DE69834420T2

DE69834420T2 - Zielsequenzen für synthetische moleküle und verfahren für deren verwendung

Info

Publication number: DE69834420T2
Application number: DE69834420T
Authority: DE
Inventors: Y. Roger La Jolla TSIEN; B. Albert Del Mar GRIFFIN
Original assignee: University of California; University of California Berkeley; University of California San Diego UCSD
Current assignee: University of California; University of California Berkeley; University of California San Diego UCSD
Priority date: 1997-10-21
Filing date: 1998-10-21
Publication date: 2007-04-19
Anticipated expiration: 2018-10-22
Also published as: WO1999021013A1; EP1032837A4; EP1032837B1; EP1032837A1; EP1684073A3; AU1113999A; EP1684073A2; DE69834420D1; ATE325344T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zum Markieren von Molekülen, insbesondere kleinen synthetischen Molekülen, die spezifisch mit Zielsequenzen reagieren können.
Hintergrund der Erfindung
Viele Techniken in den biologischen Wissenschaften benötigen ein Anbinden von Markierungen an Moleküle wie Polypeptide. Zum Beispiel kann die Lage eines Polypeptids innerhalb einer Zelle dadurch bestimmt werden, dass eine fluoreszierende Markierung an das Polypeptid angebunden wird.
Traditionell wurde ein Markieren durch eine chemische Modifikation von aufgereinigten Polypeptiden erreicht. Zum Beispiel benötigen die normalen Verfahren zum Fluoreszenzmarkieren, dass das Polypeptid kovalent in vitro mit einem Fluoreszenzfarbstoff umgesetzt, sodann aufgereinigt wird, um einen Überschuss an Farbstoff und/oder jeglichem beschädigten Polypeptid zu entfernen. Unter Verwendung dieses Ansatzes werden Probleme einer Markierungsstöchiometrie und Störung einer biologischen Aktivität oft angetroffen. Ferner kann, um ein chemisch modifiziertes Polypeptid innerhalb einer Zelle zu untersuchen, eine Mikroinjektion benötigt werden. Dies kann langwierig sein und kann nicht auf eine große Population von Zellen angewendet werden.
Thiol- und Amin-reaktive chemische Markierungen sind vorhanden und können verwendet werden, um Polypeptide innerhalb einer lebenden Zelle zu markieren. Jedoch sind diese chemischen Markierungen bunt gewürfelt. Solche Markierungen können sich nicht spezifisch mit einem bestimmten Cystein oder Lysin eines bestimmten Polypeptids innerhalb einer lebenden Zelle umsetzen, die eine Vielzahl von anderen reaktiven Thiol- und Amingruppen aufweist.
Ein moderneres Verfahren einer intrazellulären Markierung von Polypeptiden in lebenden Zellen beinhaltete eine genetische Konstruktion von Fusionspolypeptiden, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) und ein Polypeptid von Interesse beinhalten. Jedoch ist GFP hinsichtlich der Vielseitigkeit begrenzt, da es das Polypeptid nicht reversibel markieren kann. Die Fähigkeit zur leichten und verlässlichen Erzeugung eines großen Bereichs an spezifisch markierten Molekülen würde besonders nützlich sein.
Zusammenfassung der Erfindung
In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein biarsenisches Molekül der nachstehenden Formel:
und Tautomere, Anhydride und Salze davon,
worin:
jede Gruppe X¹ oder X² unabhängig voneinander ein Cl-, Br-, I-Atom, eine OR^a- oder SR^a-Gruppe ist,
oder
X¹ und X² zusammen mit dem Arsenatom einen Ring der Formel
bilden,
R^a ein H-Atom, eine C₁-C₄-Alkyl-, CH₂CH₂OH-, CH₂COOH- oder CN-Gruppe ist, Z eine 1,2-Ethandiyl-, 1,2-Propandiyl-, 2,3-Butandiyl-, 1,3-Propandiyl-, 1,2-Benzoldiyl-, 4-Methyl-1,2-benzoldiyl-, 1,2-Cyclopentandiyl-, 1,2-Cyclohexandiyl-, 3- Hydroxy-1,2-propandiyl-, 3-Sulfo-1,2-propandiyl- oder 1,2-Bis(carboxy)-1,2-ethandiylgruppe ist,
Y¹ und Y² unabhängig voneinander ein H-Atom oder eine CH₃-Gruppe sind,
oder,
Y¹ und Y² zusammen einen Ring derart bilden, dass das biarsenische Molekül die Formel
aufweist, worin M ein O-, S-Atom, eine CH₂-, C(CH₃)₂- oder NH-Gruppe ist,
R¹ und R² unabhängig voneinander eine OR^a-, OAc-, NR^aR^b-Gruppe oder ein H-Atom sind,
R³ und R⁴ unabhängig voneinander ein H-, F-, Cl-, Br-, I-Atom, eine OR^a- oder
R^a-Gruppe sind,
oder,
R¹ zusammen mit R³ oder R² zusammen mit R⁴ oder beides einen Ring bilden, in dem
(i) eine der Gruppen R¹ oder R³ eine C₂-C₃-Alkylgruppe ist und die andere eine NR^a-Gruppe ist und
(ii) eine der Gruppen R² und R⁴ eine C₂-C₃-Alkylgruppe ist und die andere eine NR^a-Gruppe ist,
R^b ein H-Atom, eine C₁-C₄-Alkyl-, CH₂CH₂OH-, CH₂COOH- oder CN-Gruppe ist,
Q eine CR^aR^b-, CR^aOR^b-, C=O-Gruppe oder ein Spirolakton der Formel:
ist, worin die Spirobindung bei C₁ gebildet wird.
Insbesondere bevorzugt ist ein biarsenisches Molekül, worin X¹ und X² zusammen mit dem Arsenatom einen Ring mit der Formel
bilden.
Auch bevorzugt ist ein biarsenisches Molekül, worin X¹ und X² zusammen mit dem Arsenatom einen Ring mit der Formel
bilden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des biarsenischen Moleküls wird Q aus den nachstehenden Spirolaktonen ausgewählt:
Eine noch mehr bevorzugte Ausführungsform ist ein biarsenisches Molekül, worin Q
ist.
Ein besonders bevorzugtes biarsenisches Molekül weist die nachstehende Formel auf:
Die Tautomere, Anhydride und Salze des biarsenischen Moleküls der Formel (III) sind auch eingeschlossen.
Vorzugsweise reagiert das biarsenische Molekül spezifisch mit einer Zielsequenz, um ein nachweisbares Signal, z.B. ein Fluoreszenzsignal, zu erzeugen.
Das biarsenische Molekül ist vorzugsweise fähig, eine biologische Membran zu durchqueren. Das biarsenische Molekül beinhaltet vorzugsweise eine nachweisbare Gruppe, z.B. eine fluoreszierende Gruppe, lumineszierende Gruppe, phosphoreszierende Gruppe, Spinmarkierung, Photosensibilisator, photospaltbare Gruppe, ein chelatierendes Zentrum, Schweratom, radioaktives Isotop, Isotop, das durch Kernmagnetresonanz nachweisbar ist, paramagnetisches Atom und Kombinationen davon.
Für einige Anwendungen kann das biarsenische Molekül auf einer Festphase, vorzugsweise durch kovalentes Koppeln, immobilisiert sein.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Kit. Der Kit beinhaltet das vorstehend beschriebene biarsenische Molekül und einen Bindepartner, der eine Zielsequenz beinhaltet. Die Zielsequenz beinhaltet ein oder mehrere Cysteine und ist fähig, spezifisch mit dem biarsenischen Molekül zu reagieren. Vorzugsweise beinhaltet die Zielsequenz vier Cysteine. Die Zielsequenz ist vorzugsweise eine cys-cys-X-Y-cys-cys-α-helikale Domäne, worin X und Y Aminosäuren sind. Vorzugsweise sind X und Y Aminosäuren mit einer hohen α-helikalen Neigung. In einigen Ausführungsformen sind X und Y die gleiche Aminosäure. In anderen Ausführungsformen sind X und Y unterschiedliche Aminosäuren. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist die Zielsequenz SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:4.
Der Bindepartner kann ein Trägermolekül, z.B. ein Trägerpolypeptid, beinhalten. In einigen Ausführungsformen ist die Zielsequenz heterolog zu dem Trägerpolypeptid. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die durch SEQ ID NO:4 spezifizierte Zielsequenz durch eine Peptidbindung an das carboxyterminale Lys-238 in der Cyan-Mutante des grün fluoreszierenden Proteins gebunden.
In einem noch weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Kit, der das vorstehend beschriebene biarsenische Molekül und einen Vektor beinhaltet, der eine Nukleinsäuresequenz beinhaltet, die für eine Zielsequenz kodiert. Die Zielsequenz beinhaltet ein oder mehrere Cysteine und ist fähig, spezifisch mit dem biarsenischen Molekül zu reagieren. Vorzugsweise beinhaltet die Zielsequenz vier Cysteine.
In einigen bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet der Vektor in dem Kit eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Trägerpolypeptid kodiert, und eine Nukleinsäuresequenz, die für eine Zielsequenz kodiert. In einigen Ausführungsformen ist das Trägerpolypeptid heterolog zu der Zielsequenz.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Komplex. Der Komplex beinhaltet das vorstehend beschriebenen biarsenische Molekül und eine Zielsequenz. In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist die Zielsequenz SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:4. Vorzugsweise ist das biarsenische Molekül ein biarsenisches Molekül der Formel (III).
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein tetraarsenisches Molekül. Das tetraarsenische Molekül beinhaltet zwei biarsenische Moleküle der vorstehend beschriebenen Formeln. Die zwei biarsenischen Moleküle sind aneinander durch eine verbindende Gruppe gekoppelt. In einigen Ausführungsformen weisen die tetraarsenischen Moleküle die Formel VI, VII oder VIII auf.
Der Bindepartner gemäß den Ansprüchen 1 bis 56 beinhaltet ein Trägerpolypeptid und eine Zielsequenz. Die Zielsequenz ist heterolog zu der Trägerpolypeptid-Zielsequenz. Die Zielsequenz beinhaltet ein oder mehrere Cysteine, die fähig sind, spezifisch mit einem biarsenischen Molekül der Formel (III) zu reagieren. Vorzugsweise beinhaltet die Zielsequenz vier Cysteine.
In einigen Ausführungsformen ist die Zielsequenz an das C-terminale Ende des Trägerpolypeptids gebunden. In anderen Ausführungsformen ist die Zielsequenz an das N-terminale Ende des Trägerpolypeptids gebunden. In noch weiteren Ausführungsformen liegt die Zielsequenz intern zu dem Trägerpolypeptid.
Die Zielsequenz kann eine cys-cys-X-Y-cys-cys-α-helikale Domäne beinhalten, worin X und Y Aminosäuren sind. Vorzugsweise sind X und Y Aminosäuren mit einer hohen α-helikalen Neigung. In einigen Ausführungsformen sind X und Y die gleiche Aminosäure. In anderen Ausführungsformen sind X und Y unterschiedliche Aminosäuren. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Zielsequenz SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:4.
Der Vektor gemäß den Ansprüchen 1 bis 56 beinhaltet eine Nukleinsäuresequenz, die für einen Bindepartner kodiert. Die Nukleinsäuresequenz, die für den Bindepartner kodiert, beinhaltet eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Trägerpolypeptid kodiert, und eine Nukleinsäuresequenz, die für eine Zielsequenz kodiert. Die Nukleinsäuresequenz, die für die Zielsequenz kodiert, ist heterolog zu der Nukleinsäuresequenz, die für das Trägerpolypeptid kodiert. Die Zielsequenz beinhaltet ein oder mehrere Cysteine, die fähig sind, spezifisch mit dem vorstehend beschriebenen biarsenischen Molekül (III) zu reagieren.
Vorzugsweise beinhaltet die Zielsequenz vier Cystein. Mehr bevorzugt beinhaltet die Zielsequenz eine cys-cys-X-Y-cys-cys-α-helikale Domäne, worin X und Y Aminosäuren sind.
Die Sequenz, die für die Zielsequenz kodiert, und die Sequenz, die für das Trägerpolypeptid kodiert, bilden vorzugsweise ein rekombinantes Gen, das einen Bindepartner nach Expression erzeugt. Der Bindepartner beinhaltet die Zielsequenz und das Trägerpolypeptid.
In einigen Ausführungsformen ist die Nukleinsäuresequenz, die für die Zielsequenz kodiert, an das 5'-Ende der Nukleinsäuresequenz, die für das Trägerpolypeptid kodiert, gebunden. In anderen Ausführungsformen ist die Nukleinsäuresequenz, die für die Zielsequenz kodiert, an das 3'-Ende der Nukleinsäuresequenz, die für das Trägerpolypeptid kodiert, gebunden. In noch anderen Ausführungsformen liegt die Nukleinsäuresequenz, die für die Zielsequenz kodiert, intern zu der Nukleinsäuresequenz, die für das Trägerpolypeptid kodiert.
Die Wirtszelle gemäß Ansprüchen 1 bis 56 beinhaltet einen exogenen Bindepartner. Der Bindepartner beinhaltet ein Trägerpolypeptid und eine Zielsequenz. In einigen Ausführungsformen ist die Zielsequenz heterolog zu dem Trägerpolypeptid. Die Zielsequenz beinhaltet ein oder mehrere Cysteine, die spezifisch mit dem vorstehend beschriebenen biarsenischen Molekül (III) reagieren.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Markieren eines Trägermoleküls. Das Verfahren beinhaltet ein Bereitstellen eines Bindepartners, der das Trägermolekül und eine Zielsequenz beinhaltet. Der Bindepartner wird mit einem biarsenischen Molekül unter Bedingungen in Kontakt gebracht, bei denen das biarsenische Molekül spezifisch mit der Zielsequenz reagiert, um einen Komplex aus biarsenischem Molekül/Zielsequenz auszubilden. Die Zielsequenz beinhaltet ein oder mehrere Cysteine, die fähig sind, spezifisch mit dem vorstehend beschriebenen biarsenischen Molekül (III) zu reagieren.
In einigen Ausführungsformen beinhaltet das Verfahren einen Schritt eines Dissoziierens des biarsenischen Moleküls von der Zielsequenz.
In einigen Ausführungsformen erzeugt das biarsenische Molekül ein nachweisbares Signal. Das nachweisbare Signal ist vorzugsweise ein Fluoreszenzsignal.
In einigen Ausführungsformen kann das Verfahren einen Schritt eines Überwachens des nachweisbaren Signals beinhalten.
In einigen Ausführungsformen ist das biarsenische Molekül an eine Festphase gekoppelt. In anderen Ausführungsformen ist die Zielsequenz an eine Festphase gekoppelt.
Das Trägermolekül ist vorzugsweise ein Polypeptid. In einigen Ausführungsformen ist das Polypeptid ein Antikörper. In anderen Ausführungsformen ist das Polypeptid ein Enzym.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen einer Wirtszelle. Die Wirtszelle beinhaltet einen exogenen Bindepartner. Der Bindepartner beinhaltet ein Trägerpolypeptid und eine Zielsequenz. Die Zielsequenz kann heterolog zu dem Trägerpolypeptid sein.
