DE69838943T2

DE69838943T2 - Anwendung von nadph- und nadh-analogen zur bestimmung von enzymaktivitäten und metaboliten

Info

Publication number: DE69838943T2
Application number: DE69838943T
Authority: DE
Inventors: Richard A. Bound Brook KAUFMAN
Original assignee: Specialty Assays Inc
Current assignee: Specialty Assays Inc
Priority date: 1997-02-04
Filing date: 1998-02-03
Publication date: 2008-12-18
Anticipated expiration: 2018-02-04
Also published as: CA2278850C; AU6259898A; DE69838943D1; WO1998033936A1; EP0973938B1; JP2001526528A; NZ336841A; EP0973938A1; EP0973938A4; JP4361611B2; AU742386B2; US5801006A; CA2278850A1; ATE382706T1

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung ist auf die Verwendung von NADPH (Nicotinamidadenindinucleotidphosphat)- und NADH (Nicotinamidadenindinucleotid)-Analoga als stabile Enzym-Cofaktoren zur Messung von Enzymaktivitäten oder von Substraten mit enzymatischen Verfahren gerichtet, in denen die Verwendung von NADPH- und/oder NADH-Cofaktoren zu deren Bestimmung erforderlich ist.
Hintergrund der Erfindung
Über die erste beschriebene Herstellung von NAD(Nicotinamidadenindinucleotid)-Analoga, deren Modifikation in der Amidgruppe des Pyridinrings von NAD durchgeführt wurde, ist in der Literatur von Zateman et al., J. Biol. Chem. 209, 453, 1954, und Zateman et al., J. Biol. Chem. 209, 467, 1954, berichtet worden. Das erste NAD-Analog mit einer Modifikation in der Amidgruppe des Pyridinrings in funktionalem Zusammenhang mit einem Enzym war 3-Acetylpyridinadenindinucleotid, das von Kaplan et al., J. Biol. Chem. 221, 823, 1956, synthetisiert wurde. Die NAD-Analoga wurden enzymatisch mit Säugetier-NAD-Glycohydrolase (NADase) synthetisiert, mit der zusätzlich zur Hydrolyse der NAD-Pyridinglycosid-Bindung eine Austauschreaktion zwischen dem Pyridinrest und weiteren substituierten Pyridinen durchgeführt werden kann. Seit diesen frühen Studien sind mindestens 48 NAD/NADP-Analoga hergestellt worden, in denen die Amidgruppe des Pyridinrings modifiziert worden ist. Bezüglich einer vollständigen Übersichtsliteratur von NAD/NADP-Analoga siehe The Pyridine Nucleotide Coenzymes von J. Everse, B. Anderson und W-S. You, Academic Press, New York, 1982, S. 92–132, sowie Pyridine Nucleotide Coenzymes (Coenzymes and Cofactors, Band III), John Wiley, New York, 1987, S. 324–365, deren Inhalt durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird. Unter den NAD/NADP-Analoga mit einer Modifikation der Amidgruppe des Pyridinrings stehen allerdings nur wenige in einem funktionalen Zusammenhang mit Hydrogenase-Enzymen. Das Erfordernis zum Funktionsvermögen mit Dehydrogenase-Enzymen beruht darauf, dass eine Carbonyl- oder Thiocarbonylgruppe an der 3-Position des Pyridinrings vorliegen muss oder die Amidgruppe an der 3-Position durch ein Halogenatom ersetzt werden (siehe oben Everse et al.).
Die meisten enzymatischen Studien mit den NAD/NADP-Analoga sind mit den oxidierten Formen zur Aufklärung der funktionellen Gruppen durchgeführt worden, die zur Bindung und zum Funktionsvermögen mit Dehydrogenase-Enzymen wesentlich sind (siehe die obige Übersichtsliteratur). Kaplan et al., J. Biol. Chem. 221, 833, 1956, untersuchten die Oxidationspotenziale von an der 3-Position mit einer Aldehydgruppe (-CHO) und einer Acetylgruppe (-COCH₃) substituierten NAD-Analoga und ermittelten ein Potenzial für beide Gruppen von ca. –0,248 V gegenüber –0,320 V für NAD. Biellman et al., FEBS Lett. 7, 199, 1970, ermittelten in ähnlichen Studien ein Potenzial von –0,285 V für das Thionicotinamid- bzw. Thiocarbonyl-NAD-Analog (-CSNH₂). Lamos et al. verwendeten in US 5,037,738 Thionicotinamid-NADP und -NADH in einem gleichzeitigen Glucose- und Harnstoff-Assay. In deren Verfahren wurde Glucose in einer enzymatischen Reaktion entweder mit Glucose-Dehydrogenase oder Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase durch Verfolgung des Absorptionsanstiegs bei 404 nm oder des Fluoreszenzanstiegs bei 550 nm durch die Bildung von Thionicotinamid-NADPH gemessen, während Harnstoff in einem gekoppelten enzymatischen Verfahren mit Urease und Glutamat-Dehydrogenase durch Verfolgung der Absorptionsabsenkung bei 340 nm oder der Fluoreszenzabsenkung bei 440 nm durch die NADH-Oxidation ermittelt wurde.
Abraham et al., Nature 203, 973, 1964; Biochemistry 4, 2616, 1965, untersuchten die spontanen Reaktionen von NADH mit Orthophosphaten in neutralen wässrigen Lösungen durch Verfolgung und Aufzeichnung der Absorptionsänderungen im UV-Bereich des Spektrum, worin NADH absorbiert. Sie beobachteten, dass die NADH-Reaktivität mit steigenden Orthophosphat-Konzentrationen anstieg, und folgerten aus diesen UV-Absorptionsänderungen, dass mindestens 3 Folgereaktionen aus 3 nacheinander aus Orthophosphat auf NADH übertragenen Protonen auftraten und abliefen. In einem Versuch in 1,5 molarem Phosphat bei pH von 6,62 mit NADH und 3-substituierten Pyridin-NADH-Analoga beobachteten sie, dass die Analoga weniger reaktiv mit Phosphat als mit NADH waren.
In den letzten Jahren ist es mit der zunehmenden Nachfrage nach gesteigerter Spezifität bei Analysen der klinischen Chemie üblich und einvernehmlich geworden, dass Enzym-Assays bzw. -Analysen in einem kinetischen oder kontinuierlichen Modus während der Reaktion und für Metabolit- und Substrat-Assays bzw. -Analysen ein Enzym direkt oder indirekt mit einem gekoppelten enzymatischen Verfahren gemessen werden. Solche Verfahren sind den auf dem Gebiet klinischer Analysen tätigen Fachleuten gut bekannt. Zur Veranschaulichung von 2 Beispielen kinetischer oder kontinuierlicher Aufzeichnung und Verfolgung von Enzym-Assays siehe die Messung der ALT (Alanin-Aminotransferase)- und AST(Aspartat-Aminotransferase)-Enzymaktivitäten:
Die ALT-Aktivität wird in typischer Weise mit dem folgenden gut eingeführten Verfahren gemessen:
In diesem Verfahren wird die ALT-Aktivität durch kontinuierliche Verfolgung der erzeugten Brenztraubensäure gemessen. Dies wird mit einer gekoppelten enzymatischen Reaktion mit Lactat-Dehydrogenase zur katalytischen Reduktion der Brenztraubensäure zu Milchsäure bei einhergehender Oxidation von reduziertem Nicotinamidadenindinucleotid (NADH) in seine oxidierte NAD-Form bewerkstelligt. Diese Reaktion wird spektrofotometrisch durch Verfolgung der Absorptionsabsenkung (gewöhnlich bei 340 nm) gemäß der NADH-Oxidation gemessen. NADH weist ein Absorptionsmaximum im UV-Bereich des Spektrum bei ca. 340 nm auf, während NAD praktisch keine Absorption bei dieser Wellenlänge aufweist.
Die AST-Aktivität wird in ähnlicher Weise wie folgt bestimmt:
In diesem Verfahren wird die AST-Aktivität durch kontinuierliche Verfolgung des erzeugten Oxaloacetat gemessen. Dies wird durch eine gekoppelte enzymatische Reaktion mit Malat-Dehydrogenase zur katalytischen Reduktion des Oxaloacetats zu Äpfelsäure bei einhergehender NADH-Oxidation in seine oxidierte NAD-Form bewerkstelligt. Diese Reaktion wird spektrofotometrisch durch Verfolgung der Absorptionsabsenkung (gewöhnlich bei 340 nm) gemäß der NADH-Oxidation gemessen.
Beispiele von Substrat- oder Metabolit-Analysen, die mit enzymatischen Verfahren gemessen werden und an die Oxidation von NADH und/oder NADPH gekoppelt sind, stellen die Bestimmungen von Kohlendioxid (kollektiv gelöstem Kohlendioxid, Bicarbonat und Carbonat), Ammoniak, Brenztraubensäure, Harnstoff oder Blut-Harnstoffstickstoff (BUN = blond urea nitrogen), Salicylaten, Triglyceriden, Adenosin-5'-triphosphat und von 2,3-Diphosphoglycerat dar. Kohlendioxid und Harnstoff werden gewöhnlich mit gekoppelten Enzym-Reaktionen gemessen, während Ammoniak gewöhnlich mit Enzym-Glutamat-Dehydrogenase und einem reduzierten Cofaktor (gewöhnlich mit NADPH) und Brenztraubensäure gewöhnlich mit Lactat-Dehydrogenase und NADH gemessen werden. Die Verfahren zur Messung von Kohlendioxid, Harnstoff und Ammoniak werden wie folgt erläutert: Kohlendioxid-Verfahren:
Kohlendioxid wird gewöhnlich als eine Endpunkt-Reaktion gemessen, obgleich ein Umsatz- oder Kinetik-Assay unter bestimmten Bedingungen ebenfalls möglich sind. Es besteht eine stöchiometrische Beziehung zwischen der Bicarbonatmenge oder dem Gesamt-Kohlendioxidgehalt in der Probe zur oxidierten NADH-Menge. Somit kann durch Bestimmung der Absorptionsabsenkung bei gewöhnlich 340 nm gemäß NADH-Oxidation durch Oxaloacetat die Bicarbonat-Menge in der Probe ermittelt werden.
Harnstoff-Verfahren:
In diesem Verfahren besteht eine direkte Beziehung zwischen der Harnstoffmenge in der Probe zur oxidierten NADH-Menge. In diesem gekoppelten enzymatischen Verfahren werden 2 mol NADH für jedes 1 mol Harnstoff in der Probe oxidiert. Obgleich diese Reaktion als Endpunkt durchgeführt werden kann, wobei aller Harnstoff zu Ammoniak und alles Ammoniak zu L-Glutamat bei einhergehender Oxidation einer stöchiometrischen NADH-Menge umgesetzt werden, wird sie üblicher als Umsatz- bzw. Geschwindigkeitsassay in klinischen Analysen durchgeführt. In diesem Verfahren werden ein Absorptionswert kurz nach Zugabe der Probe zum Reagens und dann ein zweiter Absorptionswert bei der gleichen Wellenlänge kurze Zeit später (in typischer Weise nach 1 bis 4 min) nach teilweise beendeter Reaktion abgelesen. Der letztere abgelesene Absorptionswert wird vom ersten abgelesenen Absorptionswert subtrahiert, um die Delta-Absorption ΔA für das Zeitintervall des Reaktionsablaufs zu erhalten. Diese ΔA wird mit einem Standard einer bekannten Harnstoff-Konzentration verglichen, und die unbekannte Harnstoff-Konzentration kann ermittelt werden. Alternativ dazu, können mit dem obigen Verfahren mehrere Absorptionswerte über ein festgelegtes Zeitintervall abgelesen und daraus eine Linearregression zur Bestimmung der Durchschnitts-ΔA pro Zeitdauer durchgeführt werden, oder es werden typischer die Absorptionswerte in ΔA/min umgerechnet. Auch werden bei diesem Verfahren Spektralinterferenzen aus der Probeeliminiert, solange sie sich während des verfolgten Zeitintervalls nicht verändern, da sie eliminiert werden, wenn die abgelesenen Absorptionswerte voneinander subtrahiert werden.
Ammoniak-Verfahren:
In klinischen Verfahren zur Messung von Ammoniak wird NADPH gewöhnlich anstatt NADH verwendet. Dies deshalb, um eine Interferenz aus Brenztraubensäure zu verhindern, die in der Probe vorhanden sein kann und in der Gegenwart von Lactat-Dehydrogenase, die ebenfalls in der Probe vorhanden sein kann, die folgende Reaktion katalysieren könnte:
Da Lactat-Dehydrogenase NADPH nicht nutzen kann, wird eine Interferenz aus Brenztraubensäure vermieden.
Im Allgemeinen laufen die obigen Verfahren sehr gut ab. Der Hauptnachteil bei diesen Verfahren beruht auf der innewohnenden Instabilität des NADH und NADPH in den wässrigen Reagenslösungen. Es ist gut bekannt, dass NADH und NADPH in wässrigen Lösungen erst bei einem pH über 9 beginnen relativ stabil zu werden (Wu et al., Clin. Chem. 32, 314, 1986; Lowry et al., J. Biol. Chem. 235, 2756, 1961). Leider werden allerdings alle obigen Verfahren gewöhnlich bei tieferen pH-Werten durchgeführt. Beispielsweise beträgt der optimale pH-Wert zur Messung der ALT-Aktivität in Serum 7,5 und zur Messung der AST-Aktivität in Serum 7,8, zur Messung von Kohlendioxid in Serum ist ein pH-Wert von 7,0 bis ca. 8,0 bevorzugt, welcher auch das Optimum für die obige gekoppelte enzymatische Reaktion darstellt, und Harnstoff- und Ammoniak-Assayverfahren werden in Serum in typischer Weise bei einem pH-Wert von ca. 8,3 gemessen, der der optimale pH-Wert für die obigen 2 enzymatischen Verfahren ist. Bezüglich einer umfassenderen Diskussion der Reaktionsbedingungen für diese und weitere Analyte siehe Teitz, Textbook of Clinical Chemistry, 1986, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA, dessen Offenbarungsgehalt durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird. Somit weisen wässrige Lösungen, die NADH und NADPH enthalten, lediglich eine eingeschränkte Stabilität beim pH-Wert dieser Lösungen auf, und die Reagenzien müssen bei Kühlschranktemperaturen gelagert und aufbewahrt werden, um die Stabilität während der Aufbewahrungsdauer zu maximieren.
Einige der Produkte, die aus der Instabilität von NADH und NADPH resultieren, sind die Oxidationsprodukte NAD und NADP, die sich aus einer Oxidation durch in den wässrigen Lösungen gelösten molekularen Sauerstoff ergeben können. Zur Verbesserung der Stabilitäten von NADH und NADPH in wässrigen Lösungen wandte Modrovich ( US 4,394,449 ) ein Nucleotid-Regenerierungssystem an, um den oxidierten Enzym-Cofaktor zurück in die reduzierte Form zu überführen. Obwohl dies zur Verlängerung der wässrigen Aufbewahrungsdauer von NADH- und NADPH-Cofaktoren enthaltenden Reagenzien hilfreich sein kann, stellt die Oxidation dieser Cofaktoren leider nicht den einzigen Abbauweg dar. In weiteren Versuchen zur Verbesserung der Aufbewahrungszeit von NADH und NADPH gab Modrovich ( US 4,372,894 ) die reduzierten Cofaktoren zu einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel zusammen mit Trocknungspartikeln, um den Wassergehalt unter 0,5% zu halten. In einem weiteren Verfahren zur Stabilisierung von NADH verwendeten Crowther et al. ( US 5,116,728 ) ein Puffersystem, um die NADH-Konzentration in wässriger Lösung zu Puffern. In diesem System werden Glucose, Glucose-Dehydrogenase und NAD zu einer NADH enthaltenden wässrigen Lösung gegeben. Durch Wahl eines geeigneten pH-Wertes, der Glucose-, NAD- und NADH-Konzentrationen und der Glucose-Dehydrogenaseaktivität wird beansprucht, dass ein relativ konstanter NADH-Spiegel eine Zeit lang gehalten werden kann. Der Inhalt jeder der vorgenannten USsen wird durch Bezugnahme hierin aufgenommen.
Somit besteht weiterhin ein Bedarf für eine bessere Stabilität von Diagnose-Testkits in Laboratorien der klinischen Chemie, bei denen die Verwendung von NADH- und NADPH-Cofaktoren erforderlich ist. Sobald die NADH- und NADPH-Cofaktoren in den wässrigen Lösungen in den Testkits abgebaut worden sind, ist das Reagens nicht länger funktionsfähig und muss entsorgt werden, wenn es vor der Verfallszeit nicht aufgebraucht worden ist, wobei die klinischen Laboratorien die Kosten für die nicht genutzten Reagenzien und Tests zu tragen haben. Eine bessere Cofaktorstabilität verlängert die Lagerdauer wässriger Reagenzien, verringert die Kosten pro Test (wobei alles Reagens in einem Kit genutzt wird) und steigert die Ergebnisqualität durch das Fehlen von Reagenzien fragwürdiger Stabilität.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist durch den beigefügten Anspruchssatz beschrieben.
Einer der Vorteile der vorliegenden Erfindung beruht darauf, dass bestimmte NADH- und NADPH-Analoga wie 3-Acetylpyridin-NADH, 3-Pyridinaldehyd-NADH und Thionicotinamid-NADH viel stabiler in wässrigen Lösungen bei sauren, neutralen und alkalischen pH-Werten (d. h. von ca. < 6 bis ca. 10,5) als NADH und NADPH sind. Somit verfügen mit diesen Cofaktor-Analoga hergestellte Diagnose-Reagenskits über eine weit überlegene Lagerlebensdauer gegenüber derzeitigen herkömmlichen Tests mit entweder NADH oder NADPH.
Ein weiterer Vorteil der Kits und Verfahren der Erfindung beruht darauf, dass die NADPH- und NADH-Analoga in der reduzierten Form vorliegen. Assayverfahren, z. B. wie Lactat-Dehydrogenaseaktivitätsbestimmungen, können in umgekehrter Richtung (Pyruvat → Lactat) gemessen werden, wobei die Aktivität um das ca. 2-Fache höher als in der Vorwärtsrichtung (Lactat → Pyruvat) mit stabileren Kits und wiederum weniger Reagensabfall ist, da in der Vorwärtsreaktion der oxidierte Cofaktor zur Anwendung gelangt, der relativ instabil beim optimalen pH-Wert (von ca. 9) der Vorwärtsreaktion ist.
Ein weiterer wesentlicher Vorteil der Kits und Verfahren der Erfindung beruht darauf, dass die NADPH- und NADH-Analoga gesteigerte Empfindlichkeiten in den Assay- bzw.
Analysenverfahren zeigen und ergeben. Dies gilt ganz besonders für die Bestimmung von Ammoniak in Serum und Plasma, bei der das obere Ende des Bezugsbereichs nur ca. 60 μmol pro L beträgt. Durch die Verwendung von z. B. Thionicotinamid-NADH oder Thionicotinamid-NADPH anstatt entweder NADH oder NADPH wird die Empfindlichkeit um einen Faktor von ca. 2 gesteigert. Auch weisen die Thionicotinamid-Analoga Absorptionsmaxima im sichtbaren Bereich des Spektrum auf und sind weniger empfindlich gegenüber einer Trübung in den klinischen Proben, welche durch hohe Lipidspiegel (von Triglyceriden) verursacht wird, die mit Absorptionsmessungen bei 340 nm interferieren, wo NADH und NADPH gewöhnlich gemessen werden. Auch ermöglicht die gesteigerte Empfindlichkeit der Thionicotinamid-NADH- und -NADPH-Analoga ein kleineres Probenvolumen, das in den Assayverfahren dann zur Anwendung gelangt. Dies ist bei Messung klinischer Proben von Kindern und Neugeborenen, bei denen das Probenvolumen oft eingeschränkt ist, besonders wichtig.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Es werden Diagnosekits offenbart, die NADH- und NADPH-Analoga enthalten. Die Analoga weisen die Formel auf:
worin gilt:
R₁ ist

