DE69833545T2

DE69833545T2 - In der zellmembran verankertes antikoagulant-fusionsprotein

Info

Publication number: DE69833545T2
Application number: DE69833545T
Authority: DE
Inventors: Kristian Riesbeck; Anthony Dorling; John Andrew Richmond GEORGE; Ian Robert Lechler
Original assignee: Imperial College Innovations Ltd
Current assignee: Ip2ipo Innovations Ltd
Priority date: 1997-03-26
Filing date: 1998-03-26
Publication date: 2006-12-14
Anticipated expiration: 2018-03-27
Also published as: CN1265148A; WO1998042850A1; AU6738398A; US20120017288A1; EP1676920A3; JP4243355B2; JP2008109939A; AU733681B2; CN1192109C; DE69833545D1; EP1676920A2; CA2285702C; JP2001523094A; JP2010279348A; ES2513043T3; KR100561055B1; US6423316B1; CA2285702A1; US9376684B2; NZ500007A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich auf die Inhibierung der Blutkoagulation, insbesondere bei einer Organabstoßung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die chirurgische Technik der Organtransplantation wird nun seit mehreren Jahrzehnten erfolgreich durchgeführt und wegen ihres Erfolges hat sich das Verfahren weit verbreitet und ist wohl zur Routine geworden. Allerdings können die zur Verfügung stehenden geeigneten Organtransplantate nicht den ständig steigenden Bedarf decken.
Wegen des Mangels an geeigneten menschlichen (allogenen) Organen hat die Möglichkeit, (xenogene) Tierorgane in menschlichen Transplantationsoperationen („Xenografting" oder „Xenotransplantation") zu verwenden, in den letzten Jahren erhöhte Aufmerksamkeit erfahren (z.B. Nature 1997; 385: 285). Spenderorgane vom Schwein werden für geeignete Kandidaten gehalten, weil Schweine dem Menschen anatomisch und physiologisch ähnlich und reichlich vorhanden sind.
Xenotransplantationen werden jedoch durch die schwerwiegenden und gut dokumentierten Abstoßungsprobleme beeinträchtigt. Dieser Prozess kann in verschiedene Phasen unterteilt werden, die erste geschieht innerhalb von Minuten während der Transplantation. Diese nennt man die hyperakute Reaktion und wird von existierenden Antikörpern im Empfänger verursacht, die die fremden Antigene auf den Endothelzellen (EZ) des Xenotransplantats erkennen und mit ihnen reagieren. Diese Erkennung löst die Komplementkaskade aus, die zur Lysis und zum Tod der EZ des Xenotransplantats führt.
Diese anfängliche hyperakute Abstoßung wird dann durch verzögerte vaskuläre Reaktion (die auch als akute vaskuläre Abstoßung oder verzögerte Xenograft Abstoßung bezeichnet wird) verstärkt. Lysis und Tod der EZ während der hyperakuten Reaktion sind durch Ödem und Auftreten von Adventitialzellen begleitet, die konstitutiv Gewebefaktor (TF) an ihrer Oberfläche exprimieren. Wie man annimmt, spielt der Gewebefaktor eine Schlüsselrolle bei der Aktivierung der in vivo Koagulationskaskade und sein Auftreten im Plasma löst die Gerinnungsreaktionen aus. Thrombin und TNF-α lokalisieren sich um das beschädigte Gewebe herum und dieses induziert eine weitere Synthese und Exprimierung von TF durch EZ.
Die Umgebung um ruhende EZ neigt nicht zur Koagulation. Verschiedene natürliche Koagulations-Inhibitoren sind mit den extrazellulären Proteoglykanen der EZ assoziiert, wie der Gewebefaktorinhibitor, Antithrombin III und Thrombomodulin. Die Erkennung des fremden Gewebes durch xenoreaktive natürliche Antikörper verursacht jedoch den Verlust dieser Moleküle. Zusammen mit dem Auftreten und der Induktion des Gewebefaktors wird die antikoagulante Umgebung um die EZ daher pro-koagulant.
In den vaskularisierten Regionen des Xenotransplantats bilden sich deshalb Gebiete mit Blutgerinnseln, ein Charakteristikum für beschädigtes Gewebe. Die Blutversorgung ist beeinträchtigt und das transplantierte Organ wird ischämisch. Eine umfassendere Darstellung der verzögerten vaskulären Abstoßung findet sich in Bach et al. (1996).
Die Verwendung von xenogenen Organen in Transplantaten wird deshalb durch eine initiale hyperakute Abstoßung beeinträchtigt, gefolgt von einer anhaltenden vaskulären Abstoßung, der wahrscheinlich eine T-Zellen vermittelte Abstoßung folgt. Die Inhibierung dieser Mechanismen, die für diese Abstoßung verantwortlich sind, könnte die Verwendung von Xenotransplantaten ermöglichen.
Die einfache Gabe von geeigneten Inhibitoren ist jedoch gerade keine geeignete Vorgehensweise. Die vollständige Inhibierung des Komplementsystems in einem Empfängertier ist gleichbedeutend mit einer Immunsuppression, die opportunistische Infektionen zur Folge hat. Die Inhibierung der Koagulationskaskade in einem Empfänger macht das Tier dagegen anfällig für unkontrollierte postoperative Blutungen. Deshalb sollten die Inhibitoren am besten am Ort des Xenotransplantats im Empfänger lokalisiert sein.
Die Vermeidung der hyperakuten Abstoßung ist Gegenstand des Europäischen Patentes 0495852 (Imutran). Um Gewebe für Xenotransplantationen geeigneter zu machen, lehrt dieses Patent, dass sie mit homologen Komplement-Restriktionsfaktoren assoziiert sein sollten, die die vollständige Aktivierung des Komplementsystems in dem Empfänger des xenogenen Organs verhindern.
Diese Vorgehensweise wurde entwickelt und angewendet um transgene Tiere mit Organen, die die hyperakute Abstoßung überleben, herzustellen (Squinto, 1996). Transgene Mäuse, die humanes CD59, ein Komplement-Regulator, aus Herzendothelzellen exprimieren, sind hergestellt worden. Das humane CD59 behielt seine biologische Aktivität und dass Komplementsystem wurde inhibiert, wenn die transgenen Herzen mit humanem Plasma perfundiert wurden.
Es wurde von transgenen Schweinen, die eine humane DAF- und/oder CD59-Expression aufweisen, berichtet (McCurry, 1996). Das Auftreten kardialer Abstoßung dauerte bei transgenen Xenotransplantaten doppelt so lange wie bei den Kontrollen.
Die Inhibierung der verzögerten vaskulären Abstoßung hat nicht die gleiche Beachtung gefunden, obwohl die Inhibitoren der Koagulationskaskade sehr wohl im Stand der Technik bekannt sind und viele von ihnen gut charakterisiert wurden.
Zum Beispiel ist beim Gewebefaktorinhibitor (TFPI) bekannt, dass er die Funktion des aktiven Komplexes hemmt, welcher normalerweise zwischen dem Gewebefaktor, Faktor VIIa, und Faktor Xa gebildet wird. TFPI ist ein lösliches Polypeptid mit 276 Resten, dessen positiv geladener C-Terminus sich in der Proteoglykan-Schicht der EZ an Heparinsulphat bindet. Es wird in drei theoretische „Kunitz"-Domänen geteilt: Kunitz-Domäne I ist für die Bindung an Gewebefaktor und Faktor VIIa verantwortlich; Domäne II bindet an Faktor Xa; während die Funktion des Domäne III weniger bekannt ist (Hamamoto, 1993).
Das Zecken-Antikoagulans-Peptid (TAP) ist ein spezifischer und potenter Inhibitor des Faktor Xa. Dieses 60 Aminosäuren-Polypeptid wurde aus der Weichzecke Ornithodoros moubata isoliert.
Auch viele Schlangengifte enthalten Antikoagulans-Polypeptide. Zum Beispiel wurde ein 231 Aminosäuren Protein C Aktivator aus dem Gift der Agkistrodon contortrix contortrix aufgereinigt (McMullen, 1989; Kisiel, 1987).
Hirudin ist das Antikoagulans-Protein, was vom Blutegel Hirudo medicinalis verwendet wird, wenn er das Blut seines Opfers absaugt. Es ist sehr wirksam und bindet sich an Thrombin in einem 1 : 1 Verhältnis mit einer Dissoziationskonstante im femtomolaren Bereich. Die aktive Stelle von Thrombin ist im stabilen Komplex maskiert und auf diese Weise verhindert Hirudin den Abbau des Fibrinogens, folglich blockiert es die Bildung von Blutgerinnseln.
Eine Möglichkeit die Antikoagulanzien am Ort der Abstoßung zu platzieren, ist, Hirudin an Antikörpern zu binden, die gegen E-Selektin gerichtet sind, welches auf der Oberfläche der EZ während der Zell-Aktivierung exprimiert wird. Es konnte bei dieser Vorgehensweise gezeigt werden, dass sie die Gerinnsel-Bildung effektiv in vitro hemmt (Kiely, 1995). Andere mögliche Strategien wurden kürzlich durch Bach et al besprochen. (1996).
P-Selektin (auch bekannt als CD62) wird ebenfalls auf der Oberfläche von EZ während der Zell-Aktivierung exprimiert. Während der Synthese wird es in sekretorische Speichergranula in Plättchen und Endothelzellen durch Sequenzen zielgesteuert, die in seiner zytoplasmatischen Domäne anwesend sind. Als Reaktion auf Zellagonisten, wie Thrombin, werden die Granula schnell wieder verteilt und P-Selektin auf der Zelloberfläche exprimiert (Green, 1994).
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, membrangebundene Antikoagulans-Proteine zu liefern. Diese Proteine sind geeignet für die Hemmung der Gerinnungskaskade auf der Oberfläche von EZ, folglich für die Hemmung von in vivo Mechanismen, die für die Organ-Abstoßung verantwortlich sind.
Es ist eine weitere Aufgabe, eine regulierte Expression solcher Moleküle auf der Oberfläche von EZ zu ermöglichen, so dass die Koagulationshemmung lokal im Verlauf einer Organ-Abstoßung stattfindet. Die Abstoßung kann xenogener oder allogener Natur sein.