Das Verfahren beinhaltet ein In-Kontakt-Bringen eines Vektors, der eine Nukleinsäuresequenz, die für den Bindepartner kodiert, beinhaltet, mit einer Zelle unter Bedingungen, bei denen der Vektor in die Zelle aufgenommen und durch diese exprimiert wird. Die Zielsequenz beinhaltet ein oder mehrere Cysteine, die fähig sind, spezifisch mit dem vorstehend beschriebenen biarsenischen Molekül (III) zu reagieren.
Vorzugsweise sind Wirtszellen bakterielle, Hefe-, Insekten-, Säuger- und Pflanzenzellen.
In einem noch weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Vernetzen zweier Bindepartner. Das Verfahren beinhaltet ein Bereitstellen eines tetraarsenischen Moleküls, das fähig ist, spezifisch mit zwei Zielsequenzen zu reagieren. Das tetraarsenische Molekül wird sodann mit mindestens zwei Bindepartnern in Kontakt gebracht. Der erste Bindepartner beinhaltet eine erste Zielsequenz. Der zweite Bindepartner beinhaltet eine zweite Zielsequenz. Das tetraarsenische Molekül wird mit den Bindepartnern unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die zum Ausbilden eines Komplexes aus tetraarsenischem Molekül/Zielsequenzen wirksam sind. Jede der Zielsequenzen beinhaltet ein oder mehrere Cysteine. Jede Zielsequenz ist fähig, spezifisch mit dem vorstehend beschriebenen biarsenischen Molekül der Formel (III) zu reagieren.
In einigen Ausführungsformen sind die ersten und die zweiten Bindepartner die gleichen. In anderen Ausführungsformen sind die ersten und die zweiten Bindepartner unterschiedlich.
In einigen Ausführungsformen sind die ersten und die zweiten Zielsequenzen die gleichen. In anderen Ausführungsformen sind die ersten und die zweiten Zielsequenzen unterschiedlich.
Vorzugsweise sind die ersten und die zweiten Bindepartner Polypeptide.
Der Bindepartner wird vorzugsweise von einem Vektor exprimiert, der eine Nukleinsäuresequenz, die für die Zielsequenz kodiert, und eine Nukleinsäuresequenz, die für das Trägerpolypeptid kodiert, beinhaltet.
"Bindepartner", wie hierin verwendet, betrifft ein Molekül, das mindestens die Zielsequenz enthält.
"Heterolog", wie hierin verwendet, betrifft zwei Moleküle, die natürlicherweise nicht miteinander assoziiert sind.
"Assoziiert", wie hierin verwendet, beinhaltet eine Assoziierung durch kovalente als auch durch nicht kovalente Wechselwirkungen.
Erfindungsgemäß werden biarsenische Moleküle bereitgestellt, die derart konstruiert sein können, um eine Vielzahl von Eigenschaften aufzuweisen. Zum Beispiel kann das biarsenische Molekül fluoreszierend sein. Es kann unterschiedliche Anregungs- und Emissionswellenlängen aufweisen, z.B. sichtbar oder infrarot. Das biarsenische Molekül reagiert spezifisch mit der cysteinhaltigen Zielsequenz. Zusätzlich ist die relativ kleine Größe von sowohl dem biarsenischen Molekül als auch der Zielsequenz besonders vorteilhaft.
Andere erfindungsgemäße Merkmale und Vorteile werden aus der nachstehenden detaillierten Beschreibung und aus den Ansprüchen ersichtlich werden.
SEQUENZ-ID-NUMMERN

SEQ ID NO:1: Acetyl-Trp-Glu-Ala-Ala-Ala-Arg-Glu-Ala-Cys-Cys-Arg-Glu-Cys-Cys-Ala-Arg-Ala-Amid
Kommentare: Der N-Terminus ist acetyliert und der C-Terminus ist amidiert.
SEQ ID NO:2: 5'-CGG CAA TTC TTA GGC CCT GGC GCA GCA CTC CCT GCA GCA GGC CTC CCT GGC GGC GGC CTC GGC CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC C-3'
SEQ ID NO:3: 5'-CGC GGA TCC GCC ACC ATG CAT GAC CAA CTG ACA TGC TGC CAG ATT TGC TGC TTC AAA GAA GCC TTC TCA TTA TTC-3'.
SEQ ID NO:4: Ala-Glu-Ala-Ala-Ala-Arg-Glu-Ala-Cys-Cys-Arg-Glu-Cys-Cys-Ala-Arg-Ala

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt ein Paar von biarsenischen Molekülen, die Tautomere, Salze oder Anhydride voneinander sind.
2 ist ein Reaktionsschema für die Synthese der tetraarsenischen Moleküle (VI) und (VII).
3 ist ein Reaktionsschema, das die Synthese des biarsenischen Moleküls der Formel (III) zeigt. Die Figur zeigt auch die spezifische Reaktion des biarsenischen Moleküls (III) mit der Zielsequenz.
4 ist eine graphische Darstellung der Anregungs- und Emissionsspektren des biarsenisches Molekül (III)/Zielsequenz-Komplexes.
5 ist eine graphische Darstellung der Fluoreszenzintensität gegenüber der Zeit in Experimenten mit lebenden HeLa-Zellen. HeLa-Zellen waren entweder nicht transfiziert oder mit dem Gen für die Cyan-Mutante des grün fluoreszierenden Proteins, fusioniert an die Zielsequenz, transfiziert. Die HeLa-Zellen wurden mit dem biarsenischen Molekül (III) inkubiert.
6 zeigt biarsenische Moleküle mit nachweisbaren Gruppen.
7 zeigt die Struktur eines tetraarsenischen Moleküls (VIII).
8 zeigt biarsenische Moleküle mit nachweisbaren Gruppen.
9 zeigt biarsenische Moleküle mit nachweisbaren Gruppen.
10 zeigt ein biarsenisches Molekül, bei dem das Fluoreszenzsignal gegenüber einer lokalen Lösungsmittelpolarität empfindlich ist.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Biarsenisches Molekül
Erfindungsgemäß werden biarsenische Moleküle der vorstehend in der Zusammenfassung der Erfindung beschriebenen Formel bereitgestellt. Erfindungsgemäß sind auch Tautomere, Anhydride und Salze des biarsenischen Moleküls eingeschlossen. 1 zeigt beispielhafte Paare von biarsenischen Molekülen, die Tautomere, Anhydride oder Salze voneinander sind.
Eine Reihe von Dithiolen können zum Anbinden der Arsenatome verwendet werden. Die Dithiolgruppen können das biarsenisches Molekül vor einer Umsetzung mit Stellen niedriger Affinität, z.B. einzelnen Cysteinresten oder Dihydroliponsäuregruppen, schützen. Das Dithiol kann einen 5- oder 6-gliedrigen Ring mit dem Arsenatom ausbilden. Vicinale Dithiole, die 5-gliedrige Ringe ausbilden, sind bevorzugt. Typischerweise können die 5-gliedrigen Ringe stabiler sein. 1,3-Dithiole, die 6-gliedrige Ringe ausbilden, können auch verwendet werden.
Das Dithiol kann zusätzliche Substituenten enthalten, um die Flüchtigkeit, Wasserlöslichkeit, Protonen-Ionisationskonstanten, das Redoxpotential und die Tendenz zur Komplexierung mit dem Arsenatom zu steuern. Ein Erhöhen des Molekulargewichts kann die Flüchtigkeit und den Geruch vermindern. Polare Substituenten wie Hydroxymethyl-, Carboxyl- und Sulfogruppen vermindern die Flüchtigkeit und erhöhen die Wasserlöslichkeit. Jedoch können diese Substituenten auch die Fähigkeit des biarsenischen Moleküls, eine biologische Membran zu durchqueren, vermindern. Dithiole, die Ringe enthalten, können die Affinität des Dithiols gegenüber dem Arsenatom dadurch erhöhen, dass die zwei Thiolgruppen in eine cis-Konformation organisiert werden, die bereit ist, einen zusätzlichen Ring mit dem Arsenatom auszubilden. Beispiele von Dithiolringen sind 1,2-Benzoldithiol und 1,2-Cyclohexandithiol.
Vorzugsweise ist jedes Arsenatom in dem biarsenischen Molekül an ein Dithiol, wie 1,2-Ethandithiol (EDT), gebunden. Ein unerwarteter Vorteil des biarsenischen Moleküls der Formel (III), das an EDT gebunden ist, besteht darin, dass es im Wesentlichen vollständig nicht fluoreszierend ist. Biarsenische Moleküle, die nachweisbare Fluoreszenz aufweisen, liegen auch innerhalb des Umfangs der Erfindung.
"Q" in Formel (I) ist vorzugsweise ein Spirolakton. Besonders bevorzugt ist ein biarsenisches Molekül, bei dem Q ein bicyclisches Spirolakton wie in Formel (III) ist. Die Tautomere, Anhydride und Salze des Moleküls (III) liegen auch innerhalb des Umfangs der Erfindung.
Das biarsenische Molekül kann dahingehend konstruiert sein, um eine Vielzahl von nachweisbaren Gruppen zu enthalten. "Nachweisbare Gruppe", wie hierin verwendet, betrifft ein jegliches Atom oder Molekül, das in das biarsenische Molekül eingebaut werden kann, um den Nachweis des biarsenischen Moleküls zu unterstützen, ohne die Fähigkeit des biarsenischen Moleküls, mit einer Zielsequenz zu reagieren, signifikant aufzuheben.
Das biarsenische Molekül kann an einer oder mehreren Positionen substituiert sein, um eine Signal-erzeugende nachweisbare Gruppe anzufügen. Ein Einbau von mehr als einer nachweisbaren Gruppe liegt auch innerhalb des Umfangs der Erfindung. Die Auswahl einer nachweisbaren Gruppe kann auf der Einfachheit des Protokolls zum Einbau der nachweisbaren Gruppe in das biarsenische Molekül und auf die Endverwendung des biarsenischen Moleküls basieren. Beispiele für nachweisbare Gruppen beinhalten fluoreszierende Gruppen, phosphoreszierende Gruppen, lumineszierende Gruppen, Spinmarkierungen, Photosensibilisatoren, photospaltbare Gruppen, chelatierende Zentren, Schweratome, radioaktive Isotope, Isotope, die durch Kernmagnetresonanz nachweisbar sind, paramagnetische Atome und Kombinationen davon. Die 6, 8 und 9 zeigen biarsenische Moleküle mit einigen der vorstehend beschriebenen nachweisbaren Gruppen. 10 zeigt ein biarsenisches Molekül, bei dem das Fluoreszenzsignal gegenüber lokaler Lösungsmittelpolarität empfindlich ist.
Typischerweise erzeugt eine nachweisbare Gruppe ein nachweisbares Signal, das leicht überwacht werden kann. Beispiele für nachweisbare Signale, die überwacht werden können, beinhalten Fluoreszenz, Fluoreszenzanisotropie, zeitaufgelöste Lumineszenz, Phosphoreszenzamplitude und -anisotropie, Elektronspinresonanz (ESR), Erzeugung von Singulett-Sauerstoff, Hydroxyradikal-vermittelte Proteininaktivierung, Wahrnehmung von Metallionen, Röntgenstrahlstreuung, Radioaktivität, Kernmagnetresonanz-Spektroskopie des angehängten Isotops und erhöhte Fähigkeit zur Relaxation von Protonen in der unmittelbaren Umgebung einer paramagnetischen Spezies.
Andere modifizierende Gruppen, die die Verwendung des biarsenischen Moleküls unterstützen, können auch eingebaut sein. Zum Beispiel kann das biarsenische Molekül an einer oder mehreren Positionen substituiert sein, um eine Festphasen-bindende Gruppe oder eine quervernetzende Gruppe anzufügen. Das biarsenische Molekül kann an eine Festphase gekoppelt sein.
Das biarsenische Molekül ist vorzugsweise fähig, eine biologische Membran zu durchqueren. Die kleine Größe des biarsenischen Moleküls kann zu der Fähigkeit des biarsenischen Moleküls, eine biologische Membran zu durchqueren, beitragen. Biarsenische Moleküle von weniger als 800 Dalton sind für eine Membrandurchquerung bevorzugt.
Die Polarität des biarsenischen Moleküls kann auch die Fähigkeit des biarsenischen Moleküls, eine biologische Membran zu durchqueren, bestimmen. Im Allgemeinen durchquert ein hydrophobes biarsenisches Molekül wahrscheinlicher eine biologische Membran. Das Vorhandensein von polaren Gruppen kann die Wahrscheinlichkeit, dass ein Molekül eine biologische Membran durchquert, vermindern. Ein biarsenisches Molekül, das nicht fähig ist, eine biologische Membran zu durchqueren, kann derivatisiert werden. Das biarsenische Molekül kann durch Anbringung von Gruppen derivatisiert werden, die die Fähigkeit des biarsenischen Moleküls, eine biologische Membran zu durchqueren, ermöglichen oder verstärken. Vorzugsweise verändert eine solche Derivatisierung des biarsenischen Moleküls die Fähigkeit des biarsenischen Moleküls, anschließend mit der Zielsequenz zu reagieren, nicht signifikant. Das biarsenische Molekül kann auch transient derivatisiert sein. In solchen Fällen wird nach Durchqueren der Membran die derivatisierende Gruppe eliminiert, um das ursprüngliche biarsenische Molekül wieder zu erzeugen. Beispiele für Derivatisierungsverfahren, die eine Fähigkeit zum Durchqueren einer Membran erhöhen, beinhalten eine Veresterung von Phenolen, eine Etherbildung mit Acyloxyalkylgruppen und eine Reduktion von Chromophoren zu ungeladenen Leukoverbindungen.
In einigen Ausführungsformen kann das biarsenische Molekül nahezu oder vollständig nicht nachweisbar sein, bis es spezifisch mit einer Zielsequenz reagiert. Die Erfinder haben überraschenderweise festgestellt, dass das biarsenische Molekül (III) nicht fluoreszierend ist, sogar, obwohl es aus einem fluoreszierenden Molekül (Stamm-Fluorescein) synthetisiert ist. Das biarsenische Molekül (III) reagiert spezifisch mit einer Zielsequenz, um einen biarsenisches Molekül (III)/Zielsequenz-Komplex, der fluoresziert, auszubilden. Außerdem ist das Fluoreszenzsignal, das durch diesen Komplex erzeugt wird, um etwa 20 nm relativ zu Fluorescein rot verschoben. Das biarsenische Molekül kann besonders nützlich sein, da es ein Mittel zum spezifischen und akkuraten Nachweis des Vorhandenseins des biarsenisches Molekül/Zielsequenz-Komplexes mit einem sehr geringen Hintergrundsignal bereitstellt.
