DE69830065T2

DE69830065T2 - Methoden zur kompletten chemischen synthese und zusammensetzung von genen und genomen

Info

Publication number: DE69830065T2
Application number: DE69830065T
Authority: DE
Inventors: A. Glen EVANS
Original assignee: Egea Biosciences LLC
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 1997-09-16
Filing date: 1998-09-16
Publication date: 2006-01-19
Anticipated expiration: 2018-09-17
Also published as: US20030165946A1; DK1538206T3; EP1538206A3; PT1015576E; AU9393398A; WO1999014318A1; ATE462004T1; US6521427B1; EP1538206B1; ES2243007T3; ATE294860T1; EP1538206A2; DE69830065D1; EP1015576B1; ES2340857T3; PT1538206E; DE69841578D1; DK1015576T3; EP1015576A1; CY1110163T1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen die Gebiete der Oligonukleotid-Synthese. Insbesondere betrifft sie das Zusammensetzen von Genen und Genomen von vollständig synthetischen künstlichen Organismen.
2. Beschreibung des verwandten Stands der Technik
Derzeitige Forschung und kommerzielle Anwendungen der Molekularbiologie basieren auf rekombinanter DNA, die in den 1970ern entwickelt wurde. Ein kritischer Aspekt der rekombinanten DNA ist die molekulare Klonierung in Plasmide, die in dem bahnbrechenden Patent von Cohen und Boyer (US-Patent 4,740,470 "Biologically functional molecular chimeras") behandelt wird. Dieses Patent lehrt ein auf Restriktionsendonukleasen basierendes Verfahren zum "Schneiden und Spleißen" von DNA-Molekülen, das Einbringen dieser "rekombinanten" Moleküle in Wirtszellen und ihre Vermehrung in den bakteriellen Wirten. Diese Technik ist die Basis aller molekularen Klonierungen für Forschungszwecke und kommerzielle Zwecke, die in den letzten 20 Jahren durchgeführt wurden, und die Basis für das Gebiet der molekularen Biologie und Genetik.
Rekombinante DNA-Technologie ist eine leistungsstarke Technologie, beschränkt sich jedoch hinsichtlich ihrer Nützlichkeit auf Veränderungen existierender DNA-Sequenzen, die durch 1) Restriktionsenzymschnittstellen, 2) PAC-Primer zur Amplifikation, 3) Orts-spezifische Mutagenese und andere Techniken modifiziert werden. Die Herstellung eines vollständig neuen Moleküls, oder die wesentliche Veränderung existierender Molekü le kostet extrem viel Zeit, ist teuer, bedarf mehrerer komplizierter Schritte und ist in manchen Fällen unmöglich. Die rekombinante DNA-Technologie erlaubt nicht die Herstellung vollständiger künstlicher Moleküle, Gene, Genome oder Organismen, sondern nur Veränderungen von natürlich vorkommenden Organismen.
Die derzeitige Biotechnologie im Hinblick auf die Verwendung rekombinanter DNA im Bereich der industriellen Produktion, des Wirkstoffdesigns und der Wirkstoffentwicklung, bei möglichen Anwendungen im Rahmen der Impfstoffentwicklung und Gentherapie sowie ihre landwirtschaftliche und umweltbezogene Verwendung hängt von natürlich vorkommenden Organismen und DNA-Molekülen ab. Neue oder neuartige Funktionen herzustellen oder zu konstruieren, oder Organismen für eine spezialisierte Verwendung (wie die Produktion eines menschlichen Hormons) zu verändern, bedarf im wesentlichen komplexer, zeitraubender und schwieriger Manipulationen natürlich vorkommender DNA-Moleküle. In einigen Fällen sind die Veränderungen der natürlich vorkommenden DNA so komplex, dass sie in der Praxis nicht möglich sind. Daher gibt es einen Bedarf für Technologie, die die Herstellung neuartiger DNA-Moleküle in einem einzigen Schritt erlaubt, ohne die Verwendung irgendeiner existierenden rekombinanten oder natürlich vorkommenden DNA zu benötigen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung behandelt die Grenzen von Manipulationen gegenwärtig rekombinanter Nukleinsäuren, indem sie ein schnelles, effizientes Mittel zur Herstellung praktisch jeglicher Nukleinsäuresequenz, einschließlich vollständiger Gene, Chromosomensegmente, Chromosomen und Genome bereitstellt. Da dieser Ansatz auf einem vollständig synthetischen Ansatz beruht, gibt es keine Grenzen, wie beispielsweise die Verfügbar keit existierender Nukleinsäuren, die die Konstruktion selbst sehr großer Nukleinsäuresegmente behindern könnten.
Daher wird in einer ersten Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung eines replikationskompetenten, doppelsträngigen DNA-Segments bereitgestellt, Schritte umfassend, bei denen man (i) zwei Gruppen einzelsträngiger Oligonukleotide bereitstellt, wobei (a) die erste Gruppe den vollständigen Plus-Strang des DNA-Segments umfasst, (b) die zweite Gruppe den vollständigen Minus-Strang des DNA-Segments umfasst, und (c) jedes aus der ersten Gruppe von Oligonukleotiden zu zwei Oligonukleotiden der zweiten Gruppe von Oligonukleotid komplementär ist, (ii) die erste und die zweite Gruppe von Oligonukleotiden zusammenlagert, und (iii) die zusammengelagerten Oligonukleotide mit einem ligierenden Enzym behandelt. Optionale Schritte sorgen für die Synthese der Oligonukleotidgruppen und die Transformation von Wirtszellen mit dem erhaltenen DNA-Segment.
In besonderen Ausführungsformen weist das DNA-Segment eine Länge von 100, 200, 300, 40, 800, 100, 1500, 200, 4000, 8000, 10.000, 12.000, 18.000, 20.000, 40.000, 80.000, 100.000, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹ oder mehr Basenpaaren auf. Tatsächlich wird vorgeschlagen, dass die Verfahren der vorliegenden Erfindung dazu in der Lage sein werden, vollständige künstliche Genome mit Längen vergleichbar zu bekannten Bakterien-, Hefe-, Virus-, Säugetier-, Amphibien-, Reptilien-, Vogel-Genomen herzustellen. In besonderen Ausführungsformen ist das DNA-Segment ein Gen, das für ein Protein von Interesse kodiert. Das DNA-Segment kann ferner nicht-kodierende Elemente enthalten, z.B. Replikationsursprünge, Telomere, Promotoren, Enhancer, Transkriptions- und Translations- Startsignale und Stoppsignale, Introns, Exon-Spleißstellen, Chromatin-Gerüstkomponenten und andere regulatorische Sequenzen. Das DNA-Segment kann mehrere Gene, Chromosomensegmente, Chromosomen oder sogar vollständige Genome umfassen. Die DNA-Segmente können von prokaryotischen oder eukaryotischen Sequenzen abgeleitet sein, einschließlich Sequenzen aus Bakterien, Hefen, Viren, Säugetieren, Amphibien, Reptilien, Vögeln, Pflanzen, Archebakterien oder aus anderen DNA-enthaltenden lebenden Organismen.
Die Oligonukleotidgruppen umfassen vorzugsweise Oligonukleotide von zwischen etwa 15 und 100 Basen, mehr bevorzugt zwischen etwa 20 und 50 Basen. Spezifische Längen umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 und 100. Abhängig von der Größe kann die Überlappung zwischen den Oligonukleotiden der zwei Gruppen so entworfen sein, dass sie zwischen 5 und 75 Basen pro Oligonukleotidepaar beträgt.
Die Oligonukleotide werden bevorzugt mit Polynukleotidkinase, z.B. T4-Polynukleotidkinase behandelt. Die Kinasebehandlung kann vor dem Mischen der Oligonukleotidgruppen oder danach erfolgen, aber vor dem Zusammenlagern. Nach dem Zusammenlagern werden die Oligonukleotide mit einem Enzym behandelt, das eine ligierende Funktion aufweist. Zum Beispiel wird üblicherweise eine DNA-Ligase für diesen Zweck verwendet werden. Topoisomerase jedoch, die keiner 5'-Phosphorylierung bedarf, ist schnell und funktioniert bei Raumtemperatur und kann anstelle von Ligase verwendet werden.
In einer zweiten Ausführungsform wird ein Verfahren zur Herstellung eines replikationskompetenten, doppelsträngigen DNA-Segments bereitgestellt, Schritte umfassend, bei denen man (i) zwei Gruppen einzelsträngiger Oligonukleotide bereitstellt, wobei (a) die erste Gruppe den vollständigen Plus-Strang des DNA-Segments umfasst, (b) die zweite Gruppe den vollständigen Minus-Strang des DNA-Segments umfasst, und (c) jedes aus der ersten Gruppe von Oligonukleotiden komplementär zu zwei Oligonukleotiden der zweiten Gruppe von Oligonukleotiden ist, (ii) Paare komplementärer Oligonukleotide zusammenlagert, um eine Gruppe von ersten zusammengelagerten Produkten herzustellen, wobei jedes Paar ein Oligonukleotid von jeder der ersten und der zweiten Gruppe von Oligonukleotiden umfasst, (iii) Paare des ersten zusammengelagerten Produkts mit komplementären Sequenzen zusammenlagert, um eine Gruppe von zweiten zusammengelagerten Produkten herzustellen, (iv) den Vorgang wiederholt, bis alle zusammengelagerten Produkte zu einem einzigen DNA-Segment zusammengelagert wurden und (v) die zusammengelagerten Produkte mit einem ligierenden Enzym behandelt.
In einer dritten Ausführungsform wird ein Verfahren für die Herstellung eines replikationskompetenten, doppelsträngigen DNA-Segments bereitgestellt, Schritte umfassend, bei denen man (i) zwei Gruppen einzelsträngiger Oligonukleotide bereitstellt, wobei (a) die erste Gruppe den vollständigen Plus-Strang des DNA-Segments umfasst, (b) die zweite Gruppe den vollständigen Minus-Strang des DNA-Segments umfasst, und (c) jedes aus der ersten Gruppe von Oligonukleotiden komplementär zu zwei Oligonukleotiden der zweiten Gruppe von Oligonukleotiden ist, (ii) das 5'-terminale Oligonukleotid der ersten Gruppe von Oligonukleotiden mit dem 3'-terminalen Oligonukleotid der zweiten Gruppe von Oligonukleotiden zusammenlagert, (iii) das nächste, am weitesten 5'-terminal gelegene Oligonukleotid der ersten Gruppe von Oligonukleotiden mit dem Produkt von Schritt (ii) zusammenlagert, (iv) das nächste, am weitesten 3'-terminal gelegene Oligonukleotid der zweiten Gruppe von Oligonukleotiden mit dem Produkt von Schritt (iii) zusammenlagert, (v) den Vorgang wiederholt, bis alle Oligonukleotide der ersten und der zweiten Gruppe zusammengelagert worden sind, und (vi) die zusammengelagerten Oligonukleotide mit einem li gierenden Enzym behandelt. Optionale Schritte sorgen für die Synthese der Oligonukleotidgruppen und die Transformation von Wirtszellen mit dem erhaltenen DNA-Segment. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das 5'-terminale Oligonukleotid der ersten Gruppe mit einem Träger verbunden, wobei das Verfahren den zusätzlichen Schritt des Entfernens des DNA-Segments von dem Träger enthalten kann. Der Träger kann jeder im Stand der Technik bekannte Träger sein, z.B. eine Mikrotiterplatte, ein Filter, Polystyrenkügelchen, eine Polystyrenschale, magnetische Kügelchen, Agarose oder Ähnliches.
Die Bedingungen der Zusammenlagerung können auf Grundlage der besonderen Strategie für das Zusammenlagern, der Größe und Zusammensetzung der Oligonukleotide und dem Ausmaß der Überlappung zwischen den Oligonukleotiden der ersten und zweiten Gruppe angepasst werden. Wenn alle Oligonukleotide vor dem Zusammenlagern zusammengemischt werden, wird beispielsweise die Mischung auf 80 °C erhitzt, gefolgt durch langsames Zusammenlagern für zwischen 1 bis 12 Stunden. Das Zusammenlagern kann damit für etwa 2, etwa 3, etwa 4, etwa 5, etwa 6, etwa 7, etwa 8, etwa 9 oder etwa 10 Stunden durchgeführt werden. In anderen Ausführungsformen kann die Zusammenlagerungszeit jedoch bis zu 24 Stunden lang sein.
Mit der Hilfe eines Computers ist der Erfinder in der Lage, die Synthese einer Vektor/Genkombination als Gruppe von überlappenden Oligonukleotidkomponenten unter Verwendung eines Oligonukleotid-Synthesizers mit hohem Durchsatz zu steuern. Die Oligonukleotide werden mit einer Roboter-gestützten kombinatorischen Zusammensetzungsstrategie zusammengesetzt, und die Anordnung wird unter Verwendung von DNA-Ligase oder Topoisomerase ligiert, gefolgt von einer Transformation in einen geeigneten Wirtsstamm. In einer besonderen Ausführungsform stellt diese Erfindung eine Gruppe bakterieller Stämme her, die einen geeigneten Expressionsvektor für alle Gene in einem definier ten Bereich des Genoms enthalten. In anderen Ausführungsformen wird darüber hinaus ein Hefe- oder Baculovirus-Expressionsvektorsystem in Betracht gezogen, um die Expression jedes Gens in einem chromosomalen Bereich in einem eukaryotischen Wirt zu erlauben. In einer noch anderen Ausführungsform erlaubt die vorliegende Erfindung dem Fachmann, eine "Designer-Gen"-Strategie zu entwerfen, bei der ein Gen oder Genom oder nahezu jede beliebige Struktur problemlos entworfen, synthetisiert und exprimiert werden kann. Somit kann die vorliegend beschriebene Technologie schließlich verwendet werden, um vollständige Genome für das Einbringen in Wirtszellen für die Herstellung von vollständig künstlichen lebenden Designer-Organismen herzustellen.
In besonderen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Synthese eines replikationskompetenten doppelsträngigen Polynukleotids bereit, wobei das Polynukleotid einen Replikationsursprung, einen ersten kodierenden Bereich und ein erstes regulatorisches Element umfasst, das die Expression des ersten kodierenden Bereichs steuert.
Zusätzlich kann das Verfahren weiterhin einen Schritt umfassen, bei dem das doppelsträngige Polynukleotid amplifiziert wird. In bestimmten Ausführungsformen umfasst das doppelsträngige Polynukleotid eine Länge von 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 5000, 10 × 10³, 20 × 10³, 30 × 10³, 40 × 10³, 50 × 10³, 60 × 10³, 70 × 10³, 80 × 10³, 90 × 10³, 1 × 10⁴, 1 × 10⁵, 1 × 10⁶, 1 × 10⁷, 1 × 10⁸ Basenpaare. Das erste regulatorische Element kann ein Promotor sein. In bestimmten Ausführungsformen umfasst das doppelsträngige Polynukleotid ferner ein zweites regulatorisches Element, wobei das zweite regulatorische Element ein Polyadenylierungssignal ist. In noch weiteren Ausführungsformen umfasst das doppelsträngige Polynukleotid eine Vielzahl kodierender Bereiche und eine Vielzahl regulatorischer Elemente. Es wird in Erwägung gezo gen, dass die kodierenden Bereiche für Produkte kodieren, die einen biochemischen Reaktionsweg umfassen. In besonderen Ausführungsformen ist der biochemische Reaktionsweg die Glykolyse. Insbesondere wird in Erwägung gezogen, dass die kodierenden Bereiche für Enzyme kodieren, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Enzymen des glykolytischen Reaktionswegs: Hexokinase, Phosphohexose-Isomerase, Phosphofructokinase-1, Aldolase, Triosephosphat-Isomerase, Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase, Phosphoglycerat-Kinase, Phosphoglycerat-Mutase, Enolase und Pyruvatkinase.
In anderen Ausführungsformen ist der biochemische Reaktionsweg die Lipidsynthese, die Cofaktor-Synthese. Insbesondere wird die Synthese von Liponsäure, die Riboflavinsynthese und die Nukleotidsynthese in Betracht gezogen. Das Nukleotid kann ein Purin oder Pyrimidin sein.
In bestimmten anderen Ausführungsformen wird in Erwägung gezogen, dass die kodierenden Bereiche für Enzyme kodieren, die an einem zellulären Prozess beteiligt sind, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Zellteilung, Chaperon, Detoxifikation, Peptid-Sekretion, Energiemetabolismus, regulatorische Funktion, DNA-Replikation, Transkription, RNA-Prozessierung und tRNA-Modifikation. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Energiemetabolismus oxidative Phosphorylierung.
Es wird in Betracht gezogen, dass das doppelsträngige Polynukleotid eine DNA oder eine RNA ist. In bevorzugten Ausführungsformen kann das doppelsträngige Polynukleotid ein Chromosom sein. Das doppelsträngige Polynukleotid kann ein Expressionskonstrukt sein. Insbesondere kann das Expressionskonstrukt ein bakterielles Expressionskonstrukt, ein Säugetier-Expressionskonstrukt oder ein virales Expressionskonstrukt sein. In besonderen Ausführungsformen umfasst das doppelsträngige Polynukleotid ein Genom, das ausgewählt ist aus der Gruppe beste hend aus bakteriellem Genom, Hefe-Genom, viralem Genom, Säugetier-Genom, Amphibien-Genom und Vogel-Genom.
In den Ausführungsformen, in denen das Genom ein virales Genom ist, kann das virale Genom aus der Gruppe bestehend aus Retrovirus, Adenovirus, Vacciniavirus, Herpesvirus und Adenoassoziiertem Virus ausgewählt sein.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines viralen Partikels bereit.
Eine andere Ausführungsform stellt ein Verfahren zur Herstellung eines künstlichen Genoms bereit, wobei das Chromosom alle kodierenden Bereiche und regulatorischen Elemente umfasst, die in einem entsprechenden natürlichen Chromosom gefunden werden. In besonderen Ausführungsformen ist das entsprechende natürliche Chromosom ein menschliches Mitochondrien-Genom. In anderen Ausführungsformen ist das entsprechende natürliche Chromosom ein Chloroplasten-Genom.
Es wird ferner ein Verfahren zur Herstellung eines artifiziellen genetischen Systems bereitgestellt, wobei das System alle kodierenden Bereiche und regulatorischen Elemente umfasst, die in einem entsprechenden natürlichen biochemischen Reaktionsweg gefunden werden. Ein solcher biochemischer Reaktionsweg wird wahrscheinlich eine Gruppe von Enzymen umfassen, die aufeinander folgend eine Verbindung metabolisieren. In besonders bevorzugten Ausführungsformen umfasst der biochemische Reaktionsweg die für die Glykolyse benötigten Aktivitäten. In anderen Ausführungsformen umfasst der biochemische Reaktionsweg die für den Elektronentransport benötigten Enzyme. In noch anderen Ausführungsformen umfasst der biochemische Reaktionsweg die für die Photosynthese benötigten Enzymaktivitäten.
Andere Gegenstände, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung deutlich werden. Es sollte jedoch verstanden werden, dass die ausführliche Beschreibung und die spezifischen Beispiele, obwohl sie bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung darstellen, nur zur Illustration dienen, da dem Fachmann verschiedene Änderungen und Modifizierungen im Rahmen des Erfindungsgedankens und im Rahmen des Umfangs der Erfindung anhand dieser detaillierten Beschreibung deutlich werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die folgenden Zeichnungen stellen einen Teil der vorliegenden Beschreibung dar und werden eingefügt, um bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung weiter darzustellen. Die Erfindung kann durch Bezug auf eine oder mehrere dieser Zeichnungen in Kombination mit der ausführlichen Beschreibung der vorliegend gezeigten besonderen Ausführungsformen besser verstanden werden.
