DE69911314T2

DE69911314T2 - Markierungsreagenzien und deren Verwendung

Info

Publication number: DE69911314T2
Application number: DE69911314T
Authority: DE
Inventors: Harri Takalo; Jari Hovinen; Veli-Matti Mukkala; Päivi Liitti; Heikki Mikola
Original assignee: Wallac Oy
Current assignee: Wallac Oy
Priority date: 1998-06-25
Filing date: 1999-06-03
Publication date: 2004-06-24
Anticipated expiration: 2019-06-04
Also published as: US6080839A; EP0967205B1; EP0967205A1; DE69911314D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft neuartige Verbindungen, die zur Markierung eines biospezifischen Bindungsreaktanten unter Verwendung der Festphasensynthese geeignet sind. Die Erfindung betrifft weiter neuartige Verfahren zur Markierung eines biospezifischen Bindungsreaktanten in einer Festphasensynthese.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Festphasensynthese ist eine gut bekannte und weit verbreitete Technologie in der modernen organischen Chemie zur Herstellung verschiedener biologisch wichtiger Verbindungen. Sie hat viele neue Anwendungen gefunden, wie kombinatorische Bibliotheken und das Peptid-basierte DNA-Analogon (PNA, Peptid-Nukleinsäuren). Mit der technologischen Entwicklung hat sich ein Bedarf entwickelt, diese biologisch interessanten Verbindungen während der Festphasensynthese zur markieren. Einige nicht-fluoreszierende Markierungsverbindungen sind veröffentlicht worden (Arya, R. und Gariepy, J., 1991, Bioconjugate Chem., 2, 323, Cuenoud, B. und Schepartz, A., 1991, Tetrahedron, 47, 2535; Rana, T. M., Ban, M. und Hearst, J. E., 1992, Tetrahedron Lett., 33, 4521; Song, A. I. und Rana, T. A., 1997, Bioconjugate Chem., 8, 249). Diese Markierungen sind hauptsächlich entwickelt worden um Metallionen, wie Fe, Cu, in ein Peptid einzubauen um als Sequenz-spezifisches Spaltungsagens für Proteine zu fungieren. Radioaktives ¹⁵³Gd, ¹¹¹In, usw., können zur in-vivo-Tumorlokalisierung und Radioimmunotherapie verwendet werden. Diese veröffentlichten Monomere können als lumineszierende Markierungen verwendet werden, die Lanthanidionen und einen getrennten Lumineszenzverstär kungsschritt verwenden. Es ist jedoch ein getrennter Verstärkungsschritt erforderlich um die Lumineszenz, die zu bestimmen ist, zu erzeugen. Während der Lumineszenzverstärkung muss das Lanthanid von der Markierung getrennt werden, und folglich geht räumliche Information verloren.
Fluoreszierende Markierungsmonomere für die Festphasensynthese sind veröffentlicht worden (Lohse, J., Nielsen, P. E., Harrit, N. und Dahl, O., 1997, Bioconjugate Chem., 8, 503; McCafferty, D. G., Bishop, B. M., Wall, C. G., Hughes, S. G., Mecklenberg, S. L., Meyer, T. J. und Erickson, B. W., 1995, Tetrahedron, 51, 1093; WO96/03409). Fluorescein und andere organische Chromophore werden in diesen Studien verwendet. Derartige Markierungen und markierte Biomoleküle leiden jedoch unter vielen allgemein bekannten Nachteilen, wie Raman-Streuung, anderen fluoreszierenden Verunreinigungen, niedriger Wasserlöslichkeit, Konzentrationslöschung, usw.
In speziellen Bindungsassays, wie z. B. Immunoassays, DNA-Hybridisierungsassays, Rezeptorbindungsassays und zellulären Bindungsassays, liegen im Allgemeinen sehr niedrige Konzentrationen des zu messenden Analyten vor. Daher sind verschiedene Markierungsverbindungen entwickelt worden, die es gestatten, den zu bestimmenden markierten Reaktanten qualitativ und quantitativ mit hoher Empfindlichkeit zu bestimmen. In Immunoassays und DNA-Hybridisierungsassays ist zeitaufgelöste Lumineszenzspektroskopie unter Verwendung von Lanthanidchelaten gut bekannt (z. B. I. Hemmilä, T. Ståhlberg und P. Mottram (Hrsg.), "Bioanalytical Applications of Labeling Technologies", Wallac, Turku; 1994). Stabile, photolumineszierende (in diesem Zusammenhang einfach als lumineszierend bezeichnet) Lanthanidchelate besitzen auch andere Anwendungen, z. B. Fluoreszenzmikroskopie und Cytometrie. Daher ist eine Anzahl an Versuchen gemacht worden, neue hochgradig lumineszierende Chelatmarkierungsverbindungen zu entwickeln, die für diese Arten von zeitaufgelösten, fluorometrischen Anwendungen geeignet sind. Diese beinhalten beispielsweise stabile Chelatverbindungen, die aus Derivaten von Pyridinen ( US 4 920 195 , US 4 801 722 , US 4 761 481 , PCT/FI91/00373, US 5 459 186 , EP-A 0770610, Remuinán, M. J., Román, H., Alonso, M. T. und Rodriguez-Ubis, J. C., 1993, J. Chem. Soc., Perkin Trans.2, 1099), von Bipyridinen ( US 5 216 134 ), von Terpyridinen ( US 4 859 777 , US 5 202 423 , US 5 324 825 ) oder ver-schiedenen phenolischen Verbindungen ( US 4 670 572 , US 4 794 191 , Ital. Pat. 42508 A/89) als Energie-vermittelnde Gruppen und Polycarbonsäuren als chelatisierende Teile zusammengesetzt sind. Zusätzlich sind verschiedene Dicarboxylatderivate ( US 5 032 677 , US 5 055 578 , US 4 772 563 ), makrocyclische Cryptate ( US 4 927 923 , WO 93/5049, EP-A-493 745) und makrocyclische Schiff-Basen (EP-A-369 000) patentiert worden. Keines dieser Patente und keiner dieser Artikel bieten Verfahren zur Markierung eines biospezifischen Bindungsreaktanten, wie ein Hapten, ein Peptid, ein Rezeptorligand, ein Wirkstoff oder PNA-Oligomer, mit lumineszierenden Markierungen unter Verwendung der Festphasensynthese.
AUFGABEN UND ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist es, die Probleme in Verbindung mit der Markierung kleiner Moleküle mit lumineszierenden Chelaten zu lösen und Verfahren zur einfacheren Markierung zu entwickeln. Durch Herstellen geeigneter Ligandstrukturen mittels Festphasensynthese ist das Markieren kleiner Moleküle mit direkt lumineszierenden Lanthanidchelaten zugänglich.
Eine Aufgabe der Erfindung ist es, einen neuen Markierungsreaktanten zur Verfügung zu stellen, der zur Markierung eines biospezifischen Bindungsreaktanten unter Verwendung der Festphasensynthese geeignet ist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein neuartiges Verfahren zur Markierung eines biospezifischen Bindungsreaktanten in der Festphasensynthese bereitzustellen.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Markierung eines biospezifischen Bindungsreaktanten mit einer exakten, vorbestimmten Anzahl von Markierungsreaktanten (einer oder mehrere) bereitzustellen.
