DE69920198T2

DE69920198T2 - Kamm-polymere zur regelung der zelloberflächenwechselwirkung

Info

Publication number: DE69920198T2
Application number: DE69920198T
Authority: DE
Inventors: M. Anne MAYES; G. Linda GRIFFITH; Darrell J. Irvine; Pallab Banerjee; Terry D. Johnson
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 1998-04-13
Filing date: 1999-04-13
Publication date: 2005-09-22
Anticipated expiration: 2019-04-14
Also published as: JP2002511496A; US6399700B2; WO1999052560A1; US6150459A; AU752942B2; US6207749B1; DE69920198D1; US20010027237A1; EP1071467B1; CA2328436A1; AU3556499A; EP1071467A1; CA2328436C; ATE275977T1

Description

Die Regierung der Vereinigten Staaten hat aufgrund des Grant Nr. DMR-9400334 der National Science Foundation, OSP-Projekt Nr. 6227, an Anne M. Mayes und des Grant Nr. BES 9632714 der National Science Foundation an L. G. Griffith gewisse Rechte an dieser Erfindung inne.
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der U.S.S.N 60/081 596, eingereicht am 13. April 1998.
Es werden polymere Materialien, die kontrollierte Zellreaktionen hervorrufen, und die gute mechanische und optische Eigenschaften und/oder gute Eigenschaften bezüglich der biologischen Abbaubarkeit aufweisen, für den Einsatz in biomedizinischen Anwendungen offenbart. Verarbeitungsverfahren, mittels derer derartige Polymere an einer Oberfläche aus einem Biomaterial angeordnet werden können, werden ebenfalls offenbart.
Polymere, die derzeit für biomedizinische Anwendungen eingesetzt werden, sind tendenziell im allgemeinen hydrophob. So wie der Begriff hydrophob hier definiert wird, bezieht er sich auf ein Material, das Wasser abstößt, d.h. einen statischen Kontaktwinkel mit Wasser aufweist, der bei 20°C größer als 60 Grad ist, und das eine Wasserpermeabilität P von unter 3 × 10^-10 cm³ (STP) cm/(cm² s Pa) hat. Das kann unkontrollierte Wechselwirkungen zwischen Zellen und adsorbierten Proteinen auf der Oberfläche des Materials bewirken, was eine chronische entzündliche Reaktion hervorrufen kann, die zu einem Versagen von Implantaten führen kann und sogar eine Tumorigenität fördern kann (Warson, The Applications of Synthetic Resin Emulsions, Benn, London (1972)). Materialien aus Metall oder Keramik, die für Anwendungen als Implantate verwendet werden, können ganz ähnlich unerwünschte Zellreaktionen hervorrufen.
Für Anwendungen bei einem Gewebe-Engineering ist es essentiell, dass das polymere Material, das zu Herstellung eines biologisch abbaubaren Gerüstes für Zellen verwendet wird, die Zelladhäsion, die Wanderung, das Wachstum und die Differenzierung von Zellen fördert und gleichzeitig eine ausreichende strukturelle Stütze bereit stellt. Die üblicherweise verwendeten synthetischen Gerüstmaterialien, wie Poly(lactid), Poly(glycolid) etc. sowie die Copolymere von diesen, weisen zwar geeignete mechanische Eigenschaften und geeignete Eigenschaften bezüglich der Herstellung und des biologischen Abbaus auf, aber ihre hydrophobe Natur führt zur Adsorption von Proteinen und ihrer Denaturierung auf der Oberfläche des Materials, was unkontrollierte Zellreaktionen hervorruft.
Die ideale Oberfläche für viele Anwendungen als Biomaterialien würde einer Adsorption von Protein widerstehen und gleichzeitig Zellen spezifische chemische Signale bereit stellen, um die Adhäsion, das Überleben, das Wachstum, die Wanderung und die Differenzierung zu lenken. So wie der Begriff „Biomaterial" hier verwendet wird, bezieht er sich auf ein nicht-lebendiges Material, das für eine medizinische Vorrichtung verwendet wird, die mit biologischen Systemen in Wechselwirkung treten soll. Polymeroberflächen, die mit Poly(ethylenoxid) modifiziert wurden, sind in den letzten Jahren bezüglich der Reduktion einer Proteinadsorption an die Oberfläche von Biomaterialien untersucht worden (Paine et al., Macromolecules, 23:3104 (1990)). Das Ziel dieser Schemata für eine Oberflächenmodifikation ist die Eliminierung unspezifischer Wechselwirkungen von Zellen mit Implantatmaterialien. Ein Weg, über den spezifische chemische Signale Zellen auf einer Oberfläche zugeführt werden können, verläuft über angeknüpfte Liganden für Zelloberflächenrezeptoren (Barret, Brit. Polym. J., 5: 259 (1973)). Die Bereitstellung von Signalen auf diese Weise hat gegenüber der Zugabe löslicher Faktoren Vorteile, da das Signal sehr lokalisiert in einer kontrollierten Dosis bereit gestellt wird, ohne dass es zu einem Verlust aufgrund einer Diffusion kommt (Kuhl und Griffith, Nature Medicine, 2: 1002 (1996)). Außerdem können angeknüpfte Liganden Zellen eine konstantere Stimulierung bereit stellen, da die Herunterregulierung vermieden wird, zu der es kommt, wenn lösliche Liganden von Zellen internalisiert werden. Die Steuerung der räumlichen Verteilung von Liganden auf Oberflächen kann auch einen Schlüssel zur Steuerung des Zellverhaltens darstellen. Somit sind Systeme, die die räumliche Kontrolle der lokalen Dichte von Liganden oder die Erzeugung von Clustern von Liganden auf einer Oberfläche ermöglichen, zusätzlich zur Bereitstellung einer Steuerung über die durchschnittliche Dichte von Liganden auf der Oberfläche, äußerst erstrebenswert (Kornberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 8392 (1991)).
Integrine, dimere Adhäsionsrezeptoren, die eine von ungefähr zehn bekannten Alpha-Ketten, die mit einer von ungefähr 6 bekannten Beta-Ketten gepaart sind, enthalten, vermitteln eine große Vielzahl an Wechselwirkungen zwischen Zellen und der extrazellulären Matrix (ECM), und sie steuern ganz unterschiedliche Zellreaktionen, wie eine Wanderung, das Wachstum und die Differenzierung, indem sie eine permissive Umgebung für die Wirkung von Wachstumsfaktoren bereit stellen. Für viele Integrine wurde die Spezifität der Integrinbindung an Matrix-Proteine auf kleine diskrete Peptiddomänen kartiert, und immer noch werden neue Stellen aufgeklärt (Rouslahti, Ann. Rev. Cell. Dev. Biol. 12: 697 (1996); Hynes, Cell, 48: 549 (1987)). Das prototypische Beispiel für eine derartige Spezifität ist die RGD-Stelle, die zuerst im Fibronectin und danach in anderen Matrix-Proteinen identifiziert wurde. Das RGD-Peptid ermöglicht den vollständigen Ersatz der adhäsiven Funktion des Fibronectins bei Zellen, die bestimmte Integrine exprimieren.
Viele Daten unterstützen die Idee, dass sowohl eine Besetzung als auch eine Clusterbildung von Integrinen benötigt werden, um die vollständigen zellulären Reaktionen hervorzurufen, die von Integrinen vermittelt werden (Clark und Brugge, Science, 268: 233 (1995)). Zum Beispiel benötigt die vollständige EGFR-Aktivierung der MAP-Kinase das Integrin-Clustering und die Besetzung (Miyomoto et al., J. Cell Biol., 135: 1633 (1996)). Somit kann die räumliche Präsentation der Liganden in der Umgebung, d.h., ob die Liganden eng genug zueinander angeordnet sind, um ein Clustering von ligandengebundenen Integrinen zu bewirken, das Zellverhalten beeinflussen, das von Integrinen gesteuert wird. Tatsächlich wurde gezeigt, dass der räumliche Abstand synthetischer RGD-Liganden, die kovalent an das Substrat geknüpft wurden, einen Einfluss auf die Zelladhäsion und die Zellausbreitung hat (Massia und Hubbell, J. Cell Biol., 114: 1089 (1991). Gleichzeitig wurde für die Oberflächenkonzentration eines Adhäsionsliganden wie Fibronectin gezeigt, dass sie Integrin-vermittelte Verhaltensweisen, wie die Wanderung, deutlich beeinflusst (DiMilla et al., J. Cell Biol., 122: 729 (1993)). Eine kürzlich durchgeführte Studie unter Verwendung sich von allein anordnender Monolayer, die ein Muster aus adhäsiven/nicht-adhäsiven Domänen von 1 μm aufwiesen, demonstrierte die Rolle der Zellausbeutung und der Rezeptorbesetzung für das Überleben von Zellen (Chen et al., Science, 276: 1425 (1997)). Der Längenmaßstab in dieser Studie war ungefähr derjenige eines fokalen Adhäsionskomplexes (oder größer), aber es ist wahrscheinlich, dass ein Clustering in einem viel kleineren Längenmaßstab (3-10 Integrine) ebenfalls physiologisch relevant ist. Tatsächlich deuten Daten stark darauf hin, dass ein RGD-Clustering in einem Maßstab von unter 100 nm ausgeprüfte Effekte auf das Integrin-vermittelte Wanderungsverhalten hat. Da sowohl die Konzentration als auch die räumliche Verteilung des Liganden die Zellreaktion beeinflusst, ist es wünschenswert, über ein Mittel zu verfügen, diese beiden Parameter unabhängig voneinander und über einen weiten Längenbereich (Nanometer bis Mikrometer) zu variieren, um die Zellreaktionen zu lenken.
Integrine können intrazelluläre Signalübertragungskaskaden initiieren, die mit denjenigen von Wachstumsfaktoren, wie des Epidermal Growth Factor (EGF), überlappen. Eine Kreuzkommunikation zwischen Adhäsions- und Wachstumsfaktorrezeptoren kann über eine direkte physikalische Assoziation innerhalb der fokalen Adhäsionen erfolgen. Beide Rezeptortypen sind in diesen Strukturen konzentriert (Miyamoto et al., J. Cell. Biol., 135: 1633 (1996); Plopper et al., Mol. Biol. Cell., 6: 1349 (1995)), und beide Rezeptoren können einige der gleichen stromabwärts auftretenden Wirkungen auf Moleküle wie die MAP-Kinase stimulieren. Die enge Nachbarschaft von Adhäsions- und Wachstumsfaktorrezeptoren im fokalen Adhäsionskomplex ermöglicht einen freien Fluss sowohl positiver als auch negativer regulatorischer Signale zwischen den beiden. Für mehrere Signalmoleküle wurde vorgeschlagen, dass sie diese Verknüpfung darstellen; ein intrazellulärer Mechanismus der Transmodulation verläuft über die durch die Proteinkinase C (PKC) vermittelte Dämpfung des Rezeptors für den Epidermal Growth Factor (EGFR). Es ist auch wahrscheinlich, dass die PKC-Aktivität nach der Aktivierung der Phospholipase Cγ oder der Phospholipase D durch den EGFR Verbindungen zu dem Substrat auf Integrin-Basis verändert (Welsh et al., J. Cell Biol., 114: 533 (1991); Ando et al., J. Cell. Physiol., 156: 487 (1993)). Es ist somit wünschenswert, über ein Verfahren zu verfügen, durch das zwei oder mehrere Typen von Signalliganden, beispielsweise Adhäsionspeptide und Wachstumsfaktoren, gleichzeitig auf der Oberfläche eines Biomaterials lokalisiert werden können, und zwar in kontrollierter Menge und räumlicher Verteilung.
Bis heute sind nur wenige Modellsysteme – wenn es überhaupt welche gibt – imstande, sowohl die Anforderungen an eine Widerstandsfähigkeit gegenüber Proteinen als auch bezüglich einer Oberfläche für eine zelluläre Signalübertragung zu erfüllen, wobei sich die Ansätze, bei denen klinisch einsetzbare Materialien verwendet wurden, auf Hydrogele konzentriert haben (Hern und Hubbell, J. Biomed. Mater. Res., 39: 266 (1998)), die nur eine begrenzte physikalische Stabilität aufweisen und für viele Anwendungen nicht geeignet sind. Zu weiteren Ansätzen zur Modifizierung der Oberflächen hydrophober polymerer Materialien oder anderer Biomaterialien zur Erzielung einer erwünschteren Oberflächenzusammensetzung für biomedizinische Anwendungen gehören die Adsorption von Blockcopolymeren, das chemische Pfropfen von Polymeren auf die Oberfläche und die Plasmaabscheidung eines überlagernden Films. Alle diese Verfahren leiden unter verschiedenen Nachteilen. Zum Beispiel können adsorbierte Blockcopolymere von Zellen aktiv neu angeordnet werden, aufgepfropfte Polymere können nur schwer in hoher Dichte auf eine Oberfläche aufgebracht werden, und die Plasmaabscheidung führt zu einer gelartigen Oberflächenstruktur, die für eine kontrollierte Übertragung zellulärer Signale schlecht geeignet ist. Keines dieser Verfahren stellt ein Mittel zur Modifizierung der Struktur komplexer dreidimensionaler Strukturen, wie von fibrösen oder schwammartigen Gewebegerüsten, oder zur Erzeugung von clusterförmigen Verteilungen von Liganden in unterschiedlichen Konzentrationen und mit unterschiedlichen Abständen auf den Oberflächen von Biomaterialien dar. WO 97/06833 betrifft Konjugate aus Hyperkämmen und verzweigten Polymeren. WO 98/12228 betrifft Polymere, die Polysaccharide enthalten, wie Alginate oder modifizierte Alginate. Irvine et al. (1998) J. Biomed. Mater. Res. 40: 498-509 betrifft angeknüpftes sternförmiges und lineares Polyethylenoxid.
Es wäre von Vorteil, Polymermaterialien und Verarbeitungsverfahren bereit zu stellen, die die Nachteile anderer Ansätze zur Modifizierung der Oberflächen von Biomaterialien überwinden. Es ist deshalb ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Polymermaterialien bereit zu stellen, die kontrollierte Wechselwirkungen zwischen Zellen und Oberflächen hervorrufen, indem sie eine Proteinadsorption hemmen und, sofern es angebracht ist, kontrollierte Konzentrationen und räumliche Verteilungen von Liganden, die als zelluläre Signale wirken, auf den Oberflächen von Biomaterialien bereit stellen. Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Verarbeitungsverfahren bereit zu stellen, mittels derer solche Polymere auf eine Biomaterialoberfläche aufgebracht werden können. Es ist ferner das Ziel der vorliegenden Erfindung, Polymermaterialien bereit zu stellen, die zur Erzeugung diskreter Domänen im Nanometer- bis Mikrometerbereich, die zwei oder mehr unterschiedliche Ligandentypen zur Regulation der Zellantwort präsentieren, auf einer Biomaterialoberfläche verwendet werden können.
Zusammenfassung der Erfindung
Es werden Copolymere vom Kamm-Typ, die kontrollierte zelluläre Reaktionen hervorrufen, Verfahren, mittels derer derartige Polymere auf einer Oberfläche angeordnet werden können, und Verfahren zur Verwendung derartiger Polymere für die Modifizierung der Oberflächen biomedizinischer Vorrichtungen offenbart.
Die Polymere schließen ein hydrophobes, wasserunlösliches Rückgrat und niedermolekulare, hydrophile, nicht an Zellen bindende Seitenketten ein. So wie „nicht an Zellen bindend" hier definiert wird, bezieht es sich auf Materialien, die in Standard-Zellkulturtests in serumhaltigen Medien nach 24 Stunden keine beobachtbare Zellanheftung zeigen. Das Molekulargewicht der hydrophilen Seitenketten liegt vorzugsweise über 200 Dalton und unter 2000 Dalton. Das Rückgrat kann biologisch abbaubar oder nicht biologisch abbaubar sein, in Abhängigkeit von der vorgesehenen Anwendung. Biologisch abbaubare Rückgrate werden für die meisten Anwendungen auf dem Gebiet des Gewebe-Engineering, der Arzneimittelzufuhr und von Vorrichtungen zur Wundheilung bevorzugt, während nicht biologisch abbaubare Rückgrate für Anwendungen als permanentes Implantat, für eine Biofiltration und für Zellkulturplatten wünschenswert sind. Ein Teil der nicht an Zellen bindenden Seitenketten kann an ihren Enden mit Liganden, die als zelluläre Signale wirken, versehen sein, um das Ausmaß der Zelladhäsion oder anderer zellulärer Reaktionen, die durch die Polymeroberfläche hervorgerufen werden, zu steuern. Bei der bevorzugten Ausführungsform sollte das Kamm-Copolymer ein Gesamt-Molekulargewicht haben, das ausreichend hoch ist, um dem Polymer im geschmolzenen Zustand über Kontakte zwischen den Ketten gute mechanische Eigenschaften vermitteln zu können. Das heißt, das Molekulargewicht sollte oberhalb des Molekulargewichtes der Kettenverknäuelung liegen, wie es ein Fachmann auf diesem Gebiet definiert. Das Gesamt-Molekulargewicht des Kamm-Copolymers sollte somit oberhalb von ungefähr 10 000 Dalton liegen, bevorzugter oberhalb von 20 000 Dalton und noch bevorzugter oberhalb von 30 000 Dalton.
