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DE69905049T2 - Auf zellen basiertes screening-system - Google Patents

Auf zellen basiertes screening-system

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DE69905049T2
DE69905049T2 DE69905049T DE69905049T DE69905049T2 DE 69905049 T2 DE69905049 T2 DE 69905049T2 DE 69905049 T DE69905049 T DE 69905049T DE 69905049 T DE69905049 T DE 69905049T DE 69905049 T2 DE69905049 T2 DE 69905049T2
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cell
cell surface
surface receptor
internalized
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DE69905049T
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Ray Conway
Terry Dunlay
A. Giuliano
Albert Gough
A. Rubin
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Cellomics Inc
Original Assignee
Cellomics Inc
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Publication date
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Description

    Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft das Gebiet der auf Fluoreszenz basierenden Zell- und molekularen biochemischen Tests zur Arzneistofferkennung.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Arzneistofferkennung in ihrer gegenwärtigen Form ist ein langer Mehrschritt-Prozess, der die Identifizierung spezifischer Krankheitsziele ("targets"), die Entwicklung eines Tests, der auf einem spezifischen Ziel beruht, die Validierung des Tests, die Optimierung und Automatisierung des Tests zur Erzeugung eines Screens, das Screening von Verbindungs- Bibliotheken mit dem Test in hohem Durchsatz, um "Treffer" zu identifizieren, die Validierung der Treffer und die Optimierung der Treffer-Verbindung beinhaltet. Das Ergebnis ("output") dieses Vorgangs ist eine Leit-Verbindung, die in präklinische, und, wenn sie bestätigt wird, eventuell in klinische Versuche geht. Bei diesem Vorgang unterscheidet sich die Phase des Screenings von den Phasen der Testentwicklung und beinhaltet das Testen der Wirksamkeit der Verbindung in lebenden biologischen Systemen.
  • Historisch gesehen ist die Arzneistofferkennung ein langsamer und teurer Prozess, der pro erzeugtem Arzneistoff zahlreiche Jahre und viele Hundert Millionen Dollar umfasst. Entwicklungen in den Bereichen der "Genomics"-Techniken und des Screening mit hohem Durchsatz haben in den Bereichen der Identifizierung von Zielen und dem Volumen an gescreenten Verbindungen zu gesteigerter Kapazität und Wirksamkeit geführt. Signifikante Fortschritte in der automatisierten DNA-Sequenzierung, der Anwendung der PCR, der positionellen Klonierung, der Hybridisierungstests und die Bioinformatik haben die Anzahl von Genen (und Genfragmenten) gesteigert, die für potentielle Arzneistoff-Screening-Ziele kodieren. Das Basisschema für das Arzneistoff-Screening bleibt jedoch das Gleiche.
  • Die Verwendung bestehender Verfahren und Protokolle zur Validierung genomischer Ziele als Angriffspunkte für die therapeutische Intervention wurde aufgrund der langsamen und manuellen Verfahren, die z. B. bei funktionellen in vivo Modellen, der funktionellen Analyse rekombinanter Proteine und der Expression von Kandidaten-Genen in stabilen Zelllinien verwendet werden, zu einer Engstelle. Primäre DNA-Sequenzdaten, die durch automatisiertes Sequenzieren erhalten wurden, ermöglichen keine Identifizierung der Genfunktion, können jedoch Informationen über allgemeine "Motive" und spezifische Genhomologie bei Vergleich mit bekannten Sequenzdatenbanken zur Verfügung stellen. Genomische Verfahren wie Subtraktionshybridisierung und RADE (rapid amplification of differential expression) können zur Identifizierung von Genen verwendet werden, die in einem Modell eines Krankheitszustands herauf- oder herabreguliert werden. Die Identifizierung und Validierung laufen jedoch immer noch auf dem gleichen Weg ab. Einige Proteomik-Verfahren verwenden die Identifizierung von Proteinen (globale Expressionstests, 2D-Elektrophorese, kombinatorische Bibliotheken) in Kombination mit reverser Genetik, um interessierende Kandidaten-Gene zu identifizieren. Solch mögliche "Krankheits-assoziierte Sequenzen" oder "DAS", die als intakte cDNA isoliert werden, stellen gegenüber diesen Verfahren einen großen Vorteil dar, aber sie werden hundertfach identifiziert, ohne irgendeine Information hinsichtlich der Art, der Aktivität und der Verteilung des kodierten Proteins bereitzustellen. Die Auswahl einer Teilmenge von DAS als Arzneistoff-Screening- Ziele ist "zufällig" und somit ohne funktionelle Daten zur Bereitstellung einer mechanistischen Verbindung mit der Krankheit extrem ineffizient. Es ist deshalb notwendig, neue Technologien zum schnellen Screening von DAS zur Etablierung biologischer Funktion bereitzustellen, wodurch die Validierung des Ziels und die Kandidaten-Optimierung bei der Arzneistofferkennung verbessert wird.
  • Zur Verbesserung der Produktivität der frühen Phase der Arzneistofferkennung gibt es drei Hauptrichtungen. Zunächst benötigt man Werkzeuge, die eine gesteigerte Fähigkeit zur Handhabung der Informationen bereitstellen. Die schnelle Entwicklung der DNA- Sequenzierungssysteme und die Entstehung der Genom-Datenbanken hat zu einer Blütezeit der Bioinformatik geführt. "Genomics" spielt eine wichtige Rolle bei der Identifizierung möglicher neuer Ziele. "Proteomics" wurde unerlässlich, um die Struktur und Funktion von Protein-Zielen in Zusammenhang zu bringen, um Arzneistoff-Wechselwirkungen vorherzusagen. Die nächste Stufe der biologischen Komplexität ist jedoch die Zelle. Daher besteht ein Bedarf, multidimensionale Informationen aus Zellen zu erhalten, zu verwalten und zu suchen. Weiterhin benötigt man Werkzeuge mit höherem Durchsatz. Wie es sich bereits bei der DNA-Sequenzierung und bei dem primären Screening mit hohem Durchsatz gezeigt hat, ist die Automatisierung ein Schlüssel zur Verbesserung der Produktivität. Die vorliegende Erfindung stellt automatisierte Systeme bereit, die Informationen über multiple Parameter aus Zellen gewinnen, die den Ansprüchen für Werkzeuge mit höherem Durchsatz gerecht werden. Die gegenwärtige Erfindung stellt auch Lösungen zur Miniaturisierung der Verfahren bereit, wodurch bei Verringerung der Volumen an Reagenzien und Testverbindungen, die in jedem Test benötigt werden, ein gesteigerter Durchsatz ermöglicht wird.
  • In frühen Arzneistofferkennungstest war Radioaktivität die hauptsächliche Anzeige ("readout"). Die WO 98/10287 beschreibt einen Test zur Bestimmung der Thrombin- Rezeptoraktivierung in einer Zelle durch Messung der Internalisierung eines markierten Antikörper-Thrombin-Rezeptorkomplexes nach Behandlung mit einem Agonistenpeptid. Der Bedarf nach mehr Information, höherem Durchsatz und Miniaturisierung hat jedoch eine Verschiebung zum Fluoreszenznachweis ausgelöst. Auf Fluoreszenz basierende Reagenzien können zu leistungsfähigeren Tests mit multiplen Parametern führen, die einen höheren Durchsatz und höheren Informationsgehalt aufweisen und geringere Volumina an Reagenzien und Testverbindungen erfordern. Fluoreszenz ist ebenfalls sicherer und billiger als auf Radioaktivität basierende Verfahren.
  • Das Screening von Zellen, die mit Farbstoffen und fluoreszierenden Reagenzien behandelt wurden, ist im Stand der Technik gut bekannt. Hinsichtlich der genetischen Veränderung von Zellen zur Produktion fluoreszierender Proteine, wie modifiziertes grün fluoreszierendes Protein (GFP) als Reportermolekül, gibt es beachtlich viel Literatur. Einige Eigenschaften von Wildtyp-GFP werden von Morise et al. (Biochemistry 13, 1974, Seiten 2656-2662) und Ward et al. (Photochem. Photobiol. 31, 1980, Seiten 611-615) offenbart. Das GFP der Qualle Aeguorea victoria besitzt ein Anregungsmaximum bei 395 nm und ein Emissionsmaximum bei 510 nm und benötigt für die Fluoreszenzaktivität keinen exogenen Faktor. Verwendungen für GFP, die in der Literatur offenbart sind, sind weitverbreitet und beinhalten die Untersuchung von Genexpression und Proteinlokalisation (Chalfie et al., Science 263, 1994, Seiten 12501-12504), als Werkzeug zur Sichtbarmachung subzellulärer Organellen (Rizzuto et al., Curr. Biology 5, 1995, Seiten 635-642), die Sichtbarmachung von Proteintransport entlang dem sekretorischen Signalweg (Kaether und Gerdes, FFBS Letters 369, 1995, Seiten 267-271), die Expression in Pflanzenzellen (Hu und Cheng, FEBS Letters 369, 1995, Seiten 331-334) und Drosophila-Embryonen (Davis et al., Dev. Biology 170, 1995, Seiten 726-729) und als Reportermolekül, das an ein anderes interessierendes Protein fusioniert ist (US-PS 5,491,084). In ähnlicher Weise bezieht sich die WO 96/23898 auf Verfahren zum Nachweis biologischer aktiver Substanzen, die intrazelluläre Vorgänge beeinträchtigen, unter Verwendung eines GFP-Konstrukts, welches eine Proteinkinase- Aktivierungsstelle beinhaltet. Die WO 97/20931 stellt ein Verfahren zur Identifizierung einer einzelnen Zielstelle in einem höheren eukaryotischen Genom unter Verwendung eines einfach fluoreszenzmarkierten regulatorischen Faktors bereit.
  • Zahlreiche Referenzen beziehen sich auf GFP-Proteine in biologischen Systemen. Die WO 96/09598 beschreibt z. B. ein System zur Isolierung interessierender Zellen unter Verwendung der Expression eines GFP-ähnlichen Proteins. Die WO 96/27675 beschreibt die Expression von GFP in Pflanzen. Die WO 95/21191 beschreibt die Expression von modifiziertem GFP-Protein in transformierten Organismen zum Nachweis von Mutagenese. Die US-PSen 5,401,629 und 5,436,128 beschreiben Tests und Zusammensetzungen zum Nachweis und zur Auswertung der intrazellulären Transduktion eines extrazellulären Signals unter Verwendung rekombinanter Zellen, die Zelloberflächenrezeptoren exprimieren und Reporter-Genkonstrukte enthalten, die transkriptionelle regulatorische Elemente beinhalten, welche auf die Aktivität von Zelloberflächenrezeptoren reagieren.
  • Die Durchführung eines Screens vieler Tausende von Verbindungen erfordert die parallele Handhabung und Verarbeitung vieler Verbindungen und Testreagenzien. Standard- Hochdurchsatz-Screens ("HTS") verwenden Gemische von Verbindungen und biologischen Reagenzien zusammen mit einer Indikatorverbindung, die in Anordnungen von Vertiefungen in Standard-Mikrotiterplatten mit 96 oder 384 Vertiefungen geladen sind. Das aus jeder Vertiefung gemessene Signal, entweder Fluoreszenzemission, optische Dichte oder Radioaktivität integriert das Signal des vollständigen Materials in der Vertiefung, wodurch man einen Gesamt-Populationsdurchschnitt aller Moleküle in der Vertiefung erhält.
  • Science Applications International Corporation ((SAIC), 130 Fifth Avenue, Seattle, WA 98109) beschreibt ein Bildgebungs-Plattenlesegerät. Dieses System verwendet eine CCD- Kamera, um ein Bild des gesamten Bereichs einer 96-Loch-Platte anzufertigen. Das Bild wird analysiert, um die Gesamtfluoreszenz pro Vertiefung für das gesamte Material in der Vertiefung zu berechnen.
  • Molecular Devices, Inc. (Sunnyvale, CA) beschreibt ein System (FLIPR), welches zur Verminderung des Hintergrunds bei der Sichtbarmachung von Zell-Einschichten eine Laserraster-Beleuchtung mit geringem Winkel ("low angle laser scanning illumination") und eine Maske zur selektiven Anregung von Fluoreszenz in einem Bereich von etwa 200 Mikron vom Boden der Vertiefungen in Standard-96-Loch-Platten verwendet. Dieses System verwendet eine CCD-Kamera, um ein Bild des gesamten Bereichs des Bodens der Platte anzufertigen. Obwohl dieses System Signale misst, die von einer Zell-Einschicht am Boden der Vertiefung abstammen, wird das gemessene Signal über dem Bereich der Vertiefung gemittelt und daher noch als Messung der Durchschnittsantwort einer Population von Zellen angesehen. Das Bild wird analysiert, um die Gesamtfluoreszenz pro Vertiefung für zellbasierte Tests zu berechnen. Vorrichtungen zum Flüssigkeitstransport wurden ebenfalls in zellbasierte Screening-Systeme mitaufgenommen, wie das FLIPR-System, um eine Antwort zu initiieren, die dann mit einem Makro-Bildgebungs-System als die Durchschnittsreaktion einer gesamten Vertiefungs-Population beobachtet wird.
  • Im Gegensatz zu Screens mit hohem Durchsatz wurden verschiedene Screens mit hohem Informationsgehalt ("HCS") entwickelt, um dem Bedürfnis nach detaillierter Information über die zeitlich-räumliche Dynamik von Zellbestandteilen und Vorgängen entgegenzukommen. Screens mit hohem Informationsgehalt automatisieren die Extraktion von Multicolor- Fluoreszenzinformation, die von spezifischen auf Fluoreszenz basierenden Reagenzien abgeleitet ist, die in Zellen aufgenommen wurden (Giuliano und Taylor, 1995, Curr Op. Cell. Biol. 7:4, Giuliano et al., 1995, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24:405). Die Zellen werden mit einem optischen System analysiert, welches sowohl räumliche als auch zeitliche Dynamik messen kann (Farkas et al., 1993, Ann. Rev. Physiol. 55:785; Giuliano et al., 1990, in Optical Microscopy for Biology, B. Herman und K. Jacobson (Hrsg.), Seiten 543-557, Wiley-Liss, New York; Hahn et al., 1992, Nature 359:736; Waggoner et al., 1996, Hum. Pathol. 27:494). Das Konzept besteht darin, jede Zelle als eine "Vertiefung" zu behandeln, welche auf den Aktivitäten der markierten Bestandteile räumliche und zeitliche Information besitzt.
  • Die Arten an biochemischer und molekularer Information, die jetzt über auf Fluoreszenz basierende Reagenzien zugänglich sind, die auf Zellen angewandt werden, beinhalten Ionenkonzentrationen, Membranpotential, spezifische Translokationen, Enzymaktivitäten, Genexpression als auch die Anwesenheit, Menge und Muster von Metaboliten, Proteinen, Lipiden, Kohlenhydraten und Nukleinsäuresequenzen (DeBasio et al., 1996, Mol. Biol. Cell 7:1259; Giuliano et al., 1995, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Sctruct. 24:405; Heim und Tsien, 1996, Curr. Biol. 6:178).
  • Screens mit hohem Informationsgehalt können entweder auf fixierten Zellen mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern, biologischen Liganden und/oder Nukleinsäure- Hybridisierungssonden oder mit lebenden Zellen mit Multicolor-Fluoreszenzindikatoren und "Biosensoren" durchgeführt werden. Die Wahl von Screens fixierter oder lebender Zellen hängt von dem spezifisch benötigten zellbasierten Test ab.
  • Tests mit fixierten Zellen sind am einfachsten, da eine Anordnung anfänglich lebender Zellen in einem Mikrotiterplatten-Format mit verschiedenen zu testenden Verbindungen und Dosierungen behandelt werden kann, dann können die Zellen fixiert, mit spezifischen Reagenzien markiert und gemessen werden. Nach der Fixierung muss die Umgebung der Zellen nicht kontrolliert werden. Räumliche Information wird erhalten, aber nur zu einem Zeitpunkt. Die Verfügbarkeit tausender Antikörper, Liganden und Nukleinsäure- Hybridisierungssonden, die auf die Zellen angewandt werden können, macht dies zu einem attraktiven Ansatz für viele Arten von zellbasierten Screens. Die Fixierungs- und Markierungsschritte können automatisiert werden, wodurch eine wirksame Verarbeitung der Tests ermöglicht wird.
  • Tests mit lebenden Zellen sind anspruchsvoller und aussagekräftiger, da eine Anordnung von lebenden Zellen, die die erwünschten Reagenzien enthält, sowohl über die Zeit als auch über den Raum gescreent werden kann. Während der Messung ist eine Umgebungskontrolle der Zellen (Temperatur, Feuchtigkeit und Kohlendioxid) erforderlich, da die physiologische Gesundheit der Zellen für multiple Fluoreszenzmessungen über die Zeit aufrechterhalten werden muss. Es gibt eine wachsende Liste fluoreszierender physiologischer Indikatoren und "Biosensoren", welche Veränderungen biochemischer und molekularer Aktivitäten innerhalb von Zellen anzeigen kann (Giuliano et al., 1995, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24:405; Hahn et al., 1993, in Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity, W. T. Mason (Hrsg.), Seiten 349-359, Academic Press, San Diego).
  • Die Zugänglichkeit und Verwendung von auf Fluoreszenz basierenden Reagenzien hat dazu beigetragen, die Entwicklung von Screens mit hohem Informationsgehalt sowohl mit fixierten als auch mit lebenden Zellen voranzutreiben. Fortschritte bei der Instrumentarisierung zur automatischen Extraktion von Multicolor-Information mit hohem Gehalt hat es kürzlich möglich gemacht, HCS zu einem automatisierten Werkzeug zu machen. Ein Artikel von Taylor et al. (American Scientist 80, 1992, Seiten 322-335) beschreibt viele dieser Verfahren und deren Anwendungen. Proffitt et al. (Cytometry 24:204-213, 1996) beschreiben z. B. ein semi-automatisiertes Fluoreszenz-Digital-Bildgebungs-System zur Quantifizierung relativer Zellzahlen in situ in einer Vielzahl von Gewebekultur-Plattenformaten, insbesondere von 96- Loch-Mikrotiterplatten. Dieses System besteht aus einem Epifluoreszenz- Inversionsmikroskop mit einem elektrisch angetriebenen Gestell, einer Videokamera, einem Bildverstärker und einem Computer mit einem PC-Vision-Diditalisierer. Turbo-Pascal- Software kontrolliert das Gestell und scannt die Platte, wobei pro Vertiefung multiple Bilder aufgenommen werden. Die Software berechnet die Gesamtfluoreszenz pro Vertiefung, stellt die tägliche Kalibrierung bereit und lässt sich für eine Vielzahl von Gewebekultur- Plattenformate leicht konfigurieren. Die Schwellenbestimmung von digitalen Bildern und Reagenzien, die nur fluoreszieren, wenn sie von lebenden Zellen aufgenommen werden, werden dazu verwendet, Hintergrundfluoreszenz ohne die Entfernung von überschüssigem fluoreszierendem Reagenz zu vermindern.
  • Raster-konfokale Mikroskop-Bildgebung ("scanning confocal microscope imaging") (Go et al., 1997, Analytical Biochemistry 247:210-215; Goldman et al., 1995, Experimental Cell Research 221:311-319) und Multiphoton-Mikroskop-Bildgebung (Denk et al., 1990, Science 248:73; Gratton et al., 1994, Proc. of the Microscopical Society of America, Seiten 154-155) sind ebenfalls gut etablierte Verfahren, um hochauflösende Bilder von Mikroskop-Proben zu erhalten. Der hauptsächliche Vorteil dieser optischen Systeme besteht in der sehr schmalen Fokustiefe, die ermöglicht, dass Eigenschaften von beschränktem axialem Ausmaß gegenüber dem Hintergrund aufgelöst werden. Es ist z. B. möglich, interne cytoplasmatische Eigenschaften adhärenter Zellen von den Eigenschaften auf der Zelloberfläche zu trennen. Da Raster-Multiphoton-Bildgebung ("scanning multiphoton imaging") Lasersysteme mit sehr kurzer Pulsdauer erfordert, um den erforderlichen hohen Photonenfluss zu erreichen, kann in diesen Systemen auch die Lebenszeit der Fluoreszenz gemessen werden (Lakowicz et al., 1992, Anal. Biochem. 202:316-330; Gerrittsen et al., 1997, J. of Fluorescence 7:11-15), wodurch weitere Fähigkeit für verschiedene Nachweisarten bereitgestellt wird. Kleine, zuverlässige und relative preiswerte Lasersysteme, wie z. B. Laserdioden-Pumplaser ("laser diode pumped lasers"), sind jetzt erhältlich, um Multiphoton-konfokale Mikroskopie recht routinemäßiger Art anzuwenden.
  • Eine Kombination aus biologischer Heterogenität von Zellen in Populationen (Bright et al., 1989, J. Cell. Physiol. 141:410; Giuliano, 1996, Cell Motil. Cytoskel. 35:237) als auch die hohe räumliche und zeitliche Frequenz chemischer und molarer Information, die innerhalb von Zellen anwesend ist, macht es unmöglich, Information von hohem Gehalt aus Zellpopulationen mit existierenden Gesamt-Mikrotiterplatten-Lesegeräten zu extrahieren. Für Multicolor-, fluoreszenzbasierende Screens mit Zellen, die einzeln analysiert werden, wurde keine Screening-Plattform mit hohem Gehalt entworfen. In ähnlicher Weise ist gegenwärtig kein Verfahren erhältlich, welches automatischen Flüssigkeitstransport zu Anordnungen von Zellen zum Zweck des systematischen Screening von Verbindungen hinsichtlich der Fähigkeit kombiniert, eine zelluläre Antwort zu induzieren, die durch HCS-Analyse identifiziert wird, insbesondere von Zellen, die in Mikrotiterplatten kultiviert wurden. Weiterhin existiert im Stand der Technik kein Verfahren, das Vertiefung-nach-Vertiefung-Messungen zur Identifizierung von Treffern mit hohem Durchsatz in einem Assay kombiniert, gefolgt von einer zweiten Zelle-nach-Zelle-Messung mit hohem Informationsgehalt der Vertiefungen auf der gleichen Platte, die als Treffer identifiziert wurden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Systeme, Verfahren und Screens bereit, welche Screening mit hohem Durchsatz (HTS) und Screening mit hohem Gehalt (HCS) kombinieren, die die Validierung von Zielen und die Optimierung von Kandidaten durch Kombination vieler Zell- Screening-Formate mit fluoreszenzbasierten molekularen Reagenzien und computerbasierter Eigenschafts-Extraktion, Datenanalyse und Automatisierung verbessert, was zu einer größeren Menge und Schnelligkeit der Datensammlung führt, zu verkürzten Zykluszeiten und schließlich zur schnelleren Auswertung möglicher Arzneistoff-Kandidaten. Die gegenwärtige Erfindung stellt auch Möglichkeiten zur Miniaturisierung der Verfahren bereit, wobei bei vermindertem Reagenz- und Testverbindungsvolumen, das in jedem Test erforderlich ist, ein erhöhter Durchsatz ermöglicht wird.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt vollautomatisierte Verfahren zur Messung und zur Analyse der Internalisierung von Zelloberflächen-Rezeptorproteinen während der Bildgewinnung bereit. Dieser Ansatz beinhaltet die Fluoreszenzmarkierung des interessierenden Rezeptors und die automatisierte Messung der Rezeptor-Internalisierung in stümulierten Zellen.
  • In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen bereitgestellt, die die Internalisierung von Zelloberflächen-Rezeptorproteinen induzieren oder hemmen, umfassend das Behandeln von Zellen, die ein Lumineszenz- markiertes Zelloberflächen-Rezeptorprotein besitzen, mit einer Testverbindung, das Gewinnen lumineszierender Signale aus den Zellen, das Umwandeln der lumineszierenden Signale in digitale Daten und das Verwenden der digitalen Daten zur Bestimmung, ob die Testverbindung die Internalisierung des lumineszierend markierten Zelloberflächen- Rezeptorproteins in die Zelle induziert hat, durch Messen wenigstens eines der Folgenden: (a) einer Anzahl von Objekten, von denen bestimmt wurde, dass sie gültige internalisierte Zelloberflächenrezeptoren darstellen; (b) ein Aggregatbereich der Objekte, von denen bestimmt wurde, dass sie gültige internalisierte Zelloberflächenrezeptoren darstellen; (c) eine Aggregatintensität der Objekte, von denen bestimmt wurde, dass sie gültige internalisierte Zelloberflächenrezeptoren darstellen; oder (d) eine normalisierte Aggregatintensität der Objekte, von denen bestimmt wurde, dass sie gültige internalisierte Zelloberflächenrezeptoren darstellen.
  • Es werden verschiedene bevorzugte Ausführungsformen bereitgestellt, die die verbesserte räumliche Auflösung und Quantifizierung des stimulatorischen oder inhibitorischen Effekts der Testverbindung auf die Rezeptorinternalisierung ermöglichen. In einer dieser Ausführungsformen werden die extrazellulären und intrazellulären Domänen eines membrangebundenen Rezeptorproteins jeweils mit einem unterschiedlichen Lumineszenzmarker markiert, um die Messung der relativen extrazellulären Erhältlichkeit der externen und internen Domänen der Membranrezeptoren zu ermöglichen.
  • In einem Aspekt der Erfindung werden kombinierte Verfahren mit hohem Durchsatz und hohem Gehalt bereitgestellt, um Verbindungen zu identifizieren, die die Internalisierung von Zelloberflächen-Rezeptorproteinen induzieren oder hemmen. In diesem Aspekt werden Zellen mit einem Liganden für das interessierende Rezeptorprotein behandelt, das nach Stimulierung des Rezeptorproteins ein nachweisbares Signal erzeugt. Die Zellen werden dann mit der Testverbindung behandelt und dann in einem Modus mit hohem Durchsatz gescannt, um die Zellen zu identifizieren, welches das Liganden induzierte nachweisbare Signal aufweisen. Nachfolgend werden nur die Zellen, die das nachweisbare Signal aufwiesen, in einem Modus mit hohem Gehalt gescannt, um zu bestimmen, ob die Testverbindung die Internalisierung des Lumineszenz-markierten Zelloberflächen- Rezeptorproteins in die Zelle induziert hat.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Fig. 1 zeigt ein Diagramm der Bestandteile des zellbasierten Scanning-Systems.
  • Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung des Mikroskopaufbaus.
  • Fig. 3 zeigt den Kameraaufbau.
  • Fig. 4 veranschaulicht den Vorgang des Zell-Scanning.
  • Fig. 5 veranschaulicht eine Benutzeroberfläche, die die Hauptfunktionen zur Anleitung des Benutzers zeigt.
  • Fig. 6 ist ein Diagramm der Zwei-Plattform-Architektur des "Dual Mode System" für das zellbasierte Screening, wobei eine Plattform eine Teleskoplinse verwendet, um alle Vertiefungen einer Mikrotiterplatte abzulesen, und wobei eine zweite Plattform eine Linse mit höherer Vergrößerung verwendet, um einzelne Zellen in einer Vertiefung zu lesen.
  • Fig. 7 ist ein Ausschnitt eines optischen Systems für eine Einzel-Plattform-Architektur des Dual Mode System für zellbasiertes Screening, welches eine bewegbare Teleskoplinse verwendet, um alle Vertiefungen einer Mikrotiterplatte zu erfassen, und eine bewegbare Linse mit größerer Verstärkung, um einzelne Zellen in einer Vertiefung zu erfassen.
  • Fig. 8 veranschaulicht das Flüssigkeitstransportsystem zur Gewinnung kinetischer Daten des zellbasierten Screening-Systems.
  • Fig. 9 ist ein Flussdiagramm des Prozessierungsschritts für das zellbasierte Scanning- System.
  • Fig. 10 A-J veranschaulicht die Strategie des Kern-Translokationstests.
  • Fig. 11 ist ein Flussdiagramm, das die Prozessierungsschritte in dem Dual Mode System für zellbasiertes Screening, welches das Screening von Mikrotiterplatten mit hohem Durchsatz und hohem Gehalt kombiniert, definiert.
  • Fig. 12 ist ein Flussdiagramm, welches die Prozessierungsschritte des Modus mit hohem Durchsatz des Systems für zellbasiertes Screening definiert.
  • Fig. 13 ist ein Flussdiagramm, welches die Prozessierungsschritte des Modus mit hohem Gehalt des Systems für zellbasiertes Screening definiert.
  • Fig. 14 ist ein Flussdiagramm, welches die Prozessierungsschritte definiert, die zum Erhalt kinetischer Daten im Modus mit hohem Gehalt des Systems für zellbasiertes Screening erforderlich sind.
  • Fig. 15 ist ein Flussdiagramm, welches die Prozessierungsschritte definiert, die innerhalb einer Vertiefung während der Gewinnung kinetischer Daten durchgeführt werden.
  • Fig. 16 ist ein Beispiel für Ergebnisse von einem bekannten Stimulator der Tanslokation.
  • Fig. 17 ist ein Beispiel der Daten eines bekannten Inhibitors der Translokation.
  • Fig. 18 veranschaulicht die Datendarstellung in graphischer Anzeige.
  • Fig. 19 veranschaulicht die Daten des Modus mit hohem Durchsatz des Systems für zellbasiertes Screening, ein Beispiel der Daten, die an den Modus mit hohem Gehalt weitergeleitet wurden, die Daten, die im Modus mit hohem Gehalt erhalten wurden und die Ergebnisse der Analyse der Daten.
  • Fig. 20 zeigt die Messung einer durch Arzneistoff induzierten Translokation von Cytoplasma zum Kern.
  • Fig. 21 veranschaulicht eine graphische Benutzeroberfläche der Messung, die in Fig. 20 gezeigt wird.
  • Fig. 22 veranschaulicht eine graphische Benutzeroberfläche der Messung, die in Fig. 20 gezeigt wird.
  • Fig. 23 ist ein Diagramm, das die kinetischen Daten repräsentiert, die aus den in Fig. 20 gezeigten Messungen erhalten wurden.
  • Fig. 24 veranschaulicht einen Screen mit hohem Gehalt von Arzneistoff-induzierter Apoptose.
  • Fig. 25 ist eine graphische Darstellung der Daten aus Validierungsläufen des PTHR- Internalisierungs-Screens.
  • Fig. 26 ist ein Flussdiagramm für die Signalverarbeitung.
  • Fig. 27 ist ein Flussdiagramm für einen Autofokusvorgang, der in der Signalverarbeitung verwendet werden soll.
  • Fig. 28 ist ein Flussdiagramm für einen Vorgang zur Objektverarbeitung, der in der Signalverarbeitung verwendet werden soll.
  • Fig. 29 zeigt eine repräsentative Anzeige eines PC-Bildschirms, der Daten zur Rezeptor- Internalisierung zeigt, die die Punktzählung ("spot count") einzelner Vertiefungen zeigen.
  • Fig. 30 zeigt eine repräsentative Anzeige eines PC-Bildschirms, der Daten der Rezeptor- Internalisierung zeigt, die auf einer Feld/Feld-Basis dargestellt werden.
    • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die hier verwendeten Begriffe haben die folgende spezifische Bedeutung:
  • Marker zellulärer Domänen. Lumineszierende Sonden mit hoher Affinität für spezifische zelluläre Bestandteile beinhalten spezifische Organellen oder Moleküle. Diese Sonden können entweder kleine lumineszierende Moleküle oder fluoreszenzmarkierte Makromoleküle sein, die als "Markierungsreagenzien", "Umgebungsindikatoren" oder "Biosensoren" verwendet werden.
  • Markierungsreagenzien. Markierungsreagenzien beinhalten lumineszierend markierte Makromoleküle, einschließlich Fluoreszenzprotein-Analoga und Biosensoren, lumineszierenden makromolekularen Chimären, einschließlich jenen, die mit dem grün fluoreszierenden Protein und dessen Mutanten gebildet werden, lumineszierend markierte primäre oder sekundäre Antikörper, die mit zellulären Antigenen reagieren, die an einer physiologischen Reaktion beteiligt sind, lumineszierende Färbungen, Farbstoffe und andere kleine Moleküle, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Marker zellulärer Translokationen. Lumineszierend markierte Makromoleküle oder Organellen, die während eines zellulären Vorgangs oder einer physiologischen Reaktion von einer Zelldomäne zu einer anderen wandern. Translokationsmarker können entweder einfach die Lokalisierung bezogen auf Marker zellulärer Domänen berichten oder sie können auch Biosensoren sein, welche auch einige biochemische oder molekulare Aktivität darstellen.
  • Biosensoren. Makromoleküle, die aus einer Domäne mit biologischer Funktion und einer lumineszierenden Sonde oder Sonden bestehen, welche die Veränderungen der Umgebung widerspiegeln, welche entweder in der Zelle oder auf deren Oberfläche auftreten. Eine Klasse lumineszierend markierter Makromoleküle, die dazu entworfen wurde, diese Veränderungen aufzuspüren und zu berichten, wurden als "fluoreszierende Protein- Biosensoren" bezeichnet. Der Proteinbestandteil des Biosensors stellt einen Rest mit hoch entwickelter molekularer Erkennung bereit. Ein fluoreszierendes Molekül, das an dem Proteinbestandteil in der Nähe einer aktiven Stelle angeheftet ist, übersetzt die Veränderungen der Umgebung in Fluoreszenzsignale, welche mit einem System mit einer geeigneten zeitlichen und räumlichen Auflösung, wie das Zell-Scanning-System der vorliegenden Erfindung, nachgewiesen werden. Da die Modulierung der Aktivität von nativem Protein innerhalb einer lebenden Zelle reversibel ist und da die fluoreszierenden Protein-Biosensoren so entworfen werden können, dass sie reversible Veränderungen in der Proteinaktivität aufspüren, sind diese Biosensoren im Wesentlichen wiederverwendbar.