Damit betrifft die vorliegende Erfindung unter einem Gesichtspunkt einen neuartigen Markierungsreaktanten der Formel (I) der zur Markierung eines biospezifischen Bindungsreaktanten unter Verwendung der Festphasensynthese geeignet ist
worin
A eine zweiwertige aromatische Struktur ist, die fähig ist, Licht oder Energie zu absorbieren und die Anregungsenergie auf ein Lanthanidion zu übertragen, nachdem das durch die Festphasensynthese hergestellte Produkt vom verwendeten festen Träger freigesetzt, von Schutzgruppen befreit und in ein Lanthanidchelat überführt worden ist;
R für -Z(G'-NH-X)G''-E steht, worin
R eine transiente Schutzgruppe ist, wobei diese Gruppe z. B. 2-(4-Nitrophenylsulfonyl)ethoxycarbonyl, Trityl, 4-Methoxytrityl, 4,4'-Dimethoxytrityl, tert.-Butoxycarbonyl, Fluorenylmethyloxycarbonyl ist;
E eine Carbonsäure, ihr Salz, Aktivester oder Halogenid ist, worin dieser Ester z. B. ein N-Hydroxysuccinimido, o-, p- oder m-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol oder Pentafluorophenol ist, und das Halogenid Fluorid, Bromid oder Chlorid ist;
Z der Brückenpunkt ist und aus
oder substituierten oder unsubstituierten dreiwertigen Derivaten von Cyclohexan, Cyclohexen, Cyclohexadien, Benzol, Cyclopentan, Cyclopenten, Cyclopentadien, Cyclobutan, Cyclobuten, Cyclobutadien, Aziridin, Diaziridin, Oxetan, Thietan, Azet, Azetidin, 1,2-Dihydro-1,2-diazet, 1,2-Diazetidin, Furan, Tetrahydrofuran, Thiophen, 2,5-Dihydrothiophen, Thiolan, Selenophen, Pyrrol, Pyrrolidin, Phosphol, 1,3-Dioxolan, 1,2-Dithiol, 1,2-Thiolan, 1,3-Dithiol, 1,3-Dithiolan, Oxazol, 4,5-Dihydrooxazol, Isoxazol, 4,5-Dihydroisoxazol, 2,3-Dihydroisoxazol, Thiazol, Isothiazol, Imidazol, Imidazolidin, Pyrazol, 4,5-Dihydropyrazol, Pyrazolidin, Triazol, Pyran, Pyran-2-on, 3,4-Dihydro-2H-pyran, Tetrahydropyran, 4H-Pyran, Pyran-4-on, Pyridin, Pyridon, Piperidin, Phosphabenzol, 1,4-Dioxin, 1,4-Dithiin, 1,4-Oxathiin, Oxazin, 1,3-Oxazinon, Morpholin, 1,3-Dioxan, 1,3-Dithian, Pyridazin, Pyrimidin, Pyrazin, Piperazin, 1,2,4-Triazin, 1,3,5-Triazin, 1,3,5-Triazacyclohexan-2,4,6-trion gebildet wird;
G eine Brücke zwischen A und Z ist, G' eine Brücke zwischen NH und Z ist und G'' eine Brücke zwischen E und Z ist, die gleich oder verschieden sind, nicht notwendigerweise vorliegen und aus einer bis zehn Gruppierungen gebildet werden, wobei jede Gruppierung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phenylen, 1–12 Kohlenstoffatome enthaltendes Alkylen, Ethindiyl (-C≡C-), Ether (-O-), Thioether (-S-), Amid (-CO-NH- und -NH-CO- und -CO-NR'- und – NR'-CO-), Carbonyl (-CO-), Ester (-COO- und -OOC-), Disulfid (-S-S-), Diaza (-N=N-) und tertiärem Amin (- N(R'')-), worin R'' ein Alkyl darstellt, das weniger als 5 Kohlenstoffatome enthält;
R' für -COOR''' steht, worin R''' ein Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder Benzyl ist, wobei das Phenyl oder Benzyl substituiert oder unsubstituiert sein kann.
Unter einem anderen Gesichtspunkt betrifft diese Erfindung die Verwendung eines Markierungsreaktanten der Formel (I)
worin
A eine zweiwertige aromatische Struktur ist, die fähig ist, Licht oder Energie zu absorbieren und die Anregungsenergie auf ein Lanthanidion zu übertragen, nachdem das durch die Festphasensynthese hergestellte Produkt vom verwendeten festen Träger freigesetzt, von Schutzgruppen befreit und in ein Lanthanidchelat überführt worden ist;
R für -Z(G'-NH-X)G''-E steht, worin
R eine transiente Schutzgruppe ist, worin diese Gruppe z. B. 2-(4-Nitrophenylsulfonyl)ethoxycarbonyl, Trityl, 4-Methoxytrityl, 4,4'-Dimethoxytrityl, tert.-Butoxycarbonyl, Fluorenylmethyloxycarbonyl ist;
E eine Carbonsäure, ihr Salz, aktiver Ester oder Halogenid ist, worin dieser Ester z. B. ein N-Hydroxysuccinimido, o-, p- oder m-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol oder Pentafluorophenol ist, und das Halogenid Fluorid, Bromid oder Chlorid ist;
Z der Brückenpunkt ist und aus
oder substituierten oder unsubstituierten dreiwertigen Derivaten von Cyclohexan, Cyclohexen, Cyclohexadien, Benzol, Cyclopentan, Cyclopenten, Cyclopentadien, Cyclobutan, Cyclobuten, Cyclobutadien, Aziridin, Diaziridin, Oxetan, Thietan, Azet, Azetidin, 1,2-Dihydro-1,2-diazet, 1,2-Diazetidin, Furan, Tetrahydrofuran, Thiophen, 2,5-Dihydrothiophen, Thiolan, Selenophen, Pyrrol, Pyrrolidin, Phosphol, 1,3-Dioxolan, 1,2-Dithiol, 1,2-Thiolan, 1,3-Dithiol, 1,3-Dithiolan, Oxazol, 4,5-Dihydrooxazol, Isoxazol, 4,5-Dihydroisoxazol, 2,3-Dihydroisoxazol, Thiazol, Isothiazol, Imidazol, Imidazolidin, Pyrazol, 4,5-Dihydropyrazol, Pyrazolidin, Triazol, Pyran, Pyran-2-on, 3,4-Dihydro-2H-pyran, Tetrahydropyran, 4H-Pyran, Pyran-4-on, Pyridin, Pyridon, Piperidin, Phosphabenzol, 1,4-Dioxin, 1,4-Dithiin, 1,4-Oxathiin, Oxazin, 1,3-Oxazinon, Morpholin, 1,3-Dioxan, 1,3-Dithian, Pyridazin, Pyrimidin, Pyrazin, Piperazin, 1,2,4-Triazin, 1,3,5-Triazin, 1,3,5-Triazacyclohexan-2,4,6-trion gebildet wird;
G eine Brücke zwischen A und Z ist, G' eine Brücke zwischen NH und Z ist und G'' eine Brücke zwischen E und Z ist, die gleich oder verschieden sind, nicht notwendigerweise vorliegen und aus einer bis zehn Gruppierungen gebildet werden, wobei jede Gruppierung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phenylen, 1–12 Kohlenstoffatome enthaltendes Alkylen, Ethindiyl (-C≡C-), Ether (-O-), Thioether (-S-), Amid (-CO-NH- und -NH-CO- und -CO-NR'- und – NR'-CO-), Carbonyl (-CO-), Ester (-COO- und -OOC-), Disulfid (-S-S-), Diaza (-N=N-) und tertiärem Amin (- N(R'')-), worin R'' ein Alkyl darstellt, das weniger als 5 Kohlenstoffatome enthält;
R' für -COOR''' steht, worin R''' ein Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder Benzyl ist, wobei das Phenyl oder Benzyl substituiert oder unsubstituiert sein kann;
zur Markierung eines biospezifischen Reaktanten unter Verwendung der Festphasensynthese.
