DE69902086T2

DE69902086T2 - Verfahren zum nachweis von nukleinsäure-zielsequenzen mittels in vitro transkription von einem rna-promoter

Info

Publication number: DE69902086T2
Application number: DE69902086T
Authority: DE
Inventors: Rene Assenberg; Leonard Cardy; Peter Marsh; Andrew Mock; Duncan Ray; Anthony Weston; Deborah Wharam
Original assignee: Cytocell Ltd
Current assignee: British Biocell International Ltd
Priority date: 1998-01-27
Filing date: 1999-01-26
Publication date: 2003-03-13
Anticipated expiration: 2019-01-27
Also published as: JP2002510464A; WO1999037805A1; US20030064370A1; EP1049806B1; ATE220427T1; CA2319757A1; CA2319757C; EP1049806A1; AU2431799A; US6287770B1; DE69902086D1; DE1049806T1; AU747140B2

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäurehybridisierungssonden und daraus gebildete Komplexe, deren Verwendung in Verfahren zur Amplifikation und/oder Detektion von Nucleinsäure und Kits, die die Sonden umfassen und zum Bilden der Komplexe geeignet sind. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Transkription und Amplifikation von hybridisierten Nukleinsäuresonden, so daß die Empfindlichkeit der Hybridisierungsreaktionen erhöht wird.

Hintergrund der Erfindung

Alle in dieser Beschreibung erwähnten Veröffentlichungen sind hierin als Referenz einbezogen.
Es ist viel Forschung auf dem Gebiet der RNA Polymerasen durchgeführt worden, insbesondere auf dem Gebiet der Bakteriophagen RNA Polymerasen. Im allgemeinen sind die Bakteriophagen RNA Polymerasen bei der in vitro Transkription außergewöhnlich aktiv. Dieser hohe Grad der Aktivität beruht möglicherweise zum Teil auf der Tatsache, daß sie aus einer einzelnen Polypetidkette bestehen und keinen disoziierenden Initationsfaktor benötigen. Es wurde gezeigt, daß diese Polymerasen bei superaufgewickelten (supercoiled) Matrizen aktiver sind, obwohl sie auch bei linearen Matrizen sehr aktiv sind (Smeekens & Romano 1986, Nucl. Acids Res. 14, 2811).
Insbesondere wurde von der RNA Polymerase aus den Bakteriophagen T7 gezeigt, daß sie sehr selektiv für spezifische Promotoren ist, die selten in DNA gefunden werden, die keine Verwandtschaft mit T7 DNA aufweist (Chamberlin et al., 1970 Nature 228, 227; Dünn & Studier 1983 J. Mol. Biol. 166, 477). T7 DNA Polymerase weist die Fähigkeit auf, komplette Transkripte von nahezu jeder DNA herzustellen, die unter die Kontrolle des T7 Promotors gestellt ist. T7 DNA Polymerase ist ein hochaktives Enzym, das etwa fünfmal schneller transkribiert, als Escherichia coli DNA Polymerase (Studier et al., 1990 Methods Enzymol. 185, 60). Die Synthese von kleinen RNAs unter Verwendung von T7 RNA Polymerase ist beschrieben worden, dabei wurde gezeigt, daß die Sequenzen um die RNA Polymerase Promotorsequenz hemm wichtig sind, um die Ausbeute der hergestellten RNA reproduzierbar zu verbessern (Milligan & Uhlenbeck, 1989 Methods Enzymol. 750, 51 und Milligan et al., Nucl. Acids Res. 15, 8783-8798). Andere RNA Polymerasen, die im Vergleich zu T7 ähnliche Eigenschaften aufweisen, schließen die aus Bakteriphage T3 und SP6 ein, wobei deren Gene alle kloniert worden sind und die entsprechenden Enzyme im Handel erhältlich sind.
Im Stand der Technik ist eine Anzahl von Nucleinsäureamplifikationsverfahren offenbart. Ein solches Verfahren ist die Polymerasekettenreaktion (PCR), offenbart in US 4 683 195 und 4 683 202. Das PCR Amplifizierungsverfahren ist allgemein bekannt und erfolgreich. Die PCR weist jedoch Nachteile auf, einschließlich der Notwendigkeit, die Reaktionstemperaturen alternierend zwischen mittleren Temperaturen (z. B. 50ºC bis 55ºC) und hohen Temperaturen (z. B. 90ºC bis 95ºC) einzustellen, was ein wiederholtes thermisches Zyklieren einschließt. Darüber hinaus ist auch die für mehrfache Zyklen mit großen Temperaturübergängen zum Erreichen der Amplifikation der Nucleinsäuresequenzen erforderliche Zeitdauer und das Auftreten von Sequenzfehlem in den amplifizierten Kopien der Nucleinsäuresequenz ein schwerer Nachteil, da Fehler während dem mehrfachen Kopieren von langen Sequenzen auftreten. Zusätzlich erfordert die Detektion der amplifizierten Nucleinsäuresequenz im allgemeinen weitere Verfahren, z. B. die Agarose Gel Elektrophorese.
Alternative Nucleinsäureamplifikationsverfahren, die RNA Polymerasen einsetzen, sind in WO 88/10315 (Siska Diagnostics), EP 329 822 (Canagene), EP 373 960 (Siska Diagnostics), US 5 554 516 (Gen-Probe Inc.), WO 89/01050 (Burg et al. WO 88/10315 (Gingeras et al.) und EP 329 822 (Organon Teknika) offenbart, wobei diese Dokumente sich auf Techniken beziehen, die als NASBA bekannt sind. Diese Amplifikationsverfähren beschreiben eine Zyklierungsreaktion, umfassend alternierende DNA und RNA Synthesen. Diese alternierenden RNA-DNA Synthesen werden im Prinzip durch das Annealing von Oligonucleotiden an spezifischen DNA Sequenzen erreicht, wobei diese Oligonucleotide einen transkriptionalen Promotor umfassen. Die DNA Kopien der so hergestellten spezifischen Sequenzen oder alternativ einer Input-Probe, umfassend eine spezifische RNA Sequenz (US 5 554 516) werden dann unter Verwendung eines Nucleinsäureprimers als DNA Stränge kopiert und die RNA aus dem resultierenden DNA:RNA Hybrid wird entweder durch Denaturierung entfernt (WO 88/10315) oder mit RNase H (EP 329 822, EP 373 960 und US 5 554 516) entfernt.
Das Annealing von Oligonucleotiden unter Bildung eines Transkriptionspromotors wird dann wiederholt, um die RNA Produktion zu amplifizieren. Daher wird die Amplifikation im Prinzip durch die Verwendung von effizienten RNA Polymerasen erreicht, um einen Überschuß an RNA Kopien über die DNA Matrizen zu erzielen. Die RNase Version dieses Verfahrens hat große Vorteile gegenüber der PCR, die darin bestehen, daß die Amplifikation potentiell bei einer einzigen Temperatur (d. h. isothermisch) erreicht werden kann. Zusätzlich kann ein wesentlich höherer Grad an Amplifikation pro Zyklus erreicht werden, als bei einer PCR, d. h. eine Verdopplung der DNA Kopien pro Zyklus für die PCR und 10 bis 100 RNA Kopien pro Zyklus unter Verwendung von T7 RNA Polymerase.
Die oben beschriebenen Verfahren betreffen alle Methoden, bei denen eine spezifische Nucleinsäureregion direkt kopiert wird und diese Nucleinsäurekopien zum Erzielen der Amplifikation weiterkopiert werden. Die Variabilität zwischen verschiedenen Nucleinsäuresequenzen ist so, daß die Amplifikationsgeschwindigkeiten zwischen verschiedenen Sequenzen bei dem gleichen Verfahren wahrscheinlich abweichen, wodurch Probleme auftreten, z. B. bei der Quantifizierung der Originalmenge an spezifischen Nucleinsäuren.
Die oben genannten Verfahren haben bei der Amplifikation der Ziel-Nucleinsäure eine Anzahl von Nachteilen. Daher ist unten für die sensitive Detektion einer spezifischen Ziel- Nucleinsäuresequenz eine Liste von erwünschten Merkmalen gezeigt:
a) das Verfahren sollte vorzugsweise kein Kopieren der Zielsequenz erfordern;
b) das Verfahren sollte vorzugsweise nicht ein multiples Kopieren von langen Sequenzen beinhalten;
c) das Verfahren sollte vorzugsweise allgemein sowohl für DNA als auch RNA Zielsequenzen verwendbar sein, einschließlich spezifischer Sequenzen ohne diskrete Enden;
d) das Signal sollte vorzugsweise aus der unabhängigen Hybridisierung von zwei verschiedenen Sonden oder Regionen von Sonden mit einer Zielsequenz resultieren;
e) das Verfahren sollte vorzugsweise eine Möglichkeit zur Detektion einer hybridisierten Sonde ohne jegliche zusätzliche Schritte einbeziehen.
Ein Nucleinsäureamplifizierungsverfahren, das die oben genannten erwünschten Merkmale erfüllt, wird in WO 93/06240 (Cytocell Ltd.) offenbart. Zwei Amplifikationsverfahren sind beschrieben, ein thermisches und ein isothermisches. Sowohl die thermische als auch die isothermische Version hängen von der Hybridisierung von zwei Nucleinsäuresonden ab, von denen Regionen zu der Ziel-Nucleinsäure komplementär sind. Teile der Sonden sind dabei zur Hybridisierung mit den interessierenden Sequenzen fähig, so daß die Sonden aneinander angrenzend sind oder im wesentlichen aneinander angrenzend sind, um es zu ermöglichen, daß komplementäre armspezifischen Sequenzen der ersten und zweiten Sonde aneinander annealed werden. Nach dem Annealen wird die Kettenverlängerung von einer der Sonden unter Verwendung eines Teils der anderen Sonde als Matrize erreicht. Die Amplifikation der verlängerten Sonde wird durch eine von zwei Möglichkeiten erzielt. In der thermischen Zyklierungsversion wird eine thermische Separierung der verlängerten ersten Sonde durchgeführt, um die Hybridisierung einer weiteren Sonde zu ermöglichen, die im wesentlichen zu einem Teil der neu synthetisierten Sequenz der verlängerten ersten Probe komplementär ist. Die Verlängerung einer weiteren Sonde wird durch Verwendung einer geeigneten Polymerase unter Einsatz der verlängerten ersten Sonde als Matrize erzielt. Die thermische Separierung der verlängerten ersten und der weiteren Sondenprodukte ergibt Matrizen für die Verlängerung weiterer erster Sondenmoleküle und die verlängerte erste Sonde kann als Matrize für die Verlängerung weiterer Sondenmoleküle dienen.
In der isothermischen Version erzeugt die Primerverlängerung der ersten Sonde einen funktionalen RNA Polymerase Promotor, der in Gegenwart einer relevanten RNA Polymerase die Transkription der Sondensequenz unter Erzeugung vielfacher Kopien der RNA erlaubt. Die resultierende RNA wird als Ergebnis der Wechselwirkung von komplementären RNA Nucleotiden, die weitere RNA Polymerase Promotorsequenzen enthalten weiter amplifiziert, wobei das Annealen und die Verlängerung der RNA auf dem DNA Oligonucleotid zu einer weiteren Runde RNA führt. Dieser zyklische Prozeß erzeugt große Ausbeuten an RNA, deren Detektion auf verschiedene Arten erzielt werden kann.
EP 0 851 033 offenbart ein Verfahren zur "Ziel-ausgelösten" Amplifikation, das die Verwendung von "Promotor-sequestrierten" Oligonucleotiden einschließt. Die Oligonucleotide enthalten die volle Sequenz eines Stranges des doppelsträngigen Promotors. Die volle Sequenz des komplementären Stranges wird durch ein anderes Molekül geliefert, so daß zwei Moleküle ausreichen, um den vollen doppelsträngigen Promotor bereitzustellen.
EP 0 552 931 offenbart ein Verfahren zum Erzeugen eines Hybridisierungsassays unter Verwendung von verzweigten Nucleinsäuresonden. In bestimmten im Dokument zum Stand der Technik offenbarten Ausführungsformen wird ein funktionaler RNA Polymerase Promotor durch die Hybridisierung von zwei Molekülen gebildet.
WO 94/29481 offenbart ein Verfahren zur Detektion einer Nucleinsäuresequenz, in dem das Vorliegen der Zielsequenz in einer Probe zur Produktion von RNA in einen isothermischen Amplifikationsprozeß führt. Der zur RNA Synthese erforderliche RNA Promotor wird durch zwei kontinuierliche Stränge Nucleinsäure auf einem doppelsträngigen Molekül bereitgestellt.