Die Dichte der hydrophoben Seitenketten längs des Rückgrats aus den Copolymeren hängt von der Länge der Seitenketten und den Eigenschaften des fertigen Polymers bezüglich der Wasserlöslichkeit ab. Der prozentuale Anteil der hydrophilen Seitenketten am Gewicht liegt zwischen 20 und 60 % der gesamten Copolymer-Zusammensetzung, vorzugsweise in der Gegend von 40 Gew.-%. Für Kämme, die hydrophile Seitenketten mit einem Molekulargewicht ungefähr 350 Dalton enthalten, können die Molprozente der Segmente des Rückgrats, die hydrophile Seitenketten tragen, bei bis zu 30 % liegen. Für hydrophile Seitenketten mit einem Molekulargewicht von ungefähr 2000 Dalton können die Molprozente der Segmente des Rückgrats, die hydrophobe Seitenketten tragen, bei lediglich 2 % liegen. Bei der bevorzugten Ausführungsform ist das Gesamt-Kamm-Copolymer nicht wasserlöslich. So wie der Begriff wasserlöslich hier definiert wird, bezieht er sich auf Materialien, die in wässrigen Lösungen eine Löslichkeit von über 1 Gramm pro Liter haben. Beim Kontakt mit wässrigen Lösungen quellen die hydrophilen Seitenketten und bilden eine hydratisierte Schicht, die Proteine abstößt und somit einer Zelladhäsion widersteht.
Die nicht an Zellen bindenden Seitenketten des Kamm-Copolymers können an ihren Ende mit chemischen Liganden, die als zelluläre Signale wirken, versehen sein, um kontrollierte Zellreaktionen hervorzurufen. Liganden, wie Adhäsionspeptide oder Wachstumsfaktoren, können mittels bekannter chemischer Verfahren kovalent oder ionisch an die Enden der Seitenketten befestigt werden, um den Zellen spezifische chemische Signale bereit zu stellen. Es kann ein definierter Anteil von Seitenketten, die Liganden tragen, erhalten werden, indem eine geeignete stöchiometrische Steuerung während der Kopplung der Liganden an die Polymere eingesetzt wird, indem die Endgruppen derjenigen Seitenketten, die nicht an ihren Enden mit Liganden versehen werden sollen, geschützt werden, oder über Kombinationen dieser Ansätze. Für Anwendungen, bei denen es erwünscht ist, die Liganden in einem Längenmaßstab von Nanometern oder mehreren zehn Nanometern als Cluster auf einer Oberfläche eines Biomaterials anzuordnen, kann mehr als ein Ligand (im Durchschnitt) kovalent an einer einzelnen Kette des Kamm-Copolymers befestigt werden. Bei Anwendungen, bei denen es erwünscht ist, zwei oder mehr Ligandentypen in einem einzigen Cluster auf der Oberfläche eines Biomaterials im Größenmaßstab von Nanometern bis zu mehreren zehn Nanometern anzuordnen, kann ein Typ oder können mehrere Typen eines jeden Liganden (zum Beispiel ein Adsorptionspeptid und ein Wachstumsfaktor) an einer einzelnen Kette eines Kamm-Copolymers über ihre Seitenketten mittels bekannter chemischer Verfahren befestigt werden.
Wenn Adhäsionspeptide an die Seitenketten des Kamm-Copolymers gekoppelt werden, dann heften sich die Zellen an und breiten sich schnell auf der Oberfläche des Kamm-Copolymers aus. Das Ausmaß der Zellausbreitung und der Proliferation auf der Oberfläche kann somit über das Mischen von Kamm-Copolymeren, die Adhäsionspeptide tragen, mit Kamm-Copolymeren, die nicht an Zellen binden, gesteuert werden, so dass zum Beispiel weniger als 20 % der Kämme ein Adhäsionspeptid tragen. Ähnlich kann die räumliche Verteilung der Liganden-Cluster auf der Oberfläche des Biomaterials über das Mischen von Kamm-Copolymeren, die nicht an Zellen binden, mit Kamm-Copolymeren, bei denen jede Kette im Durchschnitt mehr als einen Liganden an ihren Seitenketten befestigt trägt, gesteuert werden. In diesem Falle wird die Größe der Liganden-Cluster (d.h. die Fläche, auf der die Liganden lokalisiert sind) durch die charakteristische Größe des ligandentragenden Kamm-Copolymers vorgegeben, und sie kann aus dem Trägheitsradius R_G des Kamm-Copolymers abgeschätzt werden, der von einem Fachmann auf diesem Gebiet berechnet oder experimentell bestimmt werden kann. Der Trägheitsradius des Kamm-Copolymers kann typischerweise zwischen Nanometern und mehreren zehn Nanometern liegen, in Abhängigkeit vom Gesamt-Molekulargewicht, der Länge der Seitenketten und der Umgebung, die die Polymerkette umgibt, z.B. andere Polymerketten oder Wassermoleküle (P.-G. deGennes, Scaling Concepts in Polymer Physics, Cornell University Press, 1979). Somit können die Größe der Liganden-Cluster sowie die Zahl und der Typ der Liganden pro Cluster über die Bedingungen bei der Synthese der ligandentragenden Kamm-Copolymere gesteuert werden. Zum Beispiel hätte ein Kamm-Copolymer mit R_G = 4 nm eine Fläche pro Cluster von πR_G ² oder ungefähr 50 nm². Die Zahl der Cluster auf der Oberfläche pro Oberflächeneinheit (im Durchschnitt) kann über das Verhältnis der ligandentragenden zu den nicht an Zellen bindenden Kämmen auf der Oberfläche gesteuert werden. Um eine Trenndistanz von d zwischen den Liganden-Clustern auf der Oberfläche zu erreichen, wobei d > 2R_G, sollte die Konzentration der ligandentragenden Kämme ungefähr ϕ = V_Kette/(2R_G d²) sein, wobei V_Kette das Volumen ist, das von einer einzelnen Kette des Kamm-Copolymers besetzt wird. Zum Beispiel liegt, um eine Entfernung zwischen den Clustern von 20 nm mit einem Kamm-Copolymer zu erzielen, bei dem R_G = 4 nm und V_Kette = 48 nm³, der abgeschätzte Anteil der benötigten ligandentragenden Kämme bei 1,5 Vol.-%. Eine Entfernung zwischen den Clustern von 10 nm würde 6 Vol.-% an ligandentragenden Kämmen erfordern.
Es können zahlreiche Verfahren eingesetzt werden, um die Kamm-Copolymere oder ihre Mischungen auf verschiedene Biomaterial-Oberflächen aufzutragen. Zu diesen Verfahren gehören ein Tauchbeschichten, ein Sprühbeschichten, ein Bürstenstreichen, ein Walzenstreichen oder ein Rotationsgießen eines Films auf den Träger, typischerweise gefolgt von einer milden Erwärmung, um die Haftung auf der Oberfläche zu fördern. Prozesse zur Ausbildung einer festen freien Form, wie Techniken eines dreidimensionalen Druckens (3DP) oder Gefriertrocknungsverfahren könnten eingesetzt werden, um komplexe dreidimensionale Strukturen, einschließlich poröser Strukturen, zu erzeugen. Bei all diesen Verarbeitungsansätzen kann ein geeignetes Vernetzungsmittel eingearbeitet werden, um die mechanische Festigkeit des Films oder der Vorrichtung zu erhöhen.
Bei Anwendungen, bei denen es wünschenswert ist, nur kleine Mengen eines Copolymers zur Modifizierung der Oberfläche eines zweiten, hydrophoben oder nicht-zellregulierenden Polymers zu einzusetzen, können die Kamm-Copolymere in kleinen Mengen zum zweiten Polymer gegeben und verarbeitet werden, um eine Abscheidung des Kamm-Copolymers auf der Oberfläche zu erreichen. Bei bevorzugten Ausführungsformen würde das Kamm-Copolymer weniger als 10 Gew.-% der Polymermischung ausmachen. Zu Verarbeitungsschritten für die Erzielung einer Abscheidung gehören die Erwärmung der Mischung im Vakuum, an Luft, in Wasser, Wasserdampf, CO₂ oder einer anderen Umgebung, die das Kamm-Copolymer an der Oberfläche begünstigt, bei Temperaturen, die hoch genug über den Glasübergängen der Polymerkomponenten liegen, so dass sie eine Beweglichkeit für die Erzielung der Abscheidung auf der Oberfläche bereit stellen. In dem Falle, bei dem die zweite Polymerkomponente ein semikristallines Polymer ist, sollte die Annealingtemperatur über dem Glasübergang liegen, aber unter dem Schmelzpunkt des Polymers, um sicher zu stellen, dass die gewünschte Form der Vorrichtung beibehalten wird. Bei bevorzugten Ausführungsformen wird die Oberflächenabscheidung während eines Standard-Verarbeitungsschrittes bei der Herstellung einer biomedizinischen Vorrichtung erzielt, beispielsweise während eines Extraktions-, Autoklavierungs- oder Sterilisierungsprozesses. Bei anderen Ausführungsformen wird die Abscheidung in einem zusätzlichen Annealingschritt in einer kontrollierten Umgebung (Wasser etc.) erreicht, und zwar nach der Herstellung der Vorrichtung. Derartige Verarbeitungsschritte erzeugen eine Oberflächenschicht mit einer Dicke von ungefähr 2R_G, die fast ausschließlich das Kamm-Copolymer enthält. Die beobachtbaren Oberflächeneigenschaften derartiger, einem Annealing unterzogener Mischungen sind im wesentlichen mit denjenigen der reinen Kamm-Copolymere identisch. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist das Kamm-Copolymer mit dem zweiten Polymer mischbar, um eine Phasentrennung in der Hauptmasse der Vorrichtung zu vermeiden, die zu schlechten mechanischen oder optischen Eigenschaften führen könnte.
In anderen Fällen kann die Lokalisierung des Kamm-Polymers auf der Oberfläche einer Vorrichtung, die in erster Linie aus einem zweiten, hydrophoben oder nicht-zellregulierenden Polymer besteht, während anderer Schritte der Herstellung der Vorrichtung erreicht werden. Zum Beispiel kann die genaue Platzierung des Kamm-Copolymers auf der Oberfläche einer Vorrichtung, die aus einem zweiten Polymer besteht, mittels 3DP-Verfahren erreicht werden. Ähnlich können Unterschiede der Viskosität zwischen dem Kamm-Copolymer und einem zweiten Polymer, wenn sie gemischt werden, dazu ausgenützt werden, den Kamm während der Schmelzextrusion von Fasern, Filmen oder anderen Vorrichtungen auf der Oberfläche anzuordnen. Poröse oder nicht-poröse Membranen, Filme, Fasern oder Hohlfasern, bei denen das Kamm-Copolymer auf den Oberflächen vorkommt, können durch ein Phaseninversionsgießen hergestellt werden. Bei diesem Verfahren wird eine Lösung aus dem Kamm-Copolymer, dem zweiten Polymer und einem Lösemittel für beide in ein Koagulationsbad auf wässriger Basis gegossen, um die Vorrichtung zu formen. Während des Gießvorganges induzieren günstige Wechselwirkungen zwischen dem Kamm und dem Medium des Koagulationsbades eine Abscheidung des Kamm-Copolymers auf die äußeren Oberflächen des Films, der Faser oder der Membran. Auf diese Weise können zellregulierende, mikroporöse, biologisch abbaubare Membranen, die als temporäre Trennvorrichtungen in Anwendungen für eine Wundheilung nützlich sind, hergestellt werden. Zellregulierende, biologisch abbaubare Nähte können ähnlich durch das Spinnen von Fasern aus einer Lösung in ein Koagulationsbad auf wässriger Basis hergestellt werden. Derartige oberflächenmodifizierte Fasern können auch aus biologisch abbaubaren oder nicht biologisch abbaubaren Materialien hergestellt und zu Vlies-Gegenständen für biomedizinische Anwendungen verarbeitet werden, zu denen zellregulierende temporäre Sperrvorrichtungen und Biofiltrationsvorrichtungen gehören. Es können hohle nanoporöse Fasern hergestellt werden, die zellregulierende innere Oberflächen aufweisen. Durch das Verkapseln von Zellen in einem Teil einer derartigen Faser könnte ein Implantat für eine langfristige Arzneimittelzufuhr hergestellt werden, das erwünschte Produkte von Zellen in Mengen sekretiert, die vollständig oder teilweise durch Signale, die auf der inneren Oberfläche der Faser gebunden sind, reguliert werden. Zellregulierende, biologisch abbaubare, mikroporöse Gerüste mit einem oberflächlichen Überschuss an Kamm-Copolymeren können mittels Gefriertrocknungsverfahren hergestellt werden, indem ein sublimierendes Lösemittel gewählt wird, das eine höhere Affinität für die Komponente aus dem Kamm-Copolymer im Vergleich zur Komponente aus dem zweiten Polymer, das die Hauptmasse der Vorrichtung bildet, aufweist.
In allen oben beschriebenen Fällen, bei denen Kamm-Copolymere zusammen mit einem zweiten Polymer für die Herstellung einer Vorrichtung eingesetzt werden, können die Kamm-Copolymere nicht an Zellen bindende Kämme, ligandentragende Kämme oder eine Mischung von diesen sein, damit eine gewünschte Zellreaktion, wie es zuvor beschrieben wurde, erreicht wird.
Ein weiteres Verfahren, mittels dessen die Kamm-Copolymere zur Steuerung der Zellreaktion in biomedizinischen Anwendungen eingesetzt werden können, besteht aus der Herstellung von Polymerlatexmaterialien, bei denen die Kamm-Copolymere auf der Oberfläche der Latexteilchen eingearbeitet sind. Derartige Latexmaterialien werden mittels Dispersions- oder Emulsionspolymerisationsverfahren in einem wasserhaltigen Medium unter Verwendung der Kamm-Copolymere als Stabilisierungsmittel hergestellt. Die Polymerisierung wird durch das Auflösen oder Mischen des gewünschten Monomers, des Kamm-Stabilisators und des Initiators in einem wasserhaltigen Medium erreicht. Die Polymerisierung wird beispielsweise über die Erwärmung des Lösemittels initiiert. Das Dispersionsmedium ist ein gutes Lösemittel für das Kamm-Copolymer, aber ein schlechtes Lösemittel für das wachsende Polymer. Das hydrophobe Kamm-Rückgrat wird so gewählt, dass es mit dem Polymer, das synthetisiert wird, kompatibel ist und sich somit auf der Oberfläche der wachsenden Polymerteilchen verankert, während die hydrophilen Seitenketten die Teilchen gegen ein Ausflocken stabilisieren. Nach dem vollständigen Ablauf der Latexsynthese liegen die resultierenden Latexteilchen im Größenbereich von 0,1 bis 10 μm, und sie sind typischerweise mit einem Gewichtsanteil von 20-70 % an festem Polymer im Dispersionsmedium dispergiert. Diese Systeme können auf verschiedene Weise eingesetzt werden, um die Zellreaktion über die Kamm-Copolymere, die auf den Oberflächen der Teilchen verankert bleiben, zu steuern.
Filme oder Beschichtungen können aus den Latexdispersionen über übliche Verfahren, wie Tauchen, Bürsten, Walzen oder Gießen des Latex, auf jeder beliebigen Oberfläche hergestellt werden. Für Beschichtungen, die auf permanente Implantate zur Steuerung der Zellreaktion aufgetragen werden, werden nicht biologisch abbaubare Latexteilchen, beispielsweise Acrylmaterialien, bevorzugt. Es können opake Beschichtungen, die kontrollierte Zellreaktionen bewirken, über ein beliebiges der Standardbeschichtungsverfahren hergestellt werden, die von Fachleuten auf diesem Gebiet zur Bildung von Latexfilmen eingesetzt werden, beispielsweise über die soeben erwähnten. Alternativ koaleszieren die Teilchen als Folge einer Wärmebehandlung der Filme bei einer Temperatur, die deutlich oberhalb des Glasübergangs der Polymerteilchen liegt, zu einem glatten, transparenten Film, bei dem die Kamm-Copolymere an der Oberfläche liegen. Die Kamm-Copolymere bleiben nach dem Ablauf der Koaleszierung an der Oberfläche, und zwar entweder aufgrund einer energetisch bedingten Tendenz, an der Oberfläche zu bleiben, oder weil die Beweglichkeit des Kammes zur Diffusion in die Masse des koaleszierten Latexfilms nicht ausreicht, zum Beispiel, wenn der Film kurz nach der Koaleszenz auf eine Temperatur unterhalb seines Glasübergangs abgekühlt wird. Die Latexfilme weisen Oberflächeneigenschaften auf, die denjenigen der Kamm-Copolymere selbst ähnlich sind, aber sie zeigen die Vorteile, dass nur geringe Mengen des Kamm-Copolymers verwendet werden (typischerweise unter 1 Gew.-% des gesamten Latex), dass die Beschichtungen leicht aus Suspensionen auf Wasserbasis aufgetragen werden können, und dass die filmbildenden Eigenschaften so maßgeschneidert werden können, dass sie als Folge einer überlegten Auswahl des filmbildenden Polymers auf dem Träger haften. Zum Beispiel könnte ein Acryl-Latex, das durch nicht an Zellen bindende Kamm-Copolymere stabilisiert ist, dazu verwendet werden, transparente Acryl-Beschichtungen auf intraokulären Acryl-Linsen herzustellen, damit diese widerstandsfähig gegen eine Anheftung von Zellen und somit weniger anfällig für eine allmähliche Trübung gemacht werden. Acryl-Latexmaterialien könnten auch in Anwendungen eingesetzt werden, bei denen eine kontrollierte Zellreaktion an der Oberfläche permanenter Implantate oder anderer Vorrichtungen aus Metall, Glas oder Keramik gewünscht wird, einschließlich von Zellkulturgeräten, da man zwischen Oxidoberflächen und Acryl-Polymeren häufig eine starke Adhäsion findet. Für Zellkulturplatten oder andere Geräte aus Polystyrol könnte ein zellregulierendes PS-Latex dazu verwendet werden, eine transparente, zellregulierende Beschichtung auf die oben beschriebene Weise herzustellen.
