DE69836199T2

DE69836199T2 - Anti-invasive and anti-angiogene urokinase fragmente und deren verwendung

Info

Publication number: DE69836199T2
Application number: DE69836199T
Authority: DE
Inventors: R. Terence San Diego JONES; P. Andrew LaJolla MAZAR
Original assignee: Angstrom Pharmaceuticals Inc
Current assignee: ANGSTROM PHARMACEUTICALS, INC., SOLANA BEACH, , US
Priority date: 1997-07-25
Filing date: 1998-07-24
Publication date: 2007-09-13
Anticipated expiration: 2018-07-25
Also published as: US7807621B2; US20110065640A1; WO1999005263A1; US20030027768A1; US20090143303A1; AU8590098A; ES2275309T3; PT950096E; US5994309A; EP0950096B1; US6696416B1; ATE342967T1; US8110543B2; EP0950096A1; DK0950096T3; DE69836199D1; CY1107051T1; CA2269772A1; AU752205B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung aus den Gebieten Biochemie, organische Chemie und Medizin betrifft Peptidverbindungen und Verfahren für ihre Verwendung zur Behandlung von Krankheiten und Zuständen, die mit der Bewegung, der Migration und der Adhäsion von Zellen assoziiert sind, einschließlich Erkrankungen, an denen Angiogenese beteiligt ist, wie z. B. Tumorinvasion und Metastasenbildung.
BESCHREIBUNG DES HINTERGRUNDS DES FACHGEBIETS
Von mehreren Krankheitsprozessen ist gezeigt worden, dass sie die Invasion oder die Migration von Zellen als Teil ihrer Pathologie benötigen. Diese umfassen Tumorinvasion, Tumormetastasenbildung, pathologische Angiogenese, Entzündungen und Endometriose (Liotta et al., 1991; Fox et al., 1996; Osborn, 1990; Mareel et al., 1990; Aznavoorian et al., 1993; Lennarz & Strittmatter, 1991; Fernandez-Shaw et al., 1995).
Im Falle der Tumor-Angiogenese können ruhende Endothelzellen freibeweglich werden, dies erfolgt als Antwortreaktion auf eine Reihe von angiogenen Wachstumsfaktoren sowie auf Veränderungen in der Basalmembran, die durch die Tumorzellen und durch verschiedene akzessorische Zellen, die sich innerhalb eines Tumors befinden, induziert werden (Blood & Zetter, 1990; Liotta et al., 1991; Odedra & Weiss, 1991). Die Gefäßneubildung in/um einem Tumor ermöglicht die metastatische Ausbreitung von aggressiven Tumorzellen (1) durch die Bereitstellung eines Fluchtweges für die metastasierenden Zellen sowie (2) durch die Ernährung des Tumors über die Bereitstellung einer wachstumsfördernden Umgebung (Cornelius et al., 1995; Blood & Zetter, 1990; Weaver et al., 1997; Weinstat-Saslow & Steeg, 1994; Leek et al., 1994).
Der Prozess der Tumormetastasenbildung kann als bidirektionell angesehen werden der die folgenden Schritte umfasst:

(1) Endothelzellen wandern in den Tumor als Antwortreaktion auf einen chemotaktischen Gradienten ein, der durch die Tumorzellen oder durch die akzessorischen Zellen (Stromazellen, Leukocyten) produziert wird; und
(2) aggressive Tumorzellen wandern gleichzeitig in Richtung der sich entwickelnden neuen Gefäße.

Der Prozess der Invasion kann die Angiogenese durch die proteolytische Freisetzung von Wachstums- oder angiogenen Faktoren, die an die extrazelluläre Matrix (ECM) gebunden sind, weiter antreiben, diese umfassen den basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) und den Hepatocyten-Wachstumsfaktor (HGF) sowie andere Faktoren einschließlich Interleukin-8 (IL-8) und den Granulocyten-Makrophagen-Kolonie stimulierenden Faktor (GM-CSF). Ebenfalls erzeugt werden proteolytische Fragmente der ECM, die selber sowohl für Tumorzellen als auch für Endothelzellen chemotaktisch sind (Fox et al., 1996; Leek et al., 1994; Vlodavsky et al., 1990; Sweeney et al., 1991; Taipale & Keski-Oja, 1997).
Es wurde vermutet, dass nur 1-2% aller Zellen in einem Tumor in der Lage sind, Metastasen zu bilden. Da diese Aussage auf einer statischen Sicht des Tumor-Phänotyps basiert, ist sie wahrscheinlich ungenau. In Wirklichkeit scheint die Metastasenbildung von verstreuten Tumorzellen abhängig zu sein, die einer Umgebung ausgesetzt werden, die ihre Ausbreitung und ihr Überleben unterstützt (Weaver et al., 1997). Bei der Mehrzahl der Patienten, die einen klinisch nachweisbaren primären Tumor aufweisen, hat die Metastasenbildung bereits stattgefunden (Welch, 1997). Eine metastatische Erkrankung tritt auf, wenn die verstreuten Wachstumsherde der Tumorzellen sich in einem Gewebe ansiedeln, das ihr Wachstum und ihre Vermehrung unterstützt, und diese sekundäre Ausbreitung der Tumorzellen ist für die Morbidität und die Sterblichkeit verantwortlich, die mit der Mehrzahl der Krebsarten einhergeht. Die klinische Handhabung einer metastatischen Erkrankung ist mit den herkömmlichen cytotoxischen Therapien meist nicht erfolgreich. Die Metastasenbildung unterscheidet sich wesentlich von dem Wachstum des primären Tumors, da an ihr das gleichzeitige Auswachsen vieler Wachstumsherde beteiligt ist, die im Hinblick auf ihre Aggressivität phänotypisch ähnlich sind. Dieses Auswachsen hängt von der Fähigkeit der Zellen ab, die Metastasen gebildet haben, lokal einzudringen und neue Gefäße zu rekrutieren.
Durch die Verhinderung der Wechselwirkung von Adhäsionsmolekülen kann der wichtige Prozess der Zellmigration/Invasion und die Angiogenese vermindert oder zum Stopp gebracht werden, mit einer Reihe von wichtigen Konsequenzen für diese Krankheiten und Zustände, die zum Teil durch die unerwünschte Zellmigration, Invasion und Angiogenese verursacht werden. Neben den vaskulären Phänomenen ist eine solche Zellmigration/Invasion bei der Tumormetastasenbildung wichtig, die durch die Zusammensetzungen und Verfahren, die hierin offenbart werden, unterdrückt werden kann. Die Verabreichung wirksamer Mengen dieser Zusammensetzungen wird auch die molekularen Wechselwirkungen unterbrechen, die für die Angiogenese erforderlich sind.
Im Fachgebiet ist man sich des Bedarfs an neuen Behandlungsverfahren für Individuen mit Krebs bewusst, insbesondere bei Patienten mit metastasierendem Krebs, die die ungünstigste Prognose haben. Eine solche Behandlung sollte so weit wie möglich von unerwünschten Nebenwirkungen frei sein wie z. B. solchen, die mit einer herkömmlichen Chemotherapie und einigen der experimentellen Biotherapien assoziiert sind. Die vorliegende Erfindung ist auf dieses Ziel gerichtet. Die Hemmung der Invasion von Tumorzellen und der Migration der Endothelzellen (ein wichtiger Bestandteil bei dem Prozess der Angiogenese) stellt einen neuen Ansatz für die Behandlung von Individuen mit Metastasen-bildendem Krebs bereit. Durch die Hemmung der lokalen Ausbreitung der Tumorzellen und der Angiogenese sollten metastasierende Wachstumsherde zur Rückbildung induziert werden, und zwar aufgrund der Entziehung ihrer Blutversorgung, wodurch die Zellen angeregt werden, anschließend ihr endogenes apoptotisches Programm zu exprimieren.
Desweiteren könnte die Hemmung der Invasion von Geweben durch Leukocyten und der begleitenden Angiogenese für die Behandlung von Entzündungen und anderen Krankheitsprozessen nützlich sein, bei denen die zelluläre Invasionsfähigkeit ein Teil des pathogenen Prozesses darstellt. Es ist bekannt, dass an Entzündungen und an der Tumorinvasion und Metastasenbildung sowie der Angiogenese ähnliche Mechanismen und extrazelluläre Faktoren beteiligt sind (Liotta et al., 1991; Fox et al., 1996; Osborn, 1990; Mareel et al., 1990; Aznavoorian et al., 1993; Lennarz & Strittmatter, 1993).
Blasi et al. ( U.S. 5,416,006 ) offenbaren Plasminogen-Aktivatoren und ihre chemischen Modifikationen, insbesondere den phosphorylierten μPA und tPA, als thrombolytische Agenzien. Diese Forscher untersuchten den phosphorylierten uPA durch die Erzeugung von tryptischen Phosphopeptiden daraus und bemerkten das Vorliegen von KPSSPPEELK [SEQ ID NO: 1] (entsprechend den Positionen 136-145 des uPA). Dieses Dekapeptid wurde nicht auf irgendeine Funktion hin untersucht, noch wurden ihm irgendwelche Eigenschaften von funktioneller Bedeutung zugeschrieben. Noch wichtiger ist, wie hierin offenbart wird, dass dieses Peptid (nicht phosphoryliert), mit oder ohne Cap-Struktur, in einem in vitro-Testansatz für die Zellinvasion inaktiv ist.
Das Zitieren der vorstehenden Dokumente ist nicht als Eingeständnis beabsichtigt, dass irgendetwas des Vorstehenden einschlägiger Stand der Technik ist. Alle Aussagen zum Datum oder zur Darstellung oder zum Inhalt dieser Dokument basiert auf der Information, die dem Antragsteller zugänglich ist, und stellt kein Eingeständnis hinsichtlich der Korrektheit der Daten oder der Inhalte dieser Dokumente dar.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Anmeldung beschreibt Verfahren und Zusammensetzungen zur Behandlung von Erkrankungen und Prozessen, die durch eine unerwünschte und unkontrollierte Zellinvasion und/oder Angiogenese vermittelt werden, dies erfolgt durch die Verabreichung einer Zusammensetzung, die ein Oligopeptid oder ein chemisches Derivat umfasst, an ein Tier, und zwar in einer Dosierung, die ausreicht, um die Invasion und/oder die Angiogenese zu hemmen. Dies ist besonders nützlich für die Behandlung oder für die Unterdrückung des Wachstums von Tumoren. Die Verabreichung der Zusammensetzung an einen Menschen oder an ein Individuum mit bereits über Gefäße versorgten und metastasierenden Tumoren wird das Wachstum oder die Ausdehnung dieser Tumoren verhindern.
Somit zielt die vorliegende Erfindung auf eine Peptidverbindung mit der Sequenz Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu (in der Einzelbuchstaben-Aminosäure-Codierung auch als KPSSPPEE abgekürzt, [SEQ ID NO: 2] oder ein chemisches Derivat davon. Das Peptid oder das Derivat ist am Aminoterminus und/oder am Carboxyterminus mit einer „Cap-Struktur" versehen, wobei (a) Acetyl (abgekürzt als „Ac") an den Stickstoff des Aminoterminus gebunden ist, und (b) eine Amidgruppe (abgekürzt als „Am") an die C-terminale Carboxylgruppe gebunden ist. Im Allgemeinen wird dieses Peptid mit der Cap-Struktur in der Form „Ac-KPSSPPEE-Am" durchgängig in diesem Dokument geschrieben, wobei der Einzelbuchstaben-Aminosäure-Code verwendet wird und die blockierenden Gruppen als Ac und Am angegeben werden.
Das Peptid oder das Derivat dieser Erfindung weist eine oder mehrere der folgenden Aktivitäten auf:

(a) wenigsten etwa 20% der biologischen Aktivität von Ac-KPSSPPEE-Am in einem oder mehreren der folgenden in vitro-Bioassays: (i) Invasion in einem Matrigel^®-Assay; (ii) Bildung endothelialer Gefäße auf Matrigel^®; oder (iii) Bildung endothelialer Gefäße auf einer Fibrin-Matrix in Gegenwart von basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor und vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor; oder
(b) eine Bindungsaktivität, so dass es mit markiertem Ac-KPSSPPEE-Am um die Bindung an eine Zelle oder an ein Molekül konkurriert, das eine Bindungsstelle für Ac-KPSSPPEE-Am aufweist.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Peptid oder die Peptidvariante an beiden Enden mit einer Cap-Struktur versehen, und zwar mit einer N-terminalen Acetylgruppe und einer C-terminalen Amidgruppe.
Die Erfindung richtet sich weiterhin auf ein Arzneimittel, das für die Hemmung der Invasion von Tumorzellen oder der Angiogenese nützlich ist, umfassend (a) ein beliebiges der vorstehenden Peptide oder chemischen Derivate und (b) einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Excipienten.
Hierin ebenfalls beschrieben wird ein Verfahren zur Hemmung der Invasionsfähigkeit von Tumorzellen, umfassend das Inkontaktbringen der Zellen mit einer wirksamen Menge des Peptids oder eines Derivats wie vorstehend.
Ebenfalls beschrieben wird ein Verfahren zur Hemmung der Tumorinvasion oder der Metastasenbildung in einem Individuum, umfassend die Verabreichung eines beliebigen der vorstehenden Arzneimittel an das Individuum.
Weiterhin beschrieben wird ein Verfahren zur Hemmung der Zellmigration, Invasion, der Migrations-induzierten Zellteilung oder der Angiogenese in einem Individuum, das eine Krankheit oder einen Zustand aufweist, die/der mit einer unerwünschten Zellmigration, Invasion, einer Migrations-induzierten Zellteilung oder Angiogenese assoziiert ist, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Arzneimittels wie vorstehend beschrieben, an das Individuum.
Bei jedem der vorstehenden Verfahren kann es sich bei der Krankheit oder dem Zustand, die/der behandelt wird, um primäres Tumorwachstum, Tumorinvasion oder Metastasenbildung, Atherosklerose, vaskuläre Restenose nach Ballon-Angioplastik, Neointima-Bildung nach einer Gefäßverletzung, vaskuläre Restenose eines Transplantats, mit einer chronischen Entzündung assoziierte Fibrose, Lungenfibrose, durch Chemotherapie induzierte Fibrose, Wundheilung mit Narbenbildung und Fibrose, Psoriasis, tiefe venöse Thrombose oder um eine andere Krankheit oder Zustand handeln, bei der/dem die Angiogenese pathogen ist. Die Behandlungsverfahren werden am stärksten für das Tumorwachstum, die Invasion oder die Metastasenbildung bevorzugt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine graphische Darstellung, welche die hemmende Wirkung von Ac-Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-Am (5 μM) auf die in vitro-Invasion sowohl von menschlichen (PC-3) als auch von Ratten-(Mat BIII)Tumorzelllinien in einem Matrigel^®-System zeigt, wie es in den Beispielen beschrieben wird. Der linke Balken jedes Paares ist die Kontrollgruppe und der rechte Balken stellt Zellen dar, die bei Anwesenheit des Peptids eine Antwortreaktion zeigen.
2 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkung verschiedener Peptide auf die in vitro-Invasion von PC-3-Zellen in einem Matrigel^®-System zeigt, wie es in den Beispielen beschrieben wird. Alle Verbindungen wurden bei 5 μM untersucht. Die folgenden Peptide wurden ausgetestet: Ac-Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-Am (Ac-KPSSPPEE-Am) (SEQ ID NO: 2), auch als Å6 bezeichnet, und die folgenden Varianten: Ac-Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Am (Ac-KPSSPPE-Am), Ac-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-Am (Ac-PSSPPEE-Am), sowie SEQ ID NO: 1 (Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-Leu-Lys) entweder mit Cap-Struktur (Ac-KPSSPPEELK-Am) oder ohne Cap-Struktur (KPSSPPEELK).
3 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkung weiterer Peptide auf die in vitro-Invasion von PC-3-Zellen wie vorstehend bei zwei unterschiedlichen Konzentrationen zeigt. Neben (Ac-KPSSPPEE-Am), das eine deutliche hemmende Aktivität aufweist, sind die zusätzlichen untersuchten Peptide: A13 (KPSSPPEE, ohne Cap-Struktur) und A14 (Ac-KPSSPPEEL-Am), die beide keine hemmende Aktivität aufweisen, und A15 (GGKPSSPPEE-Am, nur am C-Terminus mit Cap-Struktur), das eine geringe hemmende Aktivität bei der höheren Konzentration aufweist. Die Peptide werden gegen eine Negativ-Kontrolle verglichen, die aus dem basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) bestand.
4 ist eine graphische Darstellung, die die Hemmung der Proliferation menschlicher Endothelzellen in vitro durch Ac-KPSSPPEE-Am (Å6) über einen Testzeitraum von drei Tagen zeigt. In Gegenwart von 2 ng/ml bFGF als Negativ-Kontrolle wurde normales Zellwachstum beobachtet, wohingegen eine signifikante Zellproliferation in Gegenwart von 50 μM des Å6-Peptids nicht stattfand.
5 ist eine graphische Darstellung, die die Dosis-abhängige Hemmung der Migration menschlicher Endothelzellen in vitro durch Ac-KPSSPPEE-Am (Å6) zeigt. Die Negativ-Kontrolle bestand aus dem bFGF.
6 ist eine graphische Darstellung, die die Hemmung des Voranschreitens des Tumors (Wachstum) in Ratten der syngenen Ratten-Brustkrebs-Linie Mat BIII durch eine Behandlung mit dem Å6-Peptid zeigt.
7 ist eine graphische Darstellung, die zeigt, dass das Å6-Peptid die Metastasenbildung von Mat BIII-Brustkrebszellen zu den Lymphknoten in syngenen Ratten hemmt.
8 ist eine graphische Darstellung, die zeigt, dass das Å6-Peptid das Wachstum von menschlichen Brustkrebszellen (MCA-MB-231-Linie) in vivo in einem Nacktmaus-Xenotransplantat-Modell zum Stillstand bringt.
9 ist eine graphische Darstellung, die zeigt, dass das Å6-Peptid die metastatische Ausbreitung von menschlichen Brustkrebszellen zu den Lymphknoten in Nacktmäusen hemmt. Mäuse, die mit diesem Peptid behandelt worden waren, wiesen in den Lungen oder in den Lymphknoten keine nachweisbaren makroskopischen Metastasen auf.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegenden Erfinder haben ein neues Peptid und Derivate davon entdeckt, das/die als Inhibitoren der Angiogenese und der Invasionsfähigkeit wirken, und sie haben verschiedene Verfahren für die Verwendung dieses Peptids zur Diagnose und Therapie sowie für die Identifizierung von Rezeptoren entwickelt. Das Peptid ist ein potenter und spezifischer Inhibitor (a) der Zellinvasion, (b) der Angiogenese an Orten eines Tumors einschließlich Orten der Metastasenbildung und (c) entzündlicher Antwortreaktionen.
Darüber hinaus wurden das Peptid und seine Derivate so entworfen, dass sie in wässrigen Pufferlösungen und Körperflüssigkeiten aber nicht in Lipiden sehr gut löslich sind. Diese Eigenschaft schränkt die unspezifische Verteilung in Membranen ein. Die unspezifische Verteilung von Verbindungen in und über Membranen ist ein häufiger Grund für die Toxizität. Die Verbindungen dieser Erfindung weisen eine minimale Toxizität auf, da aufgrund dessen, dass sie eine Coulomb-Ladung besitzen, von ihnen nicht erwartet wird, dass sie sich in die Zellen verteilen. Das/die Angriffsziel(e) der Verbindungen liegen extrazellulär und das/die Verfahren dieser Erfindung basiert/basieren darauf, dass die Zusammensetzungen zuerst im extrazellulären Raum wirken. Daher ist es wünschenswert, die Verbindungen im extrazellulären Raum zu halten.
Ein weiterer pharmakologischer Vorteil liegt in der hohen Löslichkeitsgrenze der Verbindungen, was ihre Bereitstellung in hohen Konzentrationen bei Abwesenheit von zusätzlichen Lösemitteln oder ungewöhnlichen Excipienten ermöglicht.
Von den Verbindungen der Erfindung wurde durch die vorliegenden Erfinder gezeigt (vergleiche Beispiel II), dass sie die Invasion sowohl von menschlichen als auch von Ratten-Tumorzellen in vitro in dem Matrigel^®-System blockieren.
Darüber hinaus blockieren sie die Bildung von endothelialen Gefäßen, die als Antwortreaktion auf den bFGF und den VEGF erfolgt, dies entweder in einer Fibrin-Matrix oder wenn die Endothelzellen auf Matrigel^® ausplattiert werden.
Die Verbindungen der Erfindung hemmen auch die experimentelle Metastasenbildung in einem Xenotransplantat-Modell in nu/nu-Mäusen unter Verwendung der menschlichen Prostatakarzinom-Zelllinie PC-3, die mit dem Grünfluoreszierenden Protein (GFP) als Reporter transfiziert worden war. Schließlich hemmen die Verbindungen auch die Tumorprogression, die spontane Metastasenbildung und die Angiogenese in einem syngenen Ratten-Modell für Brustkrebs.
Die Peptid-Zusammensetzungen
Das ursprüngliche hemmende und mit einer Cap-Struktur versehene Peptid, das durch die vorliegenden Erfinder entdeckt wurde, besitzt 8 Aminosäurereste mit einem Molekulargewicht von 911 Da. Dieses bevorzugte Peptid ist durch die folgende Sequenz charakterisiert:
CH₃CO-Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-GIu-NH₂ [SEQ ID NO: 2].
Der Amino- und der Carboxy-Terminus sind bevorzugt blockiert oder „mit einer Cap-Struktur versehen", und zwar mit einer Acetylgruppe (CH₃CO-, die an den aminoterminalen Stickstoff gebunden ist; auch als „Ac" abgekürzt) beziehungsweise mit einer Amidgruppe (-NH₂, die an die C-terminale Carboxylgruppe gebunden ist; auch als „Am" abgekürzt). Auf dieses Peptid wird nachstehend auch im Einzelbuchstaben-Code Beziehung genommen, wobei die blockierenden Gruppen als Ac- und als Am-Gruppe bezeichnet werden: Ac-KPSSPPEE-Am.
Die N-terminale Cap-Funktion erfolgt bevorzugt in einer Verknüpfung mit der terminalen Aminogruppe und kann aus der Gruppe ausgewählt werden, umfassend: den Formyl-Rest; Alkanoyl-Reste, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthalten, wie z. B. Acetyl, Propionyl, Butyryl; Alkenoyl-Reste, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthalten, wie z. B. Hex-3-enoyl; Alkinoyl-Resten, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthalten, wie z. B. Hex-5-inoyl; Aroyl-Resten wie z. B. Benzoyl oder 1-Naphthoyl; Heteroaroyl-Resten wie z. B. 3-Pyrroyl oder 4-Chinoloyl; Alkylsulfonyl-Resten wie z. B. Methansulfonyl; Arylsulfonyl-Resten wie z. B. Benzolsulfonyl oder Sulfanilyl; Heteroarylsulfonyl-Resten wie z. B. Pyridin-4-sulfonyl; substituierten Alkanoyl-Resten, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthalten, wie z. B. 4-Aminobutyryl; substituierten Alkenoyl-Resten, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthalten, wie z. B. 6-Hydroxy-hex-3-enoyl; substituierten Alkinoyl-Resten, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthalten, wie z. B. 3-Hydroxy-hex-5-inoyl; substituierten Aroyl-Resten wie z. B. 4-Chlorbenzoyl- oder 8-Hydroxy-naphth-2-oyl; substituierten Heteroaroyl-Resten wie z. B. 2,4-Dioxo-1,2,3,4-tetrahydro-3-methyl-chinazolin-6-oyl; substituierten Alkylsulfonyl-Resten wie z. B. 2-Aminoethansulfonyl; substituierten Arylsulfonyl-Resten wie z. B. 5-Dimethylamino-1-naphthalinsulfonyl; substituierten Heteroarylsulfonyl-Resten wie z. B. 1-Methoxy-6-isochinolinsulfonyl; Carbamoyl- oder Thiocarbamoyl-Resten; substituierten Carbamoyl-(R'-NH-CO) oder subsitutierten Thiocarbamoyl-Resten (R'-NH-CS), wobei R' ein Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Heteroaryl-, substituierter Alkyl-, substituierter Alkenyl-, substituierter Alkinyl-, substituierter Aryl- oder substituierter Heteroaryl-Rest ist; substitutierten Carbamoyl-(R'-NH-CO) und subsitutierten Thiocarbamoyl-Resten (R'-NH-CS), wobei R' ein Alkanoyl-, Alkenoyl-, Alkinoyl-, Aryol-, Heteroaroyl-, substituierter Alkanoyl-, substituierter Alkenoyl-, substituierter Alkinoyl-, substituierter Aroyl- oder substituierter Heteroaroyl-Rest ist; alle wie vorstehend definiert;
Lys-(Gly)_n, wobei n = 1-4; oder Tyr-(Gly)_n, wobei n = 1-4.
Die C-terminale Cap-Funktion kann entweder in einer Amid-Bindung mit dem terminalen Carboxyl-Rest oder in einer Ester-Bindung mit dem terminalen Carboxyl-Rest vorliegen. Cap-Funktionen, die eine Amid-Bindung bereitstellen, werden als NR¹R² bezeichnet, wobei R¹ und R² unabhängig voneinander aus der folgenden Gruppe ausgewählt werden können: Wasserstoff; Alkyl-Reste, die bevorzugt 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthalten, wie z. B. Methyl, Ethyl, Isopropyl; Alkenyl-Reste, die bevorzugt 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthalten, wie z. B. Prop-2-enyl; Alkinyl-Reste, die bevorzugt 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthalten, wie z. B. Prop-2-inyl; substiuierten Alkyl-Resten, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthalten, wie z. B. Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Mercaptoalkyl, Alkylthioalkyl, Halogenalkyl, Cyanoalkyl, Aminoalkyl, Alkylaminoalkyl, Dialkylaminoalkyl, Alkanoylalkyl, Carboxyalkyl, Carbamoylalkyl; subsituierten Alkenyl-Resten, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthalten, wie z. B. Hydoxyalkenyl, Alkoxyalkenyl, Mercaptoalkenyl, Alkythioalkenyl, Halogenalkenyl, Cyanoalkenyl, Aminoalkenyl, Alkylaminoalkenyl, Dialkylaminoalkenyl, Alkanoyalkenyl, Carboxyalkenyl, Carbamoylalkenyl; substituierten Alkinyl-Resten, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthalten, wie z. B. Hydoxyalkinyl, Alkoxyalkinyl, Mercaptoalkinyl, Alkylthioalkinyl, Halogenalkinyl, Cyanoalkinyl, Aminoalkinyl, Alkylaminoalkinyl, Dialkyaminoalkinyl, Alkanoylalkinyl, Carboxyalkinyl, Carbamoylalkinyl; Aroylalkyl-Resten, die bis zu 10 Kohlenstoffatome enthalten, wie z. B. Phenacyl oder 2-Benzoylethyl; Aryl-Resten wie z. B. Phenyl oder 1-Naphthyl; Heteroaryl-Resten wie z. B. 4-Chionlyl; Alkanoyl-Resten, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthalten, wie z. B. Acetyl oder Butyryl; Aroyl-Resten wie z. B. Benzoyl; Heteroaroyl-Resten wie z. B. 3-Chinoloyl;
OR' oder NR'R'', wobei R' und R'' unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl, Aryl, Heteroaryl, Acyl, Aroyl, Sulfonyl, Sulfinyl oder SO₂-R''' oder SO-R''' sein können, wobei R''' ein substituierter oder ein nicht-substituierter Alkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Alkenyl- oder Alkinyl-Rest ist.
Cap-Funktionen, die eine Esterbindung bereitstellen, werden als OR bezeichnet, wobei R ein Alkoxy-; Aryloxy-; Heteroaryloxy-; Aralkyloxy-; Heteroaralkyloxy-; substituierter Alkoxy-; substituierter Aryloxy-; substituierter Heteroaryloxy-; substituierter Aralkyloxy- oder substituierter Heteroaralkyloxy-Rest sein kann.
Entweder die N-terminate oder die C-terminate Cap-Funktion oder beide können eine solche Struktur aufweisen, dass das mit der Cap-Struktur versehene Molekül als ein Prodrug (ein pharmakologisch inaktives Derivat des Eltern-Arzneistoff-Moleküls) wirkt, das einer spontanen oder einer enzymatischen Umwandlung innerhalb des Körpers unterliegt, so dass der aktive Arzneistoff freigesetzt wird, und das verbesserte Bereitstellungseigenschaften gegenüber dem Eltern-Arzneistoff-Molekül aufweist (Bundgaard, 1995).
Eine wohlüberlegte Wahl der Cap-Gruppen erlaubt die Hinzufügung anderer Aktivitäten an das Peptid. So ermöglicht zum Beispiel die Anwesenheit einer Sulfhydryl-Gruppe, die mit der N- oder der C-terminalen Cap-Struktur verknüpft wird, die Konjugation des derivatisierten Peptids mit anderen Molekülen.
Herstellung der Peptide und der Derivate
Allgemeine chemische Syntheseverfahren
Die Peptide der Erfindung können unter Verwendung der rekombinanten DNA-Technologie hergestellt werden. Zieht man jedoch ihre Länge in Betracht, werden sie bevorzugt unter Verwendung einer Festphasen-Synthese hergestellt wie sie z. B. allgemein durch Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54 (1963) beschrieben wurde, obwohl andere äquivalente chemische Syntheseverfahren, die im Fachgebiet bekannt sind, ebenfalls verwendet werden können. Die Festphasen-Peptid-Synthese kann am C-Terminus des Peptids gestartet werden, indem eine geschützte α-Aminosäure an ein geeignetes Harz gekoppelt wird. Ein solches Ausgangsmaterial kann durch die Anheftung einer α-Amino-geschützten Aminosäure über eine Esterbindung an ein Chlormethyl-Harz oder an ein Hydroxymethyl-Harz hergestellt werden, oder über eine Amid-Bindung an ein BHA-Harz oder ein MBHA-Harz.
Die Herstellung des Hydroxymethyl-Harzes wird in Bodansky et al., 1966 beschrieben. Chlormethylierte Harze sind von den BioRad Laboratories, Richmond, Calif. und von Lab. Systems, Inc. kommerziell erhältlich. Die Herstellung eines solchen Harzes wird durch Stewart et al., 1969 beschrieben. BHA- und MBHA-Harz-Träger sind kommerziell erhältlich und werden im Allgemeinen nur verwendet, wenn das gewünschte Polypeptid, das synthetisiert werden soll, am C-Terminus eine nicht substituierte Amidgruppe enthält.
Die Aminosäuren können an die wachsende Peptidkette unter Verwendung von Verfahren gekoppelt werden, die im Fachgebiet für die Bildung von Peptidbindungen wohlbekannt sind. Ein Verfahren umfasst zum Beispiel die Umwandlung der Aminosäure in ein Derivat, das die Carboxylgruppe der Aminosäure gegenüber einer Reaktion mit der freien N-terminalen Aminogruppe der wachsenden Peptidkette reaktionsfähiger macht. Genauer gesagt kann der C-Terminus der geschützten Aminosäure in ein gemischtes Anhydrid umgewandelt werden, dies erfolgt durch die Reaktion des C-Terminus mit Ethylchlorformat, Phenylchlorformat, sec-Butylchlorformat, Isobutylchlorformat oder mit Pivaloylchlorid oder ähnlichen Säurechloriden. Alternativ kann der C-Terminus der Aminosäure in einen aktiven Ester umgewandelt werden, wie z. B. einen 2,4,5-Trichlorphenylester, einen Pentachlorphenylester, einen Pentafluorphenylester, einen p-Nitrophenylester, einen N-Hydroxysuccinimidester oder einen Ester, der aus 1-Hydroxybenzotriazol gebildet wird. Ein anderes Kopplungsverfahren umfasst die Verwendung eines geeigneten Kopplungsmittels wie z. B. N,N'-Dicylcohexylcarbodiimid oder N,N'-Diisopropylcarbodiimid. Andere geeignete Kopplungsreagenzien, die Fachleuten leicht ersichtlich sind, werden in Gross et al., 1979 offenbart, das hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
Die α-Aminogruppe jeder Aminosäure, die bei der Peptidsynthese verwendet wird, muss während der Kopplungsreaktion geschützt werden, um Nebenreaktionen, an denen ihre aktive α-Aminofunktion beteiligt ist, zu verhindern. Bestimmte Aminosäuren enthalten reaktionsfähige funktionelle Gruppen in der Seitenkette (z. B. Sulfhydryl, Amino-, Carboxyl- und Hydroxyl-Gruppen), und solche funktionellen Gruppen müssen ebenfalls mit geeigneten Schutzgruppen geschützt werden, um eine chemische Reaktion zu verhindern, die entweder (1) an der α-Aminogruppe oder (2) an der reaktiven Seitenkette sowohl während des ersten als auch während der anschließenden Kopplungsschritte auftreten kann.
Bei der Auswahl einer bestimmten Schutzgruppe, die zur Synthese der Peptide verwendet werden soll, werden im Allgemeinen die folgenden Regeln befolgt. Genauer gesagt sollte eine α-Aminoschutzgruppe (1) die α-Aminofunktion gegenüber den Bedingungen, die bei der Kopplungsreaktion verwendet werden, inert machen, (2) nach der Kopplungsreaktion leicht entfernt werden können, und zwar unter Bedingungen, die die Schutzgruppen der Seitenketten nicht entfernen und die die Struktur des Peptidfragments nicht verändern, und (3) die Möglichkeit einer Racematbildung nach der Aktivierung und kurz vor der Kopplung deutlich vermindern.
Andererseits sollte eine die Seitenkette schützende Gruppe (1) die funktionelle Gruppe der Seitenkette gegenüber den bei der Kopplungsreaktion angewendeten Bedingungen inert machen, (2) bei den Bedingungen, die angewendet werden, um die α-Aminoschutzgrupe zu entfernen, stabil sein, und (3) von dem gewünschten, vollständig zusammengesetzten Peptid unter Reaktionsbedingungen, die die Struktur der Peptidkette nicht verändern, leicht zu entfernen sein.
Fachleute werden leicht erkennen, dass die Schutzgruppen, von denen bekannt ist, dass sie für die Peptidsynthese nützlich sind, in ihrer Reaktionsfähigkeit gegenüber den zu ihrer Entfernung verwendeten Reagenzien variieren können. So sind zum Beispiel bestimmte Schutzgruppen wie Triphenylmethyl und 2-(p-Biphenyl)-isopropyloxycarbonyl sehr labil und können unter milden sauren Bedingungen abgespalten werden. Andere Schutzgruppen wie z. B. t-Butyloxycarbonyl (BOC), tq-Amyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und p-Methoxybenzyloxycarbonyl sind weniger labil und erfordern Säuren mittlerer Stärke für ihre Entfernung wie z. B. Trifluoressigsäure, Salzsäure oder Bortrifluorid in Essigsäure. Noch andere Schutzgruppen wie z. B. Benzyloxycarbonyl (CBZ oder Z), Halobenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, Cycloalkyloxycarbonyl und Isopropyloxycarbonyl sind sogar noch weniger labil und erfordern noch stärkere Säuren für ihre Entfernung wie z. B. Fluorwasserstoff, Bromwasserstoff oder Bortrifluoracetat in Trifluoressigsäure. Geeignete, im Fachgebiet bekannte Schutzgruppen werden in Gross et al. 1981 beschrieben.
Unter den Klassen der Aminosäureschutzgruppen, die zum Schutz der α-Aminogruppe oder zum Schutz der Gruppe einer Seitenkette nützlich sind, sind die folgenden mit eingeschlossen.