  • Krankheits-assoziierte Sequenzen ("DAS"). Diese Bezeichnung bezieht sich auf Nukleinsäuresequenzen, die durch Standardverfahren identifiziert werden, wie primäre DNA- Sequenzdaten, genomische Verfahren wie Subtraktionshybridisierung und RADE und proteomische Verfahren in Kombination mit reverser Genetik, z. B. bei Kandidatenverbindungen für Arzneistoffe. Der Begriff bedeutet nicht, dass die Sequenz nur mit einem Krankheitszustand assoziiert ist.
  • Screening mit hohem Gehalt (HCS) kann dazu verwendet werden, die Auswirkungen von Arzneistoffen auf komplexe molekulare Ereignisse wie Signaltransduktionswege als auch auf Zellfunktionen, die Apoptose, Zellteilung, Zelladhäsion, Bewegung, Exocytose und Zell-Zell- Kommunikation beinhalten, aber nicht darauf beschränkt sind, zu messen. Vielfarbige Fluoreszenz ermöglicht es, dass zahlreiche Ziele und Zellvorgänge in einem einzigen Screen getestet werden können. Das Miteinander-in-Bezug-Setzen zellulärer Reaktionen wird eine Fülle von Informationen erzeugen, die für die Validierung des Ziels und die Leitoptimierung erforderlich sind.
  • In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, welches ein Zell-Screening-System verwendet, umfassend ein optisches Fluoreszenz-System mit hoher Vergrößerung mit einem Mikroskopobjektiv, einem Gestell XY, welches dazu geeignet ist, eine Platte mit einer Anordnung von Stellen zur Aufnahme von Zellen zu halten, und mit einer Vorrichtung zur Bewegung der Platte, um die Stellen mit dem Mikroskopobjektiv in Übereinstimmung zu bringen, und eine Vorrichtung zur Bewegung der Platte in dieser Richtung, um Fokussierung auszulösen; eine Digitalkamera; eine Lichtquelle mit einer optischen Vorrichtung zur Ausrichtung des Anregungslichts auf die Zellen in der Anordnung von Stellen und eine Vorrichtung zur Ausrichtung des von den Zellen emittierten fluoreszierenden Lichts auf die Digitalkamera; und eine Computervorrichtung zum Erhalt und zur Verarbeitung der digitalen Daten von der Digitalkamera, wobei die Computervorrichtung beinhaltet: eine Vorrichtung zum Erhalt der Bilder von der Kamera, eine Anzeige für die Wechselwirkung mit dem Verwender und zur Anzeige der Testergebnisse, digitale Trägermedien zur Datenspeicherung und Archivierung und Mittel zur Kontrolle, zum Erhalt, zur Verarbeitung und zur Anzeige der Ergebnisse.
  • Fig. 1 ist ein schematisches Diagramm einer bevorzugten Ausführungsform des Zell- Scanning-Systems. Es wird ein Inversions-Fluoreszenzmikroskop 1 verwendet, wie ein Zeiss Axiovert-Inversions-Fluoreszenzmikroskop, welches Standardlobjektive mit einer Vergrößerung von 1- bis 100-fach zur Kamera verwendet, und eine Weißlichtquelle (z. B. eine 100-W-Quecksilber-Bogenlampe oder eine 75-W-Xenonlampe) mit der Stromversorgung g. Es gibt ein XY-Gestell 3 zur Bewegung der Platte 4 in XY-Richtung über das Objektiv des Mikroskops. Eine Z-Achse-Fokusantrieb 5 bewegt das Objektiv in Z- Richtung zur Fokussierung. Es ist weiterhin ein Joystick 6 vorhanden, zur manuellen Bewegung des Gestells in der XYZ-Richtung. Eine Digitalkamera 7 mit hoher Auflösung erstellt Bilder von jeder Vertiefung oder Stelle auf der Platte. Es gibt eine Stromquelle 8 für die Kamera, eine Automatisierungskontrolleinheit 9 und eine zentrale Verarbeitungseinheit 10. Der PC 11 stellt eine Anzeige 12 bereit und besitzt assoziierte Software. Über den Drucker 13 kann eine Hardcopy ausgedruckt werden.
  • Fig. 2 ist eine schematische Darstellung einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mikroskopaufbaus 1, die das XY-Gestell 3, den Z-Achsen-Fokusantrieb 5, den Joystick 6, die Lichtquelle 2 und die Automatisierungskontrolleinheit 9 genauer zeigt. Es werden Kabel zu dem Computer 15 bzw. dem Mikroskop 16 bereitgestellt. Zusätzlich zeigt Fig. 2 eine 96- Loch-Mikrotiterplatte 17, welche auf dem XY-Gestell 3 in XY-Richtung bewegt wird. Licht der Lichtquelle 2 tritt durch den PC-kontrollierten Verschluss 18 auf ein motorgetriebenes Filterrad 19 mit den Anregungsfiltern 20. Das Licht tritt in den Filterwürfel 25, der einen dichromatischen Spiegel 26 und einen Emissionsfilter 27 aufweist. Anregungslicht reflektiert von dem dichromatischen Spiegel in die Vertiefungen in der Mikrotiterplatte 17 und fluoreszierendes Licht 28 tritt durch den dichromatischen Spiegel 26 und den Emissionsfilter 27 und durch die Digitalkamera 7 hindurch.
  • Fig. 3 zeigt eine schematische Zeichnung eines bevorzugten Kameraaufbaus. Die Digitalkamera 7, die einen automatischen Verschluss zur Kontrolle und eine Stromzufuhr 31 aufweist, erhält fluoreszierendes Licht 28 vom Mikroskopaufbau. Ein digitales Kabel 30 leitet digitale Signale an den Computer weiter.
  • Die vorstehend beschriebenen standardmäßigen optischen Konfigurationen verwenden Mikroskopoptik zur direkten Erzeugung eines vergrößerten Bilds der Probe auf dem Kamerasensor, um ein Bild mit hoher Auflösung der Probe einzufangen. Dieses optische System wird im Allgemeinen als "Breitfeld"-Mikroskopie bezeichnet. Fachleute auf dem Gebiet der Mikroskopie wissen, dass ein Bild der Probe mit hoher Auflösung durch eine Vielzahl anderer optischer Systeme erzeugt werden kann, die den standardmäßigen Raster- konfokalen Nachweis eines fokussierten Punkts oder einer Linie der Erhellung beinhalten, die über die Probe gescannt wird (Go et al., 1997, supra) und die Multiphotonen-Raster- konfokale Mikroskopie (Denk et al., 1990, supra) einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind, die beide auf einem CCD-Detektor Bilder darstellen können oder durch synchrone Digitalisierung der analogen Ergebnisse einer Photoverstärkerröhre.
  • In Screening-Anwendung ist es häufig nötig, eine bestimmte Zelllinie oder eine primäre Zellkultur zu verwenden, um aus den bestimmten Eigenschaften jener Zellen Vorteile zu ziehen. Fachleute auf dem Gebiet der Zellkultur wissen, dass einige Zelllinien kontaktinhibiert sind, was bedeutet, das sie das Wachstum einstellen, wenn sie von anderen Zellen umgeben sind, während andere Zelllinien unter jenen Bedingungen weiterwachsen und sich im wahrsten Sinne des Wortes auftürmen und dabei viele Schichten bilden. Ein Beispiel einer solchen Zelllinie ist die HEK 293- (ATCC CRL-1573) Linie. Für die Verwendung mit Zelllinien, die dazu tendieren, mehrere Schichten zu bilden, ist ein optisches System nötig, welches Bilder von Einzelzellschichten in vielschichtigen Präparationen darstellen kann. Die große Tiefenschärfe von Breitfeld-Mikroskopen erzeugt ein Bild, welches einer Projektion durch die vielen Schichten von Zellen darstellt, was die Analyse subzellulärer räumlicher Verteilungen in schichtbildenden Zellen extrem schwer macht. Alternativ dazu ermöglicht die sehr geringe Tiefenschärfe, die mit einem konfokalen Mikroskop erreicht werden kann (etwa 1 Mikron) die Unterscheidung einer Einzelzellschicht bei hoher Auflösung, wodurch die Bestimmung der subzellulären räumlichen Verteilung erleichtert wird. In ähnlicher Weise ist die konfokale Bildgebung zu bevorzugen, wenn Nachweisarten wie die Darstellung von Fluoreszenz-Lebenszeit erforderlich sind.
  • Der Output eines standardmäßigen konfokalen Bildgebungs-Aufsatzes für ein Mikroskop ist ein digitales Bild, welches in das gleiche Format umgewandelt werden kann wie die Bilder, die durch die vorstehend beschriebenen anderen Zell-Screnning-System- Ausführungsformen erzeugt werden, und kann deshalb auf genau die gleiche Weise wie jene Bilder verarbeitet werden. Die Gesamt-Kontrolle, die Datengewinnung und die Analyse in dieser Ausführungsform ist im Wesentlichen die gleiche. Die optische Anordnung des konfokalen Mikroskopsystems ist mit der Ausnahme des Illuminators und der Detektoren im Wesentlichen dieselbe wie vorstehend beschrieben. Für die konfokale Mikroskopie erforderliche Systeme zur Erleuchtung und zum Nachweis wurden als Zubehör entwickelt, welches an standardmäßige mikroskopoptische Systeme angeheftet werden kann wie jene der vorliegenden Erfindung (Zeiss, Deutschland). Diese alternativen optischen Systeme können daher in das vorstehend beschriebene System leicht integriert werden.
  • Fig. 4 veranschaulicht eine alternative Ausführungsform der Erfindung, in der Zellanordnungen in Mikrovertiefungen 40 auf einer Mikrotiterplatte 41 vorliegen, die in der US-PS 6,103,479 beschrieben sind. Typischerweise ist die Mikroplatte 20 · 30 mm, verglichen zu einer Standard-96-Loch-Mikrotiterplatte, die 86 · 129 mm groß ist. Die Anordnung von Zellen auf einer Mikroplatte mit höherer Dichte ermöglicht es, dass die Mikroplatte bei niedriger Auflösung von wenigen Mikrons pro Pixel für einen hohen Durchsatz bildlich verarbeitet werden kann und bestimmte Stellen auf der Mikroplatte können bei einer höheren Auflösung von weniger als 0,5 Mikrons pro Pixel bildlich verarbeitet werden. Diese beiden Auflösungsarten helfen dabei, den Gesamtdurchsatz des Systems zu verbessern.
  • Die Mikroplattenkammer 42 dient als ein Mikroflüssigkeitstransportsystem für die Zugabe von Verbindungen zu Zellen. Die Mikroplatte 41 in der Mikroplattenkammer 42 wird in ein XY-Mikroplatten-Lesegerät 43 gestellt. Die digitalen Daten werden wie vorstehend beschrieben verarbeitet. Die geringe Größe dieses Mikroplattensystems erhöht den Durchsatz, vermindert das Reagenzvolumen und ermöglicht die Kontrolle der Verteilung und der Platzierung von Zellen für eine schnelle und genaue zellbasierte Analyse. Verarbeitete Daten können auf einem PC-Schirm 11 dargestellt werden und in eine Bioinformatik- Datenbank 44 eingespeist werden. Diese Datenbank ermöglicht nicht nur die Speicherung und die Gewinnung von Daten, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurden, sondern ermöglicht auch die Gewinnung und Speicherung externer Daten, die sich auf Zellen beziehen. Fig. 5 ist ein PC-Bildschirm, der die Wirkweise der Software veranschaulicht.
  • In einer alternativen Ausführungsform wird ein System mit hohem Durchsatz (HTS) direkt mit dem HCS entweder auf der gleichen Plattform oder auf zwei verschiedenen Plattformen, die elektronisch, d. h. über ein lokales Netzwerk verbunden sind, gekoppelt. Dieses System, welches als "Dual Mode"-optisches System bezeichnet wird, besitzt den Vorteil der Steigerung des Durchsatzes eines HCS durch dessen Kopplung mit einem HTS, wodurch eine langsamere Datengewinnung mit hoher Auflösung und Analyse nur in einer kleinen Zahl von Vertiefungen nötig wird, die eine Reaktion in der gekoppelten HTS zeigen.
  • Im Stand der Technik sind Lesesysteme mit hohem Durchsatz für vollständige Platten bekannt und werden gewöhnlich als Bestandteile eines HTS-Systems verwendet, welches dazu verwendet wird, große Anzahlen von Verbindungen zu screenen (Beggs, 1997, J. of Biomolec. Screening 2:71-78; Macaffrey et al., 1996, JJ Biomolec. Screening 1:187-190).
  • In einer Ausführungsform des "Dual Mode"-zellbasierten Screenings wird eine Architektur mit zwei Plattformen bereitgestellt, in der die Datengewinnung mit hohem Durchsatz auf einer Plattform und die Datengewinnung mit hohem Gehalt auf einer zweiten Plattform stattfindet (Fig. 6). Die Verarbeitung läuft auf jeder Plattform unabhängig ab, wobei die Ergebnisse über eine Netzwerkkarte laufen oder eine einzelne Kontrolleinheit wird dazu verwendet, die Ergebnisse beider Plattformen zu verarbeiten.
  • Wie in Fig. 6 veranschaulicht, besteht ein beispielhaftes optisches System aus zwei lichtoptischen Instrumenten, einer Plattform mit hohem Durchsatz 60 und einer Plattform mit hohem Gehalt 65, die fluoreszierende Signale ablesen, die von Zellen emittiert werden, die in Mikrotiterplatten oder Mikrovertiefungsanordnungen auf einer Mikroplatte kultiviert werden und die über eine elektronische Verbindung 64 miteinander kommunizieren. Die Plattform mit hohem Durchsatz 60 analysiert alle Vertiefungen in der gesamten Platte entweder auf parallel oder schnelle serielle Art. Fachleute wissen, dass es viele solche käuflich erhältliche Lesesysteme mit hohem Durchsatz gibt, die in ein zellbasiertes Screening-System integriert werden können (Topcount (Packard Instruments, Meriden, CT); Spectramax, Lumiskan (Molecular Devices, Sunnyvale, CA); Fluoroscan (Labsystems, Beverly, MA)). Die Plattform mit hohem Gehalt 65 scannt von Vertiefung zu Vertiefung und gewinnt und analysiert Bilddaten mit hoher Auflösung, die von individuellen Zellen innerhalb einer Vertiefung gewonnen wurden.
  • Die im Systemcomputer 62 befindliche HTS-Software kontrolliert das Instrument mit hohem Durchsatz und die Ergebnisse werden auf dem Monitor 61 dargestellt. Die im Computersystem 67 befindliche HCS-Software kontrolliert die Instrumenten-Hardware 65 für den hohen Gehalt, optionale Vorrichtungen (z. B. Platten-Beladungsgerät, Umgebungskammer, Flüssigkeitsverteiler), analysiert die digitalen Bilddaten von der Platte, stellt Ergebnisse auf dem Monitor 66 bereit und verwaltet Daten, die in einer integrierten Datenbank gemessen werden. Die beiden Systeme können sich auch einen einzelnen Computer teilen, in welchem Fall alle Daten auf diesem Computer gesammelt, verarbeitet und angezeigt würden, ohne ein lokales Netzwerk für den Transfer der Daten zu benötigen. Mikrotiterplatten werden vom System mit hohem Durchsatz zum System mit hohem Gehalt 63 entweder manuell oder durch eine bekannte (Beggs, 1997, supra; Mcaffrey, 1996, supra) Roboter-Plattentransfervorrichtung transferiert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform verwendet das "Dual Mode"-optische System ein einzelnes Plattformsystem (Fig. 7). Es besteht aus zwei getrennten optischen Modulen, einem HCS-Modul 203 und einem HTS-Modul 209, die unabhängig oder gemeinsam bewegt werden können, so dass zu einem Zeitpunkt nur eines davon dazu verwendet wird, Daten von der Mikrotiterplatte 201 zu gewinnen. Die Mikrotiterplatte 201 wird auf ein motorisiertes X,Y-Gestell montiert, so dass sie zur Bildgebung entweder im HTS- oder HCS-Modus positioniert werden kann. Nach der Gewinnung und der Analysierung der HTS-Bilddaten, wie nachstehend beschrieben, wird das HTS-optische Modul 209 aus dem optischen Weg entfernt und das HCS-optische Modul 203 wird an die richtige Position bewegt.
  • Das optische Modul für HTS 209 besteht aus einer Projektionslinse 214, einem Anregungswellenlängenfilter 213 und einem doppelbrechenden Spiegel 210, die dazu verwendet werden, den gesamten Boden der Platte mit einer spezifischen Wellenlängenbande eines herkömmlichen Mikroskoplampensystems (nicht gezeigt) zu beleuchten. Die Fluoreszenzemission wird durch den dichromatischen Spiegel 210 und den Emissionswellenlängenfilter 211 durch eine Linse 212 gebündelt, die ein Bild auf der Kamera 216 mit dem Sensor 215 erzeugt.
  • Das optische Modul für HCS 203 besteht aus einer Projektionslinse 208, einem Anregungswellenlängenfilter 207 und einem doppelbrechenden Spiegel 204, die dazu verwendet werden, die hintere Apertur des Mikroskopobjektivs 202 zu erhellen und dadurch das Feld des Objektivs eines standardmäßigen Mikroskopbeleuchtungssystems (nicht gezeigt). Die Fluoreszenzemission wird durch das Mikroskopobjektiv 202 gesammelt, tritt durch den doppelbrechenden Spiegel 204 und den Emissionswellenlängenfilter 204 und wird durch eine Röhrenlinse 206 gebündelt, die ein Bild auf der gleichen Kamera 216 mit dem Sensor 215 erzeugt.
  • In einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Zell- Screening-System weiter eine Vorrichtung zum Flüssigkeitstransport zur Verwendung mit der Ausführungsform der lebenden Zellen des Verfahrens des Zell-Screenings (siehe nachstehend). Fig. 8 stellt beispielhaft eine Flüssigkeitstransportvorrichtung zur Verwendung mit dem erfindungsgemäßen System dar. Sie besteht aus einer Bank von 12 Spritzenpumpen 701, die durch einen einzelnen Motor angetrieben werden. Die Größe jeder Spritze 702 hängt vom Volumen ab, das in jede Vertiefung transportiert werden soll, typischerweise zwischen 1 und 100 ul. Jede Spritze ist über flexible Schläuche 703 mit einer ähnlichen Bank von Konnektoren verbunden, welche Standard-Pipettenspitzen 705 verwenden. Die Bank von Pipettenspitzen ist an ein Antriebssystem angeheftet, so dass sie relativ zur Mikrotiterplatte 706 heruntergelassen und angehoben werden können, um in jede Vertiefung Flüssigkeit zu transportieren. Die Platte wird auf XY-Gestell aufgebracht, wodurch zum Zwecke der Datengewinnung eine Bewegung relativ zum optischen System 707 ermöglicht wird. Dieser Aufbau ermöglicht es, dass ein Satz von Pipettenspitzen oder sogar eine einzelne Pipettenspitze Reagenz in alle Vertiefungen der Platte transportiert. Die Bank von Spritzenpumpen kann dazu verwendet werden, gleichzeitig Flüssigkeit in 12 Vertiefungen zu transportieren oder in weniger Vertiefungen nach Entfernung einiger Spitzen.
  • In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Analyse von Zellen bereit, umfassend die Bereitstellung einer Anordnung von Zellen, die multiple Zellen enthalten, wobei die Zellen eines oder mehrere fluoreszierende Reportermoleküle enthalten; das Scanning multipler Zellen an jeder der Stellen, die Zellen enthalten, um fluoreszierende Signale der fluoreszierenden Reportermoleküle in den Zellen zu erhalten; das Umwandeln der fluoreszierenden Signale in digitale Daten; und die Verwendung der digitalen Daten zur Bestimmung der Verteilung, der Umgebung oder der Aktivität der fluoreszierenden Reportermoleküle innerhalb der Zellen.
    • Zellanordnungen
  • Das Screening einer großen Anzahl von Verbindung hinsichtlich der Aktivität im Hinblick auf eine bestimmte biologische Funktion erfordert die Herstellung von Anordnungen von Zellen für die parallele Handhabung von Zellen und Reagenzien. Standardmäßige 96-Loch- Mikrotiterplatten mit einer Größe von 86 · 129 mm, mit Vertiefungen mit 6 mm Durchmesser auf einem 9-mm-Feld, werden zur Kompatibilität mit gegenwärtigen automatisierten Beladungs- und Roboter-Handhabungssystemen verwendet. Die Mikroplatte ist typischerweise 20 · 30 mm groß, mit Zell-Lokalisationen mit einer Dimension von 100-200 Mikron auf einem Träger von etwa 500 Mikron. Verfahren zur Herstellung von Mikroplatten werden in der US-PS 6,103,479 beschrieben. Mikroplatten können aus co-planaren Schichten von Materialien bestehen, an die sich Zellen anheften, die mit Materialien durchgemustert sind, an die sich die Zellen nicht anheften werden, oder eingeritzte dreidimensionale Oberflächen ähnlich gemusterter Materialien. Zum Zwecke der folgenden Diskussion beziehen sich die Begriffe "Vertiefung" und "Mikrovertiefung" auf eine Position in einer Anordnung irgendeiner Konstruktion, an die sich Zellen anheften und innerhalb derer die Zellen bildlich verarbeitet werden. Mikroplatten können ebenfalls in den Räumen zwischen den Vertiefungen Flüssigkeitstransportkanäle beinhalten. Das kleinere Format einer Mikroplatte erhöht die Gesamteffizienz des Systems durch Minimierung der Mengen der Reagenzien, der Lagerung und der Handhabung während der Präparation und der Gesamtbewegung, die für den Scanning-Vorgang erforderlich ist. Zusätzlich kann der gesamte Bereich der Mikroplatte wirksamer bildhaft verarbeitet werden, wodurch, wie nachstehend in diesem Dokument beschrieben, für das Mikroplattenlesegerät eine zweite Wirkweise ermöglicht wird.
    • Fluoreszenz-Reportermoleküle
  • Ein Hauptbestandteil des neuen Arzneistofferkennungs-Paradigmas ist eine kontinuierlich wachsende Familie fluoreszierender und lumineszierender Reagenzien, die dazu verwendet werden, die zeitliche und räumliche Verteilung, den Gehalt und die Aktivität intrazellulärer Ionen, Metaboliten, Makromolekülen und Organellen zu messen. Klassen dieser Reagenzien beinhalten Markierungsreagenzien, welche die Verteilung und die Menge an Molekülen in lebenden und fixierten Zellen messen, Umgebungsindikatoren, die zeitlich und räumlich Signalübertragungsereignisse dokumentieren und fluoreszierende Protein-Biosensoren zur Messung von molekularen Aktivitäten eines Zielmoleküls innerhalb lebender Zellen. Ein Multiparameter-Ansatz, der in einer einzelnen Zelle verschiedene Reagenzien kombiniert, ist ein starkes neues Werkzeug für die Arzneistofferkennung.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren basiert auf der hohen Affinität von fluoreszierenden oder lumineszierenden Molekülen für spezifische zelluläre Bestandteile. Die Affinität für spezifische Bestandteile wird durch physikalische Kräfte wie Ioneninteraktionen, kovalente Brückenbindung (dies beinhaltet chimere Fusion mit proteinbasierten Chromophoren, Fluorophoren und Lumiphoren) sowie durch hydrophobe Wechselwirkungen, elektrisches Potential und in einigen Fällen Einschluss innerhalb eines zellulären Bestandteils gesteuert. Die lumineszierenden Sonden können kleine Moleküle, markierte Makromoleküle oder genetisch veränderte Proteine sein, welche grün fluoreszierende Protein-Chimären einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind.
  • Fachleute kennen eine große Vielzahl fluoreszierender Reportermoleküle, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, die fluoreszierend markierte Biomoleküle wie Proteine, Phospholipide und DNA-Hybridisierungssonden einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind. In ähnlicher Weise wurden fluoreszierende Reagenzien, die spezifisch mit bestimmten chemischen Bindungs- oder Assoziierungseigenschaften synthetisiert wurden, als fluoreszierende Reportermoleküle verwendet (Barak et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:27497-27500; Southwick et al., 1990, Cytometry 11:418-430; Tsien, 1989, in Methods in Cell Biology, Bd. 29, Taylor und Wang (Hrsg.), Seiten 127-156). Fluoreszierend markierte Antikörper sind besonders nützliche Reportermoleküle aufgrund ihrer hohen Spezifität zur Anheftung an ein einzelnes molekulares Ziel in einem so komplexen Molekülgemisch wie einer Zelle oder einem Gewebe.
  • Die lumineszierenden Sonden können innerhalb der lebenden Zelle synthetisiert werden oder können in die Zelle durch einige nicht-mechanische Arten, einschließlich Diffusion, erleichtertem oder aktivem Transport, Signalsequenz-vermitteltem Transport und endocytotischer oder pinocytotischer Aufnahme, transportiert werden. Mechanisch Massen- Beladungsverfahren, die gut bekannt sind, können ebenfalls dazu verwendet werden, lumineszierende Sonden in lebende Zellen zu transportieren (Barber et al., 1996, Neuroscience Letters 207:17-20; Bright et al., 1996, Cytometry 24:226-233; McNeil, 1989, in Methods in Cell Biology, Bd. 29, Taylor und Wang (Hrsg.), Seiten 153-173). Diese Verfahren beinhalten Elektroporation und andere mechanische Verfahren wie Beladung durch Abschaben, Beladung durch Kügelchen, Beladung durch Beschuss, Beladung durch Spritzen, hypertonisches und hypotonisches Beladen. Zusätzlich können Zellen genetisch verändert werden, um Reportermoleküle wie GFP zu exprimieren, das wie vorstehend beschrieben an ein interessierendes Protein gekoppelt ist (Chalfie und Prasher, US-PS 5,491,084; Cubitt et al., 1995, Trends in Biochemical Science 20:448-455).
  • Sobald die lumineszierenden Sonden in der Zelle sind, lagern sie sich als Ergebnis von spezifischen Wechselwirkungen mit hoher Affinität mit der Zieldomäne oder aufgrund anderer Arten der molekularen Zielausrichtung wie Signalsequenz-vermitteltem Transport an ihrer Zieldomäne an. Fluoreszierend markierte Reportermoleküle sind nützlich zur Bestimmung der Lokalisation, der Menge und der chemischen Umgebung des Reporters. Es kann z. B. bestimmt werden, ob sich der Reporter in einer lipophilen Membranumgebung oder in einer mehr wässrigen Umgebung befindet (Giuliano et al., 1995, Ann. Rev. of Biophysics and Biomolecular Structure 24:405-434; Giuliano und Taylor, 1995, Methods in Neuroscience 27:1-16). Die pH-Umgebung des Reporters kann bestimmt werden (Bright et al., 1989, J. Cell Biology 104:1019-1033; Giuliano et al., 1987, Anal. Biochem. 167:362-371; Thomas et al., 1979, Biochemistry 18:2210&supmin;²²18). Es kann bestimmt werden, ob ein Reporter mit einer chelatbildenden Gruppe an ein Ion wie Calcium&spplus;&spplus; gebunden ist oder nicht (Bright et al., 1989, in Methods in Cell Biology, Bd. 30, Taylor und Wang (Hrsg.), Seiten 157- 192; Shimoura et al., 1988, J. of Biochemistry (Tokio), 251:405-410; Tsien, 1989, in Methods in Cell Biology, Bd. 30, Taylor und Wang (Hrsg.), Seiten 127-156).
  • Weiterhin können bestimmte Zelltypen innerhalb eines Organismus Bestandteile enthalten, die spezifisch markiert sind, die in anderen Zelltypen nicht vorkommen. So enthalten z. B. Epithelialzellen häufig polarisierte Membranbestandteile. Das bedeutet, diese Zellen verteilen Makromoleküle asymmetrisch entlang ihrer Plasmamembran. Bindegewebe- oder Stützgewebezellen enthalten häufig Granula, welche Moleküle enthalten, die für diesen Zweck spezifisch sind (z. B. Heparin, Histamin, Serotonin, usw.). Die meisten muskulären Gewebezellen enthalten ein sarcoplasmatisches Retikulum, eine spezialisierte Organelle, deren Funktion darin besteht, die Konzentration von Calciumionen innerhalb des Zellcytoplasmas zu regulieren. Viele Nervengewebezellen enthalten sekretorische Granula und Vesikel, in denen sich Neurohormone oder Neurotransmitter befinden. Deshalb können fluoreszierende Moleküle so entwickelt werden, dass sie nicht nur spezifische Bestandteile innerhalb spezifischer Zellen markieren, sondern auch spezifische Zellen innerhalb einer Population gemischter Zelltypen.
  • Fachleute kennen eine große Vielzahl von Arten, Fluoreszenz zu messen. Einige Fluoreszenz-Reportermoleküle weisen z. B. eine Veränderung der Anregungs- oder Emissionsspektren auf, einige zeigen Resonanz-Energietransfer, wobei ein fluoreszierender Reporter Fluoreszenz verliert, während ein zweiter an Fluoreszenz gewinnt, einige zeigen einen Verlust (Unterdrückung) oder ein Auftreten der Fluoreszenz, während andere eine Rotationsbewegung zeigen (Giuliano et al., 1995, Ann. Rev. of Biophysics and Biomol. Structure 24:405-434; Giulian et al., 1995, Methods in Neuroscienca 27:1-16).
    • Scanning von Zellanordnungen
  • Unter Bezug auf Fig. 9 wird eine bevorzugte Ausführungsform zur Analyse von Zellen bereitgestellt, die bedienergesteuerte Parameter umfasst, die auf der Basis des durchgeführten Tests ausgewählt werden, Datengewinnung durch das Zell-Screening- System hinsichtlich der Verteilung fluoreszierender Signale innerhalb einer Probe und einen interaktiven Datenüberblick und eine Analyse. Zu Beginn eines automatisierten Scan- Vorgangs gibt der Bediener die Information 100 ein, welche die Probe beschreibt, spezifiziert die Filtereinstellung und die Fluoreszenzkanäle, um die verwendeten biologischen Marker und die gesuchte Information in Übereinstimmung zu bringen, und passt dann die Kameraeinstellungen an, um mit der Helligkeit der Probe übereinzustimmen. Zum Zwecke der Flexibilität zur Handhabung eines Probenbereichs ermöglicht die Software die Auswahl verschiedener Parametereinstellungen, die dazu verwendet werden, Kerne und Cytoplasma zu identifizieren und die Auswahl verschiedener Fluoreszenzreagenzien, die Identifizierung von interessierenden Zellen basierend auf der Morphologie oder der Helligkeit, und die pro Vertiefung zu analysierende Zellzahl. Diese Parameter werden in der Datenbank des Systems gespeichert, um für jeden automatisierten Lauf leicht erhältlich zu sein. Die interaktive Zellidentifizierung des Systems vereinfacht die Auswahl morphologischer Parametergrenzen wie der Bereich der Größe, der Form und der Intensität der zu analysierenden Zellen. Der Bediener spezifiziert, welche Vertiefungen der Platte durch das System gescannt werden und wie viele Felder oder wie viele Zellen innerhalb jeder Vertiefung analysiert werden sollen. In Abhängigkeit des Setups, welches vom Bediener in Schritt 101 ausgewählt wird, prä-fokussiert das System entweder automatisch den Bereich der Platte, der gescannt werden soll, mit einem Autofokusvorgang, um den Fokus der Platte 102 zu finden, oder der Bediener prä-fokussiert 103 interaktiv den zu scannenden Bereich durch Auswahl dreier Markierungspunkte, die den rechteckigen Bereich definieren, der gescannt werden soll. Ein "focal plane model" mit einer Anpassung der kleinsten Annäherung wird dann aus diesen Begrenzungspunkten berechnet, um den Fokus jeder Vertiefung während eines automatisierten Scan-Vorgangs abzuschätzen. Der Fokus jeder Vertiefung wird durch Interpolieren des "focal plane models" während eines Scan-Vorgangs abgeschätzt.
  • Während eines automatisierten Scan-Vorgangs zeigt die Software dynamisch den Status des Scans, einschließlich der analysierten Zellen, der gegenwärtig analysierten Vertiefung, Bilder jeder unabhängigen Wellenlänge und das Ergebnis des Screens für jede Vertiefung in dem Moment, in dem es bestimmt wird. Die Platte 4 (Fig. 1) wird in serpentinenförmiger Weise gescannt, wenn die Software das motorisierte Mikroskop-XY-Gestell von Vertiefung zu Vertiefung und von Feld zu Feld innerhalb jeder Vertiefung einer 96-Loch-Platte automatisch bewegt. Fachleute auf dem Gebiet der Programmierung können die Software für das Scanning anderer Mikroplattenformate, wie z. B. 24-, 48- und 384-Loch-Platten, anpassen. Scan-Muster der gesamten Platte sowie das Scan-Muster der Felder innerhalb jeder Vertiefung sind programmiert. Das System passt den Probenfokus innerhalb eines Autofokusvorgangs 104 (Fig. 9) durch den Z-Achsen-Fokusantrieb 5 an, kontrolliert die Filterauswahl über ein motorisiertes Filterrad 19 und erhält und analysiert Bilder von bis zu vier verschiedenen Farben ("Kanäle" oder "Wellenlängen").