R₂ ist Aryl oder Heteroaryl;
Q ist C oder S;
T ist O oder S;
X ist H, OR₃ oder H₂PO₄, worin R₃ H, C_1-4-Alkyl, C_1-4-Haloalkyl, substituiertes C_1-4-Alkyl oder Halogen ist;
Y ist O, S oder NOH; und
Z ist H, C_1-6-Alkyl, C_1-6-Halogalkyl, substituiertes C_1-6-Alkyl, NHL, worin L H, OH oder NH₂ ist, Aryl oder Aralkyl, mit der Ausnahme, dass L nicht H ist, wenn R₂ Adenin ist.
In der Formel (I) weisen einige bevorzugte Reste R₁ die Formeln auf:
worin Q C oder S und Y O, S oder NOH sind. Bevorzugter ist R₁ aus der Gruppe ausgewählt:
Alternativ dazu, kann R₁ ausgewählt sein aus:

bevorzugt aus Cl, J oder Br oder
Bevorzugt ist R₂ Adenin wie:
Alternativ dazu, kann R₂ ein substituiertes Adenin oder ein substituiertes oder unsubstituiertes Mitglied der Gruppe aus Xanthinen, Thioxanthinen, Hypoxanthinen, Guaninen oder aus weiteren kondensierten heterocyclischen Ringstrukturen, Arylen, substituierten Arylen usw. sein.
Auch sind innerhalb der Formel (I) X bevorzugt OH oder H₂PO₄ und jedes T O. Bevorzugte Verbindungen gemäß der Formel (I) als Bestandteil der hierin beschriebenen Kits und Verfahren schließen 3-Pyridinaldehyd-NADH, 3-Pyridinaldehyd-NADPH, 3-Acetylpyridin-NADH, 3-Acetylpyridin-NADPH, Thionicotinamid-NADH und Thionicotinamid-NADPH ein. Diese Verbindungen können mit organischen Standard-Chemieverfahren synthetisiert oder, gewünschtenfalls, von kommerziellen Lieferanten wie von Sigma Chemical Co. käuflich erworben werden. Es ist davon auszugehen, dass die Kits der vorliegenden Erfindung die Verbindungen der Formel (I) in Mengen von ca. 0,01 bis ca. 1,0 mmol/L enthalten.
Die hierin offenbarten Kits und Verfahren eignen sich zur Messung verschiedener Enzymaktivitäten und -metaboliten. Eine nicht einschränkende Liste solcher Materialien, die mit den hierin beschriebenen Syntheseanaloga gemessen werden können, schließen ALT(Alanin-Aminotransferase)-Aktivität, AST(Aspartat-Aminotransferase)-Aktivität, Lactat-Dehydrogenaseaktivität, α-Hydroxybutyrataktivität, Sorbit-Dehydrogenaseaktivität, Kreatin-Kinaseaktivität, 5'-Nucleotidaseaktivität, die Gehaltsbestimmung von Harnstoff, Ammoniak, Salicylaten, Triglyceriden, Brenztraubensäure, Kohlendioxid, 2,3-Diphosphoglycerat und von Adenosin-5'-triphosphat in Analysenproben ein.
In weiteren Ausführungsformen der hierin enthaltenen Offenbarung können die Diagnose-Kits auch ein Enzym wie Lactat-Dehydrogenase, Malat-Dehydrogenase, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase, Glutamat-Dehydrogenase, Urease, Salicylat-Hydroxylase, Pyruvat-Kinase, Phosphoglyceryl-Phosphokinase, Phosphoglycerat-Mutase, Glycerin-Kinase, Adenosin-Deaminase oder Glyceraldehydphosphat-Dehydrogenase einschließen. Die Enzyme sind dann in Mengen vorhanden, die hinreichen, um Enzymaktivitäten von ca. 0,1 bis ca. 150 Einheiten/mL der das Reagens enthaltenden Lösung zu ergeben. Es sollte klar sein, dass die tatsächlichen Enzymaktivitätsmengen von dem oder den im Kit enthaltenen Enzym(en) und dem Ziel-Metabolit oder der Enzymaktivität abhängen, die zur Messung gesucht werden.
Da die NADH/NADPH-Analoga der Formel (I) nicht die "natürlichen" Cofaktoren darstellen, die gewöhnlich in biologischen Systemen vorgefunden werden, sind die Kompatibilität oder Funktionsfähigkeit der NADH/NADPH-Analoga mit Dehydrogenase-Enzymen zu verifizieren. Beispielsweise wurde ermittelt und bestimmt, dass es im Fall von 3-Acetylpyridin-NADH mehrere geeignete Lactat-Dehydrogenasen gibt, einschließlich derer, die vorgefunden werden in: Hühnchenleber, Kaninchenmuskel, Schweinemuskel, Rindermuskel, Kaninchenherz, Schweineherz, Leuconostoc mesenteroides und Staphyloccus sp.. Weitere Lactat-Dehydrogenasen sind genauso gut in Betracht zu ziehen. Ebenso wurden auch die Eignung oder Kompatibilität der NADH/NADP-Analoga mit der Malat-Dehydrogenase (MDH) verifiziert, und es wurde ermittelt und bestimmt, dass sich für 3-Acetylpyridin-NADH z. B. die Malat-Dehydrogenasen aus Thermus sp. und Schweineherz eignen und weitere Enzym-Species als geeignete zu erwarten sind.
In einigen Kits kann z. B. ein Oxamat anstatt eines Enzyms, wie Lactat-Dehydrogenase, in Mengen von ca. 5 bis ca. 25 mmol/L enthalten sein.
Die Kits der vorliegenden Erfindung können entweder in nasser oder trockener Form, einschließlich einer lyophilisierten Form, abhängig von den Bedürfnissen des Anwenders zubereitet werden. Die Kits können auch einen geeigneten Puffer wie Tris(hydroxymethyl)aminomethan, Tris(hydroxymethyl)aminomethansulfat, Bicin, Bis-Tris, Hepes, Imidazol und MES enthalten. Für die auf dem Gebiet tätigen Fachleute ist erkennbar, dass der enthaltene Puffer von den vom Fachmann gesetzten Maßstäben abhängt und auch auf der Grundlage der Metabolit- oder Enzymaktivität, die zur Messung gesucht werden, ausgewählt wird. Es ist allerdings davon auszugehen, dass eine Puffermenge in den Kits, d. h. von ca. 0,01 bis ca. 1,0 mol/L, hinreicht und die das Analog enthaltende Lösung einen pH-Wert von ca. 5,5 bis 9,5 aufweist.
In noch weiteren Ausführungsformen der hierin enthaltenen Offenbarung können die Diagnose-Kits ein Substrat wie L-Alanin, α-Ketoglutarat, L-Aspartat, Brenztraubensäure, α-Ketobutyrat, Fructose, Adenosin-5'-triphosphat, Adenosin-5'-monophosphat, 2-Phosphoglykolsäure, Phosphoenolpyruvat, Adenosin-5'-diphosphat und Kreatin enthalten. Die Substrate sind in Mengen von ca. 0,1 bis ca. 1.000 mmol/L vorhanden. Gewünschtenfalls können die Kits zubereitet werden, um ein geeignetes antimikrobielles Mittel wie Natriumazid, Kathon, Bronopol oder Parabene einzuschließen. Solche antimikrobiellen Mittel können in Mengen von ca. 0,01 bis ca. 0,5 Gew.-% vorhanden sein.
Die Kits der vorliegenden Erfindung können auch zubereitet werden, um Enzym-Stabilisierbestandteile oder -Reagenssysteme, d. h. Enzyme und Substrate, wie die in US 4,394,449 angegebenen, einzuschließen, wobei ein oxidierter Cofaktor in seine ursprüngliche reduzierte Form mit einem entsprechenden geeigneten Enzym und Substrat rückreduziert werden kann. Der Inhalt dieses Patents wird durch Bezugnahme hierin aufgenommen. Kurz gesagt, dient die enzymatische Regenerierung oxidierter Cofaktoren zurück in deren reduzierte Form dazu, die Lebensdauer bereits langlebiger Reagens-Kits noch zu verlängern.
Beispiele Enzym-gekoppelter Reaktionen zur Regenerierung der oxidierten NAD(P)-Analoga sind die folgenden:

1) mit Glucose-6-phosphat und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase:
2) mit Glucose und Glucose-Dehydrogenase:

In den obigen Beispielen bedeutet das (P) entweder das NAD-Analog oder das phosphorylierte NADP-Analog. Die obigen NAD(P)-Analog-Regenerierungssysteme sollen nicht exklusiv für weitere Enzym-Substratsysteme stehen, sondern lediglich als Beispiele dienen.
Mit dem Pyridinnucleotid-Regenerierungssystem hat es sich erwiesen, dass die Stabilität reduzierter Pyridinnucleotid-Cofaktoranaloga in weiteren Reagenzien verlängert wird. Reagenzien mit NADH/NADPH-Analoga mit verbesserter Analogstabilität wurden festgestellt mit: Ammoniak, Harnstoff oder BUN, ALT und AST sowie mit Kohlendioxid.
Die Reagenzien gemäß der hierin enthaltenen Offenbarung können in mehreren unterschiedlichen Formaten konfiguriert werden. Es kann ein einzelnes Röhrchen zubereitet werden, das alle notwendigen Komponenten, einschließlich antimikrobieller Mittel, Puffer und Komponenten zur Stabilisierung des bzw. der Kopplungsenzym(en), falls vorhanden, enthält. Der Einfachheit halber ist ein einzelnes Röhrchen mit gebrauchsfertigem Flüssig-Reagens mit einer Lagertemperatur bei ca. +2 bis 8°C (Aufbewahrung im Kühlschrank) bevorzugt. Alternativ dazu, können die Reagenzien als 2-Komponenten-System oder sogar als 3- oder Mehr-Komponenten-System als Pulver (Trockenfüllung) oder als Lyophilisat zubereitet werden. Bei Vorliegen von Komponenten des Reagens in getrennten Röhrchen oder Fläschchen stellt sich gewöhnlich eine bessere Komponentenstabilität ein, was sich aber als weniger bequem für bzw. bei einigen Endanwendern erweisen könnte.
Beispiele
Die folgenden nicht-einschränkenden Beispiele erläutern bestimmte Ausführungsformen der Erfindung. Alle Teile- und Prozentsatzangaben sind auf das Gewicht bezogen, wenn nichts Anderes ausgesagt ist, und alle Temperaturen sind in °Celsius angegeben. Die grundsätzlichen Reagenzien wurden von kommerziellen Lieferanten wie von Sigma Chemical Co. erhalten.
Die unten angegebenen Reagenszusammensetzungen sind die Endkonzentrationen aller Bestandteile nach Einbeziehung des Probenvolumen. Es ist klar, dass die Reagenzien mit variierenden Konzentrationsgraden hergestellt und zubereitet werden können. Beispielsweise kann eine konzentrierte Version des Reagens zubereitet und dann mit destilliertem, entionisiertem, gereinigtem oder mit nicht gereinigtem Wasser vor Gebrauch des Reagens verdünnt werden.
Beispiel 1
Bestimmung der ALT-Aktivität
Im Folgenden wird ein Beispiel einer Reagenszusammensetzung zur Bestimmung der ALT-Aktivität in einer Analysenprobe mit 3-Acetylpyridin-NADH angegeben und beschrieben. Es gibt viele Variationen dieses Grundreagens, wobei aber alle den gleichen Zweck erfüllen, der auf die Bestimmung der ALT-Aktivität in einer Analysenprobe gerichtet ist. Die hier gewählte Formulierung ist die von IFCC (International Federation of Clinical Chemistry) empfohlene Formulierung, mit der Ausnahme, dass Pyridoxalphosphat weggelassen und der Cofaktor NADH durch 3-Acetylpyridin-NADH ersetzt worden sind. Das Pyridoxalphosphat in der IFCC-Reagensformulierung soll gewährleisten, dass alles ALT-Holoenzym in der Probe Pyridoxalphosphat gebunden hat, um alle ALT-Aktivität in der Probe sicher zu messen.

Die gekoppelte Enzym-Reaktion zur Messung der ALT-Aktivität ist die folgende:

Reagenszusammensetzung (Konzentrationen der Bestandteile, einschließlich Probenvolumen)

Bestandteil	Konzentration	zulässig
Tris(hydroxymethyl)aminomethan	100 mmol/L	10–50 mmol/L
L-Alanin	500 mmol/L	200–800 mmol/L
α-Ketoglutarat	15 mmol/L	5–50 mmol/L
Lactat-Dehydrogenase	26.000 E/L	> 600 E/L
Natriumazid	0,06% G/V	0,03–0,5% G/V
3-Acetylpyridin-NADH	0,5 mmol/L	0,1–1,0 mmol/L
pH-Wert	7,5	7–8
Verhältnis:
Probenvolumen/Gesamtvolumen	1/12	1/5–1/100

Obwohl das obige Beispiel mit 3-Acetylpyridin-NADH angegeben ist, könnten Thionicotinamid-NADH in ähnlichen Mengen sowie weitere Analoga der Formel (I), gegebenenfalls, verwendet werden. Der phosphorylierte NADH-Cofaktor NADPH ist in typischer Weise nicht mit Lactat-Dehydrogenase funktionsfähig. Somit wäre für die phosphorylierten Analoga 3-Acetylpyridin-NADPH, 3-Pyridinaldehyd-NADPH und Thionicotinamid-NADPH zur Funktionsfähigkeit im obigen Reaktionsschema eine geeignete Lactat-Dehydrogenase notwendig, die phosphorylierte Cofaktoren verwendet.
Zur Bestimmung der ALT-Aktivität mit den Cofaktor-Analoga wird die Absorptionsabsenkung spektrofotometrisch verfolgt und aufgezeichnet, wie dies auch im Normalfall bei Verwendung des NADH-Cofaktors gemacht wird. Die Cofaktor-Analoga weisen allerdings etwas andere Wellenlängenmaxima und molare Absorptionswerte als NADH auf. Deshalb unterscheiden sich die Faktoren, die zur Umrechnung der Absorptionsänderung pro Minute (ΔA/min) eingesetzt werden, für jedes Cofaktor-Analog und natürlich auch von NADH. Das Wellenlängen-Absorptionsmaximum beträgt im Nah-UV für 3-Acetylpyridin-NADH ca. 363 nm und für 3-Pyridinaldehyd-NADH ca. 358 nm (Siegel et al., Arch Biochem. and Biophys. 82, 288, 1959). Für Thionicotinamid-NADH, das im sichtbaren Bereich des Spektrum absorbiert, beträgt das Wellenlängenmaximum ca. 398 nm (Stein et al., Biochem. 2, 5, 1015, 1063). Bei diesen Wellenlängen betragen die molaren Absorptionswerte ca. 9,1 × 10³, 9,3 × 10³ bzw. 11,9 × 10³ für die 3 Cofaktor-Analoga. Zum Vergleich, beträgt der molare Absorptionswert von NADH 6,2 × 10³ bei 340 nm. Da die meisten Analysengeräte der klinischen Chemie zur Messung von NADH/NADPH entworfen worden sind, ist die Wellenlänge von 340 nm die am nächsten gelegene Wellenlänge zum Absorptionsmaximum für 3-Acetylpyridin-NADH und 3-Pyridinaldehyd-NADH, obwohl einige Analysengeräte Wellenlängen zwischen 340 und 405 nm, z. B. zwischen 360 und 380 nm, aufweisen. Bei 340 nm beträgt die Absorption von 3-Acetylpyridin-NADH ca. 92% der Absorption von NADH und ca. 70% des Absorptionsmaximum bei 363 nm. Bei 340 nm beträgt die Absorption von 3-Pyridinaldehyd-NADH ca. 94% der Absorption von NADH und ca. 82% des Absorptionsmaximum bei 358 nm. Somit muss zur Messung der Absorptionsabsenkung bei 340 nm der Faktor zur Bestimmung der ALT-Aktivität für das verwendete Cofaktor-Analog angepasst und eingestellt werden. Für den Thionicotinamid-Cofaktor weisen allerdings die meisten Analysengeräte der klinischen Chemie eine Wellenlänge bei ca. 405 nm auf, die sehr nahe am Wellenlängenmaximum von 398 nm für dieses Cofaktor-Analog liegt. Somit kann Thionicotinamid-NADH ganz bequem und einfach mit eigentlich allen Analysengeräten der klinischen Chemie bei 405 nm gemessen werden.
Bei Verwendung der NADH-Cofaktor-Analoga in der obigen ALT-gekoppelten Reaktion muss genügend Aktivität des Kupplungsenzyms im Fall von Lactat-Dehydrogenase zugegeben werden, so dass die Sekundärreaktion (in diesem Fall der Reduktion von Pyruvat zu Lactat und der einhergehenden Oxidation des reduzierten Cofaktors) der Geschwindigkeit bzw. dem Umsatz der primären Transaminierungsreaktion, besonders bei Proben mit hohen ALT-Aktivitäten, folgt und damit einhergeht. In der obigen Reagenszusammensetzung wird hinreichend Lactat-Dehydrogenase zugegeben, um eine Assaylinearität von 700 E/L zu ergeben. Eine Zugabe von weniger Enzymaktivität ergibt eine niedrigere ALT-Linearität.
Beispiel 2
Bestimmung der AST-Aktivität
Im Folgenden wird ein Beispiel einer Reagenszusammensetzung zur Bestimmung der AST-Aktivität in einer Analysenprobe mit 3-Acetylpyridin-NADH beschrieben und angegeben. Wie beim ALT-Reagens, gibt es viele Variationen dieses Grundreagens. Die hier gewählte Formulierung beruht auf der IFCC-empfohlenen Formulierung, mit der Ausnahme, dass Pyridoxalphosphat und Lactat-Dehydrogenase weggelassen und das NADH durch 3-Acetylpyridin-NADH ersetzt worden sind. Wie beim ALT-Reagens, ist das Pyridoxalphosphat zugegeben worden, um zu gewährleisten, dass alles AST-Holoenzym mit Pyridoxalphosphat gesättigt wird, so dass alle aktive AST-Aktivität gemessen wird. Lactat-Dehydrogenase wird zugegeben, um kleine Mengen Brenztraubensäure während der Verzugsphase der Reaktion zu metabolisieren, die in der Probe, besonders in Serumproben, vorliegen können. Als Alternative, kann Natriumoxamat zum Reagens gegeben werden, das die Lactat-Dehydrogenase, die in der Probe vorliegen kann, inhibiert, und somit stellt dies eine alternative Vorgehensweise zur Verhinderung einer Interferenz durch Brenztraubensäure dar.