(1) Für eine α-Aminogruppe sind die drei typischen Klassen der Schutzgruppen:
(a) aromatische Schutzgruppen vom Urethan-Typ wie z. B. Fluorenylmethyloxycarbonyl (FMOC), CBZ und substituiertes CBZ wie z. B: p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl und p-Methoxybenzyloxycarbonyl, o-Chlorbenzyloxycarbonyl, 2,4-Dichlorbenzyloxycarbonyl, 2,6-Dichlorbenzyloxycarbonyl und ähnliche;
(b) aliphatische Schutzgruppen vom Urethan-Typ wie z. B. BOC, t-Amyloxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl, 2-(p-Biphenyl)isopropyloxycarbonyl, Allyloxycarbonyl und ähnliche; und
(c) Cycloalkyl-Schutzgruppen vom Urethan-Typ wie z. B. Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und Cyclohexyloxycarbonyl. Die bevorzugten α-Amino-Schutzgruppen sind BOC und FMOC.
(2) Für die Seitenketten-Aminogruppe, die in Lys vorliegt, kann der Schutz durch eine beliebige der vorstehend in (1) erwähnten Gruppen erfolgen wie z. B. durch BOC, 2-Chlorbenzyloxycarbonyl und ähnliche.
(3) Für die Guanidino-Gruppe von Arg kann der Schutz durch die Nitro-, Tosyl-, CBZ-, Adamantyloxycarbonyl-, 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl-, 2,3,6-Trimethyl-4-methoxyphenylsulfonyl- oder die BOC-Gruppe erfolgen.
(4) Für die Hydroxylgruppen von Ser oder Thr kann der Schutz zum Beispiel durch t-Butyl; Benzyl (BZL); oder durch substituiertes BZL wie z. B. p-Methoxybenzyl, p-Nitrobenzyl, p-Chlorbenzyl, o-Chlorbenzyl und 2,6-Dichlorbenzyl erfolgen.
(5) Für die Carboxyl-Gruppen von Asp oder Glu kann der Schutz zum Beispiel durch Veresterung unter Verwendung solcher Gruppen wie BZL, t-Butyl, Cyclohexyl, Cyclopentyl und ähnlichen erfolgen.
(6) Für den Imidazol-Stickstoff von His wird der Benzyloxymethyl(BOM)- oder der Tosyl-Rest in geeigneter Weise als Schutzgruppe verwendet.
(7) Für die phenolische Hydroxyl-Gruppe von Tyr, werden Schutzgruppen wie z. B. Tetrahydropyranyl, tert-Butyl, Trityl, BZL, Chlorbenzyl, 4-Brombenzyl und 2,6-Dichlorbenzyl in geeigneter Weise verwendet. Die bevorzugte Schutzgruppe ist Brombenzyloxycarbonyl.
(8) Für die Seitenketten-Aminogruppen von Asn oder Gln wird bevorzugt Xanthyl (Xan) verwendet.
(9) Bei Met bleibt die Aminosäure bevorzugt ungeschützt.
(10) Für die Thio-Gruppe von Cys wird typischerweise p-Methoxybenzyl verwendet.

Die erste C-terminale Aminosäure der wachsenden Peptidkette wie z. B. Glu wird in der Regel an der α-Aminoposition durch eine in geeigneter Weise ausgewählte Schutzgruppe wie z. B. BOC geschützt. BOC-Glu-(γ-cyclohexyl)-OH kann zuerst an ein Benzylhydrylamin-Harz unter Verwendung von Isopropylcarbodiimid bei etwa 25°C über zwei Stunden unter Rühren oder an ein chlormethyliertes Harz gemäß dem in Horiki et. al., 1978 beschriebenen Verfahren gekoppelt werden. Nach der Kopplung der durch BOC geschützten Aminosäure an den Harzträger wird die α-Aminoschutzgruppe gewöhnlich entfernt, dies erfolgt in der Regel durch die Verwendung von Trifluoressigsäure (TFA) in Methylenchlorid oder durch TFA alleine. Die Entfernung der Schutzgruppe von der α-Aminogruppe kann über einen breiten Temperaturbereich erfolgen, wird aber gewöhnlich bei Temperaturen zwischen 0°C und Raumtemperatur durchgeführt.
Andere Standardreagenzien zur Entfernung der Schutzgruppe von der α-Aminogruppe wie z. B. HCl in Dioxan und Bedingungen für die Entfernung spezifischer α-Amino-Schutzgruppen sind den Fachleuten bekannt wie solche, die in Lübke et al., 1975, beschrieben werden. Nach der Entfernung der α-Amino-Schutzgruppe kann die ungeschützte α-Aminogruppe, deren Seitenkette in der Regel immer noch geschützt ist, schrittweise an die beabsichtigte Sequenz gekoppelt werden.
Eine Alternative zu dem schrittweisen Ansatz ist das Fragment-Kondensationsverfahren, bei dem vorgeformte Peptide mit kurzer Länge, wobei jedes einen Teil der gewünschten Sequenz darstellt, an eine wachsende Kette von Aminosäuren gekoppelt werden, die an einen Festphasenträger gebunden ist. Für diesen schrittweisen Ansatz stellen N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid oder Diisopropylcarbodiimid besonders geeignete Kopplungsreagenzien dar. Auch für den Fragmentansatz ist die Auswahl des Kopplungsreagenzes sowie die Auswahl des Fragmentierungsmusters, das man benötigt, um die Fragmente der gewünschten Art und Größe miteinander zu koppeln, wichtig für den Erfolg und den Fachleuten bekannt.
Jede geschützte Aminosäure oder Aminosäuresequenz wird üblicherweise in den Festphasen-Reaktor in einer Menge eingebracht, die die stöchiometrische Mengen übersteigt, und die Kopplung wird in geeigneter Weise in einem organischen Lösemittel wie z. B. Dimethylformamid (DMF); CH₂Cl₂ oder Gemischen davon durchgeführt. Wenn eine unvollständige Kopplung auftritt, wird die Kopplungsprozedur üblicherweise wiederholt, bevor die N-Aminoschutzgruppe für die Vorbereitung der Kopplung der nächsten Aminosäure entfernt wird. Nach der Entfernung der α-Aminoschutzgruppe können die verbleibende α-Aminosäure und die Seitenketten-geschützten Aminosäuren schrittweise zu der beabsichtigten Sequenz gekoppelt werden. Der Erfolg der Kopplungsreaktion in jedem Stadium der Synthese kann überwacht werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Überwachung der Synthese ist die Ninhydrinreaktion wie sie durch Kaiser et al., 1970 beschrieben wird. Die Kopplungsreaktionen können auch automatisch unter Verwendung wohlbekannter kommerzieller Verfahren und Geräte durchgeführt werden, zum Beispiel mit dem Beckman 990-Peptid-Synthesegerät.
Nach der Fertigstellung der gewünschten Peptidsequenz muss das geschützte Peptid von dem Harzträger abgespalten werden, und alle Schutzgruppen müssen entfernt werden. Die Abspaltungsreaktion und die Entfernung der Schutzgruppen werden in geeigneter Weise gleichzeitig oder nach den Schutzgruppenentfernungsreaktionen durchgeführt. Wenn die Bindung, die das Peptid auf dem Harz verankert, eine Esterbindung ist, kann diese durch ein beliebiges Reagenz gespalten werden, das in der Lage ist, eine Esterbindung aufzubrechen und in die Harzmatrix einzudringen. Ein besonders nützliches Verfahren ist die Behandlung mit flüssigem, wasserfreien Fluorwasserstoff. Dieses Reagenz wird gewöhnlich nicht nur das Peptid von dem Harz abspalten, sondern wird auch alle säurelabilen Schutzgruppen entfernen und wird somit direkt das vollständig von Schutzgruppen freie Peptid bereitstellen. Wenn weitere Schutzgruppen vorhanden sind, die nicht säurelabil sind, müssen zusätzliche Schritte zur Entfernung von Schutzgruppen durchgeführt werden. Diese Schritte können entweder vor oder nach der vorstehend beschriebenen Behandlung mit Fluorwasserstoff entsprechend den spezifischen Bedürfnissen und den Umständen durchgeführt werden.
Wenn ein chlormethyliertes Harz verwendet wird, führt die Spaltungs/Schutzgruppenentfernungs-Behandlung mit Fluorwasserstoff im Allgemeinen zur Bildung der freien Peptidsäuren. Wenn ein Benzhydrylamin-Harz verwendet wird, führt die Behandlung mit Fluorwasserstoff im Allgemeinen zu freien Peptidamiden. Die Reaktion mit Fluorwasserstoff in Gegenwart von Anisol und Dimethylsulfid bei 0°C über eine Stunde wird typischerweise die Schutzgruppen der Seitenketten entfernen und gleichzeitig das Peptid von dem Harz freisetzen.
Wenn gewünscht wird, das Peptid ohne eine Entfernung der Schutzgruppen abzuspalten, kann das geschützte Peptid-Harz einer Methanolyse unterzogen werden, was zu einem geschützten Peptid führt, dessen C-terminale Carboxylgruppe methyliert ist. Dieser Methylester kann anschließend unter milden alkalischen Bedingungen hydrolysiert werden, so dass die freie C-terminale Carboxylgruppe erhalten wird. Die Schutzgruppen der Peptidkette können dann durch eine Behandlung mit einer starken Säure wie z. B. flüssigem Fluorwasserstoff entfernt werden. Ein besonders nützliches Verfahren für die Methanolyse ist dasjenige von Moore et al., 1977, bei dem das geschützte Peptid-Harz mit Methanol und Kaliumcyanid in Gegenwart eines Kronenethers behandelt wird.
Andere Verfahren zur Abspaltung eines geschützten Peptids von dem Harz wenn ein chlormethyliertes Harz verwendet wird, umfassen (1) die Ammoniolyse und (2) die Hydrazinolyse. Wenn gewünscht, können das so erhaltene C-terminale Amid oder Hydrazid hydrolysiert werden, um den C-terminalen Carboxylrest freizulegen, und die Schutzgruppen können auf die übliche Weise entfernt werden. Die an der N-terminalen α-Aminogruppe vorhandene Schutzgruppe kann entweder zuvor, oder nachdem das geschützte Peptid vom Träger abgespalten wurde, entfernt werden. Die Reinigung der Peptide der Erfindung wird typischerweise unter Verwendung chromatographischer Verfahren erreicht wie z. B. der präparativen HPLC (einschließlich der Umkehrphasen-HPLC), Gelpermeation, Ionenaustausch, Verteilungschromatographie, Affinitätschromatographie (einschließlich Säulen mit monoclonalen Antikörpern) und ähnlichem oder durch herkömmlich Verfahren wie z. B. eine Gegenstromverteilung oder ähnliches.
Aminosäureaustausch- und additionsvarianten
Hierin werden ebenfalls Peptide beschrieben, in denen mindestens ein Aminosäurerest, und bevorzugt nur einer, entfernt wurde, und ein unterschiedlicher Rest an seiner Stelle eingebaut wurde. Hinsichtlich einer genauen Beschreibung der Proteinchemie und -struktur siehe Schulz, G.E. et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, 1979; und mit Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1984. Die Arten der Austausche, die an dem Peptidmolekül der vorliegenden Erfindung vorgenommen werden können, sind konservative Austausche und werden hierin als Austausche innerhalb einer der folgenden Gruppen definiert:

1. Kleine aliphatische, unpolare oder schwach polare Reste: z. B. Ala, Ser, Thr, Gly;
2. Polare, negativ geladene Reste und ihre Amide: z. B. Asp, Asn, Glu, Gln;
3. Polare, positiv geladene Reste: z. B. His, Arg, Lys;

