DE69828032T2

DE69828032T2 - Epitope vom pre-m/m protein aus dem dengue-virus, synthetische peptide

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Publication number: DE69828032T2
Application number: DE69828032T
Authority: DE
Inventors: Susana Vazquez Ramudo; Guadalupe Guzman Tirado; Gerardo Enrique Guillen Nieto; Orlando Luis Pardo Lazo; Glay Chinea Santiago; Ana Beatriz Perez Diaz; Maritza Pupo Antunez; Rosmari Rodriguez Roche; Osvaldo Reyes Acosta; Hilda Elisa Garay Perez; Gabriel Padron Palomares; Maylin Alvarez Vera; Luis Morier Diaz; Omaida Perez Insuita; Jose Luis Pelegrino Martinez De La Cotera
Original assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB; Instituto de Medicina Tropical Pedro Kouri
Current assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB; Instituto de Medicina Tropical Pedro Kouri
Priority date: 1997-01-15
Filing date: 1998-01-13
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2018-01-14
Also published as: JP3647048B2; BR9807486A; ES2235310T3; AU5649998A; CN1198933C; JP2001508457A; CA2277816A1; WO1998031814A1; MY120971A; NO993468D0; US6383488B1; EP0966535A1; HK1025999A1; CN1249781A; ATE284444T1; DE69828032D1; CU22683A1; NO993468L; EP0966535B1; AU743414B2

Description

Fachgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Biotechnologie und bezieht sich auf DNA-Rekombinationstechniken, insbesondere auf die Herstellung von synthetischen Peptiden, die das pre-M/M-Protein des Denguevirus Serotyp 2 beinhalten, sowie von chimärischen Proteinen, die Epitope des pre-M/M-Proteins des Denguevirus Serotyp 2 und 4 enthalten.
Das technische Ziel besteht darin, pre-M/M-neutralisierende und -schützende Epitope zu identifizieren, die kreuzreaktiv gegenüber allen Denguevirus-Serotypen sind, um ein Immunogen für die Impfung beim Menschen zu erhalten.
Stand der Technik
Das Denguevirus gehört zur Gattung Flavivirus, Familie Flaviviridae (Westaway, E. G. et al., 1985, Flaviviridae, Intervirol. 24, S. 183). Es ist ein komplexes Virus mit einer einzigen RNA-Kette mit positiver Polarität als genetisches Material, das für ein Polyprotein codiert, welches co- und posttransduktional durch zelluläre und virale Proteasen prozessiert wird.
Es gibt zwei Strukturproteine in der viralen Membran: E (envelope) und M (membrane), während es mehrere Kopien des anderen Strukturproteins C (capside) gibt, das das isometrische Nucleocapsid bildet. Daneben wurden wenigstens sieben Nichtstrukturproteine identifiziert (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5).
Die Glycoproteine E und NS1 sind einzeln in der Lage, aktiven und passiven Schutz vor dem homologen Serotyp des Denguevirus zu bieten, während die hohe konformatorische Komplexität der relevanten Epitope erhalten bleibt. Aus diesem Grund wurden rekombinante eukaryontische zelluläre Systeme hauptsächlich für die immunologische Bewertung dieser Proteine ausgewählt, zum Beispiel Vacciniavirus (Bray, M. et al., 1989, Mice immunized with recombinant Vaccinia virus expressing dengue-4 structural proteins with or without nonstructural protein NS1 are protected against fatal dengue virus encephalitis, J. Virol. 63, S. 2853) und Baculovirus (Zhang, Y. M. et al. 1988, Immunization of mice with dengue structural proteins and nonstructural protein NS1 expressed by baculovirus recombinant induces resistance to dengue virus encephalitis, J. Virol. 62, S. 3027).
Das kleine Protein M (8 kD) wird als glycosylierte Vorstufe namens pre-M (ungefähr 22 kD) synthetisiert, die eine späte endoproteolytische Spaltung unmittelbar vor oder nach der Freisetzung des Virus aus der infizierten Zelle erleidet (Murray, J. M. et al., 1993, Processing of the dengue virus type 2 proteins prM and C-prM, J. Gen. Virol., 74, S. 175). Die Spaltung, die wahrscheinlich durch eine zelluläre Protease erfolgt, scheint in den sauren post-Golgi-Vesikeln stattzufinden, da sie durch Mittel gehemmt wird, die den niedrigen pH-Wert dieser Vesikel destabilisieren (Randolph, V. B. et al., 1990, Acidotropic amines inhibit proteolytic processing of Flavivirus prM protein, Virol. 174, S. 450). Das pre-Fragment wurde in vitro nur im extrazellulären Medium identifiziert, sein Schicksal in vivo bleibt unbekannt (Murray, J. M. et al., 1993, Processing of the dengue virus type 2 proteins prM and C-prM, J. Gen. Virol., 74, S. 175).
Vermutlich besteht die Funktion von pre-M während des exocytischen Durchgangs des Flavivirus darin, die Aktivierung der fusogenen Membrandomäne von E mit dem sauren pH-Wert der Umgebung zu vermeiden (Randolph, V. B. et al., 1990, Acidotropic amines inhibit proteolytic processing of Flavivirus prM protein, Virol. 174, S. 450); wenn dieses Ereignis stattfindet, wird die Freisetzung des Virus verhindert. Tatsächlich wurde festgestellt, dass pre-M und E in den unreifen intrazellulären Virionen miteinander Wechselwirken (Wengler, G. und Wengler, G., 1989, Cell-associated West Nile flavivirus is covered with E + pre-M protein heterodimers which are destroyed and reorganized by proteolytic cleavage during virus release, J. Virol., 63, S. 2521) und dass die native Konformation von E nur in Gegenwart von pre-M angenommen wird (Konishi, E. und Mason, P. W., 1993, Proper maturation of the Japanese encephalitis virus envelope glycoprotein requires cosynthesis with the premembrane protein, J. Virol. 67, S. 1672). Außerdem zeigen bereits freigesetzte Virionen, die nur pre-M in ihrer Membran haben, im Allgemeinen eine geringere Infektiosität als vollständig reife Virionen (Wengler, G. und Wengler, G., 1989, Cell-associated West Nile flavivirus is covered with E + pre-M protein heterodimers which are destroyed and reorganized by proteolytic cleavage during virus release, J. Virol., 63, S. 2521), in denen zwar M und pre-M vorhanden sind, ersteres jedoch vorherrscht.