Auch innerhalb des Umfangs der Erfindung liegt ein biarsenisches Molekül, das vor und nachdem es spezifisch mit einer Zielsequenz reagiert, um den biarsenisches Molekül/Zielsequenz-Komplex auszubilden, nachweisbar sein kann. In solchen Fällen ist es bevorzugt, dass das Signal des biarsenischen Moleküls von dem Signal des Komplexes unterschieden werden kann. Zum Beispiel würde, falls das detektierbare Signal des biarsenischen Moleküls ein Fluoreszenzsignal ist, es bevorzugt sein, dass die Fluoreszenz des Komplexes relativ zu dem biarsenischen Molekül alleine rot verschoben oder blau verschoben ist. Dem biarsenischen Molekül kann auch ein nachweisbares Signal fehlen, sowohl bevor als auch sogar nachdem es spezifisch mit einer Zielsequenz reagiert hat. Diese biarsenischen Moleküle können in vielen Techniken, die kein detektierbares Signal benötigen oder die andere Nachweisverfahren verwenden, nützlich sein. Diese biarsenischen Moleküle können nützlich sein, wenn das Ziel eine Anbindung eines Polypeptids an ein festes Substrat, eine Vernetzung zweier Polypeptide oder eine Förderung, eine Polypeptid-Domäne α-helikal zu machen, ist.
Jedes der zwei trivalenten Arsenatome in dem biarsenischen Molekül kann mit einem Paar von benachbarten Cysteinen reagieren. Folglich kann das biarsenische Molekül spezifisch mit vier Cysteinen, die in einer geeigneten Konfiguration angeordnet sind, reagieren.
Ein besonders nützlicher Vorteil der spezifischen Reaktion zwischen dem biarsenischen Molekül und einer Zielsequenz ist die Reversibilität der Reaktion. Ein Komplex, der das biarsenische Molekül und die Zielsequenz enthält, kann dissoziiert werden. Eine Dissoziation kann dadurch erreicht werden, dass ein Überschuss von Reagenzien wie EDT, wie nachstehend in Beispiel 2 beschrieben, oder anderen ähnlichen Dithiolen bereitgestellt wird.
Im Allgemeinen kann das biarsenische Molekül durch eine kurze Synthese hergestellt werden. 3 zeigt die Synthese des biarsenischen Moleküls (III) aus käuflich erhältlichem Fluoreszein-Quecksilberacetat (FMA). Ein Ersetzen der zwei Quecksilberatome durch Arsenatome kann durch Palladiumdiacetat katalysiert werden. Das sich ergebende 4',5'-Bisdichlorarsenfluorescein muss nicht isoliert werden, sondern kann direkt mit EDT gekoppelt werden. Das biarsenische Molekül (III) kann sodann auf Silicagel aufgereinigt werden.
"Tetraarsenische" Moleküle, wie hierin verwendet, betreffen Moleküle, die vier Arsenatome enthalten. In einigen Ausführungsformen sind tetraarsenische Moleküle zwei biarsenische Moleküle, die miteinander über eine verbindende Grup pe chemisch gekoppelt sind. Tetraarsenische Moleküle können auf einer Vielzahl von Wegen synthetisiert werden. 2 zeigt ein Schema zum Synthetisieren von tetraarsenischen Molekülen, die zwei biarsenische Moleküle aufweisen, die durch entweder eine para- oder eine meta-Dicarboxylbenzolgruppe gekoppelt sind. Die Synthese in 2 führt zu zwei Arten von Molekülen, einem meta- und einem para-substituierten tetraarsenischen Molekül. 7 ist ein weiteres Beispiel eines tetraarsenischen Moleküls, das durch eine Dialkylamido-verbindende Gruppe gekoppelt ist. Andere geeignete verbindende Gruppen beinhalten Phenyl-, Naphthyl- und Biphenylgruppen. Es folgt, dass das tetraarsenische Molekül mit zwei Zielsequenzen reagieren kann. Tetraarsenische Moleküle können als quervernetzende Mittel, z.B. intramolekulare und intermolekulare quervernetzende Mittel, besonders nützlich sein.
Zielsequenz
Im Allgemeinen beinhaltet die Zielsequenz ein oder mehrere Cysteine, vorzugsweise vier Cysteine, die in einer geeigneten Konfiguration zum Reagieren mit dem biarsenischen Molekül vorliegen. Die Zielsequenz allein kann fähig sein, mit dem biarsenischen Molekül zu reagieren. Die Zielsequenz kann hinsichtlich der Größe variieren. Typischerweise enthält sie mindestens 6 Aminosäuren. Vorzugsweise ist die Zielsequenz mindestens 10 Aminosäuren lang. Alternativ dazu kann die Zielsequenz lediglich eine geeignete Konfiguration annehmen, wenn sie mit einem Trägermolekül assoziiert ist. Zum Beispiel kann das biarsenische Molekül mit einer Zielsequenz lediglich dann reagieren, wenn die Zielsequenz in einer α-helikalen Domäne eines Polypeptids vorliegt.
Die Zielsequenz kann eine Aminosäuresequenz derart aufweisen, dass zwei Paare von Cysteinen derart angeordnet sind, damit sie von der gleichen Seite einer α-Helix herausragen. Vorzugsweise bilden die vier Schwefelatome der Cysteine ein Parallelogramm.
Die Zielsequenz allein kann unter den Reaktionsbedingungen nicht vollständig helikal sein. Zum Beispiel kann eine Reaktion eines ersten Arsenatoms mit einem Paar von Cysteinen eine α-Helix nukleieren und die zwei anderen Cysteine günstigerweise zum Reagieren mit dem anderen Arsenatom des biarsenischen Moleküls positionieren.
Die Sekundärstruktur der Zielsequenz kann eine α-Helix sein. Eine α-helikale Zielsequenz kann eine primäre Aminosäuresequenz aus cys-cys-X-Y-cys-cys beinhalten. Die Cysteine in dieser primären Aminosäuresequenz sind für eine Förderung der Wechselwirkung von Arsenatomen über helikale Bindungen positioniert. Die vier Cysteinreste dieser Sequenz enthalten die Schwefelatome, die spezifisch mit dem biarsenischen Molekül reagieren. In dieser Sequenz können X und Y eine jegliche Aminosäure, einschließlich Cystein, sein. In einigen Ausführungsformen können X und Y die gleiche Aminosäure sein und in anderen Ausführungsformen können X und Y unterschiedliche Aminosäuren sein. Die Verwendung von natürlichen Aminosäuren ist bevorzugt. Bevorzugte Aminosäuren an den Positionen X und Y sind Aminosäuren mit einer hohen α-helikalen Neigung. Aminosäuren, die eine hohe α-helikale Neigung aufweisen, beinhalten Alanin, Leucin, Methionin und Glutamat.
Eine Bildung einer α-Helix kann auch durch Einbau von entgegengesetzt geladenen Aminosäuren gefördert werden, die durch etwa 3 Aminosäuren getrennt sind. Diese entgegengesetzt geladenen Aminosäuren können genau platziert sein, um Salzbrücken über eine Windung einer α-Helix auszubilden. Ein Beispiel eines Paars von entgegengesetzt geladenen Aminosäuren ist Arginin und Glutamat; vgl. Merutka & Stellwagen, Biochemistry 30:1591-1594 und 4245-4248 (1991). Es ist bevorzugt, Glutamat in Richtung des N-Terminus der α-Helix und Arginin in Richtung des C-Terminus für eine günstige Wechselwirkung mit dem Dipol einer α-Helix anzuordnen. Der N-Terminus der Zielsequenz kann acetyliert sein. Der C-Terminus der Zielsequenz kann amidiert sein.
Eine Zielsequenz mit anderen Sekundärstrukturen liegt auch innerhalb des Umfangs der Erfindung. Zum Beispiel können die ein oder mehreren Cysteine der Zielsequenz innerhalb einer β-Faltblatt-Struktur liegen. Andere Sekundärstrukturen sind möglich, solang die Zielsequenz mit dem biarsenischen Molekül reagieren kann.
Ein Beispiel einer Zielsequenz ist SEQ ID NO:1 als auch Varianten davon, die eine Reaktivität mit dem biarsenischen Molekül beibehalten. In dieser Zielsequenz ist der N-Terminus acetyliert und der C-Terminus ist amidiert. Eine Zielsequenz, die an dem N- und C-Terminus nicht acetyliert und amidiert ist, liegt auch innerhalb des Umfangs der Erfindung. "Abweichende" Zielsequenzen enthalten eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, typischerweise mit Aminosäuresub stituten mit etwa der gleichen Ladung und Polarität. Solche Substitutionen können z.B. Substitutionen innerhalb der folgenden Gruppen beinhalten: Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin; Asparaginsäure, Glutaminsäure; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Lysin, Arginin; und Phenylalanin, Tyrosin. Im Allgemeinen beeinflussen solche Substitutionen nicht signifikant die Funktion eines Polypeptids. Verfahren zum Herstellen von Zielsequenzen beinhalten Verfahren der Molekularbiologie und Verfahren der chemischen Polypeptid-Synthese.
Bindepartner
Der Bindepartner beinhaltet eine cysteinhaltige Zielsequenz, die spezifisch mit dem biarsenischen Molekül reagiert. Zusätzlich zu der Zielsequenz kann der Bindepartner ein Trägermolekül beinhalten, das mit der Zielsequenz assoziiert ist. Beispiele für Trägermoleküle beinhalten Polypeptide, Nukleinsäuren, Zucker, Kohlenhydrate, Lipide, natürliche Polymere, synthetische Polymere und andere biologisch oder chemisch aktive Moleküle.
Polypeptid-Bindepartner
In einigen Ausführungsformen kann das Trägermolekül ein Polypeptid sein. In solchen Fällen wird das Polypeptid als ein Trägerpolypeptid bezeichnet. In diesen Ausführungsformen beinhaltet der Bindepartner das Trägerpolypeptid, das mit der Zielsequenz assoziiert ist. Ein "Polypeptid-Bindepartner", wie hierin verwendet, betrifft einen Bindepartner, der ein Trägerpolypeptid und eine Zielsequenz beinhaltet. Das Trägerpolypeptid kann ein jegliches Polypeptid von Interesse sein. Beispiele für Trägerpolypeptide beinhalten Antikörper, Rezeptoren, Hormone, Enzyme, Bindeproteine und Fragmente davon.
Die Zielsequenz und das Trägerpolypeptid können miteinander kovalent assoziiert sein. Alternativ dazu können das Trägerpolypeptid und die Zielsequenz nicht kovalent assoziiert sein.
Die Position der Zielsequenz hinsichtlich des Trägerpolypeptids kann in einem Bindepartner variieren. Die Zielsequenz kann an das C-terminale Ende des Trägerpolypeptids gebunden sein. Alternativ dazu kann die Zielsequenz an das N-terminale Ende des Trägerpolypeptids gebunden sein.
Die Zielsequenz kann auch intern zu dem Trägerpolypeptid liegen. Eine innere Zielsequenz kann dadurch hergestellt werden, dass die Zielsequenz an einer inneren Stelle in das Trägerpolypeptid inseriert wird. Alternativ dazu kann eine innere Zielsequenz dadurch erzeugt werden, dass eine oder mehrere Aminosäuren des Polypeptids modifiziert werden, um eine Zielsequenz zu erzeugen. Solche inneren Stellen werden typischerweise aus deren α-helikalen Strukturen ausgewählt. Computeralgorithmen und Röntgenstrahl-Kristallographiedaten können verwendet werden, um α-helikale Strukturen innerhalb von Polypeptiden zu identifizieren.
In einigen Ausführungsformen sind die Zielsequenz und das Trägerpolypeptid zueinander heterolog. Das Trägerpolypeptid und die Zielsequenz können auch heterolog sein, falls die Aminosäuresequenz des Trägerpolypeptids an einer oder mehreren Aminosäurepositionen verändert ist, um die Zielsequenz zu erzeugen.
Jegliche der erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide und/oder Zielsequenzen, die kollektiv hierin als "Polypeptide" bezeichnet werden, können durch solche üblicherweise verwendeten Verfahren wie ein t-BOC- oder FMOC-Schützen von α-Aminogruppen synthetisiert werden. Beide Verfahren beinhalten schrittweise Synthesen, wodurch eine einzelne Aminosäure bei jedem Schritt angefügt wird, ausgehend von dem C-Terminus des Peptids (vgl. Coligan et al., Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991, Einheit 9). Polypeptide können auch durch bekannte Festphasen-Peptidsyntheseverfahren, die in Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1962) und Stewart und Young, Solid Phase Peptides Synthesis (Freeman, San Francisco, 1969, S. 27-62) beschrieben sind, unter Verwendung eines Copoly(styrol-divinylbenzols) mit 0,1-1,0 mmol Aminen/g Polymer synthetisiert werden. Nach Abschluss der chemischen Synthese können die Polypeptide entschützt und von dem Polymer durch Behandlung mit flüssigem HF-10% Anisol für etwa ¼-1 Stunde bei 0°C abgespalten werden. Nach Verdampfen der Reagenzien werden die Polypeptide von dem Polymer mit einer 1%igen Essigsäurelösung extrahiert, was sodann lyophilisiert wird, um das Rohmaterial zu ergeben. Dies kann normalerweise durch solche Techniken wie Gelfiltration auf Sephadex G-15 unter Verwendung von 5% Essigsäure als einem Lösungsmittel aufgereinigt werden. Eine Lyophilisation von geeigneten Fraktionen der Säule wird das homogene Polypeptid oder Polypeptid-Derivate ergeben, die sodann durch Standardtechniken wie Aminosäureanalyse, Dünnschichtchromatographie, Hochleistungs-Flüssigchromatographie, Ultraviolett-Absorp tionsspektroskopie, molare Rotation, Löslichkeit charakterisiert und durch Festphasen-Edman-Abbau quantifiziert werden können.
Polypeptide können auch durch die "native chemische" Ligationstechnik hergestellt werden, die Polypeptide miteinander verbindet (Dawson et al., Science 266:776, 1994). Proteinsequenzierungs-, Struktur- und Modellierungsansätze für eine Verwendung mit einer Reihe der vorstehend beschriebenen Techniken sind in Protein Engineering, loc. cit., und Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 1 & 2, supra, beschrieben.
Die Polypeptide können auch Nicht-Polypeptidverbindungen sein, die die spezifische Reaktion und Funktion eines Polypeptids nachahmen ("Mimetika"). Mimetika können durch den Ansatz hergestellt werden, der in Saragovi et al., Science 253:792-795 (1991) zusammengefasst ist. Mimetika sind Moleküle, die Elemente einer Polypeptid-Sekundärstruktur nachahmen; vgl. z.B. Johnson et al., "Peptide Turn Mimetics", in Biotechnology and Pharmacy, Pezzuto et al., Hrsg. (Chapman und Hall, New York, 1993). Das zugrunde liegende Grundprinzip hinter der Verwendung von Peptidmimetika besteht darin, dass das Peptidrückgrat hauptsächlich deswegen existiert, um Aminosäure-Seitenketten in einer Weise zu orientieren, um molekulare Wechselwirkungen zu erleichtern. Für die erfindungsgemäßen Zwecke können geeignete Mimetika als das Äquivalent eines jeglichen der erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide angesehen werden.