In allen oben beschriebenen Fällen, bei denen Latexmaterialien durch Kamm-Copolymere stabilisiert werden, könnten die Kamm-Copolymere nicht an Zellen bindende Kämme, ligandentragende Kämme oder eine Mischung von diesen sein, um eine gewünschte Zellreaktion zu erzielen, wie weiter oben beschrieben wurde. Alternativ können gemischte Latex-Dispersionen zur Herstellung von Filmen verwendet werden, die Bereiche mit clusterförmig angeordneten Liganden auf einer Oberfläche mit einer Größe zwischen 0,1 bis 10 μm enthalten. Das kann durch das Zusammenmischen von Dispersionen aus Latexteilchen, die mit nicht an Zellen bindenden Kämmen beschichtet sind, und solchen, die mit ligandentragenden Kämmen beschichtet sind, und das Erzeugen von Filmen aus diesen gemischten Dispersionen, wie es oben beschrieben wurde, erreicht werden. Die Größe der Liganden-Cluster ist ungefähr der Durchmesser der Latexteilchen, die mit ligandentragenden Kämmen beschichtet sind, während die Zahl der Cluster auf der Oberfläche pro Oberflächeneinheit über das Verhältnis der ligandentragenden zu den nicht an Zellen bindenden Latexteilchen in der gemischten Dispersion gesteuert werden kann.
Für Anwendungen, bei denen ein biologisch abbaubarer Film bevorzugt wird, können biologisch abbaubare Latexmaterialien durch die Verwendung von Kamm-Stabilisatoren mit biologisch abbaubaren Rückgraten hergestellt werden. Derartige biologisch abbaubare Latexmaterialien könnten auch als Träger für eine Arzneimittelzufuhr, wie es oben beschrieben wurde, eingesetzt werden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Es werden Copolymere vom Kamm-Typ, die regulierte zelluläre Reaktionen hervorrufen, Verfahren, mittels derer derartige Polymere auf einer Oberfläche angeordnet werden können, und Verfahren zur Verwendung derartiger Polymere zur Modifizierung der Oberflächen von biomedizinischen Vorrichtungen offenbart. Diese Polymere sind durch Eigenschaften charakterisiert, die eine Funktion des Typs und des Verhältnisses von hydrophilen Seitenketten und Polymeren mit hydrophobem Rückgrat, des Typs und der Zahl der angeknüpften, als zelluläre Signale wirkenden Liganden, des Molekulargewichtes und der Verarbeitungsbedingungen sind.
1. Polymerzusammensetzung
A. Polymerarchitektur
Die Polymere sind Copolymere vom Kamm-Typ mit einem Rückgrat, das aus einem hydrophoben, wasserunlöslichen Polymer besteht, und Seitenketten, die aus kurzen, hydrophilen, nicht an Zellen bindenden Polymeren mit einem Molekulargewicht zwischen 200 und 2000 Dalton bestehen. Das hydrophobe Rückgrat kann biologisch abbaubar oder nicht biologisch abbaubar sein, in Abhängigkeit von der gewünschten Anwendung. Das gesamte Kamm-Copolymer sollte ein Molekulargewicht haben, dass im schmelzflüssigen Zustand ausreichend hoch ist, so dass es dem Polymer über eine Kettenverknäuelung gute mechanische Eigenschaften verleiht, das heißt, das Molekulargewicht sollte über dem Molekulargewicht der Kettenverknäuelung liegen, wie es von einem Fachmann auf diesem Gebiet definiert wird. Das Gesamt-Molekulargewicht des Kamm-Copolymers sollte somit über ungefähr 10 000 Dalton liegen, bevorzugter über 20 000 Dalton und noch bevorzugter über 30 000 Dalton. Die Kamm-Copolymere können durch die Copolymerisation eines hydrophilen Makromonomers, das ein polymerisierbares Kettenende enthält, mit einem zweiten hydrophoben Monomer hergestellt werden. Alternativ kann ein hydrophobes Monomer mit einem zweiten Monomer, das geeignete reaktive Gruppen enthält, durch die die hydrophilen Seitenketten auf das Rückgrat gepfropft werden können, copolymerisiert werden. Alternativ kann ein hydrophobes Monomer mit einer geeigneten reaktiven Seitengruppe polymerisiert werden, und ein Teil dieser reaktiven Seitengruppen kann durch das Aufpfropfen hydrophiler Seitenketten modifiziert werden. Ein definierter Prozentsatz der nicht an Zellen bindenden Seitenketten kann an ihrem Ende mit einem geeigneten Liganden versehen werden, um eine spezifische zelluläre Reaktion hervorzurufen.
B. Hydrophobe Polymerrückgrate
1. Biologisch abbaubare hydrophobe Polymere
Hydrophobe Polymere, die dazu verwendet werden, den Rückgraten der Kamm-Copolymere die Eigenschaft der biologischen Abbaubarkeit zu verleihen, sind unter In-vivo-Bedingungen vorzugsweise hydrolysierbar. Zu geeigneten biologisch abbaubaren polymeren Einheiten gehören Hydroxysäuren oder andere biologisch abbaubare Polymere, die zu Abbauprodukten führen, die nicht toxisch sind oder als normale Metaboliten im Körper vorkommen. Zu diesen gehören Poly(aminosäuren), Poly(anhydride), Poly(orthoester) und Poly(phosphoester). Polylactone wie Poly(epsilon-caprolacton), Poly(delta-valerolacton), Polygamma-butyrolacton) und Poly(beta-hydroxybutyrat) zum Beispiel sind ebenfalls nützlich. Bevorzugte Poly(hydroxysäuren) sind Poly(glycolsäure), Poly(DL-milchsäure) und Poly(L-milchsäure) oder Copolymere von Poly(glycolsäure) und Poly(milchsäure). Im allgemeinen zersetzen sich diese Materialien in vivo sowohl durch eine nichtenzymatische als auch durch eine enzymatische Hydrolyse oder durch eine oberflächliche Erosion der gesamten Masse.
Biologisch abbaubare Bereiche können aus Monomeren, Oligomeren oder Polymeren unter Verwendung von Verknüpfungen konstruiert werden, die empfindlich gegenüber einem biologischen Abbau sind, wie Ester-, Peptid-, Anhydrid-, Orthoester- und Phosphoesterbindungen.
2. Nicht biologisch abbaubare hydrophobe Polymere
Zu repräsentativen nicht biologisch abbaubaren hydrophoben Polymeren, die in das Rückgrat der Kamm-Copolymere eingearbeitet werden könnten, gehören Polyalkylene wie Polyethylen und Polypropylen, Polychloropren, Polyvinylether, Polyvinylester wie Poly(vinylacetat), Polyvinylhalogenide wie Poly(vinylchlorid), Polysiloxane, Polystyrol, Polyurethane und Copolymere davon, Polyacrylate wie Poly(methyl(meth)acrylat), Poly(ethyl(meth)acrylat), Poly(butyl(meth)acrylat), Poly(isobutyl(meth)acrylat), Poly(hexyl(meth)acrylat), Poly(isodecyl(meth)acrylat), Poly(lauryl(meth)acrylat), Poly(phenyl(meth)acrylat), Poly(methylacrylat), Poly(isopropylacrylat), Poly(isobutylacrylat) und Poly(octadecylacrylat) (die hier gemeinsam als „Polyacrylate") bezeichnet werden) und Copolymere und Mischungen davon. Zu den Polymeren gehören nützliche Derivate, einschließlich von Polymeren mit Substitutionen, Additionen chemischer Gruppen, zum Beispiel von Alkyl-Gruppen, Alkylen-Gruppen, Hydroxylierungen, Oxidationen und anderen Modifikationen, die von Fachleuten auf diesem Gebiet routinemäßig eingeführt werden.
Zu bevorzugten nicht biologisch abbaubaren Polymeren gehören Ethylenvinylacetat, Polyacrylate, Poly(chloropren) und Copolymere und Mischungen davon.
C. Nicht an Zellen bindende hydrophile Seitenketten.
Die nicht an Zellen bindenden Seitenketten sind vorzugsweise wasserlöslich, wenn sie nicht am Rückgrat befestigt sind, und sie sind bevorzugter nichtionisch. Zu geeigneten polymeren Blöcken gehören diejenigen, die aus Poly(ethylenglycol), Poly(ethylenoxid), teilweise oder vollständig hydrolysiertem Poly(vinylalkohol), Poly(vinylpyrrolidon) und Dextran hergestellt werden. Vorzugsweise bestehen die Seitenketten aus Poly(ethylenglycol), Poly(ethylenoxid) oder Poly(acrylsäuren).
Die hydrophilen Seitenketten können von Haus aus biologisch abbaubar sein, oder sie können im Körper nur schlecht oder praktisch nicht biologisch abbaubar sein. In den letzteren beiden Fällen sollten die Seitenketten ein ausreichend niedriges Molekulargewicht haben, damit sie ausgeschieden werden können. Der bevorzugte Molekulargewichtsbereich liegt unter ungefähr 2000 Dalton, bevorzugter unter 1000 Dalton und am bevorzugtesten unter ungefähr 500 Dalton. Wenn das Polymer Polyethylenglycol ist wird es bevorzugt, dass die Zahl der monomeren Einheiten des Ethylenoxids zwischen ungefähr 4 und 20 liegt.
Wenn Monomere, die Doppelbindungen enthalten, zur Herstellung des Polymerrückgrats verwendet werden, besteht ein bevorzugtes Verfahren zur Einarbeitung der hydrophilen Seitenketten aus der Verwendung eines hydrophilen Makromonomers mit einer reaktiven Doppelbindung an einem Ende, das zufällig während der über freie Radikale oder über einen anderen Additionsmechanismus verlaufenden Polymerisation inkorporiert werden kann. Ein Beispiel für ein derartiges Makromonomer ist PEG-Methacrylat. Die Dichte der nicht an Zellen bindenden hydrophilen Seitenketten längs des Polymerrückgrats wird über die Steuerung der relativen Mengen des PEG-Methacrylats oder anderer geeigneter makromonomerer Einheiten, die verwendet werden, gesteuert.
Bei denjenigen Ausführungsformen, bei denen die Seitengruppen an ihren Enden mit als zelluläre Signale wirkenden Liganden versehen sind, enthalten die Enden der Makromonomere geeignete funktionelle Gruppen wie -NH₂, -OH oder COOH.
D. Monomere mit reaktiven funktionellen Gruppen
Bei vielen der hier beschriebenen Ausführungsformen enthalten die Monomere, die zur Bildung des Polymerrückgrats eingesetzt werden, nur zwei reaktive Gruppen, von denen beide zur Bildung des Polymers umgesetzt werden. Zum Beispiel enthält Milchsäure zwei reaktive Gruppen, eine Hydroxygruppe und eine Carboxygruppe. -OH ist die bevorzugte reaktive Gruppe. Zwar enthalten die Enden eines Polymilchsäure-Polymers eine Hydroxygruppe und eine Carboxygruppe, aber es gibt keine reaktiven Gruppen längs des Rückgrates in der fertigen Polymerkette, die zur Bildung eines Kamm-Copolymers verwendet werden können.
Monomere, die eine oder mehrere zusätzliche reaktive Gruppe(n) enthalten, müssen in das Polymerrückgrat eingearbeitet werden, vorzugsweise auf zufällige Weise, um die Copolymere vom Kamm-Typ zu bilden, wenn Monomere, die diese reaktiven Gruppen nicht enthalten, zur Bildung des Polymerrückgrats verwendet werden. Beispiele für diese Monomer-Typen sind Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannt.
Die Anforderungen an ein geeignetes reaktives Monomer bestehen darin, dass es in die wachsende Polymerkette eingearbeitet werden kann, indem es an den gleichen Typen chemischer Reaktionen teilnimmt wie die wachsende Polymerkette. Wenn zum Beispiel Lactid unter Verwendung eines Lewissäure-Katalysators polymerisiert wird, kann ein Depsipeptid (ein cyclisches Dimeres einer Aminosäure) aus Lysin hergestellt werden, bei dem die epsilon-Aminogruppe geschützt ist, zum Beispiel mit einer t-Boc-Schutzgruppe. Das Lysin wird in das Polymer eingearbeitet, und die Schutzgruppe kann entfernt werden. Die resultierenden Aminogruppen können mit hydrophilen Polymeren reagieren, die Abgangsgruppen wie Tosylate, Tresylate, Mesylate, Triflate und andere Abgangsgruppen enthalten, die Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannt sind.
Alternativ kann das reaktive Monomer eine Abgangsgruppe enthalten, die durch eine nukleophile Gruppe auf einem hydrophilen Polymer ersetzt werden kann. Zum Beispiel kann Epichlorhydrin während des Polymerisationsschrittes verwendet werden. Das Monomer wird in das Polymerrückgrat eingearbeitet, und die Chlorid-Gruppe ist im Rückgrat enthalten und steht für nachfolgende Reaktionen mit Nukleophilen zur Verfügung. Ein Beispiel für ein geeignetes hydrophiles Polymer, das eine nukleophile Gruppe enthält, ist ein PEG mit einer terminalen Aminogruppe. PEG-NH₂ kann mit den Chlorid-Gruppen auf dem Polymerrückgrat reagieren, so dass eine gewünschte Dichte der PEG-ylierung auf dem Polymerrückgrat bereit gestellt wird. Mittels der hier beschriebenen Chemie kann man unter Einbeziehung der allgemeinen Kenntnisse von Experten auf diesem Gebiet Polymerrückgrate herstellen, die geeignete Abgangsgruppen oder Nukleophile für nachfolgende Kopplungsreaktionen mit geeignet funktionalisierten hydrophilen Polymeren enthalten.
E. Liganden für die Steuerung der Zellreaktion
Es sind verschiedene Moleküle bekannt, die eine Zelladhäsion fördern. Diese können Aminosäuren, Peptide oder Glycoproteine sein. Zu beispielhaften an Zellen bindenden Liganden gehören Peptide, die die Aminosäuresequenz Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD) oder Tyrosin-Isoleucin-Serin-Arginin-Glycin (YISRG) besitzen. Für die Sequenz RGD, die in Proteinen wie Fibronectin vorkommt, wurde gezeigt, dass sie bezüglich der Förderung der Zelladhäsion und des Wachstums aktiv ist (Massia, S.P. und Hubbell, J.A., J. Cell. Biol., 114: 1089 (1991)). Die Einarbeitung von RGD-Sequenzen an den Enden der Copolymer-Seitenketten kann somit die Zelladhäsion und das Wachstum verbessern. Das ist dann besonders nützlich, wenn ein Träger nicht adhäsiv ist, zum Beispiel ein Polyester, an dem Zellen wie Hepatozyten nur schlecht haften und der dann mit dem Kamm-Copolymer modifiziert wird, um die Zelladhäsion auf kontrollierte Weise zu fördern.
Biologisch aktive Moleküle können auch in das Copolymer eingearbeitet werden, um die Adhäsion und das Wachstum eines bestimmten Zelltyps in vivo zu fördern. Es sind viele Wachstumsfaktoren bekannt, und sie können von kommerziellen Quellen wie Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, bezogen werden, zum Beispiel Wachstumsfaktoren, zu denen der Epidermal Growth Factor, der Vascular Endothelial Growth Factor, der Fibroblast Growth Factor etc. gehören.
F. Relative Verhältnisse der Kamm-Komponenten
1. Verhältnis hydrophiler zu hydrophoben Einheiten
Die Dichte der hydrophilen Seitenketten längs des Polymerrückgrats hängt zum Teil vom Molekulargewicht der Seitenketten ab. Das gesamte prozentuale Verhältnis der hydrophilen Einheiten zu den hydrophoben Einheiten in den Kamm-Copolymeren liegt bei unter 60 Gew.-%, vorzugsweise zwischen 20 und 60 Gew.-% und vorzugsweise bei ungefähr 40 Gew.-%. Für hydrophile Seitenketten mit einem Molekulargewicht von ungefähr 350 können die Molprozente der Rückgratabschnitte, die hydrophile Seitenketten tragen, bei bis zu ungefähr 30 % liegen. Für hydrophile Seitenketten mit einem Molekulargewicht von ungefähr 2000 können die Molprozente bei bis zu lediglich 2 % liegen.