1. Flussdiagramm des Jurassic Park-Paradigmas zur Herstellung synthetischer Organismen und Wiederzusammensetzen lebender Organismen.
2. Flussdiagramm der Strategie der synthetischen Genetik und des Zusammensetzens von Organismen.
3. Flussdiagramm der Achtschritte-Strategie zum kombinatorischen Zusammensetzen von Oligonukleotiden zu vollständigen Genen oder Genomen.
4A–4C. Entwurf des Plasmides Synlux4. Die Sequenz von 4800 ist mit der Lokalisierung von lux A+B-Genen, Neomycin/Kanamycin-Phosphotransferase und pUC19-Sequenzen beschriftet.
5A–5F. Liste der Oligonukleotid-Komponenten, die von der Sequenz von Synlux4 in 4A–4C abgeleitet sind.
6A–6B. Schema für das kombinatorische Zusammensetzen synthetischer Plasmide aus Oligonukleotid-Komponenten.
7A–7G. SynGene-Programm zur Herstellung überlappender Oligonukleotide, die zum Wiederzusammensetzen des Gens oder Plasmids ausreichen.
BESCHREIBUNG BEISPIELHAFTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vollständige Sequenz komplexer Genome, einschließlich des menschlichen Genoms, macht funktionelle Ansätze in der Genetik im großen Maßstab möglich. Die vorliegende Erfindung beschreibt einen neuartigen Ansatz zur Nutzung der Ergebnisse genomischer Sequenzinformationen durch Computer-gesteuerte Gen-Synthese, die auf Computer-Berechnung der menschlichen Genomdatenbank basiert. Insbesondere beschreibt die Erfindung die chemische Synthese und Resynthese von Genen zum Transfer dieser Gene in eine geeignete Wirtszelle.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren bereit, die für die de novo Synthese von DNA-Segmenten verwendet werden können, welche für Gruppen von Genen kodieren; entweder für natürlich vorkommende Gene, die ausgehend von natürlichen oder künstlichen Promotorkonstrukten exprimiert werden, oder für künstliche Gene, die von synthetischen DNA-Sequenzen abgeleitet sind, welche für Elemente von biologischen Systemen kodieren, die eine spezifische Funktion oder Zuordnung eines künstlichen Organismus ausführen, sowie auch für vollständige Genome. Indem sie solche Systeme und Genome herstellt, stellt die vorliegende Erfindung die Synthese eines replikationskompetenten doppelsträngigen Polynukleotids bereit, wobei das Polynukleotid einen Replikationsursprung, einen ersten kodierenden Bereich und ein erstes regulatorisches Element, das die Expression des ersten kodierenden Bereichs steuert, aufweist. Unter replikationskompetent wird verstanden, dass das Polynukleotid in der Lage ist, seine eigene Replikation zu steuern. Damit wird vorgesehen, dass das Polynukleotid alle cis-wirkenden Signale besitzen wird, die notwendig sind, um seine eigene Synthese zu ermöglichen. In dieser Hinsicht wird das Polynukleotid einem Plasmid oder einem Virus ähnlich sein, so dass es, wenn es innerhalb einer Zelle platziert wird, in der Lage ist, durch eine Kombination der Funktionen von Polynukleotid und Zelle repliziert zu werden.
Daher kann der Fachmann unter Verwendung der Techniken der vorliegenden Erfindung ein künstliches Genom erzeugen, das in der Lage ist, für alle Aktivitäten zu kodieren, die für die Aufrechterhaltung seiner eigenen Existenz notwendig sind. Es werden darüber hinaus artifizielle genetische Systeme in Betracht gezogen, die in der Lage sind, für Enzyme und Aktivitäten eines bestimmten biochemischen Reaktionswegs zu kodieren. Bei einem solchen System wird es gewünscht sein, dass alle Aktivitäten vorliegen, so dass der gesamte biochemische Reaktionsweg funktionieren wird. Die Coexpression einer für einen bestimmten Reaktionsweg benötigten Gruppe von Enzymen stellt ein vollständiges genetisches oder biologisches System dar. Zum Beispiel stellt die Coexpression der an der Glykolyse be teiligten Enzyme ein vollständiges genetisches System für die Produktion von Energie in der Form von ATP aus Glukose dar. Solche Systeme zur Energieproduktion können Gruppen von Enzymen umfassen, die natürlich oder künstlich eine Gruppe von Verbindungen aufeinander folgend metabolisieren.
Die Arten der biochemischen Reaktionswege würden solche für die Biosynthese von Cofaktoren, prosthetischen Gruppen und Trägern (Lipoatsynthese, Riboflavinsynthese, Pyridinnukleotidsynthese); die Biosynthese der Zellhüllen (Membranen, Lipoproteine, Porine, Oberflächenpolysaccharide, Lipopolysaccharide, Antigene und Oberflächenstrukturen); zelluläre Prozesse einschließlich Zellteilung, Chaperone, Detoxifikation, Proteinsekretion, zentraler Metabolismus von Zwischenprodukten (Energieproduktion über Phosphor-Verbindungen und andere); Energiemetabolismus einschließlich aerobischer, anaerobischer, ATP-Protonen-motivierter Energieumwandlungen, Elektronentransport, Glykolyse, Triosephosphat-Weg, Pyruvatdehydrogenase, Zuckermetabolismus; Purin-, Pyrimidin-Nukleotidsynthese, einschließlich 2'Desoxyribonukleotidsynthese, Nukleotid- und Nukleosidumwandlungen, Wiedergewinnung von Nukleosid und Nukleotiden, Zucker-Nukleotidbiosynthese und -umwandlung; regulatorische Funktionen einschließlich transkriptioneller und translationaler Kontrollen, DNA-Replikation einschließlich Abbau von DNA, DNA-Replikation, Restriktionsänderung, Rekombination und Reparatur; Transkription einschließlich Abbau von DNA, DNA-abhängige RNA-Polymerase und Transkriptionsfaktoren; RNA-Prozessierung; Translation einschließlich Aminoacyl-tRNA-Synthetasen, Degradation von Peptiden und Glykopeptiden, Proteinmodifikation, Ribsomensynthese und -modifikation, tRNA-Modifikation; Translationsfaktoren, Transport- und Bindungsproteine, einschließlich dem Transport von Aminosäuren, Peptiden, Amincarbohydraten, organischen Alkoholen, organischen Säuren und Kationen; sowie solche für andere Systeme zur Anpassung, eine spezifische Funktion oder das Überleben eines künstlichen Organismus umfassen, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
A. Definitionen
DNA-Segment – ein lineares Stück DNA, das einen doppelsträngigen Bereich und sowohl 5'- als auch 3'-Enden aufweist; das Segment kann eine beliebige Länge aufweisen, die ausreichend lang ist, um durch die Hybridisierung von mindestens zwei Oligonukleotiden mit komplementären Bereichen hergestellt zu werden.
Oligonukleotide – kleine einzelsträngige oder doppelsträngige DNA-Segmente, die aus den Nukleotidbasen A, T, G und C bestehen und durch Phosphatbindungen verbunden sind; Oligonukleotide liegen üblicherweise im Bereich von etwa 10 bis 100 Basenpaaren.
Plus-Strang – gemäß Übereinkunft der Einzelstrang einer doppelsträngigen DNA, der beim Lesen der Sequenz mit dem 5'-Ende zur linken anfängt.
Minus-Strang – gemäß Übereinkunft der Einzelstrang einer doppelsträngigen DNA, der beim Lesen der Sequenz mit dem 3'-Ende zur linken anfängt.
Komplementär – wo zwei Nukleinsäuren mindestens einen Teil in ihren Sequenzen aufweisen, der – sofern in entgegengesetzter (5'→3'; 3'→5') Richtung gelesen – aufeinanderfolgende Nukleotide auf die folgende Weise paart: A-T, G-C, T-A, G-C.
Oligonukleotidgruppen – eine Mehrzahl von Oligonukleotiden die zusammengenommen die Sequenz eines Plus-Strangs oder eines Minus-Strangs eines DNA-Segments umfassen.
Zusammengelagerte Produkte – zwei oder mehr Nukleotide mit komplementären Bereichen, denen es unter geeigneten Bedingungen erlaubt wird, eine Basenpaarung durchzuführen, wobei doppelsträngige Bereiche gebildet werden.
B. Die vorliegende Erfindung
Die vorliegende Erfindung beschreibt Verfahren, die die Herstellung von DNA-Molekülen, Genomen und vollständigen künstlichen lebenden Organismen erlauben, und die ausschließlich auf Informationen basieren, und keine existierenden Gene, DNA-Moleküle oder Genome benötigen.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind in 1 und 2 in Form von Diagrammen dargestellt und umfassen im Allgemeinen die folgenden Schritte. Allgemein ist es unter Verwendung einfacher Computer-Software, die Gruppen von Genteilen und funktionellen Elementen umfasst, möglich, im Computer ein virtuelles Polynukleotid zu konstruieren. Dieses Polynukleotid besteht aus einer Reihenfolge von DNA-Basen, G, A, T oder C, und umfasst z.B. ein vollständiges künstliches Genom in einer linearen Reihenfolge. Zum Transfer des synthetischen Gens, z.B. in Bakterienzellen, sollte das Polynukleotid die Sequenz für einen bakteriellen (wie z.B. pBR322) Replikationsursprung enthalten. Zum Transfer in eukaryotische Zellen sollte es den Replikationsursprung eines Säugetier-Virus, Chromosoms oder einer subzellulären Komponente wie eines Mitochondriums enthalten.
Nach der Konstruktion wird eine einfache Computer-Software verwendet, um die Genomsequenz in eine Gruppe überlappender Oligonukleotide von bestimmter Länge aufzuteilen. Dies ergibt eine Gruppe kürzerer DNA-Sequenzen, die überlappen, und somit das vollständige Genom in überlappenden Gruppen umfassen. Üblicherweise würde ein Gen von 1000 Basenpaaren in 20 100-mere aufgeteilt, wobei 10 davon einen Strang umfassen und 10 davon den anderen Strang umfassen. Diese würden so ausgewählt werden, dass sie auf jedem Strang um 25 bis 50 Basenpaare überlappen.
Dieser Schritt wird gefolgt durch die Einleitung der chemischen Synthese jeder der überlappenden Oligonukleotidgruppen unter Verwendung eines Synthesizers vom Array-Typ und von Phosphoamidit-Chemie, was zu einem Array synthetisierter Oligomere führt. Der nächste Schritt besteht darin, die Konzentration jedes Oligomers abzugleichen und die Oligomere zu vereinen, so dass eine einzige Mischung gleiche Konzentrationen von jedem Oligomer enthält. Die gemischten Oligonukleotide werden mit T4-Polynukleotidkinase behandelt, um die Oligonukleotide am 5'-Ende zu phosphorylieren. Der nächste Schritt besteht darin, einen "langsamen" Zusammenlagerungsschritt durchzuführen, um alle Oligomere gemeinsam zu der Sequenz des vorhergesagten Gens oder Genoms zusammenzulagern. Dies wird durchgeführt, indem die Mischung auf 80 °C erhitzt wird, wobei es ihr anschließend erlaubt wird, langsam über mehrere Stunden auf Raumtemperatur abzukühlen. Die Oligonukleotidmischung wird dann mit T4-DNA-Ligase (oder alternativ dazu mit Topoisomerase) behandelt, um die Oligonukleotide zusammenzufügen. Die Oligonukleotide werden dann in kompetente Wirtszellen transferiert.
Die obige Technik stellt eine "kombinatorische" Strategie des Zusammensetzens dar, bei der alle Oligonukleotide gemeinsam zusammengelagert werden, indem sie auf Basis der Temperatur langsam zusammengelagert werden. Eine Variation dieser Strategie, die für sehr lange Gene oder Genome (z.B. größer als 5000 Basenpaare Gesamtlänge) besser geeignet sein kann, funktioniert wie folgt. Unter Verwendung einfacher Computer- Software, die Gruppen von Genteilen und funktionellen Elementen umfasst, wird ein virtuelles Gen oder Genom im Computer konstruiert. Dieses Gen oder Genom würde aus einer Reihenfolge von DNA-Basen, G, A, T oder C bestehen, und würde das vollständige Genom in einer linearen Reihenfolge umfassen. Zum Transfer des synthetischen Gens in Bakterienzellen sollte es die Sequenz eines bakteriellen (wie z.B. pBR322) Replikationsursprunges enthalten.
Der nächste Schritt besteht darin, unter Verwendung einer neuen Oligonukleotid-Addition in jedem Schritt eine Ligationskettenreaktion durchzuführen. Bei diesem Verfahren wird das erste Oligonukleotid in der Kette an einen festen Träger (wie z.B. ein Agarosekügelchen) gebunden. Das zweite wird zusammen mit DNA-Ligase hinzugefügt, und Zusammenlagerungs- und Ligationsreaktionen werden durchgeführt, und die Kügelchen werden gewaschen. Das zweite überlappende Oligonukleotid des gegenüberliegenden Strangs wird hinzugefügt, zusammengelagert und es wird eine Ligation durchgeführt. Das dritte Oligonukleotid wird hinzugefügt und es wird eine Ligation durchgeführt. Dieser Vorgang wird wiederholt, bis alle Oligonukleotide hinzugefügt und ligiert sind. Dieses Verfahren wird bei langen Sequenzen am besten unter Verwendung einer automatischen Vorrichtung ausgeführt. Die DNA-Sequenz wird von dem festen Träger entfernt, eine letzte (zirkuläre) Ligation wird ausgeführt, und das Molekül wird in Wirtszellen transferiert.
Alternativ dazu wird in Betracht gezogen, dass, soweit die Ligationskinetik es erlaubt, alle Oligonukleotide in einer Mischung platziert werden können, und es der Ligation erlaubt wird, fortzuschreiten. In einer noch anderen Ausführungsform kann eine Reihe kleinerer Polynukleotide hergestellt werden, indem 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 Oligonukleotide zu einer Sequenz ligiert werden, und diese zu einer anderen Sequenz hinzugefügt wird, die eine ähnliche Anzahl von Oligonukleotid-Teilen umfasst.
Die Ligasekettenreaktion ("LCR", ligase chain reaction), die in EPO Nr. 320 308 offenbart ist, wird vorliegend durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen. Bei der LCR werden zwei komplementäre Sondenpaare hergestellt, und in Gegenwart der Zielsequenz wird jedes Paar so an gegenüberliegende komplementäre Stränge des Ziels binden, dass sie aneinandergrenzen. In Gegenwart einer Ligase werden sich die beiden Sondenpaare zusammenfügen, um eine einzige Einheit zu bilden. Durch Temperaturzyklen (wie bei der PCR^TM) dissoziieren gebundene ligierte Einheiten von dem Ziel und dienen dann als "Zielsequenzen" zur Ligation von überschüssigen Sondenpaaren. US-Patent 4,883,750 beschreibt ein LCR-ähnliches Verfahren zur Bindung von Sondenpaaren an eine Zielsequenz. Die folgenden Abschnitte beschreiben diese Verfahren ausführlicher.
C. Nukleinsäuren
Die vorliegende Erfindung offenbart die künstliche Synthese von Genen. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die künstlichen Gene in Zellen transferiert werden, um entweder als diskrete Einheiten oder als Teil künstlicher Chromosomen oder Genome eine bestimmte Funktion zu übertragen. Normalerweise wird man es bevorzugen, Oligonukleotide mit Abschnitten von 15 bis 100 Nukleotiden, 25 bis 200 Nukleotiden oder sofern gewünscht sogar längere zu entwerfen. Solche Fragmente können wie unten beschrieben problemlos durch direkte Synthese des Fragments mit chemischen Mitteln hergestellt werden.
Dementsprechend können die Nukleotidsequenzen der Erfindung wegen ihrer Fähigkeit benutzt werden, selektiv Duplexmoleküle mit komplementären Abschnitten von Genen oder RNAs zu bilden oder Primer für die Amplifikation von DNA oder RNA aus Gewebe bereitzustellen. Abhängig von der geplanten Anwendung, wird man anstreben, unterschiedliche Hybridisierungsbedingungen einzusetzen, um einen unterschiedlichen Grad der Hybridisierungsselektivität zu erreichen. Üblicherweise wird hohe Selektivität bevorzugt.
Für Anwendungen, die eine hohe Selektivität verlangen, wird man üblicherweise anstreben, relativ stringente Bedingungen für die Bildung der Hybride einzusetzen, z.B. wird man relativ geringe Salzbedingungen und/oder hohe Temperaturbedingungen auswählen, wie sie z.B. durch etwa 0,02 M bis etwa 0,10 M NaCl bei Temperaturen von etwa 50 °C bis etwa 70 °C gegeben sind. Unter solchen Bedingungen hoher Stringenz wird eine geringe (sofern überhaupt) Fehlpaarung zwischen dem Oligonukleotid und der Matrize oder dem Zielstrang toleriert. Es ist im Allgemeinen anerkannt, dass die Bedingungen stringenter gemacht werden können, indem man eine zunehmende Menge Formamid zugibt.
Für bestimmte Anwendungen (beispielsweise in Analogie zur Substitution von Nukleotiden durch Orts-spezifische Mutagenese) ist es anerkannt, dass Bedingungen geringerer Stringenz verwendet werden können. Unter diesen Bedingungen kann Hybridisierung auftreten, selbst wenn die Sequenzen der Sonde und des Zielstrangs nicht perfekt komplementär sind, sondern Basenfehlpaarungen in einer oder in mehreren Positionen aufweisen. Die Bedingungen können weniger stringent gemacht werden, indem man die Salzkonzentration erhöht und die Temperatur erniedrigt. Zum Beispiel könnten Bedingungen mittlerer Stringenz bei etwa 0,1 bis 0,25 M NaCl bei Temperaturen von etwa 37 °C bis etwa 55 °C gegeben sein, während Bedingungen geringer Stringenz bei etwa 0,15 M bis etwa 0,9 M Salz bei Temperaturen im Bereich von etwa 20 °C bis etwa 55 °C gegeben sein könnten.
Die Hybridisierungsbedingungen können somit in Abhängigkeit von den gewünschten Ergebnissen problemlos verändert werden.
Bei bestimmten Ausführungsformen wird es vorteilhaft sein, die Hybridisierung von Oligonukleotiden unter Verwendung einer Markierung zu bestimmen. Eine große Vielzahl geeigneter Indikatormittel ist im Stand der Technik bekannt, einschließlich fluoreszenter, radioaktiver, enzymatischer oder anderer Liganden, z.B. Avidin/Biotin, die detektiert werden können. In bevorzugten Ausführungsformen kann es gewünscht sein, eine fluoreszente Markierung oder eine Enzymmarkierung wie z.B. Urease, Alkalische Phosphatase oder Peroxidase anstelle von radioaktiven oder anderen, unter Umweltgesichtspunkten unerwünschten Reagenzien zu verwenden. Im Fall von Enzymmarkierungen sind kolorimetrische Indikatorsubstrate bekannt, die verwendet werden können, um für das menschliche Auge oder spektrophotometrisch sichtbare Detektionsmittel bereitzustellen, um zu identifizieren, ob eine spezifische Hybridisierung mit komplementären Oligonukleotiden stattgefunden hat.