Vektor
Geeignete Polypeptide können auch durch Nukleinsäuretechniken erzeugt werden, die eine Expression von Nukleinsäuresequenzen beinhalten, die für die Polypeptide kodieren. Der Begriff "Vektor" betrifft ein Plasmid, Virus oder ein anderes Vehikel, das bekannt ist, das durch Insertion oder Einbau einer Nukleinsäuresequenz manipuliert wurde.
Verfahren, die bekannt sind, können verwendet werden, um Vektoren zu konstruieren, einschließlich in vitro-rekombinanter DNA-Techniken, synthetischer Techniken und in vivo-Rekombination/genetischer Techniken. (Vgl. z.B. die Techniken, die in Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., beschrieben sind.) Geeignete Vektoren beinhalten Expressionsvektoren auf T7-Basis für eine Expression in Bakterien (Rosenberg et al., Gene 56:125, 1987), den pMSXND-Expressionsvektor für eine Expression in Säugerzellen (Lee und Nathans, J. Biol. Chem. 263:3521, 1988) und von Baculovirus abstammende Vektoren für eine Expression in Insektenzellen. Retrovirale Vektoren können auch verwendet werden. Beispiele für retrovirale Vektoren beinhalten Moloney-Maus-Leukämievirus (MoMuLV), Harvey-Maus-Sarcomavirus (HaMuS-V), Maus-Brusttumorvirus (MuMTV) und Rous-Sarcomavirus (RSV). Expressionsvektoren, die für eine in vitro-Expression geeignet sind, können auch verwendet werden.
Im Allgemeinen beinhaltet der Vektor eine Nukleinsäuresequenz, die für die Zielsequenz kodiert. Typischerweise ist die Nukleinsäuresequenz eine DNA-Sequenz, obwohl die Nukleinsäure auch eine RNA-Sequenz sein kann. Die Nukleinsäuresequenz kann eine jegliche Sequenz sein, die für eine Zielsequenz kodiert, die zum Reagieren mit dem biarsenischen Molekül fähig ist. Dies kann Nukleinsäuresequenzen beinhalten, die degenerierte Varianten voneinander sind. "Degenerierte Varianten" betreffen Nukleinsäuresequenzen, die für die gleiche Aminosäuresequenz kodieren, aber bei denen mindestens ein Kodon in der Nukleinsäuresequenz unterschiedlich ist. Degenerierte Varianten treten aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes auf, wodurch zwei oder mehrere unterschiedliche Kodons für die gleiche Aminosäure kodieren können. Erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen können synthetisch sein.
Der Vektor kann auch eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Trägerpolypeptid kodiert, zusätzlich zu der Nukleinsäuresequenz, die für die Zielsequenz kodiert, enthalten. Nukleinsäuresequenzen, die für das Trägerpolypeptid und die Zielsequenz kodieren, können ein rekombinantes Gen bilden, das, wenn es exprimiert wird, einen Polypeptid-Bindepartner erzeugt.
Die Nukleinsäuresequenz, die für die Zielsequenz kodiert, kann an dem 5'- oder 3'-Ende der Nukleinsäuresequenz, die für das Trägerpolypeptid kodiert, liegen. Alternativ dazu kann die Nukleinsäuresequenz, die für die Zielsequenz kodiert, intern zu der Nukleinsäuresequenz, die für das Trägerpolypeptid kodiert, liegen. In einem solchen Fall kann die Nukleinsäuresequenz, die für die Zielsequenz kodiert, in eine innere Stelle der Nukleinsäuresequenz, die für das Trägerpolypeptid kodiert, gespleißt werden. In diesem Fall wird die Nukleinsäuresequenz, die für die Zielsequenz kodiert, durch Nukleinsäuresequenzen, die für das Trägerpolypeptid kodieren, flankiert.
Die Nukleinsäuresequenz, die für das Trägerpolypeptid kodiert, kann eine geeignete Restriktionsenzymstelle innerhalb ihrer Nukleinsäuresequenz enthalten, die zum Inserieren der Nukleinsäuresequenz, die für die Zielsequenz kodiert, verwendet werden kann. Alternativ dazu kann eine geeignete Restriktionsenzymstelle in die Nukleinsäuresequenz, die für das Trägerpolypeptid kodiert, bei einer gewünschten Stelle eingebracht werden. Eine Restriktionsenzymstelle kann durch eine jegliche Reihe von bekannten Verfahren eingebracht werden.
Die Nukleinsäuresequenz, die für das Trägerpolypeptid kodiert, kann an einer oder mehreren Positionen verändert sein, um die Nukleinsäuresequenz, die für die Zielsequenz kodiert, zu erzeugen. Zum Beispiel kann Calmodulin verändert werden, um eine Zielsequenz zu erzeugen, wie in Beispiel 3 beschrieben. In einigen Ausführungsformen können Veränderungen in der Nukleinsäuresequenz, die für das Trägerpolypeptid kodiert, vorgenommen werden, um eine Nukleinsäure zu erzeugen, die für eine Zielsequenz kodiert, ohne die Funktion des Trägerpolypeptids wesentlich zu beeinflussen.
Stellen-spezifische und Bereichs-gerichtete Mutagenesetechniken als auch rekombinante Standardtechniken können verwendet werden, um einige der Nukleinsäuresequenzen, die für die erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide kodieren, zu erzeugen; vgl. Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 1, Kapitel 8 (Ausubel et al., Hrsg., J. Wiley & Sons 1989 & Supp. 1990-93); Protein Engineering (Oxender & Fox, Hrsg., A. Liss, Inc. 1987). Zusätzlich können Linker-Scanning- und PCR-vermittelte Techniken für eine Mutagenese verwendet werden; vgl. PCR Technology (Erlich Hrsg., Stockton Press 1989); Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 1 & 2, supra.
Der Vektor kann auch eine Reihe von Regulatorelementen für ein Antreiben einer Expression der Polypeptide enthalten. Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide kodieren, können mit einem Regulatorelement operativ assoziiert sein. Regulatorelemente beinhalten in nicht begrenzender Weise induzierbare und nicht induzierbare Promotoren, Enhancer, Operatoren und andere Elemente, die eine Genexpression antreiben oder anderweitig regulieren.
Typischerweise ist eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid kodiert, operativ an einen Promotor gebunden, der in einer geeigneten Umgebung, d.h. einer Wirtszelle, aktiv ist. Eine Vielzahl von geeigneten Promotoren sind bekannt und können erfindungsgemäß verwendet werden. Der Promotor kann ein Promotor sein, der natürlicherweise eine Expression des Trägerpolypeptids antreibt. Der Promotor kann ein viraler Promotor, ein bakterieller Promotor, ein Hefepromotor, Insektenpromotor oder ein Pflanzenpromotor sein und kann spezifisch für eine Wirtszelle sein. Beispiele für Promotoren beinhalten in nicht begrenzender Weise T7-, Metallothionein I- oder Polyhedron-Promotoren. Zum Beispiel können, falls die Polypeptide in einem bakteriellen System exprimiert werden, induzierbare Promotoren wie pL von Bakteriophage gamma, plac, ptrp, ptac (trp-lac-Hybridpromotor) und dergleichen verwendet werden. In Säugerzellsystemen können Promotoren, die sich von dem Genom von Säugerzellen (z.B. Metallothioneinpromotor) oder von Säugerviren (z.B. die Retrovirus lange terminale Wiederholung, der späte Adenoviruspromotor, der Vacciniavirus 7.5K-Promotor) ableiten, verwendet werden. Promotoren, die durch rekombinante DNA- oder synthetische Techniken erzeugt wurden, können auch verwendet werden.
Der Vektor kann auch Enhancersequenzen beinhalten. Enhancersequenzen können in eine Vielzahl von Stellen hinsichtlich der Polypeptid-kodierenden Nukleinsäuresequenzen platziert werden. Zum Beispiel können Enhancersequenzen stromaufwärts oder stromabwärts zu den kodierenden Sequenzen platziert werden und sie können benachbart zu oder in einem Abstand von den Polypeptid-kodierenden Nukleinsäuresequenzen lokalisiert sein.
Der Vektor kann auch eine Nukleinsäuresequenz enthalten, die für einen selektierbaren Marker für eine Verwendung zum Identifizieren von Wirtszellen mit einem Vektor kodiert. Ein selektierbarer Marker in einem Vektor verleiht typischerweise eine gewisse Form einer Arzneimittel- oder Antibiotikaresistenz an die Wirtszellen, die den Vektor tragen.
Eine Reihe von Selektionssystemen kann verwendet werden. In bakteriellen Wirtszellen können eine Reihe von Antibiotika-Markern verwendet werden. Antibiotika-Marker beinhalten Tetracyclin, Ampicillin und Kanamycin. In Säugerwirtszellen beinhalten Selektionssysteme in nicht begrenzender Weise Herpes simplex-Virus-Thymidinkinase (Wigler et al., 1977, Cell 11:223), Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026) und Adenin-Phosphoribosyltransferase (Lowy et al., 1980, Cell 22:817). Auch kann eine Antimetabolit-Resistenz als die Grundlage einer Selektion für dhfr-Gene, die eine Resistenz gegenüber Methotrexat verleihen (Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567, O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527), gpt-Gene, die eine Resistenz gegenüber Mycophenolsäure verleihen (Mullugan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072), neo-Gene, die eine Resistenz gegenüber dem Aminoglycosid G-418 verleihen (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1) und hygro-Gene, die eine Resistenz gegenüber Hygromycin verleihen (Santerre et al., 1984, Gene 30:147), verwendet werden. Zusätzliche selektierbare Gene beinhalten trpB, was Zellen ermöglicht, Indol anstelle von Tryptophan zu verwenden, hisD, was Zellen ermöglicht, Histinol anstelle von Histidin zu verwenden (Harman & Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047) und ODC (Ornithindecarboxylase), was eine Resistenz gegenüber dem Inhibitor der Ornithindecarboxylase, 2-(Difluormethyl)-DL-ornithin, DFMO (McConlogue L., 1987, in: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory Hrsg.), verleiht.
Wirtszelle
Eine Wirtszelle kann einen exogenen Bindepartner tragen. "Exogen", wie hierin verwendet, betrifft jegliche Moleküle, die in eine Wirtszelle eingebracht werden. In bevorzugten Ausführungsformen ist der exogene Bindepartner ein Polypeptid-Bindepartner.
Eine "Wirtszelle" kann eine jegliche Zelle sein, die zum Tragen eines exogenen Bindepartners fähig ist. Beispiele für Wirtszellen beinhalten bakterielle Zellen, Hefezellen, Insektenzellen, Säugerzellen und Pflanzenzellen. Ein geeigneter Typ von Wirtszellen beinhaltet eine Zelle der nachstehenden Typen: HeLa-Zellen, NIH 3T3 (Maus), Mv 1 lu (Nerz), BS-C-1 (Afrikanische Grüne Meerkatze) und menschliche embryonale Nieren (HEK) 293-Zellen. Solche Zellen sind z.B. in dem Cell Line-Katalog der American Type Culture Collection (ATCC) beschrieben. Zellen, die stabil einen Vektor beibehalten können, können besonders vorteilhaft sein; vgl. z.B. Ausubel et al., Introduction of DNA Into Mammalian Cells, in Current Protocols in Molecular Biology, Abschnitte 9.5.1-9.5.6 (John Wiley & Sons, Inc. 1995). Vorzugsweise exprimieren Wirtszellen nicht natürlicherweise Polypeptide mit Zielsequenzen, die mit erfindungsgemäßen Molekülen reagieren.
Ein exogener Bindepartner kann in eine Wirtszelle durch eine Vielzahl von geeigneten Techniken eingebracht werden. Diese Techniken beinhalten Mikroinjek tion von Bindepartnern und Expression innerhalb einer Zelle von Nukleinsäuren, die für Bindepartner kodieren.
Eine Wirtszelle kann zum Tragen eines exogenen Bindepartners dadurch manipuliert werden, dass eine Nukleinsäuresequenz eingebracht wird, die, wenn sie exprimiert wird, den Bindepartner erzeugt. Ein jeglicher der vorstehend beschriebenen Vektoren mit einer Nukleinsäuresequenz, die für einen Bindepartner kodiert, kann in eine Wirtszelle eingebracht werden. Ein nicht replizierendes Nukleinsäuremolekül wie ein lineares Molekül, das einen Bindepartner exprimieren kann, liegt auch innerhalb des Umfangs der Erfindung.
Die Expression eines gewünschten Nukleinsäuremoleküls kann durch eine transiente Expression der eingebrachten Polypeptid-kodierenden Nukleinsäuresequenz auftreten. Alternativ dazu kann eine dauerhafte Expression durch eine Integration der eingebrachten Nukleinsäuresequenz in ein Wirtschromosom auftreten. Folglich können die Zellen stabil oder transient transformiert sein. Der Begriff "Wirtszelle" kann auch einen jeglichen Abkömmling einer Wirtszelle beinhalten. Es soll verstanden werden, dass alle Abkömmlinge hinsichtlich der Elternzelle nicht identisch sein können, da Mutationen auftreten können, die während einer Replikation auftreten. Jedoch sind solche Abkömmlinge eingeschlossen, wenn der Begriff "Wirtszelle" verwendet wird.
Typischerweise wird der Vektor, der die Nukleinsäuresequenz beinhaltet, die für den Bindepartner kodiert, in eine Wirtszelle eingebracht. Verfahren für eine stabile Überführung, was bedeutet, dass der Vektor mit der Bindepartner-kodierenden Nukleinsäuresequenz kontinuierlich in dem Wirt beibehalten wird, sind bekannt. Der Vektor mit geeigneten Regulatorelementen für eine Expression in einer Wirtszelle kann wie vorstehend beschrieben konstruiert werden.
Der Vektor kann in eine Wirtszelle durch ein jegliches herkömmliches Verfahren eingebracht werden, einschließlich einer retroviralen Transduktion, Elektroporation, Calciumphosphat-Co-Präzipitation, einem Einbringen basierend auf Biolistika und Liposomen; vgl. z.B. Ausubel et al., Introduction of DNA Into Mammalian Cells, in Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc. 1995).
Eine Vielzahl von Wirtszell-spezifischen Expressionsvektorsystemen kann verwendet werden, um Polypeptide in einer Wirtszelle zu exprimieren. Diese be inhalten Mikroorganismen wie Bakterien, die mit rekombinanten Bakteriophagen-DNA-, Plasmid-DNA- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren transformiert wurden, Hefe, die mit rekombinanten Hefe-Expressionsvektoren transformiert wurde, Pflanzenzellsysteme, die mit rekombinanten Virus-Expressionsvektoren (z.B. Blumenkohl-Mosaikvirus, CaMV; Tabakmosaikvirus, TMV) infiziert oder mit rekombinanten Plasmid-Expressionsvektoren (z.B. Ti-Plasmid) transformiert wurden, Insektenzellsysteme, die mit rekombinanten Virus-Expressionsvektoren (z.B. Bacculovirus) infiziert wurden, oder Tierzellsysteme, die mit rekombinanten Virus-Expressionsvektoren (z.B. Retroviren, Adenovirus, Vakziniavirus) infiziert wurden oder transformierte Tierzellsysteme, die für eine stabile Expression entworfen wurden. Polypeptide können translationale und/oder post-translationale Modifikationen wie eine Anfügung von Kohlenhydraten benötigen. Diese Modifikationen können durch eine Reihe von Systemen, z.B. Säuger-, Insekten-, Hefe- oder Planzen-Expressionssysteme, bereitgestellt werden.