Die relevante Überlegung bei der Bestimmung eines geeigneten Verhältnisses von hydrophilen zu hydrophoben Einheiten in den Kamm-Copolymeren ist die, dass das Gesamtpolymer, wenn die hydrophilen Seitenketten an ihren Enden nicht mit als zellulären Signalen wirkenden Liganden versehen sind, die definierte Eigenschaft nicht an Zellen zu binden aufweist und vorzugsweise nicht wasserlöslich ist. Eine relativ hohe Dichte an sehr kurzen (MG 500 oder weniger) hydrophilen Seitenketten kann das gleiche Ausmaß einer Widerstandsfähigkeit gegen eine Zelladhäsion bereit stellen wie eine niedrigere Dichte an hochmolekularen (z.B. ein MG zwischen 1500 und 2000) Seitenketten. Fachleute auf diesem Gebiet können das Molekulargewicht und die Dichte der Polymere unter Berücksichtigung dieser Faktoren einstellen.
2. Dichte der angeknüpften Liganden
Die nicht an Zellen bindenden Seitenketten der Kamm-Copolymere können an ihren Enden mit als zelluläre Signale dienenden chemischen Liganden versehen werden, um spezifische Zellreaktionen hervorzurufen. Liganden wie Adsorptionspeptide oder Wachstumsfaktoren können kovalent oder ionisch mittels bekannter chemischer Verfahren an den Enden der Seitenketten befestigt werden, um den Zellen spezifische chemische Signale bereit zu stellen. Ein definierter Anteil ligandentragender Seitenketten kann durch die Verwendung einer geeigneten stöchiometrischen Steuerung während der Kopplung der Liganden an die Enden der Seitenketten, durch das Schützen der Endgruppen derjenigen Seitenketten, die an ihren Enden nicht mit Liganden versehen werden sollen, oder durch Kombinationen dieser Ansätze erhalten werden. Für Anwendungen, bei denen es wünschenswert ist, die Liganden in Form von Clustern im Längenmaßstab von Nanometern oder mehreren zehn Nanometern auf einer Oberfläche eines Biomaterials anzuordnen, kann mehr als ein Ligand (im Durchschnitt) an jede Kette des Kamm-Copolymers angefügt werden. Bei Anwendungen, bei denen es erwünscht ist, zwei oder mehr Ligandentypen in einem einzigen Cluster auf einer Oberfläche eines Biomaterials im Größenmaßstab von Nanometern bis mehreren zehn Nanometern anzuordnen, kann einer oder können mehrere eines jeden Ligandentyps (zum Beispiel ein Adhäsionspeptid und ein Wachstumsfaktor) mittels bekannter chemischer Verfahren an jeder Kette des Kamm-Copolymers (im Durchschnitt) angefügt werden. Die Präsentation des Liganden (oder der Liganden) auf der Oberfläche kann somit hinsichtlich der Gesamt-Oberflächendichte über das Ausnützen der verzweigten Natur des Kamm-Moleküls, bezüglich der lokalen Dichte, über die Zahl der Liganden, die an denselben Kamm angefügt sind, maßgeschneidert werden. Die Fähigkeit der Polymere zur Steuerung der Zelladhäsion oder anderer Zellfunktionen kann über das Steuern der Dichte der als zelluläre Signale wirkenden Liganden, die an der Oberfläche präsentiert werden, eingestellt werden.
II. Polymermischungen
A. Mischungen von Kamm-Copolymeren
Wenn Adhäsionspeptide an die Seitenketten des Kamm-Copolymers gekoppelt werden, dann heften sich die Zellen an und breiten sich schnell auf der Oberfläche des Kamm-Copolymers aus. Das Ausmaß der Zellausbreitung und der Proliferation auf der Oberfläche kann somit über das Mischen von Kamm-Copolymeren, die Adhäsionspeptide tragen, mit Kamm-Copolymeren, die nicht an Zellen binden, gesteuert werden, so dass zum Beispiel weniger als 20 %, typischer weniger als 2 %, der Kämme ein Adhäsionspeptid tragen. Ähnlich kann die räumliche Verteilung der Liganden-Cluster auf der Oberfläche des Biomaterials über das Mischen von Kamm-Copolymeren, die nicht an Zellen binden, mit Kamm-Copolymeren, bei denen jede Kette im Durchschnitt mehr als einen Liganden an ihren Seitenketten befestigt trägt, gesteuert werden.
Die Größe der Liganden-Cluster (d.h. die Fläche, auf der die Liganden lokalisiert sind) wird durch die charakteristische Größe des ligandentragenden Kamm-Copolymers vorgegeben, und sie kann aus dem Trägheitsradius R_G des Kamm-Copolymers abgeschätzt werden, der von einem Fachmann auf diesem Gebiet berechnet oder experimentell bestimmt werden kann. Der Trägheitsradius des Kamm-Copolymers kann typischerweise zwischen Nanometern und mehreren zehn Nanometern liegen, in Abhängigkeit vom Gesamt-Molekulargewicht, der Länge der Seitenketten und der Umgebung, die die Polymerkette umgibt, z.B. andere Polymerketten oder Wassermoleküle. Somit können die Größe der Liganden-Cluster sowie die Zahl und der Typ der Liganden pro Cluster über die Bedingungen bei der Synthese der ligandentragenden Kamm-Copolymere gesteuert werden. Zum Beispiel hätte ein Kamm-Copolymer mit R_G eine Fläche pro Cluster von πR_G ². Die Zahl der Cluster auf der Oberfläche pro Oberflächeneinheit (im Durchschnitt) kann über das Verhältnis der ligandentragenden zu den nicht an Zellen bindenden Kämmen auf der Oberfläche gesteuert werden. Um eine Trenndistanz von d zwischen den Liganden-Clustern auf der Oberfläche zu erreichen, wobei d > 2R_G, sollte die Konzentration der ligandentragenden Kämme ungefähr ϕ = V_Kette/(2R_G d²) sein, wobei V_Kette das Volumen ist, das von einer einzelnen Kette des Kamm-Copolymers besetzt wird.
B. Mischungen von Kamm-Copolymeren und anderen Polymeren
Die hier beschriebenen Copolymere können mit anderen Polymeren gemischt werden, die keine gesteuerten Zellreaktionen hervorrufen. Bei Anwendungen, bei denen es wünschenswert ist, das Kamm-Copolymer zur Modifizierung der Oberfläche eines zweiten, hydrophoben oder nicht-zellregulierenden Polymers zu einzusetzen, kann das Kamm-Copolymer in kleinen Mengen zum zweiten Polymer gegeben und verarbeitet werden, um eine Abscheidung des Kamms auf der Oberfläche zu erreichen. Zu Blends der Kamm-Copolymere mit anderen Polymeren gehören diejenigen, die zwischen 1 und 99 Gew.-% an Kamm-Copolymeren, vorzugsweise weniger als 20 Gew.-% an Kamm-Copolymeren und bevorzugter weniger als 10 Gew.-% an Kamm-Copolymeren enthalten. Zu Verarbeitungsschritten für die Erzielung einer Abscheidung gehören die Erwärmung der Mischung im Vakuum, an Luft, in Wasser, Wasserdampf, superkritischem CO₂ oder einer anderen Umgebung, die das Kamm-Copolymer an der Oberfläche begünstigt, bei Temperaturen, die hoch genug über den Glasübergängen der Polymerkomponenten (des Matrixpolymers und des Zusatzes aus dem Kamm-Copolymer) liegen, so dass sie eine Beweglichkeit für die Erzielung der Abscheidung auf der Oberfläche bereit stellen. In dem Falle, bei dem die zweite Polymerkomponente ein semikristallines Polymer ist, sollte die Annealingtemperatur über dem Glasübergang liegen, aber unter dem Schmelzpunkt des Polymers, um sicher zu stellen, dass die gewünschte Form der Vorrichtung beibehalten wird.
Bei bevorzugten Ausführungsformen wird die Oberflächenabscheidung während eines Standard-Verarbeitungsschrittes bei der Herstellung einer biomedizinischen Vorrichtung erzielt, beispielsweise während eines Extraktions-, Autoklavierungs- oder Sterilisierungsprozesses. Bei anderen Ausführungsformen wird die Abscheidung in einem zusätzlichen Annealingschritt in einer kontrollierten Umgebung (Wasser etc.) erreicht, und zwar nach der Herstellung der Vorrichtung. Derartige Verarbeitungsschritte erzeugen eine Oberflächenschicht mit einer Dicke von ungefähr 2R_G, die fast ausschließlich das Kamm-Copolymer enthält. Die beobachtbaren Oberflächeneigenschaften derartiger, einem Annealing unterzogener Mischungen sind im wesentlichen mit denjenigen der reinen Kamm-Copolymere identisch. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist das Kamm-Copolymer mit dem zweiten Polymer mischbar, um eine Phasentrennung in der Hauptmasse der Vorrichtung zu vermeiden, die zu schlechten mechanischen oder optischen Eigenschaften führen könnte.
In anderen Fällen kann die Lokalisierung des Kamm-Polymers auf der Oberfläche einer Vorrichtung, die in erster Linie aus einem zweiten, hydrophoben oder nicht-zellregulierenden Polymer besteht, während anderer Schritte der Herstellung der Vorrichtung erreicht werden. Zum Beispiel kann die genaue Platzierung des Kamm-Copolymers auf der Oberfläche einer Vorrichtung, die aus einem zweiten Polymer besteht, mittels 3DP-Verfahren erreicht werden. Ähnlich können Unterschiede der Viskosität zwischen dem Kamm-Copolymer und einem zweiten Polymer, wenn sie gemischt werden, dazu ausgenützt werden, den Kamm während der Schmelzextrusion von Fasern, Filmen oder anderen Vorrichtungen auf der Oberfläche anzuordnen. Poröse oder nicht-poröse Membranen, Filme, Fasern oder Hohlfasern, bei denen das Kamm-Copolymer auf den Oberflächen vorkommt, können durch ein Phaseninversionsgießen hergestellt werden. Bei diesem Verfahren wird eine Lösung aus dem Kamm-Copolymer, dem zweiten Polymer und einem Lösemittel für beide in ein Koagulationsbad auf wässriger Basis gegossen, um die Vorrichtung zu formen. Während des Gießvorganges induzieren günstige Wechselwirkungen zwischen dem Kamm und dem Medium des Koagulationsbades eine Abscheidung des Kamm-Copolymers auf die äußeren Oberflächen des Films, der Faser oder der Membran. Auf diese Weise können zellregulierende, mikroporöse, biologisch abbaubare Membranen, die als temporäre Trennvorrichtungen in Anwendungen für eine Wundheilung nützlich sind, hergestellt werden. Zellregulierende, biologisch abbaubare Nähte können ähnlich durch das Spinnen von Fasern aus einer Lösung in ein Koagulationsbad auf wässriger Basis hergestellt werden. Derartige oberflächenmodifizierte Fasern können auch aus biologisch abbaubaren oder nicht biologisch abbaubaren Materialien hergestellt und zu Vlies-Gegenständen für biomedizinische Anwendungen verarbeitet werden, zu denen zellregulierende temporäre Sperrvorrichtungen und Biofiltrationsvorrichtungen gehören. Es können hohle nanoporöse Fasern hergestellt werden, die zellregulierende innere Oberflächen aufweisen. Durch das Verkapseln von Zellen in einem Teil einer derartigen Faser könnte ein Implantat für eine langfristige Arzneimittelzufuhr hergestellt werden, das erwünschte Produkte von Zellen in Mengen sekretiert, die vollständig oder teilweise durch Signale, die auf der inneren Oberfläche der Faser gebunden sind, reguliert werden. Zellregulierende, biologisch abbaubare, mikroporöse Gerüste mit einem oberflächlichen Überschuss an Kamm-Copolymeren können mittels Gefriertrocknungsverfahren hergestellt werden, indem ein sublimierendes Lösemittel gewählt wird, das eine höhere Affinität für die Komponente aus dem Kamm-Copolymer im Vergleich zur Komponente aus dem zweiten Polymer, das die Hauptmasse der Vorrichtung bildet, aufweist.
In allen oben beschriebenen Fällen, bei denen Kamm-Copolymere zusammen mit einem zweiten Polymer für die Herstellung einer Vorrichtung eingesetzt werden, können die Kamm-Copolymere nicht an Zellen bindende Kämme, ligandentragende Kämme oder eine Mischung von diesen sein, damit eine gewünschte Zellreaktion, wie es zuvor beschrieben wurde, erreicht wird. Die beobachtbaren Oberflächeneigenschaften der Vorrichtung sind im wesentlichen mit denjenigen des Kamm-Copolymers oder der Kamm-Copolymer-Mischung identisch.
III. Latexmaterialien, die mit Kamm-Copolymeren hergestellt werden
A. Latexsynthese
Ein weiteres Verfahren, mittels dessen die Kamm-Copolymere zur Steuerung der Zellreaktion in biomedizinischen Anwendungen eingesetzt werden können, besteht aus der Herstellung von Polymerlatexmaterialien, bei denen die Kamm-Copolymere auf der Oberfläche der Latexteilchen eingearbeitet sind. Derartige Latexmaterialien werden mittels Dispersions- oder Emulsionspolymerisationsverfahren in einem wasserhaltigen Medium unter Verwendung der Kamm-Copolymere als Stabilisierungsmittel hergestellt. Die Polymerisierung wird durch das Auflösen des gewünschten Monomers, des Kamm-Stabilisators und des Initiators in einem wasserhaltigen Medium erreicht. Die Polymerisierung wird beispielsweise über die Erwärmung des Lösemittels initiiert. Das Dispersionsmedium ist ein gutes Lösemittel für das Kamm-Copolymer, aber ein schlechtes Lösemittel für das wachsende Polymer. Das hydrophobe Kamm-Rückgrat wird so gewählt, dass es mit dem Polymer, das synthetisiert wird, kompatibel ist und sich somit auf der Oberfläche der wachsenden Polymerteilchen verankert, während die hydrophilen Seitenketten die Teilchen gegen ein Ausflocken stabilisieren. Nach dem vollständigen Ablauf der Latexsynthese liegen die resultierenden Latexteilchen im Größenbereich von 0,1 bis 10 μm, und sie sind typischerweise mit einem Gewichtsanteil von 20 – 70 % an festem Polymer im Dispersionsmedium dispergiert. Diese Systeme können auf verschiedene Weise eingesetzt werden, um die Zellreaktion über die Kamm-Copolymere, die auf den Oberflächen der Teilchen verankert bleiben, zu steuern.
Zu Polymeren, die als Latexteilchen für Anwendungen nicht biologisch abbaubarer Materialien synthetisiert werden könnten, gehören Polyvinylether, Polyvinylester wie Poly(vinylacetat), Polyvinylhalogenide wie Poly(vinylchlorid), Polystyrol und Polyacrylate wie Poly(methyl(meth)acrylat), Poly(ethyl(meth)acrylat), Poly(butyl(meth)acrylat), Poly(isobutyl(meth)acrylat), Poly(hexyl(meth)acrylat), Poly(isodecyl(meth)acrylat), Poly(lauryl(meth)acrylat), Poly(phenyl(meth)acrylat), Poly(methylacrylat), Poly(isopropylacrylat), Poly(isobutylacrylat) und Poly(octadecylacrylat) und Copolymere und Mischungen davon sowie nützliche Derivate dieser Polymere, einschließlich von Polymeren mit Substitutionen, Additionen chemischer Gruppen, zum Beispiel von Alkyl-Gruppen, Alkylen-Gruppen, Hydroxylierungen, Oxidationen und anderen Modifikationen, die von Fachleuten auf diesem Gebiet routinemäßig eingeführt werden.
Zu Polymeren, die als Latexteilchen für Anwendungen biologisch abbaubarer Materialien synthetisiert werden könnten, gehören Poly(aminosäuren), Poly(anhydride), Poly(orthoester) und Poly(phosphoester). Polylactone wie Poly(epsilon-caprolacton), Poly(delta-valerolacton), Poly(gamma-butyrolacton) und Poly(beta-hydroxybutyrat) sowie Poly(hydroxysäuren) wie Poly(glycolsäure), Poly(DL-milchsäure) und Poly(L-milchsäure) oder Copolymere von Poly(glycolsäure) und Poly(milchsäure).