Zusammenfassung der Erfindung

In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung einen Komplex bereit, der drei Nucleinsäurestränge umfaßt: Einen Promotorstrang, einen zum Promotor komplementären Strang und einen Zielstrang; wobei der zum Promotor komplementäre Strang die Sequenz voller Länge eines ersten Stranges eines doppelsträngigen Promotors umfaßt, der Zielstrang einen Teil des zweiten Strangs des doppelsträngigen Promotors umfaßt und der Promotorstrang einen Teil des zweiten Stranges des doppelsträngigen Promotors umfaßt, der zu einem Teil des ersten Stranges komplementär ist, wobei kein Teil des zweiten Stranges des doppelsträngigen Promotors, der auf dem Zielstrang oder dem Promotorstrang vorliegt, fähig ist, bei Hybridisierung mit dem zum Promotor komplementären Strang in Abwesenheit des anderen Teils einen im wesentlichen funktionalen Promotor zu bilden, wobei aber ein im wesentlichen funktionaler Promotor gebildet wird, wenn der zum Promotor komplementäre Strang sowohl mit dem Zielstrang als auch mit dem Promotorstrang hybridisiert wird.
Der Promotorstrang ("PS") und der zum Promotor komplementäre Strang ("CS") werden zweckmäßigerweise als ein Paar von "PS" und "CS" Nucleinsäuresonden bereitgestellt. Die Sonden können DNA, Peptidnucleinsäure (PNA), geschlossene Nucleinsäure (LNA), (weniger bevorzugt RNA) oder jede Kombination daraus umfassen.
PNA ist ein synthetisches Nucleinsäureanalog, in dem das Zucker/Phosphat Gerüst durch eine peptidverknüpfte Kette ersetzt ist (typischerweise aus wiederholten N-(2-aminoethyl)- glycin Einheiten), an die die Basen durch Methylencarbonylbindungen gebunden sind. PNA/DNA Hybride haben hohe Tm-Werte im Vergleich zu doppelsträngigen DNA Molekülen, da in DNA das stark negativ geladene Phophatgerüst eine elektrostatische Abstoßung zwischen den jeweiligen Strängen verursacht, während das Gerüst von PNA nicht geladen ist. Ein anderes Merkmal von PNA besteht darin, daß eine einzelne Nichtübereinstimmung in einer Base, in relativen Begriffen, sich stärker destabilisierend auswirkt als eine Nichtübereinstimmung in einer einzelnen Base einer heteroduplex DNA. Dementsprechend ist PNA verwendbar, um in Sonden einbezogen zu werden, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, da die resultierenden Sonden eine größere Spezifität aufweisen, als ausschließlich aus DNA bestehende Sonden. Synthese und Verwendung von PNA ist z. B. von Orum et al. (1993 Nucl. Acids Res. 21, 5332), Egholm et al. (1992 J. Am. Chem. Soc. 114, 1895) und Egholm et al. (1993 Nature 365, 566) offenbart worden.
LNA ist ein synthetisches Nucleinsäureanalog, das "intern verbrückte" Nucleosidanaloge einbezieht. Die Synthese von LNA und ihre Eigenschaften sind von mehreren Autoren beschrieben worden: Nielsen et al. (1997 J. Chem. Soc. Perkin Trans, 1, 3423), Koshkin et al., (1998 Tetrahedron Letters 39, 4381), Singh & Wengel (1998 Chem. Commun. 1247), und Singh et al. (1998 Chem. Commun. 455). Wie bei PNA zeigt auch LNA bei Paarungen mit DNA eine größere thermische Stabilität als dies bei konventionellen DNA/DNA Heteroduplizes der Fall ist. LNA kann jedoch auf konventionellen Nucleinsäuresynthesemaschinen synthetisiert werden, während dies bei PNA nicht möglich ist. Daher ist LNA in mancher Hinsicht in bezug auf die Verwendung in erfindungsgemäßen Sonden vorteilhaft.
Der im wesentlichen funktionale Promotor, der durch die Bildung des erfindungsgemäßen Komplexes erzeugt wird, ist ein RNA Promotor (d. h. eine Struktur, die von einer RNA Polymerase erkannt wird und die die Synthese von RNA in Gegenwart einer geeigneten Polymerase und geeigneter Reagentien hervorruft). Ein "im wesentlichen funktionaler" Promotor kann für die vorliegenden Zwecke so definiert werden, daß er ein Nucleinsäurekomplex ist, der mindestens 20% oder mehr (vorzugsweise mindestens 50%, oder stärker bevorzugt mindestens 75% und am meisten bevorzugt mindestens 90%) der Promotoraktivität einer vollen doppelsträngigen Wildtyp Promotorsequenz aufweist, wobei das relative Ausmaß der Promotoraktivität durch Quantifizierung der Menge eines gegebenen RNA Transkriptes gemessen wird, das durch den Promotor in einer festgelegten Zeitspanne unter äquivalenten Bedingungen (z. B. in bezug auf die Temperatur und die Ribonucleotidtriphosphatkonzentration) synthetisiert wird.
Der Zielstrang kann jede Nucleinsäure (RNA oder stärker bevorzugt DNA) Sequenz von Interesse umfassen, wie die Sequenz eines Pathogen (so daß der Komplex z. B. verwendet werden kann, um das Vorliegen eines Pathogens zu delektieren) oder es kann sich um die Sequenz bestimmter humaner, tierischer oder pflanzlicher Allele handeln, so daß das Genom eines einzelnen Menschen oder eines einzelnen Tieres bestimmt werden kann. Zweckmäßigerweise (aber nicht notwendigerweise) umfaßt mindestens der Teil (typischerweise 2-4 Basen) des Ziels, der den Teil des zweiten Stranges des doppelsträngigen Promotors enthält, vorzugsweise DNA. Der Zielstrang kann DNA und/oder RNA umfassen.
In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis des Vorliegens einer Nucleinsäurezielsequenz von Interesse bereit, wobei das Verfahren umfaßt: Zugabe einer ersten und zweiten Sonde zu einer Probe, die die Sequenz von Interesse umfaßt, so daß ein Komplex gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung gebildet wird, Hervorrufen der Synthese einer neu synthetisierten Ribonucleinsäure aus einem im wesentlichen funktionellen Promotor, der in dem Komplex vorliegt, und direktes oder indirektes Delektieren der neu synthetisierten Nucleinsäure. Das Verfahren kann qualitativ oder quantitativ verwendet werden. Insbesondere kann das erfindungsgemäße Verfahren (und die Kits, wie unten definiert) verwendet werden, um das Vorliegen von Einzel-Nucleotid Polymorphismen ("SNP"s) in der Zielsequenz nachzuweisen und es kann in einem Screening mit hohem Durchsatz (HTS) für pharmacogenomische Untersuchungen verwendet werden.
In einem dritten Aspekt stellt die Erfindung einen Kit zum Bilden des Komplexes gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung bereit, wobei der Kit ein Paar Sondenmoleküle umfaßt, die mit dem Promotorstrang und dem zum Promotor komplementären Strang korrespondieren, und geeignete Verpackungsmittel. Der Kit ist vorzugsweise geeignet, um das Verfahren gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung durchzuführen. Daher umfaßt der Kit fakultativ ein oder mehrere der folgenden Komponenten: eine RNA Polymerase (insbesondere T3, T7 oder SP6 RNA Polymerase), eine DNA Polymerase (insbesondere Klenowfragment von DNA Polymerase I, Φ29 Polymerase, Bst Polymerase und Sequenase ), Deoxyribonucleotid- oder Ribonucleotidtriphosphate (markiert oder unmarkiert), Markierungsreagentien und/oder Detektionsreagentien (z. B. Fluorophore), Puffer und Instruktionen zur Verwendung in dem Verfahren gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung.
Daher umfaßt der Nucleinsäurekomplex gemäß der Erfindung typischerweise eine Zielsequenz, eine CS-Sonde und eine PS-Sonde. Die CS-Sonde (die den "zum Promotor komplementären Strang" trägt) umfaßt eine zielspezifische Region (oder "Fuß"), die spezifisch mit der Zielsequenz hybridisiert. Diese zielspezifische Region umfaßt die ersten Basen (vorzugsweise die ersten 2-4 Basen, stärker bevorzugt die ersten 3 Basen) eines RNA Polymerase Promotors, der mit den komplementären Basen in der Zielsequenz hybridisiert. Diese "Fuß"-Region der CS-Sonde kann zweckmäßigerweise LNA und/oder PNA umfassen, wodurch die Spezifität der Hybridisierung erhöht wird. Wenn PNA verwendet wird, können alle oder nahezu alle zum Ziel komplementäre Regionen PNA umfassen. Falls LNA verwendet wird, ist es normalerweise ausreichend, wenn 2-5 Basen des zielkomplementären Bereichs LNA umfassen, wobei der Rest typischerweise konventionelle Nucleinsäuren umfaßt. Die CS-Sonde umfaßt auch eine nichtzielkomplementäre "Arm"-Region, die an der zielspezifischen Fußregion anliegt und an diese angrenzend ist und die den Rest der RNA Polymerase Promotorsequenz umfaßt.
Die PS-Sonde (die den "Promotorstrang" trägt) umfaßt einen Teil, der zu der "Arm"- Region der CS-Sonde komplementär ist. Die PS-Sonde stellt den Rest der Sequenz bereit, die erforderlich ist, um einen im wesentlichen funktionalen RNA Polymerase Promotor zu bilden. Falls erwünscht, kann die PS-Sonde zusätzlich eine zielspezifische "Fuß"-Region umfassen, die mit dem Zielstrang in einer Position hybridisiert, die im wesentlichen an der CS-Sonde anliegt, aber das Vorliegen einer solchen zielspezifischen Region in der PS- Sonde ist nicht essentiell, um die Erfindung auszuführen. Wo die PS-Sonde einen zielkomplementären "Fuß" umfaßt, kann der Fuß PNA oder LNA umfassen, wie oben beschrieben.
Die PS-Sonde umfaßt vorzugsweise einen 5' Matrizenteil, der bei Bildung des funktionalen RNA Polymerase Promotors in mehrere RNA Kopien transkribiert wird. Das allgemeine Prinzip der Erfindung wird in Fig. 1 und 2 erläutert und unten sehr detailliert beschrieben. Das Arrangement ist so, daß in Abwesenheit der Zielnucleinsäure im wesentlichen keine De-novo RNA synthetisiert wird, da kein im wesentlichen funktionaler RNA Promotor gebildet wird (die miteinander hybridisierten Proben sind in Abwesenheit des Ziels nicht fähig, mindestens 20% der Aktivität des vollständig doppelsträngigen Wildtyp-Promotors bereitzustellen).
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung sind die ersten, die erkannt haben, daß einer der Stränge eines doppelsträngigen RNA Promotors diskontinuierlich sein kann und durch nicht ligierte separate Nucleinsäuremoleküle gebildet werden kann und dennoch weiterhin ein im wesentlichen funktionalen RNA Promotor bereitstellt. Insbesondere sind die Erfinder die ersten, die erkannt haben, daß dieses Phänomen verwendet werden kann, um ein Verfahren zur Detektion des Vorliegens und/oder der Menge einer Nucleinsäuresequenz von Interesse bereitzustellen.
Der RNA Polymerase Promotor ist vorzugsweise ein solcher, der durch eine Bakteriophagen RNA Polymerase erkannt wird, so z. B. T3, T7 oder SP6 Polymerase oder jede der mutanten Formen davon, die dem Fachmann bekannt sind. Insbesondere sind mutante RNA Polymerasen bekannt, die bei der Durchführung des Verfahrens verwendbar sind und die RNA oder DNA synthetisieren können (s. Kostyuk et al, 1995 FEBS Letts. 369,165-168).
Die Sequenz des T3 RNA Polymerase Promotors (beschrieben im Stand der Technik) ist:
5' AAATTAACCCTCACTAAA 3'
3' TTTAATTGGGAGTGATTT 5' (Seq. ID Nos. 1 and 2)
(Es ist auch eine Anzahl von Varianten T3 Promotor Sequenzen bekannt, insbesondere solche, in denen die ersten drei Basen des Nicht-Matrizenstranges [der obere Strang von den oben gezeigten] 5 TTA 3' und nicht AAA ist).
Die Sequenz des T7 RNA Polymerase Promotors (im Stand der Technik beschrieben) ist:
5' TAATACGACTCACTATA 3'
3' ATTATGCTGAGTGATAT 5' (Seq. ID Nos. 3 and 4)
Die Sequenz des SP6 RNA Polymerase Promotors (im Stand der Technik beschrieben) ist:
5' ATTTAGGTGACACTATA 3'
3' TAAATCCACTGTGATAT 5' (Seq. ID Nos. 5 and 6)
Es ist wünschenswert, daß mindestens eine der Sonden im Komplex einen "Matrizenteil" umfaßt, der von der Polymerase, die den in dem Komplex gebildeten Promotor erkennt, als Matrize verwendet werden kann, so daß die Bildung des erfindungsgemäßen Komplexes die Synthese einer neu synthetisierten Ribonucleinsäure ermöglicht, die direkt oder indirekt in jeder beliebigen Art delektiert werden kann, wobei die Arten der Detektion für den Fachmann offensichtlich sind. Der Matrizenteil liegt vorzugsweise auf dem Promotorstrang vor.
Es ist allgemein bevorzugt, daß das 3'-Ende in irgendeiner Art blockiert ist, so daß die durch RNA Polymerase hervorgerufene Verlängerung von diesem nicht möglich ist. Dies ist insbesondere dann wünschenswert, wenn der Promotorstrang einen zum Ziel komplementären Teil umfaßt. Das Blockieren des 3'-Endes wird zweckmäßigerweise durch Bereitstellen einer Phosphatgruppe oder einer Propylgruppe anstelle der OH-Gruppe am 3'- terminalen Nucleotid erreicht. Andere Verfahren zum Blockieren des 3'-Endes sind dem Fachmann gut bekannt.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gefunden, daß die Wirksamkeit der Initiation der RNA Synthese durch den RNA Polymerase Promotor durch Sequenzen hervorgerufen wird, die an den Promotor anliegen, und zwar stromabwärts. Insbesondere wird eine Region von 12 Basen (die "+12 Region") für eine optimale RNA Transkription benötigt. Es ist daher bevorzugt, daß der Matrizenteil des Komplexes, der transkribiert wird, eine +12 Region umfaßt, die für die den Promotor erkennende Polymerase geeignet ist. Die Erfinder haben die optimale Sequenz der +12 Regionen für die T7 Polymerase aufgeklärt (unten detaillierter beschrieben) - bislang ist noch nicht bekannt, ob diese auch für z. B. T3 und SP6 Polymerasen optimal sind. Falls, was möglich ist, SP6 und T3 Polymerase andere +12 Regionen haben, wäre es für den Fachmann ein Einfaches, die relevanten Sequenzen unter Nutzung der vorliegenden Offenbarung durch ein Versuch- und-Irrtum-V erfahren zu identifizieren.
Die Sequenzen der bevorzugten +12 Regionen, zum Einbeziehen in den Matrizenteil des Promotorstranges, sind unten in Tabelle 1 gezeigt (in bezug auf T7 Polymerase). Die am stärksten aktive +12 Region (die die stärkste Transkription ergibt) ist oben gezeigt, wobei die anderen Sequenzen in absteigender Reihenfolge der Bevorzugtheit gezeigt sind.
Tabelle 1

Alternative Matrizen +1 bis +12 Sequenzen für T7 Polymerase, in absteigender Reihenfolge der Transkriptionseffizienz (Seq. ID Nr. 7-15).

