DE69835885T2

DE69835885T2 - Immunomodulatorische Mittel aus Calliphora vicina Larven, deren Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE69835885T2
Application number: DE69835885T
Authority: DE
Inventors: Sergey I. Chernysh; German Bekker; Soo In Kim
Original assignee: Entopharm Co Ltd
Current assignee: BIOMEDICAL LTD., MOSKAU/MOSKVA, RU
Priority date: 1998-12-02
Filing date: 1998-12-02
Publication date: 2007-01-11
Anticipated expiration: 2018-12-03
Also published as: US6337093B1; EP1006124A1; DE69835885D1; EP1006124B1; US20020015738A1; ATE339443T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft immunmodulatorische Materialien, die von Wirbellosen stammen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung, die eine Peptidmischung von Wirbellosen enthält, zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten, die nützlich sind zur Behandlung von Immunmangelzuständen, Vireninfektionen und onkologischen Krankheiten.
Im Stand der Technik sind verschiedene pharmazeutische Präparate natürlichen Ursprungs, die extraktive Materialien aus Tier- und Pflanzengeweben enthalten, die die Wirksamkeit des Immunsystems stimulieren können und auch pathogene Mikroorganismen direkt töten können, bekannt.
Ein Verfahren, um zelluläres Protein mit Anti-HIV-Aktivität aus CD4-positiven T-Zellen oder myeloische Zellen zu erhalten, wird in US 5 480 782 offenbart.
Ein topisches Präparat mit einem Gingko-biloba-Extrakt, das antibakterielle und antivirale Eigenschaften aufweist, wird in DE 43 34 600 A1 offenbart.
WO 96/04005 offenbart eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Stimulierung der Immunantwort eines Organismus, die als aktiven Inhaltsstoff Antigene des Haupthistokompatibilitätskomplexes enthält, die aus Tiergeweben, Serum oder Zellen extrahiert wurden. Die Gewebe, Zellen oder Seren werden ausgewählt aus Ziegen-, Kälber- oder Schweineleber und roten Blutkörperchen vom Rind.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Extrakt der Pflanze Nigella sativa enthält, wird in US 5 482 711 zur Behandlung von Krebs offenbart, wobei die Nebenwirkungen der Antikrebschemotherapie vermieden werden und die Immunfunktionen bei Menschen verstärkt werden.
Es ist aus der wissenschaftlichen Literatur bekannt, dass Insektengewebe auch antimikrobielle Proteine und Peptide enthalten (J.P. Gillespie, M.R. Kanost und T. Trenczek, Biological mediators of insect immunity. Annu. Rev. Entomol., 1997, 42, 611–643; J.A. Hoffmann und J-M. Reichhart, Drosophila immunity Trends in Cell Biology, 1997, 7, 309–316). Diese Materialien besitzen eine direkte Toxizität für Bakterien und Pilze.
EP-A 0 320 528 offenbart die Isolierung von Hämocyanin oder Arylphorin aus dem Blut verschiedener Tiere, wobei unter anderem Calliphora erythrocephala erwähnt wird.
WO 81/03124 betrifft die Verwendung von speziellen Polypeptidfraktionen, die aus Muscheln isoliert werden können, insbesondere aus Mytilus-Arten, wie Blue mussel (Mytilus edulis) als Wirkstoff.
WO 90/14098 betrifft bakterizide und/oder bakteriostatische Peptide, die aus der Hämolymphe von Coleoptera-Insekten isoliert werden, bevorzugt von Tenebrio molitor und Leptinotarsa decemlineata.
Chernysh et al. (J. Insect Physiol., 1996, 42, 81–89) beschreiben, dass ein Belastungstest mit Bakterien das Auftreten einer starken antibakteriellen Aktivität in zellfreier Hämolymphe von ausgewachsenen Palomena prasina (Hemiptera) induziert.