B. Latexfilme
Filme oder Beschichtungen können aus den Latexdispersionen über übliche Verfahren, wie Tauchen, Bürsten, Walzen oder Gießen des Latex, auf jeder beliebigen Oberfläche hergestellt werden. Für Beschichtungen, die auf permanente Implantate zur Steuerung der Zellreaktion aufgetragen werden, werden nicht biologisch abbaubare Latexteilchen, die mit nicht biologisch abbaubaren Kamm-Stabilisatoren hergestellt werden, bevorzugt. Für Anwendungen, bei denen ein biologisch abbaubarer Film bevorzugt wird, können biologisch abbaubare Latexmaterialien unter Verwendung von Kamm-Stabilisatoren mit biologisch abbaubaren Rückgraten hergestellt werden. Es können opake Beschichtungen, die kontrollierte Zellreaktionen bewirken, über ein beliebiges der Standardbeschichtungsverfahren hergestellt werden, die zur Bildung von Latexfilmen eingesetzt werden, beispielsweise über die soeben erwähnten. Alternativ koaleszieren die Teilchen als Folge einer Wärmebehandlung der Filme bei einer Temperatur, die deutlich oberhalb des Glasübergangs der Polymerteilchen liegt, zu einem glatten, transparenten Film, bei dem die Kamm-Copolymere an der Oberfläche liegen. Die Kamm-Copolymere bleiben nach dem Ablauf der Koaleszierung an der Oberfläche, und zwar entweder aufgrund einer energetisch bedingten Tendenz, an der Oberfläche zu bleiben, oder weil die Beweglichkeit des Kammes zur Diffusion in die Masse des koaleszierten Latexfilms nicht ausreicht, zum Beispiel, wenn der Film kurz nach der Koaleszenz auf eine Temperatur unterhalb seines Glasübergangs abgekühlt wird.
Die Latexfilme weisen die Oberflächeneigenschaften der Kamm-Copolymere selbst auf, aber sie zeigen die Vorteile, dass nur geringe Mengen des Kamm-Copolymers benötigt werden (typischerweise unter 1 Gew.-% des gesamten Latex), dass die Beschichtungen leicht aus Suspensionen auf Wasserbasis aufgetragen werden können, und dass die filmbildenden Eigenschaften so maßgeschneidert werden können, dass sie als Folge einer überlegten Auswahl des filmbildenden Polymers auf dem Träger haften. Zum Beispiel könnte ein Acryl-Latex, das durch nicht an Zellen bindende Kamm-Copolymere stabilisiert ist, dazu verwendet werden, transparente Acryl-Beschichtungen auf intraokulären Acryl-Linsen herzustellen, damit diese widerstandsfähig gegen eine Anheftung von Zellen und somit weniger anfällig für eine allmähliche Trübung gemacht werden. Acryl-Latexmaterialien könnten auch in Anwendungen eingesetzt werden, bei denen eine kontrollierte Zellreaktion an der Oberfläche permanenter Implantate oder anderer Vorrichtungen aus Metall, Glas oder Keramik gewünscht wird, einschließlich von Zellkulturgeräten, da man zwischen Oxidoberflächen und Acryl-Polymeren häufig eine starke Adhäsion findet. Für Zellkulturplatten oder andere Geräte aus Polystyrol könnte ein zellregulierendes PS-Latex dazu verwendet werden, eine transparente, zellregulierende Beschichtung auf die oben beschriebene Weise herzustellen.
In allen oben beschriebenen Fällen, bei denen Latexmaterialien durch Kamm-Copolymere stabilisiert werden, könnten die Kamm-Copolymere nicht an Zellen bindende Kämme, ligandentragende Kämme oder eine Mischung von diesen sein, um eine gewünschte Zellreaktion zu erzielen, wie weiter oben beschrieben wurde. Alternativ können gemischte Latex-Dispersionen zur Herstellung von Filmen verwendet werden, die Bereiche mit clusterförmig angeordneten Liganden auf einer Oberfläche mit einer Größe zwischen 0,1 bis 10 μm enthalten. Das kann durch das Zusammenmischen von Dispersionen aus Latexteilchen, die mit nicht an Zellen bindenden Kämmen beschichtet sind, und solchen, die mit ligandentragenden Kämmen beschichtet sind, und das Erzeugen von Filmen aus diesen gemischten Dispersionen, wie es oben beschrieben wurde, erreicht werden. Die Größe der Liganden-Cluster ist ungefähr der Durchmesser der Latexteilchen, die mit ligandentragenden Kämmen beschichtet sind, während die Zahl der Cluster auf der Oberfläche pro Oberflächeneinheit über das Verhältnis der ligandentragenden zu den nicht an Zellen bindenden Latexteilchen in der gemischten Dispersion gesteuert werden kann.
IV. Polymerherstellung
Verfahren zur Herstellung hydrophober Polymere, die reaktive monomere Einheiten enthalten, sind bekannt. Typische Reaktionen sind eine Ringöffnungspolymerisation (für Monomere wie Lactid, Glycolid und andere cyclische monomere Einheiten), eine radikalische Polymerisation (für monomere Einheiten, die Doppelbindungen enthalten, wie Methylmethacrylat) und anionische oder andere Additionspolymerisationen.
Die Monomere, die zur Herstellung des hydrophoben Polymerrückgrats verwendet werden, zum Beispiel Lactid, Glycolid, Caprolacton und Trimethylencarbonat, können mit verschiedenen Polymerisationsinitiatoren, zum Beispiel Alkoholen wie Ethylenglycol und Ethanol, Wasser und Aminen, in Gegenwart eines geeigneten Katalysators, wie einer Lewissäure, umgesetzt werden, wie es zum Beispiel beschrieben wurde bei Kricheldorf, H.R., in Models of Biopolymers by Ring-Opening Polymerization, Penczek, S., Hrsg., CRC Press, Boca Raton, 1990, Kapitel 1, bei Kricheldorf, H.R., α-Aminoacid-N-Carboxy-Anhydrides and Related Heterocycles, Springer-Verlag, Berlin, 1987, und bei Imanishi, Y., in Ring-Opening Polymerization, Ivin, K.J und Saegusa, T., Hrsg., Elsevier, London, 1984, Band 2, Kapitel 8.
Die an Zellen bindenden Polymer-Seitenketten, die auf das Polymer-Rückgrat gepfropft werden, sind vorzugsweise hydrophile Polymere, wie Polyethylenglycol, Polyethylenoxid, Polyacrylsäure, Dextran und Mischungen davon, die so modifiziert werden können, dass sie reaktive funktionelle Gruppen enthalten, wie Amino-, Carbonsäure-, Halogen-, Sulfid-, Guanidino-, Imidazol- und Hydroxygruppen. Diese Gruppen können mit verschiedenen reaktiven Gruppen auf dem Polymer-Rückgrat in routinemäßigen nukleophilen Substitutionsreaktionen umgesetzt werden, um die hydrophilen Polymere auf das Rückgrat zu pfropfen. Die Seitenkettenpolymere können über standardmäßige Reaktionen einer kovalenten oder ionischen Kopplung an ihren Enden mit an Zellen bindenden Liganden versehen werden.
V. Oberflächenbeschichtungen und Vorrichtungen, die Kamm-Copolymere beinhalten
Es können zahlreiche Verfahren eingesetzt werden, um die Kamm-Copolymere, Mischungen von Kamm-Copolymeren oder Mischungen von Kamm-Copolymeren und anderen Polymeren auf Oberflächen aufzutragen. Zu diesen Verfahren gehören ein Tauchbeschichten, ein Sprühbeschichten, ein Bürstenstreichen, ein Walzenstreichen oder ein Rotationsgießen eines Films auf den Träger, gefolgt von einer milden Erwärmung, um die Adhäsion auf der Oberfläche zu fördern. Prozesse zur Ausbildung einer festen freien Form, wie 3DP- oder Gefriertrocknungsverfahren könnten eingesetzt werden, um komplexe dreidimensionale Strukturen, einschließlich poröser Strukturen, zu erzeugen. Bei all diesen Verarbeitungsansätzen könnte ein geeignetes Vernetzungsmittel eingearbeitet werden, um die mechanische Festigkeit des Films oder der Vorrichtung zu erhöhen.
Bei Anwendungen, bei denen Mischungen von Kamm-Copolymeren mit anderen Polymeren gewünscht sind, gehören zu Verarbeitungsschritten für die Erzielung einer Abscheidung des Kamm-Copolymers die Erwärmung der Mischung im Vakuum, an Luft, in Wasser, Wasserdampf, superkritischem CO₂ oder einer anderen Umgebung, die das Kamm-Copolymer an der Oberfläche begünstigt, bei Temperaturen, die hoch genug über den Glasübergängen der Polymerkomponenten liegen, so dass sie eine Beweglichkeit für die Erzielung der Abscheidung auf der Oberfläche bereit stellen. In dem Falle, bei dem die zweite Polymerkomponente ein semikristallines Polymer ist, sollte die Annealingtemperatur über dem Glasübergang liegen, aber unter dem Schmelzpunkt des Polymers, um sicher zu stellen, dass die gewünschte Form der Vorrichtung beibehalten wird.
Die Oberflächenabscheidung könnte vorzugsweise während eines Standard-Verarbeitungsschrittes bei der Herstellung einer biomedizinischen Vorrichtung erzielt werden, beispielsweise während eines Extraktions-, Autoklavierungs- oder Sterilisierungsprozesses, oder sie könnte in einem separaten Annealingschritt nach der Herstellung der Vorrichtung erfolgen. Dieser Verarbeitungstyp erzeugt eine Oberflächenschicht auf der Vorrichtung, die fast ausschließlich das Kamm-Copolymer enthält. In anderen Fällen kann die Lokalisierung des Kamm-Polymers auf der Oberfläche einer Vorrichtung, die in erster Linie aus einem zweiten Polymer besteht, während anderer Schritte der Herstellung der Vorrichtung erreicht werden. Zum Beispiel können Unterschiede der Viskosität zwischen dem Kamm-Copolymer und einem zweiten Polymer, wenn sie gemischt werden, dazu ausgenützt werden, den Kamm während der Schmelzextrusion von Fasern, Filmen oder anderen Vorrichtungen auf der Oberfläche anzuordnen. Poröse oder nicht-poröse Membranen, Filme, Fasern oder Hohlfasern, bei denen das Kamm-Copolymer auf den Oberflächen vorkommt, können durch ein Phaseninversionsgießen hergestellt werden. Bei diesem Verfahren wird eine Lösung aus dem Kamm-Copolymer, dem zweiten Polymer und einem Lösemittel für beide in ein Koagulationsbad auf wässriger Basis gegossen, um die Vorrichtung zu formen. Während des Gießvorganges induzieren günstige Wechselwirkungen zwischen dem Kamm und dem Medium des Koagulationsbades eine Abscheidung des Kamm-Copolymers auf die äußeren Oberflächen des Films, der Faser oder der Membran. Auf diese Weise können zellregulierende, mikroporöse, biologisch abbaubare Membranen, die als temporäre Trennvorrichtungen in Anwendungen für eine Wundheilung nützlich sind, hergestellt werden. Zellregulierende, biologisch abbaubare Nähte können ähnlich durch das Spinnen von Fasern aus einer Lösung in ein Koagulationsbad auf wässriger Basis hergestellt werden. Derartige oberflächenmodifizierte Fasern können auch aus biologisch abbaubaren oder nicht biologisch abbaubaren Materialien hergestellt und zu Vliesstoff-Gegenständen für biomedizinische Anwendungen verarbeitet werden, zu denen zellregulierende temporäre Sperrvorrichtungen und Biofiltrationsvorrichtungen gehören. Es können hohle, nanoporöse Fasern hergestellt werden, die zellregulierende innere Oberflächen aufweisen. Durch das Verkapseln von Zellen in einem Teil einer derartigen Faser könnte ein Implantat für eine langfristige Arzneimittelzufuhr hergestellt werden, das erwünschte Produkte von Zellen in Mengen sekretiert, die vollständig oder teilweise durch Signale, die auf der inneren Oberfläche der Faser gebunden sind, reguliert werden. Zellregulierende, biologisch abbaubare, mikroporöse Gerüste mit einem oberflächlichen Überschuss an Kamm-Copolymeren können mittels Gefriertrocknungsverfahren hergestellt werden, indem ein sublimierendes Lösemittel gewählt wird, das eine höhere Affinität für die Komponente aus dem Kamm-Copolymer im Vergleich zur Komponente aus dem zweiten Polymer, das die Hauptmasse der Vorrichtung bildet, aufweist.
V. Biomedizinische Anwendungen
Die hier beschriebenen Copolymere vom Kamm-Typ können in einer Vielzahl biomedizinischer Anwendungen eingesetzt werden, wie in Gerüsten und Trägern für das Zellwachstum beim Gewebe-Engineering, als Beschichtungen für biomedizinische Implantate, wie intraokuläre Linsen oder andere permanente Implantate, die aus Materialien aus Metall, Glas oder Keramik hergestellt werden, und als Beschichtungen für Zellkulturgeräte wie Zellkulturplatten, Pipetten etc.. Die Copolymere vom Kamm-Typ können für das Modifizieren der Oberflächeneigenschaften von Nähten, temporären Sperrfilmen oder Geweben bei Anwendungen in der Wundheilung, von künstlichen Herzen und Blutgefäßen, Kathetern, Filtern für Blut und andere Körperflüssigkeiten, von Trägern für eine gezielte und verzögerte Freisetzung von Arzneimitteln und von verkapselten zellulären Systemen für die Zufuhr von Arzneimitteln verwendet werden. Die Materialien sind vorzugsweise biologisch abbaubar, wenn sie für ein Gewebe-Engineering, eine Wundheilung und für Anwendungen für eine gezielte Arzneimittelzufuhr eingesetzt werden, und sie sind vorzugsweise nicht abbaubar, wenn sie für die Modifizierung von Implantaten, Zellkulturgeräten, Filtrationsvorrichtungen und anderen Vorrichtungen verwendet werden, die für einen langfristigen Einsatz oder eine Implantation vorgesehen sind.
A. Gewebe-Engineering
Für Anwendungen beim Gewebe-Engineering können die Kamm-Copolymere durch die Anbringung von biologisch aktiven Molekülen, die günstige Wechselwirkungen zwischen Zellen und dem Polymer fördern, wie Zelladhäsionsmolekülen und Wachstumsfaktoren, an den Enden der hydrophilen Seitenketten derivatisiert werden. Es können Matrizes, die für das Aussäen oder das Einwachsen von Zellen geeignet sind und die Kamm-Copolymere enthalten, gebildet werden, oder es kann eine Matrix, die aus einem Material wie rostfreiem Stahl, Collagen oder einem anderen Polymer hergestellt wurde, mit den Kamm-Copolymeren beschichtet werden. Die Matrix wird dann entweder mit Zellen besät und implantiert, oder die Matrix wird implantiert, damit ein Einwachsen von Gewebe erfolgen kann. Diese Materialien können über Veränderungen des Typs und der Dichte der Zelladhäsionspeptide, die an Copolymere geknüpft werden, maßgeschneidert werden, so dass die jeweiligen Bedürfnisse verschiedener Zelltypen erfüllt werden. Zu Zelltypen, die auf die Matrizes gesät werden können, gehören Parenchymzellen wie Hepatozyten, Urothelzellen, Hautzellen, Muskelzellen, Nervenzellen und knochen- und/oder knorpelbildende Zellen. Es können normale Zellen, fötale Zellen oder gentechnologisch veränderte Zellen auf die Matrizes gesät werden.
B. Arzneimittelzufuhr und Imaging
Die Kamm-Copolymere können auch zu Matrizes für eine Verwendung als Arzneimittelzufuhrsysteme oder für Imaging-Zwecke ausgeformt werden. Biologisch abbaubare Latexmaterialien, die mit den Kamm-Copolymeren beschichtet sind, können für die gezielte Zufuhr eines therapeutischen, prophylaktischen oder diagnostischen Mittels verwendet werden. Es können hohle, nanoporöse Fasern hergestellt werden, die zellregulierende innere Oberflächen aufweisen, die aus Kamm-Copolymeren oder Mischungen von Kamm-Copolymeren bestehen. Durch das Verkapseln von Zellen in einem Teil einer derartigen Faser könnte ein Implantat für eine langfristige Arzneimittelzufuhr hergestellt werden, das erwünschte Zellprodukte in Mengen sekretiert, die vollständig oder teilweise durch angeknüpfte Signale auf der inneren Oberfläche der Faser reguliert werden.
Für den Einsatz bei der Arzneimittelzufuhr kann ein therapeutisches oder prophylaktisches Mittel, wie eine Aminosäure, ein biologisch aktives Peptid oder Protein, ein Kohlenhydrat, Zucker oder Polysaccharid, eine Nukleinsäure oder eine Polynukleinsäure, eine synthetische organische Verbindung oder ein Metall mittels Verfahren, die in diesem Fachgebiet zur Verfügung stehen, über die Endgruppen der hydrophilen Seitenketten des Kamm-Copolymers befestigt werden. Die Kamm-Copolymere können modifiziert werden, um die Menge des eingearbeiteten Mittels zu erhöhen. Es können Mittel, die eine größere Stabilität für das Mittel, das zugeführt werden soll, bereit stellen, kovalent oder ionisch am Copolymer befestigt werden. Die Kamm-Copolymere können mit einer spezifisch bindenden Gruppe, zum Beispiel einem Antikörper, der das Latexteilchen für die Zufuhr an eine bestimmte Stelle innerhalb des Körpers lenkt, funktionalisiert werden. Es können auch hydrophile, hydrophobe, saure, basische oder ionische Seitenketten an den Copolymeren angebracht werden, um ihre Verwendung als Zufuhrvorrichtungen für Arzneimittel zu erweitern. Es können Matrizes aus dem modifizierten, ein Arzneimittel enthaltenden Kamm-Copolymer einem Tier oral oder parenteral verabreicht werden, um das Arzneimittel dem Tier in vivo einer Stelle zuzuführen, an der es benötigt wird.