In Ausführungsformen, bei denen eine Festphase beteiligt ist, wird z.B. das erste Oligonukleotid an eine ausgewählte Matrix oder Oberfläche adsorbiert oder auf andere Weise befestigt. Diese fixierte einzelsträngige Nukleinsäure wird dann unter den gewünschten Bedingungen einer Hybridisierung mit den komplementären Oligonukleotiden unterworfen. Die gewählten Bedingungen werden darüber hinaus von den besonderen Umständen abhängen, die auf den jeweils erforderlichen Kriterien basieren (abhängig z.B. von dem G+C-Gehalt, der Art der Zielnukleinsäure, der Quelle der Nukleinsäure, der Größe der Hybridisierungssonde etc.). Nach dem Waschen der hybridisierten Oberfläche zum Entfernen nicht-spezifisch gebundener Oligonukleotide kann die Hybridisierung mit Hilfe der Markierung detektiert oder sogar quantifiziert werden.
Für Anwendungen, bei denen die Nukleinsäuresegmente der vorliegenden Erfindung in Vektoren, wie z.B. Plasmide, Cosmide oder Viren eingefügt werden, können diese Segmente mit anderen DNA-Sequenzen kombiniert werden, wie z.B. mit Promotoren, Polyadenylierungssignalen, Restriktionsenzym-Schnittstellen, multiplen Klonierungsstellen, anderen kodierenden Segmenten und Ähnlichem, sodass ihre Gesamtlänge sich beträchtlich unterscheiden kann. Es wird in Betracht gezogen, dass ein Nukleinsäurefragment von nahezu beliebiger Länge benutzt werden kann, wobei die Gesamtlänge vorzugsweise durch die Einfachheit der Herstellung und der Verwendung in dem geplanten Protokoll zur Herstellung rekombinanter DNA begrenzt ist.
Für ein spezifisches Gen kodierende DNA-Segmente können in rekombinante Wirtszellen eingebracht werden und für die Expression eines spezifischen strukturellen oder regulatorischen Proteins genutzt werden. Alternativ dazu können durch Anwendung von Methoden der Gentechnik Teile oder Derivate ausgewählter Gene verwendet werden. Stromaufwärts lokalisierte Bereiche, wie beispielsweise Promotorbereiche, können isoliert und anschließend für die Expression des ausgewählten Gens genutzt werden.
Die verwendeten Nukleinsäuren können für Antisense-Konstrukte kodieren, die unter intrazellulären Bedingungen mit einer Nukleinsäure von Interesse hybridisieren. Die Bezeichnung "Antisense-Konstrukt" soll sich auf Nukleinsäuren, vorzugsweise Oligonukleotide beziehen, die komplementär zu den Basensequenzen einer Ziel-DNA sind. Wenn sie in eine Zielzelle eingebracht werden; binden Antisense-Nukleotide spezifisch an ihre Zielnukleinsäure und beeinträchtigen Transkription, RNA-Prozessierung, Transport, Translation und/oder Stabilität. Antisense-Konstrukte können so gestaltet sein, dass sie an den Promotor und andere Kontrollregionen, Exons, Introns oder sogar Exon-Intron-Grenzen eines Gens binden.
Andere Sequenzen mit geringeren Homologiegraden werden ebenfalls in Betracht gezogen. Zum Beispiel könnte ein Antisense-Konstrukt mit begrenzten Bereichen hoher Homologie gestaltet werden, das aber auch einen nicht-homologen Bereich enthält (z.B. ein Ribozym). Diese Moleküle würden unter geeigneten Bedingungen an Zielsequenzen binden, obwohl sie weniger als 50 Homologie aufweisen.
In bestimmten Ausführungsformen könnte man anstreben, Antisense-Konstrukte zu verwenden, die andere Elemente umfassen, z.B. solche, die C-5-Propynpyrimidine enthalten. Es wurde gezeigt, dass Oligonukleotide, die C-5-Propyn-Analoga von Uridin und Cytidin enthalten, mit hoher Affinität an RNA binden und starke Antisense-Inhibitoren der Genexpression sind (Wagner et al., 1993).
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden DNA-Segmente einer Vielzahl von Größen produziert werden. Diese DNA-Segmente werden definitionsgemäß lineare Moleküle sein. Als solche werden sie üblicherweise modifiziert werden, bevor sie weiter verwendet werden. Diese Modifizierungen umfassen in einer Ausführungsform die Restriktion der Segmente, um ein oder mehrere "klebrige Enden" zu erzeugen, die zu komplementären Enden anderer Moleküle kompatibel sind, einschließlich solcher in Vektoren, die in der Lage sind, die Replikation des DNA-Segments zu unterstützen. Diese Manipulation erleichtert die "Klonierung" der Segmente.
Üblicherweise umfasst die Klonierung die Verwendung von Restriktionsendonukleasen, die an bestimmten Orten innerhalb der DNA-Stränge schneiden, um ein DNA-Segment für den Transfer in ein Klonierungsvehikel vorzubereiten. Die Ligation der kompatiblen Enden (was stumpfe Enden einschließt) unter Verwendung einer DNA-Ligase vervollständigt die Reaktion. Abhängig von der Situation kann das Klonierungsvehikel im Vergleich zu dem eingefügten Teil einen relativ kleinen Anteil der DNA umfassen. Alternativ dazu kann das Klonierungsvehikel extrem komplex sein und eine Vielzahl von Merkmalen umfassen, die die Replikation und Funktion des DNA-Segments beeinflussen werden. In bestimmten Ausführungsformen kann eine seltene Schnittstelle in das Ende der Polynukleotidsequenz eingebracht werden.
Klonierungsvehikel umfassen Plasmide wie die pUC-Serie, Bluescript^TM-Vektoren und eine Vielzahl anderer Vehikel mit Mehrzweckklonierungsstellen, selektierbaren Markern und Replikationsursprüngen. Aufgrund der Art der vorliegenden Erfindung können die Klonierungsvehikel so komplexe Moleküle wie Phagemide und Cosmide umfassen, die relativ große DNA-Stücke enthalten. Darüber hinaus können künstliche Chromosomen und sogar Genome hergestellt werden.
Nach der Klonierung in einen geeigneten Vektor wird das Konstrukt dann in eine kompatible Wirtszelle transferiert. Eine Vielzahl verschiedener Gentransfer-Techniken wird an anderer Stelle in diesem Dokument beschrieben. Es folgt die Kultivierung der Wirtszellen für den geplanten Zweck (Amplifikation, Expression, Subklonierung).
In der gesamten Anmeldung soll die Bezeichnung "Expressionskonstrukt" eine bestimmte Art von Klonierungsvehikel umfassen, das eine Nukleinsäure enthält, welche für ein Genprodukt kodiert, wobei ein Teil oder die gesamte kodierende Nukleinsäure-Sequenz in der Lage ist, transkribiert zu werden. Das Transkript kann dann in ein Protein translatiert werden, wobei es jedoch nicht translatiert werden muss. Daher umfasst die Expression in bestimmten Ausführungsformen sowohl die Transkription eines Gens als auch Translation einer RNA in ein Genprodukt. In anderen Ausführungsformen schließt die Expression nur die Transkription der Nukleinsäure ein, z.B. um Antisense-Konstrukte herzustellen.
In bestimmten Ausführungsformen befindet sich die Nukleinsäure unter der transkriptionellen Kontrolle eines Promotors. Ein "Promotor" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die von der Synthesemaschinerie der Zelle oder einer eingebrachten Synthesemaschinerie erkannt wird und dazu benötigt wird, die spezifische Transkription eines Gens einzuleiten. Der Ausdruck "unter transkriptioneller Kontrolle" bedeutet, dass sich der Promotor in Bezug auf die Nukleinsäure am richtigen Ort und in der richtigen Orientierung befindet, um die Initiation der RNA-Polymerase und die Expression des Gens zu kontrollieren.
Die Bezeichnung Promotor wird vorliegend in Bezug auf eine Gruppe von Translationskontrollmodulen verwendet werden, die um den Initiationsort der RNA-Polymerase II gesammelt vorliegen. Viele der Gedanken über die Organisation von Promotoren stammen von Analysen mehrerer viraler Promotoren, einschließlich derer für die HSV-Thymidinkinase (tk) Transkriptionseinheit und die SV40 frühe Transkriptionseinheit. Diese durch kürzliche Arbeiten gestützten Studien haben gezeigt, dass Promotoren aus diskreten funktionellen Modulen zusammengesetzt sind, die jeweils aus etwa 7 bis 20 bp DNA bestehen und eine oder mehrere Erkennungsstellen für Transkriptionsaktivator- oder Repressorproteine enthalten.
Mindestens ein Modul in jedem Promotor wirkt, indem es die Anfangsstelle für die RNA-Synthese hinsichtlich der Position festlegt. Das am besten bekannte Beispiel ist die TATA-Box. In manchen Promotoren ohne TATA-Box, wie z.B. dem Promotor für das Säugetier-Gen für die terminale Deoxynukleotidyl-Transferase und dem Promotor für die späten Gene von SV40, hilft jedoch ein über der Startstelle selbst liegendes diskretes Element dabei, den Ort der Initiation festzulegen.
Zusätzliche Promotorelemente regulieren die Häufigkeit der Transkriptionsinitiation. Üblicherweise sind diese in dem Bereich 30-110 bp stromaufwärts der Startstelle lokalisiert, obwohl kürzlich für mehrere Promotoren gezeigt wurde, dass sie auch stromabwärts der Startstelle funktionelle Elemente enthalten. Der Abstand zwischen den Promotorelementen ist oft flexibel, sodass eine Promotorfunktion erhalten wird, wenn die Elemente invertiert oder relativ zueinander bewegt werden. Bei dem tk-Promotor kann der Abstand zwischen den Promotorelementen auf bis zu 50 bp erhöht werden, bevor die Aktivität abzuzunehmen beginnt. Es scheint, dass abhängig von dem Promotor die individuellen Elemente bei der Aktivierung der Transkription entweder kooperativ oder unabhängig voneinander wirken.
Es wird angenommen, dass der bestimmte, für die Kontrolle der Expression einer Nukleinsäure genutzte Promotor nicht kritisch ist, solange er in der Lage ist, die Nukleinsäure in der Zielzelle zu exprimieren. Daher ist es bevorzugt, den kodierenden Nukleinsäure-Bereich angrenzend an und unter Kontrolle eines Promotors zu positionieren, der in der Lage ist, in einer menschlichen Zelle exprimiert zu werden, wenn eine menschliche Zelle Zielzelle ist. Allgemein gesagt kann ein solcher Promotor entweder einen humanen oder einen viralen Promotor enthalten. Bevorzugte Promotoren umfassen die von HSV abgeleiteten Promotoren. Eine andere bevorzugte Ausführungsform ist der Tetracyclin-kontrollierte Promotor.
In verschiedenen anderen Ausführungsformen können der humane "immediate-early" Gen-Promotor des Cytomegalovirus (CMV), der frühe Promotor von SV40 und die lange terminate Wiederholung (long terminal repeat) des Rous-Sarkoma-Virus verwendet werden, um eine Expression von Transgenen auf hohem Niveau zu erhalten. Die Verwendung anderer Promotoren aus Viren oder Säugetierzellen oder Bakteriophagen, die im Stand der Technik hinlänglich bekannt sind, wird ebenfalls in Betracht gezogen, um eine Expression eines Transgens zu erreichen, solange die Expressionsniveaus für den jeweiligen Zweck ausreichend sind. Es ist vorgesehen, dass im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung beliebige Elemente/Promotoren genutzt werden können. Nachfolgend wird eine Liste viraler Promotoren, zellulärer Promotoren/Enhancer und induzierbarer Promotoren/Enhancer aufgeführt, die in Kombination mit der für ein Gen von Interesse kodierenden Nukleinsäure in einem Expressionskonstrukt verwendet werden könnten. Enhancer/Promotorelemente, die für die Verwendung mit der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen werden, umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf): schwere Kette des Immunglobulins, leichte Kette des Immunglobulins, T-Zell-Rezeptor, HLA DQ α und DQ β, β-Interferon, Interleukin-2, Interleukin-2-Rezeptor, MHC-Klasse II 5, MHC-Klasse II HLA-DRα, β-Actin, Muskelcreatinkinase, Präalbumin (Transthyretin), Elastase 1, Metallothionein, Kollagenase, Albumin-Gen, α-Fetoprotein, ι-Globin, β-Globin, e-fos, c-HA-ras, Insulin, Neurales Zelladhäsionsmolekül (NCAM), α1-Antitrypsin, H2B (TH2B) Histon, Maus- oder Typ I-Kollagen, Glukose-regulierte Proteine (GRP94 und GRP78), Rattenwachstumshormon, Humanes Serum Amyloid A (SAA), Troponin I (TN I), Blutplättchen-Wachstumsfaktor (Platelet-Derived Growth Factor), Duchenne Muskuläre Dystrophy, SV40, Polyoma, Retroviren, Papilloma-Virus, Hepatitis B-Virus, Humaner Immundefizienz-Virus, Cytomegalie-Virus, Gibbon-Affen-Leukämie-Virus. Induzierbare Promotorelemente und ihre assoziierten Inducer sind nachstehend in Tabelle 2 aufgelistet. Diese Liste soll in Bezug auf alle möglichen Elemente, die an der Förderung der transgenen Expression beteiligt sind, nicht erschöpfend verstanden werden, sondern lediglich beispielhaft für diese sein. Darüber hinaus könnte eine beliebige Promotor/Enhancer-Kombination (anhand der eukaryotischen Promotor-Datenbank EPDB) ebenfalls verwendet werden, um die Expression des Gens zu steuern. Eukaryotische Zellen können die zytoplasmatische Transkription von be stimmten bakteriellen Promotoren unterstützen, wenn die geeignete bakterielle Polymerase entweder als Teil des zu verabreichenden Komplexes oder als zusätzliches genetisches Expressionskonstrukt bereitgestellt wird.
Enhancer wurden ursprünglich als genetische Elemente nachgewiesen, die ausgehend von einer entfernten Position auf dem gleichen DNA-Molekül die Transkription eines Promotors verstärkten. Für diese Fähigkeit, über eine große Distanz zu wirken, gab es in klassischen Studien der prokaryotischen Transkriptionsregulation wenig Präzedenzfälle. Spätere Arbeiten zeigten, dass DNA-Bereiche mit Enhancer-Aktivität ähnlich wie Promotoren organisiert sind. Das heißt, sie sind aus vielen einzelnen Elementen zusammengesetzt, von denen jedes an ein oder mehrere Transkriptionsproteine bindet.
Die grundlegende Unterscheidung zwischen Enhancern und Promotoren erfolgt anhand ihrer Wirkung. Ein Enhancer-Bereich muss als Ganzes in der Lage sein, die Transkription über eine Distanz hinweg zu stimulieren; dies muss auf eine Promotor-Region oder deren Komponenten und Elemente nicht zutreffen. Andererseits muss ein Promotor ein oder mehrere Elemente aufweisen, die die Initiation der RNA-Synthese an einem bestimmten Ort und in einer bestimmten Orientierung steuern, während Enhancern diese Spezifitäten fehlen. Promotoren und Enhancer sind oftmals überlappend und aneinander angrenzend und scheinen oftmals eine sehr ähnliche modulare Organisation aufzuweisen.
Tabelle 2
Die Verwendung des Baculovirus-Systems wird mit einer Expression auf hohem Niveau einhergehen, die von dem starken Polyhedron-Promotor ausgeht.
Um eine korrekte Polyadenylierung des Transkriptes zu bewirken, wird man üblicherweise ein Polyadenylierungssignal verwenden. Es wird nicht davon ausgegangen, dass die Art des Po lyadenylierungssignals für die erfolgreiche Durchführung der Erfindung kritisch ist, und eine beliebige derartige Sequenz kann verwendet werden. Bevorzugte Ausführungsformen umfassen das SV40-Polyadenylierungssignal und das Polyadenylierungssignal des bovinen Wachstumshormons, die praktisch sind und von denen man weiß, dass sie in verschiedenen Zielzellen gut funktionieren. Als Element der Expressionskassette wird ferner ein Terminator in Betracht gezogen. Diese Elemente können dazu dienen, die mRNA-Mengen zu verbessern und das Durchlesen von der Kassette in andere Sequenzen hinein zu minimieren.
Für die effiziente Translation kodierender Sequenzen kann ferner ein spezifisches Initiationssignal notwendig sein. Diese Signale umfassen das ATG-Initiations-Kodon sowie angrenzende Sequenzen. Exogene Translationskontrollsignale, einschließlich des ATG-Initiations-Kodons, müssen eventuell bereitgestellt werden. Der Fachmann wird problemlos in der Lage sein, dies herauszufinden und die notwendigen Signale bereitzustellen. Es ist hinlänglich bekannt, dass das Initiations-Kodon im Leserahmen (in-frame) der gewünschten kodierenden Sequenz sein muss, um die Translation der gesamten eingefügten Sequenz zu gewährleisten. Die exogenen Translationskontrollsignale und Initiations-Kodons können entweder natürlich oder synthetisch sein. Die Effizienz der Expression kann durch die Verwendung geeigneter Transkriptions-Enhancer-Elemente (Bittner et al., 1987) verbessert werden.
In bestimmten Ausführungsformen kann es erwünscht sein, spezielle, als Telomere bekannte Bereiche am Ende einer genomischen Sequenz zu verwenden. Telomere sind an den Chromosomenenden gefundene Sequenzwiederholungen, und es ist seit langem bekannt, dass Chromosomen mit trunkierten Enden instabil sind, zu Fusionen mit anderen Chromosomen neigen und auf andere Weise während der Zellteilung verlorengehen. Einige Daten lassen darauf schliessen, dass Telomere mit dem Nukleoproteinkomplex und der nukleären Matrix interagieren. Eine mutmaßliche Rolle der Telomere umfasst die Stabilisierung der Chromosomen und das Abschirmen der Enden gegen degradierende Enzyme.
Eine andere mögliche Rolle der Telomere betrifft die Replikation. Gemäß der derzeitigen Lehrmeinung beginnt die Replikation von DNA an kurzen RNA-Primern, die sich an das 3'-Ende des Matrizenstrangs angelagert haben. Das Ergebnis dieses Mechanismus ist ein "Replikationsproblem der Enden", bei dem der dem RNA-Primer entsprechende Bereich nicht repliziert wird. Über mehrere Zellteilungen hinweg wird dies zur fortschreitenden Trunkierung des Chromosoms führen. Es wird angenommen, dass Telomere einen Puffer gegen diesen Effekt bereitstellen können, zumindest bis sie selbst durch diesen Effekt eliminiert werden. Eine weitere, in DNA-Segmenten zu verwendende Struktur ist ein Centromer.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung kann das Einbringen einer Nukleinsäure in eine Zelle in vitro oder in vivo identifiziert werden, indem ein Marker in das Expressionskonstrukt eingeschlossen wurde. Der Marker würde zu einer identifizierbaren Veränderung der transfizierten Zelle führen, die eine problemlose Identifizierung der Expression erlaubt.
Mehrere Selektionssysteme können verwendet werden, einschließlich der Gene für die Thymidinkinase des Herpes simplex Virus (Wigler et al., 1977), die Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (Szybalska et al., 1962) und die Adeninphosphoribosyltransferase (Lowy et al., 1980) in tk^-, hgprt bzw. aprt^- Zellen; die Selektionssysteme sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Die Resistenz gegen Antimetaboliten kann ebenfalls als Grundlage für die Selektion nach dhfr, welches Resistenz gegen Methotrexat verleiht (Wigler et al., 1980; O'Hare et al., 1981); gpt, welches Resistenz gegen Mikrophenolsäure verleiht (Mulligan et al., 1981); neo, welches Resi stenz gegen das Aminoglykosid G-418 verleiht (Colberre-Garapin et al., 1981); und hygro, welches Resistenz gegen Hygromycin verleiht, verwendet werden.