Die oben erwähnten Präparate und analoge natürliche pharmazeutische Präparate verstärken das neuere Arsenal von Arzneimitteln, die zur Behandlung von Immunmangelzuständen, Infektionen und onkologischen Krankheiten geeignet sind. Die Pharmazeutika, die bis heute verfügbar sind, erfüllen jedoch nicht bestehende Anforderungen an immunmodulierende Arzneimittel.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine pharmazeutische Zusammensetzung verfügbar zu machen, die zur Behandlung von Immunmangelzuständen, Vireninfektionen und onkologischen Krankheiten nützlich ist.
Von S. Chernysh et al. (Eur. J. Entomol., 1995, 92, 203–209) ist bekannt, dass die Hämolymphe von mit Bakterien beaufschlagten Larven von Calliphora vicina eine antibakterielle Aktivität, insbesondere Anti-Gramnegative und Anti-Gram-positive Aktivität zeigt.
Es wurde gefunden, dass Zusammensetzungen, die ein Peptid oder eine Peptidmischung von Wirbellosen und insbesondere von Insekten enthalten, eine immunmodulatorische Aktivität zeigen. Die vorliegende Erfindung betrifft daher die Verwendung einer Zusammensetzung, die eine Peptidmischung enthält, die herstellbar ist mit einem Verfahren, das die Stufen aufweist, dass (A) ein wirbelloses Tier septisch verletzt wird und (B) die Hämolymphe des wirbellosen Tiers gesammelt, zentrifugiert und chromatographisch aufgetrennt wird, wobei das wirbellose Tier eine Calliphora-vicina-Larve ist, zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Behandlung oder Verhütung eines Immunmangelzustands.
Die Zusammensetzungen, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden, enthalten eine Peptidmischung. Der Ausdruck "Peptid" bezieht sich hier auf Oligo- und Polypeptide ebenso wie auf Proteine. Es wird angenommen, dass die Peptide das aktive Prinzip in den pharmazeutischen Präparaten sind, die aus diesen Zusammensetzungen hergestellt werden. Nichtsdestotrotz können die Zusammensetzungen weitere Komponenten enthalten, die jedoch das aktive Prinzip nicht stören sollten, um nützliche pharmazeutische Präparate zu erhalten.
Die Zusammensetzungen, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden, sind herstellbar mit einem Verfahren, das die Stufen aufweist, dass (A) ein wirbelloses Tier septisch verletzt wird und (B) die Hämolymphe eines wirbellosen Tiers gesammelt, zentrifugiert und getrennt wird, wobei das wirbellose Tier eine Calliphoravicina-Larve ist. Der Abtrennungsschritt kann z.B. ausgeführt werden unter Verwendung einer Chromatographiesäule, wie einer Sep-Pak-C18-Chromatographiesäule, die von Waters Co. erhältlich ist, aber andere Trennmethoden können auch verwendet werden. Falls erwünscht, können sich weitere Reinigungs- und Konzentrationsstufen, wie eine Lyophilisierung, anschließen.
Als Quelle für die Hämolymphe, die für die Isolierung der Zusammensetzungen verwendet wird, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden, haben sich Calliphora-vicina-Larven als besonders nützlich erwiesen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Hämolymphe der Insektenlarven Calliphora vicina Robineau-Desvoidy (C. vicina, Diptera, Calliphoridae) besonders bevorzugt.
Es versteht sich, dass die Zusammensetzungen, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden, durch Extraktion aus der Hämolymphe eines einzelnen Wirbellosen ebenso wie aus Hämolymphen von zwei oder mehreren Wirbellosen erhalten werden können.
Die C.-vicina-Larven können z.B. septisch verletzt werden, indem die Haut mit einer Nadel, die in eine Suspension von hitzegetöteten Escherichia-coli- und Micrococcus-luteus-Zellen eingetaucht wurde, geritzt wird. Es ist natürlich auch möglich, andere pathogene oder nicht pathogene Bakterien, wie Staphylococcus aureus oder verschiedene Stämme von Salmonella zu verwenden.