Die gekoppelte Enzym-Reaktion zur Messung der AST-Aktivität ist die folgende:

Reagenszusammensetzung (Konzentration der Komponenten einschließlich Probenvolumen)

Bestandteil	Konzentration	zulässig
Tris(hydroxymethyl)aminomethan	80 mmol/L	10–50 mmol/L
L-Aspartat	240 mmol/L	100–500 mmol/L
α-Ketoglutarat	12 mmol/L	5–50 mmol/L
Malat-Dehydrogenase	26.000 E/L	> 600 E/L
Natriumoxamat	10 mmol/L	5–25 mmol/L
Natriumazid	0,06% G/V	0,03–0,5% G/V
3-Acetylpyridin-NADH	0,5 mmol/L	0,1–1,0 mmol/L
pH-Wert	7,8	7,3–8,2
Verhältnis:
Probenvolumen/Gesamtvolumen	1/12	1/5–1/100

Vieles der gleichen Diskussion wie im obigen Beispiel 1 für ALT gilt auch für die Bestimmung der AST-Aktivität. Als Alternative zu 3-Acetylpyridin-NADH könnten Thionicotinamid-NADH sowie weitere Analoga der Formel (I), gegebenenfalls, auch verwendet werden.
Die phosphorylierten Derivate der Cofaktor-Analoga könnten verwendet werden, solange eine geeignete Malat-Dehydrogenase gefunden werden kann, die die obigen phosphorylierten Cofaktor-Analoga verwendet.
Zur Bestimmung der AST-Aktivität mit den Cofaktor-Analoga wird die Absorptionsabsenkung spektrofotometrisch verfolgt und aufgezeichnet, wie dies im Normalfall auch bei Verwendung des NADH-Cofaktors gemacht wird. Da die Cofaktor-Analoga ihre maximale Absorption bei anderen Wellenlängen als NADH sowie andere molare Absorptionswerte aufweisen, unterscheidet sich der Faktor zur Umrechnung der Absorptionsänderung pro Minute (ΔA/min) in Einheiten pro Liter (E/L) für jeden Cofaktor und auch von NADH (siehe die Diskussion zur ALT-Aktivitätsbestimmung bezüglich Details der molaren Absorptionswerte der Cofaktor-Analoga für deren Maxima im Nah-UV und deren Empfindlichkeiten im Vergleich mit NADH bei 340 nm).
Bei Verwendung der Cofaktor-Analoga in der AST-gekoppelten Reaktion muss hinreichende Aktivität des Kupplungsenzyms, in diesem Fall der Malat-Dehydrogenase, zugegeben werden, so dass die Sekundärreaktion (in diesem Fall die Reduktion von Oxaloacetat to Malat) der Geschwindigkeit bzw. dem Umsatz der primären Transaminierungsreaktion, besonders in Proben mit hohen AST-Aktivitäten, folgt und entspricht. In der obigen Reagenszusammensetzung wurde hinreichend Malat-Dehydrogenase zugegeben, um eine Assay-Linearität von 700 E/L zu ergeben. Die Zugabe von weniger Enzymaktivität ergibt eine niedrigere AST-Linearität.
Beispiel 3
Bestimmung der Ammoniak-Konzentration
Im Folgenden wird ein Beispiel einer Reagenszusammensetzung angegeben und beschrieben, die zur Bestimmung der Ammoniak-Konzentration in einer Analysenprobe verwendet werden kann. Wie bei den obigen ALT- und AST-Reagenzien gibt es viele Variationen, das entscheidende Merkmal in dieser Formulierung ist aber die Verwendung der NADH- und NADPH-Analoga.

Die angewandte Vorgehensweise zur Messung des Ammoniak in einer Analysenprobe beruht auf der folgenden Reaktion:

Reagenszusammensetzung (Konzentration der Komponenten, einschließlich Probenvolumen)

Bestandteil	Konzentration	zulässig
Bicin (N,N-Bis[hydroxyethyl]-glycin)	0,2 mol/L	0,01–0,6 mol/L
EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure	0,07 mmol/L	0–10mmol/L
Adenosin-5'-diphosphat	3,3 mmol/L	0–10mmol/L
Xylit	20% G/V	0–30% G/V
Rinderserumalbumin	0,07% G/V	0,01–1% G/V
Natriumazid	0,07% G/V	0,03–0,5% G/V
Glutamat-Dehydrogenase	50.000 E/L	> 1.000 E/L
α-Ketoglutarat	27 mmol/L	5–75mmol/L
3-Acetylpyridin-NADH	0,4 mmol/L	0,1 bis 1 mmol/L
pH-Wert	8,3	6–9,3

Im obigen Reaktionsschema wurden 3-Acetylpyridin-NADH oder das phosphorylierte Analog 3-Acetylpyridin-NADPH als Beispiele verwendet. Thionicotinamid-NADH, Thionicotinamid-NADPH, 3-Pyridinaldehyd-NADH und 3-Pyridinaldehyd-NADPH können z. B. ebenfalls verwendet werden. Unter den drei NADH/NADPH-Analoga zeigen und ergeben die Thionicotinamide und 3-Acetylpyridine günstigere Gleichgewichtsbedingungen zur Reduktion des α-Ketoglutarats. Die Thionicotinamid-Analoga sind zur Bestimmung von Ammoniak in klinischen Proben wegen ihrer gesteigerten Empfindlichkeit und der relativ niedrigen Ammoniak-Konzentrationen in den klinischen Proben bevorzugt.
Die Ammoniak-Konzentrationen in den Analysenproben können auf vielen Wegen mit dem obigen Reaktionsschema bestimmt werden. In typischer Weise wird der Ammoniakgehalt in einer Probe als Endpunktsreaktion gemessen. Da alle oben genannten NADH/NADPH-Cofaktor-Analoga Absorptionsmaxima in den sichtbaren (reduziertes Thionicotinamid)- und Nah-UV-(reduzierte 3-Acetyl- und 3-Pyridinaldehyd-Analoga)-Bereichen des Spektrum aufweisen, ist die Absorptionsabsenkung des Reagens nach Zugabe der Probe proportional zum Ammoniakspiegel in der Probe nach Korrektur bezüglich der Auswirkung jeglicher absorbierender Verbindungen der Probe selbst. Gewöhnlich lässt man die Reaktion bis zu ihrer Beendigung oder bis zu ihrer sehr nahen Beendigung ablaufen. (Siehe die Diskussion unter ALT für die Wahl der Wellenlängen und deren molaren Absorptionswerten und -empfindlichkeiten).
Alternativ dazu, kann die Ammoniak-Konzentration als Anfangsumsatz-Assay bestimmt werden. In diesen Verfahren wird die Absorptionsänderung bei einer geeigneten Wellenlänge als Funktion der Zeit kurz nach Zugabe der Ammoniak-haltigen Probe zum Reagens bestimmt. Gewöhnlich wird die Reaktion nur eine kurze Zeit lang verfolgt, nachdem vielleicht nur 20 bis 50 Ammoniak verbraucht worden sind. Der metabolisierte Ammoniakumsatz und somit der Umsatz des Cofaktor-Verbrauchs sind proportional zum Ammoniakspiegel. Zur Durchführung von Anfangsumsatz-Assayverfahren müssen allerdings die Reaktionsbedingungen so gestaltet werden, dass die Reaktion grundsätzlich als Reaktion erster Ordnung bezüglich der Ammoniak-Konzentration abläuft. Die obige Formulierung wird so entworfen, dass sie als eine Endpunktreaktion anzuwenden ist.
Bei Verwendung der reduzierten 3-Pyridinaldehyd-Analoga ist es bevorzugt, den Ammoniak mit einem Anfangsumsatz-Assay zu messen, da die Reaktion dazu neigt, eher einen Gleichgewichtspunkt zu erreichen, als bis zu ihrer Beendigung abzulaufen.
Auch im obigen Reaktionsschema kann es bevorzugt sein, die reduzierten phosphorylierten Pyridin-Analoga anzuwenden, besonders wenn biologische Proben analysiert werden, die Brenztraubensäure und Lactat-Dehydrogenase enthalten können. Eine mögliche Nebenreaktion zwischen Brenztraubensäure und den reduzierten Cofaktor-Analoga, die durch Lactat-Dehydrogenase katalysiert wird, kann ablaufen, was eine Positivinterferenz verursachen würde, um eine Über-Rückgewinnung des Ammoniakgehalts in der Probe zu ergeben.
Alternativ dazu, könnten die NADH-Cofaktor-Analoga auch in einem Assay für Ammoniak mit den vorhandenden Species von Brenztraubensäure und Lactat-Dehydrogenase zur Anwendung gelangen, wobei aber ein Lactat-Dehydrogenase-Inhibitor, wie Oxamat, zuzugeben wäre, um die obige Reaktion zu inhibieren und die Oxidation der NADH-Cofaktor-Analoga durch Brenztraubensäure zu verhindern. Im obigen Beispiel könnten 3-Pyridinaldehyd-NAD(P)H und Thionicotinamid-NAD(P)H anstatt 3-Acetylpyridin-NAD(P)H angewandt werden, wobei Thionicotinamid-NADPH zu Ammoniak-Messung in klinischen Proben bevorzugt und des Weiteren im Zusammenwirken mit einem Enzym-Regenierungssystem wie dem hierin offenbarten noch bevorzugter ist.
Beispiel 4
Bestimmung der Harnstoff-Konzentration

Im Folgenden ist ein Beispiel einer Reagenszusammensetzung beschrieben und angegeben, die zur Bestimmung der Harnstoff-Konzentration in einer Analysenprobe zur Anwendung gelangen kann. Wiederum gibt es viele Variationen dieses Grundreaktionsschema, das entscheidende Merkmal dieser Formulierung ist aber die Verwendung der NADH/NADPH-Cofaktor-Analoga. Die zur Messung der Harnstoff-Konzentration in einer Analysenprobe angewandte Verfahrensweise beruht auf der folgenden Reaktion:

Reagenszusammensetzung (Konzentrationen der Komponenten, einschließlich Probenvolumen)

Bestandteil	Konzentration	zulässig
Bicin (N,N-Bis[2-hydroxyethyl]-glycin)	51 mmol/L	10–500 mmol/L
EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)	0,051 mmol/L	0–10 mmol/L
Adenosin-5'-diphosphat	2,56 mmol/L	0–10 mmol/L
Rinderserumalbumin	0,051% G/V	0,01–1% G/V
Xylit	15% G/V	0–30% G/V
α-Ketoglutarat	20,5 mmol/L	5–75 mmol/L
Natriumazid	0,026% G/V	0,030,5% G/V
3-Acetalpyridin-NADH	0,4 mmol/L	0,1–1 mmol/L
Urease	25.800 E/L	2.500–50.000 E/L
Glutamat-Dehydrogenase	7.700 E/L	2.000–16.000 E/L
pH-Wert	8,3	6,5–9,3

Im obigen Reaktionsschema ist 3-Acetylpyridin-NADH als Beispiel angegeben. Phosphorylierte Analoga, wie 3-Acetylpyridin-NADPH oder 3-Pyridinaldehyd-NAD(P)H und Thionicotinamid-NAD(P)H, können ebenfalls zur Anwendung gelangen. Die gleiche Diskussion wie bei der ALT-Reaktion bezüglich der Wahl der Wellenlängen, Absorptionsmaxima und -empfindlichkeiten sowie der molaren Cofaktor-Absorptionswerte gilt für diese Reaktion ebenso.
Bezüglich der oben erläuterten Verfahrensweise, werden die Harnstoff-Konzentration oder BUN (Blut-Harnstoffstickstoff, wie er manchmal bezeichnet wird) spektrofotometrisch durch Verfolgung der Oxidation (gewöhnlich des Oxidationsumsatzes) des Cofaktors bestimmt. Obwohl es möglich ist, die Reaktion bis zu ihrer Beendigung ablaufen zu lassen, ist es üblicher, Harnstoff-Assayverfahren gemäß Umsatz bzw. Geschwindigkeit, besonders in biologischen Proben wie von Serum, durchzuführen, und es ist somit ein größerer dynamischer Reaktionsbereich erhältlich. Zur Durchführung der Harnstoff-Bestimmung als Umsatzverfahren werden die Probe mit Reagens vermischt und Absorptionsmessungen bei einer geeigneten Wellenlänge als Funktion der Zeit über ein gegebenes Zeitintervall aufgenommen. Aus der Absorptionsänderung pro Zeiteinheit, die gewöhnlich als ΔA pro Minute ausgedrückt wird, ist die Harnstoff-Konzentration in einer Analysenprobe erhältlich. Gewöhnlich lässt man einen Standard unter den gleichen Bedingungen für die unbekannte Probe ablaufen, und aus der ΔA pro Minute des Standard ist die Harnstoff-Konzentration in der unbekannten Probe berechenbar. Wie bei der Ammoniak-Bestimmung müssen die Umsatzassay-Bedingungen für den Assay so optimiert werden, dass ΔA/min proportional zur Harnstoff-Konzentration ist.
Für einen Harnstoff-Endpunktassay wird die Absorptionsmessung bei einer geeigneten Wellenlänge entweder vor Zugabe der Probe oder unmittelbar nach deren Zugabe vorgenommen, bevor ein signifikanter Cofaktor-Anteil oxidiert wird. Nach einer Zeitdauer, nachdem die Reaktion ihren Endpunkt erreicht hat, werden eine zweite Absorptionsmessung bei der gleichen Wellenlänge vorgenommen und die beiden Absorptionsmessungen voneinander subtrahiert, um ΔA für die Probe zu erhalten. Weist der Proben-Hintergrund eine messbare Absorption bei der für die Absorptionsmessungen gewählten Wellenlänge auf, kann eine getrennte Leerprobe für den Fall notwendig sein, dass die Probe nach der anfänglichen Absorptionsmessung zugegeben wurde. Typischerweise wird ein Standard einer bekannten Harnstoff-Konzentration zur Eichung des Assay verwendet. Die ΔA-Werte der unbekannten Proben werden dann in Harnstoff-Konzentrationen bei Kenntnis des ΔA-Wertes und der Harnstoff-Konzentration des Standard umgerechnet.
Beispiel 5
Bestimmung des Kohlendioxidgehalts
Im Folgenden ist ein Beispiel einer Reagenszusammensetzung beschrieben und angegeben, die zur Bestimmung des Kohlendioxidgehalts in einer Analysenprobe zur Anwendung gelangen kann. Der Kohlendioxidgehalt oder "Gesamt-CO₂", wie jener manchmal bezeichnet wird, stellen ein Maß des Bicarbonat, gelösten Kohlendioxid und des Carbonat in einer Analysenprobe dar. Es gibt auch hier viele Variationen der unten angegebenen Verfahrensweise, das hierbei angegebene entscheidende Merkmal ist aber die Verwendung der NADH-Analoga.