5' GTTCTCTCTCCC 3'
5' GCTCTCTCTCCC 3'
5' GTTGTGTCTCCC 3'
5' GATGTGTCTCCC 3'
5' ATCCTCTCTCCC 3'
5' GTTCTCGTGCCC 3'
5' ATCCTCGTGCCC 3'
5' GCTCTCGTGCCC 3'
5' GTTGTGGTGCCC 3'
(Die 5' Base wird als +1 numeriert, wobei sie die erste Base stromabwärts vom Ende der Promotorsequenz aus gesehen ist, die 3' Base wird als +12 numeriert).
In einer weiteren Ausführungsform könnte der Matrizenteil des Komplexes (vorzugsweise auf dem Promotorstrang) Sequenzen enthalten, die zum Identifizieren, Delektieren oder Amplifizieren der De-novo synthetisierten RNA Kopien verwendet werden können (s. z. B. WO 93/06240 und US 5 554 516). Diese Sequenzen werden zweckmäßigerweise angrenzend an und stromaufwärts von einer +12 Region (wie oben beschrieben) plaziert und können, wobei dies nicht limitierend ist, vom Folgenden eines oder mehrere umfassen:
einzigartige "molecular beacon" Sequenzen, Fang-Sequenzen, zu der Detektionssonde komplementäre Sequenzen, alternative RNA Promotorsequenzen zur Verwendung in einer isothermen Amplifikations-Zyklierungsreaktion (s. unten). Eine besondere einzigartige Sequenz, die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung besonders verwendbar ist, wird durch die Basen 791-820 der 165 ribosomalen RNA aus Streptomyces brasiliensis (Stackebrandt et al., 1991 Appl. Environ. MicrobioL, 57, 1468-1477) bereitgestellt, wobei diese Sequenz mit keiner bekannten humanen DNA und keiner DNA eines bekannten humanen Phatogens ein Alignment aufweist.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann es vorteilhaft sein, wenn eine Sequenz von Interesse in einer Mischung delektiert werden soll, die doppelsträngige DNA (wie z. B. genomische DNA) umfaßt, in der Hybridisierungsmischung ein oder mehrere weitere Oligonucleotide ("blockierende Oligonucleotide") einzubeziehen. Diese blockierenden Oligonucleotide (vorzugsweise als Paar bereitgestellt) hybridisieren mit der Sequenz von Interesse, typischerweise auf jeder Seite des Teils, der zu der ersten Sonde komplementär ist (und zu dem Teil, der zur zweiten Sonde komplementär ist, wenn die zweite Sonde einen zielkomplementären Teil umfaßt). Die blockierenden Oligonucleotide umfassen vorzugsweise DNA, PNA, LNA (oder eine Kombination daraus) und vorteilhafterweise umfaßt jedes mindestens 10 (vorzugsweise mindestens 20) Nucleotide. Der Zweck der blockierenden Oligonucleotide besteht darin, daß Re-Annealing des Zielstranges mit seinem komplementären Strang (unter den eingesetzten Hybridisierungsbedingungen) zu verhindern. Die blockierenden Oligonucleotide können an den Zielstrang im wesentlichen an die erste und zweite Sonde anliegend annealen oder sie können davon entfernt (z. B. 5 bis 50 Basen) annealen.
Blockierende Oligonucleotide können u. U. weniger Vorteile bieten, falls die erste und/oder zweite Sonde große Ziel komplementäre "Fuß"-Regionen enthält.

Detektionsverfahren

Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren produzierte RNA konnte auf mehrere Arten delektiert werden, vorzugsweise nach der Amplifikation (am meisten bevorzugt durch einen isothermen Amplifizierungsschritt). Z. B. konnte neu synthetisierte RNA auf konventionelle Art (z. B. durch Gelelektrophorese) delektiert werden, mit oder ohne Einbeziehung von markierten Basen während der Synthese.
Alternativ konnte z. B. neu synthetisierte DNA auf einer festen Oberfläche (z. B. einem Kügelchen oder an einer Microtiterplatte) angelagert werden und das angelagerte Molekül durch Hybridisierung mit einer markierten Nucleinsäuresonde (z. B. Radio-markiert oder stärker bevorzugt mit einem Enzym, Chromophor, Fluorophor und ähnlichem markiert) delektiert werden.
Ein bevorzugtes Detektionsverfahren involviert die Verwendung von Techniken des Fluoreszenzresonanzenergietransfers ("FRET"), des verzögerten Fluoreszenzenergietransfers ("DFRET") oder der homogenen zeitaufgelösten Fluoreszenz ("HTRF"). FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) tritt auf, wenn ein Fluoreszenz Donor Molekül Energie auf dem Wege einer nichtstrahlenden Dipoldiopol-Wechselwirkung auf ein Akzeptormolekül überträgt. Beim Energietransfer, der vom R&supmin;&sup6; Abstand zwischen dem Donor und dem Akzeptor abhängt, werden die Lebenszeit des Donors und die Quantenausbeute reduziert und die Akzeptorfluoreszenz wird verstärkt oder sensibilisiert.
Die Erfinder haben FAM (6-Carboxyfluoresziin) und TAMRA (N,N,N',N'-tetramethyl-6- carboxy Rhodamin) als Donor und Akzeptor in einem Nucleinsäurehybridisierungsassay verwendet. Der Assay verwendet zwei farbstoffmarkierte DNA Oligomere (15 Mere). FAM wird an das 5'-Ende der einen Sonde und TAMRA an das 3'-Ende der anderen gebunden. Bei Hybridisierung mit Zielnucleinsäure werden die Sonden aneinander anliegend positioniert und FRET kann auftreten. Die Experimente der Erfinder haben demonstriert, daß die Sonden für ein maximales Signal durch fünf Basen getrennt sein müssen.
Ein anderer Ansatz (DEFRET, Delayed Fluorescence Energy Transfer) besteht darin, einzigartige Eigenschaften bestimmter Metallione (Lanthanide, z. B. Europium) auszunutzen, die darin bestehen, daß sie eine effiziente langlebige Emission aufweisen, wenn sie in ihren erregten Zustand angehoben werden (λ Erregung = 337 nm, λ Emission = 620 nm). Der Vorteil einer solchen langlebigen Emission besteht in der Fähigkeit, zeitaufgelöste (TR) Techniken zu verwenden, in denen die Messung der Emission nach einer anfänglichen Pause gestattet wird, so daß die gesamte Hintergrundfluoreszenz und die Lichtstreuung abgeklungen ist. Cy5 (Amersham Pharmacia) (λ Erregung = 620 nm, λ Emission = 665 nm) kann als DEFRET Partner verwendet werden.
HTRF (s. WO 92/01224, US 5 534 622) tritt auf, wenn der Donor (Europium) in einen Schutzkäfig eingeschlossen wird (Cryptat) und an das 5'-Ende eines Oligomers gebunden wird. Das Akzeptormolekül, das für dieses System entwickelt worden ist, ist ein Proteinfluorophor mit der Bezeichnung XL665. Dieses Molekül ist an das 3'-Ende der zweiten Sonde gebunden. Dieses System wurde von Packard entwickelt.
In einer anderen Ausführungsform führt die neu synthetisierte RNA, vor oder nach der Amplifikation, zu der Bildung eines Ribozyms, das zur Spaltung einer besonderen Nucleinsäuresubstratsequenz delektiert werden kann (z. B. Spaltung eines Fluorophor/Quencherdual-markierten Oligonucleotids).