Die mit der vorliegenden Erfindung hergestellten pharmazeutischen Präparate besitzen eine immunmodulatorische Aktivität auf Immunzellen von Mensch und Säugetieren und sind daher nützlich zur Behandlung oder Verhütung von Immunmangelzuständen, wie onkologischen Krankheiten, insbesondere Krebs, und Vireninfektionen.
Das Grundprinzip der immunmodulatorischen Wirkung der pharmazeutischen Präparate, die erfindungsgemäß hergestellt wurden, ist eine Stimulierung von cytotoxischen Lymphozyten, wie natürlichen Killerzellen, die maligne oder mit Virus infizierte Zellen töten können. Die pharmazeutischen Präparate verstärken z.B. Lymphozyten aus der Milz der Maus, deren Krebszellen verschiedenen Ursprungs in vitro und in vivo anzugreifen. Weiterhin induzieren die Präparate, wenn sie Mäusen injiziert werden, eine starke und längere Synthese von endogenem Interferon, dem Hauptcytokin, das verschiedene Abwehrmechanismen des Immunsystems aktiviert.
Umfangreiche Untersuchungen der Antwort von Lymphozyten aus menschlichem Spenderblut auf die pharmazeutischen Präparate, die mit der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, bestätigen, dass die pharmazeutischen Präparate auch eine starke immunmodulatorische Wirkung auf einen erheblichen Teil der menschlichen Bevölkerung haben.
Es ist bekannt, dass Mechanismen der natürlichen Cytotoxizität eine wichtige Rollen spielen beim Schutz des Organismus gegen Infektionskrankheiten ebenso wie beim Abtöten der malignen Zellen des eigenen Organismus (G. Trinchieri, Biology of natural killer cells, Advances in Immunology, 1989, Bd. 47, 187–375; J. Brittenden, S.D. Heys, J. Ross und O. Eremin, Natural killer cells and cancer, Cancer, 1996, Bd. 77, 1126–1243). Daher können Stimulatoren der natürlichen Cytotoxizität der Lymphozyten potenziell zur Behandlung und Verhütung von verschiedenen Infektions- und Krebskrankheiten, die durch eine ungenügende Wirksamkeit der cytotoxischen Mechanismen der angeborenen Immunität verursacht werden, verwendet werden.
Wie bei Interferonen, Interleukinen und anderen bekannten immunmodulatorischen Materialien ist die Wirksamkeit der pharmazeutischen Präparate, die mit der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, durch die Grundfähigkeit des Immunsystems, Krebszellen zu erkennen und zu attackieren, beschränkt. Die Wirksamkeit kann jedoch verbessert werden, wenn die pharmazeutischen Präparate mit anderen Antitumorwirkstoffen kombiniert werden. Es wurde überraschenderweise gefunden, dass die erfindungsgemäß hergestellten pharmazeutischen Präparate mit verschiedenen Cytostatika und Interferon eine Wechselwirkung eingehen und dass einige biokompatible Kombinationen in solchen Fällen aktiv sind, in denen weder der bekannte Wirkstoff noch das pharmazeutische Präparat alleine wirksam sind. Insbesondere eine Kombination der erfindungsgemäß hergestellten pharmazeutischen Präparate mit Bleomycin unterdrückte das Tumorwachstum beträchtlich und erhöhte die Lebensspanne, obwohl jeder Wirkstoff alleine viel weniger wirksam war. Diese synergistische Wirkung zwischen den vorliegenden pharmazeutischen Präparaten und dem bekannten Cytostatikum Bleomycin macht eine kombinierte Krebsimmunochemotherapie möglich, von der man sich einen höchst effektiven Weg zur Krebsbehandlung verspricht.