Die zur Messung des Kohlendioxidgehalts in einer Analysenprobe angewandte Verfahrensweise beruht auf der folgenden Reaktion:

Bestandteil	Konzentration	zulässig
Tris(hydroxymethyl)aminomethansulfat)	51 mmol/L	10–500 mmol/L
Magnesiumchlorid	10 mmol/L	2–20 mmol/L
EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)	0,05 mmol/L	0–10 mmol/L
Rinder-γ-globulin	0,05% G/V	0,01–1% G/V
Sorbit	15% G/V	0–30% G/V
Phosphoenolpyruvat	4 mmol/L	1–10 mmol/L
Phosphoenolpyruvat-Carboxylase	3560 E/L	500–10.000 S/L
Malat-Dehydrogenase	30.000 E/L	> 1.000 E/L
Natriumazid	0,05% G/V	0,03–0,5% G/V
3-Pyridinaldehyd-NADH	0,5 mmol/L	0,1–1 mmol/L
pH-Wert	7,0	5,5–9,0

In der obigen Formulierung wurde 3-Pyridinaldehyd-NADH als Cofaktor für die Malat-Dehydrogenase verwendet, wobei allerdings 3-Acetylpyridin-NADH und Thionicotinamid-NADH ebenfalls verwendet werden können. Die reduzierten phosphorylierten Cofaktoren könnten ebenfalls verwendet werden, falls eine Malat-Dehydrogenase zu finden ist, die mit den phosphorylierten Analoga funktionsfähig ist. Weitere zweiwertige Metalle wie Mangan können, gegebenenfalls, anstatt des Magnesiumdichlorids verwendet werden.
Die "Gesamt-Kohlendioxid"-Bestimmung in einer Analysenprobe kann als Endpunkt oder als Umsatzassay mit dem obigen Reaktionsschema durchgeführt werden. Für Umsatzassayverfahren müssen die Reaktionskomponenten so konfiguriert werden, dass die Reaktion als Reaktion erster Ordnung bezüglich des "Gesamt-Kohlendioxid"-Gehalts abläuft. Für den Umsatzassay werden die Absorption bei gegebener Wellenlänge über ein gegebenes Zeitintervall unmittelbar nach Zugabe der Probe aufgenommen und ΔA berechnet, das gewöhnlich pro Minute ausgedrückt wird. Durch Analyse eines Kohlendioxid-Standard unter den gleichen Reaktionsbedingungen verläuft die Reaktion relativ geradlinig, um die Kohlendioxid-Konzentration der unbekannten Probe bei Kenntnis der Konzentration und des ΔA des Standard zu berechnen. Der Endpunktsassay wird in gleicher Weise wie für die oben diskutierte Ammoniak-Bestimmung durchgeführt.
Beispiel 6
2-Komponenten-Flüssig-Gesamt-Kohlendioxid-Reagens
Ein 2-Komponenten-Flüssig-Kohlendioxid-Reagens wurde wie folgt zubereitet:

Komponente 1: Zu ca. 50 mL entionisiertem Wasser werden 3,4 g Tris-Sulfat gegeben, das bis zur Auflösung verrührt wird. 30 g Sorbit werden zusammen mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von ca. 90 mL zugegeben. 233 mg Magnesiumchlorid und 3,7 mg Na₂EDTA × 2H₂O werden zugegeben und das Ganze bis zur Auflösung verrührt. Der pH-Wert wird mit 50%iger NaOH auf 7,0 eingestellt, es werden 100 mg Rinder-γ-globulin und 90 mg Natriumazid zugegeben und bis zur vollständigen Auflösung verrührt und mit entionisiertem Wasser auf 100 mL verdünnt. Zu 66 mL dieser Lösung wird das Folgende gegeben: 4026 Einheiten Malat-Dehydrogenase (Thermus sp.), 488 Einheiten Phosphoenolpyruvat-Carboxylase (aus Mikroorganismus – Toyobo Co. Ltd.) und 50 Einheiten Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase. Die Lösung wird wie folgt aufgeteilt: zu zwei 12,0 mL-Anteilen werden 150 μL wässrige 100 mL/L Glucose-6-phosphat-Lösung und zu einem 30,0 mL-Anteil werden 375 μL der Glucose-6-phosphat-Lösung gegeben. Zu der einen 12,0 mL-Lösung werden 11,0 mg 3-Acetylpyridin-NAD, zu dem anderen 12,0 mL-Anteil werden 11,3 mg Thionicotinamid-NAD und zum 30,0 mL-Anteil werden 25,1 mg 3-Pyridinaldehyd-NAD gegeben. Zu einem dritten 12,0 mL-Anteil werden 10,9 mg NADH zum Vergleich gegeben. Die 3-Acetylpyridin-NAD- und 3-Pyridinaldehyd-NAD-Lösungen wurden fest verkappt und bei 37°C gehalten, bis die Absorption konstant bei 340 mm war – ca. 12 h für das Acetyl-Analog und 24 h für das Aldehyd-Analog.
Komponente 2: Zu ca. 5 mL entionisiertem Wasser wurden 94,6 mg Monocyclohexylammoniumsalz von Phosphoenolpyruvat gegeben. Der pH-Wert wurde mit 50%igem Natriumhydroxid auf 7,0 eingestellt.

Die vier Komponente 1-Lösungen wurden in 4 mL-Polyethylen-Fläschchen überführt und bei 37°C nach Bestimmung der vorhandenen Cofaktormenge gehalten. Dies erfolgte durch Vermischen von 100 μL Komponente 1 mit 33 μL Komponente 2 und durch Zugabe von 110 μL entionisiertem Wasser und 2 μL 1 mol/L-Natriumcarbonat-Probe. Die Cofaktormenge, ausgedrückt als Absorptionsänderung (ΔA) durch die vollständige Oxidation des Cofaktors, wurde durch Subtraktion der Absorption der Lösung 12 min nach Probenzugabe von der Absorption einer Bezugsküvette 4,5 s nach Zugabe einer entionisierten Wasser-Probe berechnet.

Die Ergebnisse der 37°C-Inkubation sind die folgenden: ΔA bei 340 nm, außer für Thionicotinamid-NADH-ΔA bei 405 nm

Tage bei 37°C	0	7	15	23	29	30	36
3-Pyridinaldehyd-NADH	1,66	1,59	1,62	1,41	1,34	-	1,34
3-Acetylpyridin-NADH	1,16	0,93	0,77	0,55		0,30
Thionicotinamid-NADH	2,03	0,96	0,45		-	-
NADH	1,22	0,09	-	-	-	-

Wie aus den Daten ersichtlich, bleiben ca. 7% NADH nach 7 Tagen bei 37°C zurück. Im Vergleich dazu, bleiben immer noch 96% 3-Pyridinaldehyd-NADH, 80% 3-Acetylpyridin-NADH und 47% Thionicotinamid-NADH während der gleichen Zeitdauer zurück. Sogar nach 36 Tagen sind immer noch 81% 3-Pyridinaldehyd-NADH in der Lösung verblieben.

Die Leistungsdaten der NADH-Cofaktor-Analoga zur Bestimmung des Kohlendioxidgehalts in einer Serie wässriger Natriumcarbonat-Proben seien wie folgt angegeben:

	ΔA bei 340 nm, außer für Thionicotinamid-NADH bei 405 nm (Messintervall = 4,5 s nach Probenzugabe zu 975 μL)
Na₂CO₃ mmol/L	3-Pyridin-aldehyd-NADH	3-Acetyl-Pyridin-NADH	Thionicotinamid-NADH
10	0,281	0,371	0,306
20	0,672	0,631	0,595
30	1,066	0,896	0,949
40	1,436	1,158	1,268

Die Daten belegen eine lineare Beziehung zwischen der Absorptionsänderung ΔA und der Natriumcarbonat-Konzentration.
Beispiel 7
1-Komponente-Flüssig-Gesamt-Kohlendioxid-Reagens
Zu ca. 50 mL entionisiertem Wasser werden 3,4 g Tris-Sulfat gegeben. 30 g Sorbit werden zugegeben und dann das Volumen auf ca. 90 mL mit entionisiertem Wasser gebracht. 190,4 mg Magnesiumchlorid und 3,7 mg Na₂EDTA × 2H₂O werden zugegeben und zur Auflösung verrührt. Der pH-Wert wird auf 6,9 eingestellt, und es werden 100 mg Rinder-γ-globulin und 90 mg Natriumazid zugegeben und nach Auflösung und Einstellung des pH-Wertes auf 7,0 das Ganze auf 100 mL mit entionisiertem Wasser verdünnt.
Zu 10 mL Lösung wurden 10,7 mg 3-Pyridinaldehyd-NAD, 4,6 mg Glucose-6-phosphat (Natriumsalz), 5 Einheiten Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase gegeben und die Lösung bei 37°C 24 h lang inkubiert. 16,6 mg Natriumphosphoenolpyruvat-Hydrat und dann 610 Einheiten Malat-Dehydrogenase und 74 Einheiten Phosphoenolpyruvat-Carboxylase wurden zugegeben.
Das Reagens wurde zur Bestimmung der Gesamt-Kohlendioxid-Konzentration in einem Satz wässriger Natriumcarbonat-Proben durch Zugabe von 2,0 μL Probe auf 140 μL Reagens und 93 μL entionisiertem Wasser verwendet. Die Absorptionsmessungen wurden bei 340 nm durchgeführt. Eine anfängliche Absorptionsmessung erfolgte 4,5 s nach Zugabe der Probe und von entionisiertem Wasser, und es wurde eine zweite Absorptionsmessung ca. 8 min später nach Beendigung der Reaktion aufgenommen. Die zweite Absorptionsmessung wurde von der anfänglichen Absorptionsmessung subtrahiert, um ΔA durch den Metabolismus des Carbonats in der Probe zu bestimmen. Eine Leerprobe zur Korrektur der ΔAbsorption bezüglich gelöstem Kohlendioxid im entionisierten Wasser wurde durchgeführt. Die Ergebnisse seien wie folgt angegeben:

Natriumcarbonat (mmol/L) ΔA bei 340 nm

10 0,389

20 0,842

30 1,188

40 1,513
Wie beim obigen 2-Komponenten-Kohlendioxid-Reagens besteht eine lineare Beziehung zwischen der Absorptionsänderung ΔA und der Natriumcarbonat-Konzentration.
Eines der inhärenten Stabilitätsprobleme bei Kohlendioxid-Reagenzien, besonders für 1-Komponente-Reagenzien, beruht auf der Absorption von Umgebungskohlendioxid und dem anschließenden Metabolismus gemäß der obigen Serie Enzymgekoppelter Reaktionen. Dies führt zum Verfall des reduzierten Pyridinnucleotid-Cofaktors und zum Verlust der Funktionsfähigkeit des Reagens zur Messung des Kohlendioxids. Dies stellt ganz besonders ein Problem dar, wenn die Reagenzien unverkappt über verlängerte Zeiträume stehen gelassen werden. Zur Verbesserung der Cofaktor-Stabilität kann ein Pyridinnucleotid-Regenerierungssystem zugegeben werden, das den oxidierten Cofaktor zurück in seine reduzierte Form reduziert. Es gibt viele Regenerierungssysteme, die diese Funktion erfüllen. Im Allgemeinen stellen eine Dehydrogenase und ein reduziertes Substrat mit der Befähigung, vom oxidierten Cofaktor oxidiert zu werden, die Hauptbedingungen dar. Im Fall der NAD-Analoga müssen die Analoga allerdings mit der Dehydrogenase funktionsfähig sein.
Unten sind Daten angegeben, die mit dem obigen Reagens mit und ohne das Vorliegen eines Nucleotid-Regenerierungssystems erhalten wurden. Das eingesetzte Nucleotid-Regenerierungssystem beruhte auf Glucose-6-phosphat- Dehydrogenase (mikrobiell) und Glucose-6-phosphat. Im obigen Reagens wurde beim Nucleotid-Regenerierungssystem die Glucose-6-phosphat-Konzentration auf 20 mmol/L erhöht. Die Kohlendioxid-Reagenzien wurden in 4 mL Polyethylen-Röhrchen gegeben und bei Raumtemperatur (ca. 22°C) ohne Verkappung der Röhrchen stehen gelassen. Zu verschiedenen Zeitintervallen wurden die Reagenzien bezüglich der Menge an verbliebenem reduzierten 3-Pyridinaldehyd-NADH mit dem obigen Protokoll getestet, wobei die Absorptionsänderung bei 340 nm berechnet wurde, nachdem aller verbliebener reduzierter Nucleotid-Cofaktor nach Zugabe einer 0,1 oder 1 mol/L-Natriumcarbonat-Probe metabolisiert worden war.
ΔA bei 340 nm Stunden oder Tage des Kohlendioxid-Reagens, aufbewahrt bei ca. 22°C in unverkappten 4 mL-Röhrchen