Eukaryotische Systeme und vorzugsweise Säuger-Expressionssysteme ermöglichen, dass genaue post-translationale Modifikationen von exprimierten Säuger-Polypeptiden auftreten. Eukaryotische Zellen, die die zelluläre Maschinerie für ein genaues Prozessieren des primären Transkripts eine Glykosylierung, Phosphorylierung und vorteilhafterweise Plasmamembran-Insertion eines Polypeptids aufweisen, können als Wirtszellen verwendet werden.
Abhängig von der verwendeten Wirtszelle und dem verwendeten Vektorsystem kann ein jegliches einer Reihe von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen, einschließlich konstitutiver und induzierbarer Promotoren, Transkription-Enhancerelementen, Transkription-Terminatoren, usw., in dem Expressionsvektor (vgl. z.B. Bitter et al., 1987, Methods in Enzymology 153:516-544), wie vorstehend beschrieben, verwendet werden. Eine Selektion der geeigneten Transkriptions- und Translationselemente ist für den Fachmann leicht ersichtlich.
Vektoren auf der Basis von Rinder-Papillomavirus, die die Fähigkeit zur Replikation als extrachromosomale Elemente aufweisen, können von besonderem Interesse sein (Sarver et al., 1981, Mol. Cell. Biol. 1:486). Kurz nach Eintritt dieser DNA repliziert sich das Plasmid zu etwa 100 bis 200 Kopien pro Zelle. Eine Transkription der Polypeptid-kodierenden Nukleinsäuresequenzen benötigt keine Integration des Plasmids in das Wirtschromosom, wodurch ein hoher Grad an Expression erreicht wird. Diese Vektoren können für eine stabile Expression durch Einbringen eines selektierbaren Markers in das Plasmid, z.B. des neo-Gens, verwendet werden.
Wichtige Faktoren beim Selektieren eines spezifischen Expressionssystems beinhalten: die Einfachheit, mit der eine Wirtszelle, die den Vektor enthält, erkannt und von einer Wirtszelle selektiert werden kann, die den Vektor nicht enthält, die Anzahl von Kopien des Vektors, die in einer spezifischen Wirtszelle gewünscht sind, und ob es erwünscht ist, dass es möglich ist, den Vektor zwischen unterschiedlichen Arten von Wirtszellen "hin und her zu bewegen".
Verwendungen von biarsenischen Molekülen und Zielsequenzen
Das biarsenische Molekül zusammen mit der Zielsequenz bildet einen biarsenisches Molekül/Zielsequenz-Komplex, der in einer Reihe von Verfahren verwendbar ist. Der Komplex ist in Verfahren zum Markieren eines Trägermoleküls besonders verwendbar. Das Trägermolekül kann mit der Zielsequenz assoziiert sein, um einen Bindepartner zu bilden. Der Bindepartner kann durch ein jegliches Verfahren, einschließlich einer Reihe der vorstehend beschriebenen Verfahren, hergestellt werden. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Trägermolekül ein Polypeptid.
Ein Bindepartner, der eine Zielsequenz beinhaltet, wird mit dem biarsenischen Molekül in Kontakt gebracht. Ein Kontakt des biarsenischen Moleküls mit dem Bindepartner erfolgt unter Bedingungen, die geeignet sind, damit eine spezifische Reaktion zwischen dem biarsenischen Molekül und der Zielsequenz auf tritt, um den biarsenisches Molekül/Zielsequenz-Komplex zu bilden.
Ein biarsenisches Molekül/Zielsequenz-Komplex, der ein nachweisbares Signal erzeugt, kann verwendet werden, falls ein Nachweis eines markierten Trägermoleküls erwünscht ist. Ein spezifischer Vorteil einer Verwendung des biarsenischen Moleküls und der Zielsequenz zum Markieren ist die Spezifität und die Reversibilität der Wechselwirkung. Der biarsenisches Molekül/Zielsequenz-Komplex kann dissoziiert werden, z.B. nach dem Nachweis des Komplexes.
Das biarsenische Molekül kann zu einer Zusammensetzung gegeben werden, die die Zielsequenz beinhaltet. Das biarsenische Molekül kann fähig sein, eine Membran zu durchqueren, oder kann dazu nicht fähig sein. Der Bindepartner kann z.B. in einem Teströhrchen, einem Mikrotiter-Well vorhanden oder auf einer Festphase immobilisiert sein. Verwendungen des biarsenisches Molekül/Zielsequenz-Komplexes beinhalten Polypeptid-Aufreinigung, Immunoassays und andere biologische und chemische Tests.
Eine Immobilisierung entweder des biarsenischen Moleküls oder des Bindepartners an eine Festphase kann besonders nützlich sein. Eine Immobilisierung kann eine Adsorption, Absorption oder eine kovalente Bindung beinhalten. Eine Festphase kann inert sein oder sie kann für ein Koppeln reaktiv sein. Festphasen, die verwendet werden können, beinhalten Glas, Keramiken und natürliche und synthetische polymerische Materialien. Beispiele für polymerische Materialien beinhalten Materialien auf Cellulosebasis, Materialien auf Dextranbasis und Materialien auf Polystyrolbasis.
Das biarsenische Molekül kann mit einem Bindepartner in einer lebenden Zelle in Kontakt gebracht werden. Der Bindepartner kann in eine Zelle eingebracht oder innerhalb einer Zelle erzeugt werden. Ein biarsenisches Molekül, das zum Durchqueren einer biologischen Membran fähig ist, ist bevorzugt, wenn das biarsenische Molekül außerhalb der Zelle eingebracht wird und der Bindepartner innerhalb der Zelle vorliegt. Typischerweise ist ein Membran-durchquerendes biarsenisches Molekül für eine Verwendung innerhalb einer lebenden Zelle bevorzugt. Beispiele für Verwendungen des biarsenisches Molekül/Zielsequenz-Komplexes innerhalb von Zellen beinhalten Polypeptid-Wechselwirkungen, Polypeptid-Lokalisierung, Polypeptid-Quantifizierungen, Nukleinsäuremolekül-Identifikation und -Lokalisation. Eine Verwendung des biarsenischen Moleküls der Formel (III) zusammen mit der Zielsequenz in HeLa-Zellen ist in dem nachstehenden Beispiel 2 gezeigt.
Das biarsenische Molekül kann verwendet werden, um eine günstigere Konformation des Bindepartners zu induzieren. Zum Beispiel kann der Bindepartner zwei mögliche Konformationen aufweisen, aber eine der Konformationen kann funktionell wichtiger sein. Der Bindepartner kann, wenn er spezifisch mit dem biarsenischen Molekül reagiert, die funktionell wichtigere Konformation annehmen. Eine funktionell wichtige Konformation kann z.B. eine Konformation sein, die ein Arzneimittel bindet.
Ein erfindungsgemäßes tetraarsenisches Molekül kann verwendet werden, um zwei Bindepartner zu vernetzen. Jeder der Bindepartner beinhaltet eine Zielsequenz. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält jeder Bindepartner eine Zielsequenz und ein Trägermolekül. Das Trägermolekül kann ein Polypeptid sein. Die Polypeptide in jedem der Bindepartner können die gleichen sein. Alternativ dazu können die Polypeptide in jedem Bindepartner unterschiedlich sein. Die Zielsequenzen können die gleichen sein oder sie können in jedem Bindepartner unterschiedlich sein. Zum Beispiel kann ein Quervernetzen von Polypeptiden beim Untersuchen der Wirkungen einer Polypeptid-Dimerisierung auf eine Signaltransduktion wertvoll sein; vgl. Ho S.N., Biggar S.R., Spencer D.M., Schreiber S.L. und Crabtree G.R., Nature 382:822-826 (1996), Spencer D.M., Wandless T.J., Schreiber S.L. und Crabtree G.R., Science 262:1019-1024 (1993). Das Trägerpolypeptid kann ein Enzym oder ein Antikörper sein.
In einigen Ausführungsformen kann ein Bindepartner mit der Zielsequenz und ein Antikörper als das Trägerpolypeptid über ein tetraarsenisches Molekül an einen Bindepartner mit der Zielsequenz und einem Enzym wie dem Trägerpolypeptid vernetzt werden. Eine solche Zusammensetzung kann z.B. in Enzym-Immunoassays nützlich sein.
Eine große Vielzahl von Tests existiert, die nachweisbare Signale als ein Mittel zum Bestimmen des Vorhandenseins oder der Konzentration eines spezifischen Moleküls verwenden. Beispiele solcher Tests beinhalten Immunoassays zum Nachweis von Antikörpern oder Antigenen, Enzymtests, chemische Tests und Nukleinsäuretests. Ein vorstehend beschriebener biarsenisches Molekül/Zielsequenz-Komplex kann in diesen Tests nützlich sein.
Im Allgemeinen können Tests wie folgt durchgeführt werden. Eine Probe mit einem Molekül von Interesse, assoziiert mit entweder dem biarsenischen Molekül oder der Zielsequenz, kann mit der Zielsequenz bzw. dem biarsenischen Molekül in Kontakt gebracht werden. Die sich ergebende Lösung wird sodann hinsichtlich des Vorhandenseins eines nachweisbaren Signals oder einer Änderung eines nachweisbaren Signals überwacht.
Eine besonders nützliche Eigenschaft des biarsenisches Molekül/Zielsequenz-Komplexes ist, dass der Komplex durch Zugabe eines Überschusses an Reagenz wie EDT dissoziiert wird. Die Dissoziation des Komplexes kann in Tests, Polypeptid-Aufreinigungsschemata und innerhalb von Zellen besonders nützlich sein.
Die Erfindung wird weiter mit Bezug auf die nachstehenden Beispiele verstanden werden, die rein beispielhaft sind und nicht als begrenzend für den tatsächlichen Umfang der Erfindung, wie in den Ansprüchen beschrieben, angesehen werden sollen.
Beispiele
Materialien
Instrumente:

UV-Vis: Cary 3E
Fluorimeter: Spex DM3000 Fluoreszenzspektrometer mit zwei SPEX 1681 0,22 m Monochromatoren 450 W Xenon-Lampen.
Gegenstrom: Hochgeschwindigkeitsgegenstrom-Chromatograph (P.C. Inc.) mit einer Shimadzu LC-8A-präparativen LC-Pumpeinheit.
HPLC: Dionex Biol. C-Säule. Dionex Ionpac NSI (10-32) reverse Phase.
NMR: Varian Gemini 200 MHz
Massenspektren: Hewlett-Packard 5989B Elektronenspray-Massenspektrometer. Alle Reagenzien und Lösungsmittel wurden von Aldrich oder Fisher bezogen und wurden wie erhalten verwendet.

Beispiel 1
Synthese und Charakterisierung des biarsenischen Moleküls (III) und einer Zielsequenz
Synthese.
Ein biarsenisches Molekül der Formel (III) (4',5'-Bis(2-arsa-1,3-dithiolan-2-yl)fluorescein), hierin als biarsenisches Molekül (III) bezeichnet, wurde durch eine kurze Synthese aus herkömmlich erhältlichem Fluoresceinquecksilberacetat (FMA) hergestellt. Alle Schritte erfolgten bei Raumtemperatur, wenn nicht anders angegeben. FMA (72 mg, 85 µmol) wurde in 1,5 ml trockenem N-Methylpyrrolidinon unter Argon suspendiert und zu einer schwach gelben Lösung nach Zugabe von 144 µl (1,7 mmol) Arsentrichlorid gelöst. Wenige Körner an Palladiumdiacetat und 120 µl trockenes Diisopropylethylamin (DIEA) wurden unter Rühren zugegeben. Nach 3 Stunden wurde die Reaktion tropfenweise zu einer Lösung von 20 ml an 50% Aceton:0,25 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7 gegeben. 1,2-Ethandithiol (EDT) (285 µl, 3,4 mmol) wurde sodann zugegeben, gefolgt von Chloroform (20 ml) nach 5 Minuten. Nach 20-minütigem Rühren wurde das Reaktionsgemisch mit 100 ml Wasser verdünnt und aufge trennt. Die wässrige Phase wurde mit Chloroform (2 × 20 ml) extrahiert. Die vereinigten Chloroformphasen wurden mit 0,1 M Na₂EDTA mit einem pH-Wert von 7(1 × 25 ml) gewaschen, mit Na₂SO₄ getrocknet und verdampft. Das sich ergebende Öl wurde in Toluol (100 ml) gelöst und mit Wasser (3 × 25 ml) gewaschen. Nach Trocknen mit Na₂SO₄ und Verdampfung wurde das Produkt durch SiO₂-Säulenchromatographie aufgereinigt, wobei in Toluol beladen und mit 10% Ethylacetat-Toluol eluiert wurde. Eine Trituierung mit 95% Ethanol ergab einen orange-roten Feststoff. Die Ausbeute betrug 21 mg (37%).
¹H-NMR (CDCl₃ mit einer Spur von CD₃OD)-Ergebnisse waren 2,3 (br s, 2 + H, OH), 3,57 (m, 8H, -SCH₂CH₂S-), 6,60 (d, 2H, H-2' J=8,8 Hz), 6,69 (d, 2H, H-1' J=8,8 Hz), 7,19 (d, 1H, H-7), 7,66 (m, 2H, H-5,6), 8,03 (d, 1H, H-4).
Lösungen des Materials ergaben einen einzigen Punkt bei einer Dünnschichtchromatographie (DSC)(Ethylacetat-Hexan 1:1, 0,1% Essigsäure, R_f-Wert von 0,55), aber nach Altern ergaben sie ein polareres Material. Eine Zugabe eines leichten Überschusses an EDT revertierte dieses Verfahren, was nahe legt, dass eine gewisse Dissoziation des Komplexes über die Zeit auftritt. Der Extinktionskoeffizient betrug 41 000 M^–1cm^–1 bei 507,5 nm in 0,1 M KCl, 10 mM KMOPS, pH-Wert von 7,3. In alkalischer Lösung (pH-Wert von 13) betrug der Extinktionskoeffizient 55 000 M^–1cm^–1 bei 496,5 nm. Eine Massenspektrumanalyse zeigte ein Molekulargewicht von 664,0 Da im Vergleich zu dem berechneten Molekulargewicht von 664,6 Da.
Zielsequenzsynthese.