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung der obigen Zusammensetzung und von Bleomycin zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats für eine kombinierte Krebsimmunochemotherapie. Statt der Zusammensetzungen, die aus der Hämolymphe von Calliphora-vicina-Larven erhalten werden, können die isolierten oder synthetisierten aktiven Prinzipien dieser Zusammensetzungen zur Herstellung der erfindungsgemäß hergestellten pharmazeutischen Präparate verwendet werden. Ein aktives immunmodulatorisches Prinzip dieser Zusammensetzung, die für die vorliegende Erfindung verwendet wird, wurde isoliert. Vorläufige Daten in Bezug auf die Aktivität des Prinzips zeigen, dass es die cytotoxische Antikrebsaktivität von Mensch- und Mauslymphozyten in vitro stimulieren kann und auch bei Mäusen die Cytotoxizität der Lymphozy ten und die Interferonproduktion in vivo induzieren kann. Eine einzigartige Besonderheit der Wirkungsart des aktiven Prinzips ist die Fähigkeit, die Aktivität der Lymphozyten bei extrem geringen Konzentrationen zu stimulieren. Die minimal wirksame Konzentration wurde bestimmt als etwa 0,0005 ng/ml. Es wurde gefunden, dass die optimale Konzentration 0,05 bis 0,5 ng/ml ist. In diesem Fall stimuliert sie die Cytotoxizität von Lymphozyten wirksamer als Interferon, ein spezifisches menschliches Cytokin, das für die Aktivierung der Lymphozyten verantwortlich ist.
Eine Vergleichsanalyse der minimalen aktiven Konzentrationen eines aktiven Prinzips einer Zusammensetzung, die für die vorliegende Erfindung verwendet wird, und der bekannten regulatorischen Humanpeptide Interleukin, Interferon, Tumornekrosefaktor, Defensin und NK-Lysin zeigt einen klaren Vorteil des aktiven Prinzips. Es wirkt bei wesentlich geringeren Konzentrationen als irgendein menschliches Cytokin, einschließlich Interleukin, der aktivste bisher bekannte Immunmodulator. Für die menschlichen cytolytischen Peptide NK-Lysin und Defensin, die die Zielzellen direkt töten, übertrifft deren Konzentration, um die Krebszellzerstörung zu verbessern, sogar die wirksame Konzentration des aktiven Prinzips um mehr als das Millionenfache.
Außerdem sind die Zusammensetzungen, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden, und deren aktive Prinzipien wirksame Stimulantien der cytotoxischen Lymphozyten, wie NK-Zellen und cytotoxische T-Zellen, und zeigen eine potente antivirale Aktivität, wenn sie unter Verwendung einer Modellmaus, die mit Humaninfluenzavirus A oder B infiziert ist, getestet werden. Bei diesem Modell wurden Wildtyp-Männchen intranasal mit einer Suspension von Humaninfluenzavirus A oder B infiziert und die pharmazeutischen Präparate wurden intraperitoneal einen Tag vor der Infektion und dann 1, 2, 4, 6 und 8 Tage danach injiziert. Sowohl eine Zusammensetzung, die für die vorliegende Erfindung verwendet wird, als auch ihr aktives Prinzip schützten Mäuse wirksam vor Lungenläsionen und dem Tod. Somit sind die Zusammensetzung und ihr aktives Prinzip nützlich zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Behandlung oder Verhütung von Vireninfektionen.
Weder eine akute noch eine chronische Toxizität der Zusammensetzung, die für die vorliegende Erfindung verwendet wird, oder ihres aktiven Prinzips wurden im Verlauf der in-vivo- und in-vitro-Studien gefunden.
Es versteht sich, dass die mit der vorliegenden Erfindung hergestellten pharmazeutischen Präparate auch übliche Additive, wie Hilfsstoffe oder Träger enthalten können. Die Präparate können dem Patienten auf enteralem, z.B. oral oder rektal, und parenteralem Weg, wie intraperitoneal, intramuskulär, intravenös oder subcutan, verabreicht werden. Die Präparate können in Dosierungsformen, wie Kapseln, Tabletten und Zäpfchen verabreicht werden. Für die parenterale Verwendung sind die pharmazeutisch aktiven Komponenten bevorzugt in Form einer injizierbaren Lösung.