Kohlendioxid-Reagens Zeit = 0 12 h 24 h 7 Tage 14 Tage

a. Kein Nucleotid-Regenerierungssystem 1,12 0,74 0,50

b. Plus Nucleotid-Regenerierungssystem 1,66 1,75 1,80
Ohne das Nucleotid-Regenerierungssystem sind mehr als 50% 3-Pyridinaldehyd-NADH nach 24 h metabolisiert worden. Mit dem Nucleotid-Regenerierungssystem ist allerdings eigentlich alles 3-Pyridinaldehyd-NADH sogar nach 14 Tagen zurückgewonnen worden. Der "scheinbare" Anstieg der Nucleotid-Konzentration im Zeitablauf in den unverkappten Röhrchen mit dem Nucleotid-Regenerierungssystem beruht auf der Verdampfung und anschließenden "Konzentrierung" des Reagens und des Nucleotid.
Mit dem Pyridinnucleotid-Regenerierungssystem hat es sich auch erwiesen, dass die Stabilität reduzierter Pyridinnucleotid-Cofaktor-Analoga in weiteren Reagenzien verlängert wurde. Reagenzien mit NADH/NADPH-Analoga, bei denen Verbesserungen der Analog-Stabilität beobachtet wurden, ergaben sich mit: Ammoniak, Harnstoff oder BUN, ALT und mit AST. Das Nucleotid-Regenierungssystem erwies sich als besonders geeignet mit den ALT- und AST-Reagenzien, da es nahezu unmöglich ist, Lactat-Dehydrogenase und Malat-Dehydrogenase zu erhalten, die vollständig ohne Kontamination durch ALT und AST vorliegen.
Beispiel 8
1-Komponente-Flüssig-Ammoniak-Reagenz
Zu ca. 100 mL entionisiertem Wasser werden 7,3 g Bicin gegeben. Nach deren Auflösung wird der pH-Wert auf ca. 8,0 mit Natriumhydroxid-Pellets eingestellt. Der Reihe nach werden unter Auflösung zugegeben: 5,6 mg Na₂EDTA × 2H₂O, 376 mg Adenosin-5'-diphosphat (Kaliumsalz-Dihydrat), 45 g Xylit, 150 mg Rinderserumalbumin und 135 mg Natriumazid. Das Volumen wird auf ca. 145 mL mit entionisiertem Wasser gebracht und der pH-Wert wird auf 8,3 mit 6 mol/L Natriumhydroxid eingestellt, worauf das Ganze auf 150 mL mit entionisiertem Wasser verdünnt wird. Zu drei 10 mL-Anteilen dieser Lösung wurde das Folgende gegeben:

Lösung 1: 4,2 mg 3-Pyridinaldehyd-NAD und 1,77 mg Glucose-6-phosphat (Natriumsalz)
Lösung 2: 5,1 mg 3-Acetylpyridin-NAD und 1,94 mg Glucose-6-phosphat (Natriumsalz)
Lösung 3: 3,4 mg Thionicotinamid-NAD und 1,26 mg Glucose-6-phosphat (Natriumsalz)

5 Einheiten Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase wurden zu jeder Lösung gegeben und die Lösung bei 37°C inkubiert. Nach 6, 22 bzw. 36 h wurden die Lösungen 1, 2 bzw. 3 aus der Inkubation genommen und zu jeder Lösung 76 mg Dinatrium-α-ketoglutarat gegeben. Zu den Lösungen 1, 2 bzw. 3 wurden 20, 75 bzw. 100 Einheiten/mL-Glutamat-Dehydrogenase (Rinderleber) gegeben. Die Lösungen wurden in einem Ammoniak-Assay mit 100 μL Reagenz und 20 bzw. 30 μL Probe für die Lösungen 3 und 2 bzw. 1 eingesetzt. Entionisiertes Wasser wurde mit den Proben zugegeben, um ein Gesamtvolumen von 150 μL für jeden Assay zu ergeben. Die Assays wurden bei 37°C durchgeführt. Die angewandten Wellenlängen waren 340 nm für 3-Pyridinaldehyd-NADH und 3-Acetylpyridin-NADH sowie 405 nm für Thionicotinamid-NADH. Zur Berechnung von ΔA für jede Probe wurde die Absorptionsmessung 600 s nach Zugabe der Probe und von entionisiertem Wasser von der Absorptionsmessung 4,5 s nach Zugabe der Probe mit dem entionisierten Wasser subtrahiert. Die Ergebnisse seien wie folgt angegeben:

Ammoniak	3-Pyridinaldehyd-NADH	3-Acetyl-Pyridin-NADH	Thionicotinamid-NADH
(μmol/L)	ΔA bei 340 nm	ΔA bei 340 nm	ΔA bei 405 nm
50	0,029	0,033	0,050
100	0,063	0,055	0,093
200	0,124	0,093	0,166
300	0,199	0,182	0,280
400	0,259	0,229	0,363
500	0,339	0,315	0,426
600	0,392	0,368	0,537

Die Daten zeigen eine lineare Beziehung zwischen der Absorptionsänderung ΔA und der Ammoniak-Konzentration. Dies belegt, dass Ammoniak mit den obigen NADH-Analoga quantitativ bestimmt werden kann.
Beispiel 9
1-Komponente-Flüssig-Harnstoff-Reagens
In 125 mL entionisiertem Wasser wurden 3,26 g Bicin gelöst und der pH-Wert auf ca. 8,3 mit Natriumhydroxid-Pellets eingestellt. Es wurden der Reihe nach unter Auflösung zugegeben: 7,4 mg Na₂EDTA × 2H₂O, 470 mg Adenosin-5'-Diphosphat (Kaliumsalz-Dihydrat), 60 g Xylit, worauf das Ganze auf ca. 190 mL mit entionisiertem Wasser verdünnt wurde. Es wurden 200 mg Rinderserumalbumin und 100 mg Natriumazid zugegeben, worauf das Ganze nach Einstellung des pH-Wertes auf 8,5 auf 200 mL mit entionisiertem Wasser verdünnt wurde.
Zu drei 10 mL-Anteilen wurde das Folgende gegeben:

Lösung 1: 5,5 mg 3-Pyridinaldehyd-NAD und 2,30 mg Glucose-6-phosphat (Natriumsalz)
Lösung 2: 6,6 mg 3-Acetylpyridin-NAD und 2,52 mg Glucose-6-phosphat (Natriumsalz)
Lösung 3: 4,4 mg Thionicotinamid-NAD und 1,64 mg Glucose-6-phosphat (Natriumsalz)

5 Einheiten Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase wurden zu jeder Lösung gegeben und jede Lösung bei 37°C wie folgt inkubiert: Lösung 1: 6 h, Lösung 2: 36 h, Lösung 3: 44 h. 76 mg Dinatrium-α-ketoglutarat und 500 Einheiten Urease wurden zu jeder Lösung gegeben, worauf Glutamat-Dehydrogenase wie folgt zugegeben wurde: Lösung 1: 30 Einheiten/mL, Lösung 2: 15 Einheiten/mL und Lösung 3: 5 Einheiten/mL. Die wässrigen Harnstoff-Proben wurden durch Zugabe von 2 μL Probe und 92 μL entionisiertem Wasser zu 100 μL Lösung 1 oder 2 und zu 200 μL Lösung 3 gemessen. Die Lösungen 1 und 2 wurden als Umsatzassay über ein Zeitintervall von 3,75 min kurz nach Zugabe der Probe durchgeführt, während die Lösung 3 als 75 s-Assay durchgeführt wurde. Die Ergebnisse seien wie folgt angegeben:

Harnstoff	3-Pyridin-aldehyd-NADH	3-Acetyl-Pyridin-NADH	Thionicotinamid-NADH
(mmol/L)	ΔA/min bei 340 nm	ΔA/min bei 340 nm	ΔA/75 s bei 405 nm
5	0,0039	0,0032	0,233
10	0,0092	0,0068	0,460
20	0,0191	0,0140	0,875
30	0,0275	0,0206	1,532
40	0,0382	0,0282	1,887
50	0,0481	0,0355	-

Die Daten zeigen eine lineare Beziehung zwischen der Absorptionsänderung ΔA und der Harnstoff-Konzentration. Die Daten belegen, dass Harnstoff mit den obigen NADH-Analoga quantitativ bestimmt werden kann.
Beispiel 10
1-Komponente-AST-Flussigreagens
Zu ca. 60 mL entionisiertem Wasser wurden unter Auflösung gegeben: 1,45 g Tris, 5,58 g L-Natriumaspartat, 30 g Sorbit, 90 mg Natriumazid und 100 mg Rinder-γ-globulin. Der pH-Wert wurde auf 7,80 mit 6 N HCl eingestellt. Zu 10 mL Reagens wurden 5,6 mg 3-Acetylpyridin-NAD, 14,1 mg Glucose-6-Phosphat (Natriumsalz) und ca. 1 Einheit Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase gegeben. Nach 12 h Inkubation bei 37°C wurden 34,2 mg Dinatrium-α-ketoglutarat, 4,1 mg Na₂EDTA × 2H₂O und 500 Einheiten Malat-Dehydrogenase gegeben.
Eine Serie wässriger AST-Proben wurde durchgeführt und mit einem handelsüblichen IFCC-AST-Reagens (ohne Pyridoxalphosphat) verglichen. Jedes Reagens wurde mit einem 1:12(Probe:Reagensvolumen)-Verhältnis angewandt und die Absorptionsmessungen bei 37°C bei 340 nm, bei Anfangsmessungen 50 s nach Probenzugabe und mit Intervallen von 25 s 10 min lang durchgeführt. Ein lineares Suchprogramm wurde angewandt, um den Linearanteil der Absorptionsmessungen für jede Probe zu ermitteln. Die Ergebnisse seien wie folgt angegeben:

Probenverdünnung E/L: 3-Acetyl-pyridin-NADH E/L: Handelsübliches IFCC-AST-Reagens

0,01 9,3 12

0,1 93 96

0,2 192 185

0,4 370 378

0,7 641 665
Die Daten belegen, dass 3-Acetylpyridin-NADH im Wesentlichen die gleichen Ergebnisse wie das handelsübliche Reagens mit NADH ergibt. Somit kann 3-Acetylpyridin-NADH zur quantitativen Bestimmung der AST-Aktivität eingesetzt werden.
Beispiel 11
1-Komponente-ALT-Flüssigreagens
Zu ca. 30 mL entionisiertem Wasser wurden unter Auflösung gegeben: 1,82 g Tris, 6,42 g L-Alanin, 428 mg α-Ketoglutarat, 90 mg Natriumazid und 100 mg Rinderserumalbumin. Die Lösung wurde auf ca. 95 mL mit entionisiertem Wasser verdünnt, worauf das Ganze nach Einstellung des pH-Wertes auf 7,5 mit 6 N HCl auf 100 mL mit entionisiertem Wasser verdünnt wurde.
Zu 10 mL Reagens wurden 5,7 mg 3-Acetylpyridin-NAD, 2,17 mg Glucose-6-phosphat (Natriumsalz) und ca. 200 Einheiten Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase gegeben. Die Lösung wurde bei 37°C ca. 36 h lang inkubiert, worauf nach Abkühlung auf Raumtemperatur 50 Einheiten Lactat-Dehydrogenase (Staphylococcus sp.) zugegeben wurden. Eine Serie wässriger ALT-Proben wurde wie oben für AST sowie auch mit dem handelsüblichen IFCC-Reagens (ohne Pyridoxalphosphat) durchgeführt. Die Ergebnisse seien wie folgt angegeben:

Probenverdünnung E/L: 3-Acetylpyridin-NADH E/L: Handelsübliches IFCC-AST-Reagens

0,01 11 7

0,10 92 90

0,20 183 169

0,40 359 369

0,70 607 664 (× 2 Verdünnung)
Die Daten belegen, dass 3-Acetylpyridin-NADH im Wesentlichen die gleichen Ergebnisse wie das handelsübliche Reagens mit NADH ergibt. Somit kann 3-Acetylpyridin-NADH zur quantitativen Bestimmung der ALT-Aktivität verwendet werden.
Beispiel 12
1-Komponente-Flüssig-Triglycerid-Reagens
Die gekoppelte Enzym-Reaktion zur Messung von Triglyceriden läuft wie folgt ab:
Zu ca. 80 mL entionisiertem Wasser wurden der Reihe nach unter Auflösung gegeben: 2,60 g (N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure])natriumsalz, 182 mg Adenosin-5'- triphosphatdinatriumsalz-Trihydrat, 203 mg Magnesiumchlorid-Hexahydrat, 37 mg Na₂EDTA × 2H₂O, 41 mg Cholinsäure, 50 mg Rinderserumalbumin und 90 mg Natriumazid. Der pH-Wert wurde auf 7,5 mit 6 N HCl eingestellt und das Volumen wurde auf 100 mL mit entionisiertem Wasser gestellt. Nach Vermischung wurden drei 10 mL-Anteile entnommen und mit A, B und C markiert. Zu diesen Lösungen wurde das Folgende gegeben:

Lösung A: 2,8 mg 3-Pyridinaldehyd-NAD, 1,18 mg Glucose-6-phosphat (Natriumsalz); Lösung B: 3,4 mg 3-Acetylpyridin-NAD, 1,26 mg Glucose-6-phosphat (Natriumsalz); Lösung C: 1,9 mg Thionicotinamid-NAD, 0,70 mg Glucose-6-phosphat (Natriumsalz)

Nach Zugabe von ca. 1 Einheit Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase wurden die Lösungen A bzw. B bei 37°C 36 bzw. 18 h lang und die Lösung C bei Raumtemperatur (22°C) 24 h lang inkubiert. Zu jeder Lösung wurden 46,6 mg Phosphoenolpyruvattri(monoclyclohexylammonium)salz, 30 Einheiten Glycerno-Kinase, 100 Einheiten Lipoprotein-Lipase und 30 Einheiten Pyruvat-Kinase gegeben. 1000 Einheiten Lactat-Dehydrogenase wurden zur Lösung A und 100 Einheiten wurden zu den Lösungen B und C gegeben. Die Triglycerid-Assayverfahren wurden bei 37°C durchgeführt. Bei den Lösungen A und B wurden 3 μL Probe und 10 μL entionisiertes Wasser zu 150 μL Reagens gegeben. Die Absorptionsmessungen bei 340 nm wurden 4,5 s nach Probenzugabe und erneut nach 12,1 und 6,25 min für die Lösungen A und B aufgenommen. Für die Lösung C wurden 2 μl Probe und 10 μL entionisiertes Wasser zu 200 μL Reagens gegeben und die Absorptionsmessungen bei 405 nm 4,5 s nach Probenzugabe und nach 10 min aufgenommen. Im Folgenden sind die Ergebnisse mit einer Serie wässriger Dicaprin-Standards angegeben:

Dicaprin	3-Pyridinaldehyd-NADH	3-Acetylpyridin-NADH	Thionicotinamid-NADH
(mg/dL)	ΔA/12,1 min, 340 nm	ΔA/6,25 min, 340 nm	ΔA/10 min, 405 nm
45	0,046	0,065	0,043
90	0,090	0,131	0,085
180	0,180	0,277	0,176
319	0,300	0,461	0,300
455	0,412	0,669	0,425

Die Daten belegen eine lineare Beziehung zwischen der Absorptionsänderung ΔA und der Dicaprin-Konzentration. Somit können Triglyceride mit den obigen NADH-Analoga quantitativ bestimmt werden.
Beispiel 13
1-Röhrchen-Flüssig-Brenztraubensäure-Reagens
Zu ca. 40 mL entionisiertem Wasser wurden unter Auflösung 1,3 g (N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure])natriumsalz, 50 mg Rinderserumalbumin und 40 mg Natriumazid gegeben. Der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt und die Lösung wurde auf 50 mL mit entionisiertem Wasser verdünnt. Zu 10 mL-Anteilen wurde das Folgende gegeben:

Lösung A: 2,2 mg Thionicotinamid-NAD und 0,81 mg Glucose-6-phosphat (Natriumsalz); Lösung B: 3,9 mg Pyridinaldehyd-NAD und 1,57 mg Glucose-6-Phosphat (Natriumsalz);
Lösung C: 3,5 mg Acetylpyridin-NAD und 1,34 mg Glucose-6-phosphat (Natriumsalz).

Nach Zugabe von ca. 1 Einheit Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase zu jeder Lösung wurde jede Lösung wie folgt inkubiert: Lösung A – 48 h bei Raumtemperatur (ca. 22°C); Lösung B – 48 h bei 37°C und Lösung C – 24 h bei 37°C.

Kaninchenmuskel-Lactat-Dehydrogenase wurde zu jeder Lösung gegeben, um die folgenden Aktivitäten zu ergeben: Lösung A – 7,5 E/mL; Lösung B – 100 E/mL und Lösung C – 6 E/mL. Eine Serie wässriger Natriumpyruvat-Proben wurde mit den 3 Lösungen analysiert. Für Lösung A wurden 5 μL Probe, 15 μL entionisiertes Wasser und 150 μL Reagens, für Lösung B 10 μL Probe, 40 μL entionisiertes Wasser und 100 μL Reagens sowie für Lösung C 10 μL Probe, 15 μL entionisiertes Wasser und 150 μL Reagens verwendet. Die Lösungen A und C wurden als Endpunkt-Assayverfahren durchgeführt, wobei die End-Absorptionsmessung von der anfänglichen Absorptionsmessung 4,5 s nach Zugabe der Probe und von entionisiertem Wasser subtrahiert wurde. Die Lösung B wurde als Umsatz-Assay durchgeführt. Alle Assayverfahren wurden bei 37°C durchgeführt. Die Ergebnisse seien wie folgt angegeben:

Pyruvat	3-Pyridinaldehyd-NADH	3-Acetylpyridin-NADH	Thionicotinamid-NADH
(mmol/L)	ΔA/10 min bei 340 nm	ΔA/5,8 min bei 340 nm	ΔA/13,6 min bei 405 nm
0,5	0,074	0,100	0,086
1,0	0,145	0,206	0,187
2,0	0,311	0,416	0,384
3,0	0,457	0,619	0,580
4,0	0,594	0,805	0,751
5,0	0,743	1,004	0,915

Die Daten belegen eine lineare Beziehung zwischen der Absorptionsänderung ΔA und der Pyruvat-Konzentration. Somit kann Brenztraubensäure mit den obigen NADH-Analoga quantitativ bestimmt werden.
Beispiel 14
Kreatin-Kinase-Verfahren
Kreatin-Kinase kann mit dem folgenden Verfahren mit NADH-Analoga bestimmt werden:
In diesem gekoppelten Enzym-Verfahren kann die Aktivität der Kreatin-Kinase durch den Oxidationsumsatz des NADH-Analog in Gegenwart eines zweiwertigen Metalls wie von Magnesium bestimmt werden. Ein Kit für diese Messung würde z. B. Thionicotinamid-NADH, 3-Acetylpyridin-NADH oder 3-Pyridinaldehyd-NADH, einen Puffer, Kreatin, Pyruvat-Kinase, Lactat-Dehydrogenase, Adencsin-5'-triphosphat und Phosphoenolpyruvat enthalten.
Beispiel 15
ATP(Adenosin-5'-triphosphat)-Verfahren
AtP kann mit dem folgenden gekoppelten Enzym-Verfahren mit NADH-Analog bestimmt werden:
In diesem gekoppelten Enzym-Assay, der in der Gegenwart eines zweiwertigen Metalls wie von Magnesium durchgeführt wird, ist die Menge des mit 1,3-Diphosphoglycerat oxidiertem NADH-Analog gleich der ATP-Menge in der Probe. Ein Kit für diese Messung würde z. B. Thionicotinamid-NADH, Thionicotinamid-NADPH, 3-Acetylpyridin-NADH, 3-Acetylpyridin-NADPH, 3-Pyridinaldehyd-NADH oder 3-Pyridinaldehyd-NADPH, einen Puffer, 3-Phosphoglycerat, Phosphoglyceryl-Phosphokinase und Glyceraldehydphosphat-Dehydrogenase enthalten.
Beispiel 16
Bestimmung der 2,3-Diphosphoglycerylsäure
Das folgende Enzym-gekoppelte Verfahren kann zur Messung der 2,3-Diphosphoglycerylsäure angewandt werden:
In diesem Verfahren, das in der Gegenwart eines zweiwertigen Metalls wie von Magnesium durchgeführt wird, ist die Menge des oxidierten NADH-Analog gleich der Menge des 2,3-Diphosphoglycerat in der Probe. Ein für diese Bestimmung geeigneter Kit würde z. B. Thionicotinamid-NADH, Thionicotinamid-NADPH, 3-Acetylpyridin-NADH, 3-Acetylpyridin-NADPH, 3-Pyridinaldehyd-NADH oder 3-Pyridinaldehyd-NADPH, einem Puffer, Adenosin-5'-triphosphat, Phosphoglycerat-Mutase, 2-Phosphoglycolsäure, Phosphoglyceryl-Phosphokinase und Glyceraldehydphosphat-Dehydrogenase enthalten.
Beispiel 17
Sorbit-Dehydrogenase-Bestimmung
Die Sorbit-Dehydrogenaseaktivität kann mit dem folgenden Verfahren bestimmt werden:
In diesem Verfahren ist die Sorbit-Dehydrogenaseaktivität gleich dem Oxidationsumsatz des NADH-Analog. Ein für diese Bestimmung geeigneter Kit würde z. B. Thionicotinamid-NADH, 3-Acetylpyridin-NADH oder 3-Pyridinaldehyd-NADH, einen Puffer und Fructose enthalten.
Beispiel 18
Lactat-Dehydrogenase-Bestimmung
Die Lactat-Dehydrogenaseaktivität kann mit dem folgenden Verfahren bestimmt werden:
In diesem Verfahren ist die Lactat-Dehydrogenaseaktivität gleich dem Oxidationsumsatz des NADH-Analog. Ein für diese Bestimmung geeigneter Kit würde z. B. 3-Acetylpyridin-NADH, 3-Pyridinaldehyd-NADH oder Thionicotinamid-NADH, einen Puffer und Brenztraubensäure enthalten.
Beispiel 19
α-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase-Bestimmung
Die α-Hydroxybutyrat-Dehydrogenaseaktivität kann mit dem folgenden Verfahren bestimmt werden:
In diesem Verfahren ist die α-Hydroxybutyrat-Dehydrogenaseaktivität gleich dem Oxidationsumsatz des NADH-Analog. Ein für diese Bestimmung geeigneter Kit würde z. B. 3-Acetylpyridin-NADH, 3-Pyridinaldehyd-NADH oder Thionicotinamid-NADH, einen Puffer und α-Hydroxybutyrat enthalten.
Beispiel 20
Verfahren zur Messung von Salicylaten
Das folgende Verfahren kann zur Messung der Salicylate in Proben angewandt werden:
In diesem Verfahren ist die Salicylatmenge gleich der Menge des oxidierten NADH-Analog. Ein für diese Bestimmung geeigneter Kit würde z. B. 3-Acetylpyridin-NADH, 3-Pyridinaldehyd-NADH oder Thionicotinamid-NADH, einen Puffer und Salicylat-Dehydrogenase enthalten.
Beispiel 21
Verfahren zur Messung der 5'-Nucleotidaseaktivität
Das folgende Verfahren kann zur Bestimmung der 5'-Nucleotidaseaktivität angewandt werden:
In diesem Verfahren ist die 5'-Nucleotidaseaktivität gleich dem Oxidationsumsatz des NADH-Analog. Ein für diese Bestimmung geeigneter Kit würde z. B. Thionicotinamid-NADH, Thionicotinamid-NADPH, 3-Pyridinaldehyd-NADPH, einen Puffer, Adenosin-5'-monophosphat, Adenosin-Deaminase, α-Ketoglutarat und Glutamat-Dehydrogenase enthalten.