Amplifizierungstechniken

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die von der zielabhängigen Transkriptionsreaktion abhängige RNA vor oder nach der Detektion amplifiziert, wobei der Amplifizierungsschritt typischerweise das Einführen eines DNA Oligonucleotids erfordert. Der Amplifizierungsschritt wird vorteilhafterweise isothermisch herbeigeführt (d. h. ohne das Erfordernis einer thermischen Zyklierung derart, wie sie bei der Durchführung eines PCR essentiell ist). Das eingeführte DNA Nucleotid ist zu der 3' Region der neu synthetisierten RNA komplementär und enthält auch die Sequenz eines Polymerase Promotors und einer einzigartigen transkripierbaren Sequenz (Matrizenteil). Bei Hybridisierung der neu synthetisierten RNA mit dem DNA Oligonucleotid erzeugt eine Primerextensionsreaktion vom 3'-Ende der RNA, hervorgerufen durch die zugegebene RNA Polymerase, einen funktionalen doppelsträngigen RNA Polymerase Promotor. In Gegenwart der relevanten RNA Polymerase werden multiple Kopien einer zweiten RNA Spezies aus der einzigartigen Region des DNA Oligonucleotids synthetisiert. Diese RNA kann ihrerseits als Primer für eine weitere Runde von Primerverlängerungs- und RNA- Synthesen dienen. Die Synthese weiterer RNA erfordert das Vorliegen eines anderen DNA Oligonucleotids, das zu der 3' Region der zweiten RNA Spezies komplementär ist. Dieses DNA Oligonucleotid enthält auch die Sequenz eines RNA Polymerase Promotorelements, zusammen mit einer Sequenz, bei dessen Transkription RNA entsteht, die Sequenzen umfaßt, die identisch zu den von der zielabhängigen Transkriptionsreaktion abgeleiteten sind. Das 3'-Ende der so synthetisierten RNA ist zu dem ersten DNA Oligonucleotid komplementär und daher wird ein zyklisches Amplifikationssystem erzeugt (s. Fig. 3).
In diesen Ausführungsformen ist es wichtig, daß der RNA Promotor (die RNA Promotoren), der (die) während des Amplifizierungsschrittes (der Amplifizierungsschritte) gebildet wird (werden) so ausgewählt ist (sind), daß er (sie) durch eine Polymerase erkannt wird (werden), die unterschiedlich ist zu der, die den Splitpromotor erkennt, der anfänglich an der 2/2- oder 3-Wege Kreuzung gebildet wird, so daß die unbeabsichtigte Bildung eines kompletten Promotors ab initio verhindert wird, die zu einem sehr hohen Hintergrundsignal führen würde.
In einer Variante der oben beschriebenen Ausführungsform hybridisiert das eingeführte DNA Oligonucleotid mit der De-novo synthetisierten RNA, wobei die jeweiligen Sequenzen so gestaltet sind, daß ein weiterer RNA Polymerase Promotor direkt gebildet wird, ohne die Notwendigkeit eines DNA Polymerase abhängigen Verlängerungsschritts (s. Fig. 13). Die Zyklierungsreaktion kann dann im wesentlichen wie oben beschrieben durchgeführt werden, wobei das Transkript von einer Reaktion mit dem DNA Oligonucleotid hybridisiert, um einen zweiten RNA Promotor zu bilden, der ein Transkript erzeugt, das eine mit dem originalen Transkript gemeinsame Sequenz umfaßt.
In einer weiteren Variante umfaßt eine von einem Splitpromotor erzeugte RNA Spezies ihrerseits die ersten Phasen eines RNA Polymerase Promotors, so daß die RNA ihrerseits die Zielsequenz für die Bildung eines zweiten Splitpromotors sein kann (bei der 2'/2- oder 3-Weg Kreuzung) was zur Synthese einer weiteren RNA Spezies führt. Falls erwünscht können die Sequenzen der Matrizenteile so ausgewählt sein, daß sie einen Amplifizierungszyklus erzeugten, in dem das RNA Transkript von einem Splitpromotor das Ziel für das Erzeugen eines zweiten Splitpromotors bildet, was ein Transkript erzeugt, das den ersten Splitpromotor erneut bildet. Dieses Schema ist in seinen Grundzügen in Fig. 15 illustriert. Es ist klar, daß in einem Amplifizierungszyklus dieser Art kein Erfordernis besteht, eine RNA Promotorsequenz zu verwenden, die sich von der in der original 2¹/&sub2;- oder 3-Weg Kreuzung unterscheidet, da das Verfahren in Abwesenheit des Ziels keinen vollständigen doppelsträngigen RNA Promotor ab initio bilden würde.
Das obige System kann so arrangiert sein, daß ein RNA Transkript eine Vielzahl von Teilen des RNA Promotors umfaßt, so daß er fähig ist, eine Vielzahl von Splitpromotoren in einem einzigen Zyklus zu bilden, wobei der Grad der Amplifikation erhöht wird. In ähnlicher Weise könnten in den anderen Arten der oben beschriebenen Amplifizierungszyklen die zugegebenen Oligonucleotide, falls erwünscht, zur Bildung einer Vielzahl von RNA Promotoren fähig sein.
In den obigen Amplifizierungstrategien kann ein gewisses Hintergrund "Rauschen" erzeugt werden, da die Tendenz von vielen RNA Polymerasen (bei relative niedriger Geschwindigkeit) RNA Transkripte einer einzelsträngigen DNA Sequenz zu bilden vorhanden ist. So kann z. B. in bezug auf Fig. 3 eine gewisse Transkription der DNA Oligonucleotide (16) und (22) auftreten, sogar bei der jeweiligen Abwesenheit der RNA Moleküle (14) und (20); oder das gleiche Phänomen kann auftreten, mit Bezug auf Fig. 13 in Abwesenheit der RNA Moleküle (14) und (52). Es ist möglich, daß dieser niedrige Grad an Hintergrundtranskription durch Entwerfen von Oligonucleotiden (16 und 22 in Fig. 3; 50 und 54 in Fig. 13) vermindert werden kann, so daß diese nahe an ihrem 3'- Ende eine Sequenz einschließen, die zur Termination von Transkription tendiert. Ein Beispiel einer solchen Sequenz, die insbesondere bei der Termination einer T7 Polymerase vermittelten Transkription wirksam ist, ist AACAGAT (im Matrizenstrang), wie durch He et al. (1998 J. Biol. Chem. 273, 18, 802) offenbart. Die gleiche oder eine ähnliche Terminationssequenz könnte am 5'-Ende der DNA Matrize positioniert sein, um die Prozessierbarkeit zu erhöhen.
Verschiedene Ausführungsformen der Erfindung werden nun beschrieben, indem illustrative Beispiele gegeben werden und ein Bezug auf die beiliegenden Zeichnungen hergestellt wird, in denen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Komplexes ist, der eine "3-Weg "-Kreuzung umfaßt;
Fig. 2, 4, 6-9, 11 und 12 schematische Darstellungen eines erfindungsgemäßen Komplexes sind, der eine "2¹/&sub2;-Weg"-Kreuzung enthält;
Fig. 3, 13 und 15 schematische Darstellungen eines Verfahrens zur Detektion einer Zielsequenz von Interesse durch Amplifizierung von Nucleinsäuresynthese sind;
Fig. 5 ein Balkendiagramm ist, die die relativen Fluoreszenzeinheiten zeigt, die nach verschiedenen Nucleinsäureamplifizierungsschritten vorliegen; und
Fig. 10 und 14 Balkendiagramme sind, die Picomole von RNA zeigen, die nach verschiedenen Nucleinsäureamplifizierungsreaktionen hergestellt sind.
Fig. 1 zeigt einen erfindungsgemäßen Komplex. Der Komplex umfaßt einen zum Promotor komplementären Strang "CS" (2), einen Promotorstrang "PS" (4) und einen Zielstrang (6). Der CS (2) umfaßt die Sequenz voller Länge eines ersten Stranges eines doppelsträngigen Promotors (als "Pr" in der Figur markiert). Der Zielstrang (6) umfaßt drei Basen, die am Endteil (8) des zweiten Stranges des doppelsträngigen Promotors liegen, der komplementär ist zu einem Teil des CS (2). Der PS (4) umfaßt den Rest des zweiten Stranges des doppelsträngigen Promotors, wobei der Teil komplementär ist zum ersten Strang des Promotors, der durch CS (2) bereitgestellt wird. Die Hybridisierung des CS (2) zu dem Zielstrang (6) oder Hybridisierung des CS (2) mit PS (4) ist nicht hinreichend, um einen funktionalen, doppelsträngigen Promotor zu bilden. Ein im wesentlichen funktionaler Promotor wird jedoch durch Hybridisierung von CS (2) mit sowohl dem Zielstrang (6) als auch PS (4) gebildet, was einen erfindungsgemäßen Komplex repräsentiert.
In der in Fig. 1 gezeigten Ausführungsform umfaßt der PS (4) einen Teil (10), der zu dem Zielstrang (6) komplementär ist, so daß der Komplex etwas bildet, was man vielleicht als "Dreiwegekreuzung" beschreiben kann. In einer alternativen Ausführungsform, schematisch in Fig. 2 gezeigt, umfaßt das PS (4) keinen Teil, der komplementär zum Zielstrang (6) ist, so daß der Komplex etwas bildet was man vielleicht als "Zweieinhalbwegekreuzung" (21/2-Wege-Kreuzung) beschreiben kann. Sowohl in der in Fig. 1 als auch in der in Fig. 2 beschriebenen Ausführungsform umfaßt das PS (4) einen Matrizenteil (12), der als Zielnucleinsäurestrang für eine De-novo-Nucleinsäuresynthese dienen kann, sobald der funktionale Promotor gebildet ist. Der Matrizenteil (12) umfaßt vorzugsweise auch eine +12 Region zur Optimierung der Transkriptionseffizienz durch RNA Polymerase. Die neu synthetisierte Nucleinsäure ist zweckmäßigerweise RNA, synthetisiert unter dem Einfluß eines RNA Polymerase Promotors, so daß multiple RNA Transkripte (14) des Matrizenteils (12) gebildet werden.
Die De-novo synthetisierte Nucleinsäure (14) kann direkt oder indirekt delektiert werden. Vorzugsweise wird die De-novo synthetisierte Nucleinsäure (14) vor der Detektion einem Amplifizierungsverfahren unterworfen. Dem Fachmann ist eine große Anzahl an geeigneten Detektionsverfahren bekannt. Z. B. kann die De-novo synthetisierte Nucleinsäure (14) an eine komplementäre "molecular beacon" Oligonucleotidsequenz hybridisieren (z. B. wie in Tyagi & Kramer, 1996 Nature Biotechnology 14, 303-308) beschrieben, so daß die De-novo Synthese zu einem verstärkten oder gegebenenfalls abgeschwächten Fluoreszenzsignal führt. Alternativ kann der Matrizenteil (12) angemessenerweise so ausgewählt sein, daß die mit dem Teil (12) als Matrize synthetisierten DNA oder RNA Moleküle z. B. Fang-Sequenzen oder Detektionssequenzen umfassen können.
Wie oben erwähnt, wird die De-novo synthetisierte Nucleinsäure vorzugsweise vor der Detektion einem Amplifizierungsschritt unterworfen. Der Amplifizierungsschritt ist so gestaltet, daß eine kleine Menge der De-novo synthetisierte Nucleinsäure zur Erzeugung eines großen Signalumfangs führt. Wünschenswerterweise wird der Amplifizierungsschritt durch Ausführen von zwei oder mehreren Nucleinsäuresyntheseschritten einer zyklischen Art erreicht, so daß das Nucleinsäureprodukt in einem ersten Syntheseschritt als Primer für einen zweiten Nucleinsäuresyntheseschritt dient, wobei das Produkt als Primer für den ersten Nucleinsäuresyntheseschritt dient usw. Eine zyklische Amplifikation dieser Art ist in WO 93/06240 offenbart.
Fig. 3 ist eine schematische Darstellung einer Ausführungsform einer zyklischen Nucleinsäuresynthese, die zur Amplifikation der Nucleinsäure führt. In der Fig. 3 ist das 3'-Ende des De-novo synthetisierten RNA Transkripts (14), hergestellt aus dem Matrizenteil (12) der Zweiten Sonde (4), mit einem zugegebenen DNA Oligonucleotid (16) hybridisiert. In Schritt (i) wird das 3'-Ende des Transkripts (14) durch Zugabe von Ribonucleotiden und/oder Deoxyribonucleotiden in Gegenwart einer geeigneten Polymerase verlängert. In der erläuterten Ausführungsform ist der verlängerte Teil (des Transkripts (14)) selbstverständlich zu dem Oligonucleotid (16) komplementär und bildet einen aktiven doppelsträngigen RNA Promotor (18), der durch eine geeignete RNA Polymerase erkannt wird, so daß multiple Kopien einer zweiten RNA Spezies (20) produziert werden, die ein Transkript des 5'-Ende des DNA Oligonucleotids (16) sind.
Das 3'-Ende der RNA Moleküle (20) kann wiederum mit weiteren zugegebenen DNA Oligonucleotiden (22) hybridisieren (Schritt ii). Wie vorher kann das 3'-Ende des RNA Moleküls (20) eine Primel-Verlängerung (Schritt iii) durch Zugabe von Ribo- oder (vorzugsweise) Deoxyribonucleotiden erfahren, wobei ein aktiver doppelsträngiger RNA Promotor (24) gebildet wird, der durch die relevante RNA Polymerase erkannt wird, die multiple Kopien eines RNA Moleküls bilden, das ein Transkript des 5'-Endes des DNA Oligonucleotids (22) ist.
Die Sequenz der DNA Oligonucleotide (16) und (22) ist vorzugsweise so ausgewählt, daß die von dem Oligonucleotid (22) produzierten RNA Transkripte Sequenzen umfassen, die mit denen identisch sind, die in dem RNA Transkripten (14) vorliegen, die ursprünglich hergestellt wurden, so daß ein Zyklus gebildet wird (Schritt iv), in dem die zuletzt synthetisierten RNA Moleküle mit dem DNA Oligonucleotid (16) hybridisieren können und unter Bildung des RNA Promotors (18) verlängert werden, usw. Auf diese Art kann eine massive Amplifizierung des originalen Transkripts (14) erreicht werden, wobei die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Detektionsverfahrens stark erhöht wird.
Fig. 15 ist eine schematische Darstellung eines Amplifizierungszyklus, in dem ein De- novo synthetisiertes RNA Transkript (14) von einem durch die Gegenwart der Sequenz von Interesse gebildeten Splitpromotor mit der ersten und zweiten Sonde (60 bzw. 62) hybridisiert, um einen zweiten Splitpromotor zu bilden (im allgemeinen als 64 bezeichnet). Die Sequenz des Matrizenteils der zweiten Proben (62) ist so, daß das RNA Transkript (66) von einem Splitpromotor (64) als Ziel für ein weiteres Paar von ersten und zweiten Sonden (68 bzw. 70) dienen kann, wodurch ein dritter Splitpromotor gebildet wird (im allgemeinen als 72 bezeichnet). Die Sequenz des Templateteils der zweiten Probe (70) ist so, daß das durch den Splitpromotor (72) gebildete RNA Transkript im wesentlichen die gleiche Sequenz aufweist, wie das original RNA Molekül (14), so daß der zweite Splitpromotor (64) erneut gebildet werden kann, wodurch sich ein Amplifizierungszyklus ergibt.

Beispiele

Beispiel 1

Transkription von einem Split T7 RNA Polymerase Promotor an einer 2¹/&sub2;-Wege-Kreuzung

Dieses Beispiel demonstriert das Erzeugen eines funktionalen DNA abhängigen RNA Polymerase Promotors als Ergebnis der Bildung einer 2 -Wege-Kreuzung, umfassend die Zielnucleinsäure (Ziel: Wildtyp humanes DNA zystische Fibröse Transmembran Konduktanz Regulator Gen (CFTR) in dem eine Deletion von TTT eine zystische Fibröse kodierende Mutation ΔF508 hervorruft), ein teilweise komplementäres Oligonucleotid (komplementärer Strang) und ein Promotorstrang. In dem Beispiel wird die Zielsequenz durch ein synthetisches Oligonucleotid bereitgestellt, das dazu dient, das Prinzip der Erfindung zu demonstrieren. In der Praxis würde die Zielsequenz eine komplexe Mischung von chromosomaler DNA umfassen.
Das Beispiel wird schematisch in Fig. 4 illustriert. Der komplette T7 Promotor liegt am 3'-Ende der promotorkomplementären Strangsonde (2). Die ersten drei (5') Basen der Promotorsequenz sind durch drei Basen (3' ATT 5') (8) im Zielstrang (6) komplementiert, und die Sonde (2) hybridisiert mit dem Ziel (6) auf solche Weise, daß das 3TTT5' im Wildtyp 14 Basen stromabwärts vom Start des Promotors liegt. Die Hybridisierung einer Promotorstrangsonde (4) (an deren 3'-Ende das Komplement zu dem T7 Promotor minus drei Basen liegt) mit Sonde (2) bildet einen doppelsträngigen Promotor, der durch die drei Basen (8) im Ziel (6) komplettiert wird und daher wird ein Splitpromotor gebildet, um eine De-novo synthetisierte DNA (14) in Gegenwart der T7 RNA Polymerase zu bilden.
Zweckmäßigerweise wird die Promotorstrangsonde (4) hiemach als PS Sonde bezeichnet und die zum Promotor komplementäre Strangsonde (2) wird hiemach als CS Sonde bezeichnet.

1.1 Herstellung der Oligonucleotide

Die Zieloligonucleotide und Sonden wurden durch Phosphoramidit Chemie unter Verwendung eines Applied Biosystems 380A Synthetisierers synthetisiert, der gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wurde. Alle Oligonucleotide wurden unter Verwendung von Standardtechniken HPLC gereinigt.

1.2 Splitpromotorsonde und RNA Synthese

Die Hybridisierungsreaktionen umfaßten Mischungen von DNA einschließlich Zieloligonucleotiden (6) PS und CS Sonden zusammen mit relevanten Kontrollen, die Mischungen mit und ohne Ziel/Sonden umfaßten. Für die Hybridisierungsreaktionen wurden 40 fmol eines Zieloligonucleotids mit 40 fmol einer PS Sonde und 40 fmol einer CS Sonde in einer Lösung gemischt, die 4 ul 5 · T7 RNA Polymerasepuffer (von Promega, ergibt 1 · Konzentrationen von 40 mM Tris (pH 7,9) 6 mM MgCl&sub2;, 2 mM Spermidin und 10 mM NaCl) und destilliertes Wasser auf ein Endvolumen von 20 ul enthielt (Zugabe am Ende von T7 RNA Polymerase und rNTP Mischung). In diesem Beispiel und in anderen in dieser Beschreibung, kann Milligan's Puffer (Milligan et al., 1987 Nucl. Acids Res. 15, 8783-8798) anstelle von Promega RNA Polymerasepuffer verwendet werden. In der Tat kann in solchen Beispielen, in denen keine DNA Polymerase verwendet wird (z. B. wenn kein DNA Polymerase abhängiger Primerverlängerungsamplifikationsschritt erfolgt) Milligan's Puffer bevorzugt sein. Die Zusammensetzung von Milligan's Puffer ist wie folgt: 20 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 80 mg/ml PEG, 50 ug/ml BSA, 0,01% (Gew./Gew.) Triton X-100 (Triton X-100 ist eine registrierte Marke), 1 mM Spermidin und 40 mM Tris HCl, pH 8,1.
Die Mischung wurde für 30 Minuten auf 90ºC erhitzt, um die Nucleinsäuren zu denaturieren, 2 Minuten auf Eis inkubiert und 1 Minute bei 37ºC equillibriert. Die Proben wurden annealed und für 180 Minuten bei 37ºC durch Zugabe von 40 Einheiten T7 RNA Polymerase (Promega) und 40 nmol rNTP Mischung (Pharmacia Biotech) transkripiert. Die DNA Oligonucleotide wurden aus der Reaktionsmischung durch Zugabe von 4 Einheiten DNase I (Ambion) entfernt und bei 37ºC bei 20 Minuten vor der Enddetektion inkubiert. Das resultierende Produkt wurde durch Synthetisierung mit einem spezifischen biotinylierten Oligonucleotid (Sonde 3) immobilisiert, das wiederum an einen mit Streptavidin beschichteten Napfgebunden war. Das immobilisierte Produkt wurde durch zeitaufgelöste Fluoreszenz auf dem Wege der Hybridisierung der Sonde 4, einer Europium markierten Oligonucleotidsonde (s. unten), delektiert.