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele erläutert:
Beispiel 1
Herstellung des Präparats aus C. vicina
Gefütterte C.-vicina-Larven, die unter Laborbedingungen gehalten wurden, wie beschrieben (S.I. Chernysh, N.P. Simonenko, H. Numata, Sensitive stage for the diapause averting effect of high temperature in the blowfly, Calliphora vicina (Diptera, Calliphoridae) Appl. Entomol. Zool., 1995, Bd. 30, Nr. 3, Seiten 498–499) wurden mit Bakterien beaufschlagt, indem die Haut mit einer Nadel, die in eine Suspension von mit Hitze getöte ten Escherichia-coli- und Micrococcus-luteus-Zellen eingetaucht worden war, geritzt wurde. Die Hämolymphe von septisch verletzten Larven wurde gesammelt, zentrifugiert und auf eine Sep-Pak-C18-Chromatographiesäule (Waters Co.) aufgetragen. Die Säule wurde mit 0,05% Trifluoressigsäure gewaschen. Dann wurden die Zielmaterialien mit 50% Acetonitril, das mit 0,05% Trifluoressigsäure angesäuert worden war, eluiert. Die eluierte Fraktion wurde lyophylisiert und als Präparat verwendet. Die Präparatausbeute entsprach 3,3% der Trockenmasse der Hämolymphe.
Beispiel 2
Immunmodulatorische Aktivität des Präparats
Die Bestimmung der immunmodulatorischen Aktivität des Präparats von Beispiel 1 beinhaltet die Stimulierung der Fähigkeit von menschlichen peripheren Blutlymphozyten und von Lymphozyten aus der Milz der Maus, kultivierte Krebszellen in vitro zu töten. In den meisten Versuchen wurde die spezifische Empfindlichkeit von Humanleukämiezellen der Zelllinie K562 für natürliche Killerzellen als Ziel für die Messung der cytotoxischen Aktivität der Lymphozyten verwendet. Außerdem wurde eine Maushepatomzelllinie als zusätzliches Modell verwendet.
2.1 Die Wirkung des Präparats auf die Maussplenozytentoxizität in vitro
Um die Wirkung des Präparats von Beispiel 1 auf die cytotoxische Aktivität der Lymphozyten der Milz aus der Maus zu analysieren, wurde der Standardcytotoxizitätsassay verwendet (J Hasimoto und E. Sudo, Evaluation of cell damage in immune reaction by release of radioactivity from H3-uridine labelled cells, Gann, 1971, Bd. 62, 139–145; N.A. Filatova, A.M. Malygin, L.B. Goryunova, V.Ya. Fel und V.K. Khavinson, Immunomodulation of natural killer activity of C3HA mice splenocytes during hepatoma 22a growth., Tsitologia, 1990, Bd. 32, Nr. 6, 652–658). H3-Uridin-markierte Maushepatomzellen und K562-Zellen wurden als Ziele für einen Angriff der cytotoxischen Lymphozyten verwendet. Frische Milzlymphozyten und Zielzellen wurden 18 Stunden lang in Gegenwart oder Abwesenheit des Präparats gleichzeitig inkubiert. Dann wurden der Anteil der getöteten und normalen Zielzellen und der entsprechende Cytotoxizitätsindex in Kontroll- und Versuchsgruppen bestimmt. Die Daten zur Wirkung des Präparats auf die Cytotoxizität der Lymphozyten aus der Milz der Maus gegen H3-Uridin-markierte K562-Zelllinie sind in den Tabellen 1 und 2 zusammengefasst. Jede Zahl in den Tabellen fasst die Ergebnisse von 24 unabhängigen Cytotoxizitätsbestimmungen zusammen. Ein statistisch signifikanter Anstieg im Cytotoxizitätsindex wurde sowohl bei Mäusen mit niedriger (Tabelle 1) als auch hoher (Tabelle 2) Anfangsaktivität der Lymphozyten der Milz gefunden, obwohl die übliche Wirksamkeit des Präparats höher war, wenn der Anfangspegel der Aktivität der Lymphozyten niedriger war. Die minimal wirksame Konzentration wurde bestimmt mit weniger als 5 ng/ml. Die stimulatorische Wirkung des Präparats auf die cytotoxische Aktivität der Milzlymphozyten wurde auch gefunden, wenn Maushepatomzellen als Ziele verwendet wurden (Daten nicht gezeigt). Tabelle 1