Claims

Verwendung eines NAD(P)H-Analogs der Formel (I):
worin R₁ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -C(O)H, -C(O)CH₃, -C(O)CH(CH₃)₂, -C(O)CH₂CH₃, -C(O)CH₂CH₂CH₃, -C(O)C₆H₅, -C(O)NHOH, -C(O)NHNH₂ und -C(O)CH₂Hal, R₂ ein Adenin ist, X ist OH oder H₂PO₄ und jedes T ist O, als Ersatz für NAD(P)H-Kofaktor in einem diagnostischen Testkit zur Messung einer enzymatischen Aktivität oder eines Analyten in einer Probe auf der Basis einer enzymatischen Reaktion oder einer Reihe enzymatischer Reaktionen, die die Verwendung des NAD(P)H-Kofaktors involvieren und umfassend den Kofaktor, einen Puffer und mindestens ein Enzym oder Reagens, involviert in der enzymatischen Reaktion oder Reihe enzymatischer Reaktionen, zur Verbesserung der Stabilität des diagnostischen Testkits im Vergleich zu Testkits, die mit NADH oder NADPH hergestellt werden.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das NAD(P)H-Analog ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 3-Pyridinaldehyd-NAD(P)H und 3-Acetylpyridin-NAD(P)H.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Kit weiterhin ein Nukleotid-Regenerierungssystem umfaßt.
Diagnostisches Testkit zur Messung einer enzymatischen Aktivität oder eines Analyten in einer Probe auf der Basis einer enzymatischen Reaktion oder einer Reihe von enzymatischen Reaktionen, die die Verwendung von NAD(P)H-Kofaktor involvieren und umfassend den Kofaktor, einen Puffer und mindestens ein Enzym oder Reagens, die an der enzymatischen Reaktion oder Reihe von enzymatischen Reaktionen involviert sind, wobei das diagnostische Testkit als Ersatz für den NAD(P)H-Kofaktor, ein NAD(P)H-Analog der Formel (I) enthält:
worin R₁ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -C(O)H, -C(0)CH₃, -C(O)CH(CH₃)₂, -C(O)CH₂CH₃, -C(O)CH₂CH₂CH₃, -C(O)C₆H₅, -C(O)NHOH, -C(O)NHNH₂ und -C(O)CH₂Hal, R₂ ein Adenin ist, X ist OH oder H₂PO₄ und jedes T ist O.
Diagnostisches Testkit gemäß Anspruch 4, wobei das NAD(P)H-Analog ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 3-Pyridinaldehyd-NAD(P)H und 3-Acetylpyridin-NAD(P)H.
Diagnostisches Testkit gemäß Anspruch 3 oder 4, wobei das Kit weiterhin ein Nukleotid-Regenerierungssystem umfaßt.
Diagnostisches Testkit zur Messung von Kohlendioxid in einer Probe auf der Basis einer Reihe enzymatischer Reaktionen, die die Verwendung von NADH-Kofaktor involvieren, wobei das diagnostische Testkit einen Puffer, Phosphoenolpyruvat, Malatdehydrogenase, ein divalentes Metallion, Phosphoenolpyruvatcarboxylase und als Ersatz für den NADH-Kofaktor ein NADH-Analog umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Pyridinaldehyd-NADH, 3-Acetylpyridin-NADH und 3-Thionicotinamid-NADH.
Diagnostisches Testkit zur Messung von Ammoniak in einer Probe auf der Basis einer enzymatischen Reaktion, die die Verwendung von NAD(P)H-Kofaktor involviert, wobei das diagnostische Testkit einen Puffer, Alpha-Ketoglutarat, Glutamatdehydrogenase und als Ersatz für den NAD(P)H-Kofaktor ein NAD(P)H-Analog umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Pyridinaldehyd-NAD(P)H, 3-Acetylpyridin-NAD(P)H und 3-Thionicotinamid-NAD(P)H.
Diagnostisches Testkit zur Messung von Harnstoff in einer Probe auf der Basis einer Reihe enzymatischer Reaktionen, die die Verwendung von NAD(P)H-Kofaktor involvieren, wobei das diagnostische Testkit einen Puffer, Alpha-Ketoglutarat, Glutamatdehydrogenase, Urease und als Ersatz für den NAD(P)H-Kofaktor ein NAD(P)H-Analog umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Pyridinaldehyd-NAD(P)H, 3-Acetylpyridin-NAD(P)H und 3-Thionicotinamid-NAD(P)H.
Diagnostisches Testkit zur Messung von Brenztraubensäure in einer Probe auf der Basis einer enzymatischen Reaktion, die die Verwendung von NADH-Kofaktor involviert, wobei das diagnostische Testkit einen Puffer, Lactatdehydrogenase und als Ersatz für den NADH-Kofaktor ein NADH-Analog umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Pyridinaldehyd-NADH, 3-Acetylpyridin-NADH und 3-Thionicotinamid-NADH.
Diagnostisches Testkit zur Messung von Alaninaminotransferase in einer Probe auf der Basis einer Reihe enzymatischer Reaktionen, die die Verwendung von NADH-Kofaktor involvieren, wobei das diagnostische Testkit einen Puffer, L-Alanin, Alpha-Ketoglutarat, Lactatdehydrogenase und als Ersatz für den NADH-Kofaktor ein NADH-Analog umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Pyridinaldehyd-NADH und 3-Acetylpyridin-NADH.
Diagnostisches Testkit zur Messung von Aspartataminotransferase in einer Probe auf der Basis einer Reihe enzymatischer Reaktionen, die die Verwendung von NADH-Kofaktor involvieren, wobei das diagnostische Testkit einen Puffer, L-Aspartat, Alpha-Ketoglutarat, Malatdehydrogenase und als Ersatz für den NADH-Kofaktor ein NADH-Analog umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Pyridinaldehyd-NADH und 3-Acetylpyridin-NADH.
Diagnostisches Testkit gemäß Anspruch 12, weiterhin umfassend eine Oxamat oder Lactatdehydrogenase.
Diagnostisches Testkit zur Messung von Lactatdehydrogenase in einer Probe auf der Basis einer enzymatischen Reaktion, die die Verwendung von NADH-Kofaktor involviert, wobei das diagnostische Testkit einen Puffer, Brenztraubensäure und als Ersatz für den NADH-Kofaktor ein NADH-Analog umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Pyridinaldehyd-NADH, 3-Acetylpyridin-NADH und 3-Thionicotinamid-NADH.
Diagnostisches Testkit zur Messung von Salicylat in einer Probe auf der Basis einer enzymatischen Reaktion, die die Verwendung von NADH-Kofaktor involviert, wobei das diagnostische Testkit einen Puffer, Salicylathydroxylase und als Ersatz für den NADH-Kofaktor ein NADH-Analog umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Pyridinaldehyd-NADH, 3-Acetylpyridin-NADH und 3-Thionicotinamid-NADH.
Diagnostisches Testkit zur Messung von Alpha-Hydroxybutyratdehydrogenase in einer Probe auf der Basis einer enzymatischen Reaktion, die die Verwendung von NADH-Kofaktor involviert, wobei das diagnostische Testkit einen Puffer, Alpha-Ketobutyrat und als Ersatz für den NADH-Kofaktor ein NADH-Analog umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Pyridinaldehyd-NADH, 3-Acetylpyridin-NADH und 3-Thionicotinamid-NADH.
Diagnostisches Testkit zur Messung von Adenosin-5'-triphosphat in einer Probe auf der Basis einer Reihe enzymatischer Reaktionen, die die Verwendung von NAD(P)H-Kofaktor involvieren, wobei das diagnostische Testkit einen Puffer, 3-Phosphoglycerat, Phosphoglycerinphosphokinase, ein divalentes Metallion, Glyceraldehydphosphatdehydrogenase und als Ersatz für den NAD(P)H-Kofaktor ein NAD(P)H-Analog umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Pyridinaldehyd-NAD(P)H, 3-Acetylpyridin-NAD(P)H und 3-Thionicotinamid-NAD(P)H.
Diagnostisches Testkit zur Messung von 2,3-Diphosphoglycerinsäure in einer Probe auf der Basis einer Reihe enzymatischer Reaktionen, die die Verwendung von NAD(P)H-Kofaktor involvieren, wobei das diagnostische Testkit einen Puffer, 2-Phosphoglycolsäure, Adenosin-5'-triphosphat, Phosphoglyceratmutase, Phosphoglycerinphosphokinase, ein divalentes Metallion, Glyceraldehydphosphatdehydrogenase und als Ersatz für den NAD(P)H-Kofaktor ein NAD(P)H-Analog umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Pyridinaldehyd-NAD(P)H, 3-Acetylpyridin-NAD(P)H und 3-Thionicotinamid-NAD(P)H.
Diagnostisches Testkit zur Messung von Sorbitdehydrogenase in einer Probe auf der Basis einer enzymatischen Reaktion, die die Verwendung von NADH-Kofaktor involviert, wobei das diagnostische Testkit einen Puffer, Fructose und als Ersatz für den NADH-Kofaktor ein NADH-Analog umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Pyridinaldehyd-NADH, 3-Acetylpyridin-NADH und 3-Thionicotinamid-NADH.
Diagnostisches Testkit zur Messung von Triglyceriden in einer Probe auf der Basis einer Reihe enzymatischer Reaktionen, die die Verwendung von NADH-Kofaktor involvieren, wobei das diagnostische Testkit einen Puffer, Phosphoenolpyruvat, Pyruvatkinase, Lactatdehydrogenase, ein divalentes Metallion, eine Gallensäure, Adenosin-5'-triphosphat, Glycerinkinase und als Ersatz für den NADH-Kofaktor ein NADH-Analog umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Pyridinaldehyd-NADH, 3-Acetylpyridin-NADH und 3-Thionicotinamid-NADH.
Diagnostisches Testkit zur Messung von Kreatinkinase in einer Probe auf der Basis einer Reihe enzymatischer Reaktionen, die die Verwendung von NADH-Kofaktor involvieren, wobei das diagnostische Testkit einen Puffer, Kreatin, Pyruvatkinase, Phosphoenolpyruvat, Lactatdehydrogenase, ein divalentes Metallion, Adenosin-5'-triphosphat und als Ersatz für den NADH-Kofaktor ein NADH-Analog umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Pyridinaldehyd-NADH, 3-Acetylpyridin-NADH und 3-Thionicotinamid-NADH.
Diagnostisches Testkit zur Messung von 5'-Nukleotidase in einer Probe auf der Basis einer Reihe enzymatischer Reaktionen, die die Verwendung von NAD(P)H-Kofaktor involvieren, wobei das diagnostische Testkit einen Puffer, Adenosindeaminase, Adenosin-5'-monophosphat, Glutamatdehydrogenase, Alpha-Ketoglutarat und als Ersatz für den NAD(P)H-Kofaktor ein NAD(P)H-Analog umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3-Pyridinaldehyd-NAD(P)H, 3-Acetylpyridin-NAD(P)H und 3-Thionicotinamid-NAD(P)H.
Diagnostisches Testkit gemäß einem der Ansprüche 7 bis 22, wobei das Kit weiterhin ein Nukleotid-Regenerierungssystem umfaßt.
Verfahren zum Quantifizieren der Gegenwart eines Enzyms oder Analyten in einer Probe auf der Basis einer enzymatischen Reaktion oder einer Reihe enzymatischer Reaktionen, die die Verwendung von NAD(P)H-Kofaktor involvieren, umfassend a) Kontaktieren der Probe mit einem Puffer, Enzymen oder Reagenzien, die an der enzymatischen Reaktion oder Reihe enzymatischer Reaktionen involviert sind und einem NAD(P)H-Analog der Formel (I):
worin R₁ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -C(O)H, -C(O)CH₃, -C(O)CH(CH₃)₂, -C(O)CH₂CH₃, -C(O)CH₂CH₂CH₃, -C(O)C₆H₅, -C(O)NHOH, -C(O)NHNH₂ und -C(O)CH₂Hal, R₂ ein Adenin ist, X ist OH oder H₂PO₄ und jedes T ist O, und b) Messung der Veränderung der Absorption oder Fluoreszenz, die sich auf dem Kontaktierungsschritt a) ergibt.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei das NAD(P)H-Analog ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 3-Pyridinaldehyd-NAD(P)H und 3-Acetylpyridin-NAD(P)H und wobei die Absorption über 320 bis 410 Nanometer gemessen wird.
Verfahren zum Quantifizieren der Gegenwart eines Enzyms, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lactatdehydrogenase, Alpha-Hydroxybutyratdehydrogenase, Sorbitdehydrogenase, 5'-Nukleotidase und Kreatinkinase, oder eines Analyten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kohlendioxid, Ammoniak, Harnstoff, Blutharnstoffstickstoff, Pyruvat, Salicylat, Triglyceriden, 2,3-Diphosphoglycerinsäure und Adenosin-5'-triphosphat, in einer Probe auf der Basis einer enzymatischen Reaktion oder einer Reihe enzymatischer Reaktionen, die die Verwendung von NAD(P)H-Kofaktor involvieren, umfassend a) Kontaktieren der Probe mit einem Puffer, Enzymen oder Reagenzien, die an der enzymatischen Reaktion oder der Reihe enzymatischer Reaktionen involviert sind, und einem NAD(P)H-Analog, wobei es sich um Thionicotinamid-NAD(P)H handelt, und b) Messung der Veränderung der Absorption, die sich aus dem Kontaktierungsschritt a) ergibt, über 360 bis 440 Nanometer.
Verfahren gemäß einem der einem der Ansprüche 24 bis 26, wobei die Reagenzien ein Nukleotid-Regenerierungssystem beinhalten.