Zu diagnostischen Agenzien gehören radioaktive Materialien, fluoreszierende Materialen, enzymatische Materialien, Gase und magnetische Materialien.
C. Verwendung der Materialien zur Bereitstellung von zellabstoßenden Oberflächen
Es ist oft erwünscht, die Wechselwirkungen von Zellen und Gewebe mit biomedizinischen Implantaten, wie intraokulären Linsen, zu minimieren. Diese Wechselwirkungen werden minimiert, wenn die Oberfläche eines Implantats mit den nicht an Zellen bindenden Copolymeren beschichtet ist. Es wird bevorzugt, dass das Copolymer bei einigen Anwendungen nicht abbaubar ist. Zum Beispiel sollen intraokuläre Linsen, wenn sie implantiert werden, über längere Zeiträume an Ort und Stelle verbleiben, und eine biologische Abbaubarkeit soll vermieden werden.
Ein bevorzugtes nicht biologisch abbaubares polymeres Material ist ein Copolymer aus einem Alkylacrylat (d.h. Methylmethacrylat) und PEG-Methacrylat. Ein bevorzugtes Verfahren zur Anordnung dieser Beschichtung an der Oberfläche besteht aus der Bildung eines Latexfilms.
Die vorliegende Erfindung wird durch die Bezugnahme auf die folgenden Beispiele besser verstanden werden, in denen die folgenden Materialien und die folgende Ausrüstung eingesetzt wurden.
Beispiel 1: Herstellung, Verarbeitung und Testung biologisch abbaubarer Kamm-Copolymere und ihrer Blends
Synthese von Kamm-Polymeren
Lactid, Epichlorhydrin, Poly(ethylenglycol)methylether (MPEG, M_G ~ 350 g/mol), Poly(ethylenglycol) (PEG, M_G ~ 400 g/mol) und wasserfreies Toluol (alle von Aldrich Chemical Co.) wurden so verwendet, wie sie erhalten wurden. Tetrahydrofuran (Aldrich Chemical Co.) wurde vor der Verwendung destilliert. Lactid und Epichlorhydrin (Aldrich Chemical Co.) wurden über eine Ringöffnungspolymerisation (Shen et al., J. Polym. Sci., Polym. Chem. Ed., 31: 1393 (1993)) bei 100°C in Toluol mit einem Trioctylaluminium-Wasser-Katalysator polymerisiert. Der In-situ-Katalysator AlOct₃:0,5 H₂O wurde mittels einer Modifizierung eines Literaturverfahrens präpariert. Es wurden, um das ganze kurz zusammenzufassen, AlOct₃ (25 Gew.-% in Hexan, Aldrich Chemical Co.) und destilliertes THF in einem verschlossenen Kolben unter Stickstoff gerührt, und dann ließ man sie bei -68°C in einem Bad aus Trockeneis/Aceton äquilibrieren. H₂O wurde der Mischung so zugesetzt, dass ein Molverhältnis von 1:0,5 zwischen AlOct₃ und Wasser erhalten wurde. Die Mischung wurde kräftig 15 min bei -68°C gerührt, dann aus dem Trockeneisbad entfernt, und dann ließ man sie innerhalb von 30 Minuten auf Raumtemperatur zurückkehren. Die Lösung des Katalysators wurde dann in einen verschlossenen Reaktionskolben injiziert, der Lactid, Epichlorhydrin und Toluol unter Stickstoff enthielt, und dann ließ man die Reaktion 16 Stunden bei 100°C ablaufen. Das resultierende LA-EO-Copolymer wurde durch wiederholtes Ausfällen in Petrolether gereinigt.
Das Pfropfen von MPEG und PEG auf das LA-EO-Copolymer erfolgte über eine Phasentransferkatalyse (Ober, Makromol. Chem, Macromol. Symp. 35: 36-87 (1990)), wobei die terminalen Hydroxygruppen der Ethylenglycol-Ketten mit den Chlorgruppen des Rückgrat-Copolymers umgesetzt wurden. Das LA-EO-Copolymer wurde in Methylenchlorid gelöst. PEG, MPEG und wässriges NaHCO₃ von pH 8 wurden dann unter kräftigem Rühren zugegeben. Man ließ die Mischung über Nacht reagieren. Nicht umgesetzte Glycole wurden aus dem Polymer durch wiederholte Ausfällungen in Methanol entfernt. Das fertige nicht an Zellen bindende Kamm-Copolymer hatte ein Molekulargewicht von ungefähr 40 000 Dalton, war unlöslich in Wasser und enthielt ungefähr 40 Gew.-% an hydrophilen PEG-Seitenketten.
Eine pentamere Aminosäuresequenz, Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro (GRGDSP von Gibco, hier bezeichnet als RGD), wurde zur Erzeugung von Kamm-Copolymeren, die Adhäsionsliganden tragen, durch das Anknüpfen der RGD an die funktionalisierten Enden von PEG-Seitenketten eingesetzt. RGD tritt spezifisch mit Rezeptoren, die als Integrine bekannt sind, auf der Oberfläche von Zellmembranen in Wechselwirkung, und die RGD-Integrin-Kopplung vermittelt die Adhäsion von Zellen an ihre Umgebungen in vivo. RGD wurde über primäre Amine unter Einsatz einer bekannten Tresylchlorid-Chemie (Obel et al., J. Polym. Sci., Polym. Lett, Ed. 23:103 (1985)) an die nicht an Zellen bindenden Kamm-Copolymere gebunden. Die Kamm-Copolymere wurden mit Tresylchloridgruppen in Lösung aktiviert und bis zur Verwendung bei -20°C gelagert. RGD wurde an die Kämme über ein Eintauchen in PBS-Lösungen von RGD (25 μg/ml, pH 7,5) für 3 Stunden bei 5°C gekoppelt. Die Systeme wurden mehrfach mit PBS gespült, um nicht umgesetztes RGD zu entfernen.
Verarbeitung des Films
Es wurden Mischungen aus aktivierten Kamm-Copolymeren und den nicht an Zellen bindenden Kamm-Copolymeren in unterschiedlichen Verhältnissen hergestellt und aus einer Lösung aus Toluol auf Glasobjektträger gegossen. Die Filme wurden anschließend 24 Stunden im Vakuum getrocknet, um restliches Lösemittel zu entfernen. RGD wurde anschließend auf die oben beschriebene Weise an die exponierten aktivierten Kamm-Copolymere an der Oberfläche des Films gekoppelt. Für Mischungen, die 100 Gew.-%, 25 Gew.-% und 5 Gew.-% Tresylaktiviertes Kamm-Copolymer enthielten, wurden RGD-Dichten an der Oberfläche von 9,5 pg/cm², 2,5 pg/cm² bzw. 0,5 pg/cm² erreicht.
Mischungen aus dem Polylactid-Homopolymer (PLA-Homopoylmer) und kleinen Mengen der nicht an Zellen bindenden oder RGD-tragenden Kamm-Copolymere (10 Gew.-% oder weniger im Vergleich zu PLA) wurden in Toluol gelöst und als Filme auf Glas gegossen. Die Filme wurden anschließend 24 Stunden im Vakuum getrocknet, um restliches Lösemittel zu entfernen. Einige der Kamm/PLA-Filme wurden anschließend 96 Stunden in einem Wasserbad von 70°C einem Annealing unterzogen. Untersuchungen mittels Röntgen-Photoelektronenspektroskopie zeigten signifikante Anreicherungen des Kamm-Copolymers an der Oberfläche der dem Annealing unterzogenen Blends (~ 60 Vol.-% Kamm-Copolymer an der Oberfläche bei einer Konzentration von 10 % in der Gesamtmasse). Messungen der Fortschreite- und der Rückschreitekontaktwinkel zeigen ganz ähnlich an, dass die dem Annealing unterzogenen Blendfilme erheblich geringere Wasserkontaktwinkel als PLA aufweisen und eine größere Hysteresis zeigen, was eine Reorientierung/Hydratisierung der PEG-Seitenkette an der Oberfläche anzeigt, wenn sie sich in Kontakt mit Wasser befindet.
Zellkultur
NR6-Fibroblasten wurden in serumhaltigen Medien auf den Filmen aus gemischten Kämmen, auf den Kamm/PLA-Blends und auf einem PLA-Kontrollfilm kultiviert. Die Polymerfilme wurden zunächst durch Eintauchen in Ethanol sterilisiert. NR6-Fibroblasten vom Wildtyp wurden auf Polymerfilmoberflächen in Modified Eagle's Medium, das mit fötalem Rinderserum supplementiert war, ausgesät. Die Zellen wurden 24 Stunden kultiviert, das Medium wurde abgesaugt, und frisches Medium wurde zugesetzt, ehe Phasenkontrastaufnahmen aufgenommen wurden.
Filme der nicht an Zellen bindenden Kämme waren über Zeiträume von 24 Stunden vollständig resistent gegen eine Zelladhäsion, sogar in Anwesenheit von Serumsupplementiertem Medium. Es wird angenommen, dass das auf der Bildung einer dichten hydratisierten Schicht von PEG-Seitenketten auf der Filmoberfläche beruht. Bei den Filmen der gemischten Kämme verstärkte die Zunahme der Oberflächendichten von RGD die Adhäsion und das Ausbreiten der Zellen auf der Filmoberfläche. Eine Variation des Gewichtanteils der RGD-gekoppelten Kämme in Filmen bezüglich der nicht-funktionalisierten Kämme von 0 bis 100 % ermöglichte eine Veränderung der Adhäsionsreaktion der Zellen auf die Oberflächen. Bei 0 % RGD-Kämmen hafteten keine Zellen an, bei 5 % RGD-Kämmen hafteten die Zellen, aber sie behielten eine abgerundete Morphologie, und bei 100 % RGD-Kämmen hafteten die Zellen stark und breiteten sich auf den Oberflächen aus.
Dieses Ergebnis zeigt, dass die Kamm-Mischungen ein gewisses Ausmaß einer einstellbaren Ligandenpräsentation und eine Steuerung der Zelladhäsion bereit stellen können. Die RGD-tragenden Oberflächen unterstützten eine Zelladhäsion und eine Ausbreitung sogar in Abwesenheit von Serum. Außerdem verhinderte der Zusatz von löslichem RGD zum Medium das Ausbreiten der Zellen und löste sie von den Oberflächen ab. Diese Ergebnisse zeigen, dass die gesehenen Wirkungen auf spezifischen Wechselwirkungen zwischen zellulären Integrinen und RGD beruhen und nicht auf Wechselwirkungen zwischen Integrinen und Serumproteinen, die an RGD adsorbiert waren.
An der Oberfläche der dem Annealing unterzogenen Blends aus dem PLA und den nicht an Zellen bindenden Kämmen wurde aufgrund der Bildung der mit den Kämmen angereicherten Oberflächenschicht, die einer Proteinadsorption widersteht, keine Zelladhäsion gefunden. Im Vergleich dazu wurde eine Zelladhäsion auf dem unmodifizierten PLA und, in geringerem Ausmaß, auf dem nicht dem Annealing unterzogenen Blend beobachtet, die es beide den Zellen ermöglichten, sich anzuheften und auf unkontrollierte Weise auszubreiten. Zellkulturuntersuchungen der dem Annealing unterzogenen PLA/RGD-tragenden Blends der Kämme zeigten sogar in Abwesenheit von Serum eine signifikante kontrollierte Zellanheftung über die RGD-Liganden.
Die Modulation des Ausmaßes der Zelladhäsion wurde auch in Zellkulturexperimenten mit primären Rattenhepatozyten gezeigt. Die Zellen wurden in einer Dichte von 30 000 Zellen/cm² auf Trägermaterialien ausplattiert, die entweder 1 % oder 100 % RGD-tragende Kämme in einem Film aus einem Blend von 10 % Kämmen und PLA enthielten, der wie zuvor beschrieben präpariert und einem Annealing unterzogen wurde. Die Hepatozyten bleiben auf Trägermaterialien, die 100 % RGD-Kämme enthalten, stark ausgebreitet, aber sie aggregieren und nehmen eine runde Morphologie auf Blends an, bei denen nur 1 % der Kämme RGD-Reste enthielt.
Beispiel 2: Herstellung biologisch abbaubarer Vorrichtungen aus Kamm/PLA-Blends
Poröses Gerüst
Biologisch abbaubare, mikroporöse Gerüste aus PLA/Kamm-Copolymer, die als Träger für Anwendungen beim Gewebe-Engineering eingesetzt werden könnten, wurden über das Gefriertrocknen von Lösungen von 10 % (Gew./Vol.) Polymer in Dioxan hergestellt. Blends, die 10 Gew.-% des biologisch abbaubaren, nicht an Zellen bindenden Kamm-Copolymers und 90 Gew.-% PLA enthielten, wurden in Dioxan gelöst und in flüssigem Stickstoff tiefgefroren, was zur Phasentrennung des Polymers und des Lösemittels führte. Nach dem Sublimieren des Dioxans wurde ein poröser, biologisch abbaubarer Schaum erhalten, der weiterbehandelt werden konnte, zum Beispiel durch Autoklavieren oder durch eine Wärmebehandlung in entionisiertem Wasser bei 90°C, um eine hohe Bedeckung der äußeren Oberflächen der Poren mit dem Kamm-Copolymer zu erhalten.
Temporäre Sperrmembran
Biologisch abbaubare, mikroporöse Membranen aus PLA/Kamm-Copolymer, die als temporäre Barrieren in Anwendungen für die Wundheilung eingesetzt werden könnten, wurden durch ein Phaseninversionsgießen aus Lösungen von 10 – 20 % Polymer in N,N-Dimethylformamid (DMF) hergestellt. Blends, die 10 Gew.-% des biologisch abbaubaren, nicht an Zellen bindenden Kamm-Copolymers und 90 Gew.-% PLA enthielten, wurden in DMF gelöst und mittels einer Abziehklinge auf einen gereinigten Glasträger gegossen. Der Träger wurde sofort in ein Bad mit entionisiertem Wasser von 90°C eingetaucht, um während der Ausfällung des unlöslichen Polymers eine poröse Membranstruktur zu erzeugen. Nach ihrer Bildung wurden die Membranen entfernt und in einem zweiten Bad aus entionisiertem Wasser bei 90°C gespült, um in Spuren vorhandene Verunreinigungen durch das Lösemittel zu entfernen.
Beispiel 3: Herstellung und Testung von nicht biologisch abbaubaren Kamm-Copolymeren und ihren Mischungen
Kamm-Synthese
Nicht biologisch abbaubare Kamm-Polymere wurden über eine radikalische Polymerisation von Methylmethacrylat (MMA) mit entweder Methoxypoly(ethylenglycol)methacrylat (MPEGMA) oder Poly(ethylenglycol)methacrylat (PEGMA) oder einer Mischung von diesen, wobei die Mischung bei 70°C mit Azo(bis)isobutyronitril initiiert wurde, hergestellt. Nach 12 – 16 Stunden wurde die Reaktion beendet, und das Polymer wurde in Petrolether ausgefällt. Das resultierende Kamm-Polymer hat ein PMMA-Rückgrat mit PEO-Seitenketten, die nahezu zufällig längs des Rückgrats verteilt sind, und ein Molekulargewicht von ungefähr 20 000 g/mol. Die PEGMA-Makromonomere stellen Seitenketten bereit, die an ihrem Ende eine Hydroxygruppe tragen, die für eine kovalente Verknüpfung der Peptide derivatisiert werden kann, während die MPEGMA-Einheiten nicht-reaktive PEG-Seitenketten mit Methoxyenden bereit stellen. Kämme, die ~ 40 Gew.-% an PEG-Seitenketten tragen, sind unlöslich in Wasser, aber sie bilden sehr hydrophile Oberflächen, die widerstandsfähig gegenüber Protein und Zellen sind und somit als nicht an Zellen bindend betrachtet werden.
Um nicht biologisch abbaubare Kämme, die Adhäsionsliganden tragen, zu erhalten, wurde das RGD-Peptid an Hydroxy-Endgruppen der PEG-Seitenketten befestigt. Die Kämme wurden in wasserfreiem Tetrahydrofuran (THF) gelöst, gefolgt vom Zusatz von Triethylamin und Tresylchlorid, und 90 Minuten umgesetzt. Das aktivierte Polymer wurde durch Ausfällen in wasserfreiem Methanol gewonnen und bei -70°C bis zur Verwendung gelagert. RGD wurde über primäre Amine an die aktivierten Kämme gekoppelt, indem die Kämme zunächst in trockenem THF gelöst wurden, gefolgt vom Zusatz der Peptidlösung (1 mg/ml GRGDSP in Phosphat-gepufferter Saline (PBS)) in einem Verhältnis von 10:1 THF:PBS. Man ließ die Kopplung unter Rühren 3 Stunden bei 5°C ablaufen. Das resultierende RGD-Kamm-Polymer wurde durch Ausfällen und Waschen mit entionisiertem Wasser gewonnen.