Pre-M und M bieten einen aktiven Schutz, wenn sie in rekombinantem Vacciniavirus exprimiert wurden, aber dies geschieht nicht mit dem pre-Fragment (Bray, M. und Lai, C.-J., 1991, Dengue virus premembrane and membrane proteins elicit a protective immune response, Virol. 185, S. 505), und außerdem ergibt die Kombination von pre-M oder M mit Glycoprotein E in demselben rekombinanten Vacciniavirus im Allgemeinen einen besseren Schutz, als er von jedem Protein einzeln erreicht wird. In ähnlicher Weise sind bestimmte Antikörper gegen pre-M/M in der Lage, Mäusen einen passiven Schutz zu bieten (Kaufman, B. M. et al., 1989, Monoclonal antibodies for dengue virus prM glycoprotein protect mice against lethal dengue infection, Am. J. Trop. Med. & Hyg., 41, S. 576).
Die Verwendung von synthetischen Peptiden hat es ermöglicht, die molekulare Basis der Antigenität gemäß der räumlichen Konformation und der immunologischen Eigenschaften des beteiligten Antigens festzustellen (Arnon, R. und Sela, M., 1985, Synthetic vaccines: present and future, Ann. Inst. Pasteur/immunol. 136 D, 271–282). Die synthetischen Peptide als Anti-Dengue-Impfstoffuntereinheiten ermöglichen es, nur die schützenden Epitope, die keine Immunamplifizierung verursachen, in die endgültige Zubereitung aufzunehmen (Halstead, S. B. und O'Rourke, E. J., 1977, Dengue viruses and mononuclear phagocytes, I. Infection enhancement by non-neutralizing antibody, J. Exp. Med. 146, S. 201; Halstead, S. B., 1979, In vivo enhancement of dengue virus infection in rhesus monkeys by passively transferred antibody, J. Infect. Dis., 140, S. 527), oder alternative dazu, schützende Peptide von jedem der vier Serotypen aufzunehmen. Die Charakterisierung der antigenen Determinanten von E und NS1 wurde erfolgreich durchgeführt. Es gibt jedoch keine ähnlichen Studien über das ebenfalls wichtige Protein pre-M/M, und deshalb sind die Ergebnisse dieser Anmeldung ein erster Schritt in diese Richtung.
Die Versuche, die flaviviralen Proteine pre-M, M und E zu exprimieren, waren nicht immer erfolgreich (Chambers, T. J. et al., 1990, Production of yellow fever virus proteins in infected cells: identification of discrete polyprotein species and analysis of cleavage kinetics using region-specific polyclonal antiserum, Virol. 177, S. 159; Yan, B.-S. et al., 1994, Truncating the putative membrane association region circumvents the difficulty of expressing hepatitis C virus protein E1 in Escherichia coli, J. Virol. Meths. 49, S. 343). Anscheinend sind die hydrophoben Bereiche, die diese Proteine im C-terminalen Teil aufweisen, die Ursache für die geringen oder nicht nachweisbaren heterologen Expressionsniveaus (Yan, B.-S. et al., 1994, Truncating the putative membrane association region circumvents the difficulty of expressing hepatitis C virus protein E1 in Escherichia coli, J. Virol. Meths. 49, S. 343).
Die Expression dieser Proteine (sowie von NS1) in E. coli wurde im Allgemeinen durch Fusion (fragmentiert oder nicht) mit anderen bakteriellen Proteinen erhalten [z. B. β-Galactosidase (Cane, P. A. und Gould, E. A., 1988, Reduction of yellow fever mouse neurovirulence by immunization with a bacterially synthesized non-structural protein (NS1) fragment, J. Gen. Virol. 69, S. 1241), TRPE (Megret, F. et al., 1992, Use of recombinant fusion proteins and monoclonal antibodies to define linear and discontinuous antigenic sites on the Dengue envelope glycoprotein, Virol. 187, S. 480) und dem Protein A von Staphylococcus aureus (Murray, J. M. et al., 1993, Processing of the dengue virus type 2 proteins prM and C-prM, J. Gen. Virol., 74, S. 175). In diesen Fusionsproteinen fehlen die meisten der relevanten konformatorischen Epitope, da die gegen sie erzeugten Antiseren zwar das ganze Virus erkennen können; aber nicht in der Lage sind, es zu neutralisieren oder seine hämagglutinierenden Eigenschaften zu hemmen (Megret, F. et al., 1992, Use of recombinant fusion proteins and monoclonal antibodies to define linear and discontinuous antigenic sites on the Dengue envelope glycoprotein, Virol. 187, S. 480). Neuere Berichte zeigen jedoch, dass wegen der Löslichkeit der Fusionsproteine und infolgedessen der Verwendung von nicht-denaturierenden Verfahren für ihre Reinigung die meisten der neutralisierenden (Seif, S. A. et al., 1995, Finer mapping of neutralizing epitope(s) on the C-terminal of Japanese encephalitis virus E-protein expressed in recombinant Escherichia coli system, Vaccine 13, S. 1515) und schützenden (Srivastava, A. K. et al., 1995, Mice immunized with a dengue type 2 virus E and NS1 fusion protein made in Escherichia coli are protected against lethal dengue virus infection, Vaccine 13, S. 1251) Epitope, die sie besitzen, erhalten bleiben können.
Im Falle von pre-M hat seine pre-Domäne 6 Cysteinreste, die an 3 Disulfidbrücken beteiligt sind, sowie eine N-Glycosylierungsstelle am Asparagin 69. Die Struktur von E und NS1 ist noch komplizierter; sie beinhaltet 6 Disulfidbrücken und mehrere N-Glycosylierungsstellen. Die kleine Ectodomäne von M ist jedoch anscheinend frei von solchen konformatorischen Komplexitäten, da sie keine Cysteine aufweist und in ihrer natürlichen Form nicht glycosyliert ist.