Es ist noch eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, biologische Gewebsarten zu liefern, die zur Transplantation, insbesondere zur Xenotransplantation geeignet sind.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Hinsichtlich des ersten Aspekts der gegenwärtigen Erfindung ist ein Protein vorgesehen, das einen Bereich mit antikoagulatorischer Wirkung aufweist, einen Bereich, der das besagte Protein an einer Zellmembran verankern kann und eine Zielsequenz, welche ein entstehendes Polypeptid in einen sekretorischen Granulus zielsteuern kann, wodurch das Protein am konstitutiven Exprimiertwerden an der Zelloberfläche gehindert wird.
Das ist vorzugsweise ein chimäres Protein, was bedeutet, dass die Ankerbereich und die antikoagulante Region aus verschiedenen Proteinen stammen.
Die antikoagulante Region kann die Sequenz jedes antikoagulanten Polypeptids besitzen. Beispiele solcher antikoagulanten Polypeptide umfassen Heparin, TAPs, Antithrombin, Hirudin und TFPIs, zuzüglich ihrer funktionellen Derivate, wie ihre Fragmente oder Derivate, die ihre antikoagulante Aktivität behalten. Über antikoagulante Derivate von Thrombin, normalerweise ein Prokoagulans, ist auch berichtet worden (Dang, 1997).
Bevorzugt besitzt die antikoagulante Region die Sequenz eines Hirudins. Hirudine umfassen Hirudin, Hirudin-Derivate, Analoga („Hiruloge") und Varianten (z.B. Hirudisine). Zum Beispiel wurde berichtet, dass Sulfatierung am Tyr-64 die antikoagulatorische Aktivität des Hirudins erhöht, und dass Hirudisin-2 ein potenterer Inhibitor der Thrombinaktivität ist, als Hirudin selbst (z.B. Knapp, 1992; Skern, 1990).
Als Alternative kann der antikoagulante Bereich die Sequenz eines Gewebefaktorinhibitors (TFPI) besitzen. TFPIs umfassen TFPI selbst und ihre Derivate und Analoga, welche inhibitorische Aktivität beibehalten. Vorzugsweise weist die TFPI-Sequenz die Kunitz-Domänen I und II des TFPI selbst auf.
Als eine weitere Alternative kann die antikoagulante Region die Sequenz eines Zecken-Antikoagulans-Peptid (TAP) besitzen. TAPs umfassen TAP selbst und seine Derivate oder Analoga, welche inhibitorische Aktivität beibehalten. Zum Beispiel wurde die Wirksamkeit der FXa-Hemmung durch TAP durch ortsspezifische Mutagenese gesteigert (z.B. Mao, 1995).
Weitere alternative antikoagulante Bereiche wären zum Beispiel die Sequenz eines Protein C Aktivators, wie die, die aus Schlangengift isoliert worden sind (z.B. McMullen, 1989, Kisiel, 1987), oder eine Sequenz des Antikoagulans des Schlangengiftes, welches anders als über die Aktivierung des Proteins C funktioniert, oder ihre Derivate oder Analoga, welche inhibitorische Aktivität beibehalten.
Der Ankerbereich kann jede beliebige funktionelle Einheit sein, die in der Lage ist, ein Protein an eine Zellmembran zu binden. Geeignete Beispiele umfassen transmembrane Sequenzen aus Membran-Proteinen und GPI-Ankern. Der Ankerbereich ist vorzugsweise eine Sequenz, die fähig ist, das Protein an die Lipid-Doppelschicht zu binden, so wie die transmembranen Regionen der HLA-Klasse I oder CD4-Proteine. Es kann ebenfalls für das Protein wünschenswert sein, die zytoplasmatische Domäne aufzuweisen, welche meistens mit den genannten transmembranen Regionen assoziiert ist, so wie die zytoplasmatische Domäne des CD4 und/oder die extrazellulären Domänen, die unmittelbar der Zellmembran angrenzen, wie die CD4 Domänen 3 und 4. Der Ankerbereich kann alternativ eine Sequenz sein, die dem Protein die Fähigkeit verleiht, sich extrazellulär mit einem Membran-Protein zu verbinden, ohne dass das Protein selbst in die Zellmembran eingefügt ist.
Vorzugsweise ist die Zielsequenz eine Polypeptid-Sequenz, welche ein entstehendes Polypeptid in einen sekretorischen Granulus zielsteuern kann, noch mehr wird ein sekretorischer Granulus bevorzugt, welcher solange nicht mit der Zellplasmamembran fuioniert, bis die Zelle hinreichend stimuliert ist. Zum Beispiel, fusionieren die Weibel-Palade-Körperchen mit der Plasmamembran solange nicht, bis die endotheliale Zelloberfläche durch ein Sekretagoge, wie Thrombin oder Fibrin stimuliert worden ist (Wagner, 1993). Vorzugsweise fusioniert der sekretorische Granulus mit der Plasmamembran während der EZ-Aktivierung, welche während einer Organ-Abstoßung vorkommt.
Folglich wird eine Zielsequenz bevorzugt, welche ein entstehendes Polypeptid in ein Weibel-Palade-Körperchen zielsteuert, wie die relevante Sequenz des P-Selektin. Am meisten wird das erfindungsgemäße Protein bevorzugt, das eine antikoagulante Sequenz und die transmembranen und zytoplasmatischen Domänen des P-Selektin umfasst. Die Domänen des P-Selektin umfassen deshalb sowohl die Anker-Sequenz als auch die Zielsequenz.
Gemäß einem zweiten Aspekt dieser Erfindung ist ein Polynukleotid vorgesehen, das gemäß der vorliegenden Erfindung ein Protein kodiert: Dieses Polynukleotid ist vorzugsweise eine DNA.
Vorzugsweise besitzt das Polynukleotid Sequenzen, die für die Regulation der Exprimierung des Proteins gemäß dieser Erfindung geeignet sind. Diese Expression kann vorzugsweise kontrolliert werden, wie eine zellspezifische Kontrolle, induzierbare Kontrolle, oder zeitliche Kontrolle. Beispielsweise kann die Expression für EZ spezifisch sein, oder kann als Antwort auf eine Zell-Aktivierung reguliert werden.
Gemäß einem dritten Aspekt dieser Erfindung ist ein Vektor vorgesehen, der ein Polynukleotid gemäß dem zweiten Aspekt besitzt.
Der Terminus „Vektor" bezeichnet ein Molekül, welches fähig ist, ein Polynukleotid in eine Wirtszelle zu transferieren. Vorzugsweise ist der Vektor ein DNA-Vektor und bevorzugt ist er zur Exprimierung einer RNA fähig, die ein erfindungsgemäßes Protein kodiert. Zahlreiche geeignete Vektoren sind im Stand der Technik bekannt.
Vorzugsweise ist der Vektor zur Produktion von transgenen Tieren geeignet. Zum Beispiel sind geeignete Vektoren zur Erzeugung transgener Schweine bei Heckl-Östreicher (1995), McCurry (1996), White (1995), Yannoutsos (1995) und Langford (1996) beschrieben. Geeignete Minigen-Vektoren zur Erzeugung transgener Mäuse sind bei Diamond (1995) beschrieben.
Gemäß dem vierten Aspekt dieser Erfindung ist ein Abgabe-System vorgesehen, das ein Molekül nach dem ersten, zweiten oder dritten Aspekt aufweist mit der Bedeutung, dass das genannte Molekül an eine Zielzelle abgegeben wird.
Bestimmten Vektore nach dem dritten Aspekt können auch als ein geeignetes Abgabe-System dienen. Bestimmte Abgabe-Systeme gemäß dem vierten Aspekt können gleichermaßen von Natur aus Vektoren sein, dies aber ist nicht immer der Fall. Zum Beispiel kann ein viraler Vektor ebenfalls als ein Abgabe-System dienen, während ein liposomales Abgabe-System kein Vektor ist.
Das Abgabe-System kann viral oder nicht-viral sein. Nicht-virale Systeme, wie Liposome, vermeiden einige der Schwierigkeiten, die mit Virus-basierten Systemen verbunden sind, wie die Kosten einer Kleinproduktion, geringe Beständigkeit der Expression und Sicherheitsaspekte. Das Abgabe-System ist vorzugsweise geeignet für die Verwendung in der Gentherapie. Zahlreiche geeignete Abgabe-Systeme im Stand der Technik bekannt.
Vorzugsweise wird das Abgabe-System darauf abzielen, dass die erfindungsgemäßen Moleküle von zur Transplantation geeigneten Zellen aufgenommen werden, oder von Zellen, die transplantiert worden sind. Vorzugsweise ist das Abgabe-System spezifisch für diese Zellen. Zum Beispiel kann das Abgabe-System auf ein spezifisches Organ abzielen, wie das Herz oder die Niere, oder ein spezifischer Zelltyp, wie Endothelzellen.
Um dies zu erreichen, kann das Abgabe-System zum Beispiel ein rezeptorvermitteltes Abgabe-System sein, dass auf Rezeptoren, die man auf Zielzellen findet, abzielt. Zum Beispiel kann das Abgabe-System auf die Rezeptoren abzielen, niemand auf Herzzellen findet, vorzugsweise auf Rezeptoren, die ausschließlich auf Herzzellen gefunden werden, oder es kann auf die Rezeptoren abzielen, die auf Endothelzellen gefunden werden, vorzugsweise auf Rezeptoren, die ausschließlich auf Endothelzellen gefunden werden, oder auf Rezeptoren, die auf aktivierten Endothelzellen gefunden werden, wie E-Selektin oder P-Selektin.
Das Abgabe-System ist vorzugsweise zur Erzeugung von transgenen Tieren geeignet. Zum Beispiel kann das Abgabe-System auf eine Gamete, eine Zygote oder eine embryonalen Stammzelle abzielen.
Gemäß einem fünften Aspekt dieser Erfindung ist ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Einschleusung eines Vektors in eine nicht-humane Zelle vorgesehen. Dies kann die Verwendung eines erfindungsgemäßen Abgabe-Systems einschließen.
Der nicht-humane Zelltyp kann prokaryotisch oder eukaryotisch sein. Die Einschleusung kann in vivo oder ex vivo erfolgen. Wenn die nicht-humane Zelle für Transplantation vorgesehene ist, ist die Zelle vorzugsweise eukaryotisch, vorzugsweise eine Endothelzelle. Die stabile Einschleusung von Endothelzellen vom Schwein ist zum Beispiel bei Heckl-Östreicher (1995) beschrieben.
Vorzugsweise ist die nicht-humane Zelle geeignet zur Erzeugung von transgenen nicht-humanen Tieren. Vorzugsweise ist die nicht-humane Zelle eine Gamete, eine Zygote oder eine embryonale Stammzelle. Die Einschleusung von murinen Eizellen durch Mikroinjektion zur Erzeugung von transgenen Mäusen ist beispielsweise bei Diamond (1995) beschrieben worden, und die Mikroinjektion Zygoten vom Schwein, beispielsweise, um transgene Schweine zu erzeugen, ist bei Yannoutsos (1995), Langford (1996), und White (1995) beschrieben.