Filmherstellung und Zellkultur
Filme für die Zellkultur wurden durch das Rotationsbeschichten der Kamm-Polymere in wasserfreiem Toluol auf Glasträger hergestellt. Vollkommen zellresistente Oberflächen wurden durch das Rotationsbeschichten von Lösungen der nicht an Zellen bindenden Kämme hergestellt, während ligandentragende Oberflächen durch das Rotationsbeschichten von Lösungen hergestellt wurden, die sowohl nicht an Zellen bindende Kämme als auch RGD-tragende Kämme enthielten.
NR6-Fibroblasten, die mit dem menschlichen Epidermal Growth Factor Receptor vom Wildtyp (WT NR6) transfiziert waren, wurden in Modified Eagle's Medium alpha (MEM-α) kultiviert, das mit 7,5 % fötalem Rinderserum, L-Glutamin, nicht-essentiellen Aminosäuren, Natriumpyruvat, Penicillin-Streptomycin und Gentamycin supplementiert war. Die Zellen wurden in einer Dichte von 20 000 Zellen/cm² auf Filme aus Kamm-Copolymeren 24 Stunden ausgesät, gefolgt von einem Absaugen, um nicht-anhaftende Zellen zu entfernen, und Zugabe von frischem Medium. Die Morphologie/Adhäsion der Zellen an die Filme wurde dann mittels eines Phasenkontrastmikroskops Axiovert 100 von Zeiss überprüft. Es wurde keine Zelladhäsion auf Filmen aus nicht an Zellen bindenden Kämmen beobachtet. Im Gegensatz dazu unterstützten Filme aus den RGD-tragenden Kämmen die Adhäsion und führten zu Zellmorphologien, die denjenigen vergleichbar waren, die auf Fibronectin beobachtet wurden.
Beispiel 4: Herstellung und Testung von Kamm-Filmen mit angeknüpftem EGF Filmherstellung
Es wurden, um nicht biologisch abbaubare Kämme mit angeknüpften Liganden aus dem Epidermal Growth Factor zu erhalten, nicht an Zellen bindende Kämme mit PMMA-Rückgraten und PEG-Seitenketten wie im Beispiel 3 beschrieben hergestellt. EGF wurde an den Hydroxy-Endgruppen der PEG-Seitenketten befestigt, indem zunächst die Seitenketten mit Tresylchlorid aktiviert wurden, gefolgt von der oben beschriebenen Prozedur.
Filme aus dem Tresyl-aktivierten Kamm wurden bei 10 000 Upm aus Toluol-Lösungen von 0,01 g/ml durch Rotationsbeschichtung gewonnen. Die Filme wurden anschließend im Vakuum getrocknet, um restliches Lösemittel zu entfernen, und dann durch eine einstündige UV-Behandlung sterilisiert. EGF wurde an die Oberflächen gekoppelt, indem sterile Lösungen von 5 μg/ml EGF in PBS (100 mM Phosphat) 3 Stunden bei 5°C auf den Filmen inkubiert wurden. Die Lösungen wurden abgesaugt, und die Proben wurden mit sterilen Tris-Lösungen (100 mM, pH 7) 1 Stunde bei 20°C geblockt. Die Kontrollen wurden in Gegenwart von Tris hydrolysiert, wodurch alle Tresyl-Stellen mit Tris-Endgruppen anstelle von EGF versehen wurden. Eine hydrolysierte Kontrolle wurde einer EGF-Lösung unter Bedingungen ausgesetzt, die den Schritt der EGF-Kopplung simulierte, um auf eine unspezifische Adsorption von EGF zu prüfen. Die Proben wurden mehrfach mit steriler PBS gespült. Dieses Protokoll stellte 1,0 ± 0,3 ng/cm² angeknüpftes EGF auf der Filmoberfläche bereit.
Zellkultur
PC12-Zellen wurden auf Oberflächen ausgesät (Medium: RMPI 1640 mit 5 % FBS, 10 % hitzeinaktiviertes Pferdeserum, supplementiert mit Penicillin-Streptomycin) und 3 Tage kultiviert. Um die PC12-Zellen in diesem Experiment auf der Oberfläche angeheftet zu halten, wurden die Oberflächen vor der Kultivierung mit 0,5 mg/ml Rattenschwanzkollagen bei 5°C über Nacht behandelt. PC12-Zellen sind Nebennierentumorzellen, die unter bestimmten Bedingungen zu einem neuronalen Phänotyp differenzieren. Diese Differenzierung ist derjenigen neuronaler Zellen im allgemeinen ähnlich und morphologisch durch die Bildung und das Auswachsen von Neuriten charakterisiert. Für PC12-Zellen, die in Gegenwart von löslichem EGF kultiviert werden, wird berichtet, dass sie eine durch das Wachstumsfaktorsignal induzierte morphologische Veränderung durchlaufen – die Zellen runden sich auf adhäsiven Oberflächen ab, wahrscheinlich aufgrund entweder einer Herunterregulierung von Integrinen oder von Veränderungen der Affinität zwischen Integrinen und der ECM, die durch die EGF-Signale induziert werden. Die EGF-tragenden Kamm-Filme sind nicht adhäsiv für Zellen, und die Collagenbehandlung führt lediglich zu schwach zelladhäsiven Oberflächen. Die PC12-Zellen wurden wie beschrieben mehrere Wochen kultiviert. Am 3. Tag wurden erste Anzeichen einer Differenzierung beobachtet, die nach zwei Wochen sehr deutlich wurden. Keine Differenzierung wurde für die Kontrollen beobachtet.
Beispiel 5: Herstellung von Oberflächen, die multiple Ligandentypen präsentieren
Nicht an Zellen bindende Kamm-Copolymere mit PMMA-Rückgraten und Methoxy- oder Hydroxy-terminierten PEO-Seitenketten wurden wie im Beispiel 3 beschrieben hergestellt. Die Kämme wurden anschließend dazu verwendet, Träger zu erzeugen, die den Epidermal Growth Factor (EGF) und RGD gemeinsam angeknüpft enthalten. Zuerst wurden RGD-tragende Kämme hergestellt, wie es in Beispiel 3 beschrieben wurde. Die RGD-tragenden Kämme wurden in THF zusammen mit den nicht an Zellen bindenden Kämmen, die mit Tresylchlorid aktiviert worden waren, solvatisiert, und Filme wurden mittels Standardtechniken einer Rotationsbeschichtung auf gereinigte Glasträger gegossen. Die Filme wurden im Vakuum 24 Stunden getrocknet, um restliches Lösemittel zu entfernen. Der Träger wurde dann einer EGF-Lösung ausgesetzt, was die kovalente Bindung von EGF an die Seitenketten des aktivierten Kammes an der Oberfläche über die terminale Aminogruppe des EGF ermöglichte. Lösungen von 10 ng/ml EGF in PBS wurden auf Oberflächen inkubiert, die die aktivierten Kämme als Mischungen mit den RGD-Kämmen enthielten, oder mit Kontrollen, die nicht-aktivierte Kämme enthielten. Die Menge des EGF, die unter diesen Bedingungen kovalent an die Träger gebunden wurde, betrug 8,5 ± 1,5 ng/cm². Die maximale DNA-Synthese von primären Hepatozyten, die auf angeknüpftem EGF kultiviert wurden, trat, um einen Vergleich zu nennen, bei einer Dichte von weniger als 1 ng/cm² (1000 EGF-Moleküle/μm²) auf, und die ungefähre Dichte der Rezeptoren auf der Zelloberfläche von Hepatozyten oder WT NR6 liegt bei 100 – 400 Molekülen/μm². Somit reicht die Menge des EGF, das kovalent an den RGD-tragenden Träger geknüpft werden kann, aus, um die Zellreaktion zu beeinflussen. Ferner ist die Menge des unspezifisch adsorbierten EGF an den Kammoberflächen, 0,9 ± 0,3 ng/cm² , im Vergleich zu der Menge, die kovalent angekoppelt ist, vernachlässigbar. WT-NR6-Fibroblasten wurden wie zuvor beschrieben 24 Stunden auf den EGF/RGD-Trägern kultiviert. Es wurde beobachtet, dass sich die Zellen anhefteten und auf der Oberfläche mit den gemischten Liganden ausbreiteten.
Beispiel 6: Kamm-Copolymer-stabilisierte Latexmaterialien
Kamm-Synthese
Der Kamm-Polymer-Stabilisator wurde über freie Radikale in Lösung synthetisiert. Methylmethacrylat (MMA), Methoxypoly(ethylenglycol)methacrylat (MPEGMA) und Poly(ethylenglycol)methacrylat (PEGMA) wurden, bei gleichen Gewichtsanteilen der PEG-Makromonomere, so zu Benzol gegeben, so dass eine Gesamtmonomerkonzentration von 0,6 M erhalten wurde. Azo(bis)isobutyronitril wurde in einem Molverhältnis Monomer:Initiator von 20:1 zugegeben. Die Lösung wurde unter Stickstoff 15 Minuten entgast, gefolgt von einer 16stündigen Polymerisation bei 60°C. Das Kamm-Polymer wurde durch wiederholte Ausfällung in Petrolether gereinigt. Um Latexkügelchen mit proteinabstoßenden Oberflächen zu erhalten, wurde zunächst das Verhältnis der PEGMA/MPEGMA-Einheiten zu den MMA-Einheiten in den Kamm-Stabilisator-Copolymeren optimiert. In anfänglichen Untersuchungen wurde gefunden, dass Kämme, die 40 Gew.-% der PEGMA/MPEGMA-Einheiten enthielten, Filme bildeten, die widerstandsfähig gegenüber Zellen in Gegenwart von Serum und gleichzeitig widerstandsfähig gegenüber einer Auflösung in Medien auf Wasserbasis waren. Kämme mit dieser Zusammensetzung waren in 50:50 Wasser:Ethanol löslich und dienten somit als idealer Stabilisator für die Herstellung der Polymerlatexe. Kämme mit höheren PEG-Anteilen (~ 50 Gew.-% oder mehr) lösten sich mit der Zeit im Wasser. Der Kamm-Stabilisator hatte vor der Anknüpfung des Peptids ein Gesamtmolekulargewicht von ungefähr 23 000 Dalton.
Zur Gewinnung von Latexmaterialien, die Adhäsionsliganden tragen, wurden RGD-tragende Kämme zuerst über eine Kopplung von GRGDSP (Gibco) in Lösung an die Enden der PEGMA-Einheiten des Kammes gekoppelt. Die Kopplung erfolgte über die Reaktion der Tresylchlorid-aktivierten Kämme mit dem N-terminalen Amin des Peptids. Die Hydroxy-Enden der PEGMA-Einheiten des Kammes wurden durch Umsetzen mit 2,2,2-Trifluorethansulfonylchlorid (Tresylchlorid) in Tetrahydrofuran aktiviert. Das Kamm-Copolymer (150 mg) wurde in 25 ml trockenem THF bei 5°C gelöst. Es wurden Triethylamin (200 μl) und Tresylchlorid (250 μl) zugegeben, und man ließ die Reaktion 3 Stunden lang ablaufen. Das aktivierte Polymer wurde dann durch Filtrieren und Ausfällen in Petrolether gewonnen. Das GRGDSP-Peptid wurde an das aktivierte Polymer gekoppelt, indem 150 μl GRGSP-Lösung (1 mg/ml in Phosphat-gepufferter Saline, pH 7,4) zu 2,5 ml einer Lösung des aktivierten Kammes (0,02 g/ml in THF) bei 5°C gegeben wurden und 3 Stunden gerührt wurde. Der RGD-gekoppelte Kamm wurde durch das Ausfällen in entionisiertem Wasser über Nacht gewonnen. Die Mengen des angekoppelten Peptids wurden mittels eines kolorimetrischen Tests bestimmt (MicroBCA, Pierce Chemical Co.). Es wurde gefunden, dass der RGD-Gehalt bei 0,3 Gew.-% (1 RGD-Peptid pro ~ 10 Moleküle des Kamm-Polymers) lag.
Acryllatex-Synthese
Polymerlatexmaterialien auf Methacrylat- und Acrylat-Basis wurden über eine Dispersionspolymerisation unter Einsatz der Kamm-Polymere als Stabilisatoren synthetisiert. Es wurden Latexmaterialien mit vier verschiedenen Zusammensetzungen in dieser Studie hergestellt: reines Poly(methylmethacrylat), Poly(methylmethacrylat-co-butylacrylat), Poly(ethylmethacrylat-co-methylacrylat) und Poly(ethylmethacrylat-co-butylmethacrylat). Außerdem wurde ein mit Zellen in Wechselwirkung tretender Poly(methylmethacrylat)-Latex unter Verwendung des RGD-Kamm-Stabilisators hergestellt. Der Kamm-Stabilisator wurde in einer Mischung von Ethanol und Wasser in Volumenanteilen von 1:1 gelöst, und anschließend wurden die Methacrylat/Acrylat-Monomere und 0,57 g Ammoniumpersulfat zugegeben. Man ließ die Reaktionen 18 Stunden lang bei 60°C unter Rühren ablaufen. Die Reaktionsansätze waren zunächst einphasige, klare Lösungen und wurden während der Polymerisation zu opaken, weißen Dispersionen. Nach dem vollständigen Ablauf der Synthesen wurden alle Latexmaterialien durch wiederholte Zentrifugation und erneutes Dispergieren in Wasser/Ethanol gereinigt. Die Suspensionen waren über Zeiträume von mehr als 24 Stunden stabil und konnten nach langer Lagerung durch eine Ultraschallbehandlung resuspendiert werden. Alle Latexmaterialien wurden vor ihrer Verwendung wenigstens 30 Minuten mit Ultraschall behandelt. Die Molekulargewichte der Polymere, die die Latexteilchen ausmachten, lagen im Bereich von ungefähr 400 000 Dalton bis 1 Million Dalton. Die Glasübergangstemperaturen der Teilchen lagen im Bereich von -26°C bis 105°C, in Abhängigkeit von den bei der Polymerisation eingesetzten Monomer-Komponenten.
Die Morphologie der Latexkügelchen wurde durch Untersuchung der Kügelchen, die auf Träger gegossen waren, mittels eines Feldemissions-Scanningelektronenmikroskops JEOL 6320, das bei einer Beschleunigungsspannung von 4,0 kV operierte, untersucht. Die Proben wurden vor dem Imaging mit Gold beschattet. Die durchschnittlichen Teilchendurchmesser wurden aus SEM-Aufnahmen bestimmt, wobei für jede Probe wenigstens 300 Teilchen vermessen wurden. Die durchschnittlichen Teilchengrößen lagen im Bereich von 0,2 bis 1,8 Mikrometer. Alle Latexmaterialien hatten Größen-Polydispersitäten von unter 1,06. In allen Fällen machte der Kamm-Stabilisator weniger als 1 Gew.-% der gesamten Zusammensetzung der Latexkügelchen aus.
Herstellung und Charakterisierung von Latexfilmen
Es wurden Filme aus den Latex-Suspensionen hergestellt, indem die Teilchen (0,02 – 0,03 g/ml in Wasser/Ethanol) bei 1000 Upm durch Rotationsbeschichten auf Glasträger aufgetragen wurde. Zur Ausbildung zusammenhängender Filme aus den gegossenen Teilchen wurden die Proben mittels eines Heißluftföns, der auf 800 – 900°C eingestellt war, kurzen Wärmebehandlungen (30 – 60 Sekunden) ausgesetzt. Die Koaleszenz der Teilchen wurde durch Untersuchung der Oberflächen unter einem Lichtmikroskop bestätigt. Für die Zellkultur- und Kontaktwinkelexperimente diente ein Poly(methylmethacrylat)-Homopolymer (kein Latex) als Kontrollträger. Filme aus PMMA (Polysciences, 68 K g/mol, M_W/M_N = 1,07) wurden aus einer Toluol-Lösung von 0,03 g/ml auf saubere Glasdeckgläschen durch Rotationsbeschichten bei 1000 Upm aufgetragen und anschließend im Vakuum bei 70°C 24 Stunden getrocknet.
Die Kontaktwinkel des Wassers auf den koaleszierten Oberflächen des Latexfilms, auf den Filmen aus dem nicht an Zellen bindenden Kamm und auf dem Kontrollfilm aus PMMA wurden mittels eines Video-Kontaktwinkelsystems VCA2000 (AST Inc.) gemessen. Die Fortschreite- und Rückschreitekontaktwinkel wurden durch das Aufzeichnen digitaler Bilder von Tröpfchen aus entionisiertem Wasser, die mittels einer Spritze auf jungfräuliche Oberflächen aufgetragen wurden, und das Messen der Winkel in den Bildern gemessen. Für alle Fälle mit Ausnahme der Kontrolle zeigte sich, dass die Fortschreitewinkel relativ konstant und unabhängig vom Tropfenvolumen sind, während die Rückschreitewinkel signifikante Veränderungen des Kontaktwinkels mit der Tropfengröße zeigen. Alle Latexfilme zeigten bei diesen Messungen eine Hysteresis von 25° oder mehr, während reines PMMA nur eine Veränderung von ~ 10° zeigte. Zu einer Hysteresis des Kontaktwinkels kann es zwar aus verschiedenen Gründen kommen, aber die wahrscheinlichste Erklärung der hier beobachteten Kontaktwinkelhysteresis ist die Reorganisation/Hydratisierung der PEG-Seitenketten auf der Oberfläche der Filme beim Benetzen. Dass das Kamm-Copolymer nicht wasserlöslich ist, wurde durch Ellipsometriemessungen der Dicken der getrockneten Latex- und Kammfilme vor und nach dem Eintauchen in Wasser gemessen, und es wurde kein nachweisbarer Polymerverlust gefunden. Diese Ergebnisse weisen deutlich darauf hin, dass der Kammstabilisator an der Oberfläche bleibt, sobald die Latexteilchen zu einem homogenen Film koalesziert sind.