1.3 Detektion von RNA durch zeitaufgelöste Fluoreszenz (TRF)

5 ul einer Reaktionsprobe wurden der Reaktionsmischung, die aus 145 ul Wallac (E. G. & G. Wallac, Crown Hill Business Centre, Milton Keynes, UK) Assaypuffer, 0,9 umol Sonde 3 und 0,3 umol Sonde 4 bestand, in einem Napf einer mit Labsystems Streptavidin beschichteten Microtiterplatte zugegeben, die bei Raumtemperatur für 60 Minuten inkubiert wurde (N. B. die Verwendung einer längeren Sonde PS ergibt ein Transkript mit längerem Fangende, so daß dessen Einfang mit der verlängerten biotinylierten Sonde 3a zu einer stärker sensitiven Detektion führt). Ungebundenes Material wurde durch Waschen der Näpfe mit 4 · 200 ul Wallac Waschlösung entfernt. 180 ul Wallac Verstärkungslösung wurden zugegeben, um das Europium von seiner gelatisierten Bindung an Sonde 4 zu dissoziieren und TRF wurde alle 10 Minuten bis zur 60. Minute gemessen, unter Verwendung des Europiumprotokolls auf einem Wallac Victor 1420 Multilabel Zähler.
Die erhaltenen Resultate (unter Verwendung der Proben Psa und 3a) sind in Fig. 5 gezeigt.

1.4 Liste der Oligonucleotide

Im allgemeinen gilt in den in Beispiel 1 offenbarten Oligonucleotidsequenzen und den nachfolgenden Beispielen unten: kleine Buchstaben zeigen die Stelle der ΔF508 Mutation, Promotorteile sind unterstrichen abgebildete, die Teile der Sonde, die zur Detektionszwecke verwendet werden, sind in Kursivschrift ausgerührt und die Einfangteile sind in Fettdruck ausgeführt. Die 3'Phosphatgruppen auf PS Sonden (wo sie vorhanden sind) sind fakultativ. Zieloligonucleotid (normale Wildtyp CFTR DNA)

CS Sonde (T7 Promotor)

5' ATAGGAAACACCAAAGATGATATTTTCTTTAATACGACTCACTATA 3' (Seq. ID No. 17) PS Sonde (T7 Promotor mit 3'ATT 5' Startsequenz im Ziel und Matrizenteil)
PSa Sonde (T7 Promotor mit 3'ATT 5' Startsequenz im Ziel und Matrizenteil mit Einfangende, verlängert auf 20 Basen für stärker sensitiven Einfang und stärker sensitive Detektion, unter Verwendung von Sonde 3a)

Sonde 3 (mit 5' Biotin, um das Einfangen auf Streptavidin beschichteten Platten zu ermöglichen)

5' TGCCTCCTTGTCTCCGTTCT 3' (Seq. ID No. 20)

Sonde 3a (Version von Sonde 3a, verlängert durch 5 Basen, um einen stärker sensitiven Einfang von Transkripten von Probe PSa zu ermöglichen)

5' TCCGCTGCCTCCTTGTCTCCGTTCT 3' (Seq. ID No. 21)

Sonde 4 (Europium markiert)

5- GGATATCACCCG 3' (Seq. ID No. 22)

Beispiel 2

Transkription von einem Split T3 RNA Polymerase Promotor an einer 2¹/&sub2;- Wege-Kreuzung bei ΔF508

Dieses Beispiel ist schematisch in Fig. 6 illustriert. Der komplette T3 Promotor liegt nahe am 3'-Ende der CS Sonde (2). Die ersten drei Basen des T3 RNA Polymerase Promotors (5' AAA 3') in der CS Sonde (2) annealed an der 3' TTT 5' ΔF508 Seite (8) im Wildtyp Ziel (6) und daher führt die ΔF508 Mutation zu einem Verlust des Splitpromotorstarts mit anschließendem Verlust der Transkription. Die Hybridisierung einer PS Probe (4) (an deren 3'-Ende das Komplement des T3 Promotors minus drei Basen liegt) an die CS Probe (2) bildet einen doppelsträngigen Promotor, der durch die drei Basen (3' TTT 5') im Ziel komplettiert wird und daher wird ein Splitpromotor gebildet, um eine De-novo synthetisierte RNA (14) in Gegenwart einer T3 RNA Polymerase zu bilden.

2.1 Herstellung von Oligonucleotiden

Die Zieloligonucleotide und Sonden werden synthetisiert und gereinigt, wie in Beispiel 1 beschrieben.

2.2 Splitpromotorsonde und RNA Synthese

Die Hybridisierungsreaktionen umfassen Mischungen von DNA, einschließlich Zieloligonucleotide, PS und CS Sonden, zusammen mit relevanten Kontrollen, umfassend Mischungen mit und ohne Ziele/Sonden PS und CS. Hybridisierungsreaktionen werden wie in Beispiel 1.2 beschrieben etabliert, unter unter Verwendung der Sondensequenzen, wie sie unten detailliert beschrieben sind und der T3 RNA Polmyerase/Puffer (Promega). Die Hybridisierungsmischung wird dann wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt, aber unter Verwendung der Sonde 3 und Sonde 4 Sequenzen, die unten detailliert beschrieben sind.

2.3 Detektion von RNA durch zeitaufgelöste Fluoreszenz (TRF)

5 ul Reaktionsprobe wird zu der Reaktionsmischung aus 145 ul Wallac Assaypuffer, 0,9 pmol Sonde 3 und 0,3 umol Sonde 4 in einem Napfeiner Labsystems Streptavidin beschichteten Microtiterplatte zugegeben, die bei Raumtemperatur für 60 Minuten inkubiert wird. Der Assay wird dann, wie oben beschrieben (in Beispiel 1.3), durchgerührt. 2.4 Liste der Oligonucleotide Zieloligonucleotide (normale Wildtyp DNA) CS Sonde (T3 Promotor) (Seq. ID Nr. 23) PS Sonde (T3 Promotor mit 3' TTT 5' Startsequenz im Ziel und Matrizenteil)

5' TGCCTCCTTGTCTCCGTTCT 3' (Seq. ID No. 20)

Sonde 4 (Europium markiert)

5' GGATATCACCCG 3' (Seq. ID. No. 22)

Beispiel 3

Transkription von einem Split T3 Polymerase Promotor bei einer 2¹/&sub2;- Wege-Kreuzung

Das Beispiel wird in Fig. 7 schematisch illustriert. Der komplette T3 Promotor (dessen erste drei Basen 5' TTA 3' sind, eine Version, die sich von der in Beispiel 3 unterscheidet) liegt nahe am 3'-Ende der CS Sonde (2). Die ersten drei 5' Basen der Promotorsequenz werden durch drei Basen (3' AAT 5') (8) im Ziel (6) komplementiert (Ziel: Hepatitis B (Hep B) DNA). Hybridisierung einer PS Sonde (4) (an deren 3'-Ende das Komplement des T3 Promotors minus drei Basen liegt) an die CS Sonde (2) bildet einen doppelsträngigen Promotor, komplettiert durch drei Basen (3' AAT 5') im Ziel (6) und daher wird ein Splitpromotor gebildet, um eine De-novo synthetisierte RNA in Gegenwart der T3 RNA Polymerase zu bilden.

3.1 Herstellung von Oligonucleotiden

Die Zieloligonucleotide und Sonden werden wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und gereinigt.

3.2. Splitpromotorsonde und RNA Synthese

Hybridisierungsreaktionen werden wie in Beispiel 2.2 beschrieben etabliert und wie in Beispiel 1.2 oben beschrieben behandelt, aber unter Verwendung der Nucleinsäuresequenzen, die unten detailliert beschrieben sind. Das resultierende Produkt wird durch Hybridisierung eines "molecular beacon" (s. unten) delektiert.

3.3 Detektion von RNA durch "molecular beacon" Assay

5 ul einer Reaktionsprobe werden der Reaktionsmischung zugesetzt, die aus 145 ul Hybridisierungslösung und 2 pmol "molecular beacon" (Fluorophor = FAM, Löscher = Methyl rot) in einer Labsystems White Microstrip Microtiterplatte zugesetzt, die im Dunklen bei Raumtemperatur für 60 Minuten inkubiert wird. Fluoreszenzsignale von dem hybridisiertem "beacon"/Ziel wird unter Verwendung eines Wallac Victor 1420 Multilable Zählers und unter Verwendung des Fluoreszinprotokolls gemessen. 3.4 Liste der Oligonucleotide Ziel (Hep B DNA) CS Sonde (T3 Promotor) PS Sonde (T3 Promotor mit 3' AAT 5' Startsequenz im Ziel und Matrizenteil) molekulare Beacon Sequenz
"Molekular beacon" Oligonucleotidesonde (umfassend eine Sequenz, die von Streptomyces thermoalkatolerans. abgeleitet ist, mit komplementären 5' und 3'-Enden)
5' CGCGATCCTGCACCGCCGGAGCTTTCCACCCCGCG 3' (Seq. ID No. 28)

Beispiel 4

Transkription von einem Split SP6 Promotor an einer 2¹/&sub2;-Wege-Kreuzung

In diesem Beispiel ist das Ziel ein Wildtyp humanes DNA CFTR Gen, in dem eine Deletion von TTT eine zystische Fibröse kodierende Mutation von ΔF508 hervorruft.
Das Beispiel wird schematisch in Fig. 8 illustriert. Der komplette SP6 Promotor liegt nahe am 3'-Ende der CS Probe (2). Die ersten drei (5') Basen der Promotorsequenz werden durch drei Basen (3' TAA 5') (8) in dem Ziel (6) komplementiert und die CS Sonde (2) hybridisiert an das Ziel (6) in einer solchen Weise, daß das 3' TTT 5' im Wildtyp 6 Basen stromabwärts vom Start des Promotors zu liegen kommt. Die Hybridisierung einer PS Sonde (4) (an deren 3'-Ende das Komplement des SP6 Promotors minus drei Basen liegt) an eine CS Sonde (2) bildet einen doppelsträngigen Promotor, der durch die drei Basen (3TAA5') im Ziel komplettiert wird, und daher wird ein Splitpromotor gebildet, um eine De-novo synthetisierte RNA (14) in Gegenwart der SP6 Polymerase zu ergeben.

4.1 Herstellung von Oligonucleotiden

Die Zieloligonucleotide und Sonden werden synthetisiert und gereinigt wie in Beispiel 1 beschrieben.

4.2. Splitpromotorsonde und RNA Synthese

Die Hybridisierungsreaktionen wurden etabliert und wie in Beispiel 1.2 beschrieben behandelt, aber unter Verwendung der unten beschriebenen Nucleinsäuresequenzen unter Verwendung von SP6 RNA Polymerase/Puffer (Promega).

4.3 Detektion von RNA durch zeitaufgelöste Fluoreszenz (TRF)

5 ul Reaktionsprobe werden der Reaktionsmischung zugesetzt, die aus 145 ul Wallac Assaypuffer, 0,9 pmol Sonde 3 und 0,3 umol Sonde 4 besteht in einer Labsystems Streptavidin beschichteten Microtiterplatte zugegeben, die bei Raumtemperatur für 60 Minuten inkubiert wird. Der Assay wird dann wie oben beschrieben (in Teil 1.3) durchgeführt. 4.4 Liste der Oligonucleotide Zieloligonucleotide (normale Wildtyp DNA) CS Sonde (SP6 Promotor)

PS Sonde (SP6 Promotor mit 3'TAA5' Startsequenz im Ziel und Matrizenteil)

5' TGCCTCCTTGTCTCCGTTCT 3' (Seq. ID No. 20)

Sonde 4 (Europium markiert)

5' GGATATCACCCG 3' (Seq. ID No. 31)

Beispiel 5

Transkription von einem Split SP6 RNA Polymerase Promotor bei einer 2¹/&sub2;-Wege-Kreuzung bei ΔF508

Das Beispiel ist schematisch in den Fig. 9A und 9B illustriert. Eine Konfirmation der ΔF508 CFTR Mutation führt zum Verlust eines 3' GAA 5' aus der Sequenz 3' TAGAAA 5', was zur Bildung eines 3' TAA 5' Trippelst (8) führt und so zu einer SP6 Promotor Startsequenz (Fig. 9B). Daher wird ein funktionaler SP6 Promotor unter Verwendung der CS Sonde (2) und der PS Sonde (4) mit dem CFTR mutanten DNA Ziel (6) gebildet, wobei unter Verwendung von PS und CS Sonden mit normalem Wildtyp DNA Ziel (Fig. 9A) kein funktionaler Promotor gebildet wird. Die Hybridisierung einer PS Probe (4) (an deren 3'-Ende das Komplement des SP6 Promotors minus drei Basen liegt) an einer CS Sonde (2) bildet einen doppelsträngigen Promotor, der durch die drei Basen (3' TAA 5') in dem mutierten Ziel (6) komplettiert wird und daher wird ein Splitpromotor gebildet, um eine De-novo synthetisierte RNA in Gegenwart von SP6 RNA Polymerase zu ergeben.

5.1 Herstellung von Oligonucleotiden

5.2 Splitpromotor Sonde und RNA Synthese

Die Hybridisierungsreaktionen werden etabliert und behandelt wie in Beispiel 1.2 beschrieben, aber unter Verwendung von Nucleinsäuresequenzen, die unten detailliert beschrieben sind und unter Verwendung von SP6 RNA Polymerase/Puffer (Promega).