Normalerweise hilft die Verwendung eines Medikamenten-Selektionsmarkers, wie z.B. Neomycin, Puromycin, Hygromycin, DHFR, GPT, Zeocin und Histidinol, bei der Klonierung und Selektion von Transformanten. Alternativ dazu können Enzyme wie die Thymidinkinase des Herpes-simplex-Virus (tk) (eukaryotisch) oder die Chloramphenicol-Acetyl-Transferase (CAT) (prokaryotisch) verwendet werden. Auch immunologische Marker können verwendet werden. Es wird nicht davon ausgegangen, dass der verwendete selektierbare Marker wichtig ist, solange er in der Lage ist, gleichzeitig mit der für ein Genprodukt kodierenden Nukleinsäure exprimiert zu werden. Weitere Beispiele für selektierbare Marker sind dem Fachmann hinlänglich bekannt.
In bestimmten Ausführungsformen werden interne Ribosomenbindungsstellen (IRES)-Elemente verwendet, um Multigen-mRNA oder polycistronische mRNA herzustellen. IRES-Elemente sind in der Lage, den Mechanismus der Überprüfung durch das Ribosom bei der Translation, die von der 5' methylierten Kappe abhängt, zu vermeiden, und führen zum Beginn der Translation an internen Stellen (Pelletier und Sonenberg, 1988). Es wurden IRES-Elemente von zwei Mitgliedern der Picornavirus-Familie (Polio und Encephalomyocarditis) beschrieben (Pelletier und Sonenberg, 1988), sowie eine IRES einer Säugetier-mRNA (Macejak und Sarnow, 1991). IRES-Elemente können mit heterologen offenen Leserahmen verbunden sein. Mehrere offene Leserahmen können zusammen transkribiert werden, jeweils getrennt durch eine IRES, was zur Bildung von polycistronischen mRNAs führt. Durch das IRES-Element ist jeder offene Leserahmen den Ribosomen für eine effiziente Translation zugänglich. Mehrere Gene können effizient exprimiert werden, indem ein einzelner Promo tor/Enhancer verwendet wird, um eine einzelne mRNA zu transkribieren.
Jeder heterologe offene Leserahmen kann mit IRES-Elementen verbunden sein. Dies umfasst Gene für Sekretionsproteine, Proteine mit mehreren durch unabhängige Gene kodierten Untereinheiten, intrazelluläre oder membrangebundene Proteine und selektierbare Marker. Auf diese Art kann die gleichzeitige Expression mehrerer Proteine in einer Zelle mit einem einzigen Konstrukt und einem einzigen selektierbaren Marker erreicht werden.
D. Kodierte Proteine
In der vorliegenden Anmeldung nutzen die Erfinder genetische Informationen zu Zwecken der Herstellung oder Synthese. Die vollständige Genomsequenz wird einen Katalog aller für das Überleben, die Reproduktion, Evolution und Artbildung eines Organismus notwendigen Gene ergeben, und die genomische Information kann (geeignete hochtechnologische Werkzeuge vorausgesetzt) verändert oder sogar aus dem "Nichts" hergestellt werden, um Leben zu synthetisieren. Es wird daher in Betracht gezogen, dass eine Kombination geeigneter Gene zur Energieerzeugung, regulatorischer Gene und anderer funktioneller Gene konstruiert werden könnte, die ausreichen würde, einen künstlichen Organismus mit den grundlegenden Funktionalitäten auszustatten, um ein unabhängiges Überleben zu ermöglichen.
Um dieses Ziel zu erreichen, nutzt die vorliegende Erfindung bekannte cDNA-Sequenzen für jedes beliebige Gen, um Proteine in einem künstlichen Organismus zu exprimieren. Jedes in dieser Erfindung auf diese Weise exprimierte Protein kann für bestimmte Zwecke nach im Stand der Technik hinlänglich bekannten Methoden modifiziert werden. Zum Beispiel können bestimmte Peptidreste derivatisiert oder chemisch modifiziert werden, um die Immunantwort zu verändern oder eine Kopplung des Peptids an andere Mittel zu ermöglichen. Es ist ferner möglich, bestimmte Aminosäuren innerhalb der Peptide zu verändern, ohne die Gesamtstruktur oder Antigenizität des Peptids zu beeinträchtigen. Solche Änderungen werden daher als "konservative" Änderungen bezeichnet und neigen dazu, sich auf die Hydrophilizität oder Polarität des Restes zu stützen. Die Größe und/oder Ladung der Seitenketten sind bei der Bestimmung, welche Substitutionen konservativ sind, ebenfalls relevante Faktoren.
Sobald die vollständige kodierende Sequenz eines Gens bestimmt wurde, kann das Gen in ein geeignetes Expressionssystem eingebracht werden. Das Gen kann in einer beliebiger Anzahl verschiedener rekombinanter DNA-Expressionssysteme exprimiert werden, um große Mengen des Polypeptidproduktes herzustellen, welches anschließend aufgereinigt und dazu verwendet werden kann, Tiere für die Herstellung von Antiseren zu impfen, die Gegenstand weiterer Studien sein können.
Beispiele für dem Fachmann bekannte Expressionssysteme umfassen Bakterien, wie z.B. E. coli, Hefen, wie z.B. Saccharomyces cerevisia und Pichia pastoris, Baculovirus, und Säugetier-Expressionssysteme wie COS- oder CHO-Zellen. In einer Ausführungsform werden die Polypeptide in E. coli und in Baculovirus-Expressionssystemen exprimiert. Es kann ein vollständiges Gen exprimiert werden oder es können alternativ dazu Fragmente des Gens, die für Teile des Peptids kodieren, hergestellt werden.
In einer Ausführungsform wird die für das Polypeptid kodierende Gensequenz analysiert, um mutmaßliche Transmembransequenzen nachzuweisen. Solche Sequenzen sind üblicherweise sehr hydrophob und werden problemlos durch Standard-Sequenzanalyse- Software, wie z.B. MacVector (IBI, New Haven, CT), nachgewiesen. Die Anwesenheit von Transmembransequenzen ist bei der Synthese eines rekombinanten Proteins in zahlreichen Expressionssystemen, insbesondere in E. coli, oftmals schädlich, da sie zur Produktion unlöslicher Aggregate führt, die schwer in die nativen Konformation des Proteins zu renaturieren sind. Die Deletion von Transmembransequenzen ändert üblicherweise die Konformation der restlichen Proteinstruktur nicht signifikant.
Darüber hinaus sind Transmembransequenzen, die per Definition innerhalb einer Membran eingebettet sind, unzugänglich. Daher werden Antikörper gegen diese Sequenzen sich für in vivo oder in situ-Studien nicht als nützlich erweisen. Die Deletion von Transmembran-kodierenden Sequenzen aus den für die Expression genutzten Genen kann mit Standardtechniken erreicht werden. Zum Beispiel können zufällig lokalisierte Restriktionsenzymschnittstellen verwendet werden, um das gewünschte Genfragment auszuschneiden, oder es kann eine PCR^TM-artige Amplifikation verwendet werden, um nur den gewünschten Teil des Gens zu amplifizieren. Der Fachmann wird erkennen, dass solche Änderungen so gestaltet werden müssen, dass sie den Translations-Leserahmen für stromabwärts liegende Teile der Proteinkodierenden Sequenz nicht ändern.
In einer Ausführungsform wird eine Computersequenzanalyse verwendet, um die Lokalisierung der vorhergesagten hauptsächlichen antigenen Determinanten-Epitope des Polypeptids zu bestimmen. Software, die diese Analyse ausführen kann, ist kommerziell problemlos erhältlich, z.B. MacVector (IBI, New Haven, CT). Diese Software benutzt normalerweise Standardalgorithmen, wie z.B. das Kyte/Doolittle- oder das Hopp/Woods-Verfahren zur Lokalisierung hydrophiler Sequenzen, die charakteristischerweise auf der Oberfläche von Proteinen gefunden werden und daher wahrscheinlich als antigene Determinanten wirken.
Sobald diese Analyse durchgeführt wurde, können Polypeptide hergestellt werden, die mindestens die essentiellen Merkmale der antigenen Determinanten enthalten und für die Erzeugung von Antiseren gegen das Polypeptid genutzt werden können. Minigene oder Gen-Fusionen, die für diese Determinanten kodieren, können konstruiert und mittels Standardmethoden in Expressionsvektoren eingefügt werden, z.B. durch PCR^TM-Methoden.
Das für ein Polypeptid kodierende Gen oder Genfragment kann mittels Standard-Subklonierungsmethoden in einen Expressionsvektor eingebracht werden. In einer Ausführungsform wird ein E. coli-Expressionsvektor verwendet, der das rekombinante Polypeptid als Fusionsprotein produziert, was eine schnelle Affinitätsreinigung des Proteins erlaubt. Beispiele für solche Fusionsprotein-Expressionssysteme sind das Glutathion-S-Transferase-System (Pharmacia, Piscataway, NJ), das Maltosebindungs protein-System (NEB, Beverley, MA), das FLAG-System (IBI, New Hauen, CT) und das 6×His-System (Qiagen, Chatsworth, CA).
Einige dieser Systeme erzeugen rekombinante Polypeptide, die nur eine kleine Anzahl zusätzlicher Aminosäuren tragen, welche die antigenen Eigenschaften des rekombinanten Polypeptids wahrscheinlich nicht beeinflussen. Zum Beispiel fügen sowohl das FLAG-System als auch das 6×His-System nur kurze Sequenzen hinzu, wobei bekannt ist, dass diese kaum antigen sind und die Faltung des Polypeptids zu seiner nativen Konformation nicht negativ beeinflussen. In anderen Fusionssystemen werden Polypeptide hergestellt, bei denen es erstrebenswert ist, den Fusionspartner von dem gewünschten Polypeptid abzuspalten. In einer Ausführungsform ist der Fusionspartner mit dem rekombinanten Polypeptid über eine Peptidsequenz verbunden, die eine spezifische Erkennungssequenz für eine Protease enthält. Bei spiele geeigneter Sequenzen sind solche, die durch die Tobacco Etch Virus-Protease (Life Technologies, Gaithersburg, MD) oder durch Faktor Xa (New England Biolabs, Beverley, MA) erkannt werden.
Rekombinante Bakterienzellen, z.B. E. coli, werden in einem von mehreren geeigneten Medien, z.B. LB, angezüchtet, und die Expression des rekombinanten Polypeptids wird durch Zugabe von IPTG zum Medium oder durch Übergang der Inkubation auf eine höhere Temperatur induziert. Nach Anzüchten der Bakterien für einen weiteren Zeitraum von zwischen 2 bis 24 Stunden werden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt und gewaschen, um restliches Medium zu entfernen. Die Bakterienzellen werden anschließend lysiert, z.B. durch Auseinanderreißen in einem Zellhomogenisator, und zentrifugiert, um die dichten Einschlusskörper und Zellmebranen von den löslichen Zellkomponenten zu trennen. Diese Zentrifugation kann unter Bedingungen durchgeführt werden, durch die die dichten Einschlusskörper selektiv angereichert werden, indem Zucker wie Saccharose im Puffer verwendet und die Zentrifugation bei einer selektiven Geschwindigkeit durchgeführt wird.
In einer anderen Ausführungsform ist das verwendete Expressionssystem ein durch den Polyhedron-Promotor von Baculovirus geregeltes Expressionssystem. Das für das Polypeptid kodierende Gen kann durch Standardtechniken manipuliert werden, um die Klonierung in den Baculovirus-Vektor zu erleichtern. Ein Baculovirus-Vektor ist der pBlueBac-Vektor (Invitrogen, Sorrento, CA). Der das Gen für das Polypeptid tragende Vektor wird mit Standardmethoden in Spodoptera frugiperda (Sf9)-Zellen transfiziert, und die Zellen werden kultiviert und prozessiert, um das rekombinante Antigen herzustellen. Siehe Summers et al., A MANUAL OF METHODS FOR BACULORIRUS VECTORS AND INSECT CELL CULTURE PROCEDURES, Texas Agricultural Experimental Station.
Beim Gestalten eines Gens, das für ein bestimmtes Polypeptid kodiert, kann der Hydropathie-Index der Aminosäuren in Betracht gezogen werden. Tabelle 3 stellt eine Kodontabelle bereit, die Nukleinsäuren zeigt, welche für eine bestimmte Aminosäure kodieren. Die Wichtigkeit des Hydropathie-Aminosäure-Index bei der Übertragung von interaktiven biologischen Funktionen auf ein Protein ist im Stand der Technik allgemein anerkannt (Kyte & Doolittle, 1982). Nachfolgend stellt eine kurze Diskussion des Hydropathie-Aminosäure-Index im Hinblick auf die Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung dar.
Tabelle 3
Es ist akzeptiert, dass der relative Hydropathiecharakter der Aminosäure zur Sekundärstruktur des sich ergebenden Proteins beiträgt, die wiederum die Interaktion des Proteins mit anderen Molekülen, z.B. Enzymen, Substraten, Rezeptoren, DNA, Antikörpern, Antigenen und Ähnlichem, bestimmt.
Jeder Aminosäure wurde auf der Grundlage ihrer Hydrophobizität und ihrer Ladungseigenschaften ein Hydropathie-Index zugeordnet (Kyte & Doolittle, 1982); diese sind: Isoleucin (+4,5); Valin (+4,2); Leucin (+3,8); Phenylalanin (+2,8); Cystein/Cystin (+2,5); Methionin (+1,9); Alanin (+1,8); Glycin (–0,4); Threonin (–0,7); Serin (–0,8); Tryptophan (–0,9) Tyrosin (–1,3); Prolin (–1,6); Histidin (–3,2); Glutamat (–3,5); Glutamin (–3,5); Aspartat (–3,5); Asparagin (–3,5); Lysin (–3,9) und Arginin (–4,5).
Es ist im Stand der Technik bekannt, dass bestimmte Aminosäuren durch andere Aminosäuren mit einem ähnlichen Hydropathie-Index oder -Wert ersetzt werden können, was immer noch zu einem Protein mit ähnlicher biologischer Aktivität führt, d.h. dass immer noch ein biologisch funktionell äquivalentes Protein erhalten wird. Bei der Durchführung solcher Änderungen wird die Substitution von Aminosäuren mit Hydropathie-Indices im Bereich von ±2 bevorzugt, wobei solche mit Indices im Bereich von ±1 stärker bevorzugt werden, und solche im Bereich von ±0,5 noch stärker bevorzugt werden.
Es ist im Stand der Technik ferner bekannt, dass die Substitution ähnlicher Aminosäuren auf Basis der Hydrophilizität wirksam durchgeführt werden kann. US-Patent 4,554,101, vorliegend durch Bezugnahme umfasst, stellt fest, dass die größte lokale durchschnittliche Hydrophilizität eines Proteins, die durch die Hydrophilizität seiner benachbarten Aminosäuren bestimmt wird, mit einer biologischen Eigenschaft des Proteins korreliert.
Wie im US-Patent 4,554,101 im Detail beschrieben, wurden den Aminosäureresten folgende Hydrophilizitätswerte zugeordnet: Arginin (+3,0); Lysin (+3,0); Aspartat (+3,0 ±1); Glutamat (+3,0 ±1); Serin (+0,3); Asparagin (+0,2); Glutamin (+0,2); Glycin (0); Threonin (–0,4); Prolin (–0,5 ±1); Alanin (–0,5); Histidin (–0,5); Cystein (–1,0); Methionin (–1,3); Valin (–1,5); Leucin (–1,8); Isoleucin (–1,8); Tyrosin (–2,3); Phenylalanin (–2,5); Tryptophan (–3,4).
Es ist ersichtlich, dass eine Aminosäure gegen eine andere Aminosäure ersetzt werden kann, die einen ähnlichen Hydrophilizitätswert aufweist, und immer noch ein biologisch äquivalentes und immunologisch äquivalentes Protein erhalten werden kann. Bei solchen Änderungen wird die Substitution von Aminosäuren mit Hydropathie-Indices im Bereich von ±2 bevorzugt, wobei solche mit Indices im Bereich von ±1 stärker bevorzugt werden, und solche im Bereich von ±0,5 noch stärker bevorzugt werden.
Wie oben beschrieben basieren Aminosäuresubstitutionen im Allgemeinen auf der relativen Ähnlichkeit der Aminosäureseitenkettensubstituenten, z.B. in Bezug auf ihre Hydrophobizität, Hydrophilizität, Ladung, Größe und Ähnlichem. Beispielhafte Substitutionen, die verschiedene der obigen Charakteristika in Betracht ziehen, sind dem Fachmann hinlänglich bekannt und umfassen: Arginin und Lysin; Glutamat und Aspartat; Serin und Threonin; Glutamin und Asparagin; sowie Valin, Leucin und Isoleucin.
E. Expression und Bereitstellen von Genen
2. Expression
Sobald das gestaltete Gen, Genom oder biologische System nach den vorliegend beschriebenen Verfahren hergestellt worden ist; können die Polynukleotide als von dem Gen, Genom oder biologischen System kodierte Peptide oder Proteine exprimiert werden. Das Konstruieren der Nukleotide zur Expression in einem prokaryotischen oder eukaryotischen System kann mittels Methoden durchgeführt werden, die dem Fachmann für rekombinante Expression allgemein bekannt sind. Daher können Promotoren oder andere Elemente, die für ein Bakterien-, Säugetier- oder anderes System spezifisch sind, von der Polynukleotidsequenz umfasst sein. Es wird davon ausgegangen, dass im Wesentlichen jedes Expressionssystem bei der Expression der beanspruchten Nukleinsäuresequenzen verwendet werden kann.
Die künstlich erzeugten Polynukleotidsequenzen sind zur eukaryotischen Expression geeignet, da die Wirtszelle im Allgemeinen die genomischen Transkripte prozessieren wird, was zu funktioneller mRNA für die Translation in Proteine führt. Es wird davon ausgegangen, dass die Verwendung einer Designer-Gen-Version Vorteile bereitstellen wird, die darin liegen, dass die Größe des Gens normalerweise. viel kleiner und leichter dazu verwendbar sein wird, die Zielzelle zu transfizieren, als dies bei einem genomischen Gen der Fall ist, welches im Vergleich zum Designer-Gen üblicherweise bis zu einer Größenordnung größer sein wird. Der Erfinder schließt jedoch die Möglichkeit nicht aus, eine genomische Version eines bestimmten Gens zu nutzen, wo dies gewünscht ist.
Wie vorliegend verwendet, sollen die Bezeichnungen "manipulierte" und "rekombinante" Zellen sich auf eine Zelle beziehen, in die ein vorliegend beschriebenes exogenes Polynukleo tid eingebracht worden ist. Damit sind manipulierte Zellen unterscheidbar von natürlich vorkommenden Zellen, die kein rekombinant eingebrachtes exogenes Polynukleotid enthalten. Manipulierte Zellen sind damit Zellen, in die durch menschliches Einwirken ein Gen oder Gene eingebracht wurde (n). Rekombinante Zellen umfassen solche, die eingebrachte Polynukleotide aufweisen, und umfassen ferner Polynukleotide, die an einen Promotor angrenzend positioniert sind, der nicht natürlicherweise mit dem betreffenden, eingebrachten Gen assoziiert ist.