Aufgrund seiner ungewöhnlichen Geometrie schränkt Pro die Kette stark ein. Wesentliche Veränderungen der funktionellen Eigenschaften können vorgenommen werden, indem Austausche gewählt werden, die weniger konservativ sind, wie z. B. zwischen und nicht innerhalb der vorstehenden Gruppen (oder zwei anderen Aminosäuregruppen, die vorstehend nicht gezeigt wurden), und die sich signifikanter in ihrer Wirkung auf die Beibehaltung (a) der Struktur des Peptidgerüsts im Bereich des Austausches, (b) der Ladung oder der Hydrophobizität des Moleküls an der Zielstelle oder (c) des Volumens der Nebenkette unterscheiden. Bei den meisten Austauschen gemäß der vorliegenden Erfindung handelt es sich um solche, die zu keinen drastischen Veränderungen der Eigenschaften des Peptidmoleküls führen. Obwohl es schwierig ist, die genaue Auswirkung eines Austausches vor der Durchführung vorherzusagen, werden Fachleute erkennen, dass die Wirkung durch Routine-Screenung-Assays bewertet werden kann, und zwar bevorzugt durch die nachstehend beschriebenen biologischen Assays. Die Modifikationen der Peptideigenschaften einschließlich der Redox- oder der Hitzestabilität, der Hydrophobizität, der Empfindlichkeit gegenüber einem proteolytischen Abbau oder der Tendenz mit Trägern oder zu Multimeren zu aggregieren, werden durch Verfahren getestet, die den Fachleuten wohlbekannt sind.
In einer Gruppe der Substitutionsvarianten von KPSSPPEE ist das Glu an der Position 7 oder 8 (oder an beiden) der SEQ ID NO: 2 durch ein Gln, Asp oder Asn oder durch zwei beliebige dieser Aminosäuren ausgetauscht.
Andere Derivate können weiterhin den Austausch von Ser an Position 3 oder 4 (oder an beiden) der SEQ ID NO: 2 mit einer oder zwei beliebigen der folgenden Aminosäuren umfassen: Thr, Ala, Gly, hSer oder ValβOH.
Weiterhin kann das Lys an Position 1 der SEQ ID NO: 2 durch His, Arg, Gln, Orn, Cit oder Hci ausgetauscht sein.
In anderen Derivate ist das Pro an Position 2, 5 oder 6 durch Hyp (Hydroxyprolin) ausgetauscht.
Hierin ebenfalls beschrieben werden Additionsvarianten, in denen zwei oder mehrere Reste an den C-Terminus hinter Glu (oder hinter einem beliebigen der vorstehenden Substituenten) in der SEQ ID NO: 2 hinzugefügt werden. Bei diesen Resten kann es sich um Leu-(Gly)_n, Ile-(Gly)_n, Val-(Gly)_n, Nva-(Gly)_n oder um Nle-(Gly)_n handeln, wobei Nva Norvalin ist, Nle Norleucin ist und wobei n = 1-10 beträgt.
Hierin ebenfalls beschrieben werden Additionsvarianten in denen einer oder mehrere Reste an den N-Terminus vor Lys (oder an einen beliebigen seiner vorstehenden Substituenten) in der SEQ ID NO: 2 hinzugefügt werden. Bei diesen Resten kann es sich um Gly, Lys-(Gly)_n, Tyr-(Gly)_n oder um Gly-(Gly)_n handeln, wobei n = 1-10 beträgt.
Ein weiteres Derivat stellt eine 9-Mer-Additionsvariante dar, bei der eine beliebige der folgenden Aminosäuren an den C-Terminus hinter Glu (oder an einen beliebigen seiner vorstehenden Substituenten) der SEQ ID NO: 2 hinzugefügt wird: Leu, Ile, Val, Nva, Nle, Met, Ala oder Gly.
Die keine Cap-Struktur enthaltenden Peptide, die eine beliebige der vorstehend beschriebenen Sequenzen aufweisen, besitzen einen freien N- und C-Terminus, wie zum Beispiel NH₂-KPSSPPEE-OH ohne Cap-Struktur [SEQ ID NO: 2].
Chemische Derivate
„Chemische Derivate" von KPSSPPEE [SEQ ID NO: 2] enthalten zusätzliche chemische Einheiten, die normalerweise nicht Teil des Peptid sind. Kovalente Modifikationen des Peptids sind im Schutzbereich dieser Erfindung eingeschlossen. Solche Modifikationen können in das Molekül eingeführt werden, indem ein gezielter Aminosäurerest des Peptids mit einem organischen derivatisierenden Mittel umgesetzt wird, das in der Lage ist, mit ausgewählten Seitenketten- oder mit terminalen Resten zu reagieren.
Die Peptide mit Cap-Struktur, die vorstehend diskutiert wurden, sind Beispiele für bevorzugte chemische Derivate des „natürlichen" Peptids ohne Cap-Struktur.
Es folgen andere Beispiele für chemische Derivate des Peptids.
Lysinyl- und aminoterminale Reste werden mit Succinsäure oder anderen Carbonsäureanhydriden derivatisiert. Die Derivatbildung mit einem cyclischen Carbonsäureanhydrid besitzt die Wirkung, dass sie die Ladung der Lysinyl-Reste umkehrt. Andere geeignete Reagenzien für die Derivatbildung eines eine α-Aminogruppe-enthaltenden Rests umfassen Imidoester wie z. B. Methylpicolinimidat; Pyridoxalphosphat; Pyridoxal; Chlorborhydrid; Trinitrobenzolsulfonsäure; O-Methylisoharnstoff; 2,4-Pentandion und die durch eine Transaminase katalysierte Reaktion mit Glyoxylat.
Die Carboxyl-Seitengruppen Aspartyl oder Glutamyl, können durch eine Reaktion mit Carbodiimiden (R-N=C=N-R') wie z. B. 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)-carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)-carbodiimid selektiv modifiziert werden. Weiterhin können die Aspartyl- oder Glutamylreste durch eine Reaktion mit Ammoniak zu Asparaginyl- und Glutaminylresten umgewandelt werden.
Andere Modifikationen umfassen die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, die Phosphorylierung der Hydroxylgruppen von Seryl- oder Threonyl-Resten, die Methylierung der Aminogruppe von Lysin (Creighton, vorstehend, S. 79-86), die Acetylierung des N-terminalen Amins und die Amidierung der C-terminalen Carboxylgruppen.
Für jede einzelne hierin offenbarte Peptidsequenz umfasst diese Erfindung die entsprechende retro-inverse Sequenz, in der die Richtung der Peptidkette umgedreht wurde, und wobei alle Aminosäuren zu der D-Serie gehören. So ist zum Beispiel das retro-inverse Analog des natürlichen Peptids KPSSPPEE der L-Serie EEPPSSPK, das aus Aminosäuren der D-Serie zusammengesetzt ist, und in dem E der N-Terminus und K der C-Terminus ist. Zum Beispiel ist das retro-inverse Analog des natürlichen L-Serie-Peptids mit Cap-Struktur Ac-KPSSPPEE-Am Ac-EEPPSSPK-Am, das aus Aminosäuren der D-Serie zusammengesetzt ist und in dem das N-terminale E acetyliert und das C-terminale K amidiert ist. Es ist beabsichtigt, dass die vollständige Reihe an N-terminalen Cap-Gruppen und die vollständige Reihe an C-terminalen Cap-Gruppen, die für die Peptide der L-Serie spezifiziert wurden, auch für die Peptide der D-Serie verwendet werden können.
Ebenfalls mit eingeschlossen sind Peptide, in denen eine oder mehrere L-Aminosäuren durch eine oder mehrere D-Aminosäuren substituiert wurden. Zusätzlich können modifizierte Aminosäuren oder chemische Derivate von Aminosäuren bereitgestellt werden, so dass das Peptid zusätzliche chemische Einheiten oder modifizierte Aminosäuren enthält, die normalerweise nicht Teil eines natürlichen Proteins sind. Solche derivatisierten Einheiten können die Löslichkeit, die Absorption, die biologische Halbwertszeit und ähnliches verbessern. Einheiten, die solche Wirkungen bereitstellen, werden zum Beispiel in Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16. Ausg., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980) offenbart.
Multimere Peptide
Es können längere Peptide hergestellt werden, in denen die grundlegende Peptidsequenz von etwa 7-9 Aminosäuren etwa zwei bis zu etwa 100 Mal wiederholt vorliegt, und dies mit oder ohne interne Spacer oder Linker. Ein Multimer des Peptids KPSSPPEE wird durch die folgende Formel beschrieben: (KPSSPPEE-X_m)_n-KPSSPPEE, wobei m = 0 oder 1 und n = 1-100 ist. X ist eine Spacer-Gruppe, bevorzugt handelt es sich um C₁-C₂₀-Alkyl, C₁-C₂₀-Alkenyl, C₁-C₂₀-Alkynyl oder um einen C₁-C₂₀-Polyether, der bis zu 9 Sauerstoffatome enthalten kann, oder Gly_z (z = 1-10).
Es ist selbstverständlich, dass solche Multimere von jedem beliebigen hierin beschriebenen Peptid angefertigt werden können. Darüber hinaus kann ein Peptid-Multimer unterschiedliche Kombinationen von Peptidmonomeren enthalten, d. h. sowohl KPSSPPEE als auch die davon offenbarten Varianten. Solche oligomere oder multimere Peptide können durch chemische Synthese oder durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt werden, wie hierin diskutiert wird. Wenn sie chemisch hergestellt werden, besitzen die Oligomere bevorzugt 2-8 Wiederholungen der zu Grunde liegenden Peptidsequenz. Wenn sie über rekombinante Verfahren hergestellt werden, können die Multimere so viele Wiederholungen besitzen, wie das Expressionssystem erlaubt, zum Beispiel zwei bis etwa 100 Wiederholungen.
Alle vorstehenden Peptide und chemischen Derivate müssen die biologische Aktivität und/oder die Bindungsaktivität von KPSSPPEE wie folgt aufweisen: mindestens etwa 20% der Aktivität von Ac-KPSSPPEE-Am in einem in vitro-Assay für Zell-Invasionsfähigkeit oder einem in vitro-Assay für die Bildung endothelialer Gefäße und/oder der Angiogenese. Diese Aktivitäten werden nachstehend in Einzelheiten beschrieben. Alternativ oder zusätzlich sollte das Peptid oder die chemischen Derivate mit markiertem Ac-KPSSPPEE-Am um die Bindung an einen Liganden oder an einen Bindungspartner für Ac-KPSSPPEE-Am konkurrieren, je nachdem, ob es sich dabei um einen zellulären Rezeptor (der in einem Bindungsassay mit intakten Zellen oder mit Fraktionen davon untersucht wird), einen isolierten Rezeptor oder um ein beliebiges anderes, an Ac-KPSSPPEE-Am bindendes Molekül handelt.
Darüber hinaus weisen die Peptide oder die Derivate der vorliegenden Erfindung keine biologischen Aktivitäten auf, die zuvor mit dem Urokinase-Plasminogen-Aktivator (uPA) assoziiert waren. Das bedeutet, dass sie die Bindung von uPA an den uPA-Rezeptor nicht blockieren. Diesen Peptiden fehlt die thrombolytische Aktivität, die ein Kennzeichen von uPA ist.
DIAGNOSTISCHE UND PROGNOSTISCHE ZUSAMMENSETZUNGEN
Desweiteren können die Peptide für den Nachweis markiert werden und zum Beispiel verwendet werden, um eine Bindestelle für das Peptid auf der Oberfläche oder im Inneren einer Zelle nachzuweisen. So kann das Schicksal des Peptids in vitro oder in vivo unter Verwendung eines geeigneten Verfahrens für den Nachweis der Markierung verfolgt werden. Das markierte Peptid kann auch in vivo für die Diagnose und die Prognose verwendet werden, zum Beispiel um okkulte Metastasen-Wachstumsherde abzubilden oder für andere Arten einer in situ-Bewertung.
Beispiele für geeignete nachweisbare Markierungen sind radioaktive, fluorogene, chromogene oder andere chemische Markierungen. Geeignete radioaktive Markierungen, die durch einen Gammazähler oder einen Szintillationszähler oder durch Autoradiographie nachgewiesen werden können, umfassen ³H, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S und ¹⁴C. Darüber hinaus ist ¹³¹I auch als therapeutisches Isotop nützlich (siehe nachstehend).
Bekannte Fluoreszenzmarkierungen umfassen Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthaldehyd und Fluorescamin.
Das Fluorophor, wie z. B. die Dansyl-Gruppe, muss mit Licht einer bestimmten Wellenlänge angeregt werden, damit es fluoresziert. Siehe zum Beispiel Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6. Ausgabe, Molecular Probes, Eugene, OR, 1996). Im Allgemeinen wird das Fluoreszenzreagenz aufgrund seiner Fähigkeit ausgewählt, leicht mit einer Aminofunktion zu reagieren. Beispiele für solche Fluoreszenzsonden umfassen die Bodipy-(4,4-Difluor-4-bor-3a,4a-diaza-s-indacen)-fluorophore, die das sichtbare Spektrum überspannen ( U.S. 4,774,339 ; U.S. 5,187,288 ; U.S. 5,248,782 ; U.S. 5,274,113 ; U.S. 5,433,896 ; U.S. 5,451,663 ). Ein bevorzugtes Mitglied dieser Gruppe ist 4,4-Difluor-5,7-dimethyl-4-bor-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionsäure.
Fluorescein, Fluoresceinderivate und Fluorescein-ähnliche Moleküle wie z. B. Oregon-Grün^TM und seine Derivate, Rhodamin-Grün^TM und Rhodol-Grün^TM werden unter Verwendung der reaktionsfähigen Isocyanat-, Succinimidylester- oder Dichlorotriazinyl-Gruppen an die Amingruppen gekoppelt. Die Rhodamine mit hoher Wellenlänge, die im Grunde Derivate von Rhodamin-Grün^TM mit Substituenten an den Stickstoffatomen darstellen, gehören zu den photostabilsten Fluorezenz-Markierungsreagenzien, die bekannt sind. Ihre Spektren werden durch Veränderungen des pH-Werts zwischen 4 und 10 nicht beeinträchtigt, was einen wichtigen Vorteil gegenüber den Fluoresceinderivaten für viele biologischen Anwendungen darstellt. Diese Gruppe umfasst Tetramethylrhodamine, X-Rhodamine und Derivate von Texas-Rot. Andere bevorzugte Fluorophore für eine Derivatbildung mit dem Peptid gemäß dieser Erfindung sind solche, die durch ultraviolettes Licht angeregt werden. Beispiele umfassen Cascade-Blau, Coumarin-Derivate, Naphthaline (von denen Dansylchlorid ein Mitglied ist), Pyrene und Pyridyloxazol-Derivate.
In einem noch anderen Ansatz erlaubt man einer oder mehreren Aminogruppen mit Reagenzien zu reagieren, die fluoreszierende Produkte ergeben, wie zum Beispiel Fluorescamin, Dialdehyde wie z. B. o-Phthaldialdehyd, Naphthalin-2,3-dicarboxylat und Anthacen-2,3-dicarboxylat. Derivate von 7-Nitrobenz-2-oxa-1,3- diazol (NBD), sowohl das Chlorid als auch das Fluorid, sind nützlich, um Amine zu modifizieren, damit sie fluoreszierende Produkte ergeben.
Fachleute werden erkennen, dass bekannte Fluoreszenzreagenzien auch andere Gruppen als Amine modifizieren können wie z. B. Thiole, Alkohole, Aldehyde, Ketone, Carbonsäuren und Amide. Daher können fluoreszierende Substrate rasch entworfen und unter Verwendung dieser anderen reaktionsfähigen Gruppen synthetisiert werden.
Das Peptid kann für den Nachweis auch unter Verwendung von Fluoreszenz abstrahlenden Metallen markiert werden wie z. B. mit ¹⁵²Eu oder anderen der Lanthaniden-Reihe. Diese Metalle können an das Peptid unter Verwendung von Metallchelat bildenden Gruppen wie Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) angeheftet werden. Das Peptid kann auch durch die Kopplung an eine chemilumineszente Verbindung nachweisbar gemacht werden. Die Anwesenheit eines mit einer chemilumineszenten Markierung versehenen Peptids wird dann durch den Nachweis des Auftretens von Lumineszenz bestimmt, die im Verlauf einer chemischen Reaktion auftritt. Beispiele für besonders nützliche chemilumineszente Stoffe sind Luminol, Isoluminol, theromatische Acridiniumester, Imidazol, Acridiniumsalze und Oxalatester. Ebenso kann eine biolumineszente Verbindung verwendet werden, um das Peptid zu markieren. Biolumineszenz ist eine Art der Chemilumineszenz, die sich in biologischen Systemen findet, und bei der ein katalytisches Protein die Wirksamkeit der chemilumineszenten Reaktion erhöht. Das Vorliegen eines biolumineszenten Proteins wird durch den Nachweis des Auftretens von Lumineszenz bestimmt. Wichtige biolumineszente Verbindungen zum Zwecke der Markierung sind Luciferin, Luciferase und Aequorin.
In einem noch anderen Ansatz kann ein kolorimetrischer Nachweis verwendet werden, der auf chromogenen Verbindungen (Chromophoren) mit hohen Extinktionskoeffizienten basiert.
Der in situ-Nachweis des markierten Peptids kann durch die Entfernung einer histologischen Probe aus einem Individuum und ihre mikroskopische Untersuchung unter geeigneten Bedingungen für den Nachweis der Markierung durchgeführt werden. Fachleute werden leicht erkennen, dass ein beliebiges aus einer großen Zahl an histologischen Verfahren (wie z. B. Färbeverfahren) modifiziert werden kann, um einen solchen in situ-Nachweis zu erreichen.
Der Begriff „diagnostisch markiert" bedeutet, dass das Peptid eine diagnostisch nachweisbare Markierung an sich angeheftet enthält. Es gibt viele unterschiedliche Markierungen und Markierungsverfahren, die den Fachleuten bekannt sind. Beispiele für die Arten von Markierungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen radioaktive Isotope, paramagnetische Isotope und Verbindungen, die durch Positronen-Emissions-Tomographie (PET) abgebildet werden können. Fachleuten werden andere geeignete Markierungen zur Bindung an die in der Erfindung verwendeten Peptide bekannt sein, oder sie werden in der Lage sein, diese durch Routineexperimente zu bestimmen. Desweiteren kann die Bindung dieser Markierungen an das Peptid oder an das Derivat unter Verwendung von Standardverfahren erfolgen, die den Fachleuten bekannt sind.
Für die diagnostische radioaktive in vivo-Bildgebung ist die Art des verfügbaren Geräts zum Nachweis ein wichtiger Faktor bei der Auswahl eines bestimmten Radionuklids. Das gewählte Radionuklid muss eine Zerfallsart aufweisen, die durch das bestimmte Gerät nachgewiesen werden kann. Im Allgemeinen kann jedes beliebige herkömmliche Verfahren für die Sichtbarmachung eines diagnostischen Bildes gemäß dieser Erfindung verwendet werden. Ein weiterer Faktor bei der Auswahl eines Radionuklids für die in vivo-Diagnose ist, dass die Halbwertszeit des Radionuklids lang genug ist, so dass es zum Zeitpunkt der maximalen Aufnahme durch das Zielgewebe immer noch nachweisbar ist, aber auch so kurz ist, dass die schädliche Strahlung in dem Individuum minimiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform emittiert das Radionuklid, das für die in vivo-Bildgebung verwendet wird, keine Partikel, sondern produziert eine große Zahl an Photonen im Bereich von 140-200 keV, die durch die üblichen Gamma-Kameras leicht nachgewiesen werden können.
Für die in vivo-Diagnose können die Radionuklide an das Peptid entweder direkt oder indirekt unter Verwendung einer intermediären funktionellen Gruppe gebunden werden. Intermediäre funktionelle Gruppen, die oft verwendet werden, um Radioisotope, die als Metallionen vorliegen, an Peptide zu binden, sind die Chelat bildenden Mittel DTPA und EDTA. Beispiele für Metallionen, die an Peptide gebunden werden können, sind ⁹⁹Tc, ¹²³I, ¹¹¹In, ¹³¹I, ⁹⁷Ru, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga, ¹²⁵I, ⁶⁸Ga, ⁷²As, ⁸⁹Zr und ²⁰¹TI. Im Allgemeinen wird die Dosis des Peptids, das für den Nachweis für eine diagnostische Verwendung markiert wird, in Abhängigkeit von dem Alter, dem Zustand, dem Geschlecht, dem Ausmaß der Krankheit des Patienten, eventuell vorhandenen Kontraindikationen und anderen Variablen variieren und kann durch den behandelnden Arzt eingestellt werden. Die Dosis kann von 0,01 mg/kg bis zu 100 mg/kg variieren.
Bei einem anderen Ansatz können die Peptide oder die Derivate der vorliegenden Erfindung als Affinitätsliganden zur Bindung an den Rezeptor des Peptids bei Assays, zur präparativen Affinitäts-Chromatographie oder zur Festphasen-Trennung verwendet werden. Solche Zusammensetzungen können auch verwendet werden, um Zellen, an die das Peptid bindet, anzureichern, zu reinigen oder zu isolieren, dies erfolgt bevorzugt über eine spezifische Rezeptor-Liganden-Wechselwirkung. Das Peptid oder das Derivat wird unter Verwendung der im Fachgebiet üblichen bekannten Verfahren immobilisiert, wie z. B. durch die Bindung an CNBr-aktivierte Sepharose^® oder Agarose^®, NHS-Agarose^® oder -Sepharose^®, Epoxy-aktivierte Sepharose^® oder -Agarose^®, EAH-Sepharose^® oder -Agarose^®, oder an Streptavidin-Sepharose^® oder -Agarose^® in Verbindung mit biotinylierten Peptiden oder Derivaten. Im Allgemeinen können die Peptide oder die Derivate der Erfindung über jedes beliebige andere Verfahren immobilisiert werden, das in der Lage ist, diese Verbindungen an einer festen Phase für den beabsichtigten Zweck zu immobilisieren. Siehe zum Beispiel: Affinity Chromatography: Principles and Methods (Pharmacia LKB Biotechnology). Somit kann eine Zusammensetzung ein beliebiges der hierin beschriebenen Peptide oder Derivate umfassen, die an eine feste Unterlage oder an ein Harz gebunden sind. Die Verbindung kann direkt oder über einen Spacer (Abstandshalter) gebunden werden, bevorzugt wird eine aliphatische Kette, die etwa 2-12 Kohlenstoffatome enthält.
Mit „fester Phase" oder „fester Unterlage" oder „Träger" sind beliebige Unterlagen oder Träger gemeint, die in der Lage sind, das Peptid oder das Derivat zu binden. Bekannte Unterlagen oder Träger neben Sepharose^® oder Agarose^®, die vorstehend beschrieben wurden, sind Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen, natürliche und modifizierte Cellulosen wie z. B. Nitrocellulose, Polyacrylamide, Polyvinylidendifluorid, andere Agarosen und Magnetit, einschließlich magnetischer Kügelchen. Der Träger kann vollständig unlöslich oder teilweise löslich sein. Das Material der Unterlage kann jede beliebige strukturelle Konfiguration aufweisen, so lange das angekoppelte Molekül in der Lage ist, an das Rezeptormaterial zu binden. Daher kann die Konfiguration der Unterlage kugelförmig sein wie z. B. bei einem Kügelchen oder zylindrisch wie z. B. bei der inneren Oberfläche eines Teströhrchens oder der Vertiefung einer Mikroplatte oder der externen Oberfläche eines Stäbchens. Alternativ kann die Oberfläche flach sein, wie z. B. bei einem Blatt, einem Teststreifen, der Bodenoberfläche einer Mikroplatten-Vertiefung, usw.
Antikörper und ihre Verwendung