5.3 Detektion von RNA durch zeitaufgelöste Fluoreszenz (TRF)

5 ul Reaktionsprobe werden der Reaktionsmischung, die aus 145 ul Wallac Assaypuffer, 0,9 umol Sonde 3 und 0,3 umol Sonde 4 besteht, in einem Napfeiner Labsystems Streptavidin beschichteten Microtiterplatte zugesetzt, die bei Raumtemperatur für 60 Minuten inkubiert wird. Der Assay wird dann wie oben beschrieben durchgeführt (Teil 1.3). 5.4 Liste der Oligonucleotide Zieloligonucleotide (normale Wildtyp DNA, keine ΔF508 Deletion) Zieloligonucleotide (CF mutante DNA mit der ΔF508 Deletion) CS Sonde (SP6 Promotor) PS Sonde (SP6 Promotor mit 3'TAA5' Startsequenz, gebildet durch eine ΔF508 Mutation in CFTR mutanter DNA, und Matrizenteil)

5' TGCCTCCTTGTCTCCGTTCT 3' (Seq. ID No. 20)

Sonde 4 (Europium markiert)

5' GGATATCACCCG 3' (Seq. ID No. 22)

Beispiel 6

Transkription von einem Split T7 RNA Polymerase Promotor an einer 3- Wege-Kreuzung

In diesem Beispiel ist das Ziel ein Wildtyp humanes DNA CFTR Gen, bei dem eine Deletion von TTT eine zystische Fibröse kodierende Mutation ΔF508 hervorruft.
Der komplette T7 Promotor ist am 3'-Ende der CS Sonde lokalisiert. Die ersten drei (5') Basen dieser Sequenz komplementieren drei Basen im Ziel. Hybridisierung einer PS Sonde (die das Komplement zum T7 Promotor minus drei Basen aufweist und ein Komplement zur Ziel DNA) mit der CS Sonde und dem Ziel bildet einen doppelsträngigen Promotor, der durch die drei Basen im Ziel komplettiert wird und daher wird ein Splitpromotor gebildet, um eine De-novo synthetisierte RNA in Gegenwart von T7 RNA Polymerase zu ergeben.

6.1 Herstellung von Oligonucleotiden

Das Zieloligonucleotid und die Sonden wurden synthetisiert und gereinigt wie in Beispiel 1 beschrieben.

6.2 Splitpromotor Sonde und RNA Synthese

Hybridisierungsreaktionen wurden etabliert und behandelt wie in Beispiel 1.2 beschrieben, aber unter Verwendung von Nucleinsäuresequenzen, die unten detailliert beschrieben werden. Das resultierende Produkt wurde durch Hybridisierung an ein spezifisch biotinyliertes Oligonucleotid (Sonde 3) immobilisiert, das wiederum an einen mit Streptavidin beschichteten Napfeiner Microtiterplatte gebunden war. Das immobilisierte Produkt wurde durch Colorimetrie auf dem Wege der Hybridisierung an Sonde 4, einer alkalische Phosphatase markierten Oligonucleotidsonde (s. unten), detektiert.

6.3 Detektion einer RNA durch Colorimetrie

5 ul Reaktionsprobe wurden der Reaktionsmischung zugesetzt, die aus 145 ul Hybridisierungspuffer (20 mM EDTA pH 8,0, 1 M NaCl, 50 mM Tris, 0,1% Rinderserumalbumin, Mischungen mit HCl auf pH 8,0 eingestellt), 0,9 umol Sonde 3 und 12,7 pmol Sonde 4 in einem Napfeiner Labsystems Streptavidin beschichteten Microtiterplatte zugegeben, die bei Raumtemperatur für 60 Minuten inkubiert wurde. Ungebundenes Material wurde durch Waschen der Näpfe mit 4 · 200 ul Waschlösung (0,25 M Tris, 0,69 M NaCl, 13,4 mM KCl, mit HCl auf pH 8,0 eingestellt) und einmal mit Substratpuffer (verwendet als 1 · Lösung, hergestellt aus 5 · konzentrierter Stammlösung, erhalten von Boehringer Mannheim 726915) entfernt. 180 ul Substratpuffer, enthaltend 5 mg/ml 4-Nitrophenylphosphat wurden dann dem Napfzugesetzt und die Farbentwicklung wurde durch Bestimmung der optischen Dichte bei 405 nm unter Verwendung eines Labsystems integrated EIA Management System Plate Readers gemessen, wobei die Messungen alle 2 Minuten über einen Zeitraum von 30 Minuten erfolgten. Die erhaltenen Resultate sind in Fig. 10 gezeigt. 6.4 Liste der Oligonucleotide Zieloligonucleotid (normale Wildtyp DNA) CS Sonde (T7 Promotor) PS Sonde (T7 Promotor mit 3' ATT 5' Startsequenz im Ziel und Matrizenteil)

5' TGCCTCCTTGTCTCCGTTCT 3' (Seq. ID No. 20)

Sonde 4 (Alkalische Phosphatase markiert)

5' GGATATCACCCGATGTG 3' (Seq. ID No. 37)

Beispiel 7

Transkription von einem Split T7 RNA Polymerase Promotor und Amplifizierung ohne die Verwendung von DNA Polymerase Verlängerung

Dieses Beispiel demonstriert die Herstellung eines funktionalen DNA abhängigen RNA Polymerase Promotors als Ergebnis der Bildung eines Nucleinsäurekomplexes, umfassend die Zielnucleinsäuresequenz (Ziel: Wildtypische humane DNA: zystische Fibröse transmenbran Konduktanz Regulator Gen (CFTR), bei dem eine Deletion von TTT eine zystische Fibröse kodierende Mutation ΔF508 hervorruft), einem teilweise komplementären Oligonucleotid und einer Promotorstrangsonde.
Das Beispiel wird schematisch in Fig. 12 illustriert. Der komplette T7 Promotor liegt nahe am 3'-Ende der CS Sonde (2). Die ersten drei (5') Basen der Promotorsequenz werden durch drei Basen (3'ATT 5') (8) im Ziel (6) komplementiert und die CS Sonde (2) hybridisiert an das Ziel (6) in solcher Weise, daß das 3' TTT 5' in der wildtypischen Sequenz 14 Basen stromabwärts vom Start des Promotors liegt. Die Hybridisierung der PS Sonde (4) (an deren 3'-Ende das Komplement zum T7 Promotor minus drei Basen liegt) and die CS Sonde (2) bildet einen doppelsträngigen Promotor, der durch die drei Basen (8) im Ziel (6) komplettiert wird und daher wird ein Splitpromotor gebildet, um eine De-novo synthetisierte RNA (14) in Gegenwart von T7 Polymerase zu ergeben.
Die De-novo synthetisierte RNA Spezies wird dann amplifiziert, wie in Fig. 13 gezeigt. In bezug auf Fig. 13 enthält das RNA Molekül (14) eine überlappende Sequenz, eine zweite Promotorsequenz (SP6, in Fig. 12 und 13 als Pr(2) bezeichnet) und weitere 6 Basen, um eine mögliche frühe Termination der Transkription zu kompensieren. Dieses Molekül (14) annealed an die zugesetzte DNA Sonde 3 (50 in Fig. 13) in dem Amplifikationsschema, was einen doppelsträngigen SP6 Promotor ergibt und daher den Amplifizierungszyklus (Schritt i) beginnt. Das RNA Transkript (52) aus der Sonde 3 (50) schließt eine andere Überlappungssequenz ein als das RNA Molekül (14), eine Sequenz für den T3 Polymerase Promotor (Promotor 3 oder Pr 3) und weitere 6 Basen. Dieses Molekül (52) annealed (Schritt ii) an zugesetzte DNA Sonde 4 (54 in Fig. 13), was zur Entstehung eines doppelsträngigen T3 Promotors führt, der die Transkription (Schritt iii) von RNA (56) beginnt und an Sonde 3 (50) (Schritt iv) annealed, in einer Fortsetzung des Amplifikationszyklus. Es wird festgestellt, daß die Promotoren l, 2 und 3 nicht notwendigerweise T7, SP6 und T3 RNA Polymerase Promotoren sein müssen. Sie könnten in einer anderen Reihenfolge, als der gezeigten, verwendet werden oder eine oder mehrere andere RNA Promotoren, die bislang nicht genannt wurden, könnten hier als Alternative eingesetzt werden.
Im Gegensatz zu dem in Fig. 3 gezeigten Amplifikationssystem wird ein aktiver RNA Promotor direkt durch Hybridisierung einer geeigneten Nucleinsäuresequenz in dem oben beschriebenen System erzeugt. Für die Bildung des Promotors ist keine Verlängerung erforderlich.

7.1 Herstellung von Oligonucleotiden

7.2 RNA Synthese durch Splitpromotor und Amplifizierungszyklus

Die Hybridisierungsreaktionen umfassen Mischungen aus DNA, einschließlich Zieloligonucleotid, PS und CS Sonden, Sonden 3 und 4 zusammen mit relevanten Kontrollen, die Mischungen mit und ohne Ziel/PS oder CS Sonden und Sonden 3 und 4 umfassen. Für die Hybridisierungsreaktionen werden 40 fmol Zieloligonucleotid mit 40 fmol jeder der Sonden PS, CS, 3 und 4 in einer Lösung gemischt, die 4 ul 5 · RNA Polymerasepuffer (ergibt einfache Konzentration 40 mM Tris (pH 7,9), 6 mM MgCl&sub2;, 2 mM Spermidin und 10 mM NaCl) und destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 20 ul enthält (nach der Endzugabe von T7, SP6 und T3 RNA Polymerase und rNTP Mischung). Die Mischung wird für 3 Minuten auf 90ºC erhitzt, um die Nucleinsäuren zu denaturieren, für 2 Minuten auf Eis inkubiert und für 1 Minute bei 37ºC equillibriert. Die Sonden werden durch Zugabe von 40 Einheiten von jeder RNA Polymerase (Promega) und 120 nmol von jedem rNTP (Pharmacia Biotech) annealed und transkripiert, bei 37ºC für 180 Minuten. DNA Oligonucleotide werden aus der Reaktionsmischung durch Erhitzen auf 90ºC für 3 Minuten und Inkubieren auf Eis für 2 Minuten entfernt, gefolgt von der Zugabe von 4 Einheiten DNase I (Ambion) und inkubieren bei 37ºC für 20 Minuten vor der Enddetektion. Eine (oder potentiell beide) der resultierenden Produkte (RNAs 14 und 52) kann durch Hybridisierung von "molecular beacon" (s. unten) delektiert werden.

7.3 Detektion von RNA durch "Molecular Beacon" Assay

5 ul der Reaktionsprobe wurden der Reaktionsmischung zugesetzt, die aus 145 ul Hybridisierungslösung und 2 umol "molecular beacon" (5' Fluorophor = FAM, 3' Löscher = Methyl Rot Sonde 5) bestand, in einer Labsystems White Microstrip Napfplatte, die im Dunkeln bei Raumtemperatur für 60 Minuten inkubiert wird. Das Fluoreszenzsignal von dem hybridisierten "beacon"/Ziel wird unter Verwendung eines Wallac Victor 1420 Multilabel Zählers unter Verwendung des Fluoreszinprotokolls gemessen. 7.4 Liste von Oligonucleotiden Zieloligonucleotide (normale Wildtyp CFTR DNA) CS Sonde (T7 Promotor) PS Sonde (T7 Promotor (Pr1) mit 3' ATT 5' Startsequenz im Ziel und Matrizenteil, der ein Transkript mit SP6 Promotor (Pr2) kodiert) Sonde 3 (erstes DNA Oligo im Amplifizierungszyklus mit SP6 Promotor (Pr2), kodierend ein Transkript mit T3 Promotor (Pr3)) Sonde 4 (zweites DNA Oligo im Amplifizierungszyklus mit T3 Promotor (Pr3), kodierend das Transkript mit SP6 Promotor (Pr2)) Sonde 5 ("molecular beacon": 5' fluoreszierender Marker und 3' Löscher)

Beispiel 8

Transkription von einer Split T7 RNA Pol Promotor 2 -Wege-Kreuzung, unter Verwendung eines RNA Ziels

Dieses Beispiel beinhaltet die Verwendung eines RNA Ziels (basierend auf der CFTR Sequenz). Der komplette T7 Promotor liegt nahe am 3'-Ende der CS Sonde. Die ersten drei (5') Basen der Promotorsequenz werden durch drei Basen (3' AUU 5') im Ziel komplementiert, wenn die CS Sonde mit dem Ziel hybridisiert. Die Hybridisierung eines zweiten Oligonucleotids (PS Sonde, an deren 3'-Ende sich das Komplement des T7 Promotors minus drei Basen befindet) mit der CS Sonde bildet einen doppelsträngigen Promotor, der durch die drei Basen im Ziel komplettiert wird und daher wird ein Splitpromotor gebildet, um eine De-novo synthetisierte RNA in Gegenwart von T7 RNA Polymerase zu ergeben. Diese Reaktion wurde mit einer Kontrollreaktion verglichen, die eine DNA Version des CFTR Ziels verwendete. Dieses Beispiel zeigt, daß die Probe RNA als Ziel für den Splitpromotor verwendet werden konnte (d. h. daß die Polymerase einen Promotor erkennt, der mindestens drei Basen von RNA an Stelle von DNA umfaßt). Darüber hinaus konnte das resultierende RNA Transkript unter Verwendung eines zweiten Splitpromotors weiter amplifiziert werden. Das RNA Signal aus diesem zweiten Promotor konnte durch erneutes Bilden des vorherigen Splitpromotors wieder erzeugt werden usw., in einem Amplifizierungszyklus, der nur vom Vorliegen von T7 RNA Polymerase und rNTPs abhängig ist (z. B. wie in Fig. 15 schematisch gezeigt).

8.1 Herstellung von Oligonucleotiden

Die Zieloligonucleotide und Sonden wurden synthetisiert und gereinigt wie in Beispiel 1 beschrieben.