Um ein rekombinantes, kodiertes Protein oder Peptid (entweder mutiert oder vom Wildtyp) gemäß der vorliegenden Erfindung zu exprimieren, würde man einen Expressionsvektor herstellen, der eine der beanspruchten isolierten Nukleinsäuren unter Kontrolle von einem oder mehreren Promotoren umfasst. Um eine kodierende Sequenz "unter die Kontrolle" eines Promotors zu bringen, positioniert man das 5'-Ende der Translations-Initiierungsstelle des Leserahmens im Allgemeinen etwa 1 bis 50 Nukleotide "stromabwärts" von (d.h., 3' von) dem gewählten Promotor. Der "stromaufwärts liegende" Promotor stimuliert die Transkription der eingefügten DNA und fördert die Expression des kodierten rekombinanten Proteins. Dies ist die Bedeutung von "rekombinanter Expression" in dem vorliegend verwendeten Kontext.
Es sind viele Standardtechniken verfügbar, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die die geeigneten Nukleinsäuren sowie transkriptionale/translationale Kontrollsequenzen enthalten, um eine Protein- oder Peptidexpression in einer Vielzahl von Wirtsexpressionssystemen zu erreichen. Zelltypen, die für die Expression verfügbar sind, umfassen Bakterien, wie E. coli und B. subtilis, die mit rekombinanter Phagen-DNA, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA transformiert sind, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Bestimmte Beispiele prokaryotischer Wirte sind E. coli Stamm RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli χ 1776 (ATCC No. 31537), sowie E. coli W3110 (F-, lambda-, prototroph, ATCC No. 273325); Bacilli, wie beispielsweise Bacillus subtilis; und andere Enterobacteriaceae wie Salmonella typhimurium, Serratia marcescens und verschiedene Pseudomonas-Arten.
Im Allgemeinen werden Plasmidvektoren, die Replikon- und Kontrollsequenzen enthalten, welche von Spezies abgeleitet sind, die mit der Wirtszelle kompatibel sind, in Verbindung mit diesen Wirten verwendet. Der Vektor trägt normalerweise eine Replikationsstelle sowie Markierungssequenzen, die in der Lage sind, eine phänotypische Selektion der transformierten Zellen zu ermöglichen. Zum Beispiel wird E. coli oft unter Verwendung von pBR322 transformiert, einem aus einer E. coli-Spezies erhaltenen Plasmid. Plasmid pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz und stellt damit Mittel zur leichten Identifizierung transformierter Zellen bereit. Das Plasmid pBR322 oder ein sonstiges mikrobielles Plasmid oder ein Phage muss ferner Promotoren enthalten, die von dem mikrobiellen Organismus für die Expression seiner eigenen Proteine verwendet werden können, oder es muss entsprechend verändert werden, sodass es sie enthält.
Zusätzlich können Phagenvektoren, die Replikon- und Kontrollsequenzen enthalten, welche mit dem Wirtsmikroorganismus kompatibl sind, als Transformationsvektoren in Verbindung mit diesen Wirten verwendet werden. Zum Beispiel kann der Phage lambda GEM^TM-11 zur Herstellung eines rekombinanten Phagenvektors verwendet werden, der zur Transformation von Wirtszellen, wie z.B. E. coli LE392, verwendet werden kann.
Weitere nützliche Vektoren umfassen die pIN-Vektoren (Inouye et al., 1985) sowie die pGEX-Vektoren zur Verwendung bei der Herstellung von löslichen Glutathion S-Transferase (GST)-Fusionsproteinen für die spätere Aufreinigung und Trennung oder Spaltung. Andere geeignete Fusionsproteine sind solche mit β-Galaktosidase, Ubiquitin oder Ähnlichen.
Die bei der Konstruktion rekombinanter DNA am häufigsten verwendeten Promotoren umfassen die β-Lactamase (Penicillinase)-, Lactose- und Tryptophan (trp)-Promotorsysteme. Während diese am häufigsten verwendeten werden, wurden andere mikrobielle Promotoren entdeckt und verwendet, und Details bezüglich ihrer Nukleotidsequenzen wurden veröffentlicht, was den Fachmann in die Lage versetzt, sie funktionell mit Plasmidvektoren zu ligieren.
Für die Expression in Saccharomyces wird z.B. häufig das Plasmid YRp7 verwendet (Stinchcomb et al. 1979; Kingsman et al. 1979; Tschemper et al. 1980). Dieses Plasmid enthält das trp1-Gen, das einen Selektionsmarker für einen mutierten Hefe-Stamm bereitstellt, dem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachsen, z.B. ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, 1977). Die Gegenwart der trp1-Läsion als Eigenschaft des Genoms der Hefe-Wirtszelle sorgt dann für eine wirksame Umgebung für die Detektion der Transformation durch Anzüchten in Abwesenheit von Tryptophan.
Geeignete Promotorsequenzen in Hefevektoren umfassen die Promotoren für die 3-Phosphoglycerat-Kinase (Hitzeman et al., 1980) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., 1968; Holland et al., 1978), wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofruktokinase, Glukose-6-Phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphat-Isomerase, Phosphoglukose-Isomerase, und Glukokinase. Bei der Konstruktion geeigneter Expressionsplasmide werden die mit diesen Genen assoziierten Terminationssequenzen ebenfalls 3' von der Sequenz, deren Expression gewünscht ist, in den Expressionsvektor ligiert, um eine Polyadenylierung der mRNA und eine Termination bereitzustellen.
Andere geeignete Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil einer durch Wachstumsbedingungen gesteuerten Transkription aufweisen, umfassen die Promotorregion von Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, mit dem Stickstoffmetabolismus assoziierte degradative Enzyme, sowie die der bereits erwähnten Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase, und die von Enzymen, welche für die Nutzung von Maltose- und Galaktose verantwortlich sind.
Darüber hinaus zu Mikroorganismen können auch von multizellulären Organismen abgeleitete Zellkulturen als Wirte verwendet werden. Im Prinzip kann mit einer beliebigen Zellkultur gearbeitet werden, sei es aus Vertebraten- oder Invertebraten-Kultur. Zusätzlich zu Säugetierzellen umfassen sie Insektenzell-Systeme, die mit rekombinanten Virus-Expressionsvektoren (z.B. Baculovirus) infiziert sind, und Pflanzenzell-Systeme, die mit rekombinanten Virus-Expressionsvektoren (z.B. Blumenkohlm-osaik-Virus, CaMV; Tabakmosaik-Virus, TMV) infiziert oder mit rekombinanten Plasmid-Expressionsvektoren (z.B. Ti-Plasmid) transformiert sind, welche eine oder mehrere kodierende Sequenzen enthalten.
In einem nützlichen Insektensystem wird das Autograph californica nuclear Polyhedrosis-Virus (AcNPV) als Vektor zur Expression fremder Gene verwendet. Das Virus wächst in Spodoptera frugiperda-Zellen. Die isolierten Nukleinsäure-kodierenden Sequenzen werden in nicht-essentielle Bereiche des Virus kloniert (z.B. in das Polyhedron-Gen) und unter Kontrolle eines AcNPV-Promotors gebracht (z.B. des Polyhedron-Promotors). Die erfolgreiche Insertion der kodierenden Sequenzen führt zur Inaktivierung- des Polyhedron-Gens und Produktion von nicht- verschlossenem rekombinanten Virus (d.h. Virus, dem die durch das Polyhedron-Gen kodierte Proteinhülle fehlt). Diese rekombinanten Viren werden dann verwendet, um Spodoptera frugiperda-Zellen zu infizieren, in denen das insertierte Gen exprimiert wird (z.B. US-Patent Nr. 4,215,051).
Beispiele für nützliche Säugetier-Wirtszelllinien sind VERO- und HeLa-Zellen, Ovarzelllinien des chinesischen Hamsters (CHO), sowie die Zelllinien W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, NIH3T3, RIN und MDCK. Darüber hinaus kann eine Wirtszelle ausgewählt werden, die auf eine bestimmte gewünschte Art die Expression der insertierten Sequenzen moduliert oder das Genprodukt modifiziert und prozessiert. Solche Modifikationen (z.B. Glykosylierung) und Prozessierung (z.B. Spaltung) von Proteinprodukten kann für die Funktion des kodierten Proteins wichtig sein.
Verschiedene Wirtszellen haben charakteristische und spezifische Mechanismen für die post-translationale Prozessierung und die Modifikation von Proteinen. Geeignete Zelllinien oder Wirtssysteme können gewählt werden, um die richtige Modifikation und Prozessierung des exprimierten fremden Proteins zu gewährleisten. Expressionsvektoren für die Verwendung in Säugetierzellen enthalten normalerweise einen Replikationsursprung (soweit notwendig), einen vor dem zu exprimierenden Gen lokalisierten Promotor, zusammen mit jeglichen notwendigen Ribosomenbindungsstellen, RNA-Spleißstellen, Polyadenylierungsstellen und Transkriptionsterminations-Sequenzen. Der Replikationsursprung kann entweder durch die Konstruktion des Vektors bereitgestellt werden, sodass dieser einen exogenen Ursprung enthält, z.B. abgeleitet von SV40 oder anderen viralen Quellen (z.B. Polyoma, Adeno, VSV, BPV), oder er kann durch den Chromosomen-Replikationsmechanismus der Wirtszelle bereitgestellt werden. Wenn der Vektor in das Wirtszellchromosom integriert, ist letzteres oftmals ausreichend.
Die Promotoren können vom Genom von Säugetierzellen (z.B. Metallothionein-Promotor) oder von Säugetier-Viren (z.B. dem späten Adenovirus-Promotor; dem Vacciniavirus 7,5K-Promotor) abgeleitet sein. Darüber hinaus ist es ferner möglich und kann erstrebenswert sein, einen Promotor oder Kontrollsequenzen zu verwenden, die normalerweise mit der gewünschten Gensequenz assoziiert sind, vorausgesetzt, dass solche Kontrollsequenzen mit den Wirtszellsystemen kompatibel sind.
Auch spezifische Initiationssignale können für eine effiziente Translation der beanspruchten isolierten kodierenden Nukleinsäure-Sequenzen notwendig sein. Diese Signale umfassen das ATG-Initiationskodon und angrenzende Sequenzen. Exogene Translationskontrollsignale, einschließlich des ATG-Initiationskodons, könnten zusätzlich erforderlich sein. Der Fachmann wäre problemlos dazu in der Lage, diese Notwendigkeit zu erkennen und die notwendigen Signale bereitzustellen. Es ist hinlänglich bekannt, dass das Initiationskodon im selben Leserahmen (in-frame oder in-phase) mit der gewünschten kodierenden Sequenz sein muss, um die Translation der vollständigen eingefügten Sequenz zu gewährleisten. Diese exogenen Translations-Kontrollsignale und Initiationskodons können vielfältiger Herkunft sein, sowohl natürlicher als auch synthetischer. Die Effizienz der Expression kann durch Einschluss geeigneter Transkriptions-Enhancer-Elemente oder Transkriptions-Terminatoren verbessert werden (Bittner et al., 1987).
Bei der eukaryotischen Expression wird man darüber hinaus üblicherweise anstreben, in die Transkriptionseinheit eine geeignete Polyadenylierungsstelle (z.B. 5'-AATAAA-3') einzubauen, wenn in dem ursprünglich klonierten Segment keine enthalten war. Üblicherweise liegt die Stelle, an der polyA hinzugefügt wird, etwa 30 bis 2000 Nukleotide "stromabwärts" von der Terminationsstelle des Proteins an einer Position vor der Transkriptionstermination.
Für die langfristige Produktion rekombinanter Proteins mit hoher Ausbeute wird eine stabile Expression bevorzugt. Zum Beispiel können Zelllinien konstruiert werden, die stabil für Proteine kodierende Konstrukte exprimieren. Statt Expressionsvektoren zu verwenden, die virale Replikationsursprünge enthalten, können Wirtszellen mit Vektoren, die durch geeignete Expressions-Kontrollelemente kontrolliert werden (z.B. Promotor, Enhancer, Sequenzen, Transkriptionsterminatoren, Polyadenylierungsstellen etc.), und einem selektierbaren Marker transformiert werden. Nach Einbringen der fremden DNA kann man es den manipulierten Zellen erlauben, für 1 bis 2 Tage in einem angereicherten Medium zu wachsen; anschließend werden sie auf ein Selektionsmedium übertragen. Der selektierbare Marker in dem rekombinanten Plasmid verleiht Resistenz gegen die Selektion und erlaubt es den Zellen, das Plasmid stabil in ihre Chromosomen zu integrieren und unter Bildung von Foci zu wachsen, die wiederum kloniert und zu Zelllinien expandiert werden können.
Es wird in Betracht gezogen, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren "überexprimiert" werden können, d.h. dass sie im Verhältnis zu ihrer natürlichen Expression in menschlichen Zellen oder sogar im Verhältnis zu der Expression anderer Proteine in der rekombinanten Wirtszelle im verstärkten Ausmaß exprimiert werden können. Eine solche Überexpression kann durch eine Vielzahl von Methoden, einschließlich radioaktiver Markierung und/oder Proteinaufreinigung, bestimmt werden. Einfache und direkte Methoden werden jedoch bevorzugt, z.B. solche, die eine SDS-PAGE und Proteinfärbung oder Westernblot umfassen, gefolgt von quantitativen Analysen, wie densitometrischem Scannen des erhaltenen Gels oder Blots. Eine spezifische Zunahme der Menge an rekombinantem Protein oder Peptid im Ver gleich zu der Menge in natürlichen menschlichen Zellen weist auf Überexpression hin, ebenso wie eine relative Anhäufung des spezifischen Proteins im Verhältnis zu anderen durch die Wirtszelle hergestellten Proteinen, und z.B. Sichtbarkeit auf einem Gel.
II. Bereitstellung
In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung kann das Expressionskonstrukt einen Virus oder ein manipuliertes, von einem viralen Genom abgeleitetes Konstrukt umfassen. Die Fähigkeit bestimmter Viren, über Rezeptor-vermittelte Endocytose in Zellen einzudringen und in das Wirtszellgenom zu integrieren und stabil und effizient virale Gene zu exprimieren, haben sie zu attraktiven Kandidaten für den Transfer fremder Gene in Säugerzellen gemacht (Ridgeway, 1988; Nicolas und Rubenstein, 1988; Baichwal und Sugden, 1986; Temin, 1986). Die ersten als Vektoren verwendeten Viren waren DNA-Viren, einschließlich der Papovaviren (Simian Virus 40, Bovines Papillomavirus und Polyoma) (Ridgeway, 1988; Baichwal und Sugden, 1986) und Adenoviren (Ridgeway, 1988; Baichwal und Sugden, 1986) und Adenoassoziierten Viren. Auch Retroviren sind attraktive Gentransfervehikel (Nicolas und Rubenstein, 1988; Temin, 1986), ebenso wie Vaccinia-Virus (Ridgeway, 1988) und Adeno-assoziiertes Virus (Ridgeway, 1988). Solche Vektoren können verwendet werden, um (i) Zelllinien in vitro zum Zwecke der Expression von Proteinen von Interesse zu transformieren oder (ii) Zellen in vitro oder in vivo zu transformieren, um therapeutische Polypeptide in einem Gentherapie-Szenario bereitzustellen. Das Herpes simplex Virus (HSV) ist ein weiterer attraktiver Kandidat, insbesondere wenn Neurotropismus erwünscht ist. HSV ist ferner relativ einfach zu manipulieren und kann bis zu hohen Titern angezüchtet werden. Damit ist die Bereitstellung ein geringeres Problem, sowohl in Bezug auf die für das Erreichen einer ausreichender MOI benötigen Volumina als auch in Bezug auf einen verminderten Bedarf an Wiederholungsdosierungen.
Mit der kürzlichen Entdeckung defekter Hepatitis B Viren wurden neue Einsichten in die Beziehung zwischen Struktur und Funktion von verschiedenen viralen Sequenzen gewonnen. In vitro-Studien zeigten, dass das Virus die Fähigkeit zur Helferabhängigen Verpackung und Reversen Transkription trotz der Deletion von bis zu 80 % seines Genoms bewahren konnte (Horwich et al., 1990). Dies legte nahe, dass große Teile des Genoms durch fremdes genetisches Material ersetzt werden könnten. Der Hepatotropismus und die Persistenz (Integration) waren besonders attraktive Eigenschaften für einen auf die Leber gerichteten Gentransfer. Chang et al. führten kürzlich anstelle der Polymerase, Oberflächen und Prä-Oberflächen kodierenden Sequenzen das Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)-Gen in das Genom eines Enten-Hepatitis B Virus ein. Es wurde mit Wildtyp-Virus in eine Vogel-Hepatom-Zelllinie cotransfiziert. Kulturmedien, die hohe Titer des rekombinanten Virus enthielten, wurden verwendet, um primäre Entenküken-Hepatozyten zu infizieren. Eine stabile CAT-Genexpression wurde für mindestens 24 Tage nach der Transfektion detektiert (Chang et al., 1991).
Mehrere nicht-virale Verfahren zum Transfer von Expressionskonstrukten in kultivierte Säugetierzellen werden erfindungsgemäß ebenfalls in Betracht gezogen. Diese umfassen Calciumphosphatpräzipitation (Graham und Van Der Eb, 1973; Chen und Okayama, 1987; Rippe et al., 1990), DEAE-Dextran (Gopal, 1985), Elektroporation (Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984), direkte Mikroinjektion (Harland und Weintraub, 1985), DNA-beladene Liposomen (Nicolau und Sene, 1982; Fraley et al., 1979) und Lipofectamin-DNA-Komplexe, Ultraschallbehandlung von Zellen (Fechheimer et al., 1987) Gen-Bombardement unter Verwendung von Mikroprojektilen mit hoher Geschwindigkeit (Yang et al., 1990) und Rezeptor-vermittelte Transfektion (Wu und Wu, 1987; Wu und Wu, 1988). Einige dieser Techniken können erfolgreich für in vivo- oder ex vivo-Verwendung angepasst werden.
Sobald das Expressionskonstrukt in der Zelle bereitgestellt wurde, kann die für das Gen von Interesse kodierende Nukleinsäure an verschiedenen Orten positioniert und exprimiert werden. In bestimmten Ausführungsformen kann die für das Gen kodierende Nukleinsäure stabil in das Genom der Zelle integriert werden. Diese Integration kann über homologe Rekombination in verwandter Lokalisierung und Orientierung stattfinden (Ersetzen eines Gens) oder es kann an einem zufälligen, nicht spezifischen Ort integriert werden (Vermehrung eines Gens). In noch anderen Ausführungsformen kann die Nukleinsäure in der Zelle stabil als getrenntes episomales DNA-Segment beibehalten werden. Solche Nukleinsäuresegmente oder "Episomen" kodieren für Sequenzen, die ausreichen, um den Erhalt und die Replikation unabhängig von oder synchron mit dem Zellzyklus des Wirts zu erlauben. Wie das Expressionskonstrukt einer Zelle bereitgestellt wird und wo in der Zelle die Nukleinsäure verbleibt, hängt von der Art des verwendeten Expressionskonstrukts ab.