Es können Antikörper hergestellt werden, die für ein Epitop, das durch die Peptidsequenz KPSSPPEE definiert ist, oder für ein chemisches Derivat davon spezifisch sind. Solche Antikörper können polyclonal, monoclonal, bispezifisch, chimär oder anti-idiotypisch sein, und sie umfassen auch die Antigen-bindenden Fragment davon. Es kann jeder beliebige im Fachgebiet bekannt Immunassay verwendet werden, um die Bindung eines solchen Antikörpers an ein Peptid, ein chemisches Derivat davon oder an ein Peptid-Oligomer gemäß dieser Erfindung nachzuweisen. Bevorzugte Assays sind Enzym-Immunassays oder Radioimmunassays. Die folgenden Referenzen beschreiben die Herstellung, Reinigung, Untersuchung und Verwendung von Antikörpern: Harlow, E. et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboraqtory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988; Campbell, A., in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Band 13 (Burdon, R., et al., Hrsg), Elsevier, Amsterdam (1984)); Work, T.S. et al., Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, North Holland Publishing Company, NY, 1978; Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, 7. Trainingskurs über Radioliganden-Assay-Verfahren, The Endocrine Society, März 1986; Butler, J.E. (Hrsg.) Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassays, CRC Press, Boca Raton, 1991; Butler, J.E., in: STRUCTURE OF ANTIGENS, Band 1, Van Regenmortel, M., Hrsg., CRC Press, Boca Raton, 1992, S. 209-259; Butler, J.E., in: van Oss, C.J. et al., (Hrsg.) IMMUNOCHEMISTRY, Marcel Dekker, Inc., New York, 1994, S. 759-803; Voller, A., et al., (Hrsg.) Immunoassays for the 1980's, University Park Press, Baltimore, 1981.
Solche Antikörper können verwendet werden, um die Anwesenheit des Peptidepitops nachzuweisen oder um seine Menge in einem biologischen Material oder in einer anderen Probe durch einen direkten oder einen kompetitiven Immunassay zu messen. Die Antikörper können an die feste Unterlage gekoppelt und bei einer Chromatographie verwendet werden, um Material, das das Peptidepitop enthält, zu isolieren und zu reinigen. Umgekehrt, und wie vorstehend beschrieben, kann das Peptid oder das chemische Derivat dieser Erfindung, das an eine feste Unterlage gebunden ist, verwendet werden, um spezifische Antikörper anzureichern oder zu reinigen. Anti-idiotypische Antikörper können verwendet werden, um Kenntnisse über die Struktur eines Peptids, einer Variante oder eines chemischen Derivats dieser Erfindung zu erhalten, wenn es/sie an einen Rezeptor, der es/sie erkennt, gebunden ist.
Biologischer Assay auf die anti-invasive Aktivität
Die Zusammensetzungen der Erfindung werden auf ihre anti-invasive Kapazität in einem Matrigel^®-Invasionsassay-System untersucht, wie es in Einzelheiten in Kleinman et al., 1986 und in Parish et al., 1992 beschrieben wird. Der Assay wird mit einer Zelllinie durchgeführt, noch bevorzugter mit einer Tumor-Zelllinie und am stärksten bevorzugt mit der Ratten-Brustkrebs-Linie (Mat BIII) oder der menschlichen Prostatakrebs-Linie (PC-3) (Xing und Rabbani, 1996; Hoosein et al., 1991).
Matrigel^® ist eine rekonstituierte Basalmembran, die Typ IV-Collagen, Laminin, Heparinsulfatproteoglycane wie Perlecan enthält, die den bFGF, Vitronectin sowie den transformierenden Wachstumsfaktor β (TGFβ), den Plasminogen-Aktivator vom Urokinase-Typ (uPA), den Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tPA) und Serpin, das als Plasminogen-Aktivator-Inhibitor Typ 1 (PAL1-) bekannt ist, binden und lokalisieren (Chambers et al., 1995).
Im Fachgebiet wird erwartet, dass die Ergebnisse, die bei diesem Assay für Verbindungen erhalten werden, die gegen extrazelluläre Rezeptoren oder Enzyme gerichtet sind, eine Vorhersage für die Wirksamkeit dieser Verbindungen in vivo ermöglichen (Rabbani et al., 1995).
Biologischer Assay auf die anti-angiogene Aktivität
Die Verbindungen dieser Erfindung werden auf ihre anti-angiogene Aktivität in einem von zwei unterschiedlichen Assay-Systemen in vitro ausgetestet.
Endothelzellen, zum Beispiel menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVEC) oder menschliche mikrovaskuläre Endothelzellen (HMVEC), die hergestellt werden oder kommerziell erhalten werden können, werden in einer Konzentration von 2 × 10⁵ Zellen/mL mit Fibrinogen (5 mg/mL) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) im Verhältnis 1:1 (Vol./Vol.) gemischt. Dann wird Thrombin zugegeben (Endkonzentration: 5 Einheiten/mL) und das Gemisch wird sofort in eine Platte mit 24 Vertiefungen überführt (0,5 mL pro Vertiefung). Dem Fibrin wird erlaubt ein Gel/Netzwerk zu bilden und dann werden der VEGF und der bFGF den Vertiefungen (jeweils bis zu einer Endkonzentration von 5 ng/mL) zusammen mit der Testverbindung zugegeben. Die Zellen werden 4 Tage bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert, und zu diesem Zeitpunkt werden die Zellen in jeder Vertiefung gezählt und entweder als abgerundet, langgestreckt ohne Verzweigung, langgestreckt mit einer Verzweigung oder langgestreckt mit 2 oder mehr Verzweigungen klassifiziert. Die Ergebnisse werden als der Durchschnittswert von 5 unterschiedlichen Vertiefungen für jede Konzentration der Verbindung angegeben. Bei Anwesenheit der angiogenen Inhibitoren bleiben die Zellen typischerweise abgerundet oder bilden undifferenzierte Gefäße (z. B. 0 oder 1 Verzweigung) aus.
Dieser Assay wird im Fachgebiet als Vorhersage für eine angiogene (oder anti-angiogene) Wirksamkeit in vivo angesehen (Min et al., 1996).
In einem anderen Assay wird die Bildung endothelialer Gefäße beobachtet, wenn Endothelzellen auf Matrigel^® kultiviert werden (Schnaper et al., 1995). Endothelzellen (1 × 10⁴ Zellen/Vertiefung) werden auf mit Matrigel^® beschichtete Platten mit 24 Vertiefungen übertragen, und die Gefäßbildung wird nach 48 Stunden quantifiziert. Die Inhibitoren werden ausgetestet, indem man sie entweder zum gleichen Zeitpunkt wie die Endothelzellen oder zu verschieden nachfolgenden Zeitpunkten zufügt.
Dieser Assay stellt die Angiogenese durch die Präsentation der Endothelzellen gegenüber einer besonderen Art einer Basalmembran nach, nämlich der Matrixschicht, von der man annimmt, dass die wandernden und sich differenzierenden Endothelzellen auf sie als erstes treffen. Neben den gebundenen Wachstumsfaktoren können auch die Matrixbestandteile, die sich in Matrigel^® (und in den Basalmembranen in situ) befinden, oder proteolytische Produkte davon, auch auf die Bildung endothelialer Gefäße stimulierend wirken, was dieses Modell zu dem bereits beschriebenen Fibringel/netzwerk-Angiogenese-Modell komplemetär macht (Blood und Zetter, 1990; Odedra und Weiss, 1991). Die Verbindungen dieser Erfindung hemmen die Bildung endothelialer Gefäße in beiden Assays, was nahe legt, dass die Verbindungen auch eine anti-angiogene Aktivität aufweisen.
In vivo-Austesten von Zusammensetzungen in Tiermodellen mitmenschlichen Tumoren.
Die Peptide, Peptidmimetika und Konjugate werden auf ihre therapeutische Wirksamkeit in verschiedenen gut etablierten Nager-Modellen untersucht, die als hoch repräsentativ für ein breites Spektrum menschlicher Tumoren angesehen werden. Die Ansätze werden in Einzelheiten in Geran, R.I. et al., „Protocols for Screening Chemical Agents and Natural Products Against Animal Tumors and Other Biological Systems (Dritte Ausgabe)", Canc. Chemother. Reports, Teil 3, 3:1-112 beschrieben. Alle allgemeinen Test-Bewertungsverfahren, Messungen und Berechnungen werden gemäß dieser Referenz durchgeführt, einschließlich der mittleren Überlebenszeit, der medianen Überlebenszeit, der Berechnung des ungefähren Tumorgewichts aus der Messung des Tumordurchmessers mit einem Nonius-Tastzirkel/greifer; der Berechnung des Tumordurchmessers, der Berechnung des mittleren Tumorgewichts aus individuell herausgeschnittenen Tumoren und der Verhältnisse zwischen den behandelten und den Kontrollgruppen für jede Messung (T/C-Verhältnisse).
A. Ratten-Modell der Tumor-Progression
Die Wirkungen der Verbindungen auf das Voranschreiten des Tumors werden in einem syngenen Ratten-Modell für Brustkrebs untersucht (Xing und Rabbani, 1996). Die Mat BIII-Zelllinie ist eine hoch aggressive Tumor-Zelllinie, die hohe Spiegel an uPA und uPAR exprimiert, und zu makroskopischen Metastasen zu den Lymphknoten führt, wenn sie in vivo angeimpft wird.
Mat BIII-Ratten-Brusttumorzellen, z. B. 10⁵-10⁶ Zellen in PBS, 0,1-0,2 mL pro Ratte, werden in die Milchdrüsenfettpolster weiblicher Fisher-Ratten angeimpft. Die Testverbindung wird in PBS gelöst (200 mM Stammlösung), sterilfiltriert und in vivo in einer Dosis von bis zu etwa 100 mg/kg/Tag abgegeben, dies erfolgt vorzugsweise über eine osmotische 14-Tage-Alza-Minipumpe, die intraperitoneal zum Zeitpunkt des Animpfens implantiert wird. Kontrolltiere erhalten den Träger (PBS) alleine. Alternativ wird die Testverbindung durch eine systemische, bevorzugt intraperitoneale (IP) Injektion verabreicht. Die Tiere werden am Tag 14 euthanisiert und auf Metastasen in Milz, Lunge, Leber, Niere und Lymphknoten untersucht, dies erfolgt vorzugsweise durch Auszählen der makroskopischen Läsionen. Primäre Tumore und Metastasen können in Paraffin eingebettet werden und für eine histologische oder immunhistochemische Analyse mit den üblichen Mitteln weiter verarbeitet werden. Die primäre Tumorgröße kann mit einem Tastzirkel/greifer gemessen werden.
B. 3LL-Lewis-Lungenkarzinom: primäres Tumorwachstum
Diese Tumorlinie trat 1951 als Karzinom in der Lunge in einer C57BL/6-Maus spontan auf (Cancer Res. 15:39, 1955. Vergleiche auch mit Malave, I. et al., J. Nat'l. Canc Inst. 62:83-88 (1979)). Sie wird durch Passage in C57BL/6-Mäusen über subcutane (sc) Beimpfung vermehrt und wird in halballogenen C57BL/6 × DBA/2-F₁-Mäusen oder in allogenen C3H-Mäusen untersucht. Typischerweise werden sechs Tiere pro Gruppe für ein subcutanes (sc) Implantat oder zehn Tiere für ein intramuskuläres (im) Implantat verwendet. Der Tumor kann sc als 2-4 mm großes Fragment oder im oder sc als ein Inokulum suspendierter Zellen von etwa 0,5-2 × 10⁶ Zellen implantiert werden. Die Behandlung beginnt 24 Stunden nach der Implantation oder wird verzögert bis ein Tumor mit einer bestimmten Größe (gewöhnlich etwa 400 mg) abgetastet werden kann. Die Testverbindung wird ip täglich über 11 Tage verabreicht.
Die Tiere werden durch Wiegen, Abtasten und Messung der Tumorgröße weiter beobachtet. Das typische Tumorgewicht in unbehandelten Kontrollempfängern am Tag 12 nach dem Beimpfen beträgt 500-2500 mg. Die typische mediane Überlebenszeit beträgt 18-28 Tage. Es wird eine positive Kontrollverbindung wie z. B. Cyclophosphamid zu 20 mg/kg/Injektion pro Tag an den Tagen 1-11 verwendet. Die aufgezeichneten Ergebnisse umfassen das mittlere Gewicht der Tiere, die Tummorgröße, das Tumorgewicht und die Überlebenszeit. Für eine bestätigte therapeutische Aktivität sollte die Testverbindung in zwei Mehrfach-Dosierungs-Assays untersucht werden.
C. 3LL-Lewis-Lungenkarzinom: Modell für primäres Wachstum und Metastasenbildung
Dieses Modell wurde von einer Reihe von Forschern verwendet. Siehe z.B. Gorelik, E. et al., J. Nat'l. Canc. Inst. 65:1257-1264 (1980); Gorelik, E. et al., Rec. Results Canc. Res. 75:20-28 (1980); Isakov, N. et al., Invasion Metas. 2:12-32 (1982); Talmadge, J.E. et al., J. Nat'l. Canc. Inst. 69:975-980 (1982); Hilgard, P. et al., er. J. Cancer 35:78-86 (1977). Die Test-Mäuse sind männliche C57BL/6-Mäuse, die 2-3 Monate alt sind. Nach der Implantation sc, im oder in die Fußballen produziert dieser Tumor Metastasen vorwiegend in den Lungen. Bei einigen Linien des Tumors übt der primäre Tumor anti-metastatische Wirkungen aus und muss vor der Untersuchung der metastatischen Phase herausgeschnitten werden (siehe auch U.S. 5,639,725 ).
Einzelzell-Suspensionen werden aus festen Tumoren durch die Behandlung des zerkleinerten Tumorgewebes mit einer Lösung von 0,3% Trypsin hergestellt. Die Zellen werden 3-mal mit PBS (pH 7,4) gewaschen und in PBS suspendiert. Die Lebensfähigkeit der 3LL-Zellen, die auf diesem Weg hergestellt werden, liegt im Allgemeinen bei 95-99% (untersucht über den Ausschluss des Farbstoffs Trypanblau). Lebensfähige Tumorzellen (3 × 10⁴ – 5 × 10⁶), die in 0,05 mL PBS suspendiert werden, werden subcutan entweder in den dorsalen Bereich oder in den hinteren Fußballen von C57BL/6-Mäusen injiziert. Sichtbare Tumoren erscheinen 3-4 Tage nach der dorsalen sc-injektion mit 10⁶ Zellen. Der Tag des Auftretens des Tumors und die Durchmesser aufgetretener Tumoren werden mit einem Tastzirkel/greifer alle zwei Tage gemessen.
Die Behandlung erfolgt als Verabreichung von einer oder von zwei Dosen des Peptids oder des Derivats pro Woche. In einer anderen Ausführungsform wird das Peptid über eine osmotische Minipumpe angeliefert.
Bei den Experimenten, die ein Herausschneiden des dorsalen Tumors beinhalten, wenn der Tumor eine Größe von etwa 1500 mm³ erreicht hat, werden die Mäuse in zufälliger Weise auf zwei Gruppen aufgeteilt: (1) der primäre Tumor wird vollständig herausgeschnitten oder (2) es wird ein Schein-chirurgischer Eingriff vorgenommen und der Tumor bleibt intakt. Obwohl Tumoren mit einer Größe von 500-3000 mm³ das Wachstum von Metastasen hemmen, ist 1500 mm³ das größte Volumen eines primären Tumors, der mit einer hohen Überlebensrate und ohne erneutes lokales Wachstum sicher herausgeschnitten werden kann. Nach 21 Tagen werden alle Mäuse getötet und es wird eine Autopsie durchgeführt.
Die Lungen werden entfernt und gewogen. Die Lungen werden in Bouin-Lösung fixiert und die Zahl an sichtbaren Metastasen wird aufgezeichnet. Die Durchmesser der Metastasen werden ebenfalls unter Verwendung eines binokularen Stereoskops, das mit einem eine Mikrometerskala enthaltenden Okular ausgestattet ist, unter 8-facher Vergrößerung gemessen. Auf der Grundlage der beobachteten Durchmesser ist es möglich, das Volumen jeder Metastase zu berechnen. Um das Gesamtvolumen der Metastasen pro Lunge zu bestimmen, wird der Mittelwert der sichtbaren Metastasen mit dem mittleren Volumen der Metastasen multipliziert. Um das Metastasenwachstum weiter zu bestimmen, ist es möglich den Einbau von ¹²⁵IdUrd in die Lungenzellen zu messen (Thakur, M.L. et al., J. Lab. Clin. Med. 89:217-228 (1977). Zehn Tage nach der Amputation des Tumors werden 25 μg Fluordesoxyuridin in die Bauchfelle Tumor-tragender (und, wenn verwendet, Tumor-entfernter) Mäuse angeimpft/injiziert. Nach 30 Minuten wird den Mäusen 1 μCi ¹²⁵IdUrd (Iod-deoxyuridin) verabreicht. Einen Tag später werden die Lunge und die Milz entfernt und gewogen, und der Grad des Einbaus an ¹²⁵IdUrd wird unter Verwendung eines Gammazählers gemessen.
Bei Mäusen mit Fußballen-Tumoren werden die Mäuse, wenn die Tumoren etwa 8-10 mm Durchmesser erreicht haben, in zufälliger Weise in zwei Gruppen aufgeteilt; (1) die Beine mit Tumoren werden nach dem Abbinden der Kniegelenke amputiert oder (2) die Mäuse bleiben intakt/unbehandelt und dienen als nicht-amputierte, Tumor-tragende Kontrolle. (Die Amputation eines Tumor-freien Beins einer Tumor-tragenden Maus hat auf die anschließende Metastasenbildung keine bekannten Auswirkungen, was mögliche Auswirkungen der Anästhesie, Stress oder des chirurgischen Eingriffs ausschließt). Die Mäuse werden 10-14 Tage nach der Amputation getötet. Die Metastasen werden wie vorstehend bewertet.
Statistik: die Werte stellen das Auftreten von Metastasen und ihr Wachstum in den Lungen von Tumor-tragenden Mäusen dar und sind nicht normalverteilt. Daher können nicht-parametrische statistische Verfahren wie z. B. der U-Test nach Mann-Whitney für die Analyse verwendet werden.
Die Untersuchung dieses Modells durch Gorelik et al. (1980, vorstehend) zeigte, dass die Größe des Tumorzellen-Inokulums das Ausmaß des metastatischen Wachstums bestimmt. Die Rate der Metastasenbildung in den Lungen der operierten Mäuse unterschied sich von der der Mäuse, die einen primären Tumor trugen. Daher war in den Lungen der Mäuse, in denen der primäre Tumor durch das Animpfen höherer Dosen an 3LL-Zellen (1-5 × 10⁶) induziert worden und anschließend chirurgisch entfernt worden war, die Zahl an Metastasen niedriger als in den nicht operierten Tumor-tragenden Mäusen, obwohl das Volumen der Metastasen größer als in den nicht operierten Kontrollen war. Bei der Verwendung des ¹²⁵IdUrd-Einbaus als ein Maß für die Lungen-Metastasenbildung, wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den Lungen von Mäusen, denen der Tumor herausgeschnitten worden war, und den Tumor-tragenden Mäusen, die ursprünglich mit 1 × 10⁶ 3LL-Zellen beimpft worden waren, gefunden. Die Amputation von Tumoren, die nach der Beimpfung mit 1 × 10⁵ Tumorzellen produziert wurden, beschleunigte das metastasierende Wachstum dramatisch. Diese Ergebnisse stehen in Einklang mit der Überlebensrate der Mäuse nach der Entfernung der lokalen Tumoren. Das Phänomen der Beschleunigung des Metastasenwachstums nach dem Herausschneiden der lokalen Tumoren ist wiederholt beobachtet worden (siehe zum Beispiel U.S. 5,639,725 ). Diese Beobachtungen haben Auswirkungen auf die Prognose von Patienten, die eine Krebsoperation durchlaufen.
D. Experimentelle Modelle der Metastasenbildung
Die Verbindungen dieser Erfindung wurden auch auf die Hemmung der späten Metastasenbildung unter Verwendung eines experimentellen Modells zur Metastasenbildung (Crowley et al., 1993) untersucht. Die späte Metastasenbildung umfasst die Schritte der Anheftung und der zusätzlichen Gefäßbildung von Tumorzellen, die lokale Invasion, die Ausbreitung, die Teilung und die Angiogenese.
Menschliche Prostatakarzinomzellen (PC-3) wurden mit einem Reportergen transfiziert, vorzugsweise dem Gen für das Grün-fluoreszierende Protein (GFP), aber als Alternative mit Genen, die die Enzyme Chloramphenicol-Acetyl-Transferase (CAT), Luciferase oder lacZ codieren. Dies erlaubt die Verwendung eines dieser Marker (Fluoreszenz-Nachweis für GFP oder histochemischer kolorimetrischer Nachweis der Enzymaktivität), um das Schicksal dieser Zellen zu verfolgen. Die Zellen werden bevorzugt iv injiziert und die Metastasen werden nach etwa 14 Tagen identifiziert, insbesondere in den Lungen aber auch in den regionalen Lymphknoten, dem Oberschenkel und dem Gehirn. Dies bildet den Organ-Tropismus von natürlich auftretenden Metastasen des Prostatakrebses ab. Es werden zum Beispiel GFP-exprimierende PC-3-Zellen (1 × 10⁶ Zellen pro Maus) iv in die Schwanzvenen nackter (nu/nu) Mäuse injiziert. Den Tieren wird ebenfalls eine Minipumpe implantiert (subdermal auf den Rücken), die entweder die Testverbindung (mindestens etwa 100 mg/kg/Tag) oder den Träger abgibt. Die Tiere werden nach 14 Tagen eingeschläfert und ihre Organe werden für eine histologische Untersuchung präpariert. Einzelne metastatische Zellen und Wachstumsherde werden sichtbar gemacht und quantifiziert, dies erfolgt durch Fluoreszenz-Mikroskopie oder lichtmikroskopische Histochemie oder durch eine Homogenisierung des Gewebes und einen quantitativen kolorimetrischen Assay der nachweisbaren Markierung.
E. Menschliches Tumor-Xenotransplantat in Nacktmäusen
Ein bevorzugtes Modell verwendet die aggressive menschliche Brustkrebs-Zellinie MDA-MB-231. Diese Linie ist in vitro hoch invasiv und exprimiert sehr hohe Spiegel an uPA und uPAR. Trotz ihres aggressiven Phänotyps in vitro wächst diese Zelllinie wie die meisten anderen menschlichen Brustkrebs-Zelllinien schlecht und bildet, wenn sie in Nacktmäuse subcutan angeimpft wird, Metastasen nicht reproduzierbar aus. Wenn MDA-MB-231-Zellen zusammen mit Matrigel oder mit Fibroblasten in die Milchdrüsenfettpolster einer Nacktmaus angeimpft werden, werden das Tumorwachstum und die Metastasenbildung signifikant gesteigert, was zu einem nützlichen Modell führt (Price (1996) Breast Cancer Research and Treatment 39:93-102).
MDA-MB-231-Zellen, z. B. 1 × 10⁵ Zellen in 0,2 mL kaltem Matrigel werden in die Milchdrüsenfettpolster weiblicher Balb/C-(nu/nu) Mäuse angeimpft und es wird ihnen erlaubt sich anzusiedeln und für einen bestimmten Zeitraum zu wachsen, der in Abhängigkeit von der Zelldosis gewöhnlich etwa 25-30 Tage beträgt. Die Behandlung mit der Testverbindung wird durch eine IP-Injektion b.i.d, gestartet. (In dem nachfolgenden Beispiel wurden 77 mg/kg/Tag des Å6-Peptids verabreicht). Die Tiere werden 2-4 Wochen später und auf makroskopische Metastasen hin untersucht. Zusätzlich werden die primären Tumore entfernt und gewogen, und sie können zur histologischen Untersuchung in Paraffin eingebettet werden. Die Metastasen treten typischerweise in den Lymphknoten auf und werden durch Auszählung der makroskopischen Läsionen quantifiziert.
Damit eine Verbindung gemäß dieser Erfindung nützlich ist, sollte sie eine Antitumoraktivität in dem vorstehenden Modell aufweisen, wie zum Beispiel eine Blockierung der Tumor-Progression, der Angiogenese und/oder der Metastasenbildung.
Angiogenese
Die Angiogenese wird durch die Bestimmung der Mikrogefäßdichte unter Verwendung einer Immunfärbung von CD31 (auch als Thrombocyten-Endothelzellen-Adhäsionsmolekül oder PECAM bekannt) gemessen. Die Ergebnisse werden als durchschnittliche Mikrogefäßdichte in jeweils 5 Feldern von 5 unterschiedlichen Schnitten angegeben (Penfold et al., 1996). Typischerweise wird der gesamte Tumor herausgeschnitten, dann werden Schnitte angefertigt und die Schnitte werden histologisch auf die Mikrogefäßdichte unter Verwendung einer geeigneten Anfärbung oder Markierung für andere Marker untersucht. Die Bildung endothelialer Gefäße ist ein anderer Testansatz, der mit der Angiogenese in Beziehung steht, und wird in den Beispielen beschrieben.