Unter noch einem anderen Gesichtspunkt betrifft diese Erfindung ein neuartiges Verfahren zur Markierung eines biospezifischen Bindungsreaktanten mit einer exakten, vorbestimmten Anzahl an Markierungsreaktanten der Formel (I) in einer Festphasensynthese, wobei das Verfahren die Stufen

a) des Umsetzens eines Markierungsreaktanten der Formel (I)
worin A eine zweiwertige aromatische Struktur ist, die fähig ist, Licht oder Energie zu absorbieren und die Anregungsenergie auf ein Lanthanidion zu übertragen, nachdem das durch die Festphasensynthese hergestellte Produkt vom verwendeten festen Träger freigesetzt, von Schutzgruppen befreit und in ein Lanthanidchelat überführt worden ist; R für -Z(G'-NH-X)G''-E steht, worin X eine transiente Schutzgruppe ist, wobei diese Gruppe z. B. 2-(4-Nitrophenylsulfonyl)ethoxycarbonyl, Trityl, 4-Methoxytrityl, 4,4'-Dimethoxytrityl, tert.-Butoxycarbonyl, Fluorenylmethyloxycarbonyl ist; E eine Carbonsäure, ihr Salz, aktiver Ester oder Halogenid ist, worin dieser Ester z. B. ein N-Hydroxysuccinimido, o-, p- oder m-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol oder Pentafluorophenol ist, und das Halogenid Fluorid, Bromid oder Chlorid ist; Z der Brückenpunkt ist und aus
oder substituierten oder unsubstituierten dreiwertigen Derivaten von Cyclohexan, Cyclohexen, Cyclohexadien, Benzol, Cyclopentan, Cyclopenten, Cyclopentadien, Cyclobutan, Cyclobuten, Cyclobutadien, Aziridin, Diaziridin, Oxetan, Thietan, Azet, Azetidin, 1,2-Dihydro-1,2-diazet, 1,2-Diazetidin, Furan, Tetrahydrofuran, Thiophen, 2,5-Dihydrothiophen, Thiolan, Selenophen, Pyrrol, Pyrrolidin, Phosphol, 1,3-Dioxolan, 1,2-Dithiol, 1,2-Thiolan, 1,3-Dithiol, 1,3-Dithiolan, Oxazol, 4,5-Dihydrooxazol, Isoxazol, 4,5-Dihydroisoxazol, 2,3-Dihydroisoxazol, Thiazol, Isothiazol, Imidazol, Imidazolidin, Pyrazol, 4,5- Dihydropyrazol, Pyrazolidin, Triazol, Pyran, Pyran-2-on, 3,4-Dihydro-2H-pyran, Tetrahydropyran, 4H-Pyran, Pyran-4-on, Pyridin, Pyridon, Piperidin, Phosphabenzol, 1,4-Dioxin, 1,4-Dithiin, 1,4-Oxathiin, Oxazin, 1,3-Oxazinon, Morpholin, 1,3-Dioxan, 1,3-Dithian, Pyridazin, Pyrimidin, Pyrazin, Piperazin, 1,2,4-Triazin, 1,3,5-Triazin, 1,3,5-Triazacyclohexan-2,4,6-trion gebildet wird; G eine Brücke zwischen A und Z ist, G' eine Brücke zwischen NH und Z ist und G'' eine Brücke zwischen E und Z ist, die gleich oder verschieden sind, nicht notwendigerweise vorliegen und aus einer bis zehn Gruppierungen gebildet werden, wobei jede Gruppierung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phenylen, 1–12 Kohlenstoffatome enthaltendes Alkylen, Ethindiyl (-C≡C-), Ether (-O-), Thioether (-S-), Amid (-CO-NH- und -NH-CO- und -CO-NR'- und – NR'-CO-), Carbonyl (-CO-), Ester (-COO- und -OOC-), Disulfid (-S-S-), Diaza (-N=N-) und tertiärem Amin (- N(R'')-), worin R'' ein Alkyl darstellt, das weniger als 5 Kohlenstoffatome enthält; R' für -COOR''' steht, worin R''' ein Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder Benzyl ist, wobei das Phenyl oder Benzyl substituiert oder unsubstituiert sein kann, mit einer funktionellen Gruppe, die an eine feste Phase gebunden ist, wobei diese funktionelle Gruppe wahlweise
i) eine von Schutzgruppen befreite funktionelle Gruppe des Markierungsreaktanten der Formel (I) ist, der an diese feste Phase gebunden ist, oder
ii) der biospezifische Bindungsreaktant ist, der an diese feste Phase gebunden ist,
b) des Entfernens der transienten Schutzgruppe X und gegebenenfalls anderer transienter Schutzgruppen, die an die feste Phase gebunden sind,
c) des Umsetzens des Markierungsreaktanten der Formel (I) zu der in Stufe b) von Schutzgruppen befreiten funktionellen Gruppe des Markierungsreaktanten der Formel (I), der in Stufe a) an die feste Phase gebunden wurde,
d) gegebenenfalls der Wiederholung der Stufen b) bis c) so oft es notwendig ist um die exakte, vorbestimmte Anzahl an Markierungsreaktanten der Formel (I), die an die feste Phase gebunden sind, zu erhalten,
e) des Abspaltens des nach der letzten Stufe c) erhaltenen Produkts von der festen Phase, des Umwandelns von R' in -COOH, des Entfernens der Gruppe oder der Gruppen, die das Produkt an die feste Phase gebunden haben, und des Entfernens möglicher Schutzgruppen sowie
f) des Umwandelns des Produkts aus Schritt e) in ein Lanthanidchelat umfasst.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt ein Umkehrphasen-HPLC-Chromatogramm des Oligopeptid-Konjugats R-E-S-Q-N-Y-P-I-V-X¹-CONH₂ nach Entschützen (rohes Reaktionsgemisch). X¹ ist das entschützte Markierungsreagens 5, das an den COOH-Terminus des Oligopeptids gebunden ist, und
2 zeigt ein Elektronenspray-Massenspektrum des Oligopeptid-Konjugats (Hauptpeak des in 1 gezeigten HPLC-Profils).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die neuartigen Markierungsreaktanten und neuartigen Markierungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung sind besonders geeignet zur Markierung kleiner Moleküle. Die kleinen Moleküle sind biospezifische Bindungsreaktanten, die Antigene, Haptene, Peptide, Rezeptorliganden, Wirkstoffe oder PNA-Oligomere enthalten, aber nicht darauf beschränkt sind, die in auf einer spezifischen Bioaffinität basierenden Bindungsassays, wie Immunoassays, DNA-Hybridisierungsassays, Rezeptorbindungsassays, immunocytochemischen oder immunohistochemischen Assays, die fluorometrische oder zeitaufgelöste fluorometrische Bestimmung der spezifischen Lumineszenz verwenden, verwendet werden.
Besonders bevorzugte transiente Schutzgruppen X sind 2-(4-Nitrophenylsulfonyl)ethoxycarbonyl, Trityl, 4-Methoxytrityl, 4,4'-Dimethoxytrityl, Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) oder tert.-Butoxycarbonyl (Boc).
Der Substituent R''' ist vorzugsweise Methyl, Ethyl oder tert.-Butyl.
Der Ausdruck "zweiwertig" in der Definition von A soll eine chemische Gruppe bedeuten, die an zwei benachbarte Atome gebunden ist.
Die zweiwertige aromatische Struktur A ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den in Schema 1 beschriebenen Strukturen.
Am meisten bevorzugt ist der Markierungsreaktant entweder 6-{N-{4-{2'''-{2''',6'''-Bis{N,N-bis-[(tert.-butoxycarbonyl)methyl]aminomethyl}-4'''-pyridyl}ethinyl}phenoxymethylcarbonyl}amino}-2-[N-(fluorenylmethyloxycarbonyl)-amino]hexansäure (5); 6-{N-{4'-{2''-{1''',3'''-Bis[(tert.-butoxycarbonyl)methyl]aminometh-5''''-yl-2''''- pyridyl}-1H-pyrazol-4''''-yl}ethyl}phenoxymethylcarbonyl}-amino-2-[N-(fluorenylmethyloxycarbonyl)amino]hexansäure (10) oder Tetra(tert.-butyl) {2,2',2'',2'''-[[4-[4-[N-(carboxymethyl)-N-[2-(4-methoxytritylamino)ethyl]aminocarbonylmethoxy]phenylethinyl]pyridin-2,6-diyl)bis(methylennitrilo)tetrakis(acetat)} (13).
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Lanthanidchelat ein Europium(III)-, Terbium(III)-, Samarium(III)- oder Dysprosium(III)chelat.
Das Markieren des biospezifischen Bindungsreaktanten wird unter Verwendung von Festphasensyntheseverfahren durchgeführt. Es erschien wünschenswert, geeignete geschützte Monomere herzustellen, die in die biospezifischen Reaktanten während der Festphasensynthese eingebaut werden konnten. Die erfindungsgemäßen Markierungsreaktanten bilden einen Lumineszenz-markierten biospezifischen Bindungsreaktanten nach Freisetzen des Produkts vom festen Träger, Entschützen und Zugabe eines geeigneten Lanthanidions. Die erfindungsgemäße Markierungstechnik besitzt viele Vorteile gegenüber herkömmlicher Markierung in flüssiger Phase, wie hohe Ausbeuten einfach gereinigter Produkte, einfache Routineautomatisierung unter Erzielung einer verbesserten Unempfindlichkeit; Scale-up und Wiederholbarkeit der Synthese und des Markierens biospezifischer Bindungsreaktanten mit einer exakten Anzahl stabiler, lumineszierender Lanthanchelate ist möglich. Obwohl viele der Vorteile eine Festphasenmarkierung betreffen, können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch bei Markierung in flüssiger Phase verwendet werden.