Gemäß dem sechsten Aspekt dieser Erfindung ist eine nicht-humane Zelle vorgesehen, die gemäß dem fünften Aspekt transfiziert wurde.
Um die Wirksamkeit der Hemmung der Koagulationskaskade zu erhöhen, ist die nicht-humane Zelle vorzugsweise fähig, zwei oder mehr unterschiedliche Proteine gemäß der Erfindung zu exprimieren, wobei jedes von ihnen imstande ist, die Koagulationskaskade in einer unterschiedlichen Phase zu hemmen. Zum Beispiel kann die antikoagulante Region in einem Protein ein TFPI aufweisen, während es in einem anderen ein Hirudin aufweist.
Gemäß einem siebten Aspekt dieser Erfindung ist ein nicht-humanes biologisches Gewebe vorgesehen, das eine erfindungsgemäße Zelle aufweist. Der hier verwendete Terminus „biologisches Gewebe" umfasst Sammlungen von Zellen, Geweben und Organen. Demgemäß umfasst der Begriff beispielsweise Fibroblasten, eine Kornea, Nervengewebe, ein Herz, eine Leber oder eine Niere.
Gemäß einem achten Aspekt dieser Erfindung ist ein nicht-humanes Tier vorgesehen, das eine erfindungsgemäße Zelle und/oder biologisches Gewebe aufweist. Vorzugsweise ist das nicht-humane Tier zur Herstellung von Organen zur Transplantation in Menschen geeignet. Vorzugsweise ist das nicht-humane Tier ein Säugetier und vorzugsweise ein transgenes Schwein oder ein transgenes Schaf.
Das nicht-humane Tier kann lebend so behandelt werden, dass es transgenes biologisches Gewebe enthält (z.B. durch Gen-Therapie behandelt). Vorzugsweise wird ein lebendes nicht-humanes Tier mit einem erfindungsgemäßen Vektor transfiziert, um ein nicht-humanes transgenes Tier herzustellen. Zum Beispiel könnte ein erfindungsgemäßer Vektor spezifisch in die Endothelzellen in einem Schwein abgegeben werden, um zur Xenotransplantation geeignete transgene Organe herzustellen.
Alternativ kann das nicht-humanes Tier als ein transgenes Tier geboren sein. Es sind verschiedene geeignete Vorgehensweisen zur Erzeugung solcher transgenen Tiere im Stand der Technik bekannt (z.B. Bradley & Liu, 1996; Clarke, 1996; Wheeler, 1994). Zum Beispiel ist die direkte Manipulation der Zygote oder eines frühen Embryos, beispielsweise durch Mikroinjektion von DNA, gut bekannt, genauso wie die in vitro Manipulation von pluripotenten Zellen, wie embryonale Stammzellen. Retrovirale Infektion von frühen Embryonen war bei einer Reihe von Spezies nachweislich erfolgreich, und über adenovirale Infektion von zonafreien Eiern wurde berichtet. Transgenese und Klonen vom Schaf durch nuklearen Transfer wurde ebenfalls beschrieben (z.B. WO 97/07668).
Gemäß einem neunten Aspekt dieser Erfindung, ist ein Verfahren zur Herstellung biologischen zur Transplantation geeigneten Gewebes vorgesehen, welches die Exprimierung eines oder mehrerer Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung in biologischem Gewebe, vorzugsweise in seinen Endothelzellen, aufweist. Das biologische Gewebe kann so entweder in vivo oder ex vivo hergestellt werden. Zum Beispiel kann ein nicht-humanes Tierorgan in vivo mit einem erfindungsgemäßen Vektor transfiziert sein, oder ein Organ könnte ex vivo vor der Transplantation oder in vivo nach der Transplantation transfiziert sein.
Gemäß einem zehnten Aspekt dieser Erfindung ist ein Verfahren zur Transplantation vorgesehen, welches die Transplantation von erfindungsgemäßem biologischem Gewebe von einem nicht-humanen Spendertier in ein nicht-humanes Empfängertier umfasst. Vorzugsweise bezieht sich das Verfahren auf die Xenotransplantation und das biologische Spender-Gewebe ist xenogen in Bezug auf das Empfängertier.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt Karten der erfindungsgemäßen Hirudin-CD4 chimären Proteine und Strukturen. (A) HLA-Hirudin-CD4 Strukturen mit Glycin Verbindungen. (B) HLA-Hirudin-CD4 Struktur mit humanem P-Selektin C-Terminus, wobei die spezifische Zielsequenz unterstrichen ist.
2 zeigt FACS Profile für die in DAP.3 Fibroblasten exprimierte Hirudin-CD4 Struktur.
3 zeigt FACS Profile für in CHO-K1 exprimierte Hirudin-CD4-P-Selektin cDNA Strukturen.
4 zeigt Hirudin-CD4 exprimierende Fibroblasten, die Thrombin binden.
5 zeigt die Spezifität der Thrombinbindung an Hirudin-CD4 exprimierende Zellen.
6 zeigt die Thrombinbindung an CHO-K1 Zellen, die mit HLA-Hirudin Strukturen transfiziert sind.
7 zeigt, dass die Inaktivierung von Thrombin die Thrombinbindung an Hirudin-CD4 an der Zelloberfläche verhindert. Hirudin-G2-CD4 exprimierende Zellen wurden mit Thrombin oder inaktiviertem Thrombin inkubiert und die Bindung des Thrombins mit Anti-Prothrombin- oder Anti-Thrombin-Hirudin-Antikörpern angefärbt.
8 zeigt Karten von erfindungsgemäßen TFPI-CD4 chimären Proteinen und Strukturen.
9 zeigt Durchflusszytometrie Profile von DAP.3 Zellen, die TFPI exprimieren, welche an die Zelloberfläche gebunden sind.
10 zeigt die spezifische FXa Bindung an zelloberflächengebundenes TFPI_1–276-CD4 und TFPI_1–183-CD4.
11 zeigt die Blockierung der FXa Bindung durch eine polyklonale Anti-TFPI Immunoglobulin-Fraktion.
12 zeigt die Blockierung der FXa Bindung durch monoklonale Antikörper, die gegen die Kunitz Domänen I und II gerichtet sind.
13 zeigt die Inhibierung von FXa durch Zellen, die TFPI_1–276-CD4 und TFPI_1–183-CD4 exprimieren. Die mittlere Zeit, nach der ein FXa-spezifisches chromogenes Substrat OD₄₀₅ = 0,1 erreicht, ist für die transfizierten DAP.3 Zellen, die mit FXa inkubiert sind, gezeigt. Die Werte für die Kontroll-Zellen wurden abgezogen und Fehlerbalken zeigen die Standardabweichungen an.
14 zeigt, dass ein aktiver TF_1–219/FVIIa Komplex für die maximale Bindung an TFPI-CD4 chimäre Proteine benötigt wird. Genügen
15 zeigt die Spezifität der Thrombinbindung an immortalisierte Endothelzellen vom Schwein (IPEC), die Hirudin-CD4 exprimieren und zeigt ebenso den Effekt der Exprimierung von Zelloberflächen-Hirudin-CD4 auf die Gerinnungszeiten.
16 zeigt die Verteilung von ACTH und Hirudin in D16/16 Zellen, wie man sie durch Fluoreszenz erhält.
17 zeigt die Veränderung der zellulären Verteilung von Hirudin-CD4-P-Selektin nach PMA-Stimulation.
18 zeigt, dass in IPEC exprimiertes TFPI-CD4 seine Bindungseigenschaften behält.
19 zeigt die kompetitive Bindung von Gewebefaktoren vom Schwein und Menschen.
20 zeigt, dass TFPI-CD4 verlängerte Gerinnungszeiten hat, wenn es auf IPEC-Oberflächen exprimiert wurde.
21 zeigt den antikoagulanten Effekt einer gemeinsamen Exprimierung von TFPI-CD4 und Hirudin-CD4.
BESCHREIBUNG DER AUSFÜHRUNGSFORMEN
1. Hirudin, dass mit HLA-Klasse I Signalpeptid fusioniert und an die Domänen 3 und 4 von humanem CD4 gebunden ist, ist mit der Zellmembran verknüpft.
Um heterologe Hirudin-Systeme in Säugetierzellen zur exprimieren, wurde die cDNA für die Membran-Zielsignalpeptid-Leadersequenz aus humanem HLA-Klasse I A2.1, Aminosäuren –1 to –24, (Holmes, 1987), unter Verwendung von PCR mit überlappenden Bereichen (1) mit der Hirudin Variante 1 fusioniert (Dodt, 1984).
Die HLA A2.1 Leadersequenz wurde unter Verwendung folgender Primer amplifiziert:
5'-cagtgtcgacggatccatggccgtcatggcgccccga-3' [hla-1] <SEQ ID 1>
(eingeführte SalI und BamHI Restriktionsstellen) und:
5'-gtcagtgtaaacaaccgcccaggtctgggtcagg-3' <SEQ ID 2>
Die Hirudinsequenz wurde unter Verwendung folgender Primer amplifiziert:
5'-acccagacctgggcggttgtttacactgactgcacc-3' und <SEQ ID 3>
5'-gacgctgcagaattcttgcaggtattcttccgggatt-3' [hir-3] <SEQ ID 4>
(eingeführte distale EcoRI und PstI Stellen).
Die resultierenden PCR Produkte (108 und 228 bp) wurden durch Agarose-Gelelektrophorese aufgereinigt und dann in einer dritten PCR mit flankierenden hla-1 und hir-3 Primern verwendet. Das resultierende PCR Produkt (300 bp) wurde mit SalI und BamHI geschnitten und in pBluescript SK(+) (Stratagene) subkloniert.
Ein aus für die CD4 Domänen 3 und 4 kodierende cDNA bestehender Anker (Maddon, 1985) wurde in Verbindung mit der Stop-Transfer-Sequenz (ST), transmembranen und cytoplasmatischen Domänen von CD4 (CD4_166–435) zu der HLA-Hirudin-Kassette hinzugegeben.