Pharmazeutische und therapeutische Zusammensetzungen und ihre Verabreichung
Die Verbindungen, die in den Arzneimitteln der Erfindung verwendet werden können, umfassen alle diejenigen Verbindungen, die vorstehend beschrieben wurden, sowie die pharmazeutisch verträglichen Salze dieser Verbindungen. Pharmazeutisch verträgliche saure Additionssalze der Verbindungen der Erfindung, die eine basische Gruppe enthalten, werden je nach Eignung mit starken oder mit mittelstarken, nicht-toxischen, organischen oder anorganischen Säuren in Gegenwart eines basischen Amins durch Verfahren gebildet, die im Fachgebiet bekannt sind. Beispiele für die sauren Additionssalze, die in diese Erfindung mit eingeschlossen sind, sind Maleat-, Fumarat-, Lactat-, Oxalat-, Methansulfonat-, Ethansulfonat-, Benzolsulfonat-, Tartrat-, Citrat-, Hydrochlorid-, Hydrobromid-, Sulfat-, Phosphat- und Nitrat-Salze.
Pharmazeutisch verträgliche basische Additionssalze der Verbindungen der Erfindung, die eine saure Gruppe enthalten, werden durch bekannte Verfahren aus organischen und anorganischen Basen hergestellt und umfassen zum Beispiel nicht-toxische Alkalimetall- und Erdalkalimetallbasen, wie z. B. Calcium-, Natrium-, Kalium- und Ammoniumhydroxid und nicht-toxische organische Basen wie z. B. Triethylamin, Butylamin, Piperazin und Tri(hydroxymethyl)methylamin.
Wie vorstehend erwähnt, besitzen die Verbindungen der Erfindung die Fähigkeit, die Invasionsfähigkeit oder die Angiogenese zu hemmen, d. h. Eigenschaften, die bei der Behandlung von Krebs, insbesondere von metastasierendem Krebs ausgenutzt werden. Eine Zusammensetzung dieser Erfindung kann als solche aktiv sein, oder sie kann als ein „Prodrug" wirken, das in vivo in die aktive Form umgewandelt wird.
Die Verbindungen der Erfindung sowie die pharmazeutisch verträglichen Salze davon können in bequeme Dosierungsformen eingebaut werden, wie z. B. in Kapseln, imprägnierten Plättchen, Tabletten oder injizierbare Präparate. Es können feste oder flüssige pharmazeutisch verträgliche Träger verwendet werden.
Die Verbindungen der Erfindung werden bevorzugt systemisch verabreicht, z.B. durch eine Injektion. Wenn verwendet, kann die Injektion auf jedem bekannten Weg erfolgen, bevorzugt erfolgt sie intravenös, subcutan, intramuskulär, intracranial oder intraperitoneal. Die Injektionsmittel können in herkömmlichen Formen hergestellt werden, d. h. entweder als Lösungen oder als Suspensionen, sowie in einer festen Form, die für die Auflösung oder Suspendierung in einer Flüssigkeit vor der Injektion geeignet ist, oder als Emulsion.
Feste Träger umfassen Stärke, Lactose, Calciumsulfatdihydrat, Terra alba, Saccharose, Talk, Gelatine, Agar, Pektin, Gummi arabicum, Magnesiumstearat und Stearinsäure. Flüssige Träger umfassen Sirup, Erdnussöl, Olivenöl, Kochsalzlösung, Wasser, Dextrose, Glycerin und ähnliche. Ebenso kann der Träger oder das Verdünnungsmittel jedes beliebige Depot-Freisetzungsmaterial umfassen wie z. B. Glycerinmonostearat oder Glycerindistearat alleine oder mit einem Wachs. Wenn ein flüssiger Träger verwendet wird, kann das Präparat in Form eines Sirups, Elixiers, einer Emulsion, als Weichgelatinekapsel, als sterile injizierbare Flüssigkeit (z. B. als Lösung) z. B. in einer Ampulle, oder als eine wässrige oder nicht-wässrige flüssige Suspension vorliegen. Eine Zusammenstellung solcher pharmazeutischen Zusammensetzungen befindet sich zum Beispiel in Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton Pennsylvania (Gennaro, 18. Ausgabe, 1990).
Die pharmazeutischen Präparate werden unter Befolgung herkömmlicher Verfahren der pharmazeutischen Chemie hergestellt und umfassen solche Schritte wie z. B. Mischen, Granulieren und Komprimieren, wenn nötig in Tablettenform, oder Mischen, Abfüllen und Lösen der Zutaten, jeweils wie geeignet, um die gewünschten Produkte für eine orale, parenterale, örtliche, transdermale, intravaginale, intranasale, intrabronchiale, intracraniale, intraokuläre, intraaurale und rektale Verabreichung zu erhalten. Die Arzneimittel können auch kleinere Mengen an nicht- toxischen Zusatzstoffen enthalten wie z. B. Befeuchtungsmittel oder Emulsionenbildende Mittel, den pH-Wert abpuffernde Mittel, und so weiter.
Obwohl die bevorzugten Wege der Verabreichung systemisch sind, können die Arzneimittel auch örtlich oder transdermal z. B. als Salbe, Creme oder Gel; oral; rektal z. B. als Zäpfchen; parenteral durch Injektion oder kontinuierlich über Infusion; intravaginal; intranasal; intrabronchial, intracranial; intraaural oder intraokulär verabreicht werden.
Für eine örtliche Anwendung kann die Verbindung in örtlich anwendbare Vehikel wie z. B. eine Heilsalbe oder eine Salbe eingebracht werden. Der Träger für den aktiven Bestandteil kann entweder in sprühfähiger oder in nicht-sprühfähiger Form vorliegen. Nicht-sprühfähige Formen können halbfeste oder feste Formen sein, die einen Träger umfassen, der für die örtlichen Anwendung geeignet ist und eine dynamische Viskosität aufweist, die vorzugsweise höher ist als die von Wasser. Geeignete Formulierungen umfassen Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Cremes, Salben, Pulver, Einreibemittel, Heilsalben und ähnliches, sind aber nicht auf diese beschränkt. Wenn gewünscht, können diese sterilisiert oder mit Zusatzstoffen wie z. B. Konservierungsmitteln, Stabilisatoren, Befeuchtungsmitteln, Puffern oder Salzen, die den osmotischen Druck beeinflussen, und ähnlichen vermischt werden. Bevorzugte Vehikel für nicht-sprühfähige örtliche Präparate umfassen Salben-Grundstoffe, wie z. B. Polyethylenglycol-1000 (PEG-1000); herkömmliche Cremes wie z. B. die HEB-Creme; Gele; sowie Petroleum-Gelee und ähnliches.
Für eine örtliche Anwendung ebenfalls geeignet sind sprühfähige Aerosol-Präparate, in denen die Verbindung, bevorzugt in Kombination mit einem festen oder flüssigen inerten Trägermaterial, in eine Quetschflasche oder in einem Gemisch mit einem zusammengepressten, volatilen, normalerweise gasförmigen Treibmittel verpackt ist. Die Aerosol-Präparate können Lösemittel, Puffer, oberflächenaktive Mittel, Parfüme und/oder Antioxidationsmittel zusätzlich zu den Verbindungen der Erfindung enthalten.
Für die bevorzugte örtliche Anwendung wird insbesondere für Menschen bevorzugt, dass eine wirksame Menge der Verbindung an einen infizierten Bereich verabreicht wird, wie z. B. die Hautoberfläche, Schleimhaut, Augen usw. Diese Menge wird im Allgemeinen etwa 0,001 mg bis etwa 1 g pro Anwendung in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Bereich, der Schwere der Symptome und der Natur des zur örtlichen Verabreichung verwendeten Vehikels betragen.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können weiterhin einen oder mehrere Zusatzstoffe umfassen, die Anti-Tumormittel darstellen, wie z. B. Mitose-Inhibitoren wie Vinblastin; Alkylierungsmittel, wie z. B. Cyclophosphamid; Folat-Inhibitoren wie z. B. Methotrexat, Piritrexim oder Trimetrexat; Antimetaboliten wie z. B. 5-Fluoruracil und Cytosinarabinosid; interkalierende Antibiotika wie z. B. Adriamycin und Bleomycin; Enzyme oder Enzyminhibitoren wie z. B. Asparaginase; Topoisomerase-Inhibitoren wie z. B. Etoposid oder Modifikatoren biologischer Antwortreaktionen wie z. B. Interferon. Tatsächlich fallen Arzneimittel, die jedes beliebige Krebs-Therapeutikum in Kombination mit den hierin offenbarten Peptiden umfassen, in den Schutzbereich dieser Erfindung.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können auch ein oder mehrere Medikamente umfassen, bevorzugt anti-infektiöse wie z. B. antibakterielle, Anti-Pilz-, Anti-Parasiten-, antivirale und Anti-Coocidien-Mittel. Beispiele für antibakterielle Mittel umfassen zum Beispiel Sulfonamide wie Sulfamethoxazol, Sulfadiazin oder Sulfadioxin; DHFR-Inhibitoren wie Trimethoprim, Bromdiaprim oder Trimetrexat; Penicilline; Cephalosporine; Aminoglycoside; bakteriostatische Inhibitoren der Proteinsynthese; die Chinoloncarbonsäuren und ihre fusionierten Isothiazol-Analoga und ähnliche.
Andere therapeutische Zusammensetzungen
Die Verbindungen dieser Erfindung können „therapeutisch konjugiert" werden und verwendet werden, um ein therapeutisches Mittel an die Stelle, an der die Verbindungen normalerweise vorkommen und binden, zu bringen, wie z. B. an die Stellen der Tumormetastasen oder die Wachstumsherde einer Infektion oder einer Entzündung. Der Begriff „therapeutisch konjugiert" bedeutet, dass die Verbindung, vorzugsweise ein Peptid, Peptidderivat oder ein Peptidmimetikum, mit einem therapeutischen Mittel konjugiert wird. Die in dieser Weise verwendeten therapeutischen Mittel sind entweder gegen die zu Grunde liegende Ursache oder gegen die Komponenten der Prozesse der Tumorinvasion, der Angiogenese oder der Entzündung gerichtet. Beispiele für Mittel, die verwendet werden, um Entzündungen zu behandeln, sind Steroide und Nicht-Steroide enthaltende entzündungshemmende Arzneimittel, von denen viele die Synthese von Prostaglandinen hemmen.
Andere therapeutische Mittel, die an die Verbindungen gemäß den Verfahren der Erfindung gekoppelt werden können, sind Arzneistoffe, Radioisotope, Lectine und andere Toxine. Die verabreichte therapeutische Dosierung ist eine Menge, die therapeutisch wirksam ist, und wird den Fachleuten bekannt sein. Die Dosis ist abhängig von dem Alter, der Gesundheit und dem Gewicht des Empfängers, der Art begleitender Behandlungen sofern solche vorgenommen werden, der Häufigkeit der Behandlung und der Natur der gewünschten Wirkung, wie zum Beispiel einer entzündungshemmenden Wirkung oder einer antibakteriellen Wirkung.
Lectine sind Proteine, die in der Regel aus Pflanzen stammen, und die an Kohlenhydrate binden. Neben anderen Aktivitäten sind einige Lectine toxisch. Einige der am stärksten cytotoxischen Stoffe die bekannt sind, sind Proteintoxine bakteriellen und pflanzlichen Ursprungs (Frankel, A.E. et al., Ann. Rev. Med. 37:125-142 (1986)). Diese Moleküle binden an die Zelloberfläche und hemmen die zelluläre Proteinsynthese. Die am häufigsten verwendeten Pflanzentoxine sind Ricin und Abrin; die am häufigsten verwendeten bakteriellen Toxine sind Diphtherie-Toxin und das Pseudomonas-Exotoxin A. Bei Ricin und Abrin liegen die bindende und die toxische Funktion in zwei getrennten Proteinuntereinheiten vor, der A- und der B-Kette. Die B-Kette von Ricin bindet an Kohlenhydrate der Zelloberfläche und fördert die Aufnahme der A-Kette in die Zelle. Nachdem sie in der Zelle ist, hemmt die A-Kette von Ricin die Proteinsynthese durch die Inaktivierung der 60S-Untereinheit der eukaryontischen Ribosomen (Endo, Y. et al., J. Biol. Chem. 262:5908-5912 (1987)). Andere aus Pflanzen stammende Toxine, die die Ribosomen hemmende einzelkettige Proteine sind, umfassen das antivirale Pokeweed (Kermesbeere/Phytolacca)-Protein, das Weizenkeim-Protein, Gelonin, Dianthine, Momorcharine, Trichosanthin und viele andere (Strip, F. et al., FEBS Lett. 195:1-8 (1986)). Diphtherie-Toxin und das Pseudomonas-Exotoxin A sind ebenfalls einzelkettige Proteine und ihre Bindungs- und Toxizitäts-Funktion befinden sich in getrennten Domänen der gleichen Proteinkette, wobei die volle Toxin-Aktivität eine proteolytische Spaltung zwischen den beiden Domänen erfordert. Das Pseudomonas-Exotoxin A besitzt die gleiche katalytische Aktivität wie das Diphtherie-Toxin. Ricin ist therapeutisch verwendet worden, indem seine toxische α-Kette an zielgerichtete Moleküle wie z. B. an Antikörper gebunden wurde, um eine ortsspezifische Anlieferung der toxischen Wirkung zu erreichen. Bakterielle Toxine wurden ebenfalls als Anti-Tumor-Konjugate verwendet. Wie hierin beabsichtigt, wird eine toxische Peptidkette oder Domäne an eine Verbindung dieser Erfindung gebunden und in ortsspezifischer Weise an eine Zielstelle angeliefert, an der die toxische Aktivität gewünscht wird, wie z. B. an einen metastatischen Wachstumsherd. Die Konjugation von Toxinen mit Proteinen wie z. B. mit Antikörpern oder anderen Liganden ist im Fachgebiet bekannt (Olsnes, S. et al., Immunol. Today 10:291-295 (1989); Vitetta, E.S. et al., Ann. Rev. Immunol. 3:197-212 (1985)).
Beispiele für therapeutische Radioisotope, die an die Verbindung für eine Verwendung gemäß den Verfahren der Erfindung gebunden werden können, sind ¹²⁵I ¹³¹I, ⁹⁰Y, ⁶⁷Cu, ²¹⁷Bi, ²¹¹At, ²¹²Pb, ⁴⁷Sc und ¹⁰⁹Pd.
Cytotoxische Arzneistoffe, die die kritischen zellulären Prozesse einschließlich der DNA-, der RNA- und der Proteinsynthese beeinträchtigen, wurden mit Antikörpern konjugiert und anschließend für die in vivo-Therapie verwendet. Solche Arzneistoffe umfassen Daunorubicin, Doxorubicin, Methotrexat und Mitomycin C, sind aber nicht auf diese beschränkt, und sie können ebenfalls an die Verbindungen dieser Erfindung gekoppelt und in dieser Form therapeutisch angewendet werden.
Therapeutische Verfahren
Hierin beschrieben werden Verfahren zur Hemmung der zellulären Invasion, hauptsächlich durch Tumorzellen, oder der Angiogenese, die primär durch die Tumorzellen in einem Individuum induziert wird. Durch die Hemmung der Invasion der Zellen oder der Angiogenese führen die Verfahren zu einer Hemmung der Tumor-Metastasenbildung. Bei diesem Verfahren wird einem Wirbeltier-Individuum, vorzugsweise einem Säuger, noch bevorzugter einem Menschen, eine Menge der Verbindung verabreicht, die ausreicht, um die Invasion oder die Angiogenese zu hemmen. Die Verbindung oder das therapeutische verträgliche Salz davon wird bevorzugt in Form eines Arzneimittels verabreicht, wie es vorstehend beschrieben wurde.
Die Dosen der Verbindungen umfassen bevorzugt pharmazeutische Dosierungseinheiten, die eine wirksame Menge des Peptids enthalten. Mit einer wirksamen Menge ist eine Menge gemeint, die ausreicht, um eine Fließgleichgewichtskonzentration in vivo zu erreichen, die zu einer messbaren Verminderung jedes relevanten Parameters der Krankheit führt, und dies kann das Wachstum des primären oder des metastasierenden Tumors, jedes anerkannte Anzeichen für eine Entzündung, oder eine messbare Verlängerung des krankheitsfreien Zeitraums oder des Überlebens sein. So wird zum Beispiel eine Verminderung des Tumorwachstums bei 20% der Patienten als wirksam angesehen (Frei III, E., The Cancer Journal 3:127-136 (1997)). Eine Wirkung dieses Ausmaßes wird jedoch nicht als minimale Erfordernis für die wirksame Dosis gemäß dieser Erfindung angesehen.
In einer Ausführungsform ist eine wirksame Dosis mindestens gleich, bevorzugt 10-fach und noch bevorzugter 100-fach höher als die zu 50% hemmende Konzentration (IC₅₀) der Verbindung in einem in vivo-Testansatz wie er hierin beschrieben wird.
Die Menge der aktiven Verbindung, die verabreicht werden soll, ist abhängig von dem bestimmten Peptid oder dem Derivat, das gewählt wurde, sowie der Krankheit oder dem Zustand, dem Weg der Verabreichung, der Gesundheit und dem Gewicht des Empfängers, anderen gleichzeitig erfolgenden Behandlungen sofern diese vorgenommen werden, der Häufigkeit der Behandlung, der Natur der erwünschten Wirkung, wie zum Beispiel der Hemmung der Tumor-Metastasenbildung, und der Beurteilung durch einen erfahrenen Arzt.
Eine bevorzugte Dosis für die Behandlung eines Individuums, vorzugsweise eines Säugers, noch bevorzugter eines Menschen, mit einem Tumor ist eine Menge von bis zu 100 Milligramm der aktiven Verbindung pro Kilogramm Körpergewicht.
Typische Einzeldosierungen des Peptids liegen zwischen etwa 1 μg und etwa 100 mg/kg Körpergewicht. Für eine örtliche Anwendung werden Dosierungen im Bereich von etwa 0,01-20% der Konzentration der Verbindung vorgeschlagen, bevorzugt werden 1-5%. Für eine orale Verabreichung wird eine tägliche Gesamtdosierung im Bereich von etwa 10 Milligramm bis zu etwa 7 Gramm bevorzugt. Die vorstehenden Bereiche sind jedoch nur Vorschläge, da die Zahl an Variablen, die bei einem individuellen Behandlungsprotokoll berücksichtigt werden, groß ist, und es werden beträchtliche Abweichungen von diesen empfohlenen Werten erwartet.
Eine wirksame Menge oder Dosis des Peptids zur Hemmung der Invasion in vitro liegt in dem Bereich zwischen 1 Pikogramm bis etwa 0,5 Nanogramm pro Zelle. Wirksame Dosen und optimale Dosisbereiche können in vitro unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren bestimmt werden.
Die Verbindungen der Erfindung können weiterhin dadurch charakterisiert werden, dass sie eine hemmende Wirkung auf die Zellmigration und Invasion, auf die Angiogenese, auf die Tumor-Metastasenbildung oder auf entzündliche Reaktionen haben. Die Verbindungen sind besonders nützlich, um eine Anti-Tumor-Wirkung in einem Säuger, bevorzugt einem Menschen, zu bewirken, der einen Tumor trägt.
Die vorstehenden Zusammensetzungen und Behandlungsverfahren sind nützlich für die Hemmung der Zellmigration und Invasion oder der durch Migration induzierten Zellteilung in einem Individuum, das eine Krankheit oder einen Zustand aufweist, die/der mit einer unerwünschten Zellinvasion, einer Migrations-induzierten Zellteilung, der Angiogenese oder der Metastasenbildung assoziiert ist. Solche Krankheiten oder Zustände können das primäre Wachstum oder feste Tumore oder Leukämien und Lymphome, die Metastasenbildung, die Invasion und/oder das Wachstum von Tumormetastasen, Atherosklerose, Myokard-Angiogenese, vaskuläre Restenose nach Ballon-Angioplastik, Bildung von Neointima nach vaskulärer Verletzung, Restenose in transplantierten Gefäßen, Bildung von kollateralen Herzkranzgefäßen, tiefe Venenthrombose, ischämische Angiogenese der Extremitäten, Telangiektasie, pyogenes Granulom, Erkrankungen der Hornhaut, Rubeose, neovaskuläres Glaukom, diabetische und andere Retinopathien, retrolentale Fibroplasie, diabetische Neugefäßbildung Makuladegeneration, Endometriose, Arthitis, mit chronischen entzündlichen Zuständen assoziierte Fibrose einschließlich Psoriasis, Skleroderm, Lungenfibrose, durch Chemotherapie induzierte Fibrose, Wundheilung mit Narbenbidung und Fibrose, peptische Geschwüre, Brüche, Keloide und Störungen der Gefäßbildung, Hämatopoiese, Ovulation, Menstruation, Schwangerschaft und Plazentation oder jede beliebige andere Krankheit oder Zustand umfassen, in der/dem die Invasion oder die Angiogenese pathogen ist.
Nachdem nun die Erfindung allgemein beschrieben wurde, wird sie durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele leichter verstanden werden, die für erläuternde Zwecke bereitgestellt werden und von denen nicht beabsichtigt wird, dass sie die vorliegende Erfindung einschränken, sofern dies nicht spezifiziert wird.
BEISPIEL I
Synthese von Acetyl-Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-NH₂
Das Ausgangsmaterial war ein p-Methyl-benzhydrylamin-Harz, das zu einem Grad von 0,70 mEq pro Gramm Harz substituiert war. Jede der L-Aminosäuren, beginnend mit Glutaminsäure, wurde der Reihe nach in einem Synthesezyklus, der aus den drei Schritten der Entfernung der Schutzgruppe mit TFA, der Kopplung und des Anhängens der Cap-Struktur bestand, angefügt. Das fertig gestellte Peptid wurde einer Abspaltung mit HF unterworfen und dann gereinigt.
1. Entfernung der Schutzgruppe mit TFA
Das Ausgangsharz wurde vor der Zugabe der ersten Glutaminsäure konditioniert oder, im Falle von nachfolgenden Zyklen, wurde die BOC-Schutzgruppe von dem α-Amino-Stickstoff des Ausgangsmaterials durch eine Behandlung des Harzes mit 50% Trifluoressigsäure (TFA) in Dichlormethan (DCM) (zwei oder Volumina pro Harzvolumen) entfernt. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt und dann abgegossen. Dann wurde das Harz einmal eine Minute mit dem gleichen Volumen Isopropanol gewaschen und zweimal mit dem gleichen Volumen Methanol gewaschen, wobei jede Waschung eine Minute in Anspruch nahm.
2. Kopplung
Das von Schutzgruppen befreite Harz wurde zweimal mit dem gleichen Volumen 10% Triethylamin in DCM gewaschen, wobei jede Waschung über eine Minute erfolgte, dann zweimal mit dem gleichen Volumen Methanol gewaschen, wobei jede Waschung eine Minute in Anspruch nahm, und dann zweimal mit dem gleichen Volumen DCM gewaschen, wobei jede Waschung eine Minute in Anspruch nahm. Die mit BOC geschützte Aminosäure (drei Äquivalente, gelöst in DCM oder in einem Gemisch aus DCM und N,N'-Dimethylformamid (DMF)) und 1-Hydroxybenztriazol (1 M Lösung in DMF, drei Äquivalente) wurden dem Harz zugegeben, und das Gemisch wurde einige Sekunden gerührt.
Dann wurde Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (1 M Lösung in DCM, drei Äquivalente) zugegeben und das gesamte Gemisch wurde 60-120 Minuten gerührt. Das Harz wurde zweimal mit dem gleichen Volumen Methanol und dann zweimal mit dem gleichen Volumen DCM gewaschen. Eine kleine Probe wurde für einen Ninhydrin-Test entnommen, um die Vollständigkeit der Kopplung zu untersuchen. Wenn sie nicht vollständig ist, wird im Allgemeinen der Kopplungsschritt 2 wiederholt. Wenn sie vollständig ist, wird mit Schritt 3, dem Anhängen der Cap-Struktur, fortgefahren.