In einer Ausführungsform kann das Expressionskonstrukt einfach aus nackter rekombinanter DNA oder aus Plasmiden bestehen. Der Transfer des Konstrukts kann mit jeder der oben erwähnten Methoden durchgeführt werden, die die Zellmembran physikalisch oder chemisch durchlässig machen. Dies trifft insbesondere für den in vitro Transfer zu, kann jedoch auch bei in vivo Verwendungen angewendet werden. Dubensky et al. (1984) injizierten erfolgreich DNA des Polyoma-Virus in Form von Calciumphosphatpräzipitaten in Leber und Milz von erwachsenen und neugeborenen Mäusen und zeigten aktive virale Replikation und akute Infektion. Benvenisty und Neshif (1986) zeigten ferner, dass direkte intraperitoneale Injektion von Calciumphosphat-gefällten Plasmiden zur Expression der transfizierten Gene führt. Es ist vorhergesehen, dass DNA, die für ein Gen von Interesse kodiert, in ähnlicher Weise ebenfalls in vivo transferiert werden kann und das Genprodukt exprimiert.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung für den Transfer eines nackten DNA-Expressionskonstrukts oder DNA-Segments in Zellen kann Partikelbombardement umfassen. Dieses Verfahren hängt von der Fähigkeit ab, DNA-bedeckte Mikroprojektile auf eine hohe Geschwindigkeit zu beschleunigen, was ihnen erlaubt, Zellmembranen zu durchdringen und in Zellen zu gelangen, ohne diese zu töten (Klein et al., 1987). Es wurden mehrere Vorrichtungen zur Beschleunigung kleiner Partikel entwickelt. Eine solche Vorrichtung basiert auf einer Entladung von hoher Spannung, um einen elektrischen Stromfluss herzustellen, der wiederum die bewegende Kraft bereitstellt (Yang et al., 1990). Die verwendeten Mikroprojektile bestanden aus biologisch inerten Substanzen wie Wolfram- oder Goldkügelchen.
Ausgewählte Organe, einschließlich Leber, Haut und Muskelgewebe von Ratten und Mäusen, wurden in vivo einem Bombardement unterzogen (Yang et al., 1990; Zelenin et al., 1991). Dies kann das chirurgische Exponieren des Gewebes oder der Zellen voraussetzen, um sämtliches störende Gewebe zwischen Vorrichtung und Zielorgan zu eliminieren, d.h. ex vivo-Behandlung. Eine DNA, die ein bestimmtes Gen kodiert, kann wiederum mit diesen Verfahren bereitgestellt werden und immer noch Teil der vorliegenden Erfindung sein.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann das DNA-Segment oder Expressionskonstrukt in einem Liposom eingeschlossen sein. Liposomen sind vesikuläre, durch eine Phospolipiddoppelschicht-Membran und ein inneres wässriges Medium charakterisierte Strukturen. In multilamellaren Liposomen sind mehrere Lipidschichten durch wässriges Medium getrennt. Sie bilden sich spontan, wenn Phospholipide in einem Überschuss wässriger Lösung suspendiert werden. Die Lipidkomponenten durchlaufen vor der Bildung geschlossener Strukturen eine selbstständigen Umlagerung und schließen Wasser und gelöste Substanzen zwischen den Lipiddoppelschichten ein (Gosh und Bachhawat, 1991). Auch Lipofectamin-DNA-Komplexe werden in Betracht gezogen.
Die durch Liposomen vermittelte Bereitstellung von Nukleinsäure und die Expression von DNA war in vitro sehr erfolgreich. Wong et al. (1980) haben die Durchführbarkeit einer Liposomenvermittelter Bereitstellung und Expression von fremder DNA in kultivierten Hühnerembryonen-, HeLa- und Hepatomzellen gezeigt. Nicolau et al. (1987) erreichten einen erfolgreichen Liposomen-vermittelten Gentransfer in Ratten nach intravenöser Injektion.
In bestimmten Ausführungsformen kann das Liposom mit einem hemagglutinierenden Virus (HVJ) komplexiert sein. Es wurde gezeigt, dass dies die Fusion mit der Zellmembran erleichtert und den Eintritt Liposomen-verkapselter DNA in die Zelle fördert (Kaneda et al., 1989). In anderen Ausführungsformen kann das Liposom mit nukleären chromosomalen nicht-Histon-Proteinen (HMG-1) komplexiert sein oder in Verbindung mit diesen verwendet werden (Kato et al., 1991). In noch anderen Ausführungsformen kann das Liposom sowohl mit HVJ als auch mit HMG-1 komplexiert sein oder in Verbindung mit diesen verwendet werden. Dadurch, dass solche Expressionskonstrukte erfolgreich beim Transfer und der Expression von Nukleinsäure in vitro und in vivo verwendet wurden, sind sie für die vorliegende Erfindung anwendbar. Bei Verwendung eines bakteriellen Promotors in dem DNA-Konstrukt wird es darüber hinaus gewünscht sein, eine geeignete bakterielle Polymerase in dem Liposom einzuschließen.
Andere Expressionskonstrukte, die für die Bereitstellung einer für ein bestimmtes Gen kodierenden Nukleinsäure in Zellen ge nutzt werden können, sind Vehikel für die Rezeptor-vermittelte Bereitstellung. Diese nutzen die selektive Aufnahme von Makromolekülen durch Rezeptor-vermittelte Endozytose in fast allen eukaryotischen Zellen aus. Wegen der Zelltyp-spezifischen Verteilung verschiedener Rezeptoren kann die Bereitstellung hochspezifisch sein (Wu und Wu, 1993).
Vehikel für Rezeptor-vermittelten gezielten Gentransfer bestehen im Allgemeinen aus zwei Komponenten: einem Zellrezeptorspezifischen Liganden und einem DNA-bindenden Mittel. Mehrere Liganden wurden für Rezeptor-vermittelten Gentransfer verwendet. Die am ausführlichsten charakterisierten Liganden sind Asialoorosomucoid (ASOR) (Wu und Wu, 1987) und Transferrin (Wagner et al., 1990). Kürzlich wurde ein synthetisches Neoglykoprotein, welches denselben Rezeptor wie ASOR erkennt, als Vehikel zur Bereitstellung eines Gens verwendet (Ferkol et al., 1993; Perales et al., 1994), und auch epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) wurde verwendet, um Gene in Plattenepithelkarzinom-Zellen einzubringen (Myers, EPO 0 273 085).
In anderen Ausführungsformen kann das Vehikel zur Bereitstellung einen Liganden und ein Liposom umfassen. Nicolau et al. (1987) verwendeten zum Beispiel in Liposomen inkorporiertes Lactosylceramid, ein Asialgangliosid mit terminaler Galaktose, und beobachteten eine Steigerung der Aufnahme des Insulin-Gens durch Hepatozyten. Es ist daher möglich, dass eine für ein bestimmtes Gen kodierende Nukleinsäure auch spezifisch in eine Zellart wie Lungen-, Epithel- oder Tumorzellen mit oder ohne Liposomen durch eine beliebige Anzahl von Rezeptor-Ligandensystemen eingebracht werden kann.
In bestimmten Ausführungsformen kann ein Gentransfer unter ex vivo-Bedingungen leichter durchgeführt werden. Ex vivo-Gentherapie bezieht sich auf die Isolation von Zellen aus einem Organismus, die in vitro-Bereitstellung einer Nukleinsäure in den Zellen und die anschließende Zurückführung der modifizierten Zellen in einen Organismus. Dies kann die chirurgische Entfernung von Gewebe/Organen aus einem Tier oder einer primären Kultur von Zellen und Geweben umfassen. Anderson et al., US-Patent 5,399,346, das in seiner Gesamtheit eingeschlossen ist, offenbart therapeutische ex vivo-Verfahren.
F. Oligonukleotidsynthese
Die Oligonukleotidsynthese ist Fachleuten hinlänglich bekannt. Mehrere verschiedene Mechanismen der Oligonukleotidsynthese wurden z.B. in den US-Patenten 4,659,774, 4,816,571, 5,141,813, 5,264,566, 4,959,463, 5,428,148, 5,554,744 5,574,146, 5,602,244 offenbart, die jeweils durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
Die Phosporamidit-Chemie (Beaucage und Lyer, 1992) ist zur bei weitem meist verwendeten Kopplungschemie für die Synthese von Oligonukleotiden geworden. Wie dem Fachmann hinlänglich bekannt ist, umfasst die Phosphoramiditsynthese von Oligonukleotiden die Aktivierung von monomeren Nukleosid-Phosphoramidit-Vorläufern durch Reaktion mit einem Aktivierungsmittel, wobei aktivierte Zwischenprodukte gebildet werden, gefolgt von sequentieller Addition der aktivierten Zwischenprodukte an die wachsende Oligonukleotidkette (die im Allgemeinen an einem Ende an einem geeigneten festen Träger verankert ist), um das Oligonukleotidprodukt zu bilden.
Tetrazol wird häufig für die Aktivierung von Nukleosid-Phosphoramidit-Monomeren genutzt. Tetrazol weist ein saures Proton auf, das wahrscheinlich den basischen Stickstoff der Diisopropylaminophosphingruppe protoniert und damit die Diisopropylaminogruppe zu einer Abgangsgruppe macht. Das negativ geladene Tetrazoliumion greift dann den trivalenten Phosphor an und bildet eine transiente Phosphor-Tetrazolid-Spezies. Die 5'-OH-Gruppe des an den festen Träger gebundenen Nukleosids greift dann die aktive trivalente Phosphor-Spezies an, was zur Bildung der Bindung zwischen den Nukleotiden führt. Der trivalente Phosphor wird schließlich zu dem pentavalenten Phosphor oxidiert. Die oben aufgeführten US-Patente beschreiben andere Aktivatoren und feste Träger für die Oligonukleotidsynthese.
Eine Oligonukleotidsynthese mit hohem Durchsatz kann unter Verwendung eines Synthesegeräts erreicht werden. Der Genome Science and Technology Center hat, als einen Aspekt im Zuge der Anstrengung bei der Entwicklung der Automatisierung, kürzlich ein Hochdurchsatz-Oligonukleotid-Synthesegerät in großem Maßstab entwickelt. Dieses als MERMADE bezeichnete Instrument basiert auf einem Plattenformat mit 96 Vertiefungen und benutzt Roboterkontrolle, um die parallele Synthese bei 192 Proben (2 Platten mit 96 Vertiefungen) durchzuführen. Diese Vorrichtung wurde verschiedentlich in der Literatur und in Präsentationen beschrieben, und ist im Allgemeinen der Öffentlichkeit zugänglich (lizensiert von der Universität of Texas und per Vertrag von Avantec erhältlich). Die Vorrichtung hat verschiedene Generationen mit unterschiedlichen Funktionsparametern durchlaufen.
Die Vorrichtung kann verwendet werden, um mit 99%igem Erfolg 192 Oligonukleotide gleichzeitig zu synthetisieren. Der Erfolg beträgt bei Oligomeren von weniger als 60 bp annähernd 100 %; es arbeitet bei Synthesemengen von 20 mM und führt zu einer Produktausbeute von mehr als 99 % vollständige Synthese. Unter Verwendung dieser Systeme hat der Erfinder über 10.000 Oligomere synthetisiert, die für die Sequenzierung, PCR^TM-Amplifikation und rekombinante DNA-Anwendungen verwendet wurden. Für die meisten Verwendungen, einschließlich der Klonierung, ist der Syntheseerfolg ausreichend, sodass keine Aufreinigung nach der Synthese erforderlich ist.
Sobald das Genom unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung synthetisiert worden ist, kann es notwendig sein, die Sequenzen bezüglich einer Funktionsanalyse mittels Screening zu untersuchen. Insbesondere wird durch den Erfinder Chip-basierte DNA-Technologie vorgeschlagen, die z.B. von Hacia et al. (1996) und Shoemaker et al. (1996) beschrieben wird. Diese Techniken umfassen quantitative Verfahren zur schnellen und genauen Analyse einer großen Anzahl von Genen. Durch die Markierung von Genen mit Oligonukleotiden oder die Verwendung von Arrays mit fixierten Sonden kann man Chip-Technologie verwenden, um Zielmoleküle als Arrays hoher Dichte zu trennen und diese Moleküle auf der Grundlage von Hybridisierung mittels Screening zu untersuchen. Siehe auch Pease et al. (1994); Fodor et al. (1991).
Die Verwendung von kombinatorischer Synthese und Hochdurchsatz-Screeningassays ist dem Fachmann hinlänglich bekannt, z.B. 5,807,754; 5,807,683; 5,804,563; 5,789,162; 5,783,384; 5,770,358; 5,759,779; 5,747,334; 5,686,242; 5,198,346; 5,738,996; 5,773,743; 5,714,320; 5,663,046 (wobei jedes ausdrücklich durch Bezugnahme eingeschlossen ist). Diese Patente lehren verschiedene Aspekte der Verfahren und Zusammensetzungen, die an dem Zusammensetzen und den Aktivitätsanalysen von Arrays hoher Dichte mit verschiedenen Polyuntereinheiten (Polynukleotide oder Polypeptide) beteiligt sind. Es wird somit in Betracht gezogen, dass die in den oben aufgeführten Patenten beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen beim Bestimmen der Aktivitätsprofile der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen nützlich sein können.
Die vorliegende Erfindung stellt ein replikationskompetentes Polynukleotid her. Viren sind natürliche replikationskompetente DNA-Stücke; in dem Ausmaß, in dem eine Offenbarung in Bezug auf Viren im Rahmen der vorliegenden Erfindung nützlich sein kann, stellt das Folgende eine Offenbarung bezüglich Viren dar. Forscher stellen fest, dass Viren sich so entwickelt haben, dass sie in der Lage sind, ihre DNA trotz der verschiedenen Abwehrmechanismen des menschlichen Körpers in verschiedene Wirtsgewebe einzubringen. Aus diesem Grund wurde von Forschern, die versuchten, Vehikel für die Bereitstellung von therapeutischen Genen herzustellen, eine Vielzahl viraler Vektoren entworfen. Einige der Virusarten, die konstruiert wurden, sind nachfolgend aufgelistet.
II. Adenovirus
Ein Adenovirus ist ein lineares doppelsträngiges DNA-Virus von 36 kb, das den Austausch großer Stücke adenoviraler DNA gegen fremde Sequenzen von bis zu 7 kb erlaubt (Grunhaus und Horwitz, 1992). Adenovirus-DNA integriert nicht in das Wirtszellchromosom, da adenovirale DNA sich auf episomale Weise replizieren kann. Adenoviren sind ferner strukturell stabil, und es wurde keine Genomumlagerung nach ausgedehnter Amplifikation festgestellt. Das Adenovirus kann annähernd alle Epithelzellen unabhängig von ihrem Zellzyklusstadium infizieren. Das heißt, das das Adenovirus Zellen infizieren kann, die sich nicht teilen. Bisher scheint eine adenovirale Infektion nur mit einer milden Erkrankung, wie beispielsweise einer akuten respiratorischen Erkrankung beim Menschen, verbunden zu sein. Diese Gruppe von Viren kann in hohen Titern erhalten werden, z.B. 10⁹-10¹¹ plaquebildende Einheiten pro ml, und sie sind hoch infektiös.
Beide Enden des viralen Genoms enthalten 100 bis 200 bp invertierte Wiederholungen (inverted repeats, ITRs), die für die virale DNA-Replikation und Verpackung notwendige cis-Elemente darstellen. Die frühen (early, E) und späten (late, L) Regionen des Genoms enthalten verschiedene Transkriptionseinheiten, die nach dem Beginn der viralen DNA-Replikation getrennt werden. Die E1-Region (E1A und E1B) kodiert für Proteine, die für die Regulation der Transkription des viralen Genoms und einiger zellulärer Gene verantwortlich sind. Die Expression der E2-Region (E2A und E2B) führt zur Synthese von Proteinen für die virale DNA-Replikation. Diese Proteine sind an der DNA-Replikation, der Expression später Gene und der Abschaltung der Wirtszelle beteiligt (Renan, 1990). Die Produkte der späten Gene, einschließlich der Mehrzahl der viralen Capsidproteine, werden erst nach eingehender Prozessierung eines einzelnen primären Transkripts exprimiert, das ausgehend von dem Haupt-Späten Promotor (major late promotor, MLP) synthetisiert wird. Der MLP (bei 16,8 m.u. lokalisiert) ist während der späten Phase der Infektion besonders effizient, und alle mRNAs, die ausgehend von diesem Promotor gebildet werden, besitzen eine 5'-Tripartite-Leadersequenz (TPL), was sie zu bevorzugten mRNAs für die Translation macht.
Die E3-Region kodiert für Proteine, die für eine effiziente Lyse von Ad-infizierten Zellen sowie für das Verhindern von TNF-vermittelter Cytolyse und CTL-vermittelter Lyse infizierter Zellen notwendig zu sein scheinen. Im Allgemeinen geht man davon aus, dass die E4-Region für 7 Proteine kodiert, von denen einige den E2-Promotor aktivieren. Es wurde gezeigt, dass dies den mRNA-Transport des Wirts blockiert und Transport viraler RNA ins Cytoplasma verbessert. Darüber hinaus ist das E4-Produkt zum Teil für die spät in der Infektion zu beobachtende Abnahme der Expression früher Gene verantwortlich. E4 inhibiert darüber hinaus die Expression von E1A und E4 (nicht aber von E1B) während des lytischen Wachstums. Einige E4-Proteine sind für die effiziente DNA-Replikation notwendig; der Mechanismus dieser Beteiligung ist jedoch unbekannt. E4 ist ferner an post-transkriptionellen Ereignissen der späten viralen Genexpression beteiligt; d.h. an alternativem Spleißen des Tripartite-Leaders bei lytischem Wachstum. Dennoch werden E4-Funktionen für die DNA-Replikation nicht unbedingt benötigt; ihr Fehlen wird jedoch die Replikation verzögern. Andere Funktionen umfassen die negative Regulation der viralen DNA-Synthese, die Induktion der normalerweise während der Adenovirus-Infektion zu beobachtenden subnukleären Reorganisation, und andere Funktionen, welche für die virale Replikation, die Akkumulation später viraler mRNA und das Abschalten der Wirtszelltranskription notwendig sind.
II. Retroviren
Die Retroviren sind eine Gruppe einzelsträngiger RNA-Viren, die durch eine Fähigkeit gekennzeichnet sind, ihre RNA in infizierten Zellen durch ein Verfahren der Reversen Transkription in doppelsträngige DNA umzuwandeln (Coffin, 1990). Die erhaltene DNA integriert sich anschließend stabil als Pro-Virus in zelluläre Chromosomen und steuert die Synthese viraler Proteine. Die Integration führt zur Retention der viralen Gensequenzen in der Empfängerzelle und ihren Nachkommen. Das retrovirale Genom enthält drei Gene, gaq, pol und env, die für Capsidproteine, Polymerase-Enzym bzw. Hüllkomponenten kodieren. Eine stromaufwärts des gag-Gens gefundene Sequenz, die als Y-Komponente bezeichnet wird, wird konstruiert (Mann et al. 1983). Wenn ein rekombinantes Plasmid, das humane cDNA enthält, zusammen mit den retroviralen LTR- und Ψ-Sequenzen in diese Zelllinie eingebracht wird (z.B. durch Calciumphosphat-Präzipitation), erlaubt die Ψ-Sequenz dem RNA-Transkript des rekombinanten Plasmids, in virale Partikel verpackt zu werden, die dann in das Kulturmedium ausgeschieden werden (Nicolas und Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Man et al., 1983). Das die rekombinanten Retroviren enthaltende Medium wird anschließend gesammelt, gegebenenfalls aufkonzentriert und zum Gentransfer verwendet. Retrovirale Vektoren sind in der Lage, eine große Vielzahl von Zelltypen zu infizieren. Zur Integration ist jedoch die Teilung der Wirtszellen nötig (Paskind et al., 1975).