Um sicherzustellen, dass Hirudin mobil und aktiv blieb, wenn es mit seinem C-Terminus an den CD4 Anker gebunden wurde, wurden 3 verschiedenlängige Glycin-Linker hergestellt (als G1 bis G3 bezeichnet, 1A) und:

– für Glycin-Linker 1 (G1; GGSGG) bestand das Oligonukleotid-Paar aus 5'-aattaggaggttctggaggctgca-3' <SEQ ID 5> (es enthielt eine mutierte EcoRI-Erkennungssequenz und eine PstI-Stelle) und 5'-gcctccagaacctcct-3' <SEQ ID 6>;
– die Glycin-Linker 2 (G2) and 3 (G3) bestanden aus der Kernsequenz (GGSGG), die zwei oder beziehungsweise dreimal wiederholt wurde.

Diese Linker wurden in das 3'-Ende des HLA-Hirudin Fragmentes eingeführt.
Die Glycin-Linker Oligonukleotide wurden gepaart und jeweils an der EcoRI/PstI-Stelle des Plasmids, das die HLA-Hirudin-Kassette enthielt, ligiert, und zwar vor der Einfügung des CD4-Ankers.
CD4_166–435 wurde unter Verwendung folgender Primer amplifiziert:
5'-tgtctgcaggaaccagaagaaggtgtgaattca-3' <SEQ ID 7>
(eingeführte EcoRI und PstI Stellen) und:
5'-gtgggatccgcctggcctcgtgcctcaa-3' <SEQ ID 8>
(enthält ein distales BamHI).
Das resultierende PCR Produkt wurde in ein pBluescript kloniert und sequenziert. In CD4_166–435 war V³²⁸ und in A³²⁸ mutiert. Das PstI/BamHI CD4 Fragment wurde in die HLA-Hirudin-G1, -G2, & -G3 Plasmide subkloniert und diese Strukturen wurden durch DNA Sequenzanalyse verifiziert.
Jeder der drei cDNA Strukturen wurde in die BamHI-Stelle des Säugetierexpressionsvektors pHßActpr-1gpt (Gunning, 1987) subkloniert, dass die humane β-Aktin-Enhancer- und Promotor-Region in Verbindung mit einem SV40 Enhancer-Element für das GPT Resistenzgen enthielt, welches die Selektion von Klonen in Gegenwart von Mycophenolsäure erlaubt (1C & 1D). Die Ausrichtung des endgültigen Konstrukts wurde durch Restriktionsendonukleasekartierung verifiziert.
Vektoren mit dem individuellen HLA-Hirudin-G1/2/3-CD4-System wurden mit Kalziumphosphat entsprechend den Standardprotokollen in die Mäuse-Fibroblasten-Zelllinie DAP.3 transfiziert (Marguelies, 1983). Nach einem Wachstum von 18 Stunden in DMEM Medium (Gibco) mit 5% fetalem Kälberserum, Ampicillin, Streptomycin und Glutamin wurden die Zellen für 30 Sekunden mit Glycerin behandelt. Die Zellen wurden dann zweimal in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und neues Medium mit Xanthin, Hypoxanthin und Mycophenolsäure in einer Endkonzentration von 12 μg/ml wurde hinzugegeben.
Als Negativkontrolle wurden DAP.3 Zellen, die mit einem HLA-DR (Zelllinie 531) exprimierenden humanen Klasse II System transfiziert waren (Lechler, 1988), in einem identischen mycophenolsäurehaltigen Kulturmedium gezüchtet.
Überlebende Klone wurden auf Hirudin und CD4 Expression mit FACS unter Verwendung muriner monoklonale Antikörper 4158-81-7 (Schlaeppi, 1991) und OKT-4 (Reinherz, 1979) getestet. 10⁵ Zellen wurden mit den murinen Antikörpern für 30 Minuten auf Eis angefärbt und ein FITC-konjugierter Schaf Anti-Maus polyklonaler Antikörper wurde als zweite Schicht zugegeben.
Wie in 2 gezeigt, wurden diese Hirudin-CD4-Systeme an der Zelloberfläche von DAP.3 gut exprimiert. Es wurde kein signifikanter Unterschied hinsichtlich der Exprimierung zwischen Hirudin-CD4 und den drei unterschiedlichen verschiedenlängigen Glycin-Linkern nachgewiesen.
Daher können antikoagulante Polypeptide stabil auf der Zelloberfläche exprimiert werden.
2. Hirudin-CD4 mit einer Zielsequenz vom C-Terminus von P-Selektin wird an der Zelloberfläche von CHO-K1 exprimiert
Zusätzlich zu den HLA-Hirudin-G1/2/3-CD4-Systemen wurden zwei weitere Systeme mit Zielsequenzen synthetisiert, die von humanem P-Selektin abgeleitet waren ( 1B). Für diese Systeme wurde die transmembrane Region von CD4 benutzt, wohingegen die Stopp-Transfersequenz und der C-Terminus durch die korrespondierenden Sequenzen von P-Selektin ersetzt wurden (Johnston, 1989).
Um die CD4 Domänen 3 und 4 plus der transmembranen Region (CD4_166–395) mit der Stopp-Transfersequenz und den cytoplasmatischen Regionen 1 und 2 von humanem P-Selektin zu fusionieren (P-sel_754–789) (McEver 1989), wurde eine PCR mitüberlappenden Bereichen durchgeführt. Für die Amplifikation des CD4 Teils des Moleküls wurden die Primer:
5'-tgtctgcaggaaccagaagaaggtggaattca-3' [CD4-5] <SEQ ID 7>
(eingeführte EcoRI und PstI Restriktions-Stellen) und:
5'- gtctgaaacgctttctgaagaagatgcctagcccaatgaaaagcaggaggccg-3' <SEQ ID 9>
benutzt. Um die C-terminale Regionen von P-Selektin zu amplifizieren, wurden die Primer:
5'-tgggctaggcatcttcttcagaaagcgtttcagacaaaaaga-3' und <SEQ ID 10>
5'-gaccaggatccggacaggtctctta-3' [P-selN3] <SEQ ID 11>
(eingeführte distale BamHI Stelle) benutzt.
Nach der Reinigung der resultierenden PCR Produkte aus Agarose-Gels wurde eine dritte PCR unter Verwendung der flankierenden Primer CD4-5 und P-selN3 durchgeführt. Das resultierende PCR Produkt (832 bp) wurde mit PstI und BamHI geschnitten, in pBluescript subkloniert und sequenziert. Danach wurde das CD4-Psel Fragment (CD4_166–395-P-SeI_754–789) mit PstI/BamHI herausgeschnitten und in HLA-Hirudin-G1 oder -G2-haltige Plasmide subkloniert.
Die endgültigen HLA-Hirudin-G1/G2-CD4-P-Selektin-Systeme wurden in die BamHI-Stelle von pHβActpr-1gpt subkloniert und in CHO-K1 Zellen (ATCC CCL61) transfiziert, die in RPMI 1640 Medium (Gibco) mit 5% fetalem Kälberserum, Ampicillin, Streptomycin und Glutamin gezüchtet waren.
Die Transfektion wurde gemäß Standardprotokollen durch Elektroporation durchgeführt. Kurz gesagt wurden 5 × 10⁶ Zellen in 350 μl serumfreies Medium resuspendiert und in eine 1 ml Elektroporationsküvette mit 0,4 cm Elektrodenabstand überführt (Bio-Rad). Nach Zugabe von 10 μg Plasmid DNA in 150 μl wurden die Proben vorsichtig geschüttelt und auf Eis gelagert. Die Zellen wurden einer Elektroporation bei unendlichem Widerstand, 960 μF und 350 V in einem Gene Pulser Gerät ausgesetzt(Bio-Rad). Einen Tag nach der Elektroporation wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und neues Medium mit Mycophenolsäure, Xanthin und Hypoxanthin wurde hinzugegeben.
Es wurde vor kurzem gezeigt das bei mit P-Selektin cDNA transfizierten CHO-K1 Zellen das P-Selektin Protein sich nicht intrazellulär kumulierte sondern an der Zelloberfläche exprimiert wurde (Disdier, 1992). In den wie oben hergestellten CHO-K1-Transfektaten wurden sowohl Hirudin-G1-CD4-P-Selektin als auch Hirudin-G2-CD4-P-Selektin an der Oberfläche exprimiert wie eine Anfärbung mit OKT-4 und 4158-81-7 monoklonalen Antikörpern zeigte (3). Als Negativkontrolle wurde eine CHO-K1 Zelllinie benutzt, welche mit den CD4 Domänen 3 und 4 fusioniertes TFPI exprimierte, und welche in demselben mycophenolsäurehaltigen Medium gezüchtet wurde.
Als Positivkontrolle wurden CHO-K1 Zellen mit dem humanen P-Selektin in voller Länge transfiziert (Johnston, 1989), welches als ein 3142bp SalI Fragment in ein pHβActpr-1 neo, dass ein SV40-gesteuertes Neomycin (G418) Resistenzgen enthielt. Diese Zellen wurden mit 400 μg/ml G418 behandelt und nach zwei Wochen wurden zwei individuelle Klone mit Baumwolltupfern gepickt und auf 12-Well Platten überführt. Überlebende Klone wurden unter Verwendung von 4158-81-7 bei 10 μg/ml und unverdünntem OKT-4 Hybridom-Überstand auf Hirudin und CD4 Expression getestet.
Humanes P-Selektin wurde mit einem Anti-CD62 mAb (Becton Dickinson) entsprechend den Herstellerangaben nachgewiesen. Eine ähnliches FACS-Profil wie für Hirudin-CD4-P-Selektin wurde für diese CD62-markierten Zellen (3E) beobachtet, was bestätigte, dass CHO-K1 Zellen P-Selektin an der Plasmamembran exprimieren.
Daher behalten chimäre Proteine, die die P-Selektin Zielsequenz aufweisen, ihre Funktion, wenn sie an der Zelloberfläche exprimiert werden.
3. An der Zelloberfläche verankertes Hirudin bindet Thrombin, wie mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen wurde
Um zu testen ob auf diese Weise an der Zelloberfläche gebundenes Hirudin er seine Thrombin bindende Aktivität behält, wurde der folgende Bindungs-Assay benutzt.
Stabil transfizierte Zellen ließ man vor jedem Experiment in T75 Kulturkolben 36 Stunden wachsen. DAP.3 Zellen wurden mit einem Zellschaber abgelöst, während CHO-K1 Zellen vom Plastik durch zehnminütige Behandlung mit PBS, EDTA bei 37°C abgelöst wurden. Nach viermaligem waschen mit PBS, das 0,1% BSA (Gew./Vol.) enthielt, wurden 2,5 × 10⁵ Zellen in 150 μl für eine Stunde bei 37° unter steigenden Thrombin-Konzentrationen inkubiert. Diese Zellen wurden viermal mit 0,1% BSA haltigem PBS gewaschen und weiter 30 Minuten auf Eis mit anti-humanen Prothrombin-Immunglobulinen vom Kaninchen (10 μg/ml in 100 μl) (Dakopatts) inkubiert. Schließlich wurden die Transfektanten dreimal gewaschen und mittels Durchflusszytometrie analysiert.