Das Einsetzen von heterologen Fragmenten in erlaubte Bereiche von immunogenen Proteinen, deren Topologie mehr oder weniger bekannt ist, und die Immunisierung mit diesen Fusionsprodukten ist eine komplementäre Alternative zur Verwendung von synthetischen Peptiden. Beide Strategien erlauben es, die Anwesenheit von sequentiellen B-Zell- sowie T-Zell-Epitopen zu definieren. Die biologische Wichtigkeit dieser Epitope kann experimentell bewertet werden, um zu entscheiden, ob sie in einem bestimmten Impfstoffpräparat mitverwendet werden sollen oder nicht.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Eine Anzahl von fünf Peptiden vom pre-M/M-Protein des Dengue-2-Virus, die 58% der Aminosäuresequenz abdecken (97/166 AA), wurden chemisch synthetisiert. Sie entsprachen den Aminosäuresequenzen 3–31; 45–67; 57–92; 69–93; und 103–124, die anschließend als B-19-6, B 20-2, B 19-5, B 20-1 bzw. B 20-3 bezeichnet wurden.
Peptide, die an ein Trägerprotein konjugiert waren oder nicht, wurden in Balb/c-Mäuse geimpft. Die nach Immunisierung mit den konjugierten Peptiden erhaltenen Seren wurden durch in-vitro-Neutralisation durch Reduktion der Zahl der Plaques sowie durch ELISA getestet. Wir untersuchten auch den aktiven Schutz vor einer Dengue-2-Virus-Reizung in den immunisierten Mäusen.
Im Falle von Mäusen, die mit den nichtkonjugierten Peptiden immunisiert wurden, wurde die Antikörperreaktion durch ELISA bewertet, und die proliferative Reaktion der Milz-T-Lymphocyten gegenüber Dengue-2-Virus wurde ebenfalls bewertet.
Es wurden auch Fusionsproteine erhalten, und zwei der vier von Peptiden abgedeckten Bereiche (1–42 und 92–133) wurden darin eingesetzt und in E.-coli-Bakterien exprimiert. Die Immunisierung mit diesen Fusionsproteinen ergänzt die mit den synthetischen Peptiden erhaltenen Ergebnisse.
Die Anwesenheit von B-Zell-Epitopen sowohl in Mäusen als auch in Menschen wurde nachgewiesen, da die Peptide durch Antikörper aus den immunisierten Mäusen und durch Seren von Patienten, die die klinische und serologische Diagnose von Denguevirus hatten, erkannt wurden, wobei in beiden Fällen ELISA verwendet wurde. Die Peptide 19-6 und 20-3 waren in der Lage, die Produktion neutralisierender Antikörper gegen die vier Denguevirus-Serotypen zu induzieren.
Virusspezifische proliferative Reaktionen wurden bei Mäusen nachgewiesen, die mit den nichtkonjugierten Peptiden 19-6 und 19-5 immunisiert waren. Mäuse, die mit den konjugierten Peptiden 19-6, 20-1 und 19-5 immunisiert wurden, zeigten einen statistisch signifikanten Schutz, wenn sie mit Dengue-2-Virus gereizt wurden.
Die Anwesenheit von sequentiellen Epitopen im pre-M/M-Protein von Denguevirus 2 wurde also nachgewiesen, wie auch ihre Bedeutung bei der Immunantwort gegen diese Flaviviren.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1. Vorhersage von antigenen Bereichen und von T-Zell-Epitopen des pre-M/M-Proteins des Denguevirus
Verschiedene theoretische Verfahren wurden angewendet, um die antigenen Bereiche im pre-M/M-Protein des Dengue-2-Virus vorherzusagen. Diese Bereiche sind diejenigen, die am wahrscheinlichsten von gegen die viralen Proteine erhaltenen Antikörpern erkannt werden und am wahrscheinlichsten Antikörper erzeugen, die die ursprünglichen Proteine erkennen. Einige Verfahren zur Vorhersage von T-Zell-Epitopen wurden angewendet.
Fünf Startpeptide, die mögliche B- und T-Zell-Epitope aufweisen, wurden gefunden (4 in pre-M und 1 in M). Die Untersuchung der antigenen Struktur dieser Proteine und die experimentelle Bestimmung von möglichen immunologisch wichtigen Peptiden beruhten auf diesem Ergebnis.
1.1 Vorhersagen der humoralen Antigenität
Verfahren, die verwendet wurden, um die Antigenität vorherzusagen, beruhten auf der Aminosäuresequenz, da weder die dreidimensionale Struktur des pre-M/M-Proteins des Dengue-2-Virus experimentell bestimmt wurde, noch es auf dem Sequenzniveau eine erhebliche Ähnlichkeit mit irgendeinem Protein bekannter dreidimensionaler Struktur gibt.
Der A-15-Stamm von Dengue 2, der 1981 in Kuba isoliert wurde (Kourí, G. et al., 1986, Hemorrhagic dengue in Cuba: history of an epidemic, Bull. P. A. H. O 20, S. 24), wurde verwendet, um dieses Beispiel zu bewerkstelligen. Die potentiell antigenen Bereiche wurden nach den folgenden Kriterien ausgewählt:

a) Bereiche mit hoher antigener Neigung gemäß verschiedenen Vorhersageverfahren auf der Basis der Hydrophilie (Hoop, T. P. und Woods, K. R., 1981, Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, S. 3824; Parker, J. M. R. et al., 1986, New hydrophilicity scale derived from HPLC peptide retention data: correlation of predicted surface residues with antigenicity and X-ray derived accessible sites, Biochemistry 25, S. 5425), Flexibilität (Karplus, P. A. und Schultz, G. E. 1985, Prediction of chain flexibility in proteins. A tool for the selection of peptide antigens, Naturwissenschaften 72, S. 212) und Zugänglichkeit (Emini, E. A. et al., 1985, Induction of hepatitis A virus-neutralizing antibody by a virus specific synthetic peptide, J. Virol. 55, S. 836).