  • Der Autofokusvorgang wird in einer durch den Bediener ausgewählten Frequenz durchgeführt, typischerweise für das erste Feld in jeder Vertiefung und dann einmal alle 4 bis 5 Felder innerhalb jeder Vertiefung. Der Autofokusvorgang berechnet den Startpunkt der Z-Achse durch Interpolieren aus dem vorberechneten plane focal model. Startet man eine programmierbare Distanz oberhalb oder unterhalb dieses Sollwerts, dann bewegt der Vorgang die mechanische Z-Achse durch eine Zahl verschiedener Positionen, gewinnt ein Bild an jeder Position und findet das Maximum eines berechneten Fokuswerts, der den Kontrast jedes Bilds abschätzt. Die Z-Position des Bilds mit dem größten Fokuswert bestimmt den besten Fokus für ein bestimmtes Feld. Fachleute auf diesem Gebiet erkennen dies als eine Variante automatisierter Autofokus-Algorithmen, wie beschrieben in Harms et al. in Cytometry 5, 1984, 236-243, Groen et al. in Cytometry 6, 1985, 81-91 und Firestone et al. in Cytometry 12, 1991, 195-206.
  • Zur Bildgewinnung wird die Expositionszeit der Kamera getrennt für jeden Farbstoff angepasst, um von jedem Kanal ein Bild mit hoher Qualität zu gewährleisten. Je nach Wahl des Bedieners können Software-Vorgänge verwendet werden, um Registrierungsschwankungen zwischen Wellenlängen zu korrigieren, bevor man weitere Messungen macht. Der elektronische Verschluss 18 wird kontrolliert, so dass eine Ausbleichung der Sonde auf ein Minimum gebracht wird. Hintergrundschatten und ungleichmäßige Ausleuchtung können durch die Software anhand bekannter Verfahren korrigiert werden (Bright et al., 1987, J. Cell Biol. 104:1019-1033).
  • In einem Kanal werden Bilder eines primären Markers 105 (Fig. 9) (typischerweise Zellkerne, die mit DAPI- oder PI-Fluoreszenzfarbstoffen gegengefärbt werden) erhalten, die mit einer adaptiven Schwellenprozedur segmentiert (identifiziert) werden. Die adaptive Schwellenprozedur 106 wird dazu verwendet, dynamisch die Schwelle eines Bilds zur Trennung der Zellen vom Hintergrund auszuwählen. Die Färbung von Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen kann über die Zellen in einer Mikrotiterplattenprobe sowie innerhalb von Bildern eines Felds von Zellen innerhalb jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte zu einem unbekannten Ausmaß variieren. Diese Variation kann als Ergebnis der Probenpräparation und/oder der dynamischen Art der Zellen auftreten. Eine globale Schwelle wird für das gesamte Bild berechnet, um die Zellen vom Hintergrund zu trennen und um Feld-zu-Feld- Variationen auszugleichen. Diese globalen adaptiven Techniken sind Varianten der im Stand der Technik beschriebenen Verfahren (Kittler et al. in Computer Vision, Graphics, and Image Processing 30, 1985, 125-147; Ridler et al. in IEEE Trans. Systems, Man, and Cybernetics, 1978, 630-632).
  • Ein alternatives Verfahren zur adaptiven Schwellenwertbildung verwendet Schwellenwertbildung in lokalen Bereichen im Vergleich zur Schwellenwertbildung über das gesamte Bild. Die Bildanalyse lokaler Bereiche führt zu einer besseren Gesamtsegmentation, da die Färbung der Zellkerne (sowie anderer markierter Bestandteile) über ein Bild variieren kann. Unter Verwendung dieser globalen, lokalen Prozedur wird ein Bild mit verminderter Auflösung (Größenverkleinerung um einen Faktor von 2 bis 4) zuerst global segmentiert (unter Verwendung adaptiver Schwellenbildung), um interessierende Bereiche in dem Bild zu finden. Diese Bereiche können dann als Anzeichen dafür dienen, die gleichen Bereiche mit voller Auflösung vollständiger zu analysieren. Für jeden interessierenden Bereich wird dann eine lokalisiertere Schwelle (wieder durch adaptive Schwellenbildung) berechnet.
  • Der "Output" des Segmentationsverfahrens ist ein binäres Bild, in dem die Bereiche weiß und der Hintergrund schwarz sind. Dieses binäre Bild, welches im Stand der Technik auch Maske genannt wird, wird dazu verwendet, zu bestimmen, ob das Feld Objekte 107 enthält. Die Maske wird mit einem Klumpen ("blob")-Markierungsalgorithmus markiert, wobei jedes Objekt (oder Klumpen) eine einzelne Nummer zugeordnet bekommt. Morphologische Eigenschaften wie Fläche und Größe der Blasen werden dazu verwendet, Blasen, die eher Zellen sind, von jenen zu differenzieren, welche als Artefakte betrachtet werden. Der Bediener gibt die morphologischen Selektionskriterien entweder durch Eingabe bekannter zellmorphologischer Eigenschaften oder durch Verwendung des interaktiven Trainingswerkzeugs ein. Wenn interessierende Objekte in dem Feld gefunden werden, dann werden Bilder für alle anderen aktiven Kanäle 108 erhalten, ansonsten wird das Gestell zu dem nächsten Feld 109 in der aktuellen Vertiefung weiter transportiert. Jedes interessierende Objekt wird für die weitere Analyse 110 in dem Bild lokalisiert. Die Software bestimmt, ob das Objekt die Kriterien für einen gültigen Zellnukleus 111 aufweisen, durch Messen der morphologischen Eigenschaften (Größe und Form). Für jede gültige Zelle wird die Lokalisation des XYZ-Gestells gespeichert, ein kleines Bild der Zelle wird gespeichert und die Eigenschaften werden gemessen 112.
  • Das Zell-Scanning-Verfahren der vorliegenden Erfindung kann dazu verwendet werden, mit zellulären Proben viele verschiedene Tests durchzuführen, durch gleichzeitige Anwendung einer Anzahl analytischer Verfahren zur Messung von Eigenschaften bei multiplen Wellenlängen. Ein Beispiel eines solchen Tests stellt die folgenden Messungen bereit:
  • 1. Die vollständige Fluoreszenzintensität innerhalb des Zellkerns für die Farben 1-4
  • 2. Der Bereich des Zellkerns für die Farbe 1 (der primäre Marker)
  • 3. Die Form des Zellkerns für Farbe 1 wird durch drei Formeigenschaften beschrieben:
  • a) Bereich des Umfangs im Quadrat
  • b) Verhältnis des Kästchenbereichs
  • c) Verhältnis von Länge zu Breite
  • 4. Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität innerhalb des Zellkerns für die Farben 1-4 (d. h. #1 geteilt durch #2)
  • 5. Die vollständige Fluoreszenzintensität eines Rings außerhalb des Kerns (vgl. Fig. 10), die die Fluoreszenz des Cytoplasmas der Zelle darstellt (cytoplasmatische Maske) für die Farben 2-4
  • 6. Der Bereich der cytoplasmatischen Maske
  • 7. Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität der cytoplasmatischen Maske für die Farben 2-4 (d. h. #5 geteilt durch #6)
  • 8. Das Verhältnis der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität der cytoplasmatischen Maske zur durchschnittlichen Fluoreszenzintensität innerhalb des Zellkerns für die Farben 2-4 (d. h. 7 geteilt durch #4)
  • 9. Die Differenz der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität der cytoplasmatischen Maske und die durchschnittliche Fluoreszenzintensität innerhalb des Zellkerns für die Farben 2-4 (d. h. #7 minus #4)
  • 10. Die Anzahl fluoreszierender Domänen (auch als Tupfen, Punkte oder Körnchen bezeichnet) innerhalb des Zellkerns für die Farben 2-4
  • Die Eigenschaften 1 bis 4 sind allgemeine Eigenschaften der verschiedenen Zell-Screening- Tests der Erfindung. Diese Schritte werden gewöhnlich in einer Vielzahl von Bildanalyseanwendungen verwendet und sind im Stand der Technik bekannt (Russ, 1992, The Image Processing Handbook, CRC Press Inc.; Gonzales et al., 1987, Digital Image Processing, Addison-Wesley Publishing Co., Seiten 391-448). Die Eigenschaften 5 bis 9 wurden spezifisch entwickelt, um Messungen der fluoreszierenden Moleküle einer Zelle innerhalb des lokalen cytoplasmatischen Bereichs der Zelle und die Translokation (d. h. Bewegung) fluoreszierender Moleküle vom Cytoplasma in den Nukleus bereitzustellen. Diese Eigenschaften (Schritte 5 bis 9) werden dazu verwendet, Zellen in Mikroplatten hinsichtlich der Hemmung der Kern-Translokation zu analysieren. Die Hemmung der Kern- Translokation von Transkriptionsfaktoren stellt z. B. einen neuen Ansatz für das Screening intakter Zellen bereit (ausführliche Beispiele von anderen Screens werden nachstehend bereitgestellt). Ein spezifischer Algorithmus misst die Menge an Sonde im Kernbereich (Eigenschaft 4) gegenüber der lokalen cytoplasmatischen Region (Eigenschaft 7) jeder Zelle. Die Quantifizierung des Unterschieds zwischen diesen beiden subzellulären Kompartimenten stellt ein Maß der Translokation von Cytoplasma in den Kern dar (Eigenschaft 9).
  • Eigenschaft 10 beschreibt einen Screen, der dazu verwendet wird, DNA- oder RNA-Sonden innerhalb der Kernbereiche in den Farben 2-4 zu zählen. Sonden sind z. B. zur Identifizierung Chromosomen-spezifischer DNA-Sequenzen kommerziell erhältlich (Life Technologies, Gaithersburg, MD; Genosys, Woodlands, TX; Biotechnologies, Inc., Richmond, CA; Bio 101, Inc., Vista, CA). Zellen sind dreidimensional und bei der Untersuchung unter dem Mikroskop bei einer starken Vergrößerung kann eine Probe im Fokus liegen, während eine andere vollständig außerhalb des Fokus liegt. Das erfindungsgemäße Verfahren zum Zell-Screening stellt ein Verfahren zum Nachweis dreidimensionaler Proben in Kernen bereit, durch Gewinnung von Bildern von multiplen fokalen Ebenen. Die Software bewegt den motorischen Z-Achsen-Antrieb 5 (Fig. 1) in kleinen Schritten, wobei die Schrittdistanz durch den Benutzer ausgewählt wird, um einem großen Bereich verschiedener Kern-Duchmesser gerecht zu werden. In jedem fokalen Schritt wird ein Bild erhalten. Die maximale Graustufenintensität jedes Pixels in jedem Bild wird ermittelt und in einem resultierenden maximalen Projektionsbild gespeichert. Das maximale Projektionsbild wird dann dazu verwendet, die Proben zu zählen. Der vorstehend genannte Algorithmus funktioniert gut bei der Zählung von Proben, die nicht direkt über oder unter einer anderen gestapelt ist. Um Proben gerecht zu werden, die auf anderen Proben in der Z-Richtung gestapelt sind, können Bediener eine Option auswählen, bei der Proben in jeder der erhaltenen fokalen Ebene analysiert werden. Auf diese Weise führt das Scanning-System den maximalen Ebenen- Projektionsalgorithmus durch, entdeckt in diesem Bild interessierende Probenbereiche und analysiert diese Bereiche dann in allen fokalen Ebenen weiter.
  • Nach der Messung der Zelleigenschaften 112 (Fig. 9) überprüft das System, ob im gegenwärtigen Feld 113 noch unverarbeitete Objekte vorhanden sind. Wenn unverarbeitete Objekte vorhanden sind, lokalisiert es das nächste Objekt 110 und bestimmt, ob es die Kriterien für einen gültigen Zellkern 111 aufweist und misst seine Eigenschaften. Sobald alle Objekte im gegenwärtigen Feld verarbeitet sind, bestimmt das System, ob die Analyse der gegenwärtigen Platte vollständig ist 114; wenn nicht, bestimmt es die Notwendigkeit, mehr Zellen in der gegenwärtigen Vertiefung 115 zu finden. Wenn der Bedarf besteht, dann schiebt das System das XYZ-Gestell zum nächsten Feld innerhalb der aktuellen Vertiefung 109 oder schiebt das Gestell zur nächsten Vertiefung 116 der Platte.
  • Nachdem ein Platten-Scan abgeschlossen ist, können die Bilder und die Daten mit den Einrichtungen des Systems zum Bildüberblick, zur Datenansicht und zur Gesamtübersicht durchgegangen werden. Alle Bilder, Daten und Einstellungen eines Scans werden in der Datenbank des Systems archiviert, um später überprüft oder mit einem Netzwerk- Informationsmanagement-System ausgetauscht zu werden. Die Daten können ebenfalls in andere statistische Programme zur tabellarischen Darstellung der Ergebnisse und zur Erzeugung anderer Daten exportiert werden. Mit einem interaktiven Bildbearbeitungsprogramm 117 kann der Bediener die Bilder jeder einzelnen Zelle, die vom System analysiert wurde, anschauen. Der Benützer kann Daten auf einer Zell-zu-Zell-Basis mit einer Kombination aus interaktiven Diagrammen, einem Datenblatt gemessener Eigenschaften und Bilder aller Fluoreszenzkanäle einer interessierenden Zelle in der Übersicht 118 anschauen. Es werden Möglichkeiten für das graphische Plotting bereitgestellt, wobei die Daten über interaktive Diagramme wie Histogramme und Streuplots analysiert werden können. Anhand einer interaktiven Vertiefung pro-Vertiefung- Datendarstellungsprozedur 119 kann der Bediener zusammenfassende Daten, die für alle Zellen innerhalb jeder Vertiefung einer Platte akkumuliert und zusammengefasst werden, überblicksweise anschauen. Die Diagramme und Bilder können auf einem großen Bereich von Standarddruckern ausgedruckt werden.
  • Als Endphase eines vollständigen Scan-Vorgangs können Berichte über eine oder mehrere Statistiken der gemessenen Eigenschaften erzeugt werden. Mit einem interaktiven Vorgang zur Erzeugung von Berichten 120 können Benützer einen graphischen Bericht von Daten zusammengefasst auf einer Vertiefung pro-Vertiefung-Basis für den gescannten Bereich der Platte erzeugen. Dieser Bericht beinhaltet eine Zusammenfassung der Statistik pro Vertiefung in Tabellen- und graphischem Format und Identifizierungsinformation über die Probe. Über das Berichtfenster kann der Bediener Kommentare über den Scan zur späteren Nutzung eingeben. Es können über viele Statistiken multiple Berichte erzeugt und durch einen Knopfdruck ausgedruckt werden. Vor dem Ausdruck können die Berichte hinsichtlich der Positionierung und der Daten in der Vorschau gesehen werden.
  • Die vorstehend genannte Ausführungsform des Verfahrens arbeitet in einem einzelnen Modus mit hoher Auflösung, der als Modus mit hohem Gehalt (HCS) bezeichnet wird. Der HCS-Modus stellt eine ausreichende räumliche Auflösung innerhalb einer Vertiefung (in der Größenordnung von 1 um) bereit, um die Verteilung von Material innerhalb der Vertiefung sowie innerhalb einzelner Zellen in der Vertiefung zu definieren. Der hohe Grad an Informationsgehalt, der auf diese Weise erreichbar ist, geht zu Lasten der Schnelligkeit und der Komplexität der erforderlichen Signalverarbeitung.
  • In einer alternativen Ausführungsform wird ein System mit hohem Durchsatz (HTS) direkt mit dem HCS entweder auf der gleichen Plattform verbunden oder auf zwei getrennten Plattformen, die elektronisch (z. B. über ein lokales Netzwerk) verbunden sind. Diese Ausführungsform der Erfindung, die als "Dual mode"-optisches System bezeichnet wird, weist den Vorteil auf, den Durchsatz eines HCS durch dessen Kopplung mit einem HTS zu erhöhen. Somit ist eine langsamere Datengewinnung mit höherer Auflösung und eine Analyse nur in einer kleinen Gruppe von Vertiefungen notwendig, die in der gekoppelten HTS eine Reaktion zeigen.
  • Lesesysteme für gesamte Platten mit hohem Durchsatz sind im Stand der Technik gut bekannt und werden gewöhnlich als Bestandteil eines HTS-Systems dazu verwendet, große Anzahlen von Verbindungen zu screenen (Beggs et al., 1997, supra; McCaffrey et al., 1996, supra). Die HTS der vorliegenden Erfindung wird auf der Mikrotiterplatte oder der Mikrovertiefungsanordnung durchgeführt, indem viele oder alle Vertiefungen in der Platte gleichzeitig mit ausreichender Auflösung gelesen werden, um Bestimmungen auf einer Basis von Vertiefung pro Vertiefung zu machen. Dies bedeutet, Berechnungen werden durchgeführt, indem ein Durchschnittswert von vielen oder allen Zellen oder der Masse des Materials in jeder Vertiefung ermittelt wird. Vertiefungen, die im HTS eine definierte Antwort aufweisen (die Treffer), werden durch das System gekennzeichnet. Dann wird auf der gleichen Mikrotiterplatte oder der gleichen Mikrovertiefungsanordnung jede Vertiefung, die als Treffer identifiziert wurde, wie vorstehend beschrieben über HCS gemessen. Somit beinhaltet der Prozess des dualen Modus:
  • 1. Schnelles Messen zahlreicher Vertiefungen einer Mikrotiterplatte oder einer Mikrovertiefungsanordnung,
  • 2. Interpretation der Daten zur Bestimmung der Gesamtaktivität fluoreszierend markierter Reportermoleküle in der Zelle auf einer Basis von Vertiefung pro Vertiefung zur Identifizierung von "Treffern" (Vertiefungen, die eine definierte Reaktion aufweisen),
  • 3. Bildverarbeitung zahlreicher Zellen in jeder "Treffer"-Vertiefung, und
  • 4. Interpretation des digitalen Bilds zur Bestimmung der Verteilung, der Umgebung oder der Aktivität der fluoreszierend markierten Reportermoleküle in den einzelnen Zellen (d. h. intrazelluläre Messungen) und der Verteilung der Zellen zum Test für spezifische biologische Funktionen
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Verarbeitung im dualen Modus (Fig. 11) gibt der Bediener am Beginn eines Laufs 301 Information 302 ein, die die Platte und ihre Bestandteile beschreibt, spezifiziert die Filtereinstellungen und die Fluoreszenzkanäle, um mit den verwendeten biologischen Markierungen übereinzustimmen, die gewünschte Information und bring die Kameraeinstellungen mit der Probenhelligkeit in Einklang. Diese Parameter werden in der Datenbank des Systems gespeichert, um für jeden automatisierten Lauf leicht erhältlich zu sein. Die Mikrotiterplatte oder die Mikrovertiefungsanordnung wird in das Zell-Screening-System 303 entweder manuell oder automatisch durch Kontrolle eines Roboter-Beladungsgeräts geladen. Zur Aufrechterhaltung der Temperatur, der Feuchtigkeit und der. Kohlendioxidkonzentrationen in der Luft, die die lebenden Zellen in den Mikrotiterplatten oder in der Mikrovertiefungsanordnung umgibt, wird eine optionale Umgebungskammer 304 durch das System kontrolliert. Zur Verteilung von Flüssigkeiten in die Vertiefungen während des Scans kontrolliert das System weiterhin eine optionale Flüssigkeitstransportvorrichtung 305 (vgl. Fig. 8).
  • Verarbeitung mit hohem Durchsatz 306 wird zunächst auf der Mikrotiterplatte oder der Mikrovertiefungsanordnung durch Gewinnung und Analyse des Signals jeder der Vertiefungen in der Platte durchgeführt. Die Verarbeitung, die im Modus mit hohem Durchsatz 307 durchgeführt wird, wird in Fig. 12 veranschaulicht und nachstehend beschrieben. Vertiefungen, welche in diesem Modus mit hohem Durchsatz eine ausgewählte Intensität der Antwort aufweisen (Treffer), werden durch das System identifiziert. Das System führt eine konditionelle Operation 308 durch, welche hinsichtlich Treffern testet. Wenn Treffer gefunden werden, dann werden jene Vertiefungen mit den spezifischen Treffern weiterhin in einem Modus mit hohem Gehalt (Mikrolevel) 309 weiter analysiert. Die Verarbeitung, die im Modus mit hohem Gehalt 312 durchgeführt wird, ist in Fig. 13 veranschaulicht. Das System aktualisiert dann 310 die Informatikdatenbank 311 mit Ergebnissen der Messungen auf der Platte. Wenn weitere Platten 313 analysiert werden sollen, lädt das System die nächste Platte 303; wenn nicht, dann endet die Analyse der Platten 314.
  • Die nachstehende Diskussion beschreibt den in Fig. 12 veranschaulichten Modus des hohen Durchsatzes. Die bevorzugte Ausführungsform dieses Systems, das Screening- System im dualen Modus auf einer einzelnen Plattform, wird beschrieben. Fachleute wissen, dass bei dem System mit zwei Plattformen eher die Platte zwischen zwei optischen Systemen als das optische System bewegt wird. Sobald das System aufgebaut wurde und die Platte beladen wurde, beginnt das System mit der HTS-Gewinnung und der Analyse 401. Das optische HTS-Modul wird durch Kontrolle eines motorisierten optischen Positonierungsgeräts 402 auf dem System im dualen Modus ausgewählt. In einem Fluoreszenzkanal werden Daten von einem primären Marker auf der Platte erhalten 403 und anhand einer Maskierungsprozedur 404 werden Vertiefungen vom Plattenhintergrund isoliert. Bilder werden auch in anderen verwendeten Fluoreszenzkanälen 405 gewonnen. Der Bereich in jedem Bild entsprechend jeder Vertiefung 406 wird gemessen 407. Eine Eigenschaft, die aus den Messungen einer spezifischen Vertiefung berechnet wird, wird mit einer vordefinierten Schwelle oder Intensitätsreaktion 408 verglichen und basierend auf dem Ergebnis wird die Vertiefung entweder als Treffer 409 oder nicht gekennzeichnet. Die Position der Vertiefungen, die als Treffer gekennzeichnet sind, werden für die nachfolgende Verarbeitung im Modus mit hohem Gehalt gespeichert. Wenn noch Vertiefungen übrig bleiben, die verarbeitet werden sollen 410, dann geht das Programm zurück 406, bis alle Vertiefungen verarbeitet wurden 411 und das System beendet den Modus mit hohem Durchsatz.
  • Nach der HTS-Analyse beginnt das System mit der Verarbeitung im Modus mit hohem Gehalt 501, der in Fig. 13 definiert ist. Das System wählt das optische HCS-Modul 502 durch Kontrolle des motorisierten Positionierungssystems aus. Für jede Treffer-Vertiefung, die im Modus mit hohem Durchsatz identifiziert wurde, wird auf die XY-Gestellposition der Vertiefung aus dem Speicher oder einer Diskette zurückgegriffen und das Gestell wird dann zur ausgewählten Gestellposition 503 bewegt. Der Autofokusvorgang 504 wird für das erste Feld in jeder Treffer-Vertiefung und dann alle 5-8 Felder innerhallb jeder Vertiefung einmal wieder durchgeführt. In einem Kanal werden Bilder des primären Markers 505 gewonnen (typischerweise Zellkerne, die mit DAPI-, Hoechst- oder PI-Fluoreszenzfarbstoff gegengefärbt wurden). Die Bilder werden dann mit einer adaptiven Schwellenprozedur 506 segmentiert (in Bereiche von Kern und Nicht-Kern aufgeteilt). Das Ergebnis des Segmentationsverfahrens ist eine binäre Maske, auf der die Objekte weiß und der Hintergrund schwarz sind. Dieses binäre Bild, welches im Stand der Technik auch als Maske bezeichnet wird, wird dazu verwendet, zu bestimmen, ob das Feld Objekte 507 enthält. Die Maske wird mit einem Blob-Markierungsalgorithmus markiert, wobei jedes Objekt (oder blob) eine eigene zugewiesene Nummer besitzt. Wenn im Feld Objekte gefunden werden, werden Bilder für alle anderen aktiven Kanäle 508 gewonnen, wenn nicht, wandert das Gestell weiter zum nächsten Feld 514 in der gegenwärtigen Vertiefung. Für die weitere Analyse 509 wird jedes Objekt im Bild lokalisiert. Morphologische Eigenschaften wie Bereich und Form der Objekte werden dazu verwendet, Objekte auszuwählen, die wahrscheinlich Zellkerne 510 sind, und jene, die als Artefakte eingeschätzt werden, zu verwerfen (d. h. nicht weiter zu verarbeiten). Für jeden gültigen Zellkern wird die Position des XYZ-Gestells aufgezeichnet, ein kleines Bild der Zelle wird gespeichert und die testspezifischen Eigenschaften 511 werden gemessen. Das System führt dann mit den Zellen verschiedene Tests durch, indem verschiedene analytische Verfahren angewandt werden, um Eigenschaften bei jeder der verschiedenen Wellenlängen zu messen. Nach Messung der Zelleigenschaften überprüft das System, ob im aktuellen Feld 512 unverarbeitete Objekte vorhanden sind. Wenn diese vorhanden sind, lokalisiert es das nächste Objekt 509 und bestimmt, ob des den Kriterien für einen gültigen Zellkern 510 gerecht wird und misst seine Eigenschaften. Nach Verarbeitung aller Objekte im aktuellen Feld bestimmt das System, ob es in der aktuellen Vertiefung 513 mehr Zellen oder Felder finden muss. Wenn dies nötig ist, dann bewegt das System das XYZ-Gestell zum nächsten Feld innerhalb der gegenwärtigen Vertiefung 515. Wenn nicht, dann überprüft das System, ob noch weitere Treffer-Vertiefungen 515 gemessen werden müssen. Wenn ja, dann schreitet das System zur Vertiefung 503 mit dem nächsten Treffer weiter und durchläuft einen weiteren Zyklus der Datengewinnung und der Analyse, ansonsten wird der HCS-Modus 516 beendet.
  • In einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum kinetischen Screening lebender Zellen bereitgestellt. Die zuvor beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung werden dazu verwendet, die räumliche Verteilung zellulärer Bestandteile zu einem bestimmten Zeitpunkt, dem Zeitpunkt der chemischen Fixierung, zu charakterisieren. Als solche haben diese Ausführungsformen nur beschränkte Anwendbarkeit zur Implementierung von Screens, die auf Kinetik basieren, aufgrund der sequenziellen Art der Bildgewinnung und der Menge an Zeit, die erforderlich ist, um alle Vertiefungen auf einer Platte zu lesen. Da z. B. zum Lesen aller Vertiefungen 30-60 Minuten erforderlich sein können, können durch einfache Präparation einer Platte lebender Zellen und nachfolgendem mehrmaligen Lesen aller Vertiefungen nur sehr langsame kinetische Vorgänge gemessen werden. Schnellere kinetische Vorgänge können gemessen werden, indem jede Vertiefung mehrfach gelesen wird, bevor man zur nächsten Vertiefung fortschreitet, aber die verstrichene Zeit zwischen der ersten und der letzten Vertiefung wäre zu lang, und schnelle kinetische Prozesse wären wahrscheinlich zu Ende, bevor man die letzte Vertiefung erreicht.
  • Die Erweiterung der Erfindung zur Erfassung der Kinetik lebender Zellen ermöglicht den Aufbau und die Verwendung von Screens, durch die ein biologischer Vorgang anstelle von oder zusätzlich zu räumlichen Charakteristika durch seine Kinetik charakterisiert wird. In vielen Fällen kann eine Reaktion in lebenden Zellen dadurch gemessen werden, dass ein Reagenz zu einer spezifischen Vertiefung zugegeben wird und in geeigneten Zeiträumen multiple Messungen von dieser Zelle genommen werden. Diese Ausführungsform der Erfindung einer dynamischen lebenden Zelle beinhaltet daher eine Vorrichtung zum Flüssigkeitstransport in einzelne Vertiefungen des Systems, um in jede Vertiefung zu einem spezifischen Zeitpunkt vor dem Lesevorgang der Vertiefung Reagenzien zu transportieren. Diese Ausführungsform ermöglicht daher kinetische Messungen mit einer zeitlichen Auflösung von Sekunden bis Minuten auf jeder Vertiefung der Platte. Zur Verbesserung der Gesamteffizienz des Systems dynamischer lebender Zellen wird das Kontrollprogramm zur Gewinnung von Daten modifiziert, um eine repetitive Datengewinnung von Unterbereichen der Platte zu ermöglichen, wodurch das System zwischen den Zeitpunkten, die für eine einzelne Vertiefung nötig ist, andere Vertiefungen lesen kann.
  • Fig. 8 beschreibt ein Beispiel einer Flüssigkeitstransportvorrichtung, die mit der erfindungsgemäßen Ausführungsform für lebende Zellen verwendet werden kann und die vorstehend beschrieben wurde. Mit diesem Aufbau können über einen Satz von Pipettenspitzen 705 oder auch über eine einzelne Pipettenspitze Reagenzien in alle Vertiefungen der Platte transportiert werden. Die Bank von Spritzenpumpen 701 kann dazu verwendet werden, Flüssigkeit gleichzeitig in 12 Vertiefungen zu transportieren oder auch in weniger Vertiefungen, indem einige der Spitzen 705 entfernt werden. Die zeitliche Auflösung des Systems kann daher, ohne zu Lasten der Datengewinnung zu gehen, angepasst werden, indem die Anzahl der Spitzen und das Muster des Scannings wie folgt ausgewechselt werden. Typischerweise erfordert die Datengewinnung und die Analyse einer einzelnen Vertiefung etwa 5 Sekunden. Die Bewegung von Vertiefung zu Vertiefung unter Fokussieren in einer Vertiefung erfordert etwa 5 Sekunden, so dass die Gesamt-Zykluszeit für eine Vertiefung etwa 10 Sekunden beträgt. Wenn daher eine einzelne Pipettenspitze dazu verwendet wird, Flüssigkeit in eine einzelne Vertiefung zu transportieren, und Daten repetitiv aus dieser Vertiefung gewonnen werden, dann können dne Messungen mit einer zeitlichen Auflösung von etwa 5 Sekunden durchgeführt werden. Wenn 6 Pipettenspitzen dazu verwendet werden, Flüssigkeit gleichzeitig in 6 Vertiefungen zu transportieren, und das System repetitiv alle 6 Vertiefungen scannt, wird jeder Scan 60 Sekunden erfordern, wodurch die zeitliche Auflösung etabliert wird. Bei langsameren Vorgängen, bei denen nur alle 8 Minuten Daten gewonnen werden müssen, können Flüssigkeiten auf eine Hälfte der Platte transportiert werden, indem die Platte während der Flüssigkeitstransportphase bewegt wird. Dann kann diese Hälfte der Platte repetitiv gescannt werden. Durch Anpassung der Größe der Unterbereiche, die auf der Platte gescannt werden, kann daher die zeitliche Auflösung angepasst werden, ohne zwischen den Datengewinnungsbereichen Wartezeiten einbauen zu müssen. Da das System kontinuierlich scannt und Daten gewinnt, ist die Zeit, die nötig ist, einen kinetischen Datensatz von der Platte zu gewinnen, genau so lang wie die Zeit, die für einen einzelnen Scan der Platte erforderlich ist, multipliziert mit der Zahl der erforderlichen Zeitpunkte. Typischerweise sollte ein Zeitpunkt vor der Zugabe der Verbindungen und zwei oder drei Zeitpunkte nach der Zugabe ausreichend für Zwecke des Screenings sein.
  • Fig. 14 zeigt den Ablauf der Datengewinnung, der für kinetische Analysen verwendet wird. Der Beginn der Verarbeitung 801 ist die Konfiguration des Systems, die größtenteils identisch zur Standard-HCS-Konfiguration ist. Zusätzlich muss der Bediener Information eingeben, die spezifisch für die durchzuführende kinetische Analyse 802 ist, wie die Größe des Unterbereichs, die Anzahl der erforderlichen Zeitpunkte und die erforderliche Steigerung der Zeit. Ein Unterbereich ist eine Gruppe von Vertiefungen, die repetitiv gescannt wird, um kinetische Daten zu gewinnen. Die Größe des Unterbereiches wird angepasst, so dass das System während einer einzelnen Zeitspanne einen gesamten Unterbereich scannen kann, wodurch Wartezeiten minimiert werden. Die optimale Größe des Unterbereichs wird aus den Einstellungsparametern berechnet und wenn nötig durch den Bediener angepasst. Das System bewegt die Platte dann zum ersten Unterbereich 803 und zur ersten Vertiefung in diesem Unterbereich 804 zur Gewinnung der Prä-Stimulierungszeitpunkte (Zeit = 0). Der Ablauf der Datengewinnung, der in jeder Vertiefung durchgeführt wird, entspricht genau einem spezifischen HCS, das im kinetischen Modus läuft. Fig. 15 veranschaulicht ein Flussdiagramm für diese Verarbeitung. Alle Schritte zwischen dem Start 901 und der Rückkehr 902 sind identisch zu den in Fig. 13 beschriebenen Schritten 504 bis 514.