Die Markierungsreaktanten und Verfahren dieser Erfindung kombinieren mehrere wichtige Merkmale, wie:

– eine aromatische Struktur, die dazu in der Lage ist, Licht oder Energie zu absorbieren und die Anregungsenergie auf ein Lanthanidion zu übertragen, nachdem das durch die Festphasensynthese hergestellte Produkt vom verwendeten festen Träger freigesetzt, entschützt und in ein Lanthanidchelat überführt worden ist,
– eine funktionelle Gruppe oder Gruppen, die ein effizientes Kuppeln der Verbindung des biospezifischen Bindungsreaktanten ohne Zerstörung seiner Bindungseigenschaften und Verringerung der Lumineszenzeigenschaften des endgültigen, markierten, biospezifischen Bindungsreaktanten gestatten,
– andere funktionelle Gruppen werden geeigneterweise gegen die in der Festphasensynthese verwendeten Bedingungen und Reaktanten geschützt, und es ist einfach, die funktionellen Gruppen während der Festphasensynthese und/oder nachdem das Produkt vom festen Träger freigesetzt worden ist, zu entschützen (bzw. von Schutzgruppen zu befreien).

Es ist jedoch wirklich nicht notwendig, dass der endgültige biospezifische Bindungsreaktant bereits an die feste Phase gebunden ist, wenn der Markierungsreaktant an die funktionelle Gruppe auf der festen Phase angebracht wird. Der endgültige biospezifische Reaktant kann an der festen Phase nach der Ankupplung des Markierungsreaktanten synthetisiert werden, oder alternativ dazu kann das Produkt, das den Markierungsreaktanten und gegebenenfalls auch Spacermoleküle umfasst, an der festen Phase aufgebaut und dann davon abgespalten werden, wonach das abgespaltene Produkt letztlich in Lösung mit dem biospezifischen Bindungsreaktanten umgesetzt wird, bevor oder nachdem es in ein Lanthanidchelat umgewandelt worden ist.
Nach einem Ausführungsbeispiel wird ein Spacermolekül mit einer transienten Schutzgruppe mit einer funktionellen Gruppe auf der festen Phase umgesetzt und die transiente Schutzgruppe wird vor einer Einführung des Markierungsreaktanten auf die feste Phase entfernt. Als Beispiel eines derartigen Spacermoleküls kann 6-Aminohexansäure, die die Aminogruppe mit einer transienten Schutzgruppe, z. B. eine Gruppe X, wie zuvor erwähnt, geschützt hat, angeführt werden.
Der Markierungsreaktant kann in Biomoleküle mit Hilfe eines Peptidsyntheseautomaten (Peptidsynthesizer) eingeführt werden. Das Reagens wird an einen Amin-gebundenen festen Träger oder eine immobilisierte Aminosäure, beispielsweise durch Carbodiimidchemie, die in Jones, J., The Chemical Synthesis of Peptides, Oxford University Press, Oxford, 1994, beschrieben ist, gekoppelt (d. h., die Carbonsäurefunktion des Markierungsreagens reagiert mit der Aminogruppe des festen Trägers oder der Aminosäure in Anwesenheit eines Aktivators). Wenn der Kondensationsschritt abgeschlossen ist, wird die transiente Aminoschutzgruppe des Markierungsreagens selektiv entfernt, während das Material immer noch am festen Träger gebunden ist (d. h., mit Piperidin im Fall der Fmoc-Schutzgruppe). Das zweite Ankoppeln eines Markierungsreagens oder eines anderen Reagens (Aminosäure, Hapten) wird wie oben durchgeführt. Wenn die Synthese des gewünschten Moleküls abgeschlossen ist, wird das Material vom festen Träger abgelöst und entschützt. Die Reinigung kann durch HPLC-Techniken durchgeführt werden. Letztlich wird der gereinigte Ligand in das entsprechende Lanthanid(III)-chelat durch Zugabe einer bekannten Menge eines Lanthanid(III)-ions überführt (Mukkala, V. -M, et al., Helv. Chim. Acta 1993, 76, 1361, und M. Kwiatkowski, M. Samiotaki, U. Lamminmäki, V. -M. Mukkala und U. Landegren, Nucleic Acid Res., 1994, Band 22, 2604– 2611).
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. Die im experimentellen Teil verwendeten Strukturen und Synthesewege sind in den Schemata 2 bis 5 abge bildet. Schema 2 veranschaulicht das Syntheseverfahren zur Herstellung des Markierungsreagens 5. Die experimentellen Details sind in den Beispielen 1 bis 4 angegeben. Schema 3 zeigt Syntheseverfahren zur Herstellung des Markierungsreagens 10. Die experimentellen Details sind in den Beispielen 5 bis 8 angegeben. Schema 4 veranschaulicht Syntheseverfahren zur Herstellung des Markierungsreagens 13. Die experimentellen Details sind in den Beispielen 9 bis 11 angegeben. Die Einführung des Markierungsreagens 5 in eine Oligopeptidstruktur unter Verwendung maschinell gestützter Festphasenchemie ist in Beispiel 12 beschrieben. Ein Festphasenverfahren zur Herstellung eines Östradiolkonjugats, das an vier Markierungsreagentien 5 angebunden ist, ist in Schema 5 dargestellt. Um die Kopplungswirksamkeit zu erhöhen, ist ein aliphatisches Spacermolekül (6-Aminohexansäure) zwischen die Markierungsreagentien eingeführt worden. Die experimentellen Details sind in Beispiel 13 angegeben.
EXPERIMENTELLE VERFAHREN
Adsorptionssäulenchromatographie wurde an Säulen, die mit Kieselgel 60 (Merck) gefüllt waren, durchgeführt. Analytische DSC wurde auf Silicagel 60-F₂₅₄-Platten (Merck) unter Verwendung der folgenden Lösungsmittelsysteme durchgeführt. System A: Petrolether/Ethylacetat 5/2 (V/V); System B: CHCl₃/MeOH 8/2 (V/V); NMR-Spektren wurden auf einem Gerät des Typs Jeol LA-400 bei 399,8 MHz für ¹H bzw. 105,0 MHz für ¹³C aufgenommen. TMS wurde als interner Standard verwendet. Kopplungskonstanten sind in Hertz angegeben. IR-Spektren wurden auf einem Perkin Elmer 2400-Spektrophotometer aufgenommen.
Beispiel 1
Synthese von Methyl-(4-ethinylphenoxy)acetat (2)
Eine Lösung von Methyl-(4-trimethylsilylethinylphenoxy)-acetat (20,00 g, 76 mmol) in Dichlormethan (400 ml) wurde mit Argon entlüftet. Tetrabutylammoniumfluorid (24,40 g, 91 mmol) wurden zugegeben und das Gemisch wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde mit 10%iger wässriger Zitronensäure (200 ml) und Wasser (5× 400 ml) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde in Diethylether gelöst und durch eine mit Kieselgel gefüllte Säule geführt. Verdampfen des Diethylethers ergab die Titelverbindung als Feststoff (12,63 g, 83%), der chromatographisch und spektroskopisch mit vorher synthetisiertem Material identisch war (Takalo, H., Hemmilä, I., Sutela, T. und Latva, M., 1996, Helv. Chim. Acta, 79, 789). R_f (A) 0,50.
Beispiel 2
Synthese von Tetra(tert.-butyl)-2,2',2'',2'''-{{4-[4'-(methoxycarbonylmethoxy)phenylethinyl]pyridin-2,6-diyl}-bis(methylennitrilo)}tetrakis(acetat) (3)
Ein Gemisch von Tetra(tert.-butyl)-2,2',2'',2'''-[(4-brompyridin-2,6-diyl)bis(methylennitrilo)]tetrakis(acetat) (1) (2,32 g, 3,4 mmol), Bis(triphenylphosphin)palladium(II)chlorid (0,050 g, 70 mmol) und CuI (0,027 g, 140 mmol) in trockenem THF (10 ml) und trockenem Triethylamin (10 ml) wurden mit Argon entlüftet. Verbindung (2) (0,79 g, 4,1 mmol) wurde zugegeben und das Gemisch wurde 7 Stunden lang bei 50°C gerührt. Die gekühlte Lösung wurde filtriert, das Filtrat eingedampft und in Chloroform (150 ml) wieder aufgelöst. Die Lösung wurde mit Wasser (3× 150 ml) gewaschen, getrocknet und eingedampft. Reinigung an Kieselgel (System A) führte zur Titelverbindung in Form eines Öls (2,01 g, 75%). R_f (A) 0,40. IR (Film): 2212 (C≡C); 1750 (C=O); 1730 (C=O). ¹H-NMR (CDCl₃): δ 1,47 (36H, s); 3,50 (8H, s); 3,83 (3H, s); 4,02 (4H, s); 4,67 (2H, s); 6,90 (2H, d, J 9,0); 7,46 (2H, d, J 9,0); 7,60 (2H, s). ¹³C-NMR (CDCl₃): δ 28, 19; 52, 36; 55, 86; 59, 73; 65, 18; 81, 25; 86, 96; 92,89; 114,74; 115,90; 122,66; 132,68; 132,69; 133,44; 158,19; 168,98; 171,11.