^*P < 0,05; ^**P < 0,01; ^***P < 0,001

– P > 0,05; ^*P < 0,05; ^**P < 0,01; ^***P < 0,001

2.2 Die Wirkung des Präparats auf die cytotoxische Aktivität der Lymphozyten aus der Milz der Maus in vivo
Die in-vivo-immunmodulatorische Wirkung des Präparats, wenn es in geeigneten Dosen in Mäuse injiziert wurde, wird beschrieben. Mäusen des C3HA-Genotyps wurde intraperitoneal eine einzige Dosis von 5 bis 500 μg (0,25 bis 25 mg/kg) des Präparats, gelöst in 0,1 ml Kochsalzlösung, injiziert. Kontrollmäusen wurde 0,1 ml Kochsalzlösung injiziert. Vier Mäuse in jeder Versuchsgruppe wurden verwendet. 24 Stunden später wurde die Milz entnommen, die Lymphozyten wurden aus der Milz freigesetzt und ihre Cytotoxizität gegen K562-Zielzellen ausgewertet, wie oben erwähnt. Die Daten in Tabelle 3 fassen die Ergebnisse von 70 einzelnen Messungen bei einem Verhältnis von Lymphozyten:Zielzellen von 5:1 und 20:1 zusammen. Diese Daten zeigen, dass die Injektion von 50 μg des Präparats einen signifikanten Anstieg der Cytotoxizität der Lymphozyten gegen Zielkrebszellen hervorrief.
Daraus wird daher geschlossen, dass das Präparat wirksam ist als Stimulans für die Cytotoxizität von Lymphozyten in vivo ebenso wie oben gezeigt in vitro. Tabelle 3

– P > 0,05; ^*P < 0,05; ^**P < 0,01; ^***P < 0,001

2.3 Die Wirkung des Präparats auf die Cytotoxizität von Humanlymphozyten in vitro
Ein Beispiel der Wirkung des Präparats auf die cytotoxische Aktivität von menschlichen peripheren Blutlymphozyten (PBLs) gegen kultivierte K562-Zellen ist in Tabelle 4 gezeigt. Lymphozyten wurden aus frischem Spenderblut freigesetzt und von Erythrozyten durch Zentrifugation gereinigt unter Verwendung der Histopak-1077-Lösung (Sigma). Nach der Zentrifugation wurden die Lymphozyten wieder in Phosphatpuffer suspendiert, zentrifugiert und wieder in RPMI-1640-Medium, das mit Glutamin, Gentamycin und RNAse ergänzt war, suspendiert. Die Lymphozyten wurden bis auf 2 × 10⁶ Zellen/ml verdünnt und sofort für die Cytotoxizitätsanalyse, wie oben erwähnt, verwendet. Jede Zahl in Tabelle 4 fasst die Ergebnisse von 10 Cytotoxizitätsmessungen zusammen.
Die Cytotoxizität der PBLs gegen K562-Krebszellen war signifikant erhöht, wenn das Präparat dem Inkubationsmedium in einer Konzentration zugegeben wurde ausgehend von 0,005 ng/ml, jedoch erreichte die stimulatorische Aktivität ein Plateau bei einer Konzentration von etwa 5 ng/ml.
Weitere Studien zeigen, dass die Empfindlichkeit des Spenders auf die Gegenwart des Präparats abhängig von der cytotoxischen Grundaktivität der PBLs variiert. Die stärkste stimulatorische Aktivität wurde bei Spendern mit einer geringen cytotoxischen Aktivität der PBLs gegen K562-Zellen gefunden, wenn der Cytotoxizitätsindex in der Kontrolle geringer als 30% war. Keine deutlich stimulatorische Aktivität wurde bei Spendern mit einer sehr hohen Grundaktivität der PBLs gefunden (Cytotoxizitätsindex in der Kontrolle ist mehr als 50%). Es wird daher vermutet, dass das Präparat zur Behandlung von Patienten verwendet werden könnte, die unter einer unterdrückten cytotoxischen Aktivität der Lymphozyten leiden. Tabelle 4