b) Bereiche mit vielen Möglichkeiten, Schleifen und Turns zu bilden, gemäß den Vorhersagen der Sekundärstruktur, die PHD verwenden (Rost, B. und Sander, C. 1993, Prediction of protein secondary structure at better than 70% accuracy, J. Mol. Biol. 232, S. 584; Rost, B. und Sander, C. 1994, Combining evolutionary information and neural networks to predict protein secondary structure, Proteins 19, S. 55; Rost, B. und Sander, C. 1994, Conservation and prediction of solvent accessibility in protein families, Proteins 20, S. 216).
c) Bereiche mit großer Variabilität, die Insertionen/Weglassungen in Bezug auf andere Flaviviren beinhalten oder auch nicht, sowie potentielle Glycosylierungsbereiche in anderen Flaviviren, die im Denguevirus verwendet werden oder auch nicht.

a) Antigenitätsprofile
1 zeigt die Profile, die erhalten werden, wenn man 4 Eigenschaften der Aminosäuren, die mit der Antigenität im Zusammenhang stehen, auf die pre-M- und M-Segmente anwendet (pre-M links, M rechts).
Im pre-Bereich gibt es hohe Hydrophilie- und Zugänglichkeitswerte in den Bereichen, die die Reste 6–9, 16–21, 28–31, 42–47, 58–65 und 82–91 aufweisen. Im M-Protein gibt es einen großen hydrophoben Bereich zwischen den Resten 41–76, der den Transmembranhelices entspricht, von denen man annimmt, dass sie nicht dem Immunsystem ausgesetzt sind. In der kleinen Ectodomäne von M (Reste 1–40) erstreckt sich der Bereich der größten Hydrophilie/Zugänglichkeit zwischen den Aminosäuren 13–31, insbesondere am Anfang (AA 13–16).
b) Vorhersagen der Sekundärstruktur
2 zeigt die Vorhersagen der Sekundärstruktur und der Zugänglichkeit des pre-M- und des M-Segments gemäß dem PHD-Programm. Die Ergebnisse der Vorhersagen zeigen, dass viele potentiell antigene Bereiche (gemäß den Profilen von 1) prädisponiert sind, um Schleifen/β-Turns mit exponierten Resten an der Oberfläche des Proteins zu bilden. Die Bildung von Transmembranhelices wird für den Bereich zwischen den Aminosäuren 41–76 von Protein M vorhergesagt, und dies steht im Einklang mit dem hydrophoben Charakter dieses Bereichs und spricht dafür, dass sich die antigenen Peptide von M hauptsächlich in der Ectodomäne (1–40) befinden.
c) Abgleich der Sequenzen des pre-M- und M-Proteins des Denguevirus und anderer Flaviviren. Variabilität und Glycosylierung
Im Allgemeinen sind Bereiche, die nicht dem Lösungsmittel ausgesetzt sind, in Familien von homologen Proteinen stärker konserviert. Daher haben Bereiche mit höherer Variabilität eine größere Wahrscheinlichkeit, exponiert zu sein.
Im Falle von Viren ist die Variabilität auch ein Fluchtmechanismus gegenüber dem immunologischen Druck; selbstverständlich schließt dies nicht aus, dass einige konservierte Bereiche antigen sein könnten oder dass es konservierte Bereiche an der Oberfläche geben könnte.
Die Analyse von Sequenzen von pre-M- und M-Bereichen von 15 Isolaten der 4 Serotypen von Dengueviren zeigen, dass wenigstens 69% der Reste streng konserviert werden. Die wichtigeren variablen Reste befinden sich in den Positionen 28–30, 55–59, 69–72 und 80–83 von pre-M sowie in den Positionen 27–30 von M. Im Allgemeinen entsprechen diese Zonen den Maxima der antigenen Profile von 1.
Der Vergleich der Sequenzen dieser Bereiche in mehr als 30 flaviviralen Isolaten zeigt, dass der Bereich 1–33 von pre-M hochgradig variabel ist, mit möglichen Schleifen, die für Insertionen/Weglassungen (in den Positionen 8 und 30) prädisponiert sind, und mehreren potentiellen Stellen für N-Glycosylierung. Dagegen ist die Variabilität in der Domäne 33–91 von pre-M geringer; es gibt mehrere Positionen, die bei allen Flaviviren streng konserviert sind, zum Beispiel: 6 Cysteine, die 3 Disulfidbrücken bilden, wenigstens 5 saure Reste im Bereich 40–65 sowie die basische Sequenz 87–91, hinter der die endoproteolytische Spaltung unmittelbar vor oder während der Freisetzung des reifen Virus erfolgt (3).
Asn-69, ein konservierter Rest im antigenen Dengue-Komplex, ist die einzige N-Glycosylierungsstelle des pre-M/M-Proteins des Komplexes. In der Familie der Flaviviridae befindet sich dieser Bereich jedoch in einer möglichen exponierten Schleife hoher Variabilität. Gleichzeitig sind die pre-M/M-Reste des Denguevirus, die den potentiellen N-Glycosylierungsstellen bei anderen Flaviviren entsprechen (zum Beispiel AA 14 in JE, SLE, MVE und YF sowie AA 32 in LI, LAN, YF und TBE), sind β-Turns in der Nähe von Zonen, die als antigen gelten.
1.2 Vorhersage von T-Zell-Epitopen
Die Vorhersage erfolgte durch zwei unabhängige Verfahren: das Musterverfahren nach Rothbard und Taylor (Rothbard, J. B. und Taylor, W. R., 1988, A sequence pattern common to T-cell epitopes, EMBO J. 7, S. 93) und die Bestimmung von Fragmenten mit einer Neigung zur Bildung von alpha-Helix-Strukturen (AMPHI 7 und 11) (Margalit, H. et al. 1987, Prediction of immunodominant helper T cell antigenic sites from the primary sequence, J. Immunol. 138, S. 2213). Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt.