8.2a Synthese und Quantifizierung von RNA Ziel

RNA Zielmoleküle wurden durch Transkription eines doppelsträngigen DNA Oligonucleotids, das so hergestellt war, daß es einen T7 Polymerase Promotor einschloß, mit T7 Polymerase unter Standardbedingungen hergestellt. DNA Oligonucleotide wurden dann aus der Reaktionsmischung durch Zugabe von 3 Einheiten DNase I (Ambion) und Inkubation bei 37ºC für 10 Minuten hergestellt, gefolgt von Hitzeinaktivierung des Enzyms für 30 Minuten bei 90ºC. Das Transkript wurde unter Verwendung des RiboGreen (RiboGreen ist eine registrierte Marke) RNA Quantifizierungskit (molekulare Sonden R- 11490) quantifiziert.
Für die Quantifizierung wurden 5 ul der Reaktionsmischungen oder von Verdünnungen in TE zu 95 ul TE in einem Napfeiner Labsystems White Microstrip Napfplatte zugegeben, zusammen mit 100 ul eines Quantifizierungsreagenzes (eine 1/2000 Verdünnung des Quantifizierungsreagenzes in TE, gemäß der Anleitung des Herstellers). Die Platte wurde bei 200 rpm für 5 Minuten bei 22ºC geschüttelt, gefolgt von der Detektion des Fluoreszenzsignals aus der interkalierten Fluorophor/RNA, gemessen unter Verwendung des Wallac Victor 1420 Multilabel Zählers unter Einsatz des Fluoreszinprotokolls. Der Wert des Fluoreszenzsignals wurde in pmol RNA konvertiert, in dem mit einer Standardkurve verglichen wurde, die in gleicher Weise wie das Transkript gemessen wurde, aber unter Verwendung von Standard synthetischer RNA (Sonde 3, unten). Die quantifizierte RNA wurde in 10 ul Aliquoten bei -80ºC gelagert.

8.2b Splitpromotor Sonde und RNA Synthese

Die Hybridisierungsreaktionen umfaßten Mischungen von DNA, einschließlich Ziel RNA oder DNA Oligonucleotide, CS Sonde und PS Sonde zusammen mit relevanten Kontrollen, die Mischungen mit und ohne Ziel/Sonden CS und PS umfaßten. Für die Hybridisierungsreaktionen wurden 50 fmol Ziel RNA oder DNA Oligonucleotide mit 50 fmol CS Sonde und 50 fmol PS Sonde in einer Lösung gemischt, enthaltend 28,3 ul T7 RNA Polymerasepuffer (ergibt Ix Konzentrationen von 40 mM Tris (pH 8,1), 20 mM MgCl&sub2;, 1 mM Spermidin, 5 mM DTT (Promega P117C), 80 mg/ml PEG 8000, 50 ug/ml BSA und 0,01% Triton X-100 (registrierte Marke), Milligan et al., 1987, Nucleic Acids Research, Band 15, Seiten 8783-8798) und destilliertes Wasser auf ein Endvolumen von 50 ul (nach Endzugabe von T7 RNA Polymerase und rNTP Mischung). Die Mischung wurde für 3 Minuten auf90ºC erhitzt, um die Nucleinsäuren zu denaturieren und dann mit 0,1ºC pro Sekunde für die Hybridisierung auf 10ºC gekühlt. Die Sonden wurden für 180 Minuten bei 37ºC annealed und transkripiert, durch Zugabe von 25 Einheiten T7 RNA Polymerase und 40 nmol von jedem rNTP. Die DNA Oligonucleotide wurden aus der Reaktionsmischung durch Zugabe von 3 Einheiten DNase I und Inkubation bei 37ºC für 10 Minuten entfernt, gefolgt von Erhitzen für 3 Minuten bei 90ºC und Abkühlen auf 15ºC vor der endgültigen Detektion. Das resultierende Produkt wurde durch Hybridisierung an ein spezifisch biotinyliertes Oligonucleotid (Sonde 4, unten) immobilisiert, das wiederum an einen mit Streptavidin beschichteten Napfgebunden war. Das immobilisierte Produkt wurde durch Colorimetrie auf dem Wege der Hybridisierung mit Sonde 5 (s. unten), einer mit alkalischer Phosphatase markierten Oligonucleotidsonde, delektiert.

8.3 Detektion von RNA durch Colorimetrie

5 ul Reaktionsprobe oder Verdünnungen wurden zu der Reaktionsmischung zugesetzt, die aus 145 ul Hybridisierungspuffer (20 mM EDTA pH 8,0, 1 M NaCl, 50 mM Tris, 0,1% Rinderserumalbumin, Mischungen mit HCl auf pH 8,0 eingestellt), 0,9 umol Sonde 4 und 6 umol Sonde 5 bestand, in einer Labsystems Streptavidin beschichteten Napfplatte, die bei 22ºC für 60 Minuten inkubiert wurde. Ungebundenes Material wurde durch Waschen der Näpfe mit 4 · 200 ul Waschlösung (0,25 M Tris, 0,69 M NaCl, 13,4 mM KCl, mit HCl auf pH 8,0 eingestellt) und 1 · mit Substratpuffer (verwendet als 1 · Lösung, hergestellt aus einer fünffach konzentrierten Stammlösung, erhalten von Boehringer Mannheim). 180 ul Substratpuffer, enthaltend 5 mg/ml 4-Nitrophenylphosphat wurden dem Napfzugesetzt und die Farbentwicklung wurde durch Bestimmung der optischen Dichte bei 405 nm unter Verwendung eines Labsystems integrierten EIA Management System Plattenlesers gemessen, wobei Ablesungen über 30 Minuten alle 2 Minuten vorgenommen wurden. Die Ergebnisse sind in Fig. 14 gezeigt.
Fig. 14 ist ein Balkendiagramm, das die Menge der hergestellten RNA zeigt (in pmol) unter Verwendung entweder eines RNA Zieles (Balken auf der linken Seite) oder eines DNA Zieles (Balken auf der rechten Seite). Für jede Gruppe der Säulen gibt (1) das Ergebnis an, das für Mischungen erhalten wird, die das Ziel und die erste und zweite Sonde umfaßt, (2) gibt das Ergebnis an, das in Abwesenheit des Ziels erhalten wird und (3) gibt das Ergebnis an, das in Abwesenheit des Zieles und der ersten Probe erhalten wird.
Es ist zu sehen, daß, obwohl ein DNA Ziel zur Herstellung von mehr RNA führt, sowohl DNA als auch RNA Ziele erfolgreich verwendet werden können, um funktionale "Split" Promotoren zu bilden. In jedem Fall ist das Hintergrundsignal sehr niedrig.

8.4 Liste der Oligonucleotide

RNA Ziel (Sequenz basiert auf normaler Wildtyp CFTR DNA) (Seq. ID Nr. 42) DNA Zieloligonucleotide (normale Wildtyp CFTR DNA) CS Sonde (T7 Promotor mit komplementärer 3' ATT 5' Startsequenz im Ziel) PS Sonde (T7 Promotor und Matrize) Sonde 3 (RNA Kontrolle zur Konstruktion der Standardkurve im RiboGreen Assay)

Sonde 4 (mit 5' Biotin, um die Immobilisierung auf Streptavidin beschichteten Platten zu ermöglichen)

5'TCCGCTGCCTCCTTGTCTCCGTTCT3' (Seq. ID No. 21)

Sonde 5 (alkalische Phosphatase markiert)

5'GGATATCACCCG3' (Seq. ID No. 22)

Beispiel 9

Transkription eines Ribozyms von einem Split T7 RNA Promotors an einer 2¹/&sub2;-Wege-Kreuzung
In diesem Beispiel hat von einem Splitpromotor produzierte RNA die Sequenz eines bekannten Ribozyms (Clouet-D'Orval & Uhlenbeck, 1996 RNA 2(5): 483-491) und kann an ein dualmarkiertes einzelsträngiges Oligonucleotid bilden, um ein funktionales Ribozym zu bilden. Spaltung des markierten Oligonucleotids an einer spezifischen Stelle generiert dann ein Signal. Der komplette T7 Promotor liegt nahe am 3'-Ende der CS Sonde. Die ersten drei (5') Basen der Promotorsequenz werden durch die drei Basen (3' ATT 5') im Ziel komplementiert, wenn die CS Sonde mit dem Ziel hybridisiert. Die Hybridisierung eines zweiten Oligonucleotids (PS Sonde, an dessen 3'-Ende das Komplement des T7 Promotors minus drei Basen ist) mit CS Sonde bildet einen doppelsträngigen Promotor, der durch drei Basen im Ziel komplettiert wird und daher wird ein Splitpromotor gebildet, um ein De-novo synthetisiertes RNA Ribozym in Gegenwart von T7 Polymerase zu bilden.

9.1 Herstellung von Oligonucleotiden

9.2 Splitpromotorsonde und RNA Synthese

Hybridisierungsreaktionen umfassen Mischungen von DNA, einschließlich Zieloligonucleotide, CS Sonden und PS Sonden, zusammen mit relevanten Kontrollen, umfassend Mischungen mit und ohne Ziel/Sonde CS und PS. Für die Hybridisierungsreaktionen werden 40 fmol Zieloligonucleotid mit 40 fmol CS Sonde und 40 fmol PS Sonde in einer Lösung gemischt, die 4 ul 5 · T7 RNA Polymerasepuffer (ergibt 1 · Konzentration 40 mM Tris (pH 7,9), 6 mM MgCl&sub2; , 2 mM Spermidin und 10 mM NaCl) und destilliertes Wasser auf ein Endvolumen von 20 ul enthält, gemischt (nach Endzugabe von T7 RNA Polymerase und rNTP Mischung). Die Mischung wird für 3 Minuten auf 90ºC erhitzt, um die Nucleinsäuren zu denaturieren, und dann für die Hybridisierung mit 0,1ºC pro Sekunde auf 10ºC abgekühlt. Die Sonden werden annealed und transkripiert bei 37ºC für 180 Minuten durch Zugabe von 40 Einheiten T7 RNA Polymerase und 40 nmol von jedem rNTP. Die DNA Oligonucleotide werden durch Zugabe von drei Einheiten DNase I und Inkubieren für 20 Minuten bei 37ºC vor der Enddetektion aus der Reaktionsmischung entfernt.

9.3 Detektion von synthetisierter RNA

5 ul Aliquote der Probe oder 5 ul einer geeigneten Verdünnung der behandelten Assayprobe werden zu 100 ul Puffer zugegeben (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 mM MgCl&sub2;, 10% Ethanol) gefolgt von 10 umol Probe 3. Diese doppelmarkierte DNA (5'-Tamra, 3'- Fam) ist das Ribozymsubstrat. Das RNA Produkt der 2¹/&sub2;-Wege-Kreuzung (gebildet in Gegenwart eines spezifischen Ziels) wird so entworfen, daß es das korrespondierende "Hammerkopf' Ribozym ist. Sonde 3 annealed daher an das RNA Produkt, unter Erzeugung eines funktionalen Ribozyms. Die Ribozymspaltung des Substrats, was zum Entfernen des Löschers aus dem Fluorophor führt, kann durch Fluoreszenzresonanz- Energietransfer (Tamraerregung bei 546 nm, Emission bei 579 nm) aufgezeichnet werden. Alternativ könnte die Spaltung des Substrates durch eine Abnahme in der Fluoreszenzpolarisation gemessen werden. Da ein Substratübergang möglich ist, kann während des Detektionsverfahrens ein gewisser Grad an Amplifizierung erreicht werden.

Alternatives Echtzeitdetektionssystem.

Echtzeitdetektion wäre möglich, wenn das Ribozymsubstratmolekül in die Extensions- /Transkriptionsreaktionsmischung unter geeigneten Pufferbedingungen einbezogen wird.

Alternative Detektionssysteme

Das RNA Produkt könnte eine Immobilisierungssequenz einschließen, die es erlaubt, daß es über eine biotinylierte Fangsonde auf einem mit Streptavidin beschichteten Napf immobilisiert wird. Nach den Waschschritten zum Entfernen von ungebundenem Material kann Sonde 3 zugesetzt werden und eine Ribozymspaltung könnte wie oben beschrieben aufgezeichnet werden.
Alternative Markierungen können an das Ribozymsubstratmolekül angebracht werden. 9.4 Liste der Oligonucleotide Zieloligonucleotide (normale Wildtyp CFTR DNA) CS Sonde (T7 Promotor mit 3' ATT 5' Startsequenz im Ziel) PS Sonde (T7 Promotor und Matrize, die das Ribozym kodiert)

Sonde 3 (Ribozymsubstrat)

5'Tamra-GAAUCGAAACGCGAAAGCGUCUAGCGU-FAM3'
(Seq. ID No. 45)

Beispiel 10

Es wurde ein Experiment durchgeführt, um die optimale Sequenz der +12 Region in bezug auf die effizienteste Transkription durch T7 RNA Polymerase zu bestimmen.
Demgemäß wurde eine Serie von zweiten Sonden Molekülen hergestellt, die alle identische T7 Promotoren, Detektions- und Fangsequenzen umfaßten, aber verschiedene +12 Sequenzen angrenzend an die T7 Promotorsequenz aufwiesen. Diese Sonden wurden mit einem komplementären 22 Basen Oligonucleotid (enthaltend den komplementären Strang des T7 Promotors) unter identischen Bedingungen hybridisiert und die Menge an hergestellter RNA wurde, wie in den vorherigen Beispielen beschrieben, bestimmt.
Tabelle 2 unten zeigt den relativen "RNA Transkriptionsfaktor" für jede der verschiedenen getesteten +12 Sequenzen.

Tabelle 2

Alternative Matrizen T7 +1 bis +12 Sequenzen in absteigender Reihenfolge ihrer Transkriptionssequenz.