  • Nach der Verarbeitung jeder Vertiefung in einem Unterbereich kontrolliert das erfindungsgemäß verwendete System, ob alle Vertiefungen im Unterbereich verarbeitet wurden 806 (Fig. 14) und wandert über alle Vertiefungen, bis der gesamte Bereich verarbeitet wurde. Das System bringt die Platte dann in Position für die Flüssigkeitszugabe und kontrolliert den Flüssigkeitssystemtransport von Flüssigkeiten zum vollständigen Unterbereich 807. Hierzu können mehrere Zugaben für Unterbereiche nötig sein, die einige Reihen auf der Platte umfassen, wobei das System die Platte zwischen den Zugaben auf dem XY-Gestell bewegt. Sobald die Flüssigkeiten zugegeben wurden, bewegt sich das System zur ersten Vertiefung im Unterbereich 808, um die Datengewinnung von Zeitpunkten zu gewinnen. Daten werden von jeder Vertiefung 809 gewonnen, bevor das System durch alle Vertiefungen im Unterbereich 810 wandert. Nach jedem Durchgang durch den Unterbereich kontrolliert das System, ob alle Zeitpunkte 811 gemessen wurden, und wenn nicht, legt es eine Pause 813 ein, um, wenn nötig 812, mit dem erforderlichen Zeitschritt synchronisiert zu bleiben. Ansonsten überprüft das System zusätzliche Unterbereiche auf der Platte 814 und bewegt sich entweder zum nächsten Unterbereich 803 fort oder beendet den Vorgang 815. Somit umfasst der Modus der kinetischen Analyse die Identifizierung von Unterbereichen auf der Mikrotiterplatte oder den zu untersuchenden Mikrovertiefungen durch den Bediener, basierend auf der zu untersuchenden kinetischen Reaktion, wobei Daten innerhalb eines Unterbereichs vor der Datengewinnung in nachfolgenden Unterbereichen gewonnen werden.
    • Spezifische Screens
  • In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein durch eine Maschine lesbares Speichermedium, umfassend ein Programm, das einen Satz von Anweisungen enthält, durch die ein Zell-Screening-System Abläufe zur Definition der Verteilung und Aktivität spezifischer zellulärer Bestandteile und Vorgänge ausführt, im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein fluoreszenzoptisches System mit hoher Vergrößerung mit einem Gestell, das zum Halten von Zellen angepasst ist, und einer Vorrichtung zum Bewegen des Gestells, eine Digitalkamera, eine Lichtquelle zum Erhalt und zur Verarbeitung der digitalen Daten von der Digitalkamera und einen Computer zum Erhalt und zur Verarbeitung der digitalen Daten von der Digitalkamera in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet. In diesem Aspekt der Erfindung werden Programme verwendet, die das Zell-Screening-System anleiten, die Verteilung und Aktivität spezifischer zellulärer Bestandteile und Prozesse unter Verwendung der lumineszierenden Sonden, dem optischen bildgebenden System und der Mustererkennungs-Software der Erfindung zu definieren. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das maschinenlesbare Speichermedium Programme, die aus einem Satz von Instruktionen bestehen, durch die ein Zell-Screening-System veranlasst wird, die in den Fig. 9, 11, 12, 13, 14, 15 oder 28 dargestellten Vorgänge ausführen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird ein Programm verwendet, welches aus einem Satz von Instruktionen besteht, die dazu führen, dass ein Zell-Screening-System Vorgänge zum Nachweis der Verteilung und der Aktivität spezifischer zellulärer Bestandteile und Vorgänge ausführt. In den meisten bevorzugten Ausführungsformen beinhalten die zellulären Vorgänge die Kern-Translokation eines Proteins, zelluläre Hypertrophie, Apoptose, die Internalisierung von Transmembran- Rezeptoren und die durch Protease induzierte Translokation eines Proteins, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Die nachstehenden Beispiele dienen lediglich der Beschreibung und beschränken nicht den Schutzumfang der Erfindung, der in den beigefügten Ansprüchen definiert wird.
  • Die verschiedenen chemischen Verbindung, Reagenzien, Farbstoffe und Antikörper, auf die in den nachstehenden Beispielen Bezug genommen wird, sind käuflich von Sigma Chemical (St. Louis, MO), Molecular Probes (Eugene, OR), Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Accurate Chemical Company (Westbury, NY), Jackson Immunolabs und Clontech (Palo Alto, CA) erhältlich.
    • Beispiel 1 Automatisierter Screen für Verbindungen, die die Kerntranslokation eines DNA-Transkriptionsfakfors induzieren oder hemmen
  • An der Regulation der Transkription einiger Gene ist die Aktivierung eines Transkriptionsfaktors in Cytoplasma beteiligt, was dazu führt, dass der Faktor in den Kern transportiert wird, wo er die Transkription eines bestimmten Gens oder von Genen initiieren kann. Diese Veränderung der Verteilung eines Transkriptionsfaktors stellt die Grundlage eines Screens für ein zellbasiertes Screening-System dar, das Verbindungen nachweisen soll, welche die Transkription eines bestimmten Gens oder einer Gruppe von Genen inhibiert oder induziert. Der Screen wird im Allgemeinen beschrieben, gefolgt von einem spezifischen Beispiel.
  • Die Verteilung des Transkriptionsfaktors wird durch Markierung der Kerne mit einem DNA- spezifischen Fluorophor wie Hoechst 33423 und des Transkriptionsfaktors mit einem spezifischen fluoreszierenden Antikörper bestimmt. Nachdem auf die mit Hoechst markierten Kerne autofokussiert wird, wird bei einer 20-fachen Vergrößerung in dem zellbasierten Screening-System ein Bild der Kerne gemacht und dazu verwendet, eine Maske durch eine oder verschiedene optionale Schwellenwertverfahren, wie vorstehend beschrieben, zu erzeugen. Die morphologischen beschreibenden Faktoren der durch die Maske definierten Bereiche werden mit denen durch den Benutzer definierten Parametern verglichen, gültige Kernmasken werden identifiziert und mit dem folgenden Algorithmus dazu verwendet, Verteilungen von Transkriptionsfaktoren zu extrahieren. Jede gültige Kernmaske wird abgetragen, um eine etwas kleinere Kernregion zu definieren. Die ursprüngliche Kernmaske wird dann in zwei Schritten erweitert, um eine ringförmige Region um den Nukleus herum zu definieren, die einen cytoplasmatischen Bereich darstellt. Die durchschnittliche Antikörper- Fluoreszenz in jeder dieser zwei Bereiche wird bestimmt und der Unterschied zwischen diesen Durchschnittswerten wird als der NucCyt-Unterschied definiert. Zwei Beispiele der Bestimmung der Kern-Translokation werden nachstehend diskutiert und sind in den Fig. 10A-J veranschaulicht. Fig. 10A veranschaulicht eine nicht-stirnulierte Zelle mit einem Nukleus 200, der mit einem blauen Fluorophor markiert ist, und einem Transkriptionsfaktor im Cytoplasma 201, der mit einem grünen Fluorophor markiert ist. Fig. 10B veranschaulicht die Kernmaske 202, die durch das auf Zellen basierende Screening-System abgeleitet wurde. Fig. 10C veranschaulicht das Cytoplasma 203 der nicht-stimulierten Zelle, aufgenommen bei einer grünen Wellenlänge. Fig. 10D veranschaulicht, dass die Kernmaske 202 einmal verkleinert wurde, um eine Kern-Samplingregion 204 mit minimaler Cytoplasmaverteilung zu definieren. Die Kerngrenze 202 wird mehrere Male expandiert, um einen Ring zu bilden, welcher 2-3 Pixel breit ist, der dazu verwendet wird, die Cytoplasma- Samplingregion für die gleiche Zelle zu definieren. Fig. 10E veranschaulicht weiterhin eine Seitenansicht, die die Kern-Samplingregion 204 und die Cytoplasma-Samplingregion 205 zeigt. Unter Verwendung dieser beiden Samplingregionen können Daten hinsichtlich der Kern-Translokation automatisch durch das auf Zellen basierende Screening-System auf einer Zelle-pro-Zelle-Basis analysiert werden. Fig. 10F-J veranschaulicht die Strategie zur Bestimmung der Kern-Translokation in einer stimulierten Zelle. Fig. 10F zeigt eine stimulierte Zelle, deren Nukleus 206 mit einem blauen Fluorophor markiert ist, und eine Transkriptionsfaktor im Cytoplasma 207, der mit einem grünen Fluorophor markiert ist. Die Kernmaske 208 in Fig. 10G ist von dem auf Zellen basierenden Screening-System abgeleitet. Fig. 10H zeigt das Cytoplasma 209 einer stimulierten Zelle, das bei einer grünen Wellenlänge photographiert wurde. Fig. 101 veranschaulicht den Kern-Samplingbereich 211 und den Cytoplasma-Samplingbereich 212 der stimulierten Zelle. Fig. 10J ist eine Seitenansicht, die den Kern-Probenbereich 211 und den Cytoplasma-Probenbereich 212 zeigt.
  • Zur Validierung dieses Verfahrens als Screen wurde eine spezifische Anwendung dieses Verfahrens verwendet. Eine humane Zelllinie wurde in 96-Loch-Mikrotiterplatten ausplattiert. Einige Reihen von Vertiefungen wurden mit einem Agonisten titriert, einem bekannten Induktor eines spezifischen Kern-Transkriptionsfaktors. Die Zellen wurden dann fixiert und durch Standardverfahren mit einem Fluorescein-markierten Antikörper gegen den Transkriptionsfaktor und Hoechst 33423 gefärbt. Das zellbasierte Screening-System wurde dazu verwendet, Bilder von dieser Platte zu machen und zu analysieren. Man fand, dass der NucCyt-Unterschied stark mit der Menge an zu den Vertiefungen zugegebenem Agonisten korrelierte, wie in Fig. 16 veranschaulicht. In einem zweiten Experiment wurde ein Antagonist gegen den Rezeptor für den Agonisten in Anwesenheit von Agonist titriert, der fortschreitend die durch Agonist induzierte Translokation des Transduktionsfaktors hemmte. Man stellte fest, dass der NucCyt-Unterschied stark mit der Hemmung dieser Translokation korrelierte, wie in Fig. 17 veranschaulicht.
  • Zusätzliche Experimente haben gezeigt, dass der NucCyt-Unterschied über einen großen Bereich von Zelldichten und Reagenz-Konzentrationen konsistente Ergebnisse ergibt und daher routinemäßig dazu verwendet werden kann, Verbindungs-Bibliotheken auf spezifische Kern-Translokations-Aktivität zu sreenen. Weiterhin kann das gleiche Verfahren mit Antikörpern gegen andere Transkriptionsfaktoren oder mit GFP-Transkriptionsfaktor- Chimären in lebenden und fixierten Zellen verwendet werden, um die Effekte auf die Regulation der Transkription dieser und anderer Gene zu screenen.
  • Fig. 18 ist eine repräsentative Darstellung auf einem PC-Schirm von Daten, die gemäß Beispiel 1 erhalten wurden. In Graph 1 180 ist der Unterschied zwischen der durchschnittlichen Antikörper-Fluoreszenz in dem Kern-Samplingbereich und im Cytoplasma-Samplingbereich aufgetragen, NucCyt-Unterschied gegen Vertiefung #. In Graph 2 181 ist die durchschnittliche Fluoreszenz des Antikörpers im Kern-Samplingbereich, NP1-Durchschnitt, gegen die Vertiefung aufgetragen. In Graph 3 182 ist die durchschnittliche Antikörper-Fluoreszenz im Cytoplasma-Samplingbereich, LIP1- Durchschnitt, gegen die Vertiefung # aufgetragen. Die Software ermöglicht die Darstellung von Ergebnissen von jeder Zelle. So zeigt z. B. Fig. 18 eine Bildschirmdarstellung 183, das Kernbild 184 und das Bild des fluoreszierenden Antikörpers 185 für die Zelle #26.
  • Der NucCyt-Unterschied, auf den in Diagramm 1 180 von Fig. 18 Bezug genommen wird, ist der Unterschied zwischen der durchschnittlichen Intensität der cytoplasmatischen Sonde (fluoreszierendes Reportermolekül) und der durchschnittlichen Intensität der Kernsonde (fluoreszierendes Reportermolekül). Der in Diagramm 2 181 von Fig. 18 genannte NP1- Durchschnitt ist der Durchschnitt der Intensität des cytoplasmatischen Sonde (fluoreszierendes Reportermolekül) innerhalb des Kern-Probenbereichs. Der in Diagramm 3 182 von Fig. 18 genannte LIP1-Durchschnitt ist die durchschnittliche Sondenintensität (fluoreszierendes Reportermolekül) innerhalb des cytoplasmatischen Probenbereichs.
    • Beispiel 2 Automatisierter Screen für Verbindungen, die in Herz-Myozyten Hypertrophie induzieren oder hemmen
  • Dieses Beispiel wird zur Verfügung gestellt, um die Verwendung des automatischen Screens beispielhaft darzustellen. Die Hypertrophie in Herz-Myozyten wurde mit einer Kaskade von Veränderungen in der Genexpression in Zusammenhang gebracht und kann in der Zellkultur durch eine Veränderung der Zellgröße charakterisiert werden, die deutlich sichtbar ist bei adhärenten Zellen, die auf einem Objektträger wachsen. Anhand der folgenden Strategie wird ein Screen implementiert. Die Myozytenzelllinie QM7 (Wachtel-Muskelklon 7; ATCC CRL-1962), die in 96-Loch-Platten kultiviert wurde, kann mit verschiedenen Verbindungen behandelt und dann mit einem fluoreszierenden Antikörper gegen einen Zelloberflächenmarker und eine DNA-Markierung wie Hoechst fixiert und markiert werden. Nach Fokussierung auf die mit Hoechst markierten Kerne werden zwei Bilder gemacht, eines der mit Hoechst markierten Kerne und eines vom fluoreszierenden Antikörper. Die Kerne werden durch Schwellenwertbildung identifiziert, um eine Maske zu erstellen. Die morphologischen beschreibenden Parameter der Maske werden mit einem Satz von durch den Benutzer definierten beschreibenden Werten verglichen. Lokale Bereiche, die Zellen enthalten, werden um die Kerne herum definiert. Die Grenzwerte für Zellen in diesen Bereichen werden dann durch einen lokalen dynamischen Schwellenwertvorgang auf dem gleichen Bereich in dem Bild des fluoreszierenden Antikörpers definiert. Eine Abfolge von Verkleinerungen und Erweiterungen wird dazu verwendet, um sich berührende Zellen zu trennen, und ein zweiter Satz von morphologischen beschreibenden Faktoren wird dazu verwendet, Einzelzellen zu identifizieren. Der Bereich der einzelnen Zellen wird in Tabellenform gebracht, um die Verteilung der Zellgrößen zum Vergleich mit Größenwerten von normalen und hypertrophen Zellen zu definieren. Zusätzlich kann ein zweiter fluoreszierender Antikörper gegen ein bestimmtes zelluläres Protein, z. B. gegen eines der Hauptmuskelproteine Actin oder Myosin mitaufgenommen werden. Von diesem zweiten Antikörper können Bilder gemacht und mit den vorstehend genannten Bildern für die spätere Durchsicht gespeichert werden, um später Anomalien der Verteilung dieser Proteine in hypertrophen Zellen zu identifizieren. Es können auch Algorithmen entwickelt werden, um die Verteilungen der markierten Proteine in diesen Bildern automatisch zu analysieren.
    • Beispiel 3 Automatisierte Screens für Verbindungen, die die Internalisierung von Rezeptoren induzieren oder hemmen G-Protein-gekoppelte Rezeptoren
  • G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind eine große Klasse von 7 Transmembrandomänen-Zelloberflächenrezeptoren, welche Signale aus der extrazellulären Umgebung über ihre Wechselwirkung mit heterotrimeren G-Proteinen an das Zellcytoplasma übertragen. Die Aktivierung dieser Rezeptoren durch Ligandenbindung fördert den Austausch von GDP gegen GTP auf dem assoziierten G-Protein, was zur Dissoziierung des G-Proteins in aktives Gα-GTP und Gβγ-Untereinheiten führt. Die Wechselwirkung dieser Untereinheiten mit ihren Effektoren stimuliert eine Kaskade sekundärer Signale in der Zelle, wie die Produktion von zyklischem AMP (cAMP) und Inositoltriphosphat (IP&sub3;), die Mobilisierung von CA&spplus;&spplus; und die Aktivierung einer Vielzahl von Kinasen. Ein großer Bereich biologischer Funktionen ist mit GPCRs assoziiert, einschließlich Geruchssinn, Geschmackssinn, Lichtwahrnehmung, Kontrolle des Blutdrucks, Neurotransmission, endokrine und exokrine Funktion, Chemotaxis, Exocytose, Embryogenese und Entwicklung, Zellwachstum und Differenzierung und Onkogenese, ist aber nicht darauf beschränkt. GPCRs wurden deshalb zu einem wichtigen möglichen Ziel für eine Vielzahl von therapeutischen Einheiten.
  • GPCRs durchdringen die Plasmamembran und unterliegen in nicht-stimulierten Zellen einer relativ geringen Rate von Endozytose von der Zelloberfläche in Endosomen. Obwohl aus mechanistischer Sicht nur wenig verstanden, weiß man, dass die Anwesenheit von Agonist die Rate der Rezeptor-Internalisierung dramatisch erhöht. Sobald die GPCRs in Endosomen internalisiert sind, können sie entweder in die Plasmamembran recycelt werden oder zum Abbau in Lysosomen transportiert werden. Die Signifikanz dieser Anlagerung von GPCRs ist noch nicht voll verstanden. Die Rezeptor-Internalisierung kann eine Rolle bei der Desensibilisierung (Verlust einer funktionellen Reaktion) spielen, die sich als eine Verminderung der Fähigkeit des Rezeptors zeigt, in Anwesenheit fortgesetzter Stimulierung einen Second Messenger zu erzeugen. Die Rate an Rezeptor-Verlust von der Oberfläche ist jedoch im Allgemeinen zu gering, um für die schnelle Rate der Desensibilisierung verantwortlich sein zu können (Tobin, A. B. et al., 1992, Mol. Pharmacol. 42:1042-1048), und es gibt Beispiele, in denen gezeigt wurde, dass die beiden Prozesse entkoppelt sind (Baumgold, J. et al., 1989, Neuropharmacology 28:1253-1261; Kanbe, S. et al., 1990, Biochem. Pharmacol. 40:1005-1014).
  • Es ist wahrscheinlich, dass die Endozytose von Rezeptoren an der Resensibilisierung beteiligt sein kann (die Wiedererrichtung der Fähigkeit der Zelle, Second Messenger als Reaktion auf Stimulierung zu erzeugen). Für den β&sub2;-adrenergen Rezeptor (β&sub2;-AR) wurde gezeigt, dass Mutanten, die sequestrationsdefizient sind, sowie Rezeptoren, die mit Agenzien behandelt wurden, welche die Sequestration blockieren, nicht resensibilisieren (Yu, S. S. et al., 1993, J. Biol. Chem. 268(1):337-341; Barak, L. S. et al., 1994, J. Biol. Chem. 269(4):2790-2795). Bei β&sub2;-AR führt die Agonist-Stimulation zur Rezeptor-Phosphorylierung durch Proteinkinase A und durch β&sub2;-adrenerge Rezeptorkinase (β-ARK). Anschließend erfolgt eine Entkopplung des Rezeptors von seinem G-Protein als Ergebnis der Rekrutierung und der Bindung von β-Arrestin an den Rezeptor und die Internalisierung des Rezeptors über Clathrin-beschichtete Vehikel wird initiiert. Der saure pH-Wert in Endosomen begünstigt die Aktivität der Phosphatase, wodurch die Dephoshorylierung des Rezeptors verstärkt wird (Krueger, K. M. et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(1):5-8), wodurch der Rezeptor für die Plasmamembran recycelt wird, um wieder mit G-Protein zu reassoziieren. Es wurde jedoch gezeigt, dass die Resensibilisierung anderer Rezeptoren, z. B. beim M&sub4;-Muscarin-Rezeptor, durch Endozytose verzögert wird (Bogatekewitsch, G. S. et al., 1996, Mol. Pharmacol. 50:424-429). Trotz der Tatsache, dass die funktionelle Wichtigkeit der Rezeptor- Internalisierung sich zwischen den Rezeptorklassen unterscheiden kann, bleibt deutlich, dass die Internalisierung ein signifikanter Schritt auf dem Weg der Rezeptor-Aktivierung und -Funktion ist.
  • Die fundamentale Wichtigkeit der zellulären Prozesse, an denen GPCRs beteiligt sind, macht sie zu einem wichtigen Ziel für das Arzneistoff-Screening. Der Stand der Technik zur Überwachung von GPCR-Liganden-Wechselwirkungen und der Rezeptor-Interanalisierung ist auf die Messung eines einzelnen Ereignisses beschränkt (d. h. Rezeptor-Ligand- Wechselwirkung oder Rezeptorverlust aus der Plasmamembran). Aktuelle Verfahren beinhalten die Messung der Bindung eines markierten Liganden (gewöhnlich radiaktiv markiert) an vollständige Zellen oder an isolierte Membranfraktionen (WO 97/04214; von Zastrow und Kobilka, J. Biol. Chem. 269:18448-18452, 1994; Koch et al., J. Biol. Chem. 273:13652-13657, 1998; Tiberi et al., J. Biol. Chem. 271:3771-3778, 1996), die gleichzeitige Wanderung von Rezeptoren mit verschiedenen Markern in subzelluläre Fraktionen, die durch Zentrifugation aufgetrennt werden (Seibold et al., J. Biol. Chem. 273:7637-7642, 1998; Stefan et al., Mol. Biol. Cell. 9:885-899, 1998), die Sichtbarmachung fluoreszierend markierter Ligandenbindung an Rezeptoren in fixierten Zellen (Tarasova et al., J. Biol. Chem. 272:14817-14824, 1997) oder die Markierung mit Antikörpern (entweder direkt oder an Epitope) zur Identifizierung von Rezeptoren (von Zastrow und Kobilka, J. Biol. Chem. 269:18448-18452, 1994; Segredo et al., 1997, J. Neurochem. 68:2395-2404; Krueger et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(1):5-8; Tiberi et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(7):3771-3778). Neuerdings wurden Fusionen aus grün fluoreszierendem Protein (GFP) und Rezeptoren verwendet, welche die Sichtbarmachung von GPCR-Rezeptor-"Trafficking" in lebenden Zellen ermöglicht (Kallal, L. et al., 1998, J. Biol. Chem. 273(1):322-328; Tarasova, N. I. et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(3):14817-14824). Dies erfordert jedoch eine konfokale Bildgebung zum Erhalt von dreidimensionaler Information, um unterscheiden zu können, ob ein Rezeptor internalisiert wurde oder sich einfach nur in der Ebene der Plasmamembran bewegt hat. Es wurden ebenfalls Verfahren zur Identifizierung von GPCRs, ihren Liganden und Verbindungen offenbart, die ihre Aktivität modulieren (VVO 98/13353 und WO 97/48820). Diese Verfahren weisen jedoch die Aktivierung von G-Protein indirekt durch Ligandenbindung an den Rezeptor und durch Reportergen-Aktivierung nach. Keines der Verfahren markiert den Rezeptor direkt oder misst direkt die Internalisierung des Rezeptors als Anzeichen der Rezeptor-Aktivierung.
  • Während die bestehenden Ansätze Information und ein Mittel zur Messung der Rezeptor- Funktion bereitgestellt haben, besteht ein Bedarf nach einem Verfahren zur direkten Messung der durch Liganden induzierten Rezeptor-Internalisierung mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung als ein Maß der Rezeptor-Aktivierung.
  • Deswegen wird hier ein neuartiger Ansatz zur Messung der Rezeptor-Internalisierung beschrieben, der die Messung der Rezeptor-Internalisierung in einem einzigen Schritt mit geeigneter Automatisierung und einem geeigneten Durchsatz ermöglicht. Dieser Ansatz beinhaltet die Fluoreszenzmarkierung des GPCR und die automatisierte Messung der GPCR-Internalisierung in stimulierten Zellen. Ein hier beschriebener alternativer Ansatz beinhaltet die Verwendung zweifach markierter Rezeptoren, umfassend eine Markierung, die spezifisch für den Aminoterminus des Rezeptors ist, um seine extrazelluläre Domäne unterschiedlich zu färben, zusätzlich zu einem molekularen Chromophor wie GFP oder einer Luciferase auf dem Carboxyterminus des Rezeptors zur spezifischen Markierung der intrazellulären Domäne. Verfahren zur Konstruktion solcher chimeren Protein- exprimierenden DNA-Konstrukte sind gut bekannt (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, Bd. 185, Hrsg. D. Goeddel, 1991, Academic Press, San Diego, CA), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., 1990, Academic Press, San Diego, CA), Gene Transfer and Expression Protocols, Seiten 109-128, Hrsg. E. J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N. J.).
  • Ein Verhältnis der Fluoreszenzintensität der beiden Markierungen wird von nicht-stimulierten und stimulierten Zellen angefertigt. Da der Aminoterminus des Rezeptors nur zur Markierung erhältlich ist, wenn der Rezeptor in die Plasmamembran inseriert vorliegt, kann das Verhältnis der beiden Markierung in nicht-permeabilisierten Zellen dazu verwendet werden, das Ausmaß der Internalisierung des Rezeptors zu messen. Es existiert gegenwärtig keine bekannte Technologie zur gleichzeitigen Messung der relativen extrazellulären Erhältlichkeit der externen und internen Domänen von Membran-Rezeptoren.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Screens auf Modulatoren von GPCRs werden lebende Zellen aus kontinuierlichen Linien normaler oder transformierter Zellen erhalten oder primäre normale oder transformierte Zellen werden direkt aus Tieren erhalten. Die geeigneten Zellen können transient oder stabil mit einem DNA-Konstrukt (entweder ein Plasmid oder auf Virus basierend) transfiziert werden, welches das interessierende GPCR exprimiert, welches entweder an seinem Amino- oder Carboxy-Terminus oder intern an ein molekulares Chromophor fusioniert ist, so dass der Rezeptor seine Funktion beibehält.
  • Beispiele nützlicher molekularer Chromophore beinhalten GFP und seine zahlreichen Mutanten, sind aber nicht darauf beschränkt (Heim und Tsien, 1996, Current Biology 6:178- 182; Zhang et al., 1996, Biochem. Biophys. Res. Comm. 227:707-711). Zusätzlich können Luciferasen und ihre Mutanten ebenfalls verwendet werden. Dies wäre eine neue Markierungstechnik, da die Verwendungsbeispiele dieses molekularen Chromophors bis jetzt die Verwendung als Reporter für Gen-Aktivität (Yang et al., 1998, J. Biol. Chem. 273(17):10763-10770; Peng et al., 1998, J. Biol. Chem. 273(27):17286-17295; Baldari et al., 1998, Biologicals 26(1):1-5) und die Konstruktion von Biosensoren (Campbell und Patel, 1983, Biochem. J. 216:185-194; Sala-Newby und Campbell, 1992, FEBS Lett. 307:241-244; Jenkins et al., 1990, Biochem. Soc. Trans. 18:463-464) beinhalten, aber nicht als Chimären zur Markierung eines bestimmten Protein-Ziels. Die Expression der GPCR-lumineszierenden Proteinfusion kann konstitutiv (gesteuert durch eine Vielzahl von Promotoren, einschließlich CMV, SV40, RSV, Actin, EF, aber nicht darauf beschränkt) oder induzierbar sein (mit einem Promotor, einschließlich Tetracyclin, Ecdyson, Steroid-responsiv, aber nicht darauf beschränkt).
  • Alternativ dazu werden die Zellen transient oder stabil mit einem DNA-Konstrukt (entweder Plasmid oder Virus) transfiziert, welches das interessierende GPCR fusioniert, an ein kleines Peptid oder ein Epitop exprimiert. Das Epitop kann an den Amino- oder Carboxy-Terminus oder an eine interne Stelle fusioniert sein, so dass der Rezeptor funktional bleibt, oder alternativ kann das GPCR mit zwei unterschiedlichen Epitopen markiert sein, die jeweils an ein Ende des GPCR fusioniert sind. Einige Beispiele für Epitope beinhalten FLAG (Sigma Chemical, St. Louis, MO), myc (9E10) (Invitrogen, Carlsbad, CA), 6-His (Invitrogen; Novagen, Madison, WI) und HA (Boehringer Mannheim Biochemicals), sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Die Expression der GPCR-Fusion kann konstitutiv oder induzierbar sein.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden die Zellen transient oder stabil mit einem DNA- Konstrukt (Plasmid oder Virus) transfiziert, das ein interessierendes GPCR exprimiert, das an seinem Aminoterminus an ein Epitop und an seinem Carboxyterminus an ein molekulares Chromophor fusioniert ist. Alternativ dazu kann das GPCR an seinem Carboxyterminus an ein Epitop und an seinem Aminoterminus an ein molekulares Chromophor fusioniert sein. Die Expression der GPCR-Fusion kann konstitutiv oder induzierbar sein.
  • Die geeigneten Zellen werden dann zur Behandlung und zur Analyse auf Anordnungen verteilt. Diese Anordnungen können Platten mit multiplen Vertiefungen mit 96, 384, 1536 oder individuelleren Vertiefungen sein. Die Zellen können auch mit dem CellChipTM-System (US-PS 6,103,479) in Mikroanordnungen von virtuellen Vertiefungen angeordnet werden. Diese Mikroanordnungen können vom gleichen Zelltyp sein und werden mit einer kombinatorischen Bibliothek unterschiedlicher Verbindungen behandelt. Alternativ können die Mikroanordnungen eine kombinatorische Bibliothek von verschiedenen Zelltypen sein, die mit einer oder mehreren Verbindungen behandelt werden.
  • Sobald die ausgewählten Zellen in Vertiefungen oder Mikrovertiefungen angeordnet sind, werden sie mit Arzneistoff- oder Ligandenlösungen behandelt, um die Rezeptor- Internalisierung entweder zu hemmen oder zu stimulieren. Das Flüssigkeitstransportsystem kann manuell, automatisiert oder das Mikroflüssigkeit-CellChipTM-System (US-PS 6,103,479) sein. Nach einer geeigneten Inkubationszeit werden die Zellen mit einem chemischen Quervernetzungsagens fixiert und mit lumineszenzbasierenden Reagenzien gefärbt. Diese Reagenzien schließen Lumineszenz-markierte primäre und sekundäre Antikörper ein, die mit dem GPCR reagieren, mit dem Epitop oder mit anderen zellulären Antigenen, die mit der Internalisierung des GPCR korrelieren sollen, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Lumineszierende Färbungen, Farbstoffe und andere kleine Moleküle können ebenfalls dazu verwendet werden, die physiologische Antwort der Zellen auf Arzneistoffe zu messen. Diese Reagenzien werden dazu verwendet, die räumlichen und zeitlichen Veränderungen der Ionen, der Metaboliten, der Makromoleküle und der Organellen zu messen, die durch Arzneistoffe induziert werden. Makromolekulare Indikatoren der zellulären Physiologie können ebenfalls im Test verwendet werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden Zellen in Vertiefungen oder Mikroanordnungen mit Arzneistoffen behandelt und die physiologische Reaktion wird zeitlich und räumlich innerhalb einer Population von lebenden Einzelzellen nach einer geeigneten Inkubationszeit gemessen. Lumineszierende Färbungen, Farbstoffe und andere kleine Moleküle können dazu verwendet werden, die physiologische Antwort von lebenden Zellen auf Arzneistoffe zu messen. Molekulare Chromophoren, die von den Zellen selbst exprimiert werden (wie GFP und seine Mutanten), sind besonders gut für Messungen an lebenden Zellen geeignet. Diese Reagenzien können dazu verwendet werden, die zeitlichen und räumlichen intrazellulären Veränderungen von Ionen, Metaboliten, Makromolekülen und Organellen zu messen, die durch Arzneistoffe induziert werden. Makromolekulare Indikatoren der zellulären Physiologie können ebenfalls in diesem Test verwendet werden. Diese lumineszierenden Analoga und Biosensoren können dazu verwendet werden, die zeitlichen und räumlichen Veränderungen der Verteilung und der Aktivität von Makromolekülen wie Protein, DNA, RNA, Lipiden und Kohlenhydraten als Reaktion auf Arzneistoffbehandlungen zu messen.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird ein fluoreszierend markierter Ligand dazu verwendet, die Rezeptor-Sequestrierung zu induzieren und das Schicksal des Liganden folgt einem Parameter des Screens mit hohem Gehalt.
  • In einer weiteren Ausführungsform können Zellen mehr als einen unterschiedlich markierten Rezeptor enthalten, so dass verschiedene GPCRs in den gleichen Zellen durch Verwendung verschiedenere Fluoreszenzkanäle zur Gewinnung dieser Daten analysiert werden können. In ähnlicher Weise können die Vertiefungen oder Mikroanordnungen gemischte Populationen von Zellen enthalten, wobei jede Population einen unterschiedlichen Rezeptor enthält, der mit einem spektral-unterschiedlichen Fluorophor markiert ist. Die Auswirkungen von Arzneistoffen auf verschiedene Rezeptoren können in einem einzelnen Lauf durch Verwendung eines Zell-Screening-Systems wie das erfindungsgemäße Zell-Screening- System gemessen werden, das die Fluoreszenzkanäle der verschiedenen Rezeptoren in diesem Beispiel unterscheiden kann. Auf diese Weise kann man auch Verbindungen screenen, die multiple Rezeptor-Typen beeinträchtigen oder umgekehrt auch Verbindungen, die nur einen Rezeptor-Typ und nicht andere beeinträchtigen.