Beispiel 3
Synthese von 4-{2''',6'''-Bis{N,N-bis[(tert.-butoxycarbonyl)methyl]aminomethyl}-4'''-pyridyl}ethinyl}phenoxymethylessigsäure (4)
Verbindung (3) (1,98 g, 2,5 mmol) wurden in 0,25 M KOH (25 ml, 98% EtOH, 2% Wasser) gelöst und das Gemisch wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von l0%iger wässriger Zitronensäure (100 ml) gequencht. Die resultierende Suspension wurde mit Chloroform (100 ml) gequencht. Die organische Schicht wurde mit Zitronensäure (2× 100 ml) und Wasser (2× 100 ml) gewaschen. Eindampfen bis zur Trockne ergab die Titelverbindung in Form eines Feststoffs (87%). R_f (B) 0,4. IR (Film): 2209 (C≡C). ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 1,41 (36H, s); 3,48 (8H, s); 3,89 (4H, s); 4,76 (2H, s); 6,99 (2H, d, J 8,8); 7,52 (2H, d, J 8,8); 7,52 (2H, s).
Beispiel 4
Synthese von 6-{N-{4-{2''-{2''',6'''-Bis{N,N-bis[(tert.-butoxycarbonyl)methyl]aminomethyl}-4'''-pyridyl}ethinyl}-phenoxymethylcarbonyl}amino}-2-[N-(fluorenylmethyloxycarbonyl)amino]hexansäure (5).
Verbindung 4 (0,75 g, 0,98 mmol) und N-Hydroxysuccinimid (HO-Su) (0,13 g, 1,1 mmol) wurden in trockenem Dioxan (30 ml) gelöst. In trockenem Dioxan (5 ml) vorgelöstes DCC (0,23 g, 1,1 mmol) wurde zugegeben und das Gemisch wurde 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und auf eine Lösung eines Fmoc-Lysin-Hydrochlorids (0,88 g, 2,2 mmol) in einem Gemisch von trockenem DMF (15 ml) und Pyridin (5 ml) filtriert. Nach 4 Stunden wurde Ethanol-freies Chloroform (150 ml) zugegeben, und die Lösung wurde mit 10%iger wässriger Zitronensäure (3× 50 ml) und Wasser (50 ml) gewaschen, getrocknet (Molekularsieb 4A) und eingeengt. Reinigung an Silicagel (System B) führte zur Titelverbindung in Form eines Feststoffs (56%). IR (Film): 3315 (OH); 2210 (C≡C); 1681 (C=O). ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 1,23 (2H, m); 1,40 (36H, s); 3,10 (2H, m); 3,30 (4H, m); 3,42 (8H, s); 3,89 (4H, s); 3,73 (1H, m), 4,24 (5H, m); 4,51 (2H, m); 7,01 (2H, d, J 8,8); 7,32 (2H, t, J 7,2); 7,40 (2H, t, J 7,2); 7,51 (2H, s); 7,52 (2H, d, J 8,8); 7,69 (2H, d, J 7,5); 7,88 (2H, d, J 7,5); 8,17 (1H, t, J 6,3); 8,32 (1H, s).
Beispiel 5
Synthese von Tetra(tert.-butyl)-2,2',2'',2'''-{{6,6'-[4'-(methoxycarbonylmethoxy)phenylethinyl]-1H-pyrazol-1'',3''-diyl}bis(pyridin)-2,2'-diyl}bis(methylennitrilo)}tetrakis(acetat) (7)
Ein Gemisch von Verbindung 6 (2,14 g, 2,5 mmol), Bis(triphenylphosphin)palladium(II)chlorid (35 mg, 50 mmol) und CuI (19 mg, 0,1 mmol) in trockenem DMF (12,5 ml), das trockenes Triethylamin (10 ml) enthielt, wurden mit Argon entlüftet. Das Gemisch wurde über Nacht bei 35°C gerührt. Die Lösung wurde filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde in Chloroform (100 ml) aufgenommen, mit Wasser (3× 100 ml) gewaschen, getrocknet und eingeengt. Die Reinigung wurde auf einer Kieselgelsäule (System A) durchgeführt. Die Ausbeute betrug 1,12 g (45%). R_f (A) 0,2. IR (Film): 1737 (C=O); 1143 (C-O, C=O). ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 1,38 (18H, s); 1,42 (18H, s); 3,49 (4H, s); 3,52 (4H, s); 3,72 (3H, s); 4,00 (2H, s); 4,08 (2H, s); 4,86 (2H, s); 6,98 (2H, d, J 8,9); 7,95 (1H, t, J 7,8); 8,01 (1H, d, J 7, 1); 8, 88 (1H, s).
Beispiel 6
Synthese von Tetra(tert.-butyl)-2,2',2'',2'''-{{6,6'-{2-[4'-(methoxycarbonylmethoxy)phenyl]ethyl}-1H-pyrazol-1'',3''-diyl}bis(pyridin)-2,2'-diyl}bis(methylennitrilo)}-tetrakis(acetat) (8).
Verbindung 7 (0,82 g, 0,88 mmol) wurden in trockenem Methanol (60 ml) gelöst. Pd/C (0,16 g; 10%) wurden zugegeben und das Gemisch wurde 4 Stunden lang unter einer Wasserstoffatmosphäre gerührt. Die Lösung wurde durch Celite filtriert und eingedampft. Die Ausbeute betrug 0,57 g (70%). R_f (A) 0,3. IR (Film): 1738 (C=O); 1143 (C-O). ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 1,37 (18H, s); 1,41 (18H, s); 2,88 (2H, d, J 8,4); 3,18 (2H, d, J 8,4); 3,48 (4H, s); 3,49 (4H, s); 3,68 (3H, s); 3,98 (2H, s); 4,04 (2H, s); 4,73 (2H, s); 6,82 (2H, d, J 8,4); 7,18 (2H, d, J 8,4); 7,47 (1H, d, J 7,6); 7,55 (1H, d, J 7,6); 7,87 (1H, d, J 7,8), 7,88 (1H, t, J 7,6); 7,96 (1H, t, J 7,8); 7,98 (1H, t, J 7,6), 8,44 (1H, s).
Beispiel 7
Synthese von {4'-{2''-{1''',3'''-Bis[(tert.-butoxycarbonyl)methyl]aminometh-5''''-yl-2''''-pyridyl}-1H-pyrazol-4'''-yl}ethylphenoxy}essigsäure (9).
Die Titelverbindung (9) wurde, wie oben für 4 in Beispiel 2 beschrieben, unter Verwendung von Verbindung 8 (0,57 g, 0,62 mmol) als Ausgangsmaterial synthetisiert. Reinigung wurde an Silicagel (Petrolether/Ethylacetat 5/2 → MeOH/CHCl₃ 2/8) durchgeführt. Die Ausbeute betrug 100%. R_f (B) 0,95. ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 1,37 (18H, s); 1,41 (18H, s); 2,84 (2H, d, J 8,4); 3,15 (2H, d, J 8,4); 3,47 (4H, s); 3,48 (4H, s); 3,98 (2H, s); 4,03 (2H, s); 4,17 (2H, s); 6,74 (2H, d, J 8,4); 7,11 (2H, d, J 8,4); 7,46 (1H, d, J 7,8); 7,55 (1H, d, J 6,9); 7,87 (1H, d, J 7,8); 7,88 (1H, t, J 7, 9); 7,95 (1H, d, J 6,9); 7,98 (1H, t, J 7,8); 8,44 (1H, s).
Beispiel 8
Synthese von 6-{N-{4'-{2''-{1''',3'''-Bis[(tert.-butoxycarbonyl)methyl]aminometh-5''''-yl-2''''-pyridyl}-1H-pyrazol-4'''-yl}ethyl}phenoxymethylcarbonyl}amino-2-[N-(fluorenylmethyloxycarbonyl)amino]hexansäure (10).