Alle Aminosäuren wurden als α-BOC-Derivate verwendet. Die Schutzgruppen der Nebenketten waren folgende:

Aminosäure	Schutzgruppe
Histidin	Benzyloxmethyl
Asparagin	Xanthyl
Glutamin	Xanthyl
Serin	O-Benzyl
Threonin	O-Benzyl
Lysin	2-Brom-Z
Tyrosin	2-Chlor-Z
Glutaminsäure	Cyclohexyl
Asparaginsäure	Cyclohexyl

3. Anhängen der Cap-Struktur
Das Harz wurde mit dem gleichen Volumen an Essigsäureanhydrid (20% Lösung in DCM) 5 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt. Dann wurde das Harz zweimal mit dem gleichen Volumen Methanol gewaschen und anschließend zweimal mit dem gleichen Volumen DCM gewaschen.
4. Abspaltung mit HF
Das Harz, das die gewünschte Aminosäuresequenz trug (1,0 Gramm), wurde in ein Teflon-Reaktionsgefäß platziert, und es wurde wasserfreies Anisol (1 mL) zugegeben. Das Gefäß wurde mit flüssigem Stickstoff gekühlt und es wurde wasserfreies HF (10 mL) in das Gefäß destilliert. Die Temperatur wurde mit Eiswasser auf 0°C erhöht. Das Gemisch wurde bei dieser Temperatur eine Stunde gerührt und dann wurde das HF bei 0°C abdestilliert. Der Rest wurde mit wasserfreiem Ether gewaschen und das Peptid wurde mit einem 1:1-Gemisch von CH₃CN:H₂O extrahiert.
5. Reinigung
Das gefriergetrocknete Pulver wurde in 0,1 % TFA-Puffer gelöst und auf eine präparative C18-Säule von Waters (2 Zoll Durchmesser, 15-20 μm Partikelgröße, 300Å Porengröße) aufgetragen. Die beladene Säule wurde mit einem Zwei-Komponenten-Elutionsmittel eluiert, das als ein linearer Gradient aufgetragen wurde, beginnend mit 0% Lösung A in Lösung B und endend mit 40% Lösung A in Lösung B. Lösung A war 0,1 % TFA in H₂O und Lösung B war 0,1 % TFA in CH₃CN. Fraktionen, die eine Reinheit aufwiesen, die gleich oder besser wie gewünscht war, wurden vereinigt und gefriergetrocknet, um das gereinigte Endprodukt in das Trifluoressigsäuresalz umzuwandeln.
Beispiel II
Anti-invasive Aktivität von KPSSPPEE mit Cap-Struktur und verwandten Peptiden
Mehrere Peptide wurde auf ihre anti-invasive Kapazität mit dem Matrigel^®-Invasionsassy-System wie vorstehend angegeben untersucht (Kleinman et al., vorstehend; Parish et al., vorstehend).
Es wurden Zellen der Ratten-Brustkrebs-Linie Mat BIII und der menschlichen Prostatakrebs-Linie PC-3 verwendet. Tumorzellen (5 × 10⁵/mL in einem Volumen von 200 μL) in serumfreiem RPMI-1640-Medium wurden in eine einmal verwendbare Transwell-Invasionskammer, die mit Matrigel^® (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) beschichtet war, gegeben. Die Invasionskammern wurden in Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen gestellt, die mit serumfreiem RPMI-1640 gefüllt waren, und die Platten wurden in einer Atmosphäre mit 5% CO₂ in befeuchteter Luft bei 37°C für 48-72 Stunden gehalten. Dann wurden die Kammern entfernt und umgedreht, und die Zellen, die eingewandert waren (und sich nun auf der Bodenfläche der Invasionskammer befanden) wurden fixiert und unter Verwendung von Diff-Quik^® (Scientific Products) angefärbt. Die Zellen wurden in 10 unterschiedlichen Feldern auf jedem Filter gezählt und es wurde ein Durchschnittswert ermittelt. Typischerweise wurden 3-5 Replika-Tests bei jeder Konzentration der untersuchten Verbindung durchgeführt.
Wie in 1 gezeigt, hemmte das Octapeptid Ac-KPSSPPEE-Am mit Cap-Struktur (auch als Å6 bezeichnet) die Invasion sowohl der Ratten- als auch der menschlichen Tumorzelllinien. Dieses Peptid war für die Zellen weder cytotoxisch noch hemmte es die Zellteilung. Daher ist die beobachtete Wirkung keine Nebenwirkung der Cytotoxizität und kann einem Wirkungsmechanismus zugeschrieben werden, der sich von dem cytotoxischer oder cytostatischer Mittel unterscheidet.
Die Untersuchungen wurden ebenfalls mit kürzeren, verwandten Peptiden mit Cap-Struktur durchgeführt, die die Sequenz Ac-PSSPPEE-Am (eine Deletionsvariante der SEQ ID NO: 2, der das N-terminale Lys fehlt) und Ac-KPSSPPE-Am (eine Deletionsvariante der SEQ ID NO: 2, der einer der beiden C-terminalen Glu-Reste fehlt) besaßen. Ebenfalls untersucht wurde ein ähnliches längeres Peptid: KPSSPPEELK (SEQ ID NO: 1) (Blasi et al., U.S. 5,416,006 ) und sein Gegenstück mit Cap-Struktur Ac-KPSSPPEELK-Am.
Es ist bemerkenswert, dass alle anderen Peptide außer Ac-KPSSPPEE-Am wenig oder keine Aktivität bei diesem Assay zeigten, was bedeutet, dass die SEQ ID NO: 2 die minimal erforderliche Größe für die Aktivität aufweist (2). Die Ergebnisse weisen auch darauf hin, dass die Hinzufügung von Leu und Lys an den C-Terminus von KPSSPPEE dessen biologische Aktivität aufhebt und zwar unabhängig davon, ob die Enden eine Cap-Struktur enthalten oder nicht.
Die weiteren Ergebnisse für die als Å13 (KPSSPPEE, ohne Cap-Struktur), Å14 (Ac-KPPSSPPEEL-Am) und Å15 (GGKPPSSPPEE-Am, nur am C-Terminus mit Cap-Struktur) bezeichneten Peptide werden in 3 gezeigt. Weder Å13 noch Å14 waren hemmend, wohingegen Å15 bei der höheren untersuchten Konzentration eine geringe Aktivität aufwies.
Beispiel III
Hemmung der Proliferation und der Migration von Endothelzellen
Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um die Aktivität des Peptid Å6 als Inhibitor der Zellproliferation und der Migration in vitro zu bewerten. Solche Assayformate können entweder für Tumorzellen oder für Endothelzellen verwendet werden. In diesem Fall wurden Zellen (20.000 pro Vertiefung) in einer Platte mit 24 Vertiefungen ausgesät. Das Zellwachstum kann durch Verwendung von Serum, Cytokinen oder Matrixkomponenten, mit denen die Platten vor der Zugabe der Zellen beschichtet werden, stimuliert werden. Alle Zellproliferationsassays werden während der logarithmischen Wachstumsphase (typischerweise <70% konfluente Zellen) durchgeführt, die durch die Bestimmung von Wachstumskurven für jede Zelllinie ermittelt wird. Das typische Volumen in jeder Vertiefung beträgt 0,5 mL und dieses Medium wird alle 48 Stunden ausgetauscht (einschließlich dem Austausch des jeweils untersuchten Inhibitors). Nach Beendigung des Assays wird jede Vertiefung 3 × mit PBS (0,5 mL pro Vertiefung für 5 Minuten) gewaschen und die Zellzahl wird unter Verwendung eines kolorimetrischen Assays wie z. B. des MTS-Assays (Promega) oder CyQuant (Pierce) nach den Angaben des Herstellers bestimmt. Jede Bedingung (Inhibitor-Konzentration, Tag des Assays, usw.) wird dreimal ausgetestet und der Mittelwert aus drei Vertiefungen wird angegeben.
Bei dieser Untersuchung wurden die Zellen mit 2 ng/ml des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors (bFGF) stimuliert. Die in 4 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass Å6 ein potenter Inhibitor der Zellproliferation ist.
Die Migrations-Assays waren ähnlich denjenigen, die in dem vorstehenden Beispiel II beschrieben wurden. Transwell-Invasionskammern (Costar, 8 μm Porengröße) wurden mit Typ I-Collagen (50 μg/mL) durch Zugabe von 200 μL Collagenlösung pro Transwell-Invasionskammer beschichtet und dann über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Transwell-Invasionskammern wurden in eine Platte mit 24 Vertiefungen gestellt und es wurde ein Chemoattraktionsmittel, in diesem Falle der bFGF, der Bodenkammer in einem Gesamtvolumen von 0,8 mL in F12K-Medium, das mit 10% FBS und Antibiotika ergänzt worden war, zugegeben. Dies ist das geeignete Medium für menschliche vaskuläre Endothelzellen, kann aber für andere Zellarten variiert werden. Endothelzellen, die von einer Monolayer-Kultur unter Verwendung von Trypsin abgelöst worden waren, wurden mit serumfreiem Medium auf eine Endkonzentration von 1 × 10⁶ Zellen/mL verdünnt, und 0,2 mL dieser Zellsuspension wurde der oberen Kammer jeder Transwell-Invasionskammer zugegeben. Die Test-Inhibitoren, das Å6-Peptid, wurden sowohl der oberen als auch der unteren Kammer zugegeben und die Migration wurde 5 Stunden in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37°C ablaufen lassen. Die Transwell-Invasionskammern wurden von der Platte entfernt und die obere Kammer wurde mit einem Baumwolltupfer sauber gewischt. Der oberen Kammer wurde für 5 Minuten ein Fixiermittel zugegeben, daraufhin erfolgten Waschungen (3 × 5 Minuten pro Waschung) mit PBS. Die Zellen wurden mit Toluidinblau angefärbt und unter starker Vergrößerung (400 ×) gezählt, um die Zahl an migrierten/eingewanderten Zellen zu bestimmen.
Die Ergebnisse (5) zeigen, dass, verglichen mit der bFGF-Kontrolle, die Zugabe von Å6 in Konzentrationen zwischen 1 und 1000 μM eine Hemmung der Migration von 20-80% verursachte.
Beispiel IV
Hemmung der Angiogenese in vivo durch KPSSPPEE mit Cap-Struktur (das Å6-Peptid) und verwandte Verbindungen
Die Angiogenese, die durch Tumorwachstum und Metastasenbildung in vivo induziert wird, wurde in den vorstehend beschriebenen Modellsystemen untersucht. Mäuse, denen 3LL-Zellen injiziert worden waren, wurden entweder mit dem Peptid oder mit dem Träger behandelt und zu verschiedenen Zeitpunkten getötet. Die Angiogenese wird durch die Bestimmung der Mikrogefäßdichte (MGD) unter Verwendung eines Antikörpers, der für das mikrovaskuläre Endothel spezifisch ist, oder anderen Markern für wachsende Blutgefäße wie z. B. PECAM (CD31) untersucht. Ein solcher Antikörper wird bei den üblichen immunhistologischen Verfahren verwendet, um Gewebeschnitte immunologisch anzufärben wie durch Penfold et al., vorstehend, beschrieben wird. Eine große Zahl dieser Antikörper ist kommerziell erhältlich, wie zum Beispiel der mAk JC70. Die MGD wird mit anderen Messwerten für das Tumorverhalten korreliert, einschließlich des Zustandes der Lymphknoten und der primären Tumorgröße sowie der Wachstumsrate. Wie durch Penfold et al., vorstehend, beschrieben wird, korreliert in Menschen die Tumor-MGD mit der Metastasenbildung in den Lymphknoten und ist von der Tumorgröße, der Wachstumsrate oder der Art der histologischen Differenzierung unabhängig. Nur die MGD zeigte eine signifikante Assoziation bei der Metastasenbildung in den Lymphknoten.
Die Verbindungen werden i.v., i.p. oder über eine osmotische Minipumpe verabreicht. Typische Dosierungen betragen 100-250 mg/kg/Tag. Zu verschiedenen Zeitpunkten werden zwei Tiere getötet und das Tumorgewebe und das umgebende Gewebe werden für eine histologische Untersuchung präpariert. Die Ergebnisse werden als die durchschnittliche Mikrogefäßdichte von jeweils 5 Feldern von 5 unterschiedlichen Schnitten angegeben. Es wurden die folgenden Verbindungen untersucht: Ac-KPSSPPEE-Am (SEQ ID NO. 2), Ac-KPTTPPEE-Am (Disubstitutionsvariante an den Positionen 3 und 4), Ac-KPSSPPDD-Am (Disubstitutionsvariante an den Positionen 7 und 8), Ac-RPSSPPEE-Am (Substitutionsvariante an Position 1), Ac-PSSPPEE-Am (Deletionsvariante, Position 1 der SEQ ID NO: 2 deletiert), Ac-KPSSPPE-Am (Deletionsvariante, Position 8 der SEQ ID NO: 2 deletiert) und Ac-KPPSSPPEELK-Am (SEQ ID NO: 1).
Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten. In den Ratten, die mit Ac-KPSSPPEE-Am, Ac-KPTTPPEE-Am, Ac-KPSSPPDD-Am und Ac-RPSSPPEE-Am behandelt worden waren, gibt es eine signifikante Verminderung der Zahl der Mikrogefäße in der Region des primären Tumors an der subcutanen Impfstelle im Vergleich zu den Kontrollen. Die Peptide Ac-PSSPPEE-Am, Ac-KPSSPPE-Am und Ac-KPPSSPPEELK-Am hatten keine signifikante Auswirkung auf die Angiogenese. Daher besitzen die vier angegebenen Verbindungen eine anti-angiogene Aktivität, die zumindest zum Teil für ihre Wirksamkeit als Antitumormittel verantwortlich ist.
Beispiel V
Die Hemmung des Tumorwachstums und der Metastasenbildung in vivo durch KPSSPPEE mit Cap-Struktur (das Å6-Peptid) und verwandte Verbindungen
Das syngene Ratten-Brustkrebs-System verwendet Mat BIII-Ratten-Brustkrebszellen. 1 × 10⁶ Tumorzellen, die in 0,1 mL PBS suspendiert vorlagen, wurden in die Milchdrüsenfettpolster 10 weiblicher Fisher-Ratten angeimpft. Zum Zeitpunkt des Beimpfens wurde eine osmotische 14-Tage-Alza-Minipumpe intraperitoneal qimplantiert, um das Peptid zu liefern. Das Peptid wird in PBS gelöst (200 mM Stammlösung), dann sterilfiltriert und in die Minipumpe gefüllt, um eine Abgaberate von etwa 100 mg/kg/Tag zu erreichen. Kontrolltiere erhalten den Träger (PBS) alleine in der Minipumpe. Die Tiere werden am Tag 14 eingeschläfert.
In der vorliegenden Untersuchung wurden Mat BIII-Zellen (Xing und Rabbani, 1996) (1 × 10⁵ Zellen in 0,2 mL sterilem PBS) in die Milchdrüsenfettpolster weiblicher Fisher-Ratten angeimpft. Å6 wurde über eine kontinuierliche Infusion unter Verwendung der chirurgisch implantierten Minipumpe oder in einem zweiten Experiment übler eine IP-Verabreichung angeliefert. Die Gesamtdosis (77 mg/kg/Tag) war bei beiden Studien identisch, obwohl bei der IP-Studie die Tiere nur eine Hälfte der Gesamtdosis bei jeder IP-Injektion b.i.d. erhielten. Die Ratten wurden am Tag 15 eingeschläfert und auf makroskopische Metastasen hin untersucht. Diese Metastasen sowie die Tumore, die sich aus der ersten Aussetzung ergaben, wurden in Paraffin eingebettet, und es wurden Schnitte für eine histologische und immunhistochemische Analyse hergestellt. Tumore, die von der primären Aussetzung herrührten, wurden unter Verwendung eines Tastzirkels/greifers bewertet und die Metastasen wurden durch einfaches Auszählen bewertet.
Die Ergebnisse des primären Tumorwachstums werden in 6 gezeigt. Das Å6-Peptid führte zu einer hoch signifikanten Hemmung des lokalen Wachstums des Brusttumors, wie man zu drei Zeitpunkten sehen kann. 7 zeigt, dass die Ausbreitung des Tumors zu den Lymphknoten durch das Peptid vollständig gehemmt wurde.
Die histologische Analyse zeigte, dass die Behandlung mit Å6 eine massive Apoptose der Tumorzellen induzierte, vermutlich über einen anti-angiogenen Wirkmechanismus, der den Tumorzellen überlebenswichtige Faktoren entzieht, indem er die Bildung neuer Gefäße hemmt. Dies wird durch die Tatsache unterstützt, dass das Å6-Peptid weder cytotoxisch ist noch dass es die Apoptose in Tumorzellen in vitro induzieren kann.
Bei anderen Untersuchungen werden die folgenden Ergebnisse erwartet. Bei Ratten, die mit Ac-KPSSPPEE-Am, Ac-KPTTPPEE-Am, Ac-KPSSPPDD-Am und Ac-RPSSPPEE-Am behandelt werden, erfolgt eine signifikante Verminderung der Größe des primären Tumors und der Zahl an Metastasen in Milz, Lunge, Leber, Niere und Lymphknoten (spezifiziert als diskrete Wachstumsherde). Bei einer histologischen und immunhistochemischen Analyse wird beobachtet, dass in den behandelten Tieren eine verstärkte Nekrose und Zeichen für eine Apoptose vorliegen. In den Tumorbereichen, in denen keine Bildung neuer Gefäße erfolgt, werden große nekrotische Bereiche beobachtet.
Im Gegensatz dazu, verursacht die Behandlung mit den Peptiden Ac-PSSPPEE-Am, Ac-KPSSPPE-Am und Ac-KPPSSPPEELK-Am keine signifikante Veränderung der Tumorgröße oder der Metastasenbildung.
Beispiel VI
Hemmung des Wachstums und der Metastasenbildung von xenotransplantierten menschlichen Tumorzellen
Unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Modells (siehe auch Price, vorstehend) wurden MDA-MB-231-Zellen (1 × 10⁵ Zellen in 0,2 mL kaltem Matrigel) in die Milchdrüsenfettpolster weiblicher Balb/C-(nu/nu) Mäuse angeimpft. Den Tumorzellen wurde für 27 Tage erlaubt sich anzusiedeln und zu wachsen. Am Tag 28 wurde mit der Behandlung mit dem Å6-Peptid begonnen. Das Peptid wurde b.i.d über eine IP-Injektion in einer Dosierung von 75 mg/kg/Tag verabreicht. Das Wachstum des primären Tumors wurde alle 2 Tage gemessen. Die Mäuse wurden am Tag 50 eingeschläfert und auf makroskopische Metastasen hin untersucht. Die primären Tumore wurden entfernt und gewogen und dann für eine histologische Bewertung in Paraffin eingebettet. Metastasen wurden in den Lymphknoten beobachtet und durch Zählung der makroskopischen Läsionen quantifiziert.
Die Ergebnisse werden in den 8 und 9 gezeigt. Das Å6-Peptid war beim Stoppen des Wachstums dieser aggressiven Tumorzellen hoch wirksam ( 8). Die mit dem Å6-Peptid behandelten Mäuse besaßen keine makroskopischen Metastasen an jeder untersuchten Stelle. Die Quantifizierung der Lymphknoten-Metastasen wird in 9 gezeigt.
Wie bei dem Rattenmodell zeigte die histologische Analyse, dass die Behandlung mit Å6 eine massive Apoptose von Tumorzellen induzierte, die durch einen anti-angiogenen Mechanismus vermittelt worden war.
Somit folgern wir, dass das Peptid Ac-KPSSPPEE-Am ein potentes Antikrebsmittel auf der Ebene des primären Tumors darstellt und, für menschliche Individuen noch wichtiger, die Entwicklung von Metastasen unterdrückt.
Beispiel VIII
Hemmung der experimentellen Metastasenbildung von Tumorzellen in vivo
Die in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Peptidverbindungen werden auf ihre Wirksamkeit in vivo in dem 3LL-Modell (ebenfalls vorstehend beschrieben) untersucht.
In einem anderen Modell werden PC3-Zellen mit dem Gen, das das Enzym Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) codiert, in Mäuse i.v. in Dosen von 1 × 10⁶ Zellen pro Maus angeimpft. Diesen Mäusen wird wie vorstehend eine Minipumpe implantiert, die 100 mg/kg/Tag des Peptids oder des Trägers über einen Zeitraum von 14 oder 21 Tagen abgibt. Am Ende der Behandlung werden die Tieren eingeschläfert und die Tumormarkersonde wird in den regionalen Lymphknoten, den Oberschenkelknochen, der Lunge und dem Gehirn untersucht.
Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten. In den Mäusen, die mit Ac-KPSSPPEE-Am, Ac-KPTTPPEE-Am, Ac-KPSSPPDD-Am und Ac-RPSSPPEE-Am behandelt worden waren, war die Metastasenbildung deutlich gehemmt. Diese Ergebnisse zeigen, dass diese Verbindungen den Vorgang der Metastasenbildung beeinträchtigen. Im Gegensatz dazu weisen die Mäuse, die mit den Peptiden Ac-PSSPPEE-Am, Ac-KPSSPPE-Am und Ac-KPPSSPPEELK-Am behandelt worden waren, keine Verminderung der Metastasen auf.
Beispiel IX
Das Å6-Peptid hemmt die endotheliale Gefäßbildung in vitro
Für diesen Testansatz wurde Matrigel (0,375 mg/mL; 250 μL/Vertiefung) einer Gewebekulturplatte mit 24 Vertiefungen zugegeben und 30 Min. bei 37°C gelieren lassen. Dann wurden diesen beschichteten Vertiefungen Endothelzellen in einer Menge von 20.000 Zellen/Vertiefung in F12K/10% FBS/Antibiotika-Medium (siehe vorstehend) zugegeben. Bestimmten Testvertiefungen wurde ein angiogenes Stimulationsmittel, in diesem Falle der bFGF, zugegeben. Die Verbindung, die auf ihre hemmende Aktivität hin untersucht werden soll, wird zum Zeitpunkt 0 zugegeben oder kann zu einem beliebigen Zeitpunkt danach zugegeben werden. Das Medium und die Inhibitoren werden alle 24 Stunden ausgetauscht, wenn der Test länger dauert. Die Gefäßbildung wurde durch Messung der Gesamtgefäßlänge in jeder Vertiefung unter Verwendung eines mikroskopischen Nachweises quantifiziert.
Die Ergebnisse zeigen, dass das Å6-Peptid die endotheliale Gefäßbildung signifikant blockierte und ebenfalls den Zerfall bereit gebildeter Gefäße förderte. Dies ist ein weiterer Beweis für die Potenz dieses Peptids und der anderen Peptide dieser Erfindung als anti-angiogene Mittel.
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Nachdem diese Erfindung nun vollständig beschrieben ist, wird durch Fachleute erkannt werden, dass das Gleiche innerhalb eines breiten Bereichs äquivalenter Parameter, Konzentrationen und Bedingungen durchgeführt werden kann, ohne von dem Geist und dem Schutzbereich der Erfindung abzuweichen und auch ohne übermäßiges Experimentieren.
Obwohl diese Erfindung in Verbindung mit spezifischen Ausführungsformen beschrieben wurde, ist verständlich, dass sie zu weiteren Modifizierungen in der Lage ist. Diese Anmeldung beabsichtigt alle Variationen, Anwendungen oder Anpassungen der Erfindung abzudecken, die im Allgemeinen den Prinzipien der Erfindung folgen, und sie umfasst auch solche Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung, wie sie innerhalb der bekannten oder der üblichen Praxis im Fachgebiet, zu dem die Erfindung gehört, vorkommen und wie sie auf die wesentlichen Eigenschaften, die hierin vorstehend angeführt wurden, angewendet werden können, gemäß dem Schutzbereich der angehängten Ansprüche.