Das nicht aufgereinigte Polypeptid Acetyl-Trp-Glu-Ala-Ala-Ala-Arg-Glu-Ala-Cys-Cys-Arg-Glu-Cys-Cys-Ala-Arg-Ala-Amid (SEQ ID NO:1), das von der UCSD-Peptidsynthese-Einrichtung hergestellt worden war, wurde durch Gegenstrom-Chromatographie auf einer 390 ml-Planetenschleife (PC, Inc.), die bei 800 Upm rotierte, unter Verwendung von n-Butanol als der stationären Phase und Wasser als der mobilen Phase (4 ml/min) aufgereinigt. Das Polypeptid eluierte in einem breiten Peak, der sein Zentrum bei 75 Minuten nach der Wasserlösungsmittelfront aufwies. Diese Zielsequenz wurde in den nachstehenden Beispielen verwendet, wenn nicht anders angegeben.
Bildung eines Zielsequenz/biarsenisches Molekül (III)-Komplexes.
Das biarsenische Molekül (III) (3 µl einer 1 mM Lösung in DMSO) wurde zu 100 µl an 25 µM Zielsequenz (SEQ ID NO:1) in 25 mM Phosphat, pH-Wert von 7,4, 100 mM KCl und 1 mM Mercaptoethansulfonat gegeben. Nach 1,5 Stunden wurde das Reaktionsgemisch (bei Raumtemperatur) auf eine Dionex IonPac NS1-reverse Phase-HPLC-Säule injiziert, wobei ein Gradient von 20% auf 46% Acetonitril (0,1% TFA) von 3 bis 17 Minuten verwendet wurde. Der Komplex eluierte bei 14,7 Minuten (freie Zielsequenz eluierte bei 12,6 Minuten). Eine Massenspektrumanalyse zeigte ein Molekulargewicht von 2414,99 Da und das berechnete Molekulargewicht für den 1:1-Komplex betrug 2415,33 Da.
Quantenausbeute eines Zielsequenz/biarsenisches Molekül (III)-Komplexes.
Lösungen von Fluorescein in 0,1 N NaOH und von Zielsequenz/biarsenisches Molekül (III)-Komplex in 25 mM Phosphat, pH-Wert von 7,4 und 100 mM KCl wurden auf gleiche Absorptionswerte (0,0388) bei 499 nm eingestellt. Das Verhältnis der integrierten Emission (Anregung bei 499 nm) des Zielsequenz/biarsenisches Molekül (III)-Komplexes relativ zu Fluorescein wurde mit 0,9, der Quantenausbeute von Fluorescein, multipliziert, was eine Quantenausbeute von 0,44 für den Zielsequenz/biarsenisches Molekül (III)-Komplex ergab.
Das biarsenische Molekül (III) und die Zielsequenz bilden einen 1:1-Komplex, wie durch Elektrospray-Massenspektroskopie gezeigt. Dieser Komplex weist eine Fluoreszenz-Quantenausbeute von 0,44 mit einem Anregungsmaximum bei 508 nm und einem Emissionsmaximum bei 528 nm auf (4). Der Komplex wies eine ausreichende Stabilität auf, um in Gegenwart von bis zu 100 Äquivalenten an 2,3-Dimercapto-1-propanol (BAL) intakt zu bleiben. Inkubationen mit BAL erfolgten bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Eine 100 nM-Lösung des biarsenisches Molekül (III)/Zielsequenz-Komplexes wurde kaum durch die Zugabe von 1 µM oder 10 µM BAL beeinflusst. Eine Zugabe von 100 µM BAL führte zu einer signifikanten Verminderung der Fluoreszenz, was anzeigt, dass der biarsenisches Molekül (III)/Zielsequenz-Komplex gespalten wurde.
Monothiole wurden für die wirksame Bildung des Komplexes benötigt. Dass das Monothiol nicht allein als ein Reduktionsmittel fungierte, wurde durch die Tatsache gezeigt, dass ein Austausch des Monothiols gegen Triscarboxyethylphosphin nicht zu einer wirksamen Bildung des Komplexes führt.
Beispiel 2
Die Verwendung des biarsenischen Moleküls (III) in HeLa-Zellen
Ein Polypeptid-Bindepartner, der die Zielsequenz (SEQ ID NO:4) enthält, gebunden an die Cyan-Mutante des grün fluoreszierenden Proteins, wurde in HeLa-Zellen exprimiert.
Expression der Cyan-GFP-Zielsequenz-Fusion in HeLa-Zellen.
Unter Verwendung von molekularbiologischen Standardtechniken wurde die Zielsequenz (SEQ ID NO:4) (wobei das Tryptophan in SEQ ID NO:1 durch ein Alanin ersetzt wurde) an das cyan fluoreszierende Protein (CFP) gebunden. CFP ist das grün fluoreszierende Protein (GFP) von Aequorea victoria mit den nachstehenden zusätzlichen Mutationen: F64L, S65T, Y66W, N146I, M153T, V163A, N212K; Miyawaki A. et al., Nature 388:882-7 (1997). Eine Fusion der Zielsequenz an den C-Terminus von Cyan-GFP wurde unter Verwendung eines PCR-Primers erreicht. Der PCR-Primer wies die nachstehende Oligonukleotidsequenz auf: 5'-CGG CAA TTC TTA GGC CCT GGC GCA GCA CTC CCT GCA GCA GGC CTC CCT GGC GGC GGC CTC GGC CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC C-3' (SEQ ID NO:2), die für die Expression der Zielsequenz kodiert. Sie wurde in den pcDNA3-Vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA) unter Verwendung von HindIII- und EcoRI-Restriktionsstellen insertiert. Nach Amplifikation in DH5-Bakterien wurde er in HeLa-Zellen unter Verwendung des Lipofectin-Systems von GibcoBRL transfiziert (bei 37°C).
Messung von FRET in HeLa-Zellen.
3 Tage nach Transfektion wurde eine Konzentration von 1,0 µM biarsenischem Molekül (III) und 10,0 µM Ethandithiol auf die transfizierten Zellen angewendet. Fluoreszenzänderungen wurden unter Verwendung eines 440DF20-Filters (Omega Optical, Brattleboro, VT) und eines 4% Transmissionsneutral-Dichtefilters für die Anregung und 480DF30- und 635DF50-Filtern für die Emission überwacht.
CFP ist eine konstruierte Mutante von GFP mit Anregungs- und Emissionsmaxima bei kürzeren Wellenlängen. Es wurde ausgewählt, da seine Emission mit der Anregung des biarsenisches Molekül (III)/Zielsequenz-Fluorophors gut überlappt. Die Zielsequenz wurde an den C-Terminus von CFP ohne zusätzliche Linker fusioniert. Die Kristallstruktur von GFP zeigt, dass die letzten C-terminalen Aminosäuren ungeordnet sind und daher genügend Flexibilität bereitstellen sollten, um zu gewährleisten, dass das Molekül (III)/Zielsequenz-Fluorophor nicht in eine unvorteilhafte Position für einen Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) eingefroren ist.
Fluoreszenzänderungen wurden nach In-Kontakt-Bringen der Zellen mit dem biarsenischen Molekül (III) überwacht. Ein Marker wurde verwendet, um diejenigen Zellen anzuzeigen, die Zielsequenz exprimierten, und auch um zu zeigen, dass das biarsenische Molekül (III) mit der Zielsequenz in einer spezifischen Wei se reagierte. Die Fluoreszenz des CFP zeigte, dass Zellen die Zielsequenz exprimierten, und FRET zwischen dem CFP und dem biarsenischen Molekül (III)/Zielsequenz zeigte die Spezifität der Reaktion.
HeLa-Zellen, die das Fusionsprotein exprimieren, wurden mit biarsenischem Molekül (III) auf einer Fluoreszenz-Mikroskopbühne in Kontakt gebracht. Beobachtete Veränderungen der Fluoreszenz zeigten an, dass die gewünschte spezifische Reaktion zwischen dem biarsenischen Molekül (III) und der Zielsequenz auftrat. 5 zeigt einen Zeitverlauf der Fluoreszenzintensität für zwei Zellen bei zwei unterschiedlichen Wellenlängen (480 nm und 635 nm), was der Emission von CFP und dem Schweif bei langer Wellenlänge der Emission des biarsenischen Moleküls (III)/Zielsequenz entspricht, als auch Spuren von nicht transfizierten Zellen in dem gleichen Mikroskopfeld. Bei dem Start des Experiments ist es ersichtlich, dass die Anregung von CFP zu einer Emission hauptsächlich in dem 480 nm-Kanal führte. Nach Zugabe von 1,0 µM biarsenischen Molekül (III), gemischt mit 10 µM EDTA, um eine Hintergrundfärbung zu hemmen, verminderte sich die Fluoreszenzintensität bei 480 nm wie die Energie von dem CFP auf das biarsenische Molekül (III) übertragen wurde, das mit der Zielsequenz reagiert hatte. Es gab eine entsprechende Zunahme der Fluoreszenz in dem 635 nm-Kanal aufgrund der biarsenisches Molekül (III)/Zielsequenz-Emission. Nach Entfernung der Lösung an biarsenischem Molekül (III) gab es eine geringe Änderung. Eine Zugabe von 10 µM EDT führte lediglich zu einer kleinen Änderung.
Die Reversibilität der Reaktion wurde dadurch gezeigt, dass die Zellen mit 1 mM EDT behandelt wurden, eine Konzentration, die ausreicht, um biarsenisches Molekül (III) von der Zielsequenz in Lösung zu entfernen. Jedoch war die Entfernung in den Zellen schnell, aber nicht vollständig. Eine Wiederherstellung der CFP-Fluoreszenz zeigte, dass die frühere Verminderung des Signals in diesem Kanal tatsächlich auf eine Energieübertragung und nicht auf einen Abbau des CFP-Polypeptids zurückzuführen war.
Ein außerordentliches Merkmal in diesem Experiment war das Fehlen von Hintergrundfluoreszenz unter den FRET-Bedingungen von entweder nicht transfizierten Zellen in dem Feld oder von dem Medium mit biarsenischem Molekül (III). Dies war hauptsächlich auf die Nichtfluoreszenz von biarsenischem Molekül (III) in Gegenwart eines Überschusses von EDT zurückzuführen. Es war auch hilfreich, dass in diesem Experiment biarsenisches Molekül (III)/Zielsequenz lediglich durch Energieübertragung angeregt werden konnte, da es eine Anre gungsamplitude bei 440 nm, bei der CFP illuminiert wurde, von nahezu Null aufwies.
In einem getrennten Experiment, das unter den gleichen Bedingungen, jedoch unterschiedlichen Wellenlängen erfolgte, wurde das Signal bei 535 nm unter Verwendung einer Anregung bei 480 nm auch untersucht, was etwa den Spektren von biarsenisches Molekül (III)/Zielsequenz entsprach. Bei diesen Wellenlängen entwickelten nicht transfizierte Zellen etwa 10% der Fluoreszenz von Zellen, die die CFP-Zielsequenz-Fusion exprimierten, nach Abzug des Signals von CFP, das vor einer Anwendung des biarsenischen Moleküls (III) vorhanden war. Dieser Grad an Hintergrund war gering genug, um die Verwendung des biarsenischen Moleküls (III) als ein Markierungsreagenz für viele Anwendungen nicht zu stören.
Beispiel 3
Zielsequenz, die in Calmodulin erzeugt wurde
Eine Zielsequenz, die die Sequenz Cys-Cys-X-Y-Cys-Cys enthielt, wurde in eine vorhandene Helix in Calmodulin eingebracht. Die Kristallstruktur von Calmodulin zeigt eine exponierte α-Helix, wo Substitutionen gemacht werden könnten, ohne die Aminosäurereste, die für ein Calciumbinden verantwortlich sind, zu verändern. Im Vergleich dazu würde eine Fusion von Calmodulin (147 Aminosäuren) an GFP (238 Aminosäuren) ein chimäres Polypeptid bilden, das mehr als zweieinhalb Mal größer ist als Calmodulin allein. Eine solch große Größenzunahme könnte die biologische Aktivität oder Lokalisierung von Calmodulin stören.
Vier Cysteine wurden in die N-terminale α-Helix von Xenopus-Calmodulin eingebracht, wie nachstehend gezeigt:
Das mutierte Calmodulin wird als Calmodulin+cys4 bezeichnet. Die Substitutionen wurden unter Verwendung eines PCR-Primers der nachfolgenden Oligonukleotidsequenz generiert: 5'-CGC GGA TCC GCC ACC ATG CAT GAC CAA CTG ACA TGC TGC CAG ATT TGC TGC TTC AAA GAA GCC TTC TCA TTA TTC-3' (SEQ ID NO:3), die die Expression dieser Substitutionen kodiert. Die Nukleinsäuresequenz, die für das Cystein-substituierte Calmodulin kodiert, wurde in den pcDNA3-Vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA) unter Verwendung der BamHI- und EcoRI-Restriktionsstellen insertiert. Nach Amplifikation in DH5-Bakterien wurde der Vektor in HeLa-Zellen unter Verwendung des Lipofectin-Systems von GibcoBRL transfiziert (bei 37°C).
3 Tage nach Transfektion wurden die Zellen mit 1 µM biarsenischem Molekül (III) und 10,0 µM EDT für 1 Stunde behandelt. Eine Beobachtung auf einer Fluoreszenz-Mikroskopbühne unter Verwendung eines 480DF30-Filters (Omega Optical, Brattleboro, VT) und eines 4% Transmissionsneutral-Dichtefilters für die Anregung und eines 535DF25-Filters für die Emission zeigte viele Zellen mit starker Fluoreszenz im Vergleich zu benachbarten leicht angefärbten Zellen. Diese leicht angefärbten Zellen können das Calmodulin+cys4-Polypeptid exprimiert haben, aber bei niedrigeren Niveaus als die leuchtenden Zellen. Nicht transfizierte Zellen, die mit den gleichen Konzentrationen an biarsenischem Molekül (III) und EDT behandelt worden waren, wiesen lediglich eine sehr schwache Fluoreszenz auf. Eine Entfernung des 1,4-Neutraldichtefilters war erforderlich, um Details der Färbung der nicht transfizierten Zellen, die anscheinend mitochondrial war, zu sehen. Dieses Experiment zeigte die Möglichkeit einer Verwendung des biarsenischen Moleküls (III) zum Markieren von Polypeptiden innerhalb von Zellen durch Erzeugen einer Zielsequenz in bereits bestehenden Polypeptiden, wobei das Molekulargewicht des Polypeptids im Wesentlichen unverändert bleibt.
Beispiel 4
Synthese eines Dichlor-Derivats des biarsenischen Moleküls (III)
Eine Lösung von 84 mg (265 µmol) Quecksilberacetat in 500 µl 1:1 Essigsäure/Wasser wurde (bei Raumtemperatur) zu einer Lösung von 19 mg (47 µmol) an 2',7'-Dichlorfluorescein in 500 µl Ethanol gegeben. Nach Rühren über Nacht wurde der rote Feststoff filtriert, mit Ether gespült und unter vermindertem Druck getrocknet. 20 mg (22 µmol, 47%) an 2',7'-Dichlor-4',5'-di(acetoxyquecksilber)fluorescein wurden gesammelt.