  • Für den Fachmann ist es offensichtlich, dass diese Erfindung auf jeden Zelloberflächen- Rezeptor angewandt werden kann, der als Reaktion auf Agonisten-Stimulation Internalisierung eingeht. Einige bekannte Beispiele der GPCRs sind adrenerge Rezeptoren, muskarine Acetylcholin-Rezeptoren, Opioid-Rezeptoren, Chemokin-Rezeptoren, Neuropeptid-Rezeptoren, Prostaglandin-Rezeptoren, Parathyroid-Hormon-Rezeptor, Cholecystokinin-Rezeptor, Secretin-Rezeptor, Rhodopsin, Dopamin-Rezeptoren, Serotonin- Rezeptoren, Geruchs-Rezeptoren, Histamin-Rezeptoren, Angiotensin-Rezeptoren, Gastrin- Rezeptoren, Follikel-stimulierender Hormon-Rezeptor, luteinisierender Hormon-Rezeptor, metabotroper Glutamat-Rezeptor, Glucagon-Rezeptor (eine vollständigere Liste bekannter GPCRs und ihrer Liganden ist in Beck-Sickinger, A. G., 1996, Drug Discovery Today 1(12):502-513 erhältlich). Diese Erfindung ist nicht auf GPCIRs beschränkt; Beispiele anderer Rezeptoren, auf die diese Erfindung angewandt werden könnte, umfassen Wachstumsfaktor-Rezeptoren wie PDGF (Heldin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257(8):4216- 4221; Kapeller et al., 1993, Mol. Cell. Biol. 13(10):6052-6063) und EGF (Zidovetzki et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. 78(11):6981-6985; Beguinot et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81(8):2384-2388; Emlet et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(7):4079-4086), den Transferin- Rezeptor (Klausner et al., 1983, J. Biol. Chem. 258(8):4715-4724; Ciechanover et al., 1983, J. Cell. Biochem. 23(1-4):107-130) und den Insulin-Rezeptor (Baldwin et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. 77(10):5975-5978; Di Guglielmo et al., 1998, Mol. Cell. Biochem. 182(1- 2):59-63), sind aber nicht darauf beschränkt. Diese Erfindung kann auch auf "Orphan"- Rezeptoren angewandt werden, für die kein spezifischer Ligand und/oder Effektor bekannt ist.
  • Das folgende Beispiel ist ein Screen hinsichtlich der Aktivierung eines G-Protein- gekoppelten Rezeptors (GPCR), die durch die Translokation des GPCR aus der Plasmamembran zu einer Lokalisierung in der Nähe des Kerns nachgewiesen wird. Das Beispiel veranschaulicht, wie ein Screen mit hohem Durchsatz mit einem Screen mit hohem Gehalt in dem System für zellbasiertes Screening im dualen Modus gekoppelt werden kann.
  • Fig. 19 veranschaulicht einen Screen im dualen Modus für die Aktivierung eines GPCR. Zellen, die eine stabile Chimäre des GPCR mit einem blaufluoreszierenden Protein (BFP) tragen, werden mit der Acetoxymethylester-Form von Fluo-3 beladen, ein zelldurchgängiger Calciumindikator (grüne Fluoreszenz), der durch die Esterhydrolyse in lebenden Zellen eingeschlossen wird. Sie werden dann in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte 601 ausplattiert. Die Vertiefungen werden dann unter Verwendung eines Flüssigkeitstransportsystems mit einer Anordnung von Testverbindungen behandelt. Eine kurze Sequenz von Fluo-3-Bildern der gesamten Mikrotiterplatte wird gemacht und hinsichtlich Vertiefungen analysiert, die eine Calciumreaktion zeigen (d. h. Modus mit hohem Durchsatz). Die Bilder sehen wie die Veranschaulichung der Mikrotiterplatte 601 in Fig. 19 aus. Eine kleine Anzahl von Vertiefungen wie die Vertiefungen C4 und E9 in der Darstellung fluoreszieren aufgrund des nach Rezeptorstimulation freigesetzten Ca&spplus;&spplus; heller. Die Position der Vertiefungen, die Verbindungen enthalten, die eine Antwort 602 induzierten, werden dann in das HCS- Programm transferiert und die Optik wird für eine ausführliche Zelle-pro-Zelle-Analyse der blauen Fluoreszenz für einen Hinweis auf eine Translokation von GPCR in die perinukleäre Region umgeschalten. Das untere Ende von Fig. 19 veranschaulicht die beiden möglichen Ergebnisse der Analyse der Zelldaten mit hoher Auflösung. Die Kamera macht ein Bild des Unterbereichs 604 der Vertiefungszone 603, wobei Bilder der fluoreszierenden Zellen 605 gemacht werden. Die gleichförmige Verteilung der Fluoreszenz in den Zellen in der Vertiefung C4 zeigt, dass der Rezeptor nicht internalisiert wurde, was impliziert, dass die gesehene Ca&spplus;&spplus;-Reaktion das Ergebnis der Stimulierung eines anderen Signalsystems in der Zelle war. Dagegen zeigen die Zellen in der Vertiefung E9 606 deutlich eine Konzentration des Rezeptors im perinukleären Bereich, was klar auf die vollständige Aktivierung des Rezeptors hinweist. Da nur wenige Treffer-Vertiefungen mit hoher Auflösung analysiert werden müssen, kann der Gesamtdurchsatz des Systems im dualen Modus verglichen mit einem System mit hohem Durchsatz alleine sehr hoch sein.
    • Beispiel 4 Screen mit hohem Gehalt für die durch Liganden induzierte Internalisierung von Parathyroid Hormon-Rezeptor
  • Plasmid-Konstrukt. Ein eukaryotisches Expressionsplasmid, das die kodierende Sequenz für eine humanisierte GFP-Mutante (pEGFP-N&sub2;, CLONTECH, Palo Alto, CA) enthält, wurde dazu verwendet, eine GFP-humane Parathyroid-Hormon-Rezeptor- (PTHR, GenBank #L04308) Chimäre zu erzeugen.
  • Zellpräparation. Das Plasmidkonstrukt wurde dazu verwendet, eine humane embryonale Nierenzelllinie (HEK 293) (ATCC-Nr. CRL-1573) zu transfizieren. Klonale Linien, die die GFP-PTHR-Chimäre stabil exprimieren, wurden durch eine Antibiotika-Selektion mit dem Neomycin-Analogon Geneticin (0,5 mg/ml; Life Technologies, Gaithersburg, MD) etabliert. Zellen werden präpariert und in DMEM/F12-Medium (Life Technologies), das 25 mM HEPES-Puffer (kein Natriumbicarbonat), 10% fötales Kälberserum (FCS), Penicillin/Streptomycin (PS) und 2 mM L-Glutamin enthält, plattiert. Zellen werden in einer Dichte von 4 · 10&sup4; pro Vertiefung in eine 96-Loch-Mikrotiterplatte in einem Volumen von 200 ul pro Vertiefung ausplattiert. Die Zellen können sich für etwa 30 Minuten bei Raumtemperatur absetzen und die Platte wird dann bei 37ºC in einen Feuchtluftinkubator gestellt.
  • Die Induktion der GFP-PTHR-Internalisierung durch Parathyroid-Hormon. Eine 100- uM-Vorratslösung des bovinen Parathyroid-Hormons (PTH), Aminosäuren 1-34 (Bachem, King of Prussia, PA) wird mit säurehaltigem Wasser (pH 4-5,5) präpariert. Zur Induzierung der Internalisierung der GFP-PTHR-Chimäre werden die Zellen durch Zugabe von 50 ul von 500 nM PTH zu jeder Vertiefung (verdünnt in DMEM/F12, 10% FCS, PS; 2 mM L-Glutamin) stimuliert. Dieses Volumen wird dann zu den bereits in der Vertiefung vorhandenen 200 ul Medium hinzugegeben, wodurch eine Endkonzentration von 100 nM PTH erzielt wird. Die Platte wird dann für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, wobei sie mit Aluminiumfolie abgedeckt wird, um das Fluorophor völlig zu schützen. Nach der 2-stündigen Stimulation mit PTH wird das Medium von der Platte abgegossen, die Zellen werden fixiert und die Kerne durch die Zugabe von 200 ul einer Hank's balancierten Salzlösung (HBSS), die 3,7% Formalin (Sigma) und 1 ug/ml Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, Oregon) enthält, gefärbt. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wird die Lösung von der Platte abgegossen, die Zellen durch Zugabe von 200 ul pro Vertiefung HBSS gewaschen und die Platten werden mit frischem HBSS (200 ul pro Vertiefung) analysiert/gelagert.
  • Bildgewinnung und Analyse. (Vgl. Fig. 26 für einen Überblick.) Nach der Autofokussierung 101 (Fig. 27) auf die mit Hoechst markierten Kerne wird ein Bild der Kerne 102 bei einer 20-fachen Vergrößerung gewonnen. Das Kernbild wird durch Schwellenwertbestimmung 103 segmentiert, wobei ein Schwellenwert verwendet wird, der von dem Benutzer ausgewählt wird oder durch eines oder zwei andere Verfahren erhalten wurde, zwischen denen der Benutzer auswählen kann (Isodaten-Algorithmus oder Spitzen-Interpolierung). Der Gesamtbereich der Pixel aller Kerne im Bild wird dann als eine Einzelsumme 104 berechnet. Ein Bild der GFP-Fluoreszenz wird dann bei einer 20-fachen Vergrößerung 105 gewonnen (Fig. 26). Der Bereich der Platte, der auf diesem Weg bildlich dargestellt wird, wird als Feld bezeichnet.
  • Größere Artefakte werden aus GFP-Bild wie folgt 106 entfernt (Fig. 26). Ein Schwellenwert des Bilds wird bei einem durch den Benutzer ausgewählten Intensitätswert bestimmt, der höher als die Schwelle ist, die dazu verwendet wird, später gültige Objekte nachzuweisen. Alle in dem entstehenden Bild nachgewiesenen Objekte werden markiert und ihre Größe (Anzahl an Pixel) wird gemessen. Objekte, die größer als die durch den Benutzer spezifizierte Größe sind, werden als Artefakte behandelt. All diese Objekte werden kopiert und in ein neues leeres Bild eingefügt, das Artefaktbild. Das Artefalktbild wird leicht erweitert, um sicherzugehen, dass die Artefakte vollständig gelöscht werden. Das Artefaktbild wird dann von dem ursprünglichen GFP-Bild subtrahiert, wodurch das Zwischenbild erhalten wird.
  • Zur Entfernung von Variationen in der Hintergrundfluoreszenz wird das Zwischenbild einer Zylinder ("top hat")-Transformation 107 unterzogen (Fig. 26). Diese Transformation besteht aus (a) einer Graustufenerosion (Austausch jedes Pixelwerts durch den Minimumwert in seiner Nachbarschaft), (b) einer Graustufenerweiterung (Austausch jedes Pixelwerts durch den maximalen Wert in seiner Nachbarschaft) mit der gleichen Größe der Umgebung wie in (a), wodurch ein Hintergrundbild erzeugt wird, und (c) Subtraktion des entstehenden Hintergrundbilds vom ursprünglichen Input-Bild zur Erzeugung des Objektbilds, welches kleine helle Tupfen enthält. Die Größe der für die Schritte (a) und (b) verwendeten Nachbarschaft wird so ausgewählt, dass sie etwas größer als alle im Bild interessierenden Objekte ist. Als Ergebnis fehlen solche Objekte auf dem Hintergrundbild nach der Erosion (a) und der Erweiterung (b). Schrittweise Variationen im Hintergrund des Originalbilds werden jedoch im Hintergrundbild beibehalten. Deshalb entfernt der Subtraktionsschritt (c) diese Variationen im Hintergrund aus dem Objektbild.
  • Das Objektbild wird verarbeitet, um zu bestimmen, welche der hellen Tupfen den internalisierten Rezeptor in stimulierten Zellen darstellen. In diesem Vorgang wird eine Helligkeitsschwelle und eine minimale Größeneinstellung verwendet, die durch den Bediener eingestellt wird. Das Objektbild wird an der Helligkeitsschwelle zur Erzeugung der binären Objektmaske 108 auf einen Schwellenwert eingestellt (Fig. 26). Die Objekte in der binären Objektmaske werden markiert und ihre Größe wird in Pixel gemessen. Jene Objekte, die die minimale Größe besitzen oder diese überschreiten, sind gültige Punkte 109 (Fig. 28); der Rest wird ignoriert.
  • Für jeden gültigen Punkt werden dann die folgenden Messungen bestimmt (Fig. 28). Die Zählung der Punkte im Feld wird gesteigert 110. Die Anzahl der Pixel wurde zuvor gezählt. Für jeden gültigen Punkt wird die Region mit seiner Markierung aus der binären Objektmaske extrahiert, um die Einzelpunktbinäre Maske zu erzeugen. Die Einzelpunktbinäre Maske wird auf das ursprüngliche Objektbild angewandt, um das Graustufen- Punktbild des entsprechenden Punkts zu erhalten. Die Intensitäten der Pixel in dem Graustufen-Punktbild werden zusammengezählt, um die Aggregat-Intensität des Punkts 111 zu erhalten. Sobald alle Punkte verarbeitet wurden, wird die Summe aller Bereiche der gültigen Punkte zusammengezählt, um für das Feld 112 den Aggregatpunktbereich zu erhalten. Der. Gesamtwert der Aggregat-Intensität der Punkte wird ermittelt, um die Aggregatpunktintensität des Felds zu erhalten. Für den endgültigen Wert für das Feld (oder die Vertiefung) kann man aus verschiedenen Statistiken wählen: (a) die Anzahl an gültigen Punkten; (b) der Aggregatbereich der gültigen Punkte; (c) die Aggregat-Intensität der gültigen Punkte; (d) die Aggregat-Intensität der gültigen Punkte, geteilt durch den Gesamtbereich der Kerne. Wenn mehr als ein Feld innerhalb jeder Vertiefung analysiert wird, werden die Werte für alle Felder der Vertiefung zusammen gemittelt, um für das Feld 113 eine Aggregat-Statistik zu ermitteln (Fig. 26).
  • Die folgenden Beispiele der Bestimmung der Rezeptor-Internalisierung unter Verwendung der vorstehenden Techniken veranschaulichen die Unterschiede, die man zwischen behandelten und nicht-behandelten Zellen gefunden hat. Die Kerne nicht-stimulierter Zellen werden mit dem DNA-spezifischen Hoechst-Farbstoff markiert und mit einem Nahe-UV- Fluoreszenz-Filtersatz bildlich dargestellt. Die gleichen Zellen werden mit einem blaufluoreszierenden Filtersatz photographiert, der die Verteilung der GFP-Fluoreszenz zeigt. Die Kernmaske wird durch Anwendung eines Schwellenwerts auf das Bild mit dem markierten Kern abgeleitet und das Hintergrundbild wird durch Graustufenerosion und Erweiterung des GFP-Bilds abgeleitet, wodurch sich Variationen in der Hintergrundintensität zeigen. Das Objektbild wird dann durch Subtraktion des Hintergrundbilds vom GFP-Bild abgeleitet und zeigt als Ergebnis schwache Punkte. Die Objektmaske wird dann durch Anwendung des Schwellenwerts auf das Objektbild abgeleitet. Einige schwache Punkte werden durch die Schwellenwertbildung eliminiert. Einige andere haben weniger Pixel über dem Schwellenwert als für einen gültigen Punkt nötig sind. Als Ergebnis findet man in dem Bild der nicht-stimulierten Zellen nur wenige gültige Punkte. Der Punktzähler, die Aggregatpunktbereiche und die Aggregatpunkthelligkeit haben alle niedrige Werte.
  • In einem zweiten Beispiel werden die Kerne stimulierter Zellen mit dem DNA-spezifischen Hoechst-Farbstoff markiert und wie im vorstehenden Beispiel genannt bildlich dargestellt. Die Kernmaske wird durch das automatisierte Schwellenwertverfahren abgeleitet und das Hintergrundbild wird durch Graustufenerosion und Erweiterung des GFP-Bilds abgeleitet, wodurch sich Variationen in der Hintergrundintensität zeigen. Das Objektbild wird durch Subtraktion des Hintergrundbilds vom GFP-Bild abgeleitet, was zu hellen Punkten führt. Die Objektmaske wird durch Anwendung des Schwellenwerts auf das Objektbild abgeleitet. Auf der Objektmaske sieht man viele Punkte und viele dieser Punkte weisen ausreichend Pixel über dem Schwellenwert auf, um das Erfordernis für einen gültigen Punkt zu erreichen. Der Punktzähler, die Aggregatpunktbereiche und die Aggregatpunkthelligkeit haben alle hohe Werte. Ergebnisse aus Experimenten wie in diesen Beispielen wurden bereits in Fig. 25 gezeigt.
  • Fig. 29 zeigt eine repräsentative Darstellung auf einem PC-Bildschirm, der Daten zeigt, die anhand der in den vorstehend genannten Beispielen beschriebenen Verfahren erhalten wurden. Jeder Datenpunkt stellt den Punktzähler einer einzelnen Vertiefung der Platte dar, der durch Zusammenzählen aller Punktzähler der Felder dieser Vertiefung berechnet wurde. Das Diagramm 300 zeigt individuelle Kurven, die jeweils eine einzelne Reihe auf der 96- Loch-Platte darstellen. Die am weitesten links gelegenen sechs Punkte jeder Kurve zeigen die Punktzähler von unbehandelten Vertiefungen, während die rechts gelegenen sechs Punkte behandelte Vertiefungen darstellen. Die Punktzählereigenschaft ("obj count" in der Darstellung) kann anhand der Liste 302 ausgewählt werden. Die numerischen Werte für alle Reihen werden im Tabellenformat 303 gezeigt. Das Diagramm 300 und die Tabelle 303 können ausgedruckt werden und die Tabelle kann in ein durch Komma getrenntes Format exportiert werden, um in ein Tabellenkalkulationsprogramm wie Microsoft ExcelTM aufgenommen zu werden.
  • Alternativ dazu können die Daten auf einer pro Feld-Basis dargestellt werden (Fig. 30). Jedes Diagramm 304, 305 und 306 kann gewählt werden, um eine der berechneten Statistiken (gemittelt über die Felder der Vertiefung) gegen die Anzahl der Vertiefung aufgetragen zu werden. Die Tabelle 307 zeigt die numerischen Daten, die auf einer Pro- Feld-Basis berechnet wurden. Die Auswahl einer Zeile der Tabelle führt dazu, dass die entsprechenden Hoechst 308- und GFP 309-Bilder gezeigt werden. Die Tabelle 305 kann ausgedruckt oder in ein ASCII-Datenformat exportiert werden, um in Tabellenkalkulationsprogramm wie Microsoft ExcelTM exportiert zu werden.
  • Das Diagramm 304 zeigt den Punktzähler gegen die Zahl der Vertiefung. Der Punktzähler ist die Anzahl an gültigen Punkten, die in den GFP-Bildern nachgewiesen wurden. Im erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Computer zur Umwandlung des digitalen Signals von der Kamera in diesen Parameter und zum Auftrag der Parameter gegen die Zahl der Vertiefung verwendet.
  • Das Diagramm 305 zeigt den Aggregatpunktbereich (in der Darstellung der "gesamte Punktbereich") gegen die Vertiefungsnummer. Der Aggregatpunktbereich ist der summierte Bereich aller gültigen Punkte, die in den GFP-Bildern nachgewiesen wurden. Im erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Computer zum Umwandeln der digitalen Signale von der Kamera in diesen Parametern und zum Auftrag dieser Parameter gegen die Vertiefungsnummer verwendet.
  • Das Diagramm 306 zeigt das normalisierte Punkt-Intensitätsverhältnis (in der Darstellung "Punkt Intensitäts Verhältnis · 100" gegen die Nummer der Vertiefung. Das normalisierte Punkt-Intensitätsverhältnis ist die Summe der Intensitäten aller Pixel in den gültigen Punkten, die in den GFP-Bildern nachgewiesen wurden, geteilt durch die summierte Anzahl an Pixel in den Kernmasken in dem entsprechenden Hoechst-Bild. Im erfindungsgemäßen Verfahren wird zur Umwandlung der digitalen Signale von der Kamera in diesen Parameter und zum Auftrag der Parameter gegen die Nummer der Vertiefung ein Computer verwendet.
  • Fig. 25 ist eine graphische Darstellung von Daten aus Validierungsläufen des PTHR- Internalisierungs-Screens. Diese Abbildung veranschaulicht, dass die Daten für Minimum ("minimale Antwort" = nicht-stimuliert) und Maximum ("maximale Antwort" = stimuliert) zwischen verschiedenen Platten konsistent sind (die Unterschied sind nicht statistisch signifikant), wodurch sich Varianzkoeffizienten innerhalb einer konsistenten und akzeptablen Spanne ergeben.
  • In einem spezifischen Beispiel eines Screens mit hohem Gehalt wurden in jeder Vertiefung vier Felder erhalten. Der Punktzähler wurde über die Felder einer Vertiefung zusammengezählt und unter den ähnlich behandelten Vertiefungen gemittelt. Die nichtbehandelte Hälfte der Platte wies einen Punktzähler von 69,3- ± 17,7-fach (Mittelwert ± Standardabweichung) der unbehandelten Hälfte der Platte auf, wodurch sich ein Varianzkoeffizient (COV, die Standardabweichung geteilt durch den Mittelwert) von 26% ergab. Die Werte der Felder der behandelten Hälfte der Platte hatten einen Punktzähler von 404,2 ± 41,2, wodurch sich ein COV von etwa 10% ergab. Der mittlere Punktzähler der behandelten Hälfte betrug das 5,83-fache des mittleren Punktzählers der nicht-behandelten Hälfte.
    • Beispiel 5 Kinetischer Screen mit hohem Gehalt
  • Der alleinige Nachweis, dass am Endpunkt ein internalisierter Rezeptor vorliegt oder nicht, kann zur Definition der Wirksamkeit einer Verbindung als Rezeptor-Agonist oder -Antagonist nicht ausreichend sein. In anderen Ausführungsformen werden die Zellen mit einem Arzneistoff behandelt und Daten werden nach der Arzneistoffbehandlung an verschiedenen Zeitpunkten erhoben, um die Kinetik der Rezeptor-Internalisierung zu quantifizieren.
  • Diese kinetischen Assays können wie vorstehend beschrieben mit lebenden Zellen durchgeführt werden oder verschiedene Vertiefungen von Zellen können zu jedem der interessierenden der verschiedenen Zeitpunkte nach der Arzneistoffbehandlung fixiert werden. In jedem Fall können die Zellen mit den vorstehend beschriebenen Reagenzien und Verfahren markiert werden. Solche kinetischen Messungen würden nicht nur über die Wirksamkeit während des Zeitverlaufs der Messung Information bereitstellen, sondern würden auch eine Extra-Polierung der Daten auf längere Zeitspannen ermöglichen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden kinetische Messung zuerst in einem Fluoreszenzkanal in einem Modus mit hohem Durchsatz oder mit ultra-hohem Durchsatz für eine zelluläre Reaktion durchgeführt, die mit Rezeptor-Internalisierung assoziiert ist. Diese Reaktion ist weniger Rezeptor-spezifisch als der Internalisierungsprozess selbst und kann Veränderungen in Ca&spplus;&spplus;-, cAMP- oder IP&sub3;-Konzentrationen oder in der Aktivierung irgendeiner einer Vielzahl von Kinasen beinhalten, ist aber nicht darauf beschränkt. Vertiefungen, die den gewünschten Output dieses Parameters zeigen, werden dann im HCS-Modus für eine detaillierte zeitliche und räumliche Information auf einer Zelle-pro-Zelle- Basis analysiert.
  • Die Lumineszenzsignale lebender oder fixierter Zellen werden mit einem Zell-Scanning- System wie dem erfindungsgemäßen Zell-Scanning-System analysiert.
    • Beispiel 6 Inserierte Sequenzen und deren Liganden für Screens mit hohem Gehalt mit doppelt-markierten Rezeptoren
  • In einer weiteren Ausführungsform wird ein Membran-Rezeptor so modifiziert, dass er spezifische Peptidsequenzen enthält, die an jedes Ende fusioniert sind, um die extrazellulären und intrazellulären Domänen unterschiedlich zu markieren. In nichtstimulierten und stimulierten Zellen wird ein Verhältnis der Fluoreszenzintensität der beiden Markierungen ermittelt; da der Aminoterminus des Rezeptors nur dann markierbar ist, wenn der Rezeptor in die Plasmamembran inseriert ist, kann das Verhältnis der beiden Markierung in nicht-permeabilisierten Zellen dazu verwendet werden, das Ausmaß an Internalisierung des Rezeptors zu messen. Es gibt gegenwärtig kein bekanntes Verfahren zur gleichzeitigen Messung der relativen extrazellulären Erhältlichkeit externer und interner Domänen von Membran-Rezeptoren.
  • Geeignete Zellen werden transient oder stabil mit einem DNA-Konstrukt (Plasmid oder Virus) transfiziert, welches das interessierende GPCR exprimiert, das an seinem Aminoterminus an ein Epitop und an seinem Carboxyterminus an ein molekulares Chromophor fusioniert ist. Alternativ dazu kann das GPCR an seinem Carboxyterminus an ein Epitop und an seinem Aminoterminus an ein molekulares Chromophor fusioniert werden. Die Expression der GPCR-Fusion kann konstitutiv oder induzierbar sein.
  • Einige Beispiele von Epitop-Markierungen schließen FLAG (Sigma Chemical, St. Louis, MO), myc (9E10) (Invitrogen, Carlsbad, CA), 6-His (Invitrogen; Novagen, Madison, WI) und HA (Boehringer Mannheim Biochemicals) ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Expression der GPCR-Fusion kann konstitutiv oder induzierbar sein.
  • Beispiele nützlicher molekularer Chromophore beinhalten GFP und seine zahlreichen Mutanten, sind aber nicht darauf beschränkt (Heim und Tsien, 1996, Current Biology 6:178- 182; Zhang et al., 1996, Biochem. Biophys. Res. Comm. 227:707-711). Zusätzlich können Luciferasen und ihre Mutanten ebenfalls verwendet werden. Die Verwendung einer Luciferase als Teil eines chimären Zielproteins umfasst eine neue Markierungstechnik, da die Verwendungsbeispiele dieses molekularen Chromophors bis jetzt die Verwendung als Reporter für Gen-Aktivität (Yang et al., 1998, J. Biol. Chem. 273(17):10763-10770; Peng et al., 1998, J. Biol. Chem. 273(27):17286-17295; Baldari et al., 1998, Biologicals 26(1):1-5) und die Konstruktion von Biosensoren (Campbell und Patel, 1983, Biochem. J. 216:185-194; Sala-Newby und Campbell, 1992, FEBS Lett. 307:241-244; Jenkins et al., 1990, Biochem. Soc. Trans. 18:463-464) beinhalten, aber nicht als eine Chimäre zur Markierung eines bestimmten Protein-Ziels. Die Expression der Fusion aus Membranproteinlumineszierendem Protein kann konstitutiv (gesteuert durch eine Vielzahl von Promotoren, einschließlich CMV, SV40, RSV, Actin, EF, aber nicht darauf beschränkt) oder induzierbar sein (mit einem Promotor, einschließlich Tetracyclin, Ecdyson, Steroid-responsiv, aber nicht darauf beschränkt).
  • Alternativ dazu werden Zellen transient oder stabil mit einem DNA-Konstrukt (entweder Plasmid oder Virus) transfiziert, welches das interessierende Membran-Protein exprimiert, das an zwei unterschiedliche Epitope fusioniert ist, wobei eines davon an jedes Ende des Membran-Proteins fusioniert ist.
  • Die äußere Erhältlichkeit der inserierten Sequenzen hängt von dem Internalisierungszustand des Rezeptors ab. Dies bedeutet, das Verhältnis der externen Erhältlichkeit der inserierten Sequenzen stellt ein direktes Maß der Höhe der Rezeptor-Internalisierung bereit. Dies ist ein Screen mit hohem Gehalt, der zweifach-markierte Rezeptoren beinhaltet. Die externe Erhältlichkeit der inserierten Sequenzen kann mit einem einzigen Ansatz oder mit einer Kombination verschiedener Ansätze gemessen werden:
  • 1. Eine oder mehrere der inserierten Sequenzen können Epitope für spezifische Antikörper sein. Antikörper-Bindung an das Epitop kann mit histochemischen, radioaktiven oder Fluoreszenzverfahren gemessen werden. Mögliche Epitope schließen jene aus Tabelle I ein, sind aber nicht darauf beschränkt. TABELLE I. PEPTID-EPITOPE UND IHRE ENTSPRECHENDEN ANTIKÖRPER
  • 2. Die inserierten Sequenzen können für fluoreszierende Proteine kodieren. Neben den natürlichen Fluorophoren von trp, tyr und phe, die in vielen Proteinen vorkommen, können andere fluoreszierende Proteinsequenzen inseriert werden. Die GFP-Sequenz oder eine ihrer mutierten Varianten können in die für den Rezeptor kodierende Sequenz inseriert werden. Sequenzen, die für Luziferase und ihre mutierten Varianten kodieren, können ebenfalls inseriert werden. Jede Peptidsequenz, die für ein Fluorophor kodiert oder damit interagiert, kann in diesem Verfahren verwendet werden. Die inserierten Sequenzen können so aufgebaut sein, dass sie fluoreszierende Proteine mit verschiedenen fluoreszierenden Eigenschaften exprimieren, so dass fluoreszierende Signale von jedem unabhängig gemessen werden können.
  • 3. Die inserierten Sequenzen können für Peptide kodieren, die kleine (< 1000 Mr) Liganden mit hoher Affinität (Kd < 10&supmin;&sup9;) und Spezifität binden. Diese kleinen Moleküle bilden dann eine feste Bindung an andere Moleküle oder Makromoleküle, die lumineszierend oder radioaktiv markiert werden können. Die inserierten Sequenzen können so aufgebaut sein, dass sie verschiedene überbrückende Moleküle bilden, welche unterschiedlich markierte Moleküle oder Makromoleküle binden, so dass die Signale von jedem unabhängig gemessen werden können. Das Peptid mit der Sequenz -HHHHHH- bindet ein Metallion (z. B. Ni²&spplus;, Cu²&spplus;, usw.), welches eine feste Brückenbindung mit einem Polydentatessigsäurerest (z. B. Nitriloessigsäure) binden wird. Der Säurerest kann kovalent an Moleküle gekoppelt werden, die lumineszierend, radioaktiv oder auf andere Weise lichtabsorbierend sind. Diese Moleküle können lumineszierende Farbstoffe oder Makromoleküle wie Proteine sein, die eine lumineszierende oder eine radioaktive Markierung enthalten. Andere Beispiele inserierter Peptidsequenzen sind jene, die eine hohe Affinität für andere kleine Moleküle aufweisen, einschließlich Steroidhormonen, Vitaminen und Kohlenhydraten, welche eine feste Brückenbindung mit anderen Molekülen oder Makromolekülen bilden, die lumineszierend oder radioaktiv markiert werden können.
    • Beispiel 7 Ein verallgemeinerter Screen mit hohem Gehalt auf Rezeptor-Internalisierung mit doppelter Markierung
  • Ein modifizierter G-Protein-gekoppelter Rezeptor (GPCR bekannter Funktion oder "Orphan") wird in humane epitheliale Nierenzellen (HEK 293) transfiziert, in denen seine Lokalisierung ein Maß der Internalisierung von der Plasmamembran bereitstellt. Der modifizierte GPCR enthält eine Epitop-Markierung (z. B. FLAG) am N-Terminus (extrazellulär) und ein GFP- Molekül am C-Terminus (intrazellulär). Zur Messung der GPCR-Internalisierung nach der Behandlung mit Liganden werden die Zellen fixiert und mit Hoechst 33342 (ein DNA- bindender Fluoreszenzfarbstoff) und einem unterschiedlichen lumineszierend markierten Antikörper gegen die Epitop-Markierung markiert. Ein Zell-Screening-System wie das erfindungsgemäße Zell-Screening-System, welches Verhältnis-Bilddarstellung verwendet, wird dazu verwendet, die Internalisierung des GPCR aufgrund des Verlusts eines GPCR- Epitops von der externen Seite der Plasmamembran und einer Steigerung des nur mit GFP markierten Rezeptors in der Zelle zu berechnen. Dieser Ansatz zur Messung durch Liganden induzierte Rezeptor-Internalisierung ist von den Internalisierungsmechanismen unabhängig, so dass es deshalb auf einem weiten Bereich von Rezeptoren sowohl bekannter als auch unbekannter Funktion angewandt werden kann.
    • Beispiel 8 Screen mit hohem Gehalt der Translokation von humanem Glukokortikoid- Rezeptor
  • Eine Gruppe von HCS beinhaltet die durch Arzneistoff induzierte dynamische Wiederverteilung intrazellulärer Bestandteile. Der humane Glukokortikoid-Rezeptor (hGR), ein einzelner Sensor in der komplexen Reaktionsmaschinerie der Zelle auf die Umgebung bindet Steroidmoleküle, welche in die Zelle diffundiert sind. Der Ligand-Rezeptor-Komplex transloziert zum Nukleus, wo die transkriptionelle Aktivation stattfindet (Htun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93:4845, 1996).
  • Im Allgemeinen sind Hormonrezeptoren ausgezeichnete Ziele für Arzneistoffe, da ihre Aktivität am Gipfel von Schlüssel-intrazellulären Signalwegen liegt. Deswegen besitzt ein Screen mit hohem Gehalt der hGR-Translokation deutliche Vorteile gegenüber einem in vitro-Ligand-Rezeptor-Bindungstest. Das Vorhandensein zweier oder mehrerer Fluoreszenzkanäle im erfindungsgemäßen Zell-Screening-System ermöglicht den Screen zweier zusätzlicher Parameter auf parallele Weise, wie von anderen Rezeptoren, anderen unterschiedlichen Zielen oder anderen zellulären Vorgängen.