Claims

Nicht natürlich vorkommendes Peptid, das aus der Sequenz Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu (SEQ ID NO: 2) besteht, welches am N-Terminus und/oder am C-Terminus mit einer Cap-Struktur versehen ist, wobei das Peptid eine oder mehrere der folgenden Aktivitäten aufweist: (a) wenigstens etwa 20% der biologischen Aktivität von Ac-Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-Am in einem oder mehreren der folgenden in vitro-Bioassays: (i) Invasion in einem Matrigel^®-Assay; (ii) Bildung endothelialer Gefäße auf Matrigel^®, oder (iii) Bildung endothelialer Gefäße auf einer Fibrin-Matrix in Gegenwart von basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor und vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor; oder (b) es konkurriert mit markiertem Ac-Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-Am um die Bindung an eine Zelle oder ein Molekül, das eine Bindungsstelle für Ac-Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-Am aufweist.
Peptid nach Anspruch 1, welches am Amino-Terminus acetyliert und am Carboxy-Terminus amidiert ist.
Peptid nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Peptid markiert ist.
Peptid nach Anspruch 3, wobei die Markierung ausgewählt ist aus einer radioaktiven, fluorogenen, chromogenen oder anderen chemischen Markierung.
Peptid nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Peptid mit einem therapeutischen Mittel konjugiert ist.
Arzneimittel, welches das Peptid nach einem der vorangegangenen Ansprüche umfasst.