– P > 0,05; ^**P < 0,01; ^***P < 0,001

Beispiel 3
Antitumoraktivität des Präparats
Die Antitumoraktivität des Präparats von Beispiel 1 wurde an Mäusen und Ratten, die mit verschiedenen Krebszellen beaufschlagt wurden, untersucht. Die therapeutische Wirkung war unterschiedlich, abhängig vom Ursprung und den spezifischen Eigenschaften der Krebszellen. Keine positive Antwort wurde bei Wildtyp-Mäusen gefunden, die mit Erlich-Ascites-Krebszellen beaufschlagt wurden, und bei Mäusen des C5781-Genotyps, die mit Melanom-B16-Krebszellen beaufschlagt bzw. getestet wurden. Eine schwache Antikrebsaktivität wurde bei Mäusen des DBA-Genotyps gefunden, die intravenös mit Leukämie-P388-Zellen beaufschlagt wurden (Erhöhung der Lebensspanne) und bei Ratten, die intravenös mit Rabdomyosarkomzellen beaufschlagt wurden (Abnahme der durchschnittlichen Größe der Lungenmetastasen).
Eine signifikante solide Tumoren unterdrückende Aktivität wurde jedoch bei Mäusen des C3HA-Genotyps gefunden, die mit syngenen Maushepatokarzinom-22a-Zellen 17 Tage nach Impfung beaufschlagt wurden (Tabelle 5). Die Mäuse wurden subcutan mit 3 × 10⁵ Hepatokarzinomzellen beaufschlagt. Das Präparat wurde subcutan einen Tag später injiziert und die gleichen Injektionen wurden einmal pro Woche wiederholt. Jede Versuchsgruppe enthielt 10 Tiere. Eine klare dosisabhängige Unterdrückung des Tumorwachstums wurde bei Tieren festgestellt, die das Präparat erhielten. In der Gruppe, die 500 μg des Präparats erhielt, hatten nur 30% der Mäuse sichtbare subcutane Tumoren 17 Tage nach der Impfung im Vergleich zu 90% in der Kontrollgruppe (Kochsalzlösung injiziert). Sogar wenn Tumoren erschienen, war ihre durchschnittliche Größe signifikant verringert im Vergleich zu den Kontrolltieren.
Diese Daten bestätigen die Antikrebsaktivität des Präparats bei bestimmten Tumoren, die wahrscheinlich empfindlich sind auf die immunologische Überwachung, was aus dem kürzlich erworbenen Wissen über die immunmodulatorische Aktivität des Präparats geschlossen werden kann. Tabelle 5