Wie die 4 zeigt, behält an der Zelloberfläche exprimiertes Hirudin die Fähigkeit Thrombin zu binden und die Glycin-Linkerlänge beeinflusst nicht die Thrombin-Bindung.
Um die Menge an Thrombin zu bestimmen, die benötigt wird, um die Hirudin-CD4 exprimierenden Zellen zu sättigen, wurden zwei Klone mit Thrombin bei 82 U/ml inkubiert. Nach der Analyse der prozentual positiven Zellen wurden die Transfektanten bei 41 U/ml Thrombin gesättigt (4C). Nach den mittleren Fluoreszenz-Intensitäten (MFI) wurden die Zellen jedoch selbst bei 82 U/ml nicht gesättigt (4D). Bei diesen hohen experimentellen Thrombin-Konzentrationen nahm die Hintergrundbindung an Kontrollzellen, die HLA-DR exprimieren, signifikant zu.
Um die Spezifität der Thrombin-Bindung an Hirudin-CD4 weiter zu klären, wurden Blockierungs-Experimente durchgeführt. DAP.3 HLA-Hirudin-G3-CD4 Transfektanten wurden auf Eis für 30 Minuten mit 10 μg/ml Anti-Hirudin mAB oder geeigneten Kontrollen (Maus IgG1 and IgG2a, Dakopatts) für 30 Minuten auf Eis präinkubiert und zweimal in 0,1% BSA haltigem PBS gewaschen, vor einer Inkubation mit Thrombin für eine Stunde bei 37°C wie oben beschrieben. Die Thrombin-Bindung wurde wie oben beschrieben analysiert.
Die Präinkubation mit 4158-81-7 inhibierte die spezifische Thrombin-Bindung an Hirudin-CD4 (5A). Die Thrombin-Bindung durch Hirudin-CD4 wurde durch Inkubation mit Thrombin und Vergleich der Markierung mit mAB 4107-76-1 (Schlaeppi, 1991) und Anti-Prothrombin-Immunglobulinen gezeigt. 4107-76-1 ist direkt gegen den Hirudin-Thrombin-Komplex gerichtet und weist weder Hirudin ohne Thrombin noch Thrombin nach, dass an endogene Thrombin-Rezeptoren gebunden ist. Wie in 5B gezeigt wird, lief die mit 4107-76-1 nachgewiesene Thrombin-Bindung parallel zur mit der Anti-Prothrombin-Immunglobulin-Fraktion nachgewiesenen Bindung.
Daher behält an der Oberfläche von DAP.3 Zellen exprimiertes Hirudin die spezifische Thrombin-Bindung.
Immortalisierte Endothelzellen vom Schwein (IPEC) wurden mit Hirudin-CD4 auf die gleiche Weise transfiziert. Wie in 15A gezeigt, banden nur die transfizierten Zellen Thrombin, und dieses wurde durch das 4158-81-7 in einer dosisabhängigen Weise blockiert (15B). Ein humanes Plasma Rekalzifizerungs-Testsystem wurde für die weitere Untersuchung der funktionalen Wirkungen der Exprimierung von oberflächengebundenem Hirudin auf IPEC benutzt. Wie in 15C gezeigt, verkürzte untransfiziertes IPEC die Gerinnungszeit von rekalzifizertem Plasma auf ungefähr 170 Sekunden, verglichen mit einer Kontroll-Gerinnungszeit von 370 Sekunden in Abwesenheit von den Zellen. Die Präinkubation mit IL-1, dass die TF- Expression induziert, reduziert die Gerinnungszeit weiter unter 100 Sekunden. Im Gegensatz dazu wurden die Gerinnungszeiten für transfizierte IPEC verlängert, sogar nach Präinkubation mit IL-1-induzierter TF Expression. Die Inkubation mit 4158-81-7 reduzierte den antikoagulanten Effekt in einer dosisabhängigen Weise, was darauf hinweist, dass der Effekt auf der Anwesenheit von Zelloberflächen-Hirudin beruhte (15).
Auf der Oberfläche von IPEC exprimiertes Hirudin bindet demnach Thrombin und inhibiert auch die Gerinnung von humanem Plasma.
4. Durch CHO-K1 exprimiertes Hirudin-CD4-P-Selektin bindet Thrombin
Um zu untersuchen ob Hirudin-CD4-P-Selektin auch Thrombin bindet, wenn es an der Oberfläche von CHO-K1 Zellen exprimiert wird, wurden diese Zellen eine Stunde bei 37°C mit Thrombin inkubiert. Nach Färbung mit Anti-Prothrombin-Immunglobulinen und Zugabe einer zweiten FITC-markierten Antikörperschicht wurden die Zellen mit Durchflusszytometrie untersucht.
Ein unterschiedliches Bindungsprofil wurde entdeckt, wie 6 zeigt. Mit Anti-Prothrombin-Immunglobulinen war eine Hintergrund-Thrombin-Bindung an CHO-K1 Zellen, die ein irrelevantes an CD4 gebundenes Protein exprimierten, nach Inkubation mit ziemlich geringen Thrombin-Konzentrationen feststellbar. Die spezifische Bindung von Thrombin an Hirudin wurde jedoch durch Färbung mit dem spezifischen Anti-Hirudin/Thrombin mAB 4107-76-1 verifiziert (6B). Mit diesem Antikörper war die Hintergrundbindung der der Kontroll-CHO-K1 Zellen nicht nachweisbar. Es ist ebenso aus 6 ersichtlich, dass Hirudin exprimierende Klone Thrombin unspezifisch in einem unterschiedlichen Ausmaß binden, was impliziert, dass sie verschiedene Exprimierungsgrade von endogenen Thrombin-Rezeptoren hatten. Diese Abweichung im unspezifischen Bindungsverhalten bestätigte sich mit verschiedenen anderen Klonen.
Zum Vergleich sind die Ergebnisse von zwei CHO-K1 Transfektanten, die Hirudin-G1-CD4 und Hirudin-G1-CD4 (das heißt keine P-Selektin Sequenz) exprimierten, in den 6C und 6D gezeigt. Mit Ausnahme einer leicht erhöhten Thrombin Bindung auf Grund besser exprimierter chimärer Proteine (höherer MFIs) wurden im Vergleich mit Transfektanten, die Hirudin exprimierten, welches an den CD4-P-Selektin Anker gebunden war, keine größeren Unterschiede in den Bindungsprofilen nachgewiesen.
5. Hirudin-CD4-P-Selektin wird in sekretorischen Granula gespeichert und kann durch Aktivierung freigesetzt werden
Um die intrazelluläre Akkumulation von Hirudin und sein Weg von den sekretorischen Granula zur Zelloberfläche zu untersuchen, wurde eine sekretorische murine hypophysäre Zelllinie (D16/16) vorübergehend mit cDNA, die entweder Hirudin-CD4-P-Selektin oder Hirudin-CD4 kodierte, transfiziert. Diese Zelllinie wurde aus zwei Gründen ausgewählt. Zum ersten ist bekannt, dass diese Zellen ACTH in spezifischen Speicher-Granula exprimieren, die bei Aktivierung durch Phorbolester von der Zelloberfläche freigesetzt werden. Zum zweiten verlieren Endothelzellen (die als der ideale Zelttyp zur Untersuchung des intrazellulären Ziels des P-Selektin Systems erscheinen würden) in einer vitro Kultur schnell ihre Weibel-Palade-Speichergranula.
48 Stunden nach der Transfektion wurden die D16/16 Zellen mit Antikörpern gegen Hirudin und ACTH gefärbt. In mit Hirudin-CD4-P-Selektin transfizierten Zellen wurde Hirudin in Granula gleichmäßig im Cytoplasma verteilt nachgewiesen (16A). Dasselbe Muster der Granula-Verteilung wurde mit spezifischer ACTH-Färbung gesehen, was eine Kolokalisation mit Hirudin bedeutet (16B)., wenn beide Antikörper für die Anfärbung benutzt wurden (16C).
Im Gegensatz dazu akkumulierten sich mit Hirudin-CD4 transfizierte D16/16 Zellen nicht in den intrazellulären Granula, sondern exprimierten große Mengen Hirudin an der Zelloberfläche (16C). Doppelte Färbung (16F) ergab lediglich eine leichte Kolokalisation von Hirudin und ACTH.
Hirudin-CD4-P-Selektin exprimierende Zellen wurden mit Phorbolester PMA aktiviert und mit Durchflusszytometrie analysiert. 4107-76-1 erkannte kein Hirudin an der Zelloberfläche in unstimulierten Zellen (17A). Nach 30 Minuten Stimulation wurde das Hirudin jedoch an der Zelloberfläche nachgewiesen (17B). Des Weiteren banden die aktivierten D16/16 Zellen spezifisch an Thrombin, im Gegensatz zu den nichtaktivierten Zellen (17C – gefärbt mit 4107-76-1).
Deshalb wurde klar nachgewiesen, dass, bei Verwendung der granulushaltigen hypophysären Zelllinie D16/16, Hirudin-CD4-P-Selektin an spezifische intrazelluläre Speichergranula zielgesteuert werden kann und dass durch Aktivierung funktionelle chimäre Moleküle freigesetzt und an der Zelloberfläche freigelegt werden können.
6. Die Interaktion zwischen Thrombin und Hirudin-CD4 wird aufgehoben, wenn die katalytische Seite von Thrombin inaktiviert ist.
Die spezifische Thrombinbindung an Hirudin-CD4 mit und ohne P-Selektin Zielsequenz war eindeutig (4 und 6). Um die Spezifität der Thrombin-Hirudin-Interaktion weiter zu verstärken, wurde Thrombin (210 mM in 50 μl Tris-gepufferter Salzlösung (TBS), 0,1% BSA, pH 7,4) für eine Stunde bei 37°C präinkubiert mit:

– nativem Hirudin in voller Länge (Biopharm) im 10-fachen molaren Überschuss;
– -D-Phe-Pro-Arg Chloromethyl-Keton-Dihydrochlorid ("PPACK-HCl") (Calbiochem) in einem 100-fachen molaren Überschuss; oder
– einem synthetischen C-terminalen Hirudin-Dodecapeptid Analogon aus den Hirudinresten 53–64 mit Sulfato-Tyr64 (American Diagnostica) im 100-fachen molaren Überschuss. Die thrombinabhängige Aktivität wurde mit einem kleinen chromogenen Oligopeptidsubstrat analysiert (H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl ("S-223 8") (Quadratech).