+1 bis +12 Sequenz RNA Transkriptionsfaktor
5' GTTCTCTCTCCC 3' 142
5' GCTCTCTCTCCC 3' 115
5' GTTGTGTCTCCC 3' 110
5' GATGTGTCTCCC 3' 105
5' ATCCTCTCTCCC 3' 96
5' GTTCTCGTGCCC 3' 84
5' ATCCTCGTGCCC 3' 76
5' GCTCTCGTGCCC 3' 64
5' GTTGTGGTGCCC 3' 21

SEQUENZLISTEN

(1) ALLGMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER
(A) NAME: Cytocell Limited
(B) STRASSE: Einheit 6, Somerville Court, Tinity Way
(C) STADT: Adderbury. Banbury
(E) LAND: Vereinigtes Königreich
(F) POSTLEITZAHL (ZIP): OX 17 3SN
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Verbesserung, die Nucleinsäurepromotoren betreffen oder damit in Zusammenhang stehen
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 45
(iv) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) MEDIUM TYP: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Version #1.0, Version #1.30 (EPA)
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
AAATTAACCC TCACTAAA.
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
TTTAGTGAGG GTTAATTT
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 17 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
TAATACGACT CACTATA
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 17 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
TATAGTGAGT CGTATTA
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 17 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
ATTTAGGTGA CACTATA
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 17 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
TATAGTGTCA CCTAAAT
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 12 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
GTTCTCTCTC CC
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 12 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
GCTCTCTCTC CC
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 12 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
GTTGTGTCTC CC
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 12 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
GATGTGTCTC CC
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 12 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG; SEQ ID NO: 11:
ATCCTCTCTC CC
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 12 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
GTTCTCGTGC CC
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 12 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
ATCCTCGTGC CC
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 14:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 12 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBÜNG: SEQ ID NO: 14:
GCTCTCGTGC CC
(2) INFORMATION FÜR SEQ IDNO: 15:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 12 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:
GTTGTGGTGC CC
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 16:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 79 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:
TTATGCCTGG CACCATTAAA GAAAATATCA TCTTTGGTGT TTCCTATGAT GAATATAGAT ACAGAAGCGT CATCAAAGC
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 17:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 46 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:
ATAGGAAACA CCAAAGATGA TATTTTCTTT AATACGACTC ACTATA
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 18:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 52 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:
CCTTGTCTCC GTTCTGGATA TCACCCGATG TGTCTCCCTA TAGTGAGTCG TA
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 19:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 57 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:
TGCCTCCTTG TCTCCGTTCT GGATATCACC CGATGTGTCT CCCTATAGTG AGTCGTA
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 20:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:
TGCCTCCTTG TCTCCGTTCT
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 21:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 25 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:
TCCGCTGCCT CCTTGTCTCC GTTCT
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 22:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 12 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22:
GGATATCACC CG
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 23:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 47 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23:
CTGTATCTAT ATTCATCATA GGAAACACCA AATTAACCCT CACTAAA
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 24:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 53 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24:
CCTTGTCTCC GTTCTGGATA TCACCCGATG TGATTCCCTT TAGTGAGGGT TAA
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 25:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 84 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 25:
GAGGCATAGC AGCAGGATGA AGAGGAAGAT GATAAAACGC CGCAGACACA TCCAGCGATA
ACCAGGACAG GTTGGAGGAC AGGA
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 26:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 47 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 26:
TGGTTATCGC TGGATGTGTC TGCGGCGTTT TAAACCCT CACTAAA
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 27:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 53 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 27:
GTTCTATCCT GCACCGCCGG AGCTTTCCAC CCCTTCCCTT TAGTGAGGGT TAA
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 28:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 35 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 28:
CGCGATCCTG CACCGCCGGA GCTTTCCACC CCGCG
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 29:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 45 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 29:
ATTCATCATA GGAAACACCA AAGATGATAT TTAGGTGACA CTATA
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 30:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 52 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 30:
CCTTGTCTCC GTTCTGGATA TCACCCGATG TGGTATTCTA TAGTGTCACC TA
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 31:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 12 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 31:
GGATATCACC CG
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 32:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 120 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 32:
GTTGGCATGC TTTGATGACG CTTCTGTATC TATATTCATC ATAGGAAACA CCAAAGATGA TATTTTCTTT AATGGTGCCA GGCATAATCC AGGAAAACTG AGAACAGAAT GAAATTCTTC
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 33:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 117 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 33:
GTTGGCATGC TTTGATGACG CTTCTGTATC TATATTCATC ATAGGAAACA CCAATGATAT TTTCTTTAAT GGTGCCAGGC ATAATCCAGG AAAACTGAGA ACAGAATGAA ATTCTTC
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 34:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 46 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 34:
TTATGCCTGG CACCATTAAA GAAAATATCA TTTAGGTGAC ACTATA
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 3 5:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 46 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 35:
CAGTTTTCCT GGATTATGCC TGGCACCATT AATACGACTC ACTATA
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 36:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 84 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 36:
CCTTGTCTCC GTTCTGGATA TCACCCGATG TGTCTCCCTA TAGTGAGTCG TAAGAAAATA TCATCTTTGG TGTTTCCTAT GATG
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 37:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 17 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 37:
GGATATCACC CGATGTG
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 38:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 60 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 38:
GTATTCTATA GTGTCACCTA AATATTTCAC GCGATAAGTA TCTCCCTATA GTGAGTCGTA
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 39:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 109 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 39:
CTTCCCTTTA GTGAGGGTTA ATAATGCCTC CTTGTCTCCG TTCTCGTGGA ATGTTGCCCA CACCTAGTGC CCACGTATTC TATAGTGTCA CCTAAATATT TCACGCGAT
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 40:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 109 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 40:
GTATTCTATA GTGTCACCTA AATATTTCAC GCGATAAGTA CGTGGAATGT TGCCCACACC TAGTGCCCAC CTTCCCTTTA GTGAGGGTTA ATAATGCCTC CTTGTCTCC
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 41:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 38 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 41:
CGCGCGTGGA ATGTTGCCCA CACCTAGTGC CCACCGCG
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 42:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 100 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 42:
GGGAGAUGAU GACGCUUCUG UAUCUAUAUU CAUCAUAGGA AACACCAAAG AUGAUAUUUU CUUUAAUGGU GCCAGGCAUA AUCCAGGAAA ACUGAGAACA
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 43:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 38 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 43:
GGGAGACACA UCGGGUGAÜA UCCAGAACGG AGACAAGG
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 44:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 44 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 44:
GAATCTCATC AGTAGCGAGT TCTCTCTCCC TATAGTGAGT CGTA
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 45:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 45:
GAAUCGAAAC GCGAAAGCGU CUAGCGU

Claims

1. Verfahren zum Nachweis des Vorliegens einer Nucleinsäure-Zielsequenz von Interesse, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Zufügen erster und zweiter Nucleinsäuresonden zu einer Probe, welche die Sequenz von Interesse umfasst, um auf diese Weise einen Komplex zu bilden, der drei Nucleinsäurestränge umfasst, worin die erste Sonde die Sequenz in voller Länge eines ersten Stranges eines doppelsträngigen Promotors umfasst, die Zielsequenz einen Teil eines zweiten Stranges des doppelsträngigen Promotors umfasst, der komplementär zu einem Teil des ersten Stranges ist, und die zweite Sonde den Rest des zweiten Stranges des doppelsträngigen Promotors umfasst, der komplementär zu einem Teil des ersten Stranges ist, dergestalt, dass ein fünktioneller Promotor gebildet wird, wenn die erste Sonde sowohl zu der Zielsequenz als auch der zweiten Sonde hybridisiert wird;

(b) Zufügen einer Polymerase, die den Promotor erkennt, um auf diese Weise die Z)enovo- Synthese von Nucleinsäure aus dem in dem Komplex vorliegenden Promotor zu veranlassen und

(c) direkter oder indirekter Nachweis der synthetisierten De-novo-Nucleinsäure,

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Promotor ein RNA-Polymerase-Promotor ist und die synthetisierte De-novo-Nucleinsäure RNA ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin der Promotor von T3-, T7- oder SP6-RNA- Polymerase oder einer Mutantenform davon erkannt wird.

4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die zweite Sonde einen Matrizen-Anteil umfasst, der als eine Matrize für die Synthese von Nucleinsäure aus dem fünktionellen Promotor wirken kann.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin die zweite Sonde eine 12-Basen-Sequenz unmittelbar stromabwärts vom Promotor zur Optimierung der Transkription aus dem Promotor umfasst.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin der Promotor erkannt wird durch eine T7-RNA- Polymerase und die zweite Sonde eine 12-Basen-Sequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4, 5, oder 6, worin der Matrizen-Anteil, wenn durch die Polymerase kopiert, eine Sequenz vorsieht, die als ein RNA-Polymerase-Promotor wirken kann oder zum Nachweis und/oder Einfangen (Capture) an einer festen Oberfläche verwendet werden kann.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4-7, worin der Matrizen-Anteil, wenn durch die Polymerase kopiert, eine Sequenz vorsieht, die als ein Ribozym wirkt.

9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die synthetisierte De-novo- Nucleinsäure vor dem Nachweis einem Amplifikationsschritt unterzogen wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin der Amplifikationsschritt umfasst:

Hybridisierung der synthetisierten De -novo-Nucleinsäure zu einer dritten Nucleinsäuresonde, welche Hybridisierung einen zweiten doppelsträngigen Nucleinsäure-Promotor entweder direkt oder durch 3'-Verlängerung der synthetisierten De-novo-Nucleinsäure unter Verwendung der dritten Sonde als Matrize bildet; und Zufügen einer Polymerase, die den zweiten Promotor erkennt, um auf diese Weise die Nucleinsäuresynthese daraus zu veranlassen.

11. Verfahren nach Anspruch 9, worin die aus dem zweiten Promotor synthetisierte Nucl einsäure nachgewiesen wird.

12. Verfahren nach Anspruch 10, das des Weiteren die folgenden Schritte umfasst: Hybridisieren der aus dem zweiten Promotor synthetisierten Nucleinsäure zu einer vierten Nucleinsäuresonde, welche Hybridisierung einen dritten doppelsträngigen Nucleinsäure Promotor entweder direkt oder durch 3'-Verlängerung der aus dem zweiten Promotor synthetisierten Nucleinsäure unter Verwendung der vierten Sonde als Matrize bildet; und Zufügen einer Polymerase, die den dritten Promotor erkennt, um auf diese Weise die Nucleinsäuresynthese daraus zu veranlassen.

13. Verfahren nach Anspruch 12, worin aus dem dritten Promotor synthetisierte Nucleinsäure nachgewiesen wird.

14. Verfahren nach Anspruch 12, das des Weiteren den Schritt der Hybridisierung der aus dem dritten Promotor synthetisierten Nucleinsäure zu der dritten Sonde umfasst, um dadurch den zweiten doppelsträngigen Promotor zu reformieren, um auf diese Weise einen Nucleinsäure- Synthesezyklus herbeizuführen.

15. Verfahren nach Anspruch 9, worin der Amplifikationsschritt umfasst: Zufügen dritter und vierter Nucleinsäuresonden, um auf diese Weise einen Komplex zu bilden, der die genannten Sonden und die synthetisierte De-novo-Nucleinsäure umfasst, worin die dritte Sonde die Sequenz in voller Länge eines ersten Stranges eines doppelsträngigen Promotors umfasst, die synthetisierte De-novo-Nucleinsäure einen Teil eines zweiten Stranges des doppelsträngigen Promotors umfasst, der komplementär zu einem Teil des ersten Stranges ist und die vierte Sonde den Rest des zweiten Stranges des doppelsträngigen Promotors umfasst, welcher komplemetär zu einem Teil des ersten Stranges ist, dergestalt, dass ein funktioneller Promotor gebildet wird, wenn die dritte Sonde sowohl zu der synthetisierten De-novo-Nucleinsäure als auch zu der vierten Sonde hybridisiert wird; Zufügen einer Polymerase, die den Promotor erkennt, um auf diese Weise die Synthese von Nucleinsäure aus dem Promotor zu veranlassen, der in dem Komplex vorliegt, und direkter oder indirekter Nachweis der synthetisierten Nucleinsäure.

16. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die zweite Sonde keine zielspezifische Region aufweist.

17. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die erste Sonde eine zielspezifische Region aufweist, die LNA und/oder PNA umfasst.

18. Nucleinsäurekomplex, der drei Nucleinsäure-Stränge umfasst: Einen PromotorStrang, einen komplementären Promotor-Strang und einen Zielstrang, worin der komplementäre Promotor-Strang die Sequenz in voller Länge eines ersten Stranges eines doppelsträngigen Promotors umfasst; der Zielstrang einen Teil eines zweiten Stranges des doppelsträngigen Promotors umfasst, der komplementär zu einem Teil des ersten Stranges ist und der Promotor-Strang einen Teil des zweiten Stranges des doppelsträngigen Promotors umfasst, der komplementär zu einem Teil des ersten Stranges ist, worin keiner der Teile des zweiten Stranges des auf dem Zielstrang oder auf dem Promotor-Strang vorliegenden doppelsträngigen Promotors zur Bildung eines fünktionellen Promotors fähig ist, wenn er in der Abwesenheit des anderen Teils zu dem komplementä ren Promotor-Strang hybridisiert wird, aber worin ein funktioneller Promotor gebildet wird, wenn der komplementäre Promotor-Strang zu dem Zielstrang wie auch dem Promotor-Strang hybridisiert wird.

19. Komplex nach Anspruch 18, worin der komplementäre Promotor-Strang und der Promotor-Strang durch erste bzw. zweite Nucleinsäure-Sonden vorgesehen sind, wobei der Komplex bei der Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-17 gebildet wird.

20. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, worin das Kit erste und zweite Sonden umfasst, zum Bilden, zusammen mit der entsprechenden Zielsequenz, des Komplexes nach Anspruch 18 und Anleitungen zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-17.

21. Kit nach Anspruch 20, das des Weiteren eines oder mehreres des Folgenden umfasst:

DNA-Polymerase; KNA-Polymerase; Ribo- oder Desoxyribonucleotidtriphosphate; Markierungsreagenzien; Nachweisreagenzien; Puffer.