Das Dichlor-Derivat des biarsenischen Moleküls (III) (2',7'-Dichlor-4',5'-bis(2-arsa-1,3-dithiolan-2-yl)fluorescein) wurde wie folgt hergestellt. 2',7'-Dichlor-4',5'-di(acetoxyquecksilber)fluorescein (13 mg, 14 µmol) wurde wie vorstehend beschrieben hergestellt und in 500 µl trockenem N-Methylpyrrolidinon suspendiert. Nach Zugabe von 24 µl (285 µmol) Arsentrichlorid löste sich der suspendierte Feststoff zu einer leicht gelben Lösung. DIEA (20 µl) und eine katalytische Menge an Palladiumdiacetat wurden zugesetzt. Nach 3 Stunden wurde das dunkle Reaktionsgemisch mit 2,5 ml 1:1 Aceton/Wasser abgestoppt. EDT (200 µl) wurde zugegeben und die Reaktion wurde 45 Minuten gerührt. Das Produkt wurde in Chloroform extrahiert. Die organische Phase wurde mit gesättigtem NaCl gewaschen. Das Meiste des Lösungsmittels wurde durch Rotationsverdampfen entfernt und sodann wurde zusätzliches Chloroform zugegeben. Der weiße Feststoff, der präzipitierte, wurde verworfen. Das Produkt wurde auf Silicagel mit Ethylacetat-Hexan 1:1 isoliert, wobei 0,1% Essigsäure als Eluent verwendet wurde. Der Retentionsfaktor, R_f, betrug 0,6 (1:1 Ethylacetat-Hexan 1:1, 0,1% Essigsäure). Die Ausbeute betrug 113 nmol (1%), wie durch Absorption bestimmt, wobei ein Peak-Extinktionskoeffizient von 80 000 M^–1cm^–1 angenommen wurde.
Bildung eines Komplexes mit einer Zielsequenz und dem Dichlor-Derivat des biarsenischen Moleküls (III).
Das Dichlor-Derivat des biarsenischen Moleküls (III) (5 µl einer 675 µM Lösung in DMSO) wurde zu 100 µl 25 µM Zielsequenz (SEQ ID NO:1) in 25 mM Phosphat, pH-Wert von 7,4, 100 mM KCl, 1 mM Mercaptoethansulfonat gegeben. Nach 1,5 Stunden wurde das Reaktionsgemisch auf eine Dionex IonPac SN1-reverse Phase-HPLC-Säule injiziert, wobei ein Gradient von 20% bis 46% Acetonitril (0,1% TFA) von 3 bis 17 Minuten verwendet wurde. Der Komplex eluierte in zwei überlappenden Peaks des gleichen Molekulargewichts bei 16,1 und 16,4 Minuten. (Freies Peptid eluierte bei 12,6 Minuten.) Eine Massenspektrumanalyse zeigte ein Molekulargewicht von 2484,80 Da im Vergleich zu dem berechneten Molekulargewicht des 1:1-Komplexes, das 2484,22 Da betrugt.
Das Dichlor-Derivat des biarsenischen Moleküls (III) verhielt sich ähnlich zu dem biarsenischen Molekül (III). Eine 10 nm-Rotverschiebung wurde erhalten (Anregung bei 518 nm, Emission bei 538 nm).
Beispiel 5
Synthese von tetraarsenischen Molekülen
Bifluorescein-Molekül.
(Vgl. auch O Silberrad (1906), J. Chem. Soc. 89:1787-1811 und S. Dutt (1926), J. Chem. Soc. 1926:1171-1184.) Pyromellitsäure (744 mg, 2,93 mmol) und Resorcinol (1,367 g, 12,4 mmol) wurden 2 Stunden bei 160°C ohne Lösungsmittel erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das feste Produkt in Wasser gekocht und filtriert. Der orange Feststoff, der dann gesammelt wurde, wurde in Ethanol suspendiert und filtriert. 196 mg Rohprodukt wurden nach Zugabe von Wasser zu diesem Filtrat präzipitiert. Zwei Produkte, die eng beabstandete DSC-Punkte ergaben (R_f-Wert von 0,08, 1:1 Ethylacetat/Hexan) wurden auf einem Silicagel mit 99,9% Ethylacetat, 0,1% Essigsäure isoliert. Diese waren höchstwahrscheinlich die para- und meta-Substitutionsisomere (2). Der orange Feststoff (84 mg) mit den zwei Isomeren wurde gesammelt (5%). Eine Massenspektrumanalyse zeigte ein Molekulargewicht von 586,47 und das berechnete Molekulargewicht betrug 586,51.
Tetrakis(acetoxyquecksilber)bifluorescein.
Quecksilberacetat (252 mg, 790 µmol), gelöst in 2 ml 1:1 Wasser/Essigsäure, wurde zu einem Gemisch von 84 mg (143 µmol) Bifluorescein in 6 ml Ethanol gegeben. Nach Rühren über Nacht verblieb das gesamte Material auf der Grundlinie durch DSC (1:1 Ethylacetat/Hexan), was anzeigt, dass eine Mercurierung auftrat. Der dunkelrote Feststoff (149 mg, 64%), der durch Filtration gesammelt wurde, wurde nicht weiter charakterisiert.
Tetraarsenische Moleküle.
Das vorstehende Material (67 mg, 41 µmol), suspendiert in 3 ml trockenem N-Methylpyrrolidinon, löste sich zu einer gelben Lösung nach Zugabe von 140 µl (1,66 mmol) AsCl₃. DIEA (290 ml) und eine katalytische Menge an Palladiumdiacetat wurden zugegeben. Nach 1,5 Stunden wurde die Reaktion in ein Gemisch von 5 ml Aceton, 5 ml Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,4 und 2 ml EDT geschüttet. Nach Entfernung des Lösungsmittels von einem Chloroformextrakt der wässrigen Reaktion wurde das Produkt auf Silicagel mit 1:1 Ethylacetat/Hexan 0,1% Essigsäure isoliert. Eine Massenspektralanalyse zeigte ein Molekulargewicht von 1250,47 Da im Vergleich zu einem berechneten Molekulargewicht von 1250,86.
Das Endprodukt, das auf Silica isoliert wurde, wies hauptsächlich die korrekte Masse auf (eine Massenspektrumanalyse zeigte ein Molekulargewicht von 1250,47 und das berechnete Molekulargewicht betrug 1250,86). Ein kleiner Peak war auch vorhanden, der der Masse eines Produkts entsprach, dem eine arsenische Gruppe fehlte (eine Massenspektrumanalyse zeigte ein Molekulargewicht von 1084,55 und das berechnete Molekulargewicht betrug 1084,75).
Bildung des Komplexes des tetraarsenischen Moleküls mit zwei Zielsequenzen.
Das tetraarsenische Molekül (5 µl von 550 µM in DMSO) und 3 µl von 1,4 mM Zielsequenz (SEQ ID NO:1) wurden zu 50 µl 25 mM Phosphat, pH-Wert von 7,4, 100 mM KCl, 1 mM Mercaptoethansulfonat gegeben. Nach 1,5 Stunden wurden 10 µl des Reaktionsgemisches auf eine C-18-reverse Phase-HPLC-Säule injiziert, die mit einem Massenspektrometer verbunden war. Ein Peak, der bei 13 Minuten eluierte, enthielt eine Spezies mit einem Molekulargewicht von 4752,07 Da im Vergleich zu dem berechneten Molekulargewicht für den 2:1-Komplex von 4752,11 Da, was anzeigt, dass sich der gewünschte Komplex gebildet hatte.
Andere Ausführungsformen liegen innerhalb der nachstehenden Ansprüche.
Zum Beispiel kann das biarsenische Molekül die nachstehende Formel
aufweisen.
Eine spezifische Ausführungsform kann die nachstehende Formel
aufweisen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Markieren eines Trägermoleküls, umfassend a) Bereitstellen eines Bindepartners, der das Trägermolekül und eine Zielsequenz umfasst, und b) In-Kontakt-Bringen des Bindepartners mit einem biarsenischen Molekül, wobei das biarsenische Molekül die nachstehende Formel aufweist
und Tautomere, Anhydride und Salze davon, worin: jede Gruppe X¹ oder X² unabhängig ein Cl-, Br-, I-Atom, eine OR^a- oder SR^a-Gruppe ist, oder X¹ und X² zusammen mit dem Arsenatom einen Ring der Formel
bilden, R^a ein H-Atom, eine C₁-C₄-Alkyl-, CH₂CH₂OH-, CH₂COOH- oder CN-Gruppe ist, Z eine 1,2-Ethandiyl-, 1,2-Propandiyl-, 2,3-Butandiyl-, 1,3-Propandiyl-, 1,2-Benzoldiyl-, 4-Methyl-1,2-benzoldiyl-, 1,2-Cyclopentandi yl-, 1,2-Cyclohexandiyl-, 3-Hydroxy-1,2-propandiyl-, 3-Sulfo-1,2-propandiyl- oder 1,2-Bis(carboxy)-1,2-ethandiylgruppe ist, Y¹ und Y² unabhängig voneinander ein H-Atom oder eine CH₃-Gruppe sind, oder Y¹ und Y² zusammen einen Ring derart bilden, dass das biarsenische Molekül die Formel
aufweist, worin M ein O-, S-Atom, eine CH₂-, C(CH₃)₂- oder NH-Gruppe ist, R¹ und R² unabhängig voneinander eine OR^a-, OAc-, NR^aR^b-Gruppe oder ein H-Atom sind, R³ und R⁴ unabhängig voneinander ein H-, F-, Cl-, Br-, I-Atom, eine OR^a- oder R^a-Gruppe sind, oder R¹ zusammen mit R³ oder R² zusammen mit R⁴ oder beides einen Ring bilden, in dem (i) eine der Gruppen R¹ oder R³ eine C₂-C₃-Alkylgruppe ist und die andere eine NR^a-Gruppe ist und (ii) eine der Gruppen R² und R⁴ eine C₂-C₃-Alkylgruppe ist und die andere eine NR^a-Gruppe ist, R^b ein H-Atom, eine C₁-C₄-Alkyl-, CH₂CH₂OH-, CH₂COOH- oder CN-Gruppe ist, Q eine CR^aR^b-, CR^aOR^b-, C=O-Gruppe oder ein Spirolakton der Formel:
ist, wobei die Spirobindung bei C₁ gebildet wird, unter Bedingungen, bei denen das biarsenische Molekül mit der Zielsequenz reagiert, wobei die Zielsequenz ein oder mehrere Cysteine umfasst, die fähig sind, spezifisch mit dem biarsenischen Molekül zu reagieren.
Verfahren nach Anspruch 1, das ferner einen Schritt eines Dissoziierens des biarsenischen Moleküls von der Zielsequenz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das biarsenische Molekül ein nachweisbares Signal erzeugt.
Verfahren nach Anspruch 3, das ferner einen Schritt eines Überwachens des nachweisbaren Signals umfasst.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Signal ein Fluoreszenzsignal ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das biarsenische Molekül an eine Festphase gekoppelt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zielsequenz an eine Festphase gekoppelt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Trägermolekül ein Polypeptid ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Polypeptid ein Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Polypeptid ein Enzym ist.
Verfahren zum Herstellen einer Wirtszelle, die einen exogenen Bindepartner umfasst, wobei der Bindepartner ein Trägerpolypeptid und eine Zielsequenz umfasst, wobei die Zielsequenz heterolog zu dem Trägerpolypeptid ist, wobei das Verfahren ein In-Kontakt-Bringen eines Vektors, der eine Nukleinsäuresequenz, die für den Bindepartner kodiert, umfasst, mit einer Zelle unter Bedingungen, bei denen der Vektor von der Zelle aufgenommen und exprimiert wird, wobei die Zielsequenz ein oder mehrere Cysteine um fasst, die fähig sind, spezifisch mit einem biarsenischen Molekül der nachstehenden Formel:
zu reagieren, und ein In-Kontakt-Bringen des Bindepartners mit einem biarsenischen Molekül, das die nachstehende Formel aufweist
und Tautomere, Anhydride und Salze davon, worin: jede Gruppe X¹ oder X² unabhängig ein Cl-, Br-, I-Atom, eine OR^a- oder SR^a-Gruppe ist, oder X¹ und X² zusammen mit dem Arsenatom einen Ring der Formel
bilden, R^a ein H-Atom, eine C₁-C₄-Alkyl-, CH₂CH₂OH-, CH₂COOH- oder CN-Gruppe ist, Z eine 1,2-Ethandiyl-, 1,2-Propandiyl-, 2,3-Butandiyl-, 1,3-Propandiyl-, 1,2-Benzoldiyl-, 4-Methyl-1,2-benzoldiyl-, 1,2-Cyclopentandiyl-, 1,2-Cyclohexandiyl-, 3-Hydroxy-1,2-propandiyl-, 3-Sulfo-1,2-propandiyl- oder 1,2-Bis(carboxy)-1,2-ethandiylgruppe ist, Y¹ und Y² unabhängig voneinander ein H-Atom oder eine CH₃-Gruppe sind, oder Y¹ und Y² zusammen einen Ring derart bilden, dass das biarsenische Molekül die Formel
aufweist, worin M ein O-, S-Atom, eine CH₂-, C(CH₃)₂- oder NH-Gruppe ist, R¹ und R² unabhängig voneinander eine OR^a-, OAc-, NR^aR^b-Gruppe oder ein H-Atom sind, R³ und R⁴ unabhängig voneinander ein H-, F-, Cl-, Br-, I-Atom, eine OR^a- oder R^a-Gruppe sind, oder R¹ zusammen mit R³ oder R² zusammen mit R⁴ oder beides einen Ring bilden, in dem (i) eine der Gruppen R¹ oder R³ eine C₂-C₃-Alkylgruppe ist und die andere eine NR^a-Gruppe ist und (ii) eine der Gruppen R² und R⁴ eine C₂-C₃-Alkylgruppe ist und die andere eine NR^a-Gruppe ist, R^b ein H-Atom, eine C₁-C₄-Alkyl-, CH₂CH₂OH-, CH₂COOH- oder CN-Gruppe ist, Q eine CR^aR^b-, CR^aOR^b-, C=O-Gruppe oder ein Spirolakton der Formel:
ist, worin die Spirobindung bei C₁ gebildet wird, unter Bedingungen umfasst, bei denen das biarsenische Molekül spezifisch mit der Zielsequenz reagiert.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Wirtszelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Bakterien-, Hefe-, Insekten-, Säuger- und Pflanzenzellen.