Um zu überprüfen ob Thrombin durch PPACK-HCl und Hirudin inaktiviert wurde, wurde 5 μl jeder Reaktionsmischung mit 95 ml TBS, 0,1% BSA verdünnt und mit 50 μl 4 mM S-2238 für 10 Minuten bei 37°C inkubiert.
Wie erwartet wurde keine chromogene Umwandlung von mit PPACK-HCl oder Hirudin inkubiertem Thrombin beobachtet, verglichen mit Thrombin, das ohne Inhibitor inkubiert worden war, wohingegen das Dodecapeptid die thrombinabhängige katalytische Aktivität, die durch S-2238 Abbau gemessen wurde, nicht beeinflusste.
Die drei unterschiedlichen Präparationen wurden zu Transfektanten hinzugegeben, die an der Zelloberfläche gebundenes Hirudin exprimierten. Unter Verwendung der oben beschriebenen Prozedur wurde die Thrombinbindung mit den Anti-Prothrombin- oder Anti-Hirudin-Thrombin-Antikörpern untersucht. Wie man in 7A sieht, wurde Thrombin, das mit Hirudin oder PPACK-HCl inaktiviert war, nicht durch Hirudin gebunden, was an der Zelloberfläche von DAP.3 exprimiert wurde. Zusätzlich wurde nur eine teilweise Thrombin-Dodecapeptid-Komplex Bindung beobachtet. Im Gegensatz zu DAP.3 Transfektanten, zeigten CHO-K1 Zellen eine relativ hohe Thrombin-PPACK-HCl-Hirudin Bindung (7B). Diese Wechselwirkung erwies sich als unspezifisch, wie mit dem Anti-Hirudin-Thrombin mAB 4107-76-1 gezeigt wurde. Es wurde keine spezifische Thrombin-PPACK-HCl-Hirudin Bindung nachgewiesen.
Dadurch wird bestätigt, dass an die Zelloberfläche gebundenes Hirudin spezifisch und fest an Thrombin an seiner katalytischen Stelle bindet.
7. Vollständiges und trunkiertes TFPI, das an CD4 Domänen verankert ist, wird an der Zelloberfläche exprimiert
Um TFPI an die Zellmembran zu binden, wurde ein Fusionsprotein aus humanem CD4_166–435 entweder an ein TFPI mit voller Länge einschließlich aller drei Kunitz Domänen oder an eine trunkierte TFPI Form ohne die Kunitz Domäne III und den C-Terminus (TFPI_1–183) (Wun, 1988) (8) gebunden. Diese wurden auf ähnliche Weise synthetisiert, wie oben für Hirudin beschrieben ist, wobei die TFPI und CD4 Sequenzen unter Verwendung eines Kassetten-Klonverfahrens fusioniert wurden, im Gegensatz zu Hirudin ist TFPI aber ein Säugetierprotein und enthält deshalb endogene Signalpeptide.
DNA, die den N-terminalen Bereich von TFPI einschließlich der Kunitz Domänen I und II (675 bp) kodiert, wurde unter Verwendung folgender Primer amplifiziert:
5'-catcgtcgacggatcctagatgatttacacaatgaagaaagtacatgcactttgggc-3 ' <SEQ ID 12>
(eingeführte SalI und BamHI Restriktions-Stellen) und:
5'-ggacctgcagaattcaaaaaggctgg-3' <SEQ ID 13>
(mit den EcoRI und PstI Restriktions-Stellen).
DNA, die die dritte Kunitz Domäne zusammen mit dem C-terminalen Ende von TFPI (315 bp) kodiert, wurde unter Verwendung folgender Primer amplifiziert:
5'-agcctttttgaattccacggtccctcat-3' <SEQ ID 14>
(mit einer EcoRI Stelle); und
5'-cattgctataacaactgcagatamttaac-3' <SEQ ID 15>
(mit einer PstI Stelle).
CD4_166–435 wurde wie oben beschrieben amplifiziert.
Durch die Einführung der Restriktionsstellen in das 3'-Ende von der TFPI_1–183 cDNA und dem 5'-Ende der TFPI_184–276 cDNA wurden H¹⁸⁴ und G¹⁸⁵ zu C¹⁸⁴ und R¹⁸⁵ in den rekombinanten Fusionsproteinen mutiert (Figur acht). Weiterhin wurde P¹⁸⁶ in S¹⁸⁶ mutiert. Das Stopcodon von TFPI wurde durch Einführung der PstI Stelle entfernt, dadurch M²⁷⁶ zu I²⁷⁶ mutiert und die Aminosäure C²⁷⁷ hinzugefügt. Im Verlauf der Einführung einer PstI Stelle an das N-terminale Ende der CD4 Domäne 3 wurden jeweils L¹⁶⁴ und Q¹⁶⁵ in C¹⁶⁴ und R¹⁶⁵ mutiert. Es wurde beobachtet, dass in der TFPI_184–276 cDNA K²⁵⁶ zu E²⁵⁶ und in CD4_166–435 V³²⁸ in A³²⁸ mutiert war (wie oben beschrieben).
An der PCR Produkte wurden in pBluescript SK(+) kloniert.
Die kompletten TFPI-CD4 cDNAs wurden in die BamHI Stelle des pHβActpr-1gpt Expressionsvektors ligiert.
Wie oben beschrieben, wurden die DAP.3 Zellen, die in DMEM mit Zusätzen aufbewahrt wurden, mit Kalziumphosphat wie oben beschrieben transfiziert. Die Klone wurden auf TFPI und CD4 Expression durch FACS unter Verwendung von murinem anti-humanem TFPI mABs 4903 oder 4904 (American Diagnostica), jeweils bei 10 μg/ml und einem unverdünnten OKT-4 Hybridom-Überstand, analysiert (Reinherz 1979). 4903 ist gegen die Kunitz Domäne I gerichtet, wohingegen 4904 gegen die Kunitz Domäne II gerichtet ist. Für jede Probe wurden 10⁵ Zellen analysiert und die Zelllinie 531 als Kontrolle verwendet, wie oben beschrieben.
Wie in 9 gezeigt, können sowohl TFPI_1–276-CD4 als auch TFPI_1–183-CD4 an der Zelloberfläche exprimiert werden.
8. An die Zelloberfläche gebundenes TFPI_1–183-CD4 und TFPI_1–276-CD4 vermittelt. die FXa Bindung
Um zu überprüfen, ob auf diese Weise an die Zelloberfläche gebundenes TFPI seine FXa Bindungs-Aktivität behält, wurde der folgende Bindungs-Assay benutzt.
Stabil transfizierte DAP.3 Zellen wurden durch zehnminütige Behandlung bei 37°C mit PBS, 5 mM EDTA abgelöst. Nach viermaligem Waschen mit PBS im Überschuss, 0,1% BSA (Gew./Vol.), wurden 2,5 × 10⁵ Zellen in 100 μl für eine Stunde bei 37°C mit steigenden FXa Konzentrationen inkubiert.
Die Zellen wurden dann zweimal gewaschen und weiter für 30 Minuten auf Eis bei 10 μg/ml in 100 μl antihumanen FXa-Immunglobulinen (RAFX-IG, Enzyme Research Laboratories) vom Kaninchen inkubiert. Nach zweimaligem zusätzlichem Waschen wurden die Zellen für 30 Minuten mit FITC-konjugierten Schweine-Anti-Kaninchen polyklonalen Immunglobulinen inkubiert und mittels Durchflusszytometrie analysiert.
Wie 10 zeigt, binden DAP.3 Zellen, die TFPI_1–183-CD4 und TFPI_1–276-CD4 an der Zelloberfläche exprimieren, FXa fest in einer dosisabhängigen Weise (10), wobei eine signifikante Bindung bei 0,02 nM nachgewiesen wurde. Kein Unterschied in der FXa Bindung wurde zwischen TFPI-CD4 in voller Länge und trunkiertem TFPI-CD4 gemessen.
Es war ebenfalls möglich, die FXa Bindung mit einer polyklonalen Anti-TFPI Immunglobulin-Fraktion (4901) oder mit den monoklonalen 4903 und 4904 zu blockieren.
Die Zellen wurden auf Eis für 30 Minuten mit 4901, 4903 oder 4904 bei steigenden Konzentrationen inkubiert, wobei ein Antihämoglobin-Antiserum (Dakopatts) als Negativkontrolle benutzt wurde. Die Zellen wurden dann zweimal in PBS, 0,1% BSA gewaschen und weiter für eine Stunde bei 37°C mit 5 nM FXa inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen und mit RAFX-IG inkubiert, wie oben beschrieben, und die FXa Bindung mittels FACS analysiert.
Die FXa Bindung an TFPI_1–276-CD4 verringerte sich um 27% und 55% bei 10 und 80 μg/ml polyklonalem 4901, entsprechend verglichen mit Zellen, die mit der irrelevanten Antihämoglobin-polyklonalen Kontrolle inkubiert waren (11A). Die verringerte FXa Bindung wurde ebenso für TFPI_1–183-CD4 Zellen gefunden, die mit 4901 präinkubiert wurden (11).
Wenn TFPI _1–276-CD4 mit entweder 4903 oder 4904 blockiert wurde, wurde eine 33% geringere FXa Bindung bei 40 μg/ml mAB beobachtet, verglichen mit isotypisch übereinstimmenden Maus-Immunglobulinen (12). Es wurde kein signifikanter Unterschied in der Blockierungsaktivität zwischen den mABs 4903 und 4904 gefunden.
Dies zeigt zum ersten Mal, dass TFPI seine FXa Bindungsaktivität behält, wenn es als membrangebundenes Fusionsprotein exprimiert wird.
9. TFPI_1–183-CD4 und TFPI_1–276-CD4 sind beide funktionell aktiv gegen FXa
Um zu bestimmen, ob an die Zelloberfläche gebundenes TFPI seine Fähigkeit behält, die Funktion von FXa zu inhibieren, wurde die proteolytische Aktivität von FXa unter Verwendung des chromogenen Substrates N-a-Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl ("S-2765") (Quadratech) analysiert.