1.3 Peptide, die zur Identifizierung von relevanten Epitopen vorgeschlagen werden
Die Bestimmung von neutralisierenden und schützenden Peptiden im Allgemeinen ist sehr wichtig für die Entwicklung von effizienteren Impfstoffen, und Peptide aus Bereichen mit hoher antigener Neigung sind für ihre Identifizierung sehr nützlich; insbesondere solche linearer Natur.
Tabelle 1 zeigt eine Menge von Peptiden, die Bereiche enthalten, welche prädisponiert sind, um B- und T-Zell-Epitope (gemäß den mehreren Vorhersageverfahren, die in diesem Beispiel verwendet werden) des pre-M/M-Proteins des D2-Virus aufzuweisen. Wenn die Gültigkeit dieser Vorhersage experimentell nachgewiesen wird, werden die immunologisch wichtigen Epitope jedes Bereichs durch die Gestaltung von kleineren Peptiden innerhalb jeden Bereichs genau lokalisiert.
Tabelle 1. Antigene Peptide, die im pre-M/M-Protein des Dengue-2-Virus vorgeschlagen werden
Beispiel 2. Chemische Synthese von Oligopeptiden und Oligonucleotiden
2.1. Synthese von Oligopeptiden
Alle Peptide wurden unter Verwendung einer Boc-Strategie in fester Phase am p-Methylbenzhydrylamin-Harz (MBHA-Harz, Bachem, Schweiz) synthetisiert.
Die geschützten Aminosäuren wurden von Bachem erhalten. Der Schutz von reaktiven Gruppen der Aminosäurekette war wie folgt: Arg (Tos), Asp (OBzl), Cys (4-Me-Bzl), Glu (OBzl), Lys (2-Cl-Z), Trp (CHO), Tyr (Cl₂-Bzl), Thr (Bzl). Asn, Gln und Pro wurden ohne Schutz in den Seitenketten verwendet.
Die Entfernung der Boc-Amino-Schutzgruppe wurde unter Verwendung von 37,5%iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan durchgeführt. Für die Kopplungsreaktion jedes Restes wurde eine Aktivierung mit Diisopropylcarbodiimid (DIC) in situ verwendet, außer bei den Aminosäuren Asn und Gln, die unter Verwendung von DIC und 1-Hydroxybenzotriazol in N,N-Dimethylformamid aktiviert wurden.
Die endgültige Entfernung der Schutzgruppen und Peptidfreisetzung vom Harz wurden in speziellen Geräten erreicht. Das verwendete Verfahren ist als Low-High-HF bekannt.
Während des ersten Teils des Verfahrens (Low HF) wurde das geschützte Harzsystem 120 Minuten lang bei 0°C mit HF (25%) : DMS (65%) : p-Kresol (10%) behandelt. Im Falle von Trp-enthaltenden Peptiden wurde das Gemisch durch HF (25%) : DMS (60%) : EDT (10%) : p-Kresol (5%) ersetzt. Anschließend wurde das Harz-Peptid mehrmals mit Diethylether, Dichlormethan und 2-Propanol gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Während des zweiten Teils des Verfahrens (High HF) wurde das Harz-Peptid 60 Minuten lang bei 0°C mit HF (90%) : Anisol (10%) behandelt.
Das Rohprodukt wurde mit Ether gewaschen, dann mit 30% Essigsäure in Wasser extrahiert und schließlich lyophilisiert.
Die Peptide wurden durch RP-HPLC in einer Baker-C-18-Säule (4,6 × 100 mm) und durch Massenspektrometrie unter Verwendung von FAB als Ionisierungsverfahren in einem Gerät des Typs JEOL HX-110 HF charakterisiert.
Die Aminosäuresequenz sowie ihre Position im pre-M/M-Protein des Denguevirus ist in Tabelle 1 gezeigt.
2.2. Synthese von Oligonucleotiden
Oligonucleotide wurden automatisch in dem Gerät Gene Assembler Plus gemäß dem Phosphoramidit-Verfahren synthetisiert.
Die Sequenz der sechs Oligonucleotide ist in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2. XbaI- und EcoRI-Stellen, die am Ende jeweils für die spätere Manipulation erzeugt wurden, sind unterstrichen bzw. doppelt unterstrichen. Das Leseraster des codierten Proteins ist durch die Basentripletts definiert
Beispiel 3. Kopplung von Peptiden an ein Trägerprotein und Immunisierungsschema
3.1 Kopplung von Peptiden an BSA
Die Kopplung von Peptiden wurde wie folgt durchgeführt:

1. Aktivierung von BSA: Tropfenweise und unter Schütteln wurden 80 μl einer Lösung des bifunktionellen Reagens m-Maleinimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS) [5 μg/μl] in Dimethylformamid zu einer Lösung von 2,8 mg Rinderalbuminfraktion V (BSA) in 250 μl PBS gegeben. Dann wurde es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in Bewegung gehalten, und das Gemisch wurde durch eine PD10-Säule gegeben.
2. Kopplung des Peptids an das aktivierte BSA: Eine Lösung von 1 mg Peptid in 300 μl PBS wurde tropfenweise und unter Schütteln zu der Lösung des aktivierten BSA gegeben. Es wurde 3 Stunden lang auf Raumtemperatur gehalten, und die Konzentration wurde nach dem Lowry-Verfahren bestimmt.

3.2 Immunisierungsschema
Das Immunisierungsschema von an BSA gebundenen Peptiden ist wie folgt:
Männliche Balb/c-Mäuse im Alter von 4–6 Wochen wurden intraperitoneal mit 50 μg des Peptid-BSA-Konjugats immunisiert. Außerdem wurden zwei Immunisierungsschemata durchgeführt, eines mit BSA und das andere mit PBS. Insgesamt 4 Impfungen wurden im Abstand von jeweils 15 Tagen durchgeführt. In den ersten Dosen wurde Freunds vollständiges Adjuvans und in den anderen Freunds unvollständiges Adjuvans verwendet. Sieben Tage nach der letzten Impfung wurde eine Blutprobe aus der Retroorbitalvene entnommen.