  • Plasmidkonstrukt. Ein eukaryotisches Expressionsplasmid, das eine kodierende Sequenz für eine Chimäre aus grün fluoreszierendem Protein-humanem Glukokortikoid-Rezeptor (GFP-hGR) enthält, wurde mit GFP-Mutanten präpariert (Palm et al., Nat. Struct. Biol. 4:361, 1997). Das Konstrukt wurde dazu verwendet, eine humane Cervix-Karzinom-Zelllinie zu transfizieren (HeLa).
  • Zellpräparation und Transfektion. HeLa-Zellen (ATCC CCL-2) wurde trypsinisiert und 12- 24 Stunden vor der Transfektion in DMEM, das 5% Kohle/Dextran-behandeltes fötales bovines Serum (FBS) (HyClone) und 1% Penicillin-Streptomycin (C-DMEM) enthielt, plattiert und bei 37ºC und 5% CO&sub2; inkubiert. Transfektionen wurden durch Calciumphosphat-Co- Präzipitation (Graham und Van der Eb, Virology 52:456, 1973; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989) oder mit Lipofectamin (Life Technologies, Gaithersburg, MD) durchgeführt. Für die Calciumphosphat-Transfektionen wurde das Medium vor der Transfektion gegen DMEM ausgetauscht, das 5% Kohle/Dextran-behandeltes FBS enthielt. Zellen wurden mit dem Calciumphosphat-DNA-Präzipitat für 4-5 Stunden bei 37ºC und 5% CO&sub2; inkubiert, 3-4-mal mit DMEM zur Entfernung des Präzipitats gewaschen, gefolgt von der Zugabe von C-DMEM.
  • Lipofectamin-Transfektionen wurden in serumfreiem DMEM ohne Antikörper gemäß den Anweisungen des Herstellers (Life Technologies, Gaithersburg, MD) durchgeführt. Nach einer 2-3-stündigen Inkubation mit den DNA-Liposomen-Komplexen wurde das Medium entfernt und durch C-DMEM ersetzt. Alle transfizierten Zellen in 96-Loch-Mikrotiterplatten wurden bei 33ºC und 5% CO&sub2; für 24-48 Stunden vor der Arzneistoffbehandlung inkubiert. Die Experimente wurden mit einem transient in HeLa-Zellen exprimierten Rezeptor durchgeführt.
  • Dexamethason-Induktion der Translokation von GFP-hGR. Um kinetische Daten über die Rezeptor-Ligand-Translokation zu erhalten, wurden die Kerne transfizierter Zellen zuerst mit 5 ug/ml Hoechst 33342 (Molecular Probes) in C-DMEM für 20 Minuten bei 33ºC und 5% CO&sub2; markiert. Die Zellen wurden einmal in Hank's balancierter Salzlösung (HBSS) gefolgt von der Zugabe von 100 nM Dexamethason in HBSS mit 1% Kohle/Dextran-behandeltem FBS gewaschen. Um Daten über die Dexamethason-Titrierung an festgelegten Zeitpunkten zu erhalten, wurden die transfizierten HeLa-Zellen zunächst mit DMEM gewaschen und dann für 1 Stunde in Anwesenheit von 0-1000 nM Dexamethason in DMEM, das 1% Kohle/Dextran-behandeltes FBS enthielt, bei 33ºC und 5% CO&sub2; inkubiert. Die Zellen wurden lebendig analysiert oder sie wurden mit HBSS gespült, für 15 Minuten mit 3,7% Formaldehyd in HBSS fixiert, mit Hoechst 33342 gefärbt und vor der Analyse gewaschen. Das intrazelluläre GFP-hGR-Fluoreszenzsignal wurde durch diese Fixierungsvorgehensweise nicht vermindert.
  • Bildgewinnung und Analyse. Die kinetischen Daten wurden durch Erzeugung von Fluoreszenz-Bildpaaren (GFP-hGR und Hoechst 33342-markierte Kerne) aus Feldern lebender Zellen in 1-Minuten-Intervallen für 30 Minuten nach der Zugabe von Dexamethason erhoben. In ähnlicher Weise wurden Bildpaare von jeder Vertiefung der Screening-Platten zu festgelegten Zeitpunkten 1 Stunde nach der Zugabe von Dexamethason erhalten. In beiden Fällen wurden die zu jedem Zeitpunkt erhaltenen Bildpaare dazu verwendet, nukleäre und cytoplasmatische Bereiche in jeder Zelle zu definieren. Die Translokation von GFP-hGR wurde durch Division der integrierten Fluoreszenzintensität von GFP-hGR im Kern durch die integrierte Fluoreszenzintensität der Chimäre im Cytoplasma oder als eine Kern- Cytoplasma-Differenz der GFP-Fluoreszenz berechnet. In dem Screen mit festgelegten Zeitpunkten wurde dieses Translokationsverhältnis aus Daten berechnet, die aus wenigstens 200 Zellen bei jeder getesteten Dexamethason-Konzentration erhalten wurden. Die durch Arzneistoff induzierte Translokation von GFP-hGR aus dem Cytoplasma in den Nukleus wurde daher mit einer Zunahme des Translokationsverhältnisses korreliert.
  • Ergebnisse. Fig. 20 zeigt schematisch die Translokation vom Cytoplasma 253 in den Nukleus 252 des humanen Glukokortikoid-Rezeptors, die durch Arzneistoff induziert wurde. Das obere Paar der schematischen Diagramme zeigt die Lokalisierung von GFP-hGR innerhalb der Zelle vor 250 (A) und nach 251 (B) Stimulierung mit Dexamethason. Bei diesen experimentellen Bedingungen induziert der Arzneistoff, dass ein großer Teil des cytoplasmatischen GFP-hGR in den Nukleus transloziert. Diese Wiederverteilung wird durch Bestimmung des integrierten Intensitätsverhältnisses der cytoplasmatischen und der Kernfluoreszenz in behandelten 255 und nicht-behandelten 254 Zellen quantifiziert. Das untere Paar an Fluoreszenzdiagrammen zeigt die dynamische Niederverteilung von GFP- hGR in einer Einzelzelle vor 254 und nach 255 Behandlung. HCS wird auf Vertiefungen durchgeführt, die 100 bis Tausende von transfizierten Zellen enthalten und die Translokation wird für jede Zelle in dem Feld quantifiziert, die eine GFP-Fluoreszenz zeigt. Obwohl die Verwendung einer stabil transfizierten Zelllinie die am meisten konsistent markierten Zellen erzeugen würde, störten die heterogenen Konzentrationen an GFP-hGR-Expression, die durch die transiente Transfektion induziert wurden, die erfindungsgemäße Analyse durch das Zell-Screening-System nicht.
  • Zur Ausführung des Screens scannt das Zell-Screening-System jede Vertiefung der Platte, macht ein Bild der Zellpopulation in jeder Vertiefung und analysiert die Zellen individuell. Hier werden zur Definition der Cytoplasma- und Kernverteilung von GFP-hGR innerhalb jeder Zelle zwei Fluoreszenzkanäle verwendet. In Fig. 21 ist die graphische Benutzerschnittstelle des Zell-Screening-Systems am Ende eines GFP-hGR-Screens dargestellt. Die Benutzerschnittstelle zeigt die parallele Datengewinnung und die Analysefähigkeit des Systems. Die Fenster, die mit Kern 261 und GFP-hGR 262 bezeichnet sind, zeigen die Fluoreszenz-Bildpaare, die in einem einzelnen Feld erhalten und analysiert werden. Das mit Farbüberlagerung 260 markierte Fenster wird durch Pseudofarbgebung der oben genannten Bilder und deren Überlagerung erhalten, so dass der Benutzer unmittelbar Veränderungen in der Zelle identifizieren kann. Innerhalb des mit "gelagerte Objektbereiche" bezeichneten Fensters 265 wird ein Bild, welches jede analysierte Zelle und ihre Nachbarn enthält, präsentiert. Weiterhin werden die HCS-Ergebnisse, wenn sie erhoben werden, analysiert, in diesem Fall auf GFP-hGR-Translokation, und in eine unmittelbare Treffer-Reaktion übersetzt. Die in dem unteren Fenster des Screens 267 gezeigte 96-Loch-Platte zeigt, welche Vertiefungen die benutzerdefinierten Screening-Anforderungen getroffen haben. Eine weiß gefärbte Vertiefung 269 zeigt z. B., dass die durch Arzneistoff induzierte Translokation einen vorbestimmten Schwellenwert von 50% überschritten hat. Andererseits zeigt eine schwarz gefärbte Vertiefung 270, dass der getestete Arzneistoff weniger als 10% Translokation induzierte. Grau gefärbte Vertiefungen 268 zeigen Treffer an, in denen der Translokationswert zwischen 10% und 50% lag. Die Reihe "E" auf der analysierten 96-Loch- Platte 266 zeigt eine Titration mit einem Arzneistoff, von dem man weiß, dass er GFP-hGR- Translokation aktiviert, nämlich Dexamethason. Dieser beispielhafte Screen benützte nur zwei Fluoreszenzkanäle. Zwei zusätzliche Kanäle (Kanäle 3 263 und 4 264) sind für die parallele Analyse anderer spezifischer Ziele, Zellprozesse oder Cytotoxizität zur Erzeugung von Screens für multiple Parameter erhältlich.
  • Es besteht eine Verbindung zwischen der Bilddatenbank und der Informationsdatenbank, die während des Validierungsprozesses neuer Screens ein wichtiges Werkzeug darstellt. Nach Abschluss eines Screens hat der Benutzer vollständigen Zugang zu den Bilddaten und den berechneten Daten (Fig. 22). Das umfangreiche Datenanalyseprogramm des Zell- Screening-Systems ermöglicht es dem Benutzer, HCS-Daten auf verschiedenen Stufen zu untersuchen. Die Bilder 276 und die ausführlichen Daten in einer Tabelle 279 von einzelnen Zellen können getrennt angeschaut werden oder es können zusammengefasste Daten aufgetragen werden. Die berechneten Ergebnisse eines einzelnen Parameters für jede Zelle in einer 96-Loch-Platte sind z. B. in der Darstellung gezeigt, die als Diagramm 1 bezeichnet ist 275. Durch Auswahl eines einzelnen Punkts in dem Diagramm kann der Benutzer den gesamten Datensatz für eine bestimmte Zelle anzeigen, die aus einer bestehenden Datenbank abgerufen wird. Hier werden das Bildpaar 276 und ausführliche Fluoreszenz- und morphometrische Daten einer einzelnen Zelle (Zell Nr. 118, graue Linie 277) gezeigt. Das große graphische Insert 278 zeigt die Ergebnisse der Dexamethason-Konzentration auf die Translokation von GFP-hGR. Jeder Punkt ist der Durchschnitt von Daten von wenigstens 200 Zellen. Der kalkulierte EC&sub5;&sub0;-Wert für Dexamethason in diesem Assay beträgt 2 nM.
  • Ein wichtiger Aspekt des HCS mit dem Zell-Screening-System liegt in der Fähigkeit zu kinetischen Messungen unter Verwendung von mehrfarbigen Fluoreszenzen und morphometrischen Parametern in lebenden Zellen. Es können zeitliche und räumliche Messungen einer Einzelzelle innerhalb einer Population von Zellen in einem Feld gemacht werden. Fig. 23 zeigt kinetische Daten für die durch Dexamethason induzierte Translokation von GFP-hGR in einigen Zellen innerhalb eines einzelnen Felds. Humane HeLa-Zellen, die mit GFP-hGR transfiziert wurden, wurden mit 100 nM Dexamethason behandelt und die Translokation von GFP-hGR wurde über die Zeit in einer Population von Einzelzellen gemessen. Das Diagramm zeigt die Reaktion der transfizierten Zellen 285, 286, 287 und 288 und der nicht-transfizierten Zellen 289. Diese Ergebnisse veranschaulichen auch die Fähigkeit zur Analyse von Zellen mit verschiedenen Expressionshöhen.
    • Beispiel 9 Screen mit hohem Gehalt der durch Arzneistoff induzierten Apoptose
  • Apoptose ist ein komplexes zelluläres Programm, an dem eine Myriade von molekularen Ereignissen und Signalwegen beteiligt ist. Um die Mechanismen der Wirkweise von Arzneistoffen auf diesem Vorgang verstehen zu können, ist es essentiell, so viele dieser Ereignisse wie möglich innerhalb Zellen, wenn möglich mit zeitlicher und räumlicher Auflösung, zu messen. Somit wäre ein Screen für Apoptose, der nur eine geringe Zellprobenpräparation benötigt, aber gleichzeitig einen automatischen "Read-out" einiger mit Apoptose verbundener Parameter bietet, ideal. Ein auf Zellen basierter Test, der für das Zell-Screening-System entworfen wurde, wurde dazu verwendet, gleichzeitig einige der morphologischen, Organell-spezifischen und makromolekularen Kennzeichen der durch Paclitaxel-induzierten Apoptose zu quantifizieren.
  • Zellpräparation. Für diese Untersuchung wurden Maus-Bindegewebs-Fibroblasten (L- 929; ATCC CCL-1) und eine hoch-invasive Glioblastom-Zelllinie (SNB-19; ATCC CRL-2219) (Welch et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. 31:610, 1995) ausgewählt. Am Tag vor der Behandlung mit einem die Apoptose induzierenden Arzneistoff wurden 3500 Zellen in jede Vertiefung einer 96-Loch-Platte ausplattiert und über Nacht bei 37ºC in einer feuchten 5%-CO&sub2;- Atmosphäre inkubiert. Am folgenden Tag wurde das Kulturmedium aus jeder Vertiefung entfernt und mit frischem Medium ersetzt, das verschiedenen Konzentrationen von Paclitaxel (0-50 uM) aus einem in DMSO angefertigen 20-mM-Vorrat enthielt. Die maximale Konzentration an DMSO, die in diesen Experimenten verwendet wurde, betrug 0,25%. Die Zellen wurden dann für 26 Stunden wie vorstehend beschrieben inkubiert. Am Ende der Paclitaxel-Behandlungszeit erhielt jede Vertiefung frisches Medium, das 750 nM Mito Tracker® Red (Molecular Probes; Eugene, OR) und 3 ug/ml Hoechst 33342-DNA-bindenden Farbstoff (Molecular Probes) enthielt, und wurde wie vorstehend genannt für 20 Minuten inkubiert. Jede Vertiefung der Platte wurde dann mit HBSS gewaschen und mit 3,7% Formaldehyd in HBSS für 15 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Das Formaldehyd wurde mit HBSS ausgewaschen und die Zellen wurden für 90 Sekunden mit 0,5% (vlv) Triton X- 100 permeabilisiert, mit HBSS gewaschen, mit 2 U ml&supmin;¹ Bodipy FL-Phallacidin (Molecular Probes) für 30 Minuten inkubiert und mit HBSS gewaschen. Die Vertiefungen auf der Platte wurden dann mit 200 ul HBSS gefüllt, versiegelt und die Platte bei 4ºC wenn nötig gelagert. Die Fluoreszenzsignale von auf diese Weise gelagerten Platten waren für wenigstens 2 Wochen nach der Präparation stabil. Wie auch schon in Kern-Tranalokations-Assays können Fluoreszenzreagenzien so behandelt werden, um diesen Assay in einen Screen mit hohem Gehalt von lebenden Zellen umzuwandeln.
  • Bildgewinnung und Analyse auf dem ArrayScan® System. Die Fluoreszenzintensität des intrazellulären MitoTracker® Red, Hoechst 33342 und Bodipy FL-Phallacidin wurde wie vorstehend beschrieben mit dem Zell-Screeening-System gemessen. Morphometrische Daten von jedem Bildpaar, das von jeder Vertiefung erhalten wurde, wurden ebenfalls erhoben, um jedes Objekt im Bildbereich (z. B. Zellen und Kerne) nachzuweisen und um dessen Größe, Form und integrierte Intensität zu berechnen.
  • Berechnungen und Output Pro Bildbereich wurde eine Gesamtmenge von 50-250 Zellen gemessen. Für jedes Zellfeld wurden die folgenden Berechnungen durchgeführt: (1) Der durchschnittliche Kernbereich (um²) wurde durch Division des gesamten Kernbereichs in einem Feld durch die Anzahl nachgewiesener Kerne berechnet. (2) Der durchschnittliche Kern-Umfang (um) wurde durch Division der Summe der Durchmesser aller Kerne in einem Feld durch die Anzahl der in diesem Feld nachgewiesenen Kerne berechnet. Stark aufgequollene apoptotische Kerne besaßen die größten Kerndurchmesserwerte. (3) Die durchschnittliche Kernhelligkeit wurde durch Division der integrierten Intensität des gesamten Kernfelds durch die Anzahl der Kerne in diesem Feld berechnet. Eine Zunahme der Kernhelligkeit wurde mit gesteigertem DNA-Gehalt korreliert. (4) Die durchschnittliche zelluläre Helligkeit wurde durch Division der integrierten Intensität eines gesamten Felds an Zellen, die mit MitoTracker®-Farbstoff gefärbt wurden, durch die Anzahl an Kernen in diesem Feld berechnet. Da die Menge an MitoTracker®-Farbstoff, die sich innerhalb der Mitochondrien anlagert, proportional zum mitochondrialen Potential ist, ist eine Zunahme der durchschnittlichen Zellhelligkeit konsistent mit einer Zunahme des mitochondrialen Potentials. (5) Die durchschnittliche zelluläre Helligkeit wurde auch durch Division der integrierten Intensität eines Gesamtfelds an Zellen, die mit dem Farbstoff Bodipy FL- Phallacidin gefärbt wurden, durch die Anzahl an Kernen in diesem Feld berechnet. Da die Phallotoxine mit hoher Affinität an die polymerisierte Form von Actin binden, ist die Menge an Bodipy FL-Phallacidin-Farbstoff, die sich innerhalb der Zelle anlagert, proportional zum Zustand der Actin-Polymerisation. Eine Zunahme der durchschnittlichen Zellhelligkeit ist mit einer Zunähme der Actin-Polymerisation konsistent.
  • Ergebnisse. Fig. 24 (obere Reihe) zeigt die Veränderung, die durch Paclitaxel in der Kernmorphologie von L-929-Zellen induziert wurde. Zunehmende Mengen von Paclitaxel führten dazu, dass sich die Kerne vergrößern und fragmentieren 293, ein Kennzeichen für Apoptose. Die quantitative Analyse dieser und anderer Bilder, die durch das Zell-Screening- System erhalten wurden, ist in der gleichen Abbildung dargestellt. Jeder gemessene Parameter zeigte, dass die L-929-Zellen 296 gegenüber niedrigen Konzentrationen am Paclitaxel weniger sensitiv als SNB-19-Zellen 297 waren. Bei höheren Konzentrationen zeigten die L-929-Zellen für jeden gemessenen Parameter eine Reaktion. Der Ansatz mit vielen Parametern dieses Tests ist nützlich, um die Mechanismen der Arzneistoffwirkung aufzutrennen. So erreicht z. B. der Bereich, die Helligkeit und die Fragmentation des Nukleus 298 und die Werte der Actin-Polymerisation 294 einen maximalen Wert, wenn die SNB-19- Zellen mit 10 nM Paclitaxel (Fig. 24; untere und obere Diagramme) behandelt wurden. Das mitochondriale Potential 295 war jedoch bei der gleichen Konzentration von Paclitaxel minimal (Fig. 24; mittleres Diagramm). Die Tatsache, dass alle gemessenen Parameter bei zunehmenden Paclitaxel-Konzentrationen (> 10 nM) Kontrollkonzentrationen erreichten, legt nahe, dass SNB-19-Zellen metabolische oder sonstige Reinigungssignalwege für Arzneistoffe mit geringer Affinität aufweisen, die bei ausreichend hohen Konzentrationen des Arzneistoffs kompensatorisch wirken. Im Gegensatz zur Arzneistoffsensitivität von SNB-19- Zellen 297 zeigten L-929-Zellen eine unterschiedliche Reaktion auf Paclitaxel 296. Diese fibroblastischen Zellen zeigten bei 5 uM Paclitaxel, einer 500fach höheren Dosis als bei SNB-19-Zellen, eine maximale Antwort bei vielen Parametern. Weiterhin zeigten die L-929- Zellen bei keiner der getesteten Paclitaxel-Konzentrationen einen starken Rückgang des mitochondrischen Potentials 295. Dieses Ergebnis stimmt mit der Anwesenheit einzigartiger Apoptose-Signalwege zwischen einer normalen und einer Krebszelllinie überein. Daher zeigen diese Ergebnisse, dass ein relativ einfaches Fluoreszenzmarkierungsprotokoll mit dem erfindungsgemäßen Zell-Screening-System gekoppelt werden kann, um einen Screen mit hohem Gehalt für Schlüsselereignisse, die an programmiertem Zelltod beteiligt sind, zu erzeugen.
    • Beispiel 10 Durch eine Protease induzierte Translokation eines Signalenzyms, das eine Krankheits-assoziierte Sequenz enthält, vom Cytoplasma in den Kern
  • Plasmidkonstrukt. Ein eukaryotisches Expressionsplasmid, welches eine kodierende Sequenz für eine Chimäre aus grün fluoreszierendem Protein und Caspase (Cohen, 1997, Biochemical J. 326:1-16; Liang et al., 1997, J. of. Molec. Biol. 274:291-302) enthält, wird mit GFP-Mutanten präpariert, das Konstrukt wird zur Transfektion eukaryotischer Zellen verwendet.
  • Zellpräparation und Transfektion. Zellen werden trypsinisiert und 24 Stunden vor der Transfektion plattiert und bei 37ºC und 5% CO&sub2; inkubiert. Die Transfektionen werden durch Verfahren wie Calciumphosphat-Co-Präzipitation oder Lipofektion durchgeführt, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Zellen werden mit dem Calciumphosphat-DNA-Präzipitat für 4-5 Stunden bei 37ºC und 5% CO&sub2; inkubiert, 3-4-mal mit DMEM zur Entfernung des Präzipitats gewaschen, gefolgt von der Zugabe von C-DMEM. Lipofectamin-Transfektionen werden in serumfreiem DMEM ohne Antibiotika gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Nach einer 2-3-stündigen Inkubation mit den DNA-Liposomen-Komplexen wird das Medium entfernt und gegen C-DMEM ausgetauscht.
  • Induktion der Translokation des Caspase-GFP durch Apoptosa. Um kinetische Daten über die Caspase-GFP-Translokation zu erhalten, werden Kerne transfizierter Zellen zuerst mit 5 ug/ml Hoechst 33342 (Molecular Probes) in C-DMEM für 20 Minuten bei 37ºC und 5% CO&sub2; markiert. Die Zellen werden einmal in Hank's balancierter Salzlösung (HBSS) gewaschen, gefolgt von der Zugabe von Verbindungen, die Apoptose induzieren. Diese Verbindungen schließen Paclitaxel, Staurosporin, Ceramid und Tumornekrosefaktor ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Um Titrationsdaten zu festgelegten Zeitpunkten zu erhalten, werden transfizierte Zellen zuerst mit DMEM gewaschen und dann bei 37ºC und 5% CO&sub2; für 1 Stunde in Gegenwart von 0-1000 nM Verbindung in DMEM inkubiert. Die Zellen werden lebend analysiert oder mit HBSS gespült, für 15 Minuten mit 3,7% Formaldehyd in HBSS fixiert, mit Hoechst 33342 gefärbt und vor der Analyse gewaschen.
  • Bildgewinnung und Analyse. Kinetische Daten werden durch Gewinnung von Fluoreszenz-Bildpaaren (Caspase-GFP und Hoechst 33342-markierte Kerne) aus Feldern lebender Zellen in 1-Minuten-Intervallen für 30 Minuten nach der Zugabe der Verbindung erhoben. In ähnlicher Weise werden Bildpaare von jeder Vertiefung der Screening-Platten zu festgelegten Zeitpunkten 1 Stunde nach der Zugabe von Verbindung erhoben. In beiden Fällen werden die zu jedem Zeitpunkt erhobenen Bildpaare dazu verwendet, nukleäre und cytoplasmatische Bereiche in jeder Zelle zu definieren. Die Translokation von Caspase-GFP wird durch Division der integrierten Fluoreszenzintensität des Caspase-GFP in den Kern durch die integrierte Fluoreszenzintensität der Chimäre im Cytoplasma oder als ein Unterschied der GFP-Fluoreszenz zwischen Kern und Cytoplasma berechnet. In dem Screen zu festgelegten Zeitpunkten wird dieses Translokationsverhältnis aus Daten berechnet, die von wenigstens 200 Zellen an jeder getesteten Konzentration der Verbindung berechnet wurden. Die durch Arzneistoff induzierte Translokation von Caspase-GFP aus dem Cytoplasma in den Nukleus wird daher mit einer Zunahme des Translokationsverhältnisses in Verbindung gebracht. Molekulare Wechselwirkungs- Bibliotheken, die mögliche Aktivatoren oder Inhibitoren von durch Apoptose aktivierten Enzymen umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind, werden dazu verwendet, die Indikator-Zelllinien zu screenen und einen spezifischen Liganden für das DAS zu identifizieren und einen Signalweg, der durch die Verbindungsaktivität aktiviert wurde.
    • Beispiel 11 Identifizierung neuer Steroid-Rezeptoren für DAS
  • Um sich diese Ausführungsform zunutze zu machen, sind zwei Quellen von Material und/oder Information nötig, die die Auswertung der Funktion eines nicht-charakterisierten Gens ermöglichen. Zuerst können Krankheits-assoziierte Sequenzbanken, die cDNA- Sequenzen enthalten, die zur Transfektion in Säugerzellen geeignet sind, verwendet werden. Da jedes RADE- oder differenzielle Expressionsexperiment bis zu einigen Hunderten Sequenzen erzeugt, ist es möglich, einen großen Vorrat an DAS zu erzeugen. Weiterhin kann Information aus primären Sequenzdatenbanksuchen dazu verwendet werden, DAS in große Kategorien einzuteilen, einschließlich Signalsequenzen, sieben Transmembran-Motiven, konservierten Protease-Domänen oder anderen identifizierbaren Motiven, sind aber nicht darauf beschränkt. Basierend auf der aus diesen Quellen erhaltenen Information können Algorithmentypen und zu transfizierende Indikator-Zelllinien ausgewählt werden. Eine große Anzahl an Motiven ist bereits charakterisiert und in den linearen Sequenzen kodiert, die in den großen Anzahl von Genen, die in existierenden genomischen Datenbanken vorliegen, enthalten sind.
  • In einer Ausführungsform werden die folgenden Schritte vorgenommen:
  • 1) Information aus dem DAS-Identifizierungsexperiment (einschließlich Datenbanksuchen) wird als Basis zur Auswahl der relevanten biologischen Prozesse verwendet (z. B. Untersuchung des DAS einer Tumorzelllinie im Hinblick auf Zellzyklusmodulation, Apoptose, metastatischen Proteasen, usw.).
  • 2) Sortieren von DNA-Sequenzen oder DAS anhand identifizierbarer Motive (d. h. Signalsequenzen, 7-Transmembrandomänen, konservierte Domänen aktiver Protease- Stellen, usw.). Diese anfängliche Gruppierung führt zur Bestimmung von Strategien zur Fluoreszenzmarkierung, zu Wirtszelllinien, zu Indikator-Zelllinien, zu untersuchenden Banken bioaktiver Moleküle, wie vorstehend beschrieben.
  • 3) Ligation von DAS in einem zu diesem Zweck geeigneten Expressionsvektor unter Verwendung etablierter molekularbiologischer Verfahren. Generalisierte Expressionsvektoren enthalten Promotoren, Enhancer und Terminatoren, um Zielsequenzen in eine Zelle zur transienten Expression zu bringen. Solche Vektoren können ebenfalls Antikörper-Markierungssequenzen, direkte Assozierungssequenzen, Chromophor- Fusionssequenzen wie GFP enthalten, um den Nachweis nach Expression durch die Wirtszelle zu erleichtern.
  • 4) Transiente Transfektion von Zellen mit Vektoren, die DAS enthalten, mit Standard- Transfektionsprotokolle einschließlich: Calciumphosphat-Co-Präzipitation, Liposom- Transfektion, DEAE-Dextran, Polykation, viral oder Elektroporation und Plattierung in Mikrotiterplatte oder Mikrovertiefungsanordnungen. Alternativ kann die Transfektion direkt in der Mikrotiterplatte durchgeführt werden.
  • 5) Durchführung der vorstehend beschriebenen Verfahren zum Zell-Screening.
  • In dieser Ausführungsform wird eine DAS, von der gezeigt wurde, dass sie ein Motiv besitzt, welches ein Transfektions-aktivierendes Potential nahe legt (z. B. DNA-bindende Domäne, Amino-terminale modulierende Domäne oder eine Carboxy-terminale Liganden-bindende Domäne) dazu verwendet, neue Steroid-Rezeptoren zu identifizieren.
  • Die Definition der Fluoreszenzmarkierung für dieses Experiment beinhaltet die Identifizierung des Kerns durch Färbung und Markierung der DAS durch Erzeugung einer GFP-Chimäre über Insertion des DAS in einen Expressionsvektor, in dem sie proximal an das für GFP kodierende Gen fusioniert ist. Alternativ könnte ein einzelkettiges Antikörperfragment mit hoher Affinität für einen Teil der exprimierten DAS anhand Verfahren aus dem Stand der Technik (Cambridge Antibody Technologies) konstruiert und an ein Fluorophor (FITC) gekoppelt werden, um den möglichen transkriptionellen Aktivator/Rezeptor in den Zellen zu markieren. Diese Alternative würde eine externe Markierung bereitstellen, die keine DNA- Transfektion erfordert, und wäre deshalb nützlich, wenn die Verteilungsdaten aus den ursprünglichen primären Kulturen erhalten werden sollen, die zur Generierung der DAS verwendet wurden.
  • Plasmidkonstrukt. Ein eukaryotisches Expressionsplasmid, das eine Sequenz enthält, die für eine Chimäre aus grün fluoreszierendem Protein-DAS kodiert, wird mit GFP-Mutanten präpariert. Das Konstrukt wird zur Transfektion von HeLa-Zellen verwendet. Das Plasmid produziert, wenn es in die Wirtszelle transfiziert ist, ein an das DAS-Proteinprodukt fusioniertes GFP, welches als GFP-DASpp bezeichnet wird.
  • Zellpräparation und Transfektion. HeLa-Zellen werden trypsinisiert und unter Verwendung von DMEM, das 5% Kohle/Dextran-behandeltes fötales bovines Serum (FBS) (HighClone) und 1% Penicillin/Streptomycin (C-DMEM) enthält, 12-24 Stunden vor der Transfektion plattiert und bei 37ºC und 5% CO&sub2; inkubiert. Transfektionen werden anhand Calciumphosphat-Co-Präzipitation oder mit Lipofectamin (Life Technologies) durchgeführt. Für die Calciumphosphat-Transfektion wird das Medium vor der Transfektion gegen DMEM ausgetauscht, das 5% Kohle/Dextran-behandeltes FBS enthält. Düe Zellen werden mit dem Calciumphosphat-DNA-Präzipitat für 4-5 Stunden bei 37ºC und 5% CO&sub2; inkubiert, 3-4-mal mit DMEM zur Entfernung des Präzipitats gewaschen, gefolgt von der Zugabe von C-DMEM. Lipofectamin-Transfektionen werden ohne Antibiotika gemäß den Anweisungen des Herstellers in serumfreiem DMEM durchgeführt. Nach einer 2-3-stündigen Inkubation mit den DNA-Liposomen-Komplexen wird das Medium entfernt und gegen C-DMEM ausgetauscht. Alle transfizierten Zellen in 96-Loch-Mikrotiterplatten werden bei 33ºC und 5% CO&sub2; für 24-48 Stunden vor der Arzneistoffbehandlung inkubiert. Die Experimente werden mit einem transient in HeLa-Zellen exprimierten Rezeptor durchgeführt.
  • Lokalisation von exprimiertem GFP-DASpp in Zellen. Um zelluläre Verteilungsdaten zu erhalten, werden Kerne transfizierter Zellen zuerst mit 5 ug/ml Hoechst 33342 (Molecular Probes) in C-DMEM für 20 Minuten bei 33ºC und 5% CO&sub2; markiert. Die Zellen werden einmal in Hank's balancierter Salzlösung (HBSS) gewaschen. Die Zellen werden lebend analysiert oder mit HBSS gespült, für 15 Minuten mit 3,7% Formaldehyd in HBSS fixiert, mit Hoechst 33342 gefärbt und vor der Analyse gewaschen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Bildgewinnung und die Analyse mit dem erfindungsgemäßen Zell-Screening-System durchgeführt. Das intrazelluläre GFP-DASpp- Fluoreszenzsignal wird durch Gewinnung von Fluoreszenz-Bildpaaren (GFP-DASpp und Hoechst 33342-markierte Kerne) aus Zellfeldern erhoben. Die zu jedem Zeitpunkt erhaltenen Bildpaare werden dazu verwendet, Kern- und cytoplasmatische Bereiche in jeder Zelle zu definieren. Daten, die ein verteiltes Signal im Cytoplasma zeigen, wären mit bekannten Steroid-Rezeptoren konsistent, die Aktivatoren der DNA-Transkription sind.