Die Retrovirus-Familie umfasst die Unterfamilien der Onkoviren, der Lentiviren und der Spumaviren. Zwei Onkoviren sind das Moloney murine Leukämievirus (MMLV) und das feline Leukämievirus (FeLV). Die Lentiviren umfassen das humane Immundefizienzvirus (HIV), das Affen-Immundefizienzvirus (SIV) und das feline Immundefizienzvirus (FIV). Unter den murinen Viren wie MMLV gibt es eine weitere Einteilung. Murine Viren können ecotrop, xenotrop, polytrop oder amphotrop sein. Jede Klasse von Viren zielt auf unterschiedliche Zelloberflächenrezeptoren, um die Infektion zu initiieren.
Weitere Fortschritte beim Entwerfen retroviraler Vektoren und bei Konzentrationsverfahren haben die Produktion amphotroper und xenotroper Viren mit Titern von 10⁸ bis 10⁹ cfu/ml ermöglicht (Bowles et al., 1996; Irwin et al., 1994; Jolly, 1994; Kitten et al., 1997).
Replikationsdefekte rekombinante Retroviren sind in Primaten keine akuten Pathogene (Chowdhury et al., 1991). Sie wurden erfolgreich in Zellkultursystemen verwendet, um das CFTR-Gen zu transferieren und cAMP-aktivierte Cl^--Sekretion in einer Vielzahl von Zellarten, einschließlich menschlichen Luftröhrenepithels, zu bewirken (Drumm et al., 1990, Olsen et al., 1992; Anderson et al., 1991; Olsen et al., 1993). Obwohl es Beweise für Immunantworten gegen virale gag- und env-Proteine gibt, verhindert dies nicht die erfolgreiche Wiederverabreichung des Vektors (McCormack et al., 1997). Da rekombinante Retroviren außer dem Transgen keine exprimierten Genprodukte aufweisen, ist ferner das Risiko einer inflammatorischen Antwort des Wirts aufgrund der viralen Proteinexpression begrenzt (McCormack et al., 1997). Bezüglich der Bedenken gegen eine Insertions-Mutagenese gibt es bislang keine Beispiele für In sertions-Mutagenese aus irgendeinem menschlichen Versuch mit rekombinanten retroviralen Vektoren.
Kürzlich wurden lentivirale Hybrid-Vektoren beschrieben, in denen Elemente des humanen Immundefizienzvirus (HIV) (Naldini et al., 1996) oder des felinen Immundefizienzvirus (FIV) (Poeschla et al., 1998) und MMLV kombiniert wurden. Diese Vektoren transduzieren sich nicht teilende Zellen im ZNS (Naldini et al., 1996; Blomer et al., 1997), in der Leber (Kafri et al., 1997), im Muskel (Kafri et al., 1997) und der Retina (Miyoshi et al., 1997). Ein kürzlicher Bericht von Xenotransplantationsmodellen des menschlichen Luftröhrenepithels läßt darauf schliessen, dass in gut differenzierten Epithelien ein Gentransfer mit VSV-G-pseudotypisiertem, auf HIV basierenden Lentivirus ineffizient ist (Goldman et al., 1997).
III. Adeno-assoziiertes Virus
Darüber hinaus besitzt AAV mehrere einzigartige Merkmale, die es gegenüber anderen Vektoren vorteilhafter machen. Anders als Retroviren kann AAV Zellen infizieren, die sich nicht teilen; Wildtyp-AAV wurde durch Orts-spezifische Integration in das Chromosom 19 humaner Zellen charakterisiert (Kotin und Berns, 1989; Kotin et al., 1990; Kotin et al., 1991; Samulsiki et al., 1991); und AAV besitzt ferner anti-onkogene Eigenschaften (Ostrove et al., 1981; Berns und Giraud, 1996). Rekombinante AAV-Genome werden durch molekulare Klonierung von DNA-Sequenzen von Interesse zwischen die ITRs von AAV konstruiert, wobei die vollständigen kodierenden Sequenzen des Wildtyp AAV-Genoms eliminiert werden. Den so hergestellten AAV-Vektoren fehlt jegliche kodierende Sequenz des Wildtyp AAVs, sie besitzen jedoch sowohl bei einer in vitro als auch bei einer in vivo Transduktion die Eigenschaft der stabilen Chromosomen-Integration und der Expression der rekombinanten Gene (Berns, 1990; Berns und Bohenksy, 1987; Bertran et al., 1996; Kearns et al., 1996; Ponnazhagan et al., 1997a). Bis vor kurzem hat man geglaubt, dass AAV nahezu alle Zellarten infiziert, sogar über Spezies-Barrieren hinweg. Es wurde jedoch nunmehr festgestellt, dass die AAV-Infektion Rezeptor-vermittelt erfolgt (Ponnazhagan et al., 1996; Mizukami et al., 1996).
AAV nutzt eine lineare, einzelsträngige DNA von etwa 4700 Basenpaaren. Invertierte terminale Wiederholungen (inverted terminal repeats) flankieren das Genom. In dem Genom gibt es zwei Gene, die zu mehreren verschiedenen Genprodukten führen. Das erste, das cap-Gen, stellt drei verschiedene Virionproteine (VP) her, die als VP-1, VP-2 und VP-3 bezeichnet werden. Das zweite, das rep-Gen, kodiert für vier nicht-strukturelle Proteine (NS). Eines oder mehrere dieser rep-Genprodukte sind für die Transaktivierung der AAV-Transkription verantwortlich. Die Sequenz von AAV wird in Srivastava et al. (1983) und in US-Patent 5,252,479 bereitgestellt (der vollständige Text derselben ist durch Bezugnahme ausdrücklich eingeschlossen).
Die drei Promotoren von AAV werden durch ihre Lokalisierung im Genom in Kartierungseinheiten (map units) bezeichnet. Diese sind von links nach rechts p5, p19 und p40. Die Transkription führt zu sechs Transkripten, wobei jeweils zwei von jedem der drei Promotoren ausgehen, und wovon eines von jedem Paar gespleißt wird. Die Spleißstelle, abgeleitet von den Kartierungseinheiten 42-46, ist für jedes Transkript die gleiche. Die vier nicht-strukturellen Proteine scheinen von dem längeren der Transkripte abgeleitet zu sein und die drei Virionproteine entstehen alle vom kleinsten Transkript.
AAV ist nicht mit irgendeinem pathologischen Zustand bei Menschen assoziiert. Interessanterweise bedarf AAV für eine effiziente Replikation einer "Helfer"-Funktionen durch Viren wie das Herpes simplex Virus I und II, das Cytomegalovirus, das Pseudorabiesvirus und selbstverständlich das Adenovirus. Der am besten charakterisierte Helfer ist das Adenovirus, und es wurde gezeigt, dass viele "frühe" Funktionen dieses Virus bei die AAV-Replikation unterstützen. Es wird angenommen, dass ein geringes Ausmaß der Expression von AAV rep-Proteinen die strukturelle Expression von AAV begrenzt, und man glaubt, dass die Infektion mit einem Helfervirus diese Blockade beseitigt.
IV. Vacciniavirus
Vacciniaviren sind eine Gattung der Pockenvirus-Familie. Vacciniavirus-Vektoren wurden wegen der Einfachheit ihrer Konstruktion, der relativ hohen erhaltenen Expressionsspiegel, des breiten Wirtsspektrums und der großen Kapazität, DNA aufzunehmen, in erheblichem Umfang genutzt. Vaccinia enthält ein lineares doppelsträngiges DNA-Genom von etwa 186 kb, das eine deutliche "A-T"-Präferenz zeigt. Invertierte terminale Wiederholungen von etwa 10,5 kb flankieren das Genoms. Die Mehrzahl der essentiellen Gene scheint innerhalb der zentralen Region zu kartieren, die bei Pockenviren am stärksten konserviert ist. Geschätzte offene Leserahmen in Vacciniavirus-Zellen liegen im Bereich von zwischen 150 und 200. Obwohl beide Stränge kodierend sind, ist eine erhebliche Überlappung der Leserahmen nicht üblich. US-Patent 5,656,465 (ausdrücklich durch Bezugnahme eingeschlossen) beschreibt die in vivo-Bereitstellung eines Gens unter Verwendung von Pockenviren.
V. Papovavirus
Die Papovavirus-Familie umfasst die Papillomaviren und die Polyomaviren. Die Polyomaviren umfassen das Simian Virus 40 (SV40), das Polyomavirus und die menschlichen Polyomaviren BKV und JCV. Papilloma-Viren umfassen die bovinen und humanen Papillomaviren. Die Genome von Polyomaviren sind zirkuläre DNAs von etwas mehr als 5000 Basen. Die vorherrschenden Genprodukte sind drei Virionproteine (VP1-3) sowie das große T-Antigen und das kleine T-Antigen. Einige weisen ein zusätzliches Strukturprotein, das Agno-Protein, auf und andere weisen ein mittleres T-Antigen auf. Papillomaviren sind etwas größer, etwa 8 kb.
Über die zellulären Rezeptoren der Polyomaviren ist wenig bekannt. Die Polyomainfektion kann jedoch durch Behandlung mit Sialidase blockiert werden. SV40 infiziert Sialidase-behandelte Zellen zwar noch, aber JCV kann bei Sialidase-behandelten Zellen nicht zur Hämagglutination führen. Da die Interaktion von Polyoma VP1 mit der Zelloberfläche c-myc und c-fos aktiviert, wurde die Hypothese aufgestellt, dass der Virusrezeptor einige Eigenschaften eines Wachstumsfaktor-Rezeptors aufweist. Papillomaviren sind hinsichtlich ihrer Infektion spezifisch für Plattenepithelien, obwohl der spezifische Rezeptor nicht identifiziert wurde.
VI. Paramyxovirus
Die Paramyxovirus-Familie ist in drei Gattungen eingeteilt: Paramyxovirus, Morbillivirus und Pneumovirus. Die Paramyxovirus-Gattung umfasst unter anderem das Mumpsvirus und das Sendai-Virus, während die Morbilliviren das Masernvirus umfassen und die Pneumoviren das Respiratorische Syntcytial Virus (RSV) umfassen. Paramyxovirus-Genome basieren auf RNA und enthalten eine Gruppe von sechs oder mehr Genen, die in einer. Reihe hintereinander kovalent miteinander verbunden sind (in tandem). Das Genom hat eine Länge von etwas mehr als 15 kb. Das virale Partikel weist einen Durchmesser von 150-250 nm auf, mit "unscharfen" Vorsprüngen oder Spitzen, die aus ihm hinausragen.
Dabei handelt es sich um virale Glykoproteine, die bei der Vermittlung von Anheftung und Eintritt des Virus in die Wirtszellen helfen.
An der Bindung und dem Eintritt von Paramyxoviren ist eine Reihe von spezialisierten Proteinen beteiligt. Die Anheftung wird bei Paramyxoviren und Morbilliviren von Glykoproteinen vermittelt, die an Rezeptoren binden, welche Sialinsäure enthalten. Andere Proteine verankern das Virus durch Einbetten hydrophober Regionen in die Lipid-Doppelschicht der Zelloberfläche und zeigen hämagglutierende Aktivität sowie Neuraminidase-Aktivität. Bei Pneumoviren ist das Glykoprotein durch O-glykosidische Bindungen stark glykosyliert. Diesem Molekül fehlen die gezeigte hämagglutinierende Aktivität und die Neuraminidase-Aktivität seiner Verwandten.
VII. Herpes-Virus.
Da das Herpes simplex Virus (HSV) neurotrop ist, hat es bei der Behandlung von Störungen des Nervensystems beträchtliches Interesse erregt. Darüber hinaus macht die Fähigkeit von HSV, latente Infektionen in sich nicht teilenden neuronalen Zellen ohne Integration in das Wirtszellchromosom oder andere Änderung des Wirtszellmetabolismus zu etablieren, gemeinsam mit der Existenz eines während der Latenz aktiven Promotors, HSV zu einem attraktiven Vektor. Obwohl sich viel Aufmerksamkeit auf die neurotropen Anwendungen von HSV konzentriert hat, kann dieser Vektor in Anbetracht seines breiten Wirtsspektrums auch für andere Gewebe genutzt werden.
Ein anderer Faktor, der HSV zu einem attraktiven Vektor macht, ist die Größe und Organisation des Genoms. Da HSV groß ist, ist die Inkorporation mehrerer Gene oder Expressionskassetten weniger problematisch als in anderen kleineren viralen Systemen. Zusätzlich macht die Verfügbarkeit verschiedener viraler Kontrollsequenzen mit verschiedener Leistung (zeitlich, Stärke, etc.) es möglich, die Expression in einem stärkeren Ausmaß als in anderen Systemen zu kontrollieren. Es ist ferner ein Vorteil, dass das Virus relativ wenig gespleißte mRNAs aufweist, was genetische Manipulationen weiter erleichtert.
HSV ist darüber hinaus relativ einfach zu manipulieren und kann zu hohen Titern gezüchtet werden. Somit ist die Bereitstellung sowohl in Bezug auf das für das Erreichen einer ausreichenden MOI benötigte Volumen als auch in Bezug auf einen verringerten Bedarf an Wiederholungsdosierungen ein geringeres Problem. Für einen Übersichtsartikel über HSV als Gentherapievektor wird auf Glorioso et al. (1995) verwiesen.
HSV (bezeichnet mit Subtypen 1 und 2) sind Viren mit Hülle, die zu den am meisten verbreiteten infektiösen Agenzien gehören, die dem Menschen begegnen, und sie infizieren Millionen Menschen weltweit. Das große, komplexe, doppelsträngige DNA-Genom kodiert für dutzende verschiedener Genprodukte, von denen einige von gespleißten Transkripten abgeleitet sind. Zusätzlich zu den strukturellen Komponenten von Virion und Hülle kodiert das Virus für zahlreiche andere Proteine, einschließlich einer Protease, einer Ribonukleotidreduktase, einer DNA-Polymerase, eines ssDNA-bindenden Proteins, einer Helicase/Primase, einer DNA-abhängigen ATPase, einer dUTPase und anderer Proteine.
HSV-Gene bilden mehrere Gruppen, deren Expression koordiniert reguliert und ähnlich einer Kaskade aufeinanderfolgend geordnet ist (Honess und Roizman, 1974; Honess und Roizman 1975; Roizman und Sears, 1995). Die Expression von α-Genen, der ersten nach der Infektion exprimierten Gruppe von Genen, wird durch Virionprotein Nr. 16 oder α-transduzierendem Faktor verstärkt (Post et al., 1981; Batterson und Roizman, 1983; Campbell et al., 1983). Die Expression von β-Genen erfordert funk tionelle α-Gen-Produkte, bemerkenswerterweise ICP4, welches durch das α4-Gen kodiert wird (DeLuca et al., 1985). γ-Gene, eine heterogene Gruppe von Genen, die im Wesentlichen für strukturelle Virion-Proteine kodiert, benötigen für eine optimale Expression den Beginn der viralen DNA-Synthese (Holland et al., 1980).
Im Einklang mit der Komplexität des Genoms ist der Lebenszyklus von HSV ziemlich kompliziert. Zusätzlich zum lytischen Zyklus, der zur Synthese von Viruspartikeln und letztlich zum Zelltod führt, hat das Virus die Fähigkeit, in ein latentes Stadium einzutreten, in dem das Genom in neuralen Ganglien erhalten wird, bis ein bislang nicht definiertes Signal ein Wiederauftreten des lytischen Zyklus auslöst. Avirulente Varianten von HSV wurden entwickelt und sind zur Verwendung im Zusammenhang mit der Gentherapie problemlos verfügbar (US-Patent 5, 672, 344).
G. Beispiele
Die folgenden Beispiele wurden aufgenommen, um bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung zu zeigen. Es sollte vom Fachmann anerkannt werden, dass die Techniken, welche in den folgenden Beispielen offenbart werden, Techniken repräsentieren, bei denen der Erfinder entdeckt hat, dass sie bei der Ausführung der Erfindung gut funktionieren, und sie können damit als bevorzugte Ausführungformen betrachtet werden. Der Fachmann sollte angesichts der vorliegenden Offenbarung jedoch erkennen, dass hinsichtlich der offenbarten spezifischen Ausführungsformen zahlreiche Veränderungen durchgeführt werden können und dabei immer noch ein gleiches oder ähnliches Ergebnis erhalten werden kann, ohne den Bereich der Erfindung zu verlassen.
BEISPIEL 1
Kombinatorisches Zusammensetzen von Genen
Der Erfinder hat eine Strategie zum Zusammensetzen von Oligomeren in größere DNA-Moleküle entwickelt, die als kombinatorisches Zusammensetzen bezeichnet wird. Das Verfahren wird wie folgt ausgeführt: man kann unter Verwendung von einem aus einer Anzahl von kommerziellen oder im öffentlichen Sektor erhältlichen Computerprogrammen ein Plasmid so entwerfen, dass es die notwendigen Gene, Promotoren, Wirkstoffselektion, Replikationsursprung etc. enthält. SynGene v.2.0 ist ein Programm, das eine Liste überlappender Oligonukleotide erzeugt, die ausreichen, um das Gen oder Plasmid zusammenzusetzen (siehe 7A–7G). Zum Beispiel kann SynGene 2.0 bei einem 5000 bp-Gen zwei Listen mit 100 50-mer-Komponenten aus einem Strang und 100 50-mer-Komponenten aus dem komplementären Strang erzeugen, sodass jedes Paar von Oligomeren um 25 bp überlappt. Das Programm überprüft die Sequenz auf Wiederholungen und stellt eine MERMADE-Input-Datei her, die das Oligonukleotid-Synthesegerät direkt programmiert. Das Synthesegerät produziert zwei Gruppen von Platten mit 96 Vertiefungen, die die komplementären Oligonukleotide enthalten. Ein SynGene-Programm ist in 7 abgebildet. Das Programm ist zur Zerlegung eines Designer-Gens oder -Genoms in Oligonukleotide für die Synthese gestaltet. Das Programm dient der vollständigen Synthese von Designer-Genen und basiert auf einem von Dr. Glen Evans geschriebenen Originalprogramm zur Formatierung von DNA-Sequenzen.
Das kombinatorische Zusammensetzen wird am besten unter Verwendung einer programmierbaren Roboter-Arbeitsstation, wie z.B. der Beckman Biomek 2000 ausgeführt. Paare überlappender Oligomere werden vermischt und zusammengelagert. Nach dem Zusammenlagern wird eine kleinere Gruppe von Duplex-Oligomeren hergestellt. Diese werden wiederum gepaart und zusammengela gert und bilden eine kleinere Gruppe größerer Oligomere. Überlappenden Oligomeren wird es nacheinander erlaubt, sich zusammenzulagern, bis das gesamte Zusammensetzen vollendet ist. Die Zusammenlagerung kann in Gegenwart einer Ligase durchgeführt werden, oder es kann nach jedem Schritt eine Ligation erfolgen. In einer Ausführung werden Oligomere in der Anwesenheit von Topoisomerase 2 zusammengelagert, die keine 5'-Phosphorylierung des Oligomers erfordert, bei Raumtemperatur stattfindet und im Gegensatz zur 12 Stunden-Ligation bei 12 °C eine schnelle (5 Minuten) Reaktion darstellt. Nach dem vollständigen Zusammensetzen kann das erhaltene DNA-Molekül für den geplanten Zweck verwendet werden, normalerweise für die Transformation in einen bakteriellen Wirt zum Zwecke der Replikation. Die Schritte in diesem Zyklus sind in 3 dargestellt.