^*P < 0,05; ^**P < 0,01; ^***P < 0,001

Beispiel 4
Antivirale Aktivität in Tiermodellen
Um die antivirale Aktivität des Präparats von Beispiel 1 zu bestimmen, wurden männliche Wildtyp-Mäuse intranasal mit Stämmen von Humaninfluenzavirus A oder B, das für Mäuse virulent ist, infiziert. Das Präparat wurde intraperitoneal einen Tag vor der Infektion und dann 1, 2, 4, 6 und 8 Tage danach injiziert. Die Sterblichkeit der infizierten Mäuse 10 Tage nach der Virusimpfung ist in den Tabellen 6 (Virus A) und 7 (Virus B) angegeben.
Das Präparat schützte Mäuse effektiv vor Lungenläsionen und dem Tod, der durch beide Virusinfektionen verursacht wird. Es ist wichtig festzustellen, dass es für Influenzavirus B bisher keine wirksame Chemotherapie gibt. Tabelle 6
Tabelle 7
Beispiel 5
Toxizität des Präparats
Um die akute Toxizität auszuwerten, wurde das Präparat von Beispiel 1 in einer Dosis von 0,6 bis 5,0 mg intraperitoneal in 0,25 ml Kochsalzlösung (0,9% NaCl) männlichen Wildtyp-Mäusen mit 18 bis 20 g Gewicht injiziert. Jede der 4 Versuchsgruppen beinhaltete 3 Tiere. Nach 48 Stunden Exposition wurden die Tiere getötet und seziert. Kein Tier hatte Zeichen einer pathologischen Antwort. Die Mäuse waren aktiv und verloren kein Gewicht. Die inneren Organe (Leber, Milz, Nebennierenrinden, Gallenblase, Schleimhautmembranen) waren ohne sichtbare Veränderungen. Somit scheint das Präparat keine akute Toxizität zu haben, wenn es in einer einzelnen Dosis bis zu 5 mg pro Tier injiziert wird (etwa 100 mg/kg), was die vorgeschlagene therapeutische Dosis um das bis zu 100-fache übersteigt.
Das Präparat wurde auch für 10 Mäuse intravenös als einzelne Dosis mit 1 mg angewendet ohne irgendwelche Zeichen der akuten Toxizität.
Weiterhin wurde die Toxizität des Präparats in vitro getestet unter Verwendung von kultivierten K562-Humanzellen und frischen Humanerythrozyten.
Die K562-Zellen wurden in dem RPMI-1640-Zellkulturmedium in Gegenwart verschiedener Konzentrationen des Präparats inkubiert (Tabelle 8). Nach 1 oder 2 Tagen der Inkubation wurden die Zellen mit Tripan-Blau gefärbt und die Anzahl der normalen (ungefärbt) und geschädigten (gefärbt) Zellen wurde gezählt. Die Daten in Tabelle 8 fassen die Ergebnisse von 10 unabhängigen Versuchen zusammen. Die Anzahl der geschädigten Zellen in der Population war nicht signifikant erhöht, sogar wenn die Konzentration des Präparats im Medium 500 μg/ml war. Unter der Annahme, dass die minimal wirksame immunmodulatorische Konzentration des Präparats in vitro kleiner als 1 ng/ml ist (siehe Beispiel 2), wird geschlossen, dass das Präparat keine Toxizität für K562-Zellen in vitro hat.
Diese Daten bestätigen auch, dass der Anstieg der Cytotoxizität der Lymphozyten ebenso wie die Tumor unterdrückende Aktivität, die oben in den Beispielen 2 und 3 gezeigt wurde, nicht der direkten Cytotoxizität des Präparats zugerechnet werden können. Tabelle 8
Die hämolytische Aktivität des Präparats wurde an frischen Erythrozyten, die aus Spenderblut von 4 antigenen Gruppen freigesetzt worden waren, getestet (Tabelle 9). Es wurden keine Zeichen für eine Hämolyse in einem Konzentrationsbereich des Präparats bis zu 400 μg/ml gefunden. Eine begrenzte Hämolyse war bei einer Konzentration von 800 μg/ml bei den Erythrozyten der Antigengruppen II und III, nicht aber I und IV sichtbar. Die letzte Konzentration übersteigt die minimale immunmodulatorische Konzentration etwa um das 1-Millionfache.
Bei einer Zusammenfassung der verfügbaren Ergebnisse der Auswertung der Toxizität in vivo und in vitro kann daher geschlossen werden, dass das Präparat keine Toxizität in Konzentrationen hat, die die angenommenen therapeutischen Dosen dramatisch übersteigen. Tabelle 9
Hämolyserate:

–

keine

+

Spuren

++

begrenzt

+++

intensiv

++++

vollständig

Claims

Verwendung einer Zusammensetzung, die eine Peptidmischung enthält, die mit einem Verfahren erhältlich ist, das die Stufen aufweist, dass (A) ein wirbelloses Tier septisch verletzt wird und (B) die Hämolymphe des wirbellosen Tiers gesammelt, zentrifugiert und chromatographisch getrennt wird, wobei das wirbellose Tier eine Calliphora-vicina-Larve ist, zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Behandlung oder Verhütung eines Immunmangelzustandes.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das wirbellose Tier eine Larve von Calliphora vicina Robineau-Desvoidy ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der Immunmangelzustand eine onkologische Krankheit, insbesondere Krebs ist.
Verwendung der Zusammensetzung, wie in Anspruch 1 oder Anspruch 2 definiert, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer Vireninfektion.
Verwendung von (a) der Zusammensetzung, wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, und (b) von Bleomycin zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats für eine kombinierte Krebsimmunchemotherapie.