Die erhaltenen Seren von jedem Schema wurden zur späteren Verwendung bei –20°C aufbewahrt.
Beispiel 4. In-vitro-Plaque-Reduktions-Neutralisationstest
Die Neutralisationstechnik wurde nach Morens durchgeführt (Morens, D. M. et al. 1985, Simplified plaque reduction neutralization assay for dengue viruses by semimicro methods in BKH-21 cells: Comparison of the BHK suspension test with standard plaque reduction neutralization, J. Clin. Microbiol. 22, S. 250).
Verdünnungen von Anti-Peptid-Seren und Anti-BSA-Kontrollen sowie negativen Seren von 1/10 bis 1/640 wurden hergestellt. Jede Verdünnung von Seren wurde mit einer Verdünnung des Virus (Stamm A 15 von Dengue 2), die 15–20 PFU/50 μl aufwies, in Kontakt gebracht.
Das Gemisch wurde 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Insgesamt 50 μl von jedem Gemisch wurden in dreifachen Parallelansätzen zu BHK-21-Zellen in 24-Napf-Platten gegeben und 4 Stunden lang in einem CO₂-Inkubator bei 37°C inkubiert. Dann wurden 0,5 ml Carboxymethylcellulose-haltiges Medium hinzugefügt, und es wurde je nach dem verwendeten viralen Serotyp wiederum mehrere Tage lang inkubiert. Nach diesen Tagen wurde angefärbt, und die Anzahl der von dem Virus erzeugten Lyseplaques wurde bestimmt.
Der Titer wurde in jedem Fall ausgedrückt als die Verdünnung, bei der 50% der Reduktion der Plaquezahl erhalten wurde.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3. PRNT der Antipeptidseren gegen 19-6 und 20-3
Beispiel 5. Identifizierung von T-Zell-Epitopen
Die Anwesenheit von T-Zell-Epitopen in den Peptiden von pre-M wurde durch die Untersuchung der Anti-Peptid-Antikörper-Reaktion bewertet, die in mit freien Peptiden (nichtkonjugiert) immunisierten Mäusen hervorgerufen wurde. Sensibilisierte Tiere zeigten eine höhere Serumantikörperproduktion als Reaktion auf eine Auffrischungsdosis des Antigens im Vergleich zur Reaktion bei naiven Tieren. Diese Ergebnisse bestätigen die Existenz von B-Zell-Epitopen in diesen Peptiden und zeigen, dass diese Sequenzen T-Zell-Epitope enthalten, die in der Lage sind, Th-Aktivität in vivo zu stimulieren und so die Titer der Antikörperreaktion zu verbessern.
Virusspezifische proliferative Reaktionen von Milz-T-Lymphocyten wurden in peptidimmunisierten BALB/c-Mäusen gezeigt. T-Zellen von mit 19-6 und 19-5 immunisierten Mäusen proliferierten in einem in-vitro-Blastogenese-Assay, wenn sie mit dem Dengue-2-Virus kultiviert wurden. Das 20-2-Peptid rief jedoch keine signifikante proliferative Reaktion gegen das Virus hervor. Es könnte ein T-Zellkryptisches Epitop enthalten, das in der freien Form des Peptids erkannt wird, aber nicht als Ergebnis der Präsentierung immundominanter Epitope und Prozessierung des Virus bei einer natürlichen Infektion (5).
Beispiel 6. Schutzassay
Mäuse wurden 7 Tage nach der letzten Immunisierung durch Injektion einer 1/2500-Verdünnung (entspricht 100 LD₅₀-Dosen) eines lebenden mäuseadaptierten Dengue-2-Virus (Stamm A15) in den Schädel gereizt. Die Mäuse wurden bis zu 21 Tage lang in Bezug auf Morbidität und Mortalität beobachtet. Die Daten wurden unter Verwendung eines Fisher-Tests auf statistische Signifikanz getestet. Die prozentuale Überlebensrate bei peptidimmunisierten und Kontrolltieren sind in 6 gezeigt. Der Grad des Schutzes, der für die Peptide 19-5, 19-6 und 20-1 induziert wurde, war statistisch signifikant (p < 0,05).
Beispiel 7. Indirekter ELISA zum Nachweis von Anti-Peptid-Antikörpern
Humanseren
Die Peptide 19-6, 20-1, 20-2, 20-3 wurden in einer Konzentration von 10 μg/ml in Beschichtungspuffer an den Platten fixiert, und dann wurden sie über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Seren wurden in einer Verdünnung von 1/200 in PBS-Tween 20 hinzugefügt. Schließlich wurde ein Konjugat von Anti-Gesamt-Human-Immunglobulin und Peroxidase hinzugefügt, und anschließend wurde das Substrat (ortho-Phenylendiamin, H₂O₂, 0,05 M Phosphat-Citrat-Puffer, pH 5) hinzugefügt. Das Ablesen erfolgte in einem ELISA-Lesegerät bei 492 nm, und der Schwellenwert für jedes Peptid wurde bestimmt.
Die verwendeten Seren stammten von Patienten mit einer viralen klinischen Infektion, die anhand von Hämagglutinationshemmungstechniken (Clarke, D. H. und Casals, J. 1958, Techniques for hemagglutination and hemagglutinationinhibition with Arthropod Borne Virus, Am. J. Trop. Med. Hyg. 7, S. 561) und inhibitorischem ELISA (Vázquez, S. und Fernández, R. 1989, Utilización de un método de ELISA de Inhibición en el diagnóstico serológico de dengue, Rev. Cub. Med. Trop. 41(1), S. 18–26) für Gesamt-Anti-Dengue-Antikörper serologisch als Dengue diagnostiziert wurde.