Die Titelverbindung (10) wurde, wie in Beispiel 4 für 5 beschrieben, unter Verwendung von 9 als Ausgangsmaterial hergestellt. ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 1,05 (1H, m); 1,20 (2H, m); 1,36 (18H, s); 1,40 (18H, s); 1,60 (2H, s); 1,71 (2H, m); 2,86 (2H, t, J 7,9); 3,10 (2H, m); 3,18 (2H, m); 3,30 (4H, s); 3,38 (4H, s); 3,80 (1H, m); 3,97 (2H, s); 4,03 (2H, s); 4,23 (4H, m); 4,39 (2H, s); 6,85 (2H, d, J 8,6); 7,17 (2H, d, J 8,6); 7,31 (2H, 7, J 7,4); 7,40 (2H, t, J 7,4); 7,47 (1H, d, J 7,7); 7,55 (1H, d, J 7,7); 7,70 (2H, d, J 7,3); 7,88 (1H, d, J 7,6); 7,99 (1H, d, J 7,8); 8,44 (1H, s).
Beispiel 9
Synthese von Methyl-N-[2-{4-Methoxytrityl)amino}ethyl]-glycinat (11).
N-[4-Methoxytrityl]-1,2-diaminoethan (4,69 g, 14,2 mmol) wurden in trockenem THF (20 ml) gelöst. Trockenes TEA (2 ml) und Methylbromacetat (1,58 ml, 14,2 mmol) wurden zugegeben und das Gemisch wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt, wonach der gebildete Niederschlag abfiltriert wurde. Nach dem Einengen wurde das Filtrat in Ethylacetat gelöst, mit gesättigter Na₂SO₄-Lösung und Wasser gewaschen und getrocknet. Reinigung an Silicagel (Eluent PE : EA : TEA 5 : 1 : 1) ergab die Titelverbindung in Form eines Öls. ¹H-NMR (CDCl₃): δ 1,93 (1H, br); 2,26 (2H, t, J 5,6); 2,72 (2H, t, J 5,6); 3,34 (2H, s); 3,69 (3H, s); 3,74 (3H, s); 6,80 (2H, d, J 8,8); 7,14 (2H, t); 7,24 (4H, t); 7,36 (2H, d); 7,46 (4H, t).
Beispiel 10
Synthese von Tetra(tert.-butyl)-{2,2',2'',2'''-[[4-[4-[N-(methoxycarbonylmethyl)-N-[2-(4-methoxytritylamino)ethyl]-aminocarbonylmethoxy]phenylethinyl]pyridin-2,6-diyl]bis(methylennitrilo)tetrakis(acetat)} (12).
Verbindung 4 (0,5 g, 0,65 mmol), Verbindung 11 (0,26 g, 0, 65 mmol) und N-Hydroxysuccinimid (115 mg, 1, 0 mmol) wurden in trockenem Acetonitril gelöst. DCC (134 mg, 0,65 mmol; in trockenem Acetonitril vorgelöst) wurden zugegeben und das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Gebildetes DCU wurde abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Reinigung an Silicagel führte zu 12. ¹H-NMR (CDCl₃): δ 1,41 (36H, s); 2,27 (2H, m); 2,61 (2H, m); 3,38 (2H, s); 3,47 (8H, s); 3,68 (3H, s); 3,76 (3H, s); 4,00 (4H, s); 6,77 (2H, d, J 8,8); 6,89 (2H, d, J 8,8); 7,41– 7,14 (14H, m); 7,51 (2H, s).
Beispiel 11
Synthese von Tetra(tert.-butyl)-{2,2',2'',2'''-[[4-[4-[N-(carboxymethyl)-N-[2-(4-methoxytritylamino)ethyl]aminocarbonylmethoxy]phenylethinyl]pyridin-2,6-diyl]bis(methylennitrilo)tetrakis(acetat)} (13).
Verbindung 12 wurde hydrolysiert und wie in Beispiel 3 beschrieben gereinigt. Die Ausbeute betrug 65%. ¹H-NMR (CDCl₃): δ 1,39 (36H, s); 2,26 (2H, m); 2,61 (2H, m); 3,38 (2H, s); 3,47 (8H, s); 3,70 (3H, s); 3,78 (3H, s); 4,00 (4H, s); 6,77 (2H, d, J 8,8); 6,89 (2H, d, J 8,8); 7,42– 7,17 (14H, m); 7,54 (2H, s).
Beispiel 12
Einführung des Markierungsreagens in Oligopeptide
Um die Anwendbarkeit der hergestellten Liganden bei der Markierung von Oligopeptiden zu zeigen, wurde eine Sequenz R-E-S-Q-N-Y-P-I-V-X¹-CONH₂ auf einem Perkin Elmer 433A-Peptidsyntheseautomat (5 mmol-Maßstab) unter Verwendung von Standard-Fmoc-Chemie synthetisiert. Der Ligand 5 wurde im ersten Kopplungsschritt unter Verwendung einer verlängerten Kopplungszeit (1 h anstelle von 30 min.) eingeführt. Als die Kettenbildung vollständig war, wurde das Oligopeptid entschützt und durch HPLC gereinigt. Ein typisches HPLC-Chromatogramm (ein rohes Reaktionsgemisch) ist in 1 gezeigt. Das Produkt wurde durch Elektronenspray-Massenspektrometrie (2) bestätigt. Letztlich wurde das gereinigte Material in das entsprechende Europium(III)chelat unter Verwendung der Standardvorschrift überführt.
Beispiel 13
Markierung von Östradiol mit vier Europium(III)chelaten
Das Markierungsreagens 5 wurde, wie in Beispiel 12 beschrieben, in einen Amino-derivatisierten festen Träger eingeführt. Nach Entfernen der α-Fmoc-Schutzgruppe wurde 6-Fmoc-Aminohexansäure gekoppelt. Diese Zyklen wurden dreimal wiederholt und ein Östradiolderivat, das an einem Carbonsäurelinker gebunden war, wurde als letzter Kopplungsschritt eingeführt. Entschützen und Reinigen wurden wie in Beispiel 12 beschrieben durchgeführt.
Es ist offensichtlich, dass die erfindungsgemäßen Verfahren in der Form einer Vielzahl von Ausführungsformen, von denen nur wenige hierin beschrieben sind, einbezogen sein können. Die beschriebenen Ausführungsformen sind veranschaulichend und sollten nicht als einschränkend interpretiert werden.
Schema 1
Schema 2
Schema 3
Schema 4
Schema 5

Claims

Markierungsreaktant der Formel (I), der zur Markierung eines biospezifischen Bindungsreaktanten unter Verwendung der Festphasensynthese geeignet ist
worin A eine zweiwertige aromatische Struktur ist, die fähig ist, Licht oder Energie zu absorbieren und die Anregungsenergie auf ein Lanthanidion zu übertragen, nachdem das durch die Festphasensynthese hergestellte Produkt vom festen Träger freigesetzt, von Schutzgruppen befreit und in ein Lanthanidchelat übergeführt worden ist; R für -Z(G'-NH-X)G''-E steht, worin X eine transiente Schutzgruppe ist; E eine Carbonsäure, ihr Salz, aktiver Ester oder Halogenid ist; Z der Brückenpunkt ist und aus
oder substituierten oder unsubstituierten dreiwertigen Derivaten von Cyclohexan, Cyclohexen, Cyclohexadien, Benzol, Cyclopentan, Cyclopenten, Cyclopentadien, Cyclobutan, Cyclobuten, Cyclobutadien, Aziridin, Diaziridin, Oxetan, Thietan, Azet, Azetidin, 1,2-Dihydro-1,2-diazet, 1,2-Diazetidin, Furan, Tetrahydrofuran, Thiophen, 2,5-Dihydrothiophen, Thiolan, Selenophen, Pyrrol, Pyrrolidin, Phosphol, 1,3-Dioxolan, 1,2-Dithiol, 1,2-Thiolan, 1,3-Dithiol, 1,3-Dithiolan, Oxazol, 4,5-Dihydrooxazol, Isoxazol, 4,5-Dihydroisoxazol, 2,3-Dihydroisoxazol, Thiazol, Isothiazol, Imidazol, Imidazolidin, Pyrazol, 4,5-Dihydropyrazol, Pyrazolidin, Triazol, Pyran, Pyran-2-on, 3,4-Dihydro-2H-pyran, Tetrahydropyran, 4H-Pyran, Pyran-4-on, Pyridin, Pyridon, Piperidin, Phosphabenzol, 1,4-Dioxin, 1,4-Dithiin, 1,4-Oxathiin, Oxazin, 1,3-Oxazinon, Morpholin, 1,3-Dioxan, 1,3-Dithian, Pyridazin, Pyrimidin, Pyrazin, Piperazin, 1,2,4-Triazin, 1,3,5-Triazin, 1,3,5-Triazacyclohexan-2,4,6-trion gebildet wird; G eine Brücke zwischen A und Z ist, G' eine Brücke zwischen NH und Z ist und G'' eine Brücke zwischen E und Z ist, die gleich oder unterschiedlich sind, nicht notwendigerweise vorhanden sind und aus einer bis zehn Gruppierungen gebildet sind, wobei jede Gruppierung aus der Gruppe bestehend aus Phenylen, Alkylen, enthaltend 1–12 Kohlenstoffatome, Ethindiyl (-C≡C-), Ether (-O-), Thioether (-S-), Amid (-CO-NH- und -NH-CO- und -CO-NR'- und -NR'-CO-), Carbonyl (-CO-), Ester (-COO- und -OOC-), Disulfid (-S-S-), Diaza (-N=N-) und tertiärem Amin (-N(R'')-), worin R'' ein Alkyl, das weniger als 5 Kohlenstoffatome enthält, darstellt, ausgewählt ist; R' für -COOR'' steht, worin R'' ein Alkyl mit 1–4 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder Benzyl ist, wobei das Phenyl oder Benzyl substituiert oder unsubstituiert sein kann.