Transfizierte DAP.3 Zellen wurden, wie oben beschrieben, abgelöst und viermal mit TBS im Überschuss, pH 7, 4,0, 1% BSA, gewaschen. 0,5 × 10⁶ Zellen (in 100 μl) pro Well wurden für eine Stunde bei 37°C mit verschiedenen Konzentrationen von FXa inkubiert. 50 μl 4 mM S-2765 wurde zugegeben und die Zellen wurden weiter für zwei Stunden bei 37°C inkubiert. OD₄₀₅ wurde alle 30 Sekunden gemessen und die Zeit, die benötigt wurde um ein OD₄₀₅ = 0,1 zu erreichen, wurde bestimmt, welche das verbliebene aktive FXa zeigte.
Die FXa Aktivität wurde durch exprimiertes TFPI-CD4 dosisabhängig inhibiert, wobei die größte Hemmung beobachtet wurde, wenn geringe Konzentrationen FXa (0,16 nM) zugegeben wurden (13). In einer Reihe von Experimenten wurde kein signifikanter Unterschied in der FXa Hemmung zwischen den Zellen, die TFPI_1–183-CD4 oder TFPI_1–276-CD4 exprimierten, gefunden.
Dies bedeutet, dass die Kunitz Domäne II ihre Funktion behält, wenn sowohl TFPI_1–183-CD4 oder auch TFPI_1–276-CD4 an der Zelloberfläche gebunden ist.
10. Der TF_1–219/FVIIa-Komplex bindet unabhängig von der Anwesenheit der dritten Kunitz Domäne
Die Bindung des Gewebefaktors und des Faktors VIIa kann benutzt werden, um zu bestimmen, ob die Kunitz Domäne I ebenso ihre Funktion behält.
Rekombinantes humanes TF_1–219 und FVIIa wurden jeweils in E. coli und CHO-K1 produziert (O'Brian, 1994). Diese wurden in äquimolaren Konzentrationen gemischt und bei 25°C für 15 Minuten inkubiert, um einen TF_1–219/FVIIa-Komplex zu erhalten.
Polyklonale Kaninchen-Immunglobuline gegen humanes TF wurden gemäß den Standardverfahren produziert.
DAP.3 Zellen, die entweder TFPI_1–276-CD4 oder TFPI_1–183-CD4 exprimierten, wurden mit 5 nM für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden zweimal gewaschen und der TF_1–219/FVIIa-Komplex wurde zu 2,5 × 10⁵ Zellen in 100 μl gegeben. Nach einer Stunde bei 37°C wurden die Transfektanten zweimal gewaschen und mit 50 μl polyklonalen Kaninchen-Anti-TF-Immunglobulinen (2,5 μg/ml) für 30 Minuten auf Eis inkubiert, gefolgt von zweimaligem Waschen und einer weiteren Inkubation mit FITCkonjugierten Schweine-Anti-Kaninchen Immunglobulinen. Positive Zellen wurden mit Durchflusszytometrie analysiert.
TF_1–219/FVIIa band gleichermaßen wirksam an sowohl TFPI_1–276-CD4 (14A) als auch an TFPI_1–183-CD4 (Figur für 14B), während überhaupt keine Bindung an die Kontroll-Zelllinie 531 gemessen wurde.
Um eine spezifische Bindungen an die Kunitz Domäne I durch den TFPI_1–219/FVIIa-Komplex nachzuweisen, wurde FVIIa durch Präinkubation mit 1,5-Dansyl-Glu-Gly-Arg-Chloromethyl-Keton,Dihydrochlorid („1,5-DNS-GGACK·HCL") inaktiviert. Dieses bindet an die aktive Bindungsstelle von FVIIa und hemmt die Bindung an TFPI, während die Bildung des TF_1–219/FVIIa-Komplexes nicht beeinflusst wird (Bajaj, 1992).
FVIIa wurde zuerst mit 100-fachem molaren Überschuss an 1,5-DNS-GGACK·HCL für 18 Stunden bei 20°C inkubiert und durch Ionenaustausch-Chromatographie wieder aufgereinigt. Das an der aktiven Bindungsstelle gehemmte FVIIa (FVIIai) wurde mit einer äquimolaren Konzentration von TF_1–219 bei 25°C für 15 Minuten inkubiert und dann zu 2,5 × 10⁵ Zellen in 100 μl hinzugegeben. Die darauf folgenden Schritte wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
Wie aus der 14 ersichtlich, war signifikant weniger TF_1–219/FVIIai-Komplex an TFPI-CD-4-exprimierende Zellen gebunden als im Vergleich „aktives" TF_1–219/FVIIa. Es konnte kein Unterschied zwischen DAP.3 beobachtet werden, das mit TFPI_1–276-CD-4 oder mit TFPI_1–183-CD-4 b transfiziert war.
Folglich behält die Kunitz Domäne I ihre Funktion auch, wenn sie an der Zelloberfläche an TFPI_1–183-CD-4 und TFPI_1–276-CD-4 gebunden ist. Es ist deshalb offensichtlich, dass an der Zelloberfläche gebundenes TFPI funktionell aktiv als Ganzes ist.
11. Auf IPEC exprimiertes TFPI-CD-4 bindet relevante humane Gerinnungsfaktoren und TF vom Schwein
Wie in der 18 gezeigt, kann das TFPI-CD-4 Fusionsprotein auf IPEC exprimiert werden und behält die Fähigkeit, an FXa und FVIIa zu binden. Um zu zeigen, dass TFPI körperlich mit TF vom Schwein in Wechselwirkung treten kann, wurde eine Methode zur kompetitiven Hemmung unter Verwendung von löslichem humanen TF durchgeführt. Wie 19A zeigt, war in Gegenwart von Sättigungskonzentrationen von FXa und FVIIa die Bindung von löslichem humanen TF an TFPI-transfiziertes IPEC (vorbehandelt mit IL-1 α) signifikant vermindert, verglichen mit der Bindung durch TF-negative Kontroll-Transfektanten (nicht-IL-1α-aktiviert). Dieses deutet darauf hin, dass TF vom Schwein mit löslichem humanen TF um VIIa konkurriert und deshalb auch um die TFPI-Bindung. 19B unterstützt dies und zeigt, dass die Bindung von löslichem humanen TF an TFPI-CD-4-transfiziertes IPEC (IL-1α voraktiviert) erhöht wurde, wenn die Transfektanten mit steigenden Konzentrationen von Antikörpern gegen TF vom Schwein inkubiert wurden. Der Effekt dieses Antikörpers könnte die Hemmung der Wechselwirkung zwischen TF vom Schwein und FVIIa oder zwischen den TF-VIIa-Komplexen vom Schwein und TFPI-CD-4 widerspiegeln. Auf jeden Fall deutet das Resultat darauf hin, dass das auf der Oberfläche von IPEC exprimierte TFPI-CD-4-Fusionsprotein körperlich mit dem TF-FVIIa vom Schwein interagiert.
12. Auf IPEC exprimiertes TFPI-CD4 hemmt die TF-abhängige Fibrinbildung
20A zeigt das Ergebnis eines einzelnen repräsentativen Experimentes, um den prokoagulanten Phänotyp von TFPI-CD4-transfizierten IPEC darzustellen. Die Anwesenheit eines Fusionsproteins auf transfizierten Zellen verlängerte konsistenterweise die Gerinnungszeiten verglichen mit Kontroll-IPEC. Dieser Effekt wurde jedoch nur nach IL-1α Aktivierung beobachtet – die TFPI-CD4 Exprimierung hatte keinen Einfluss auf die Gerinnungszeiten, wenn TF-negative IPEC verwendet wurden. Daher inhibierte das TFPI-CD4 wie erwartet die TF-abhängige, aber nicht die TF-unabhängige Fibrinbildung. Ein Anti-TFPI-Antikörper, der in steigenden Konzentrationen während eines Präinkubationsschrittes verwendet wurde, war in der Lage, die Gerinnungszeiten auf die Werte zu normalisieren, die man mit nichttransfizierten IL-1α-aktivierten Kontroll-IPEC sieht (20B), was zeigt, dass die Verlängerung der Gerinnungszeiten in Anwesenheit von transfizierten Zellen vollständig auf die inhibierende Wirkung von TFPI zurückzuführen ist.
13. Expression eines Protein C Aktivators an der Zellmembran
Um heterologe Konstrukte, die den aus dem Schlangengift von Agkistrodon contortrix contortrix (McMullen, 1989; Kisiel, 1987) isolierten Protein C Aktivator aufweisen, zu exprimieren, wurde eine dieses Protein kodierende cDNA synthetisiert. Die Proteinsequenz ist <SEQ ID 16>:
In Übereinstimmung mit der Verwendung von Codewörtern des Schweins (welche für die meisten Säugetierzellen, wenn nicht für alle, anwendbar sind), wurde die folgende einsträngige DNA synthetisiert <SEQ ID 17>:
Die einsträngige DNA wurde mit komplementären Oligonukleotiden gepaart, um ein doppelsträngiges zu erhalten. Die Restriktionsstellen wurden an beiden Enden der doppelsträngigen DNA aber eingefügt, mit der ein CD4-Anker und eine P-Selektin-Signalsequenz in gleicher Weise wie oben beschrieben, ligiert wurde. Das resultierende Molekül wurde, wie oben beschrieben, in den pHβActpr-1 gpt Vektor ligiert.
Als alternative DNA Quelle könnte eine Schlangen-cDNA-Datenbank auf Basis der bekannten Proteinsequenz durchsucht werden.
14. Die gemeinsame Exprimierung von TFPI-CD4 und Hirudin-CD4 verursacht die Hemmung von TF-abhängiger und TF-unabhängiger Gerinnung
Es wurden stabile Transfektanten, die sowohl TFPI-CD4 als auch Hirudin-CD4 exprimierten, erzeugt. Wie 21A zeigt, exprimierten die primären Transfektanten unterschiedliche Mengen an Hirudin und geringer Mengen an TFPI. Trotz dieser bescheidenen Expression durch die Mehrheit der Transfektanten, wurde der prokoagulante Phänotyp dieser Zellen verglichen mit den Kontrollen signifikant reduziert (21B). Die Zell oberflächen-Anwesenheit beider antikoagulanter Moleküle auf IL-1α-aktivierten IPEC verlängerte die Plasma-Gerinnungszeit merklich auf ungefähr 300 Sekunden, was der Zeit nahe kommt, bei der rekalzifiziertes humanes Plasma spontan gerinnt. Blockierungsstudien mit Anti-Hirudin und Anti-TFPI-Antikörpern bestätigten, dass der veränderte Phänotyp dieser Doppel-Transfektanten auf der spezifischen Hemmung der Koagulation durch das exprimierten Hirudin und TFPI beruhte.