Die Studie umfasste 118 Seren von Patienten der Epidemie, die in Kuba 1981, Panama 1994 und Costa Rica 1994 auftrat. Bei dieser Epidemie wurde das Denguevirus 2 isoliert, neben dem Serotyp 1 und 4 in Costa Rica; sie wurden in Fällen von primären und sekundären Infektionen gemäß den Titern von Hämagglutinationshemmenden Antikörpern klassifiziert.
46,6% der Seren reagierten positiv auf die 4 verwendeten Peptide. Es wurden Prozentsätze der Positivität gegenüber den Peptiden B 19-6, 20-1, 20-2 und 20-3 von 56,8%, 79,6%, 77,1% bzw. 83,1% erhalten.
Der Mittelwert des Reaktivitätsindex, der durch den Quotienten der optischen Dichte der Probe und des Schwellenwerts berechnet wurde, betrug für jedes Peptid 1,07, 1,52, 1,57 bzw. 1,49.
Mäuseseren
Der verwendete indirekte ELISA war so, wie es oben beschrieben ist, aber unter Verwendung eines Anti-Maus-Ig, der an Peroxidase konjugiert war. Die Antikörpertiter, die in den Antipeptidseren erhalten wurden, lagen im Allgemeinen oberhalb von 1/10000.
Beispiel 8. Insertion von pre-M/M-Fragmenten in das P64k-Protein von Neisseria meningitidis
In diesem Beispiel exprimierten wir Fragmente des pre-M/M-Proteins von Dengue 2 (A-15-Stamm) und von Dengue 4 (814669-Stamm) (Zhao, B. et al. 1986, Cloning full-length dengue type 4 viral DNA sequences: analysis of genes coding for structural proteins, Virol. 155, S. 77), die in ein N.-meningitidis-Protein insertiert waren, welches zuvor in unserer Gruppe charakterisiert worden war (Silva, R. et al. 1992, Nucleotide sequence coding for an outer membrane protein from Neisseria meningitidis and use of said protein in vaccine preparations, Europäisches Patent 0 474 313, 1997): P64k, das sich in mehreren Tiermodellen als hochgradig immunogen erwiesen hat. Außerdem erreicht das Niveau der Expression von P64k in E. coli mehr als 30% des Gesamtproteins der Bakterien.
Das P64k-Protein (64 kD), das dimerer Natur ist, hat in jeder Untereinheit zwei funktionelle Domänen: eine mit Liponsäure-bindender Aktivität (1–100) und die andere mit Lipoamid-Dehydrogenase-Aktivität (117–594). Beide wurden durch Röntgenkristallographie als relativ unabhängige konformatorische Domänen identifiziert (Li de la Sierra, I. et al. 1994, Crystallization and preliminary X-ray investigation of a recombinant outer membrane protein from Neisseria meningitidis, J. Mol. Biol. 235, S. 1154; Li de la Sierra, I. et al. 1997, Molecular Structure of the lipoamide dehydrogenase domain of a surface antigen from Neisseria meningitidis, J. Mol. Biol. 269, S. 129).
Die erstere Domäne wurde ausgewählt (in den Aminosäurepositionen 40–45), um die Insertionen der Fragmente 1–42 und 92–133 von pre-M/M durchzuführen, da diese kleine Domäne stärker exponiert ist und nicht an der Dimerbildung beteiligt zu sein scheint. Dies ließ vermuten, dass die globale Struktur des chimärischen Proteins in Bezug auf das natürliche P64k weniger verändert wäre, als wenn eine Insertionsstelle in der Domäne 117–594 verwendet würde, die außerdem direkt an der Bildung des Dimers beteiligt ist.
Der Bereich, der für die Aminosäuren 38–47 (TLETDKATMD) codiert, welche den Bereich der Liponsäurebindung des P64k-Gens beinhaltet, der bei der Herstellung von Fusionsproteinen verwendet wird, wurde im voraus zu TLDLEMD geändert. Diese Modifikation wurde durchgeführt, um die Erkennung von P64k durch die Seren von Patienten mit primärer biliärer Zirrhose zu vermeiden, die Selbstantikörper gegen homologe Epitope aufweisen, die sich in der humanen mitochondrialen Dehydrolipoamid-Acetyltransferase befinden (Tuaillon, N. et al. 1992, A lipoyl synthetic octadecapeptide of dihydrolipoamide acetyl transferase specifically recognized by anti-M2 autoantibodies in primary biliary cirrhosis, J. Immunol. 148, S. 445).
Die Strategie zur Herstellung der beiden Klone ist im Folgenden erläutert:
Die Fragmente Pre-2, M-2 und M-4 wurden durch Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert, wobei man eine Kombination der Oligonucleotide 1 und 2, 3 und 4 bzw. 5 und 6 verwendete (siehe Tabelle 2) und das Plasmid pD-5 als Matrize verwendete. Dieses Plasmid pD-5 beinhaltet eine Kopie des pre-M/M-Gens vom Dengue-2-Virus (Stamm A-15), die in den pBluescript-Vektor (Stratagene) kloniert ist. DNA-Banden, die in jedem Fall erhalten wurden (120 bp), wurden mit XbaI (Pre-2 und M-2) oder XbaI/EcoRI (M-4) abgebaut, und sie wurden in die entsprechenden Stellen, die in Position 135–145 des P64k-Gens künstlich geschaffen worden waren, in den Vektor pM-92 einkloniert. Außerdem wurde ein chimärischer Klon, der die M-2- und M-4-Banden in den bereits erwähnten Stellen XbaI und EcoRI enthält, durch dreifache Ligierung erzeugt. Rekombinante Klone, die die Inserts in der richtigen Orientierung tragen, wurden durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzierung identifiziert.