Dieser Ansatz hat wesentliche Vorteile gegenüber einer traditioneller Klonierung, die auf rekombinanter DNA basiert. Während es technisch möglich ist, praktisch jede Modifikation oder Mutation in existierenden DNA-Molekülen durchzuführen, macht der benötigte Aufwand sowie die hohen technischen Fertigkeiten einige Konstruktionen schwierig oder lästig. Dieses Verfahren ist, obwohl es viele Jahre verwendet wurde, der automatisierten Klonierung von Genen oder der Herstellung vollständig neuartiger DNA-Sequenzen in großem Maßstab nicht zugänglich.
BEISPIEL 2
Herstellung künstlicher Gene
In einem Beispiel wird die vorliegende Erfindung ein bekanntes Gen einer Länge von etwa 1000 Basenpaaren durch das folgende Verfahren herstellen. Eine Gruppe von Oligonukleotiden, jeweils aus 50 Basen, wird so hergestellt, dass der vollständige Plus-Strang des Gens dargestellt wird. Eine zweite Gruppe von Oligonukleotiden, die ebenfalls aus 50-meren besteht, wird für den Minus-Strang hergestellt. Diese Gruppe wird jedoch so gestaltet, dass eine komplementäre Paarung der ersten und zweiten Gruppe zu einer Überlappung "gepaarter" Sequenzen führt, d.h., dass jedes Oligonukleotid der ersten Gruppe komplementär zu Regionen von zwei Oligonukleotiden der zweiten Gruppe ist (mit der möglichen Ausnahme der terminalen Oligonukleotide). Die überlappende Region wird bei 30 bp gewählt, wobei ein Überhang von 20 Basepaaren für jedes Paar übrigbleibt. Die erste und zweite Gruppe von Oligonukleotiden wird in einer einzigen Mischung zusammengelagert und mit einem ligierenden Enzym behandelt.
In einem zweiten Beispiel ist das zu synthetisierende Gen etwa 5000 bp lang. Jede Gruppe von Oligonukleotiden besteht aus fünfzig 100-meren mit überlappenden Bereichen komplementärer Oligonukleotide von 75 bp, wobei 25 Basen als "klebrige Enden" verbleiben. In dieser Ausführungsform wird das 5'-terminale Oligonukleotid der ersten Gruppe von Oligonukleotiden mit dem 3'-terminalen Oligonukleotid der zweiten Gruppe zusammengelagert, um ein erstes zusammengelagertes Produkt zu bilden; anschließend wird das nächste, am weitesten 5'-terminal gelegene Oligonukleotid der ersten Gruppe mit dem ersten zusammengelagerten Produkt zusammengelagert, um ein zweites zusammengelagertes Produkt zu bilden, und der Vorgang wird wiederholt, bis alle Oligonukleotide der ersten und zweiten Gruppe zusammengelagert wurden. Die Ligation der Produkte kann zwischen den Schritten oder nach Abschluss aller Hybridisierungen erfolgen.
In einem dritten Beispiel wird ein Gen von 100.000 bp aus eintausend 100-meren synthetisiert. Die Überlappung zwischen "Paaren" von Plus- und Minus-Oligonukleotiden beträgt erneut 75 Basen, wobei ein Überhang von 20 Basepaaren verbleibt. Bei diesem Verfahren wird ein kombinatorischer Ansatz verwendet, bei dem einander entsprechende Paare partiell komplementärer Oligonukleotide in einem ersten Schritt hybridisiert werden. Dann wird eine zweite Hybridisierungsrunde mit geeignet komplementären Produktpaaren aus der ersten Runde durchgeführt. Dieser Vorgang wird insgesamt 10mal wiederholt, wobei jede Hybridisierungsrunde die Anzahl der Produkte um die Hälfte reduziert. Dann wird eine Ligation der Produkte durchgeführt.
BEISPIEL 3
Expression humaner Genprodukte in großem Maßstab
Sobald das menschliche Genom charakterisiert worden ist, wird die auf der vollständigen Sequenz basierende funktionelle Analyse des menschlichen Genoms eine Vielzahl von Ansätzen der strukturellen, funktionellen und Netzwerk-Biologie erfordern. Der vorliegend vorgeschlagene Ansatz zur Herstellung einer Serie von Expressionskonstrukten, die alle möglichen menschlichen Genprodukte darstellen, sowie zum Zusammensetzen von Gruppen von Bakterien und/oder Hefen, welche diese Produkte exprimieren, wird einen wichtigen Weg zu den Anfängen der Funktionsanalyse bereitstellen.
Zweitens wird der vorliegend beschriebene Ansatz, wenn er bis zu seinem theoretischen Optimum weiterentwickelt wird, im großen Maßstab den Transfer von Genen in Zelllinien oder Organismen für die Funktionsanalyse erlauben. Das langfristige Ziel dieses Konzepts ist die vollständig auf Bioinformatik und Informationsprozessierung basierende Herstellung lebender Organismen. Offensicht reicht das Wissen um die vollständige Sequenz nicht aus, um die unzähligen, dem Leben innewohnenden biologische Konzepte zu verstehen.
BEISPIEL 4
Herstellung eines synthetischen Plasmids
Unter Verwendung synthetischer Teile bereits bekannter Plasmide wurde ein DNA-Molekül entworfen. Zur Demonstration dieser Technik wurde das Plasmid synlux 4 entworfen. Synlux 4 besteht aus 4800 Basenpaaren DNA. In dieser Sequenz ist die Sequenz von lux A und lux B, den A- und B-Komponenten des Luciferaseproteins aus Vibrio Fisherii, enthalten, sowie Teile des Plasmids pUCl9, einschließlich des Replikationsursprungs und der Replikationsstabilitätssequenzen, und der Promotors sowie die kodierende Sequenz der tn9 Kanamycin/Neomycin-Phosphotransferase. Die Sequenz wurde auf einen Computer unter Verwendung von Microsoft Word und Vektor NTI (InforMax, Inc.) entworfen. Die Sequenz ist in 4A–4C aufgeführt.
Nach dem Entwerfen wurde das Computerprogramm SynGene 2.0 verwendet, um die Sequenz in Komponenten zu zerlegen, die aus überlappenden 50-mer Oligonukleotiden bestehen. Aus der Sequenz von 4800 bp wurden 192 50-mere entworfen. Die Oligonukleotid-Komponenten sind in 5A–5F aufgeführt. Diese Oligonukleotid-Komponenten wurden unter Verwendung eines herkömmlichen Oligonukleotid-Synthesegeräts für 96 Vertiefungen (Rayner et al.) Genome Research, 8, 741-747 (1998) synthetisiert. Die Oligonukleotid-Komponenten wurden in zwei Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen hergestellt, wobei jede Platte eine Gruppe von Oligonukleotid-Komponenten enthielt. Platte 1 enthielt die Oligos des Vorwärtsstrangs und Platte 2 die Oligos des umgekehrten Strangs.
Das Zusammensetzen der Oligonukleotide und die Ligationen erfolgten unter Verwendung einer Biomek 1000 Roboter-Arbeitsstation (Beckman). Die sequentiellen Transfers von Oligonukleotiden aus einer Vertiefung in eine zweite Vertiefung der Platte erfolgte durch Pipettieren, und eine Ligationsreaktion wurde unter Verwendung von T4-Ligase durchgeführt. Das Muster des Zusammensetzens ist in 6A–6B skizziert.
Nach dem Zusammensetzen wurde der erhaltene Ligationsmix verwendet, um den kompetenten E. coli-Stamm DH5a zu transformieren. Die Transformationsmischung wurde auf 25 μg/ml Kanamycinsulfat enthaltende LB-Platten ausplattiert, und es wurden rekombinante Kolonien erhalten. Die erhaltenen rekombinanten Klone wurden isoliert, kloniert und die DNA wurde präpariert. Die DNA wurde auf 1%igen Agarosegelen analysiert, um rekombinante Moleküle zu detektieren. Es wurde gezeigt, dass die Klone das erwartete Plasmid von 4800 bp umfassten, welches die Gene lux A und lux B enthielt.
Alle vorliegend offenbarten und beanspruchten Zusammensetzungen und/oder Verfahren können angesichts der vorliegenden Offenbarung ohne unzumutbaren experimentellen Aufwand hergestellt und ausgeführt werden. Während die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren im Hinblick auf bevorzugte Ausführungsformen beschrieben wurden, wird es für den Fachmann ersichtlich sein, dass bei den Zusammensetzungen und/oder Verfahren und bei den Schritten oder bei der Reihenfolge der Schritte des vorliegend beschriebenen Verfahrens Veränderungen vorgenommen werden können, ohne sich von dem Konzept, der Idee und dem Bereich der Erfindung zu lösen. Es wird verstanden werden, dass bestimmte Mitel, die sowohl chemisch als auch physiologisch verwandt sind, gegen vorliegend beschriebene Mittel ausgetauscht werden können, wobei gleiche oder ähnliche Ergebnisse erreicht werden würden. Alle solche dem Fachmann ersichtlichen ähnlichen Ersatzstoffe und Veränderungen werden als innerhalb der Idee, des Bereichs und des Konzepts der von den angefügten Ansprüchen definierten Erfindung betrachtet.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Synthese eines replikationskompetenten, doppelsträngigen Polynukleotids ohne Verwendung irgendeiner existierenden rekombinanten oder natürlich vorkommenden DNA, wobei das Polynukleotid einen Replikationsursprung, einen ersten kodierenden Bereich und ein erstes regulatorisches Element umfasst, welches die Expression des ersten kodierenden Bereichs steuert, und wobei das Verfahren Schritte umfasst, bei denen man a) eine erste Gruppe von Oligonukleotiden erzeugt, die dem gesamten Plus-Strang des doppelsträngigen Polynukleotids entsprechen; b) eine zweite Gruppe von Oligonukleotiden erzeugt, die dem gesamten Minus-Strang des doppelsträngigen Polynukleotids entsprechen; und c) die erste und zweite Gruppe von Oligonukleotiden zusammenlagert; wobei jedes der Oligonukleotide der zweiten Gruppe von Oligonukleotiden mit zwei komplementären Oligonukleotiden der ersten Gruppe von Oligonukleotiden überlappt und mit diesen hybridisiert, mit der Ausnahme, dass zwei Oligonukleotide an einem 5'- oder 3'-Ende des doppelsträngigen Polynukleotids mit nur einem komplementären Oligonukleotid hybridisieren werden.
Verfahren nach Anspruch 1, das ferner Schritte umfasst, bei denen man die zusammengelagerten Oligonukleotide mit einem ligierenden Enzym behandelt, um zusammenhängende Stränge des doppelsträngigen Polynukleotids zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem das ligierende Enzym Topoisomerase ist.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem das ligierende Enzym T4-DNA-Ligase ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, bei dem Schritt (c) Schritte umfasst, bei denen man i) das 5'-terminale Oligonukleotid der ersten Gruppe von Oligonukleotiden mit dem 3'-terminalen Oligonukleotid der zweiten Gruppe von Oligonukleotiden zusammenlagert, ii) das nächste, am weitesten 5'-terminal gelegene Oligonukleotid der ersten Gruppe von Oligonukleotiden mit dem Produkt von Schritt (i) zusammenlagert, iii) das nächste, am weitesten 3'-terminal gelegene Oligonukleotid der zweiten Gruppe von Oligonukleotiden mit dem Produkt von Schritt (ii) zusammenlagert, a) den Vorgang wiederholt, bis alle Oligonukleotide der ersten und zweiten Gruppe von Oligonukleotiden zusammengelagert worden sind.
Verfahren nach Anspruch 1, das ferner einen Schritt umfasst, bei dem das doppelsträngige Polynukleotid amplifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das doppelsträngige Polynukleotid eine Länge von 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 5000, 10 × 10³, 20 × 10³, 30 × 10³, 40 × 10³, 50 × 10³, 60 × 10³, 70 × 10³, 80 × 10³, 90 × 10³, 1 × 10⁵, 1 × 10⁶, 1 × 10⁷ oder 1 × 10⁸ Basenpaaren umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das erste regulatorische Element ein Promotor ist.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem das doppelsträngige Polynukleotid ein zweites regulatorisches Element umfasst, und wobei das zweite regulatorische Element ein Polyadenylierungs-Signal ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das doppelsträngige Polynukleotid eine Vielzahl von kodierenden Bereichen und eine Vielzahl von regulatorischen Elementen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die kodierenden Bereiche für Produkte kodieren, die einen biochemischen Reaktionsweg umfassen.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der biochemische Reaktionsweg die Glykolyse ist.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, bei dem die Produkte ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Hexokinasen, Phosphohexose-Isomerase, Phosphofructokinase-1, Aldolase, Triosephosphat-Isomerase, Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase, Phosphoglycerat-Mutase, Enolase, Pyruvatkinase.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der biochemische Reaktionsweg die Lipidsynthese ist.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der biochemische Reaktions-Weg die Cofaktor-Synthese ist.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem Liponsäure an dem Reaktionsweg beteiligt ist.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der biochemische Reaktionsweg die Riboflavin-Synthese ist.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der biochemische Reaktionsweg die Nukleotid-Synthese ist.
Verfahren nach Anspruch 18, bei dem das Nukleotid ein Purin ist.
Verfahren nach Anspruch 18, bei dem das Nukleotid ein Pyrimidin ist.
Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die kodierenden Bereiche für Enzyme kodieren, die an einem zellulären Prozess beteiligt sind, welcher ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Zellteilung, Chaperon, Detoxifikation, Peptid-Sekretion, Energiemetabolismus, regulatorische Funktion, DNA-Replikation, Transkription, RNA-Prozessierung und tRNA-Modifikation.
Verfahren nach Anspruch 21, bei dem der Energiemetabolismus die oxidative Phosphorylierung ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das doppelsträngige Polynukleotid eine DNA ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das doppelsträngige Polynukleotid eine RNA ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das doppelsträngige Polynukleotid ein Expressionskonstrukt ist.
Verfahren nach Anspruch 25, bei dem das Expressionskonstrukt ein bakterielles Expressionskonstrukt ist.
Verfahren nach Anspruch 25, bei dem das Expressionskonstrukt ein Säugetier-Expressionskonstrukt ist.
Verfahren nach Anspruch 25, bei dem das Expressionskonstrukt ein virales Expressionskonstrukt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das doppelsträngige Polynukleotid ein Genom umfasst, welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus bakteriellem Genom, Hefegenom und viralem Genom.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Überlappung zwischen den Oligonukleotiden der ersten und zweiten Gruppe von Oligonukleotiden zwischen 5 Basenpaaren und 75 Basenpaaren ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Überlappung 10 Basenpaare, 15 Basenpaare, 20 Basenpaare, 25 Basenpaare, 30 Basenpaare, 35 Basenpaare, 40 Basenpaare, 45 Basenpaare, 50 Basenpaare, 55 Basenpaare, 60 Basenpaare, 65 Basenpaare oder 70 Basenpaare ist.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem der Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CMV IE, SV40 IE, RSV, β-Actin, Tetracyclin-regulierbarem und Ecdyson-regulierbarem.
Verfahren nach Anspruch 29, bei dem das virale Genom ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Retrovirus, Adenovirus, Vacciniavirus, Herpesvirus und Adeno-assoziiertem Virus.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das doppelsträngige Polynukleotid ein Chromosom ist.
Verfahren zur Herstellung eines viralen Partikels, Schritte umfassend, bei denen man a) eine Wirtszelle bereitstellt; b) die Wirtszelle mit einem artifiziellen viralen Genom transformiert, das ohne Verwendung irgendeiner existierenden rekombinanten oder natürlich vorkommenden DNA hergestellt worden ist, indem man: i) eine erste Gruppe von Oligonukleotiden erzeugt, die dem gesamten Plus-Strang des viralen Genoms entsprechen; ii) eine zweite Gruppe von Oligonukleotiden erzeugt, die dem gesamten Minus-Strang des viralen Genoms entsprechen; und iii) die erste und zweite Gruppe von Oligonukleotiden zusammenlagert; wobei jedes der Oligonukleotide der zweiten Gruppe von Oligonukleotiden mit zwei komplementären Oligonukleotiden der ersten Gruppe von Oligonukleotiden überlappt und mit diesen hybridisiert, mit der Ausnahme, dass zwei Oligonukleotide an einem 5'- oder 3'-Ende des viralen Genoms mit nur einem komplementären Oligonukleotid hybridisieren werden, und c) die transformierte Wirtszelle unter Bedingungen so kultiviert, dass das Viruspartikel exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 35, bei dem das virale Genom ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Retrovirus, Adenovirus, Vacciniavirus, Herpesvirus und Adeno-assoziiertem Virus.
Verfahren zur Herstellung eines artifiziellen Genoms, das ein Chromosom umfasst, ohne Verwendung irgendeiner existierenden rekombinanten oder natürlich vorkommenden DNA, wobei das Chromosom alle kodierenden Bereiche und regulatorischen Elemente umfasst, die in einem entsprechenden natürlichen Chromosom vorgefunden werden, Schritte umfassend, bei denen man: a) eine erste Gruppe von Oligonukleotiden erzeugt, die dem gesamten Plus-Strang des Chromosoms entsprechen; b) eine zweite Gruppe von Oligonukleotiden erzeugt, die dem gesamten Minus-Strang des Chromosoms entsprechen; und c) die erste und zweite Gruppe von Oligonukleotiden zusammenlagert; wobei jedes der Oligonukleotide der zweiten Gruppe von Oligonukleotiden mit zwei komplementären Oligonukleotiden der ersten Gruppe von Oligonukleotiden überlappt und mit diesen hybridisiert, mit der Ausnahme, dass zwei Oligonukleotide an einem 5'- oder 3'-Ende des Chromosoms mit nur einem komplementären Oligonukleotid hybridisieren werden.
Verfahren nach Anspruch 37, bei dem das entsprechende natürliche Chromosom ein humanes Mitochondrien-Genom ist.
Verfahren nach Anspruch 37, bei dem das entsprechende natürliche Chromosom ein Chloroplasten-Genom ist.
Verfahren zur Herstellung eines artifiziellen genetischen Systems ohne Verwendung irgendeiner existierenden rekombinanten oder natürlich vorkommenden DNA, wobei das System alle kodierenden Bereiche und regulatorischen Elemente umfasst, die in einem entsprechenden natürlichen biochemischen Reaktionsweg vorgefunden werden, Schritte umfassend, bei denen man: a) eine erste Gruppe von Oligonukleotiden erzeugt, die dem gesamten Plus-Strang des Chromosoms entsprechen; b) eine zweite Gruppe von Oligonukleotiden erzeugt, die dem gesamten Minus-Strang des Chromosoms entsprechen; und c) die erste und zweite Gruppe von Oligonukleotiden zusammenlagert; wobei jedes der Oligonukleotide der zweiten Gruppe von Oligonukleotiden mit zwei komplementären Oligonukleotiden der ersten Gruppe von Oligonukleotiden überlappt und mit diesen hybridisiert, mit der Ausnahme, daß zwei Oligonukleotide an einem 5'- oder 3'-Ende des Chromosoms mit nur einem komplementären Oligonukleotid hybridisieren werden, wobei die Expression der kodierenden Bereiche des biochemischen Reaktionswegs zur Expression einer Gruppe von Enzymen führt, die eine Verbindung nacheinander metabolisieren.
Verfahren nach Anspruch 40, bei dem der biochemische Reaktionsweg die für die Glykolyse erforderlichen Aktivitäten umfasst.
Verfahren nach Anspruch 40, bei dem der biochemische Reaktionsweg die für den Elektronen-Transport erforderlichen Enzyme umfasst.
Verfahren nach Anspruch 40, bei dem der biochemische Reaktionsweg die für die Photosythese erforderlichen Enzym-Aktivitäten umfasst.