Markierungsreaktant nach Anspruch 1, wobei X 2-(4-Nitrophenylsulfonyl)ethoxycarbonyl, Trityl, 4-Methoxytrityl, 4,4'-Dimethoxytrityl, tert-Butoxycarbonyl (Boc) oder Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) ist.
Markierungsreaktant nach Anspruch 1, wobei E ein aktiver Ester, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N-Hydroxysuccinimido, o-, p- und m-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol und Pentafluorphenol, ist oder E ein Halogenid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fluorid, Bromid und Chlorid, ist.
Markierungsreaktant nach Anspruch 1, wobei R''' Methyl, Ethyl oder tert-Butyl ist.
Markierungsreaktant nach Anspruch 1, wobei der biospezifische Bindungsreaktant aus der Gruppe bestehend aus einem Antigen, einem Hapten, einem Peptid, einem Rezeptorliganden, einem Arzneimittel oder einem PNA-Oligomer ausgewählt ist.
Markierungsreaktant nach Anspruch 1, wobei -A- eine zweiwertige aromatische Struktur, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Strukturen, die in Schema 1 offenbart sind, ist.
Markierungsreaktant nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 6-{N-{4-{2''-{2''',6'''-Bis{N,N-bis[(tert-butoxycarbonyl)methyl]aminomethyl}-4'''-pyridyl}ethinyl}phenoxymethylcarbonyl}amino}-2-[-N-(fluorenylmethyl-oxycarbonyl)amino]hexansäure (5), 6-{N-{4'-{2''-{1''',3'''-Bis[(tert-butoxycarbonyl)methyl]aminometh-5''''-yl-2''''-pyridyl}-1H-pyrazol-4'''-yl}ethyl}phenoxymethylcarbonyl}amino-2-[N-(fluorenylmethyloxycarbonyl)amino]hexansäure (10) und Tetra (tert-butyl) {2,2',2'',2'''-[[4-[4-[N-(carboxymethyl)-N-[2-(4-methoxytritylamino)ethyl]aminocar bonylmethoxy]phenylethinyl]pyridin-2,6-diyl]bis(methylennitrilo)tetrakis(acetat)} (13).
Verwendung eines Markierungsreaktanten der Formel (I)
worin A eine zweiwertige aromatische Struktur ist, die fähig ist, Licht oder Energie zu absorbieren und die Anregungsenergie auf ein Lanthanidion zu übertragen, nachdem das durch die Festphasensynthese hergestellte Produkt vom festen Träger freigesetzt, von Schutzgruppen befreit und in ein Lanthanidchelat übergeführt worden ist; R für -Z(G'-NH-X)G''-E steht, worin X eine transiente Schutzgruppe ist; E eine Carbonsäure, ihr Salz, aktiver Ester oder Halogenid ist; Z der Brückenpunkt ist und aus
oder substituierten oder unsubstituierten dreiwertigen Derivaten von Cyclohexan, Cyclohexen, Cyclohexadien, Benzol, Cyclopentan, Cyclopenten, Cyclopentadien, Cyclobutan, Cyclobuten, Cyclobutadien, Aziridin, Diaziridin, Oxetan, Thietan, Azet, Azetidin, 1,2-Dihydro-1,2-diazet, 1,2-Diazetidin, Furan, Tetrahydrofuran, Thiophen, 2,5-Dihydrothiophen, Thiolan, Selenophen, Pyrrol, Pyrrolidin, Phosphol, 1,3-Dioxolan, 1,2-Dithiol, 1,2-Thiolan, 1,3-Dithiol, 1,3-Dithiolan, Oxazol, 4,5-Dihydrooxazol, Isoxazol, 4,5-Dihydroisoxazol, 2,3-Dihydroisoxazol, Thiazol, Isothiazol, Imidazol, Imidazolidin, Pyrazol, 4,5-Dihydropyrazol, Pyrazolidin, Triazol, Pyran, Pyran-2-on, 3,4-Dihydro-2H-pyran, Tetrahydropyran, 4H-Pyran, Pyran-4-on, Pyridin, Pyridon, Piperidin, Phosphabenzol, 1,4-Dioxin, 1,4-Dithiin, 1,4-Oxathiin, Oxazin, 1,3-Oxazinon, Morpholin, 1,3-Dioxan, 1,3-Dithian, Pyridazin, Pyrimidin, Pyrazin, Piperazin, 1,2,4-Triazin, 1,3,5-Triazin, 1,3,5-Triazacyclohexan-2,4,6-trion gebildet wird; G eine Brücke zwischen A und Z ist, G' eine Brücke zwischen NH und Z ist und G " eine Brücke zwischen E und Z ist, die gleich oder unterschiedlich sind, nicht notwendigerweise vorhanden sind und aus einer bis zehn Gruppierungen gebildet sind, wobei jede Gruppierung aus der Gruppe bestehend aus Phenylen, Alkylen, enthaltend 1–12 Kohlenstoffatome, Ethindiyl (-C≡C-), Ether (-O-), Thioether (-S-), Amid (-CO-NH- und -NH-CO- und -CO-NR'- und -NR'-CO-), Carbonyl (-CO-), Ester (-COO- und -OOC-), Disulfid (-S-S-), Diaza (-N=N-) und tertiärem Amin (-N(R')-), worin R'' ein Alkyl, das weniger als 5 Kohlenstoffatome enthält, darstellt, ausgewählt ist; R' für -COOR''' steht, worin R''' ein Alkyl mit 1–4 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder Benzyl ist, wobei das Phenyl oder Benzyl substituiert oder unsubstituiert sein kann; zur Markierung eines biospezifischen Bindungsreaktanten unter Verwendung der Festphasensynthese.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei X im Markierungsreaktanten 2-(4-Nitrophenylsulfonyl)ethoxycarbonyl, Trityl, 4- Methoxytrityl, 4,4'-Dimethoxytrityl, tert-Butoxycarbonyl (Boc) oder Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei E im Markierungsreaktanten ein aktiver Ester, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N-Hydroxysuccinimido, o-, p- und m-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol und Pentafluorphenol, ist oder E ein Halogenid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fluorid, Bromid und Chlorid, ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei R''' im Markierungsreaktanten Methyl, Ethyl oder tert-Butyl ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei der biospezifische Bindungsreaktant aus der Gruppe bestehend aus einem Antigen, einem Hapten, einem Peptid, einem Rezeptorliganden, einem Arzneimittel oder einem PNA-Oligomer ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei A im Markierungsreaktanten eine zweiwertige aromatische Struktur, ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus den Strukturen, die in Schema 1 offenbart sind, ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei der Markierungsreaktant aus der Gruppe bestehend aus 6-{N-{4-{2''-{2''',6'''-Bis{N,N-bis((tert-butoxycarbonyl)methyl]aminomethyl}-4'''-pyridyl}ethinyl}phenoxymethylcarbonyl}amino}-2-[-N-(fluorenylmethyloxycarbonyl)amino]hexansäure (5), 6-{N-{4'-{2''- {1''',3'''-Bis[(tert-butoxycarbonyl)methyl]aminometh-5''''-yl-2''''-pyridyl}-1H-pyrazol-4'''-yl}ethyl}phenoxymethylcarbonyl}amino-2-[N-(fluorenylmethyloxycarbonyl)amino]hexansäure (10) und Tetra (tert-butyl) {2,2',2'',2'''-[[4-[4-[N-(carboxymethyl)-N-[2-(4-methoxytritylamino)ethyl]aminocar bonylmethoxy]phenylethinyl]pyridin-2,6-diyl]bis(methylennitrilo)tetrakis(acetat)} (13) ausgewählt ist.