Biarsenisches Molekül der Formel:
und Tautomere, Anhydride und Salze davon, worin: jede Gruppe X¹ oder X² unabhängig ein Cl-, Br-, I-Atom, eine OR^a- oder SR^a-Gruppe ist, oder X¹ und X² zusammen mit dem Arsenatom einen Ring der Formel
bilden, R^a ein H-Atom, eine C₁-C₄-Alkyl-, CH₂CH₂OH-, CH₂COOH- oder CN-Gruppe ist, Z eine 1,2-Ethandiyl-, 1,2-Propandiyl-, 2,3-Butandiyl-, 1,3-Propandiyl-, 1,2-Benzoldiyl-, 4-Methyl-1,2-benzoldiyl-, 1,2-Cyclopentandiyl-, 1,2-Cyclohexandiyl-, 3-Hydroxy-1,2-propandiyl-, 3-Sulfo-1,2-propandiyl- oder 1,2-Bis(carboxy)-1,2-ethandiylgruppe ist, Y¹ und Y² unabhängig voneinander ein H-Atom oder eine CH₃-Gruppe sind, oder Y¹ und Y² zusammen einen Ring derart bilden, dass das biarsenische Molekül die Formel
aufweist, worin M ein O-, S-Atom, eine CH₂-, C(CH₃)₂- oder NH-Gruppe ist, R¹ und R² unabhängig voneinander eine OR^a-, OAc-, NR^aR^b-Gruppe oder ein H-Atom sind, R³ und R⁴ unabhängig voneinander ein H-, F-, Cl-, Br-, I-Atom, eine OR^a- oder R^a-Gruppe sind, oder R¹ zusammen mit R³ oder R² zusammen mit R⁴ oder beides einen Ring bilden, in dem (i) eine der Gruppen R¹ oder R³ eine C₂-C₃-Alkylgruppe ist und die andere eine NR^a-Gruppe ist und (ii) eine der Gruppen R² und R⁴ eine C₂-C₃-Alkylgruppe ist und die andere eine NR^a-Gruppe ist, R^b ein H-Atom, eine C₁-C₄-Alkyl-, CH₂CH₂OH-, CH₂COOH- oder CN-Gruppe ist, Q eine CR^aR^b-, CR^aOR^b-, C=O-Gruppe oder ein Spirolakton der Formel:
ist, wobei die Spirobindung bei C₁ gebildet wird.
Molekül nach Anspruch 13, wobei die Gruppen X¹ und X² zusammen mit dem Arsenatom einen Ring der Formel
bilden.
Molekül nach Anspruch 13, wobei die Gruppen X¹ und X² zusammen mit dem Arsenatom einen Ring der Formel
bilden.
Molekül nach Anspruch 13, wobei Q ein Spirolakton der nachstehenden Formel:
ist.
Molekül nach Anspruch 13, wobei Q
ist.
Molekül nach Anspruch 13, wobei das Molekül die nachstehende Formel aufweist:
und Tautomere, Anhydride und Salze davon.
Molekül nach Anspruch 13, wobei das Molekül spezifisch mit einer Zielsequenz reagiert, um ein nachweisbares Signal zu erzeugen.
Molekül nach Anspruch 13, wobei das Molekül spezifisch mit einer Zielsequenz reagiert, um ein Fluoreszenzsignal zu erzeugen.
Molekül nach Anspruch 13, wobei das Molekül zum Durchqueren einer biologischen Membran fähig ist.
Molekül nach Anspruch 13, wobei das Molekül an einer oder mehreren Positionen mit einer nachweisbaren Gruppe substituiert ist.
Molekül nach Anspruch 22, wobei die nachweisbare Gruppe eine fluoreszierende Gruppe ist.
Molekül nach Anspruch 13, wobei das Molekül an eine Festphase gekoppelt ist.
Kit, umfassend: a. ein biarsenisches Molekül der Formel:
und Tautomere, Anhydride und Salze davon, worin: jede Gruppe X¹ oder X² unabhängig ein Cl-, Br-, I-Atom, eine OR^a- oder SR^a-Gruppe ist, oder X¹ und X² zusammen mit dem Arsenatom einen Ring der Formel
bilden, R^a ein H-Atom, eine C₁-C₄-Alkyl-, CH₂CH₂OH-, CH₂COOH- oder CN-Gruppe ist, Z eine 1,2-Ethandiyl-, 1,2-Propandiyl-, 2,3-Butandiyl-, 1,3-Propandiyl-, 1,2-Benzoldiyl-, 4-Methyl-1,2-benzoldiyl-, 1,2-Cyclopentandiyl-, 1,2-Cyclohexandiyl-, 3-Hydroxy-1,2-propandiyl-, 3-Sulfo-1,2-propandiyl- oder 1,2-Bis(carboxy)-1,2-ethandiylgruppe ist, Y¹ und Y² unabhängig voneinander ein H-Atom oder eine CH₃-Gruppe sind, oder Y¹ und Y² zusammen einen Ring derart bilden, dass das biarsenische Molekül die Formel
aufweist, worin M ein O-, S-Atom, eine CH₂-, C(CH₃)₂- oder NH-Gruppe ist, R¹ und R² unabhängig voneinander eine OR^a-, OAc-, NR^aR^b-Gruppe oder ein H-Atom sind, R³ und R⁴ unabhängig voneinander ein H-, F-, Cl-, Br-, I-Atom, eine OR^a- oder R^a-Gruppe sind, oder R¹ zusammen mit R³ oder R² zusammen mit R⁴ oder beides einen Ring bilden, in dem (i) eine der Gruppen R¹ oder R³ eine C₂-C₃-Alkylgruppe ist und die andere eine NR^a-Gruppe ist und (ii) eine der Gruppen R² und R⁴ eine C₂-C₃-Alkylgruppe ist und die andere eine NR^a-Gruppe ist, R^b ein H-Atom, eine C₁-C₄-Alkyl-, CH₂CH₂OH-, CH₂COOH- oder CN-Gruppe ist, Q eine CR^aR^b-, CR^aOR^b-, C=O-Gruppe oder ein Spirolakton der Formel:
ist, worin die Spirobindung bei C₁ gebildet wird, und b. einen Bindepartner, der eine Zielsequenz umfasst, wobei die Zielsequenz ein oder mehrere Cysteine umfasst, die fähig sind, spezifisch mit dem biarsenischen Molekül zu reagieren.
Kit nach Anspruch 25, wobei die Zielsequenz vier Cysteine umfasst.
Kit nach Anspruch 25, wobei die Zielsequenz eine Cys-Cys-X-Y-Cys-Cys-Sequenz umfasst, wobei die Gruppen X und Y Aminosäuren sind.
Kit nach Anspruch 27, wobei die Gruppen X und Y Aminosäuren mit hoher alpha-helikaler Neigung sind.
Kit nach Anspruch 27, wobei die Gruppen X und Y die gleiche Aminosäure sind.
Kit nach Anspruch 27, wobei die Gruppen X und Y unterschiedliche Aminosäuren sind.
Kit nach Anspruch 25, wobei die Zielsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:4.
Kit nach Anspruch 25, wobei der Bindepartner ferner ein Trägermolekül umfasst.
Kit nach Anspruch 25, wobei der Bindepartner ferner ein Trägerpolypeptid umfasst.
Kit nach Anspruch 33, wobei die Zielsequenz heterolog zu dem Trägerpolypeptid ist.
Kit nach Anspruch 25, wobei das biarsenische Molekül spezifisch mit der Zielsequenz reagiert und ein nachweisbares Signal erzeugt.
Kit nach Anspruch 35, wobei das nachweisbare Signal ein Fluoreszenzsignal ist.
Kit, umfassend: a. ein biarsenisches Molekül, das die nachstehende Formel umfasst:
und Tautomere, Anhydride und Salze davon, worin: jede Gruppe X¹ oder X² unabhängig ein Cl-, Br-, I-Atom, eine OR^a- oder SR^a-Gruppe ist, oder X¹ und X² zusammen mit dem Arsenatom einen Ring der Formel
bilden, R^a ein H-Atom, eine C₁-C₄-Alkyl-, CH₂CH₂OH-, CH₂COOH- oder CN-Gruppe ist, Z eine 1,2-Ethandiyl-, 1,2-Propandiyl-, 2,3-Butandiyl-, 1,3-Propandiyl-, 1,2-Benzoldiyl-, 4-Methyl-1,2-benzoldiyl-, 1,2-Cyclopentandiyl-, 1,2-Cyclohexandiyl-, 3-Hydroxy-1,2-propandiyl-, 3-Sulfo-1,2-propandiyl- oder 1,2-Bis(carboxy)-1,2-ethandiylgruppe ist, Y¹ und Y² unabhängig voneinander ein H-Atom oder eine CH₃-Gruppe sind, oder Y¹ und Y² zusammen einen Ring derart bilden, dass das biarsenische Molekül die Formel
aufweist, worin M ein O-, S-Atom, eine CH₂-, C(CH₃)₂- oder NH-Gruppe ist, R¹ und R² unabhängig voneinander eine OR^a-, OAc-, NR^aR^b-Gruppe oder ein H-Atom sind, R³ und R⁴ unabhängig voneinander ein H-, F-, Cl-, Br-, I-Atom, eine OR^a- oder R^a-Gruppe sind, oder R¹ zusammen mit R³ oder R² zusammen mit R⁴ oder beides einen Ring bilden, in dem (i) eine der Gruppen R¹ oder R³ eine C₂-C₃-Alkylgruppe ist und die andere eine NR^a-Gruppe ist und (ii) eine der Gruppen R² und R⁴ eine C₂-C₃-Alkylgruppe ist und die andere eine NR^a-Gruppe ist, R^b ein H-Atom, eine C₁-C₄-Alkyl-, CH₂CH₂OH-, CH₂COOH- oder CN-Gruppe ist, Q eine CR^aR^b-, CR^aOR^b-, C=O-Gruppe oder ein Spirolakton der Formel:
ist, worin die Spirobindung bei C₁ gebildet wird, und b. einen Vektor, der eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die für eine Zielsequenz kodiert, wobei die Zielsequenz ein oder mehrere Cysteine umfasst, die fähig sind, spezifisch mit dem biarsenischen Molekül zu reagieren.
Kit nach Anspruch 37, wobei die Zielsequenz vier Cysteine umfasst.
Kit nach Anspruch 37, wobei die Zielsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:4.
Kit nach Anspruch 37, wobei der Vektor ferner eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die für ein Trägerpolypeptid kodiert.
Kit nach Anspruch 40, wobei das Trägerpolypeptid heterolog zu der Zielsequenz ist.
Kit nach Anspruch 37, wobei das biarsenische Molekül spezifisch mit der Zielsequenz reagiert und ein nachweisbares Signal erzeugt.
Kit nach Anspruch 42, wobei das nachweisbare Signal ein Fluoreszenzsignal ist.
Komplex, der ein biarsenisches Molekül und eine Zielsequenz umfasst, wobei die Zielsequenz ein oder mehrere Cysteine umfasst, die fähig sind, mit dem biarsenischen Molekül zu reagieren, wobei das biarsenische Molekül die nachstehende Formel aufweist:
und Tautomere, Anhydride und Salze davon, worin: jede Gruppe X¹ oder X² unabhängig ein Cl-, Br-, I-Atom, eine OR^a- oder SR^a-Gruppe ist, oder X¹ und X² zusammen mit dem Arsenatom einen Ring der Formel
bilden, R^a ein H-Atom, eine C₁-C₄-Alkyl-, CH₂CH₂OH-, CH₂COOH- oder CN-Gruppe ist, Z eine 1,2-Ethandiyl-, 1,2-Propandiyl-, 2,3-Butandiyl-, 1,3-Propandiyl-, 1,2-Benzoldiyl-, 4-Methyl-1,2-benzoldiyl-, 1,2-Cyclopentandiyl-, 1,2-Cyclohexandiyl-, 3-Hydroxy-1,2-propandiyl-, 3-Sulfo-1,2-propandiyl- oder 1,2-Bis(carboxy)-1,2-ethandiylgruppe ist, Y¹ und Y² unabhängig voneinander ein H-Atom oder eine CH₃-Gruppe sind, oder Y¹ und Y² zusammen einen Ring derart bilden, dass das biarsenische Molekül die Formel
aufweist, worin M ein O-, S-Atom, eine CH₂-, C(CH₃)₂- oder NH-Gruppe ist, R¹ und R² unabhängig voneinander eine OR^a-, OAc-, NR^aR^b-Gruppe oder ein H-Atom sind, R³ und R⁴ unabhängig voneinander ein H-, F-, Cl-, Br-, I-Atom, eine OR^a- oder R^a-Gruppe sind, oder R¹ zusammen mit R³ oder R² zusammen mit R⁴ oder beides einen Ring bilden, in dem (i) eine der Gruppen R¹ oder R³ eine C₂-C₃-Alkylgruppe ist und die andere eine NR^a-Gruppe ist und (ii) eine der Gruppen R² und R⁴ eine C₂-C₃-Alkylgruppe ist und die andere eine NR^a-Gruppe ist, R^b ein H-Atom, eine C₁-C₄-Alkyl-, CH₂CH₂OH-, CH₂COOH- oder CN-Gruppe ist, Q eine CR^aR^b-, CR^aOR^b-, C=O-Gruppe oder ein Spirolakton der Formel:
ist, wobei die Spirobindung bei C₁ gebildet wird.
Komplex nach Anspruch 44, wobei das biarsenische Molekül
ist, und Tautomere, Anhydride und Salze davon.
Komplex nach Anspruch 44, wobei die Zielsequenz vier Cysteine umfasst.
Komplex nach Anspruch 44, wobei die Zielsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:4.
Tetraarsenisches Molekül, das zwei biarsenische Moleküle gemäß Anspruch 13, die aneinander über eine verbindende Gruppe gekoppelt sind, umfasst.
Tetraarsenisches Molekül nach Anspruch 48, wobei das Molekül die Formel
aufweist.
Tetraarsenisches Molekül nach Anspruch 48, wobei das Molekül die Formel
aufweist.
Tetraarsenisches Molekül nach Anspruch 48, wobei das Molekül die Formel
aufweist.
Verfahren zum Vernetzen zweier Bindepartner, umfassend a) Bereitstellen eines tetraarsenischen Moleküls nach einem der Ansprüche 48 bis 51, das fähig ist, spezifisch mit einer ersten und einer zweiten Zielsequenz zu reagieren, und b) In-Kontakt-Bringen des tetraarsenischen Moleküls mit mindestens zwei Bindungspartnern unter Bedingungen, die für das tetraarsenische Molekül wirksam sind, um spezifisch mit den ersten und zweiten Zielsequenzen zu reagieren, wobei der erste Bindepartner die erste Zielsequenz umfasst, der zweite Bindepartner die zweite Zielsequenz umfasst, wobei die ersten und zweiten Zielsequenzen ein oder mehrere Cysteine umfassen, die fähig sind, spezifisch mit einem biarsenischen Molekül der nachstehenden Formel
zu reagieren.
Verfahren nach Anspruch 52, wobei die ersten und zweiten Bindepartner gleich sind.
Verfahren nach Anspruch 52, wobei die ersten und zweiten Bindepartner unterschiedlich sind.
Verfahren nach Anspruch 52, wobei die ersten und zweiten Zielsequenzen gleich sind.
Verfahren nach Anspruch 52, wobei die ersten und zweiten Zielsequenzen unterschiedlich sind.
Verfahren nach Anspruch 52, wobei die ersten und zweiten Bindepartner ferner Polypeptide umfassen.