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