Die durch die Klone von Pre-2 (pD31), M-2 (pD30), M-2/M-4 (pD33) und M-4 (pD34) erzeugten Fusionsproteine wurden unter dem Promotor des Tryptophanoperons (ptrp) im E.-coli-Stamm MM294 exprimiert (F^– end A1 hsdR17 (rk^– mk⁺) sup E44 thi-1 relA1? RfbD1? SpoT1?). Alle wurden in den erwarteten Größen und mit Expressionsniveaus von bis zu 30% der Gesamtproteine der Bakterien erhalten, wenn das PD31-Protein auch eine hohe Instabilität zeigte (7). Alle Fusionsproteine wurden im ELISA (Daten nicht gezeigt) und Western-Blotting (8), wo ein bemerkenswerter Abbau im Vollzellextrakt nachgewiesen wurde, von einigen monoklonalen Maus-Anti-P64k-Antikörpern erkannt. Die Aminosäuresequenz dieser Proteine ist im Sequenzprotokoll gezeigt.
Die Immunisierung von Mäusen mit den Fusionsproteinen PD33 und PD34, die nach einer nichtdenaturierenden Vorschrift halbgereinigt wurden, rief im ELISA hohe Titer gegen sie hervor (bis zu 1/100000), und gleichzeitig wurden im ELISA gegen die synthetischen Peptide Antikörper mit Titern von bis zu 1/4000 erhalten.
Beschreibung der Figuren
1. Hydrophilie-, Zugänglichkeits- und Flexibilitätsprofile des pre-M- (A) und des M-Proteins (B) des Denguevirus.
2. Vorhersage der Sekundärstruktur und der Zugänglichkeit des pre-M- (A) und des M-Proteins (B). AA: Aminosäuren. PHD sec: Vorhersage der Sekundärstruktur (E = beta, H = Helix, L = Schleife); P_3 acc: Vorhersage der Zugänglichkeit (e = exponiert, b = nicht exponiert). Sub sec (Sub acc): Reste, bei denen die Vorhersage der Sekundärstruktur (Zugänglichkeit) zu 82,4% (70%) wirksam ist.
3. Variabilitätsprofile des pre-M- und des M-Proteins. Die Variabilität wurde unter Berücksichtigung von 3 Gruppen von Flavivirus-Sequenzen berechnet. Dengue: Sequenzen von 15 Dengue-Isolierungen. MBV: von Stechmücken übertragene Flavivirus-Sequenzen einschließlich Denguevirus, Kunji, West-Nile-Virus, Murray-Valley-Encephalitis und Saint-Louis-Encephalitis. Flavivirus: Sequenzen von mehr als 30 verschiedenen Flavivirus-Isolierungen: (MBV + Gelbfieber, Langat, Louping Ill und Zeckenencephalitis).
4. Vorhersage von T-Zell-Epitopen des pre-M- (A) und des M-Proteins (B): AMPHI 7 (11): Vorhersage von amphipathischen Segmenten von 7 (11) Resten, positive Reste sind die zentralen Aminosäuren eines potentiell antigenen amphipathischen Blocks. RT 4 (5): Vorhersage der antigenen Profile von 4 (5) Resten, positive Reste sind solche, die die Profile erfüllen.
5. Proliferative Reaktion auf Dengue-2-Virus-Antigene (bei Konzentrationen von 10, 20 und 40 μg/ml) von Milz-T-Zellen aus mit Peptiden immunisierten Mäusen 19-6, 19-5 und 20-2.
6. Prozentuale Überlebensrate bei peptidimmunisierten und Kontrolltieren. Der Grad des induzierten Schutzes für die Peptide 19-5, 19-6 und 20-1 war statistisch signifikant.
7. 10% SDS-PAGE des E.-coli-Stammes MM294, transformiert mit Fusionsproteinen und dem P64k-Protein (pM-92-Plasmid). Bahnen: 1 – untransformierter MM294-Stamm, 2 – pM-92/MM294, 3 – pD-30/MM294, 4 – pD-31/MM294, 5 – pD-33/MM294, 6 – pD-34/MM294.
8. Western-Blot unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers 114 gegen P64k, das vom Plasmid pM-92 im E.-coli-Stamm MM 296 exprimiert wurde. Bahnen: 1 – untransformierter MM294-Stamm, 2 – pM-92/MM294, 3 – pD-30/MM294, 4 – pD-31/MM294, 5 – pD-33/MM294, 6 – pD-34/MM294.
Sequenzprotokoll

Claims

Denguevirus-spezifisches Peptid, das ein Epitop des Pre-M/M-Proteins von wenigstens einem Denguevirus-Serotyp umfasst, wobei es sich bei dem Peptid um die Aminosäuren Nr. 3–31, die Aminosäuren Nr. 69–93 oder die Aminosäuren Nr. 103–124 von Pre-M/M handelt.
Denguevirus-spezifisches Peptid gemäß Anspruch 1, wobei das Peptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 4 und SEQ ID Nr. 5 besteht.
Fusionsprotein mit einem Trägerprotein und einer Dengue-spezifischen Aminosäuresequenz, die ein Epitop des Dengue-2- und/oder Dengue-4-Virus umfasst, wobei es sich bei der Dengue-spezifischen Aminosäuresequenz um die Aminosäuren Nr. 1–42 oder die Aminosäuren Nr. 92–134 von Pre-M/M-Proteins dieses Virus handelt.
Fusionsprotein gemäß Anspruch 3, wobei es sich bei dem Trägerprotein um P64k von Neisseria meningitidis handelt und die Dengue-spezifische Aminosäuresequenz nach der Aminosäure Nr. 42 von P64k eingesetzt ist.
Fusionsprotein gemäß Anspruch 4, das eine Sequenz aus der Gruppe umfasst, die aus SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 8 und SEQ ID Nr. 9 besteht.
Dengue-spezifischer Antikörper, der an ein Epitop des Pre-M/M-Proteins eines Denguevirus bindet, wobei das Epitop wie in Anspruch 1 oder 2 definiert ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gegen Denguefieber, die einen Dengue-spezifischen Antikörper gemäß Anspruch 6 umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Denguevirus-spezifisches Peptid gemäß Anspruch 1 oder 2, das gegebenenfalls mit einer Trägersubstanz konjugiert ist, oder ein Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5 umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, die ein Adjuvans enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 8 oder 9, bei der es sich um einen Impfstoff gegen Denguefieber handelt.