Zellkultur
Alle Zellkulturreagenzien wurden von Gibco bezogen. NR6-Fibroblasten, die mit dem humanen Epidermal Growth Factor Receptor vom Wildtyp (WT NR6) transfiziert waren, wurden in Modified Eagle's Medium alpha (MEM-α) kultiviert, das mit 7,5 % fötalem Rinderserum, L-Glutamin, nicht-essentiellen Aminosäuren, Natriumpyruvat, Penicillin-Streptomycin und Gentamycin supplementiert war.
Untersuchungen zur Zellanheftung wurden durchgeführt, indem 20 000 Zellen/cm² auf die Filme aus den nicht an Zellen bindenden Kamm-Copolymeren, auf Filme aus koalesziertem PMMA-Latex und auf zwei Kontrollen, nämlich Filme aus Gewebekultur-Polystyrol (TCPS) und Filme aus reinem PMMA, ausgesät wurden. Die Zellen wurden 24 Stunden lang in 1,5 ml serumhaltigem Wachstumsmedium kultiviert, woran sich ein Absaugen zur Entfernung nicht- angehefteter Zellen und die Zugabe von frischem Medium anschlossen. Die Morphologie und die Adhäsion der Zellen an die Latexfilme wurden dann mittels eines Phasenkontrastmikroskops Axiovert 100 von Zeiss untersucht.
Nach 24 Stunden haften die Zellen auf beiden Kontrollen und breiten sich aus, vermutlich über Proteinschichten, die an diese Oberflächen adsorbiert sind. Die PEG-Seitenketten der Kamm-Copolymer-Stabilisatoren verhindern dagegen eine Zellanheftung des Kamm-Films unter diesen stringenten Bedingungen vollständig. Ähnlich präsentiert der Film aus PMMA-Latex eine Oberfläche, die praktisch äquivalente, zellabweisende Eigenschaften hat, obwohl der Kamm-Stabilisator nur ~ 1 Gew.-% des gesamten Polymerfilms ausmacht. Diese Beobachtung ist ein weiterer Hinweis darauf, dass die Kämme während der Koaleszenz an der Filmoberfläche lokalisiert bleiben.
Es wurden Filme, die aus dem RGD-tragenden PMMA-Latex durch Koaleszenz gebildet wurden, hergestellt und wie zuvor mit WT-NR6-Zellen besät. Im Gegensatz zu Latexmaterialien, die mit den nicht an Zellen bindenden Kämmen stabilisiert waren, riefen die koaleszierten Filme aus dem RGD-tragenden Latex eine Zellanheftung und -ausbreitung hervor. Offenbar sind die für diese Latexfilme erhaltenen Dichten des RGD-Liganden an der Oberfläche mit denen des reinen RGD-verknüpften Kamms vergleichbar, obwohl der Latexfilm nur 1/100 an gesamtem Peptid enthält. Die Spezifität der Adhäsion der Zellen an die RGD-tragende Oberfläche wurde durch die Zugabe von überschüssigem, löslichem GRGDSP (45 mM) zum Kulturmedium bestätigt. Es wurde beobachtet, dass sich alle Zellen innerhalb von 1 Stunde nach der Zugabe des löslichen RGD ablösten.

Claims

Zellregulierendes Copolymer vom Kammtyp, das umfasst: a) ein hydrophobes Polymerrückgrat, b) nicht an Zellen bindende, hydrophile polymere Seitenketten, die auf das Polymerrückgrat gepfropft sind, wobei die Seitenketten ein Molekulargewicht zwischen 200 und 2000 Dalton haben, wobei zwischen null und 100% der nicht an Zellen bindenden, hydrophilen Seitenketten an ihrem Ende an Zellen bindende oder als zelluläre Signale wirkende Liganden tragen, so dass sie kurze, an Zellen bindende Copolymer-Seitenketten bilden, und wobei die Seitenketten weniger als 60% des Gesamtgewichts des Copolymers ausmachen.
Kamm-Copolymer nach Anspruch 1, dass ein Gesamt-Molekulargewicht von über 10 000 Dalton hat.
Kamm-Copolymer nach Anspruch 1, wobei das Rückgrat biologisch abbaubar ist.
Copolymer nach Anspruch 1, wobei das Rückgrat nicht biologisch abbaubar ist.
Copolymer nach Anspruch 1, wobei die Seitenketten kleiner als 500 Dalton sind und weniger als 60% des Gesamtgewichts des Copolymers ausmachen.
Copolymer nach Anspruch 1, wobei die Molprozente der Rückgratsegmente, die an hydrophilen Seitenketten befestigt sind, zwischen 2 und 30% liegen.
Copolymer nach Anspruch 1, wobei der prozentuale Anteil der hydrophilen Seitenketten, die funktionelle Gruppen aufweisen, die imstande sind, kovalent oder ionisch an einem an Zellen bindenden oder als zelluläres Signal wirkenden Liganden befestigt werden zu können, zwischen 1 und 20% liegt.
Copolymer nach Anspruch 1, wobei die nicht an Zellen bindenden Seitenketten aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Polyethylenglycol, Polyethylenoxid, Polyacrylsäure und Dextran besteht.
Copolymer nach Anspruch 1, wobei die Liganden aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Adhäsionspeptiden, als zelluläre Signale wirkenden Peptiden und Wachstumsfaktoren besteht.
Copolymer nach Anspruch 1 in einer Mischung, die außerdem nicht an Zellen bindende Kamm-Copolymere aufweist, deren Seitenketten an ihrem Ende nicht mit an Zellen bindenden oder als zelluläre Signale wirkenden Liganden versehen sind.
Kamm-Copolymer-Mischung nach Anspruch 10, wobei weniger als 20% der Kamm-Copolymere Seitenketten aufweisen, die an ihrem Ende mit an Zellen bindenden oder als zelluläre Signale wirkenden Liganden versehen sind.
Matrix für ein Gewebe-Engineering, Zellkulturmatrix, biomedizinische Vorrichtung oder Implantat, die bzw. das aus dem Kamm-Copolymer nach einem beliebigen der Ansprüche 1-11 geformt oder mit diesem beschichtet ist, wobei das Kamm-Copolymer bezüglich der Regulation der Zelladhäsion oder -reaktion auf die Oberfläche wirksam ist.
Matrix für ein Gewebe-Engineerng, Zellkulturmatrix, biomedizinische Vorrichtung oder Implantat nach Anspruch 12, die bzw. das mit Zellen besät ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Parenchymzellen, Hautzellen, Muskelzellen, Knorpelzellen, Nervenzellen und Knochenzellen besteht.
Matrix für ein Gewebe-Engineering, Zellkulturmatrix, biomedizinische Vorrichtung oder Implantat nach Anspruch 12, wobei das zellregulierende Copolymer vom Kammtyp definierte Mischungen nicht an Zellen bindender und ligandenmodifizierter, zellregulierender Copolymere vom Kammtyp umfasst.
Matrix für ein Gewebe-Engineering, Zellkulturmatrix, biomedizinische Vorrichtung oder Implantat nach Anspruch 14, wobei die Oberfläche diskrete Nanodomänen oder Cluster nur eines Ligandentyps vor einem Hintergrund aus nicht an Zellen bindenden, hydrophilen Seitenketten präsentiert.
Matrix für ein Gewebe-Engineering, Zellkulturmatrix, biomedizinische Vorrichtung oder Implantat nach Anspruch 14, wobei die Oberfläche diskrete Nanodomänen oder Cluster von zwei oder mehr Ligandentypen vor einem Hintergrund aus nicht an Zellen bindenden, hydrophilen Seitenketten präsentiert.
Matrix für ein Gewebe-Engineering, Zellkulturmatrix, biomedizinische Vorrichtung oder Implantat nach Anspruch 15 oder 16, wobei jede Nanodomäne oder jedes Cluster zwischen 2 und 50 als zelluläre Signale wirkende Liganden auf einer Fläche von 0,0001 – 0,01 μm im Quadrat enthält, wobei der Abstand zwischen den Rändern solcher Domänen im Bereich von 3 – 200 nm liegt.
Verfahren zur Herstellung einer Matrix für ein Gewebe-Engineering, einer Zellkulturmatrix, eines Implantats oder einer biomedizinischen Vorrichtung mit regulierter Zelladhäsion oder -reaktion, wobei das Verfahren das Beschichten oder Formen der Matrix, des Implantats oder der Vorrichtung mit bzw. aus einem Kamm-Copolymer umfasst, dass umfasst: a) ein hydrophobes Polymerrückgrat, b) nicht an Zellen bindende, hydrophile polymere Seitenketten, die auf das Polymerrückgrat gepfropft sind, wobei die Seitenketten ein Molekulargewicht zwischen 200 und 2000 Dalton haben, wobei zwischen null und 100% der nicht an Zellen bindenden, hydrophilen, an ihrem Ende mit an Zellen bindenden oder als zelluläre Signale wirkenden Liganden versehen sind, so dass sie kurze, an Zellen bindende Copolymer-Seitenketten bilden, und wobei die Seitenketten weniger als 60% des Gesamtgewichts des Copolymers ausmachen.
Verfahren zur Herstellung einer Matrix für ein Gewebe-Engineering, einer Zellkulturmatrix, einer biomedizinische Vorrichtung oder eines Implantats nach Anspruch 18, wobei die nicht an Zellen bindenden Seitenketten der Kamm-Copolymere an der Oberfläche an ihrem Ende mit Liganden versehen werden, nachdem die Beschichtung, Matrix, Vorrichtung oder das Implantat gebildet worden ist.
Verfahren zum Engineering von Gewebe, wobei das Verfahren das Züchten von Zellen auf einer Matrix für das Gewebe-Engineering umfasst, die aus dem zellregulierenden Copolymer vom Kammtyp geformt oder damit beschichtet ist, wobei das Copolymer umfasst: a) ein hydrophobes Polymerrückgrat, b) nicht an Zellen bindende, hydrophile polymere Seitenketten, die auf das Polymerrückgrat gepfropft sind, wobei die Seitenketten ein Molekulargewicht zwischen 200 und 2000 Dalton haben, wobei zwischen null und 100% der nicht an Zellen bindenden, hydrophilen Seitenketten an ihrem Ende mit an Zellen bindenden oder als zelluläre Signale wirkenden Seitenketten versehen sind, so dass sie kurze, an Zellen bindende Copolymer-Seitenketten bilden, und wobei die Seitenketten weniger als 60% des Gesamtgewichts des Copolymers ausmachen, wobei das Kamm-Copolymer bezüglich der Regulation der Zelladhäsion oder -reaktion auf die Oberfläche wirksam ist.
Polymerlatex, der Polymerteilchen umfasst, die in einem wasserhaltigen Medium dispergiert sind, stabilisiert durch ein zellregulierendes Copolymer vom Kammtyp, das umfasst. a) ein hydrophobes Polymerrückgrat, b) nicht an Zellen bindende, hydrophile polymere Seitenketten, die auf das Polymerrückgrat gepfropft sind, wobei die Seitenketten ein Molekulargewicht zwischen 200 und 2000 Dalton haben, wobei zwischen null und 100% der nicht an Zellen bindenden, hydrophilen Seitenketten an ihrem Ende mit an Zellen bindenden oder als zelluläre Signale wirkenden Liganden versehen sind, so dass sie kurze, an Zellen bindende Copolymer-Seitenketten bilden, und wobei die Seitenketten weniger als 60% des Gesamtgewichts des Copolymers ausmachen.
Polymerlatex nach Anspruch 21, wobei die Kamm-Copolymere als Stabilisierungsmittel während der Latexsynthese dienen.
Polymerlatex nach Anspruch 21, wobei das Kamm-Copolymer weniger als 1 % des Trockengewichts des Latex ausmacht.
Polymerlatex nach Anspruch 21, der außerdem nicht an Zellen bindende Kamm-Copolymere umfasst, deren Seitenketten an ihrem Ende nicht mit an Zellen bindenden oder als zelluläre Signale wirkenden Liganden versehen sind.
Polymerlatex nach Anspruch 21, der außerdem Latexteilchen umfasst, die mit nicht an Zellen bindenden Kamm-Copolymeren stabilisiert sind, um eine definierte Mischung aus nicht an Zellen bindenden und aus ligandenmodifizierten, zellregulierenden Latexteilchen zu erhalten.
Polymerlatex nach Anspruch 21, wobei die nicht an Zellen bindenden Seitenketten der Kamm-Copolymere auf der Oberfläche der Teilchen an ihrem Ende mit Liganden versehen werden, nachdem die Latexteilchen synthetisiert worden sind.
Polymerbeschichtungen und -folien, die das Zellverhalten regulieren und durch das Gießen eines Polymerlatex hergestellt werden, der Polymerteilchen umfasst, die in einem wasserhaltigen Medium dispergiert sind, stabilisiert durch zellregulierende Copolymere vom Kammtyp, die umfassen: a) ein hydrophobes Polymerrückgrat, b) nicht an Zellen bindende, hydrophile polymere Seitenketten, die auf das Polymerrückgrat gepfropft sind, wobei die Seitenketten ein Molekulargewicht zwischen 200 und 2000 Dalton haben, wobei zwischen null und 100% der nicht an Zellen bindenden, hydrophilen Seitenketten an ihrem Ende mit an Zellen bindenden oder als zelluläre Signale wirkenden Liganden versehen sind, so dass sie kurze, an Zellen bindende Copolymer-Seitenketten bilden, und wobei die Seitenketten weniger als 60% des Gesamtgewichts des Copolymers ausmachen.
Polymerfolien und -beschichtungen nach Anspruch 27, die hergestellt werden durch das Gießen eines gemischten Latex aus Mikroteilchen, stabilisiert mit den nicht an Zellen bindenden Kamm-Copolymeren, um eine definierte Mischung aus nicht an Zellen bindenden und aus ligandenmodifizierten, zellregulierenden Latexteilchen zu erhalten.
Polymerfolien und -beschichtungen nach Anspruch 27, die diskrete Domänen aus nur einem Typ eines als zelluläres Signal wirkenden Liganden vor einem Hintergrund aus nicht an Zellen bindenden, hydrophilen Seitenketten aufweisen, wobei die Größe der Domänen in der Größenordnung der Latexteilchen liegt.
Polymerfolien und -beschichtungen nach Anspruch 27, die diskrete Domänen aus multiplen, als zelluläre Signale wirkenden Liganden vor einem Hintergrund aus nicht an Zellen bindenden, hydrophilen Seitenketten aufweisen, wobei die Größe der Domänen in der Größenordnung der Latexteilchen liegt.
Polymerfolien und -beschichtungen nach Anspruch 29 und 30, wobei die Größe der Domänen bei einem Durchmesser zwischen 0,1 und 10 μm liegt.
Polymerfolie und -beschichtung nach Anspruch 27, wobei die nicht an Zellen bindenden Seitenketten der Kamm-Copolymere auf der Oberfläche der aufgetragenen Folie oder Beschichtung an ihrem Ende mit Liganden versehen werden, nachdem die Folie oder Beschichtung hergestellt worden ist.
Verfahren zur Herstellung von Polymerbeschichtungen und -folien, die das Zellverhalten regulieren, dass das Gießen eines Polymerlatex umfasst, der Polymerteilchen umfasst, die in einem wasserhaltigen Medium dispergiert sind, stabilisiert durch zellregulierende Copolymere vom Kammtyp, die umfassen: a) ein hydrophobes Polymerrückgrat, b) nicht an Zellen bindende, hydrophile polymere Seitenketten, die auf das Polymerrückgrat gepfropft sind, wobei die Seitenketten ein Molekulargewicht zwischen 200 und 2000 Dalton haben, wobei zwischen null und 100% der nicht an Zellen bindenden, hydrophilen Seitenketten an ihrem Ende mit an Zellen bindenden oder als zelluläre Signale wirkenden Liganden versehen sind, so dass sie kurze, an Zellen bindende Copolymer-Seitenketten bilden, und wobei die Seitenketten weniger als 60% des Gesamtgewichts des Copolymers ausmachen.
Verfahren zur Herstellung von Polymerfolien und -beschichtungen nach Anspruch 33, wobei die nicht an Zellen bindenden Seitenketten der Kamm-Copolymere an der Oberfläche an ihrem Ende mit Liganden versehen werden, nachdem die Beschichtung oder Folie hergestellt worden ist.