  • Screening für die Induktion der Translokation von GFP DASpp. Unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Konstrukts, dessen geeignete Expression des GFP-DASpp bestätigt wurde als eine Indikator-Zelllinie, wird ein Screen verschiedener Liganden mit einer Reihe von Steroid-Typ-Liganden durchgeführt, die Östrogen, Progesteron, Retinoide, Wachstumsfaktoren, Androgene und viele andere Steroide und auf Steroid basierende Moleküle einschließt, aber nicht darauf beschränkt ist. Die Bildgewinnung und die Analyse werden mit dem erfindungsgemäßen Zell-Screening-System durchgeführt. Das intrazelluläre GFP-DASpp-Fluoreszenzsignal wird durch Gewinnung von Fluoreszenz-Bildpaaren (GFP- DASpp und Hoechst 33342-markierte Kerne) aus Zellfeldern gewonnen. Die zu jedem Zeitpunkt erhaltenen Bildpaare werden dazu verwendet, in jeder Zelle Kern- und cytoplasmatische Bereiche zu definieren. Die Translokation von GFP-DASpp wird durch Division der integrierten Fluoreszenzintensität des GFP-DASpp im Nukleus durch die integrierte Fluoreszenzintensität der Chimäre im Cytoplasma oder als ein Unterschied der GFP-Fluoreszenz im Kern und im Cytoplasma berechnet. Eine Translokation aus dem Cytoplasma in den Kern zeigt eine Aktivierung der Liganden-Bindung des DASpp an, wodurch die mögliche Rezeptorklasse und Wirkweise identifiziert wird. Die Kombination dieser Daten mit anderen Daten, die auf ähnliche Weise mit bekannten Inhibitoren und Modifikatoren von Steroid-Rezeptoren erhalten wurde, würde entweder DASpp als Ziel validieren oder aus verschiedenen Quellen würden mehr Daten erzeugt werden.
    • Beispiel 12 Zusätzliche Screens Translokation zwischen der Plasmamembran und dem Cytoplasma:
  • Profilactin-Komplex-Dissoziation und Bindung von Profilin an die Plasmamembran. In einer Ausführungsform wird ein fluoreszierender Protein-Biosensoir der Bindung von Profilin an die Membran durch die Markierung von aufgereinigtem Profilin präpariert (Federov et al. 1994, J. Molec. Biol. 241:480-482; Lanbrechts et al., 1995, Eur. J. Biochem. 230:281-286); mit einer Sonde, die eine Lebenszeit der Fluoreszenz im Bereich von 2-300 ns besitzt. Das markierte Profilin wird in lebende Indikatorzellen mit einem Massenbeladungsverfahren eingebracht und die Indikatorzellen werden mit Testverbindungen behandelt. Fluoreszenz- Anisotropie bildgebende Mikroskopie (Gough und Taylor, 1993, J. Cell Biol. 121:1095-1107) wird dazu verwendet, die von der Testverbindung abhängige Bewegung des fluoreszierenden Derivats des Profilins zwischen dem Cytoplasma und der Membran für eine Zeitspanne nach der Behandlung im Bereich von 0,1 Sekunden mit 10 Stunden zu messen.
  • Translokation des Rho-RhoGDI-Komplex zur Membran. In einer anderen Ausführungsform werden Indikatorzellen mit Testverbindungen behandelt und dann fixiert, gewaschen und permeabilisiert. Die Zellplasmamembran des Indikators, das Cytoplasma und der Nukleus werden alle mit unterschiedlich markierten Markern markiert, gefolgt von der Immun-Lokalisation des Rho-Proteins (Self et al., 1995, Methods in Enzymology 256:3- 10; Tanaka et al., 1995, Methods in Enzymology 256:41-49) mit Antikörpern, die mit einer vierten Farbe markiert sind. Jede der vier Markierungen wird separat mit dem Zell- Screening-System photographiert und die Bilder werden dazu verwendet, die Menge an Hemmung oder Aktivierung der Translokation zu berechnen, die durch die Testverbindung ausgelöst wurde. Für diese Berechnung werden die Bilder der Sonden, die zur Markierung der Plasmamembran und des Cytoplasma verwendet wurden, dazu verwendet, das Bild der immunologischen Sonde zu markieren, die die Lokalisation des intrazellulären Rho-Proteins markiert. Die integrierte Helligkeit pro Bereichseinheit unter jeder Maske wird dazu verwendet, einen Translokationsquotienten durch Division der integrierten Helligkeit der Plasmamembran/Bereich durch die integrierte Helligkeit des Cytoplasma/Bereich zu bilden. Durch Vergleich der Translokationsquotientenwerte zwischen Kontroll- und Testvertiefungen wird die prozentuale Translokation für jede potentielle Leitverbindung berechnet.
    • Translokation von &beta;-Arrestin in die Plasmamembran nach Aktivierung des G-Protein- Rezeptors.
  • In einer anderen Ausführungsform eines Screens mit hohem Gehalt der Translokation von Cytoplasma zur Membran wird die Translokation des &beta;-Arrestin-Proteins aus dem Cytoplasma in die Plasmamembran als Reaktion auf Behandlung der Zellen gemessen. Zur Messung der Translokation werden lebende Indikator-Zellen, die lumineszierende Domänen- Marker enthalten, mit Testverbindungen behandelt und die Bewegung des &beta;-Arrestin- Markers wird sowohl zeitlich als auch räumlich mit dem erfindungsgemäßen Zell-Screening- System gemessen. In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Indikator-Zellen lumineszierende Marker bestehend aus einem grün fluoreszierenden Protein-&beta;-Arrestin- (GFP-&beta;-Arrestin) Protein-Chimäre (Barak et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:27497-27500; Daaka et al., 1998, J. Biol. Chem. 273:685-688), die durch die Indikator-Zellen durch die Verwendung transienter oder stabiler Zelltransfektion und anderer Reporter, die zur Markierung cytoplasmatischer und Membran-Domänen verwendet werden, exprimiert wird. Wenn sich die Indikator-Zellen im Ruhezustand befinden, teilen sich die Domänen- Markermoleküle hauptsächlich zwischen der Plasmamembran oder dem Cytoplasma auf. In dem Screen mit hohem Gehalt werden diese Marker dazu verwendet, das Zellcytoplasma und die Plasmamembran in unterschiedlichen Fluoreszenzkanälen darzustellen. Wenn die Indikator-Zellen mit einer Testverbindung behandelt werden, dann wird die dynamische Neuverteilung des GFP-&beta;-Arrestins als eine Reihe von Bildern über einen Zeitraum im Bereich von 0,1 Sekunden bis 10 Stunden aufgezeichnet. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zeitspanne 1 Stunde. Jedes Bild wird anhand eines Verfahrens analysiert, welches die Bewegung der GFP-&beta;-Arrestin-Protein-Chimäre zwischen der Plasmamembran und dem Cytoplasma quantifiziert. Um diese Berechnung durchzuführen, werden die Bilder der Sonden, die zur Markierung der Plasmamembran und des Cytoplasmas verwendet werden, dazu verwendet, das Bild der GFP-&beta;-Arrestin-Sonde, das die Position des intrazellulären GFP-&beta;-Arrestin-Proteins markiert, zu maskieren. Die integrierte Helligkeit pro Bereichseinheit unter jeder Maske wird dazu verwendet, einen Translokationquotienten durch Teilen der integrierten Helligkeit der Plasmamembran pro Bereich durch die integrierte Helligkeit des Cytoplasmas pro Bereich zu bilden. Durch Vergleich der Translokationsquotientwerte zwischen Kontroll- und Testvertiefungen wird der Prozentsatz an Translokation für jede potentielle Leitverbindung berechnet. Der Output des Screens mit hohem Gehalt bringt quantitative Daten, die die Stärke der Translokation iri einer großen Zahl von individuellen Zellen beschreibt, die mit interessierenden Testverbindungen behandelt wurden, miteinander in Bezug.
    • Translokation zwischen dem endoplasmatischen Reticulum und dem Golgi:
  • In einer Ausführungsform eines Screens mit hohem Gehalt der Translokation von endoplasmatischem Reticulum zum Golgi wird die Translokation eines VSVG-Proteins des ts045-mutierten Stamms des vesikulären Stomatitisvirus (Ellenberg et al., 1997, J. Cell Biol. 138:1193-1206; Presley et al., 1997, Nature 389:81-85) aus dem endoplasmatischen Reticulum zur Golgi-Domäne in Reaktion auf Zellbehandlung gemessen. Zur Messung der Translokation werden Indikator-Zellen, die lumineszierende Reporter enthalten, mit Testverbindungen behandelt und die Bewegung der Reporter wird mit dem erfindungsgemäßen Zell-Screening-System räumlich und zeitlich gemessen. Die Indikator- Zellen enthalten lumineszierende Reporter, die aus einer GFP-VSVG-Protein-Chimäre bestehen, die durch die Verwendung transienter oder stabiler Zelltransfektion durch die Indikator-Zelle exprimiert wird, und aus anderen Domänen-Markern, die zur Messung der Lokalisierung des endoplasmatischen Retikulums und der Golgi-Domänen verwendet werden. Wenn die Indikator-Zellen bei 40ºC im Ruhezustand sind, dann teilen sich die GFP- VSVG-Protein-Chimären-Moleküle hauptsächlich im endoplasmatischen Reticulum auf. In diesem Screen mit hohem Gehalt werden Domänen-Marker unterschiedlicher Farben dazu verwendet, das endoplasmatische Retikulum und die Golgi-Domänen in unterschiedlichen Fluoreszenzkanälen zu bezeichnen. Wenn die Indikator-Zellen mit einer Testverbindung behandelt und die Temperatur gleichzeitig auf 32ºC erniedrigt wird, dann wird die dynamische Wiederverteilung der GFP-VSVG-Protein-Chimäre als eine Reihe von Bildern über einen Zeitraum im Bereich von 0,1 Sekunden bis 10 Stunden aufgezeichnet. Jedes Bild wird mit einem Verfahren analysiert, welche die Bewegung der GFP-VSVG-Protein-Chimäre zwischen dem endoplasmatischen Reticulum und den Golgi-Domänen quantifiziert. Zur Ausführung dieser Berechnung werden die Bilder von Sonden, die zur Markierung des endoplasmatischen Reticulums und der Golgi-Domänen verwendet wurden, dazu verwendet, das Bild der GFP-VSVG-Sonde zu maskieren, die die Lokalisierung des intrazellulären GFP- VSVG-Proteins markiert. Die integrierte Helligkeit pro Bereichseinheit unter jeder Maske wird dazu verwendet, einen Tanslokationsquotienten durch Division der integrierten Helligkeit des endoplasmatischen Reticulums pro Bereich durch die integrierte Helligkeit des Golgi pro Bereich zu bilden. Durch Vergleich der Translokationsquotientenwerte zwischen Kontroll- und Testvertiefungen wird der Prozentsatz an Translokation für jede mögliche Leitverbindung berechnet. Der Output des Screens mit hohem Gehalt bringt quantitative Daten, die die Höhe der Translokation innerhalb einer großen Anzahl individueller Zellen beschreibt, die mit interessierenden Testverbindungen in Endkonzentrationen in Bereichen von 10&supmin;¹² M bis 10&supmin;³ M für einen Zeitraum zwischen 1 Minute bis 10 Stunden behandelt wurden, miteinander in Bezug.
    • Induktion und Hemmung der Funktion von Organellen:
  • Stabilität intrazellulärer Mikrotubuli. In einer Ausführungsform eines Screens mit hohem Gehalt auf Funktion von Organellen wird der Zustand des Zusammenbaus intrazellulärer Mikrotubuli als Antwort auf Zellbehandlung gemessen. Zur Messung dieses Zustands werden Indikator-Zellen, die lumineszierende Reporter enthalten, mit Testverbindungen behandelt und die Verteilung der Reporter wird räumlich und zeitlich mit dem erfindungsgemäßen Zell-Screening-System gemessen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Reporter des intrazellulären Mikrotubuli- Aufbaus MAP 4 (Bulinski et al., 1997, J. Cell Science 110:3055-3064), ein ubiquitäres mit Mikrotubuli assoziiertes Protein, von dem man weiß, dass es mit Mikrotubuli in Interphase- und mitotischen Zellen assoziiert. Die Indikator-Zellen enthalten lumineszierende Reporter, die aus einer GFP-MAP 4-Chimäre bestehen, die durch Indikator-Zellen über transiente oder stabile Zelltransfektion exprimiert wird, und aus anderen Reportern, die zur Messung der Lokalisation der cytoplasmatischen und Membranbestandteile verwendet werden. Ein GFP- MAP 4-Konstrukt wird wie folgt herstellt: Eine PCR-Amplifikation von nativen oder mutanten GFP-Molekülen wird mit Primern durchgeführt, um Restriktionsenzymstellen einzubringen. Das PCR-Produkt wird in die MAP 4-cDNA innerhalb eines eukaryotischen Expressionsvektors eingebracht. Indikator-Zellen werden dann mit dem Expressionsvektor transfiziert, um entweder transient oder stabil transfizierte Indikator-Zellen zu erzeugen.
  • Indikator-Zellen werden mit Testverbindungen in Endkonzentrationen im Bereich von 10&supmin;¹² M bis 10&supmin;³ M für einen Bereich zwischen 1 Minute bis 10 Stunden behandelt. Es wird Wachstumsmedium zugegeben, welches Markierungsreagenz enthält, um den Kern und das Cytoplasma zu markieren. Nach der Inkubation werden die Zellen mit Hank's balancierter Salzlösung (HBSS) gewaschen, mit 3,7% Formaldehyd für 10 Minuten bei Raumtemperatur fixiert und gewaschen und in HBSS gelagert.
  • Sowohl von fixierten als auch von lebenden Indikator-Zellen werden Bilder gewonnen. Zur Extraktion morphometrischer Daten aus jedem der erhaltenen Bilder wird das folgende Analyseverfahren verwendet:
  • 1. Jedes Kern- und Cytoplasmabild wird einer Schwellenwertbestimmung unterzogen, um eine Maske zu generieren, die einen Wert = 0 für jeden Pixel außerhalb eines Kerns oder einer Zellgrenze besitzt.
  • 2. Die Maske wird auf das ursprüngliche Bild gelegt, jedes Objekt im Feld (d. h. Kern oder Zelle) wird nachgewiesen und seine Größe, Form und integrierte Intensität wird berechnet.
  • 3. Die vorstehend erhaltene Gesamtzellmaske wird auf das entsprechende GFP-MAP 4-Bild gelegt und zur Berechnung der vollständigen Randfestigkeit ("edge strength") innerhalb jeder Zelle wird eine automatische Messung der Randfestigkeits-Routine (»edge strength routine) (Kolega et al., 1993, Biolmaging 1:136-150) verwendet. Zur Normalisierung hinsichtlich der Zellgröße wird die vollständige Randfestigkeit durch den Zellbereich dividiert, um den "Fasrigkeitswert" zu erhalten. Große Werte bei der Fasrigkeit sind mit starken Randfestigkeitswerten assoziiert und sind daher in Zellen maximal, die ausgeprägte Mikrotubulistrukturen enthalten. In ähnlicher Weise sind kleine Werte bei der Fasrigkeit mit schwacher Randfestigkeit assoziiert und sind in Zellen minimal, die depolymerisierte Mikrotubuli aufweisen. Der physiologische Bereich der Fasrigkeitswerte wird durch Behandlung von Zellen entweder mit dem Mikrotubuli-stabilisierenden Arzneistoff Paclitaxel (10 uM) oder mit dem Mikrotubuli-depolymerisierenden Arzneistoff Nocodazol (10 ug/ml) bestimmt.
    • Screens mit hohem Gehalt, die die funktionelle Lokalisation von Makromolekülen beinhalten
  • Innerhalb dieser Klasse von Screens mit hohem Gehalt wird die funktionelle Lokalisation von Makromolekülen in Reaktion auf externe Stimuli innerhalb lebender Zellen gemessen.
  • Regulation der Aktivität des glykolytischen Enzyms. In einer bevorzugten Ausführungsform eines Screens mit hohem Gehalt auf zelluläre Enzymaktivität wird die Aktivität von regulatorischen glykolytischen Schlüsselenzymen in behandelten Zellen gemessen. Zur Messung der Enzymaktivität werden Indikator-Zellen, die lumineszierende Markierungsreagenzien enthalten, mit Testverbindungen behandelt und die Aktivität der Reporter wird mit dem erfindungsgemäßen Zell-Screening-System räumlich und zeitlich gemessen.
  • In einer Ausführungsform ist der Reporter der intrazellulären Enzymaktivität Fructose-6- phosphat, 2-Kinase/Fructose-2,6-bisphosphatase (PFK-2), ein regulatorisches Enzym, dessen Phosphorylierungsstatus den intrazellulären Kohlenhydrat-Anabolismus oder Katabolismus anzeigt (Deprez et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:17269-17275; Kealer et al.; 1996, FEBS Letters 395:225-227; Lee et al., 1996, Biochemistry 35:6010-6019). Die Indikator-Zellen enthalten lumineszierende Reporter bestehend aus einem fluoreszierenden Protein-Biosensor der PFK-2-Phosphorylierung. Der fluoreszierende Protein-Biosensor wird durch Einbringen eines umgebungssensitiven Fluoreszenzfarbstoffs nahe der bekannten Phosphorylierungsstelle des Enzyms konstruiert (Deprez et al., 1997, supra; Giuliano et al., 1995, supra). Der Farbstoff kann der Ketocyaninklasse (Kessler und Wolfbeis, 1991, Spectrochimica Acta 47A:187-192) oder irgendeiner Klasse angehören, die einen proteinreaktiven Rest und ein Fluorochrom enthält, dessen Anregungs- oder Emissionsspektrum sensitiv gegenüber Lösungspolarität ist. Der fluoreszierende Protein- Biosensor wird anhand der Massenbeladungsvorgehensweise in Indikator-Zellen eingebracht.
  • Lebende Indikator-Zellen werden mit Testverbindungen in Endkonzentrationen im Bereich von 10&supmin;¹² M bis 10&supmin;³ M für Zeiten im Bereich von 0,1 Sekunden bis 10 Stunden behandelt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Bildverhältnisdaten von lebenden behandelten Indikator-Zellen durch Sammlung eines spektralen Paars von Fluoreszenzbildern zu jedem Zeitpunkt erhalten. Um für jeden Zeitpunkt morphometrische Daten zu erhalten, wird zwischen jedem Bildpaar durch numerisches Teilen der beiden spektralen Bilder bei jedem Zeitpunkt, Pixel pro Pixel, ein Verhältnis aufgestellt. Jeder Pixelwert wird dann dazu verwendet, die fraktionelle Phosphorylierung von PFK-2 zu berechnen. Bei kleinen fraktionellen Werten der Phosphorylierung stimuliert PFK-2 den Kohlenhydrat-Katabolismus. Bei hohen fraktionellen Werten der Phosphorylierung stimuliert PFK-2 den Kohlenhydrat- Anabolismus.
  • Aktivität von Proteinase K und Lokalisation von Untereinheiten. In einer anderen Ausführungsform eines Screens mit hohem Gehalt werden sowohl die Domänen- Lokalisation als auch die Aktivität der Proteinkinase A (PKA) innerhalb von Indikator-Zellen als Reaktion auf Behandlung mit Testverbindungen gemessen.
  • Die Indikator-Zellen enthalten lumineszierende Reporter, einschließlich einem fluoreszierenden Protein-Biosensor der PKA-Aktivierung. Der fluoreszierende Protein- Biosensor wird durch Einbringen eines umgebungssensitiven fluoreszierenden Farbstoffs in die katalytische Untereinheit von PKA nahe der Stelle konstruiert, von der man weiß, dass sie mit der regulatorischen Untereinheit von PKA interagiert (Harootunian et al., 1993, Mol. Biol. of the Cell 4:993-1002; Johnson et al., 1996, Cell 85:149-158; Giuliano et al., 1995, supra). Der Farbstoff kann zur Ketocyaninklasse (Kessler und Wolfbeis, 1991, Spectrochimica Acta 47A:187-192) oder irgendeiner Klasse angehören, die einen proteinreaktiven Teil und ein Fluorochrom enthält, dessen Anregungs- oder Emissionsspektrum sensitiv gegenüber Lösungspolarität ist. Der fluoreszierende Protein- Biosensor der PKA-Aktivierung wird in die Indikator-Zellen mittels Massenbeladungsverfahren eingebracht.
  • In einer Ausführungsform werden lebende Indikator-Zellen mit Testverbindungen in Endkonzentrationen im Bereich von 10&supmin;¹² M bis 10&supmin;³ M für Zeiträume zwischen 0,1 Sekunden bis 10 Stunden behandelt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Bildverhältniswerte aus lebenden behandelten Indikator-Zellen erhalten. Um Biosensor- Ergebnisse von jedem Zeitpunkt zu extrahieren, wird zwischen jedem Bildpaar ein Verhältnis aufgestellt und jeder Pixelwert wird dann verwendet, um die fraktionelle Aktivierung von PKA (d. h. Trennung der katalytischen und regulatorischen Untereinheiten nach cAMP-Bindung) zu berechnen. Bei hohen fraktionellen Aktivitätswerten stimuliert PFK-2 biochemische Kaskaden innerhalb der lebenden Zelle.
  • Zur Messung der Translokation der katalytischen Untereinheit von PKA werden Indikator- Zellen, die lumineszierende Reporter enthalten, mit Testverbindungen behandelt und die Bewegung dieser Reporter wird mit dem Zell-Screening-System räumlich und zeitlich gemessen. Die Indikator-Zellen enthalten lumineszierende Reporter, die aus Domänen- Markern bestehen, die zur Messung der Lokalisation der cytoplasmatischen Domäne und der Kern-Domäne verwendet werden. Wenn die Indikator-Zellen mit einer Testverbindung behandelt werden, wird die dynamische Neuverteilung eines PKA-fluoreszierenden Protein- Biosensors intrazellulär als eine Reihe von Bildern über einen Zeitbereich von 0,1 Sekunden bis 10 Stunden aufgezeichnet. Jedes Bild wird durch ein Verfahren analysiert, welches die Bewegung des PKA zwischen der cytoplasmatischen Domäne und den Kern-Domänen quantifiziert. Um diese Berechnung auszuführen, werden die Bilder der Sonden, die zur Markierung der cytoplasmatischen und der Kern-Domäne verwendet werden, dazu verwendet, das Bild des PKA-fluoreszierenden Protein-Biosensors zu maskieren. Die integrierte Helligkeit pro Bereichseinheit unter jeder Maske wird dazu verwendet, einen Translokationsquotienten durch Teilen der integrierten Helligkeit im Cytoplasma pro Bereich durch die integrierte Helligkeit im Kern pro Bereich zu bilden. Durch Vergleich der Translokationsquotientenwerte der Kontroll- und Testvertiefungen wird der Prozentsatz an Translokation für jede mögliche Leitverbindung berechnet. Der Output der Screens mit hohem Gehalt bringt quantitative Daten, die die Höhe der Translokation innerhalb einer großen Zahl von individuellen Zellen beschreibt, die mit Testverbindungen im Konzentrationsbereich von 10&supmin;¹² M bis 10&supmin;³ M behandelt wurden, miteinander in Bezug.
    • Screens mit hohem Informationsgehalt betreffend die Induktion oder Hemmung von Genexpression Auf RNA basierende fluoreszierende Biosensoren
  • Transkription von Cytoskelett-Proteinen und Lokalisierung der Message. An der Regulierung allgemeiner Klassen von physiologischen Zellreaktionen, einschließlich Zell- Substratadhäsion, Zell-Zell-Adhäsion, Signaltransduktion, Zellzyklusereignisse, intermediärem und Signalmolekül-Metabolismus, Zellbewegung, Zell-Zell-Kommunikation, und an Zelltod kann eine Veränderung der Genexpression beteiligt sein. Screens mit hohem Gehalt können zur Messung dieser Art von physiologischer Reaktion entworfen werden.
  • In einer Ausführungsform ist der Reporter für intrazelluläre Genexpression ein Oligonukleotid, das an die Ziel-mRNA hybridisieren und ihr Fluoreszenzsignal verändern kann. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Oligonukleotid ein molekularer Köder (Tyagi und Kramer, 1996, Nat. Biotechnol. 14:303-308), ein auf Lumineszenz basierendes Reagenz, dessen Fluoreszenzsignal von intermolekularen und intramolekularen Wechselwirkungen abhängt. Der fluoreszierende Biosensor wird durch Einbringen eines Fluoreszenz-Energietransfer-Paars fluoreszierender Farbstoffe konstruiert, so dass eines davon an jedem Ende (5' und 3') des Reagenzes zu finden ist. Die Farbstoffe können irgendeiner Klasse angehören, die einen proteinreaktiven Rest und Fluorochrome besitzt, deren Anregungs- und Emissionsspektren ausreichend überlappen, um zwischen den Farbstoffen im Ruhezustand Fluoreszenz-Energietransfer bereitzustellen, einschließlich Fluorescein und Rhodamin (Molecular Probes, Inc.), aber nicht darauf beschränkt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Teil der Message, die für &beta;-Actin kodiert (Kislauskis et al., 1994, J. Cell Biol. 127:441-451; McCann et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94:5679- 5684; Sutoh, 1982, Biochemistry 21:3654-3661) in den Schleifenbereich eines haarnadelförmigen Oligonukleotids inseriert, wobei die Enden aufgrund intramolekularer Hybridisierung aneinander gelagert sind. An jedem Ende des Biosensors sind ein Fluoreszenz-Donor (Fluorescein) und ein Fluoreszenz-Akzeptor (Rhodamin) kovalent gebunden. Im gebundenen Zustand ist der Fluoreszenz-Energietransfer maximal und zeigt daher ein nicht-hybridisiertes Molekül an. Wenn die Hybridisierung mit der für &beta;-Actin kodierenden mRNA erfolgt, wird die Bindung aufgebrochen und der Energietransfer geht verloren. Der vollständige fluoreszierende Biosensor wird mittels Masselbeladungsverfahren in die Indikator-Zellen eingebracht.
  • In einer Ausführungsform werden lebende Indikator-Zellen mit Testverbindungen in Endkonzentrationen im Bereich von 10&supmin;¹² M bis 10&supmin;³ M für Zeitspannen im Bereich von 0,1 Sekunden bis 10 Stunden behandelt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Daten über Bildverhältnisse aus lebenden behandelten Indikator-Zellen erhalten. Zur Extraktion morphometrischer Daten zu jedem Zeitpunkt wird zwischen jedem Bilderpaar ein Verhältnis aufgestellt und jeder Pixelwert wird dann dazu verwendet, die fraktionelle Hybridisierung des markierten Nukleotids zu berechnen. Bei kleinen fraktionellen Werten der Hybridisierung wird auf geringe Expression von &beta;-Actin hingewiesen. Hohe fraktionelle Werte der Hybridisierung zeigen maximale Expression von &beta;-Actin. Weiterhin ist die Verteilung hybridisierter Moleküle innerhalb des Cytoplasmas von Indikator-Zellen auch ein Maß für die physiologische Reaktion der Indikator-Zellen.
    • Zelloberflächenbindung eines Liganden
  • Die Bindung von markiertem Insulin an seinen Zelloberflächen-Rezeptor in lebenden Zellen. Zellen, deren Plasmamembran-Domäne mit einem Markierungsreagenz einer bestimmten Farbe markiert wurde, werden mit einer Lösung inkubiert, die Insulinmoleküle enthält (Lee et al., 1997, Biochemistry 36:2701-2708; Martinez-Zaguilan et al., 1996, Am. J. Physiol. 270:C1438-C1446), die mit einer lumineszierenden Sonde einer anderen Farbe markiert sind, für eine geeignete Zeit unter geeigneten Bedingungen. Nach der Inkubation werden ungebundene Insulinmoleküle weggewaschen, die Zellen fixiert und die Verteilung und die Konzentration des Insulins auf der Plasmamembran gemessen. Um dies auszuführen, wird das Bild der Zellmembran als Maske für das Insulinbild verwendet. Die integrierte Intensität des maskierten Insulinbilds wird mit einem Satz von Bildern verglichen, die bekannte Mengen an markiertem Insulin enthalten. Die Menge an an die Zelle gebundenem Insulin wird aus den Standards bestimmt und zusammen mit der Gesamtkonzentration an mit der Zelle inkubiertem Insulin dazu verwendet, eine Dissoziationskonstante von Insulin zu seinem Zelloberflächen-Rezeptor zu berechnen.
    • Markierung von zellulären Kompartimenten Markierung ganzer Zellen
  • Markierung ganzer Zellen wird durch Markierung zellulärer Bestandteile so bewerkstelligt, dass die Dynamik der Zellform und der Bewegung der Zelle über die Zeit durch die Analyse der Fluoreszenzbilder der Zellen gemessen werden kann.
  • In einer Ausführungsform werden kleine reaktive fluoreszierende Moleküle in lebende Zellen eingebracht. Diese membrandurchdringenden Moleküle diffundieren sowohl durch als reagieren auch mit Proteinkomponenten in der Plasmamembran. Farbstoffmoleküle reagieren mit intrazellulären Molekülen, um sowohl das von jedem Molekül emittierte Fluoreszenzsignal zu erhöhen als auch um den Fluoreszenzfarbstoff in lebenden Zellen einzuschließen. Diese Moleküle schließen reaktive Chlormethylderivate der Aminocumarine, Hydroxycumarine, Eosindiacetat, Fluoresceindiacetat, einige Derivate des Bodipy-Farbstoffs und Tetramethylrhodamin ein. Die Reaktivität dieser Farbstoffe gegenüber Makromolekülen beinhaltet freie primäre Aminogruppen und freie Sulfhydrylgruppen.
  • In einer anderen Ausführungsform wird die Zelloberfläche durch In-Kontakt-Bringen der Zelle mit fluoreszierend markierten Antikörpern oder Lectinen (Sigma Chemical Company, ST. Louis, MO) markiert, die spezifisch mit Molekülen auf der Zelloberfläche reagieren. Es können auch Zelloberflächen-Protein-Chimären, die von der interessierenden Zelle exprimiert werden, die ein grün fluoreszierendes Protein oder eine Mutante davon enthalten, dazu verwendet werden, die gesamte Zelloberfläche fluoreszierend zu markieren. Sobald die vollständige Zelle markiert ist, können Bilder der vollständigen Zelle oder einer Zellanordnung ein Parameter für Screens mit hohem Gehalt sein, die die Messung der Zellform, der Bewegung, der Größe und des Wachstums und der Teilung beinhalten.
    • Markierung der Plasmamembran
  • In einer Ausführungsform wird zur Markierung der gesamten Plasmamembran die gleiche Vorgehensweise verwendet, die vorstehend zur Markierung vollständiger Zellen beschrieben wurde. Lumineszierende Moleküle, die die gesamte Zelloberfläche markieren, unterstreichen die Plasmamembran.
  • In einer zweiten Ausführungsform können Subdomänen der Plasmamembran, die extrazelluläre Oberfläche, die Lipid-Doppelschicht und die intrazelluläre Oberfläche getrennt markiert und als Bestandteile von Screens mit hohem Gehalt verwendet werden. In der ersten Ausführungsform wird die extrazelluläre Oberfläche mit einer kurzen Behandlung mit einem reaktiven fluoreszierenden Molekül wie dem Succinimidylester oder Iodacetamidderivaten von Fluoreszenzfarbstoffen wie Fluoresceine, Rhodamine, Cyanine und Bodipys markiert.
  • In einer dritten Ausführungsform wird die extrazelluläre Oberfläche mit fluoreszierend markierten Makromolekülen mit einer hohen Affinität für Zelloberflächenmoleküle markiert. Diese umfassen fluoreszierend markierte Lectine wie Fluorescein, Rhodamin und Cyaninderivate von Lectinen, die von der Jack-Bohne abgeleitet sind (Con A), rote Kidneybohne (Erythroagglutinin PHA-E) oder Weizenkeim.
  • In einer vierten Ausführungsform werden fluoreszierend markierte Antikörper mit einer hohen Affinität für Zelloberflächenbestandteile dazu verwendet, die extrazelluläre Region der Plasmamembran zu markieren. Extrazelluläre Regionen von Zelloberflächen-Rezeptoren und Ionenkanäle sind Beispiele von Proteinen, die mit Antikörpern markiert werden können.
  • In einer fünften Ausführungsform wird die Lipid-Doppelschicht der Plasmamembran mit fluoreszierenden Molekülen markiert. Diese Moleküle beinhalten fluoreszierende Farbstoffe, die an lange Ketten von hydrophoben Molekülen angeheftet sind, die stark mit dem hydrophoben Bereich im Zentrum der Lipid-Doppelschicht der Plasmamembran wechselwirken. Beispiele dieser Farbstoffe beinhalten die PKH-Reihe von Farbstoffen (US- PSen 4,783,401, 4,762,701 und 4,859,584; erhältlich von Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), fluoreszierende Phospholipide wie Nitrobenzoxadiazolglycerophosphoethanolamin und Fluorescein-derivatisiertes Dihexadecanoylglycerophosphoethanolamin, fluoreszierende Fettsäuren wie 5-Butyl-4,4- difluor-4-bor-3a,4a-diaza-s-indacen-3-nonansäure und 1-Pyrendecansäure (Molecular Probes, Inc.), fluoreszierende Sterole, einschließlich Cholesteryl-4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4- bor-3a,4a-diaza-s-indacen-3-dodecanoat und Cholesteryl-1-pyrenhexanoat, und fluoreszierend markierte Proteine, die spezifisch mit Bestandteilen von Lipid- Doppelschichten interagieren, wie das Fluoresceinderivat von Annexin V (Caltag Antibody Co., Burlingame, CA).