Verfahren zur Markierung eines biospezifischen Bindungsreaktanten mit einer genauen, vorherbestimmten Anzahl an Markierungsreaktanten der Formel (I) in einer Festphasensynthese, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst: a) Umsetzen von E eines Markierungsreaktanten der Formel (I)
worin A eine zweiwertige aromatische Struktur ist, die fähig ist, Licht oder Energie zu absorbieren und die Anregungsenergie auf ein Lanthanidion zu übertragen, nachdem das durch die Festphasensynthese hergestellte Produkt vom festen Träger freigesetzt, von Schutzgruppen befreit und in ein Lanthanidchelat übergeführt worden ist; R für -Z(G'-NH-X)G''-E steht, worin X eine transiente Schutzgruppe ist; E eine Carbonsäure, ihr Salz, aktiver Ester oder Halogenid ist; Z der Brückenpunkt ist und aus
oder substituierten oder unsubstituierten dreiwertigen Derivaten von Cyclohexan, Cyclohexen, Cyclohexadien, Benzol, Cyclopentan, Cyclopenten, Cyclopentadien, Cyclobutan, Cyclobuten, Cyclobutadien, Aziridin, Diaziridin, Oxetan, Thietan, Azet, Azetidin, 1,2-Dihydro-1,2-diazet, 1,2-Diazetidin, Furan, Tetrahydrofuran, Thiophen, 2,5-Dihydrothiophen, Thiolan, Selenophen, Pyrrol, Pyrrolidin, Phosphol, 1,3-Dioxolan, 1,2-Dithiol, 1,2-Thiolan, 1,3-Dithiol, 1,3-Dithiolan, Oxazol, 4,5-Dihydrooxazol, Isoxazol, 4,5-Dihydroisoxazol, 2,3-Dihydroisoxazol, Thiazol, Isothiazol, Imidazol, Imidazolidin, Pyrazol, 4,5-Dihydropyrazol, Pyrazolidin, Triazol, Pyran, Pyran-2-on, 3,4-Dihydro-2H-pyran, Tetrahydropyran, 4H-Pyran, Pyran-4-on, Pyridin, Pyridon, Piperidin, Phosphabenzol, 1,4-Dioxin, 1,4-Dithiin, 1,4-Oxathiin, Oxazin, 1,3-Oxazinon, Morpholin, 1,3-Dioxan, 1,3-Dithian, Pyridazin, Pyrimidin, Pyrazin, Piperazin, 1,2,4-Triazin, 1,3,5-Triazin, 1,3,5-Triazacyclohexan-2,4,6-trion gebildet wird; G eine Brücke zwischen A und Z ist, G' eine Brücke zwischen NH und Z ist und G'' eine Brücke zwischen E und Z ist, die gleich oder unterschiedlich sind, nicht notwendigerweise vorhanden sind und aus einer bis zehn Gruppierungen gebildet sind, wobei jede Gruppierung aus der Gruppe bestehend aus Phenylen, Alkylen, enthaltend 1–12 Kohlenstoffatome, Ethindiyl (-C≡C-), Ether (-O-), Thioether (-S-), Amid (-CO-NH- und -NH-CO- und -CO-NR'- und -NR'-CO-), Carbonyl (-CO-), Ester (-COO- und -OOC-), Disulfid (-S-S-), Diaza (-N=N-) und tertiärem Amin (-N(R'')-), worin R'' ein Alkyl, das weniger als 5 Kohlenstoffatome enthält, darstellt, ausgewählt ist; R' für -COOR''' steht, worin R''' ein Alkyl mit 1–4 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder Benzyl ist, wobei das Phenyl oder Benzyl substituiert oder unsubstituiert sein kann; mit einer funktionellen Gruppe, die an eine feste Phase gebunden ist, wobei die funktionelle Gruppe ggf. i) eine von einer Schutzgruppe befreite funktionelle Gruppe des Markierungsreaktanten der Formel (I), gebunden an den festen Träger, ist, oder ii) der biospezifische Bindungsreaktant, gebunden an die feste Phase, ist, b) Entfernen der transienten Schutzgruppe X und ggf. anderer transienter Schutzgruppen, die an die feste Phase gebunden sind, c) Umsetzen des Markierungsreaktanten der Formel (I) mit der in Stufe b) von einer Schutzgruppe befreiten funktionellen Gruppe des Markierungsreaktanten der Formel (I), der in Stufe a) an die feste Phase gebunden wurde, d) ggf. Wiederholen der Stufen b) bis c) für eine Anzahl von Male, die notwendig ist, um die genaue, vorher festgesetzte Zahl von Markierungsreaktanten der Formel (I), gebunden an die feste Phase, zu erhalten, e) Abspalten des Produkts nach der letzten Stufe c) von der festen Phase, Überführen von R' in -COOH, Entfernen der Gruppe oder der Gruppen, die das Produkt an die feste Phase gebunden haben, und Entfernen fakultativer Schutzgruppen und f) Umwandeln des Produkts aus Stufe e) in ein Lanthanidchelat.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei auf die Stufe f) eine Umsetzung des biospezifischen Bindungsreaktanten mit dem in Stufe f) erhaltenen Lanthanidchelat folgt, um den markierten biospezifischen Bindungsreaktanten zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der biospezifische Bindungsreaktant mit dem Produkt, das die Markierungsreaktanten enthält, umgesetzt wird, während das Produkt noch an die feste Phase gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der biospezifische Bindungsreaktant in der Festphasensynthese aufgebaut wird.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei ein Spacermolekül, das eine transiente Schutzgruppe hat, mit einer funktionellen Gruppe an der festen Phase umgesetzt wird und diese transiente Schutzgruppe vor Einführung des Markierungsreaktanten an die feste Phase entfernt wird.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei X im Markierungsreaktanten 2-(4-Nitrophenylsulfonyl)ethoxycarbonyl, Trityl, 4-Methoxytrityl, 4,4'-Dimethoxytrityl, tert-Butoxycarbonyl (Boc) oder Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei E im Markierungsreaktanten ein aktiver Ester, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N-Hydroxysuccinimido, o-, p- und m-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol und Pentafluorphenol, ist oder E ein Halogenid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fluorid, Bromid und Chlorid, ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei R''' im Markierungsreaktanten Methyl, Ethyl oder tert-Butyl ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der biospezifische Bindungsreaktant aus der Gruppe bestehend aus einem Antigen, einem Hapten, einem Peptid, einem Rezeptorliganden, einem Arzneimittel oder einem PNA-Oligomer ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei A im Markierungsreaktanten eine zweiwertige aromatische Struktur, ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus den Strukturen, die in Schema 1 offenbart sind, ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Markierungsreaktant aus der Gruppe bestehend aus 6-{N-{4-{2''-{2''',6'''-Bis{N,N-bis[(tert-butoxycarbonyl)methyl]aminomethyl}-4'''-pyridyl}ethinyl}phenoxymethylcarbonyl}amino}-2-[-N-(fluorenylmethyloxycarbonyl)amino]hexansäure (5), 6-{N-{4'-{2''-{1''',3'''-Bis[(tert-butoxycarbonyl)methyl]aminometh-5''''-yl-2''''-pyridyl}-1H-pyrazol-4'''-yl}ethyl}phenoxymethylcarbonyl}amino-2-[N-(fluorenylmethyloxycarbonyl)amino]hexansäure (10) und Tetra(tert-butyl){2,2',2'',2'''-[[4-[4-[N-(carboxymethyl)-N-[2-(4-methoxytritylamino)ethyl]aminocarbonylmethoxy]phenylethinyl]pyridin-2,6-diyl)bis(methylennitrilo)tetrakis(acetat)} (13) ausgewählt wird.