LITERATURANGABEN

Bach FH, Winkler H, Ferran C, Hancock WW, Robson SC. Delayed xenograft rejection.lmmunology Today 1996; 17(8); 379–384.
Bajaj SP, Sabharwal AK, Gorka J, Birktoft JJ. Antibody-probed conformational transitions in the protease domain of human factor IX upon calcium binding and zymogen activation: putative high-affinity Ca2'-binding site in the protease domain. PNAS USA 1992; 89: 152–1 56.
Bradley A, Liu P. Target practice in transgenics. Nature Genet. 1996; 14: 12 1–1 23.
Clarke AR. The adenovirus and the egg: a new approach to transgenesis. Nature Biotech. 1996; 14: 942.
Dang QD, Guinto ER, Di Cera E. Rational engineering of activity and specificity in a serine protease. Nature Biotech. 1997; 15: 146–149.
Diamond LE, McCurry KR, Oldham ER, Tone M, Waldmann H, Platt JL, Logan JS. Human CD59 expressed in transgenic mouse hearts inhibits the activation of complement. Transplant Immunol. 1995; 3: 305–3 12.
Disdier M, Morrissey JH, Fugate RD, Bainton DF, McEver RP. Cytoplasmic domain of P-selectin (CD62) contains the signal for sorting into the regulated secretory pathway. Molec. Biol. Cell. 1992; 3: 309–321.
Dodt J, Kohler S, Baici A. Interaction of site specific hirudin variants with alphathrombin. FEBS Lett. 1988; 229: 87–90
Green SA, Setiadi H, McEver RP, Kelly RB. The cytoplasmic domain of P-selectin contains a sorting determinant that mediates rapid degradation in lysosomes. J. Cell. Biol. 1994; 124: 435–448.
Gunning P, Leavitt J, Muscat G, Ng SY, Kedes L. A human beta-actin expression vector system directs high-level accumulation of antisense transcripts. PNAS USA. 1987; 84: 483 1–5
Hamamoto T, Yamamoto M, Nordfang 0, Petersen JGL, Foster DC, Kisiel W. Inhibitory properties of full-length and truncated recombinant TFPI variants expressed in Succharomyces cereviuiae. J. Biol. Chem. 1993; 268: 13344–13351.
Heckl-Östreicher B, Binder R, Kirschfink M. Functional activity of the membraneassociated complement inhibitor CD59 in a pig-to-human in vtiro model for hyperacture Xenograft rejection. Clin. Exp. Immunol. 1995;102: 589–595.
Holmes N, Ennis P, Wan AM, Denney DW, Parham P. Multiple genetic mechanisms have contributed to the generation of the HLA-A2/A28 family of class I MHC molecules. J Immunol. 1987; 139: 936–41
Johnston GI, Cook RG, McEver W. Cloning of GMP-140, a granule membrane protein of platelets and endothelium: sequence similarity to proteins involved in cell adhesion and inflammation. Cell. 1989; 56: 1033–44
Kiely J-M, Cybulsky MI, Luscinskas FW, Gimborne MA. Immunoselective targeting of an anti-thrombin agent to the surface of cytokine-activated vascular endothelial cells. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 1995; 15: 1211–1218.
Kisiel E, Kondo S, Smith KJ, McMullen BA, Smith LF. Characterization of a protein C activator from Agkistrodon contortrix contortrix venom. J. Biol. Chem. 1987;262: 12607–13.
Knapp A, Degenhardt T, Dodt J. Hirudisins. J. Biol. Chem. 1992; 34: 24230–24234.
Langford GA, Cozi E, Yannoutsos N, Lancaster R, Elsome K, Chen P, White DGJ. Production of pigs transgenic for human regulators of complement activation using YAC technology. Transplant Proc. 1996; 28: 862–863.
Lechler RI, Bal V, Rothbard JB, Germain FW, Sekaly R, Long EO, Lamb J. Structural and functional studies of HLA-DR restricted antigen recognition by human helper T lymphocyte clones by using transfected murine cell lines. J Immunol. 1988; 141: 3003–3009.
McCurry KR, Diamond LE, Kooyman DL, Byrne GW, Martin MJ, Logan JS, Platt JL. Human complement regulatory proteins expressed in transgenic swine protect swine xenografts from humoral injury. Transplant Proc. 1996; 28: 758.
McMuilen BA, Fujikawa K, Kisiel W. Primary structure of a protein C activator from Agkistrodon contortrix contortrix venom. Biochemistry 1989; 28: 674–679.
Maddon PJ, Littman DR, Godfrey M, Maddon DE, Chess L, Axel R. The isolation and nucleotide sequence of a cDNA encoding the T cell surface protein T4: a new member of the immunoglobulin gene family. Cell. 1985; 42: 93–104
Mao SS, Huang J, Welebob C, Neeper MP, Garsky VM, Shafer JA. Identification and characterization of variants of tick anticoagulant peptide with increased inhibitory potency toward human factor Xa. Biochemistry 1995; 34: 5098–5 103.
Merkenschlager M, Altmann DM, Ikeda H. T cell alloresponses against HLA-DQ and -DR products involve multiple epitopes on the CD4 molecule. Distinct mechanisms contribute to the inhibition of HLA class II-dependent and -independent T cell responses by antibodies to CD4. J.Immuno1.1990;145: 3181–7.
O'Brien DP, Kemball-Cook G, Hutchinson AM, Martin DM, Johnson DJ, Byfield PG, Takamiya O, Tuddenham EG, McVey JH. Surface plasmon resonance studies of the interaction between factor VII and tissue factor. Biochemistry 1994; 33: 141 62–9.
Reinherz EL, Kung PC, Goldstein G, Schlossman SF. Separation of functional subsets of human T cells by a monoclonal antibody. PNAS USA.1979; 76: 4061–4065 10
Schlaeppi JM. Preparation of monoclonal antibodies to the thrombin/hirudin complex. Thromb Res. 1991; 62: 459–470
Skern T, Bischoff R, Jallat S, Dott K, Ali-Hadji D, Clesse D, Kieny MP, Courtney M. Sulphation of hirudin in BHK cells. FEBS. 1990; 1: 36–38.
Squinto SP. Xenogeneic organ transplantation. Curr. Opin. Biotech. 1996; 7: 641–645.
Wagner DD. The Weibel-Palade body: the storage granule for von Willebrand factor and P-selectin. Thrombosis & Haemostasis. 1993; 70: 105–1 10.
Wheeler MB. Development and validation of swine embryonic stem cells: a review. Reprod. Fertil. Dec. 1994; 6: 563–568.
White D, Cozzi E, Langford G, Ogiesby T, Wang M, Wright L, Wallwork J. The control of hyperacute rejection by genetic engineering of the donor species. Eye 1995; 9: 185–189.
Wun TC, Kretzrner KK, Girard TJ, Miletich JP, Broze GJ. Cloning and characterization of a cDNA coding for the lipoprotein-associated coagulation inhibitor shows that it consists of three tandem Kunitz-type inhibitory domains. J. Biol. Chem. 1988; 263 : 6001–4
Yannoutsos N, Langford GA, Cozzi E, Lancaster R, Elsome K, Chen P, White DJG. Production of pigs transgenic for human regulators of complement activation. Transplant Proc. 1995; 27: 324–325.

SEQUENCE LISTING

Claims

Protein, umfassend einen Bereich mit einer antikoagulierenden Wirkung, einen Bereich, der das Protein an einer Zellmembran verankern kann und eine Zielsequenz, welches entstehendes Polypeptid in einen sekretorischen Granulus zielsteuern kann, wodurch das Protein am konstitutiven Exprimiertwerden an der Zelloberfläche gehindert wird.
Protein nach Anspruch 1, worin der antikoagulierende Bereich die Sequenz eines Hirudins, einen Gewebefaktorstoffwechselinhibitor, ein Tick-Antikoagulant-Peptid oder einen Protein-C-Aktivator umfasst.
Protein nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin der Ankerbereich eine Sequenz ist, die in der Lage ist, das Protein an eine Lipiddoppelschicht anzuheften.
Protein nach Anspruch 3, worin der Ankerbereich die Transmembransequenz für ein Membranprotein umfasst.
Protein nach Anspruch 4, worin die Transmembransequenz aus einem HLA-Klasse I- oder CD4-Protein besteht.
Protein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das sekretorische Granulus nicht mit der Plasmamembran der Zelle fusioniert, bis die Zelle geeignet stimuliert ist.
Protein nach Anspruch 6, worin das sekretorische Granulus ein Weibel-Palade-Körper ist.
Protein nach Anspruch 7, worin die Zielsteuersequenz der zytoplasmatische Bereich von P-Selektin ist.
Protein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Verankerungssequenz jene von P-Selektin ist.
Polynukleotid, das ein Protein nach einem der vorhergehenden Ansprüche kodiert.
Vektor, umfassend ein Polynukleotid nach Anspruch 10.
Abgabesystem das ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 9 umfasst, ein Polynukleotid nach Anspruch 10 oder einen Vektor nach Anspruch 11.
Verfahren zum Transfizieren einer Zelle mit einem Vektor nach Anspruch 11, vorausgesetzt, dass die Zelle keine menschliche Zelle ist.
Transfizierte Zelle nach Anspruch 13.
Biologisches Gewebe, das eine Zelle nach Anspruch 14, umfasst, vorausgesetzt, dass das Gewebe nicht ein humanes Gewebe ist.
Biologisches Gewebe nach Anspruch 15, worin das Gewebe gewählt ist aus: Fibroblasten, einer Cornea, Nervengewebe, Herz, Leber oder Niere.
Tier, umfassend (a) biologisches Gewebe nach Anspruch 15 oder Anspruch 16 und/oder (b) eine Zelle nach Anspruch 14, vorausgesetzt, dass das Tier kein transgenes menschliches Wesen ist.
Tier nach Anspruch 17, worin das Tier ein transgenes Schwein oder Schaf ist.
Verfahren, um ein Gewebe oder Organ zur Transplantation geeignet zu machen umfassend das Exprimieren eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 9 in Endothelialzellen in dem Gewebe oder Organ, vorausgesetzt, dass das Gewebe oder Organ nicht ein menschliches Gewebe oder Organ ist.
Biologisches Gewebe nach Anspruch 15 oder Anspruch 16 zur Verwendung bei Transplantation.