  • In einer weiteren Ausführungsform wird der intrazelluläre Bestandteil der Plasmamembran mit fluoreszierenden Molekülen markiert. Beispiele dieser Moleküle sind die intrazellulären Bestandteile des trimeren G-Protein-Rezeptors, Adenylcyclase und Ionentransportproteine. Diese Moleküle können als Ergebnis einer festen Bindung an einen fluoreszierend markierten spezifischen Antikörper oder durch den Einbau einer fluoreszierenden Protein- Chimäre, die aus einem Membran-assoziierten Protein und dem grün fluoreszierenden Protein oder dessen Mutanten besteht, markiert werden.
    • Fluoreszenzmarkierung von Endosomen
  • In einer Ausführungsform werden Liganden, die durch Rezeptor-vermittelte Endocytose in Zellen transportiert werden, dazu verwendet, die Dynamik von endosomalen Organellen aufzuspüren. Beispiele markierter Liganden beinhalten Bodipy FL-markierte Lipoprotein- Komplexe niedriger Dichte, Tetramethylrhodamintransferrin-Analoga und fluoreszierend markierte Epidermis-Wachstumsfaktor (Molecular Probes, Inc.).
  • In einer zweiten Ausführungsform werden fluoreszierend markierte primäre oder sekundäre Antikörper (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; Molecular Probes, inc., Eugene, OR; Caltag Antibody Co.), die spezifisch endosomale Liganden markieren, dazu verwendet, endosomale Kompartimente in Zellen zu markieren.
  • In einer dritten Ausführungsform werden Endosomen in Zellen, die Protein-Chimären exprimieren, die durch Fusion eines grün fluoreszierenden Proteins oder dessen Mutanten mit einem Rezeptor entstehen, dessen Internalisierung Endosomen markiert, fluoreszierend markiert. Chimären des EGF, Transferrin und von Lipoprotein-Rezeptoren mit niedriger Dichte sind Beispiele dieser Moleküle.
    • Markierung von Lysosomen
  • In einer Ausführungsform werden membrangängige Lysosomen-spezifische lumineszierende Reagenzien dazu verwendet, das lysosomale Kompartiment lebender und fixierter Zellen zu markieren. Diese Reagenzien beinhalten die lumineszierenden Moleküle Neutral-Rot, N-(3- ((2,4-Dinitrophenyl)-amino)-propyl)-N-(3-aminopropyl)-methylamin und die LysoTracker®- Sonden, welche sowohl den intralysosomalen pH als auch die dynamische Verteilung von Lysosomen dokumentieren (Molecular Probes, Inc.).
  • In einer zweiten Ausführungsform werden Antikörper gegen lysosomale Antigene (Sigma Chemical Co., Molecular Probes, Inc.; Caltag Antibody Co.) dazu verwendet, lysosomale Komponenten, die in spezifischen lysosomalen Domänen lokalisiert sind, zu markieren. Beispiele dieser Bestandteile sind abbauende Enzyme, die an der Hydrolyse von Cholesterinestern beteiligt sind, Membran-Proteinproteasen und Nukleasen sowie die durch ATP angetriebene lysosomale Protonenpumpe.
  • In einer dritten Ausführungsform werden Protein-Chimären, die aus einem lysosomalen Protein bestehen, das genetisch an ein intrinsisch lumineszierendes Protein, wie das grün fluoreszierende Protein oder Mutanten davon, genetisch fusioniert ist, dazu verwendet, die lysosomale Domäne zu markieren. Beispiele dieser Bestandteile sind abbauende Enzyme, die an der Cholesterinesterhydrolyse beteiligt sind, Membran-Proteinproteasen und Nukleasen sowie die durch ATP angetriebene lysosomale Protonenpumpe.
    • Fluoreszenzmarkierung des Cytoplasma
  • In einer Ausführungsform werden zellgängige fluoreszierende Farbstoffe (Molecular Probes, Inc.) mit einer reaktiven Gruppe mit lebenden Zellen reagiert. Reaktive Farbstoffe, die Monobrombiman, 5-Chlormethylfluoresceindiacetat, Carboxy-Fluorescein-Diacetat- Succinimidylester und Chlormethyltetramethylrhodamin beinhalten, sind Beispiele von zellgängigen Fluoreszenzfarbstoffen, die für die Langzeitmarkierung des Zellcytoplasmas verwendet werden.
  • In einer zweiten Ausführungsform werden polare Tracer-Moleküle wie Lucifer-Gelb und auf Kaskade-Blau basierende Fluoreszenzfarbstoffe (Molecular Probes, Inc.) mittel Massenbeladungsverfahren in Zellen eingebracht und werden ebenfalls für die Markierung des Cytoplasmas verwendet.
  • In einer dritten Ausführungsform werden Antikörper gegen cytoplasmatische Bestandteile (Sigma Chemical Co., Molecular Probes, Inc.; Caltag Antibody Co.) zur Fluoreszenzmarkierung des Cytoplasmas verwendet. Beispiele von cytoplasmatischen Antigenen sind viele der Enzyme, die an dem intermediären Metabolismus beteiligt sind. Enolase, Phosphofructokinase und Acetyl-CoA-Dehydrogenase sind Beispiele einheitlich verteilter cytoplasmatischer Antigene.
  • In einer vierten Ausführungsform werden Protein-Chimären, die aus einem cytoplasmatischen Protein bestehen, das genetisch an ein intrinsisch lumineszierendes Protein wie das grün fluoreszierende Protein oder dessen Mutanten fusioniert ist, dazu verwendet, das Cytoplasma zu markieren. Fluoreszierende Chimären einheitlich verteilter Proteine werden zur Markierung der ganzen cytoplasmatischen Domäne verwendet. Beispiele dieser Proteine sind viele der Proteine, die am Intermediärstoffwechsel beteiligt sind und schließen Enolase, Lactat-Dehydrogenase und Hexokinase ein.
  • In einer fünften Ausführungsform werden Antikörper gegen cytoplasmatische Antigene (Sigma Chemical Co., Molecular Probes, Inc.; Caltag Antibody Co.) dazu verwendet, cytoplasmatische Komponenten zu markieren, die in spezifischen cytoplasmatischen Subdomänen lokalisiert sind. Beispiele dieser Komponenten sind die Cytoskelett-Proteine Actin, Tubulin und Cytokeratin. Eine Population dieser Proteine innerhalb von Zellen ist in bestimmten Strukturen, die fibrotisch sind, angelagert. Die Fluoreszenzmarkierung dieser Proteine mit Antikörper-basierenden Reagenzien markiert deshalb eine spezifische Subdomäne des Cytoplasma.
  • In einer sechsten Ausführungsform werden nicht auf Antikörper beruhende fluoreszierend markierte Moleküle, die stark mit cytoplasmatischen Proteinen wechselwirken, dazu verwendet, spezifische cytoplasmatische Bestandteile zu markieren. Ein Beispiel ist ein Fluoreszenz-Analogon des Enzyms DNAse I (Molecular Probes, Inc.). Fluoreszenz-Analoga dieses Enzyms binden fest und spezifisch an das cytoplasmatische Actin, wodurch eine Subdomäne des Cytoplasmas markiert wird. In einem anderen Beispiel werden Fluoreszenz- Analoga des Pilztoxins Phalloidin oder des Arzneistoffs Paclitaxel (Molecular Probes, Inc.) dazu verwendet, Bestandteile des Actin- bzw. des Mikrotubuli-Cytoskeletts zu markieren.
  • In einer siebten Ausführungsform werden Protein-Chimären, die aus einem cytoplasmatischen Protein bestehen, das genetisch an ein intrinsisch lumineszierendes Protein wie das grün fluoreszierende Protein oder dessen Mutanten fusioniert ist, dazu verwendet, spezifische Domänen des Cytoplasma zu markieren. Fluoreszierende Chimären von hoch-lokalisierten Proteinen werden zur Markierung cytoplasmatischer Subdomänen verwendet. Beispiele dieser Proteine sind viele der Proteine, die bei der Regulation des Cytoskeletts beteiligt sind. Sie beinhalten die Strukturproteine Actin, Tubulin und Cytokeratin sowie die regulatorischen Proteine Mikrotubuli-assoziiertes Protein 4 und &alpha;-Actinin.
    • Markierung des Kerns
  • In einer Ausführungsform werden membrangängige Nukleinsäure-spezifische lumineszierende Reagenzien (Molecular Probes, Inc.) zur Markierung des Kerns lebender und fixierter Zellen verwendet. Diese Reagenzien beinhalten auf Cyanin basierende Farbstoffe (z. B. TOTO®, YOYO® und BOBOTM), Phenanthidine und Acridine (z. B. Ethidiumbromid, Propidiumiodid und Acridinorange), Indole und Imidazole (z. B. Hoechst 33258, Hoechst 33342 und 4',6-Diamidino-2-phenylindol) und andere ähnliche Reagenzien (z. B. 7-Aminoactinomycin D, Hydroxystilbamidin und die Psoralene).
  • In einer zweiten Ausführungsform werden Antikörper gegen Kern-Antigene (Sigma Chemical Co., Molecular Probes, Inc.; Caltag Antibody Co.) zur Markierung von Kernbestandteilen verwendet, die in spezifischen Kerndomänen lokalisiert sind. Beispiele dieser Bestandteile sind Makromoleküle, die an der Aufrechterhaltung der DNA-Struktur und -Funktion beteiligt sind. DNA, RNA, Histone, DNA-Polymerase, RNA-Polymerase, Lamine und Kernvarianten von cytoplasmatischen Proteinen wie Actin sind Beispiele nukleärer Antigene.
  • In einer dritten Ausführungsform werden Protein-Chimären, die aus einem Kernprotein bestehen, das genetisch an ein intrinsisch lumineszierendes Protein wie das grün fluoreszierende Protein oder Mutanten davon fusioniert ist, zur Markierung der Kerndomäne verwendet. Beispiele dieser Proteine sind viele der Proteine, die an der Aufrechterhaltung der DNA-Struktur und -Funktion beteiligt sind. Histone, DNA-Polymerase, RNA-Polymerase, Lamine und Kernvarianten von cytoplasmatischen Proteine wie Actin sind Beispiele für Kernproteine.
    • Markierung der Mitochondrien
  • In einer Ausführungsform werden membrangängige für Mitochondrien spezifische lumineszierende Reagenzien (Molecular Probes, Inc.) zur Markierung der Mitochondrien von lebenden und fixierten Zellen verwendet. Diese Reagenzien beinhalten Rhodamin 123, Tetramethylrhodamin, JC-1 und die MitoTracker®-reaktiven Farbstoffe.
  • In einer zweiten Ausführungsform werden Antikörper gegen mitochondriale Antigene (Sigma Chemical Co., Molecular Probes, Inc.; Caltag Antibody Co.) zur Markierung mitochondrialer Bestandteile verwendet, die in spezifischen mitochondrialen Domänen lokalisiert sind. Beispiele dieser Komponenten sind die Makromoleküle, die an der Aufrechterhaltung der DNA-Struktur und -Funktion von Mitochondrien beteiligt sind. DNA, RNA, Histone, DNA- Polymerase, RNA-Polymerase und mitochondriale Varianten cytoplasmatischer Makromoleküle wie mitochondriale tRNA und rmA sind Beispiele mitochrondrialer Antigene. Andere Beispiele mitochondrialer Antigene sind die Bestandteile des oxidativen Phosphorylierungssystems, das man in Mitochondrien findet (z. B. Cytochrom c, Cytochrom c-Oxidase und Succinatdehydrogenase).
  • In einer dritten Ausführungsform werden Protein-Chimären, die aus einem mitochondrialen Protein bestehen, das genetisch an ein intrinsisch lumineszierendes Protein wie das grün fluoreszierende Protein oder Mutanten davon fusioniert ist, dazu verwendet, die mitochondriale Domäne zu markieren. Beispiele dieser Bestandteile sind die Makromoleküle, die an der Aufrechterhaltung der mitochondrialen DNA-Struktur und -Funktion beteiligt sind. Beispiele beinhalten die Histone, DNA-Polymerase, RNA-Polymerase und die Bestandteile des oxidativen Phosphorylierungssystems, das man in den Mitochondrien findet (z. B. Cytochrom c, Cytochrom c-Oxidase und Succinatdehydrogenase).
    • Markierung des endoplasmatischen Reticulums
  • In einer Ausführungsform werden membrangängige für das endoplasmatische Reticulum spezifische lumineszierende Reagenzien (Molecular Probes, Inc.) dazu verwendet, das endoplasmatische Reticulum lebender und fixierter Zellen zu markieren. Diese Reagenzien beinhalten kurzkettige Carbocyanin-Farbstoffe (z. B. DiOC&sub6; und DiOC&sub3;), langkettige Carbocyanin-Farbstoffe (z. B. DiIC&sub1;&sub6; und DiIC&sub1;&sub8;) und lumineszierend markierte Lectine wie Concanavalin A.
  • In einer zweiten Ausführungsform werden Antikörper gegen Antigene des endoplasmatischen Reticulums (Sigma Chemical Co., Molecular Probes, Inc.; Caltag Antibody Co.) zur Markierung von Bestandteilen des endoplasmatischen Reticulums verwendet, die in spezifischen Domänen des endoplasmatischen Reticulums lokalisiert sind. Beispiele dieser Bestandteile sind die Makromoleküle, die bei der Fettsäuren-Verlängerung beteiligt sind, Glucose-6-Phosphatase und HMG CoA-Reduktase.
  • In einer dritten Ausführungsform werden Protein-Chimären, die aus einem Protein des endoplasmatischen Reticulums bestehen, das genetisch an ein intrinsisch lumineszierendes Protein wie das grün fluoreszierende Protein oder Mutanten davon fusioniert ist, zur Markierung der Domäne des endoplasmatischen Reticulums verwendet. Beispiele dieser Bestandteile sind die Makromoleküle, die an der Fettsäuren-Verlängerung beteiligt sind, Glucose-6-Phosphatase und HMG CoA-Reduktase.
    • Markierung des Golgi-Apparats
  • In einer Ausführungsform werden membrangängige für den Golig-Apparat spezifische lumineszierende Reagenzien (Molecular Probes, Inc.) zur Markierung des Golgi lebender und fixierter Zellen verwendet. Diese Reagenzien beinhalten lumineszierend markierte Makromoleküle wie Weizenkeimagglutinin und Brefeldin A sowie lumineszierend markiertes Ceramid.
  • In einer zweiten Ausführungsform werden Antikörper gegen Golgi-Antigene (Sigma Chemical Co., Molecular Probes, Inc.; Caltag Antibody Co.) zur Markierung von Golgi- Bestandteilen verwendet, die in spezifischen Golgi-Domänen lokalisiert sind. Beispiele dieser Komponenten sind N-Acetylglucosamin-Phosphotransferase, Golgi-spezifische Phosphodiesterase und Mannose-6-Phosphat-Rezeptorprotein.
  • In einer dritten Ausführungsform werden Protein-Chimären, die aus einem Golgi-Protein bestehen, das genetisch an ein intrinsisch lumineszierendes Protein wie das grün fluoreszierende Protein oder Mutanten davon fusioniert ist, zur Markierung der Golgi- Domäne verwendet. Beispiele dieser Komponenten sind N-Acetylglucosamin- Phosphotransferase, Golgi-spezifische Phosphodiesterase und Mannose-6-Phosphat- Rezeptorprotein.
  • Während viele der hier dargestellten Beispiele die Messung einzelner zellulärer Vorgänge beinhalten, ist dies nur für veranschaulichende Zwecke gedacht. Screens mit hohem Gehalt für viele Parameter können durch Kombination mehrerer Screens mit einzelnen Parametern zu einem Screen mit hohem Gehalt mit vielen Parametern kombiniert werden oder durch die Addition von zellulären Parametern zu jedem beliebigen bestehenden Screen mit hohem Gehalt. Während weiterhin jedes Beispiel als auf entweder lebenden oder fixierten Zellen basierend beschrieben wird, kann jeder Screen mit hohem Gehalt so angepasst werden, dass er sowohl mit lebenden als auch fixierten Zellen verwendet werden kann.
  • Fachleute werden eine große Vielzahl an unterschiedlichen Screens erkennen, die anhand der hier bereitgestellten Offenbarung entwickelt werden können. Es gibt eine lange und anwachsende Liste bekannter biochemischer und molekularer Vorgänge in Zellen, an denen die Translokationen oder die Reorganisationen spezifischer Komponenten innerhalb von Zellen beteiligt ist. Der Signalweg von der Zelloberfläche zu Zielorten innerhalb der Zelle beinhaltet die Translokation von Plasmamembran-assoziierten Proteinen in das Cytoplasma. Es ist z. B. bekannt, dass ein Protein aus der src-Familie der Protein-Tyrosinkinasen, pp60csrc (Walker et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:19552-19558) nach Stimulation von Fibroblasten mit Plättchen-abgeleitetem Wachstumsfaktor (PDGF) von der Plasmamembran ins Cytoplasma transloziert. Zusätzlich können die Screening-Ziele selbst zu auf Fluoreszenz basierenden Reagenzien umgewandelt werden, welche über molekulare Veränderungen einschließlich Liganden-Bindung und posttranslationalen Modifikationen Bericht erstatten.

Claims (29)

1. Ein automatisiertes Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die Internalisierung von Zelloberflächen-Rezeptorproteinen induzieren, umfassend
- die Bereitstellung einer Anordnung ("Array") von Stellen, enthaltend multiple Zellen, die mit einer Testverbindung behandelt werden sollen, wobei die Zellen ein interessierendes Zelloberflächen-Rezeptorprotein besitzen, und wobei das Zelloberflächen-Rezeptorprotein entweder als ein lumineszierend markiertes Protein exprimiert wird, oder durch In-Kontakt-Bringen der Zelle mit einem lumineszierend markierten Molekül, das an den interessierenden Zelloberflächen- Rezeptor bindet, lumineszierend markiert wird, wobei das In-Kontakt-Bringen entweder vor oder nach der Behandlung mit der Testverbindung durchgeführt werden kann;
- Behandlung der Zellen mit der Testverbindung;
- Scannen multipler Zellen an jeder der Stellen, die multiple Zellen enthalten, um Lumineszenzsignale von dem lumineszierend markierten Zelloberflächen- Rezeptorprotein zu erhalten;
- Umwandeln der lumineszierenden Signale in digitale Daten; und
- Verwendung der digitalen Daten zur automatischen Bestimmung, ob die Testverbindung die Intemalisierung des lumineszierend markierten Zelloberflächen-Rezeptorprotein induziert hat, durch Messen wenigstens eines der folgenden:
(a) eine Anzahl von Objekten, von denen bestimmt wurde, dass sie gültige internalisierte Zelloberflächen-Rezeptoren darstellen;
(b) ein aggregierter Bereich von Objekten, von denen bestimmt wurde, dass sie gültige internalisierte Zelloberflächen-Rezeptoren darstellen;
(c) eine aggregierte Intensität der Objekte, von denen bestimmt wurde, dass sie gültige internalisierte Zelloberflächen-Rezeptoren darstellen; oder
(d) eine normalisierte aggregierte Intensität der Objekte, von denen bestimmt wurde, dass sie gültige internalisierte Zelloberflächen-Rezeptoren darstellen.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, weiter umfassend die Bestimmung einer Anzahl von Zellen, die das lumineszierend markierte Zelloberflächen-Rezeptorprotein internalisiert haben.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, weiter umfassend die Bestimmung einer Gesamt- Zellzahl.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Bestimmung der Gesamt-Zellzahl die Schritte umfasst:
a. Erhalten eines Bildes der Zellkerne;
b. Segmentieren des Bildes der Zellkerne; und
c. Berechnen des gesamten Bereiches aller Kerne in dem Bild der Zellkerne.
5. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Bestimmung einer Anzahl von Zellen, die das lumineszierend markierte Zelloberflächen-Rezeptorprotein Internalisiert haben, die Schritte umfasst:
a. Erhalten eines Objektbildes des lumineszierend markierten Zelloberflächen- Rezeptorproteins in oder auf den Zellen;
b. Segmentieren des Objektbildes; und
c. Bestimmung, ob Objekte in dem segmentierten Objektbild gültige Intemalisierte lumineszierend markierte Zelloberflächen-Rezeptorproteine darstellen.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5, weiter umfassend wenigstens eines der folgenden:
a. Entfernen von Artefakten aus dem Objektbild; oder
b. Korrektur hinsichtlich Hintergrundlumineszenz.
7. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei von Unterbereichen der Anordnung von Stellen, die multiple Zellen enthalten, mehrere Male in Intervallen eine Probe genommen wird, um kinetische Messungen der Internalisation von Zelloberflächen-Rezeptorprotein in die Zelle bereitzustellen.
8. Ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die Internalisation von Zelloberflächen-Rezeptorproteinen hemmen, umfassend
- die Bereitstellung einer Anordnung von Stellen, enthaltend multiple Zellen, die mit einer Testverbindung behandelt werden sollen, wobei die Zellen ein interessierendes Zelloberflächen-Rezeptorprotein besitzen, und wobei das Zelloberflächen-Rezeptorprotein entweder als ein lumineszierend markiertes Protein exprimiert wird, oder durch In-Kontakt-Bringen der Zelle mit einem lumineszierend markierten Molekül, das an den interessierenden Zelloberflächen- Rezeptor bindet, lumineszierend markiert wird, wobei das In-Kontakt-Bringen entweder vor oder nach der Behandlung mit der Testverbindung durchgeführt werden kann;
- Behandlung der Zellen mit einer Testverbindung;
- Behandlung der Zellen mit einem Liganden, der dazu führt, dass das Zelloberflächen-Rezeptorprotein in Abwesenheit der Testverbindung internalisiert wird;
- Scannen multipler Zellen an jeder der Stellen, die Zellen enthalten, um Lumineszenzsignale von dem lumineszierend markierten Rezeptorprotein zu erhalten;
- Umwandeln der lumineszierenden Signale in digitale Daten; und
- Verwendung der digitalen Daten zur Bestimmung, ob die Testverbindung Liganden induzierte Internalisierung des lumineszierend markierten Zelloberflächen-Rezeptorprotein gehemmt hat, durch Messen wenigstens eines der folgenden:
(a) eine Anzahl von Objekten, von denen bestimmt wurde, dass sie gültige internalisierte Zelloberflächen-Rezeptoren darstellen;
(b) ein aggregierter Bereich von Objekten, von denen bestimmt wurde, dass sie gültige internalisierte Zelloberflächen-Rezeptoren darstellen;
(c) eine aggregierte Intensität der Objekte, von denen bestimmt wurde, dass sie gültige internalisierte Zelloberflächen-Rezeptoren darstellen; oder
(d) eine normalisierte aggregierte Intensität der Objekte, von denen bestimmt wurde, dass sie gültige internalisierte Zelloberflächen-Rezeptoren darstellen.
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, weiter umfassend die Bestimmung einer Anzahl von Zellen, die das lumineszierend markierte Zelloberflächen-Rezeptorprotein internalisiert haben.
10. Verfahren gemäß Anspruch 9, weiter umfassend die Bestimmung einer Gesamt- Zellzahl.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die Bestimmung der Gesamt-Zellzahl die Schritte umfasst:
a. Erhalten eines Bildes der Zellkerne
b. Segmentieren des Bildes der Zellkerne; und
c. Berechnen des gesamten Bereiches aller Kerne in dem Bild der Zellkerne.
12. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Bestimmung einer Anzahl von Zellen, die das lumineszierend markierte Rezeptorprotein internalisiert haben, die Schritte umfasst:
a. Erhalten eines Objektbildes des lumineszierend markierten Zelloberflächen- Rezeptorproteins in oder auf den Zellen;
b. Segmentieren des Objektbildes; und
c. Bestimmung, ob Objekte in dem segmentierten Objektbild gültige internalisierte lumineszierend markierte Zelloberflächen-Rezeptorproteine darstellen.
13. Verfahren gemäß Anspruch 12, weiter umfassend wenigstens eines der folgenden:
a. Entfernen von Artefakten aus dem Objektbild; oder
b. Korrektur hinsichtlich Hintergrundlumineszenz.
14. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei von Unterbereichen der Anordnung von Stellen, die multiple Zellen enthalten, mehrere Maie in Intervallen Proben genommen werden, um kinetische Messungen der Hemmung der Internalisation von Zelloberflächen- Rezeptorprotein in die Zelle bereitzustellen.
15. Ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die Internalisation von Zelloberflächen-Rezeptorproteinen induzieren, umfassend:
die Bereitstellung einer Anordnung von Stellen, enthaltend multiple Zellen, die mit einer Testverbindung behandelt werden sollen, wobei die Zellen ein interessierendes Zelloberflächen-Rezeptorprotein besitzen, und wobei das Zelloberflächen-Rezeptorprotein entweder als ein lumineszierend markiertes Protein exprimiert wird, oder durch In-Kontakt-Bringen der Zelle mit einem lumineszierend markierten Molekül, das an den interessierenden Zelloberflächen- Rezeptor bindet, lumineszierend markiert wird, wobei das In-Kontakt-Bringen entweder vor oder nach der Behandlung mit der Testverbindung durchgeführt werden kann;
- Behandlung der Zellen mit einem Indikator, der nach Stimulierung des Rezeptorproteins ein nachweisbares Signal erzeugt
- Behandlung der Zellen mit einer Testverbindung;
- Scannen der Vertiefungen mit hohem Durchsatz zur Identifizierung der Vertiefungen, die ein nachweisbares Signal zeigen
- Selektives Scannen nur eines Unterbereiches der Vertiefungen in ein Modus mit hohem Gehalt ("high content mode") um lumineszierende Signale von dem lumineszierend markierten Rezeptorprotein in einzelnen Zellen zu erhalten, wobei der Unterbereich aus Vertiefungen besteht, die das nachweisbare Signal während Scannen mit hohem Durchsatz zeigen;
- Umwandeln der lumineszierenden Signale in digitale Daten; und
- Verwendung der digitalen Daten zur Bestimmung, ob die Testverbindung Internalisierung des lumineszierend markierten Zelloberflächen-Rezeptorprotein induziert hat, durch Messen wenigstens eines der folgenden:
(a) eine Anzahl von Objekten, von denen bestimmt wurde, dass sie gültige internalisierte Zelloberflächen-Rezeptoren darstellen;
(b) ein aggregierter Bereich der Objekte, von denen bestimmt wurde, dass sie gültige internalisierte Zelloberflächen-Rezeptoren darstellen;
(c) eine aggregierte Intensität der Objekte, von denen bestimmt wurde, dass sie gültige internalisierte Zelloberflächen-Rezeptoren darstellen; oder
(d) eine normalisierte aggregierte Intensität der Objekte, von denen bestimmt wurde, dass sie gültige internalisierte Zelloberflächen-Rezeptoren darstellen.
16. Verfahren gemäß Anspruch 15, weiter umfassend die Bestimmung einer Anzahl von Zellen, die das lumineszierend markierte Zelloberflächen-Rezeptorprotein internalisiert haben.
17. Verfahren gemäß Anspruch 16, weiter umfassend die Bestimmung einer Gesamt- Zellzahl.
18. Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei die Bestimmung der Gesamt-Zellzahl die Schritte umfasst:
a. Erhalten eines Bildes der Zellkerne;
b. Segmentieren des Bildes der Zellkerne; und
c. Berechnen des gesamten Bereiches aller Kerne in dem Bild der Zellkerne.
19. Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die Bestimmung einer Anzahl von Zellen, die das lumineszierend markierte Rezeptorprotein internalisiert haben, die Schritte umfasst:
a. Erhalten eines Objektbildes des lumineszierend markierten Zelloberflächen- Rezeptorproteins in oder auf den Zellen;
b. Segmentieren des Objektbildes; und
c. Bestimmung, ob Objekte in dem segmentierten Objektbild gültige internalisierte lumineszierend markierte Zelloberflächen-Rezeptorproteine darstellen.
20. Verfahren gemäß Anspruch 19, weiter umfassend wenigstens eines der folgenden:
a. Entfernen von Artefakten aus dem Objektbild; oder
b. Korrektur hinsichtlich Hintergrundlumineszenz.
21. Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei von Unterbereichen der Anordnung von Stellen, die multiple Zellen enthalten, mehrere Male in Intervallen Proben genommen werden, um kinetische Messungen der Internalisation von Zelloberflächen-Rezeptor bereitzustellen.
22. Ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die Internalisation von Zelloberflächen-Rezeptorproteinen hemmen, umfassend:
- die Bereitstellung einer Anordnung von Stellen, enthaltend multiple Zellen, die mit einer Testverbindung behandelt werden sollen, wobei die Zellen ein interessierendes Zelloberflächen-Rezeptorprotein besitzen, und wobei das Zelloberflächen-Rezeptorprotein entweder als ein lumineszierend markiertes Protein exprimiert wird, oder durch In-Kontakt-Bringen der Zelle mit einem lumineszierend markierten Molekül, das an den interessierenden Zelloberflächen- Rezeptor bindet, lumineszierend markiert wird, wobei das In-Kontakt-Bringen entweder vor oder nach der Behandlung mit der Testverbindung durchgeführt werden kann;
- Behandlung der Zellen mit einem Indikator, der nach Stimulierung des Rezeptorproteins ein nachweisbares Signal erzeugt
- Behandlung der Zellen mit einer Testverbindung;
- Behandlung der Zellen mit einem Liganden, der dazu führt, dass das Zelloberflächen-Rezeptorprotein in Abwesenheit der Testverbindung in die Zelle internalisiert wird;
- Scannen der Vertiefungen mit hohem Durchsatz zur Identifizierung der Vertiefungen, die kein Indikator-induziertes nachweisbares Signal zeigen;
- Selektives Scannen nur eines Unterbereiches der Vertiefungen in einem Modus mit hohem Gehalt (»high content mode") um lumineszierende Signale von dem lumineszierend markierten Rezeptorprotein in einzelnen Zellen zu erhalten, wobei der Unterbereich aus den Vertiefungen besteht, die das erwünschte nachweisbare Signal während Scannen mit hohem Durchsatz nicht zeigten;
- Umwandeln der lumineszierenden Signale in digitale Daten; und
- Verwendung der digitalen Daten zur Bestimmung, ob die Testverbindung Liganden induzierte Internalisierung des lumineszierend markierten Zelloberflächen-Rezeptorprotein induziert hat, durch Messen wenigstens eines der folgenden:
(a) eine Anzahl von Objekten, von denen bestimmt wurde, dass sie gültige internalisierte Zelloberflächen-Rezeptoren darstellen;
(b) ein aggregierter Bereich von Objekten, von denen bestimmt wurde, dass sie gültige internalisierte Zelloberflächen-Rezeptoren darstellen;
(c) eine aggregierte Intensität der Objekte, von denen bestimmt wurde, dass sie gültige internalisierte Zelloberflächen-Rezeptoren darstellen; oder
(d) eine normalisierte aggregierte Intensität der Objekte, von denen bestimmt wurde, dass sie gültige internalisierte Zelloberflächen-Rezeptoren darstellen.
23. Verfahren gemäß Anspruch 22, umfassend die Bestimmung einer Anzahl von Zellen, die das lumineszierend markierte Zelloberflächen-Rezeptorprotein internalisiert haben.
24. Verfahren gemäß Anspruch 23, weiter umfassend die Bestimmung einer Gesamt- Zellzahl.
25. Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei die Bestimmung der Zellzahl die Schritte umfasst:
a. Erhalten eines Bildes der Zellkerne;
b. Segmentieren des Bildes der Zellkerne; und
c. Berechnen des gesamten Bereiches aller Kerne in dem Bild der Zellkerne.
26. Verfahren gemäß Anspruch 23, wobei die Bestimmung einer Anzahl von Zellen, die das lumineszierend markierte Rezeptorprotein internalisiert haben, die Schritte umfasst:
a. Erhalten eines Objektbildes des lumineszierend markierten Zelloberflächen- Rezeptorproteins in oder auf den Zellen;
b. Segmentieren des Objektbildes; und
c. Bestimmung, ob Objekte in dem segmentierten Objektbild gültige internalisierte lumineszierend markierte Zelloberflächen-Rezeptorproteine darstellen.
27. Verfahren gemäß Anspruch 26, weiter umfassend wenigstens eines der folgenden:
a. Entfernen von Artefakten aus dem Objektbild; und
b. Korrektur hinsichtlich Hintergrundlumineszenz.
28. Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei von Unterbereichen der Anordnung von Stellen, die multiple Zellen enthalten, mehrere Male in Intervallen Proben genommen werden, um kinetische Messungen der Internalisation von Zelloberflächen-Rezeptor bereitzustellen.
29. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-28, wobei ein computerlesbares Speichermedium verwendet wird, umfassend ein Programm, das einen Satz von Instruktionen zum Auslösen eines Zell-Screening-Systems enthält, und wobei das Zell- Screening-System ein optisches System mit einem Gestell umfasst, das dazu geeignet ist, eine Platte, die Zellen enthält, zu halten, ein Mittel zur Bewegung des Gestells oder des optischen Systems, eine Digitalkamera, ein Mittel zur Ausrichtung des von den Zellen emittierten Lichtes zur Digitalkamera, und einen Computer zum Erhalt und zur Verarbeitung der digitalen Daten von der digitalen Kamera.
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