DE69827260T2

DE69827260T2 - Konjugate von transportpeptiden und nukleinsäureanaloga und deren verwendung

Info

Publication number: DE69827260T2
Application number: DE69827260T
Authority: DE
Inventors: Ulo Langel; Tamas Bartfai; Margus Pooga; Andres Valkna; Kulliki Saar; Mattias Hallbrink
Original assignee: PerSeptive Biosystems Inc
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 1997-07-24
Filing date: 1998-07-16
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2018-07-17
Also published as: AU741546B2; EP0998577B1; WO1999005302A1; EP0998577A1; AU8408098A; DE69827260D1; CA2298067A1; JP2002511885A; US6025140A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich im allgemeinen auf die Gebiete der Molekularbiologie und der Zellbiologie. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf den Transport von membran-permeablen Molekülen durch Lipidmembranen von Zellen, um die Moleküle mit bestimmten intrazellulären DNA- und RNA-Sequenzen in Kontakt zu bringen.
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HINTERGRUND
Der Transport von Oligonukleotiden, Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga in Zellen ist ein grundlegendes Erfordernis für deren therapeutische Wirksamkeit als Antisense-Agenzien (Yabukov, 1989). Die Hauptprobleme bei erhältlichen Antisense-Reagenzien liegen in ihrer niedrigen intrazellulären Stabilität und in der ineffizienten zellulären Aufnahme (Stein, 1993). Weiterhin führen die hohen Dosen von Antisense-Reagenzien, die für eine therapeutische Wirkung notwendig sind, häufig zu toxischen Nebenwirkungen. Diese Nachteile können umgangen werden, indem man Nuklease-resistente Oligonukleotide verabreicht (Bennet, 1998), oder indem man den intrazellulären Transport von Antisense-Oligonukleotiden erhöht. Aufgrund ihres hydrophoben Inneren, ist die Lipid-Doppelschicht der Plasmamembran eine höchst undurchlässige Barriere für die meisten polaren und geladenen Moleküle (Alberts, 1989). Viele Antisense-Nukleinsäuren scheitern als mögliche Arzneistoffkandidaten da sie keine wirksame Pharmakokinetik erreichen, d. h. keine wirksamen intrazellulären Konzentrationen.
Der Antisense-Ansatz beruht auf dem Transport spezifischer Nukleinsäuren oder Nukleinsäure-Analoga zur Hemmung der Expression oder Replikation von DNA auf transkriptioneller Ebene („Antigen") oder mRNA auf translationeller Ebene („Antisense"). Aus den vielen Studien zu den Wirkweisen von Antigen und Antisense ist es klar, das die Aufnahme durch die Zelle und die Verteilung der Schlüssel zur therapeutischen Wirkung sind (Helene, 1990; Akhtar, 1992; Stein, 1993). Die vorliegende Erfindung erreicht Verbesserungen dieser wichtigen Parameter.
Angesichts der Beschränkungen und der Mängel bei herkömmlichen Konstrukten von Peptiden und Nukleinsäureanaloga und ungeeigneter Verfahren zum intrazellulären Transport durch Membranen ist es von Interesse, neue Konstrukte mit membran-durchgängigen Eigenschaften zu entwickeln. Konstrukte, die Peptid- und Peptid-Analog-Sequenzen enthalten, die in hoher Konzentration und schnell durch Lipidmembranen transportiert werden, sind wünschenswert. Nukleinsäure-Analoga-Reste von Konstrukten, die nach dem Transport freigesetzt werden können und mit Zielmolekülen wechselwirken, sind hoch wünschenswert. Weiterhin ist es wünschenswert, spaltbare Linker zwischen dem Peptid- und dem Nukleinsäure-Analoga-Rest der Konstrukte bereitzustellen.
Nukleinsäure-Analoga, die an Zielpolynukleotide hybridisieren können, sind besonders erwünscht. Hydrophobe, ungeladene Nukleinsäureanaloga sind als Nukleinsäure-Analoga-Reste bevorzugt. Wirksame Verfahren zur Synthese und Aufreinigung der Konstrukte sind wünschenswert. Die Erfindung stellt Lösungen für einige der Beschränkungen und Mängel beim Transport und Ausrichten von Molekülen in Zellen über optimierte Konstrukte und Verfahren bereit.
ZUSAMMENFASSUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf neue Konstrukte aus Peptiden und Nukleinsäureanaloga gerichtet, die aneinander konjugiert sind, für den Transport durch eine Lipidmembran und für den Transport im interaktiven Kontakt mit intrazellulären Polynukleotiden wie RNA, DNA, Enzymen, Rezeptoren und regulatorischen Elementen. Der Transport erfolgt durch die Membran der Zelle, und durch die Wände einiger subzellulärer Strukturen, einschließlich Nukleus, Mitochondrien, Ribosomen, etc.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet zwei Peptide, die die intrazelluläre Verteilung von Nukleinsäureanaloga erhöhen, z. B. PNA: (i) Transportan, Galanin (1-12)-Lys-Mastoparan (1-14) Amid (Pooga, 1998), und (ii) pAntennapedia, pAntp(43-58) (Allinquant, 1994, Troy, 1996, Derossi, 1996). Es wurde gezeigt, dass beide Peptide in Zellen in einer energie- und rezeptorunabhängigen Weise eintreten. Viele andere Proteine können an Nukleinsäureanaloga gekoppelt und wegen ihrer Membran-durchgängigen Eigenschaften verwendet werden (Alberts, 1989), z. B. grün fluoreszierendes Protein (Chalfie, 1995) und konservative Varianten davon.
Im allgemeinen umfasst der Peptidrest im erfindungsgemäßen Konstrukt die Abfolge von Aminosäuren:
INLKALAALAKKIL (SEQ ID NO. 1)
Nach dem 1-Buchstaben-Aminosäurecode (Tabelle 1), wobei der C-Terminus vorzugsweise so funktionalisiert ist, dass er eine Amidgruppe, Homologe davon, konservative Varianten davon oder Peptidanaloga davon bildet, die die membrandurchgängige Eigenschaft der Sequenz erhalten.
Das gegenwärtig am meisten bevorzugte Peptid zur Verleihung dieser Zellmembrandurchgängigen Eigenschaft hat die Aminosäuresequenz des Peptids, das als Transportan oder Galparan bezeichnet wird (Pooga, 1998):
GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL-Amid (SEQ ID NO: 3).
Vorzugsweise ist das Nukleinsäureanalogon, das an dieses Peptid gekoppelt ist, an den ersten (von N nach C, oder links nach rechts) Lysinrest K gekoppelt, durch ein schwache Bindung, wie eine Disulfidbrücke, die ein Paar von Cysteinresten verbindet. Für die Stabilität und die einfache Synthese und Aufreinigung wird die Carboxylgruppe des C-Terminus typischerweise über den geeigneten Synthese-Unterstützungs-Linker in ein Amid umgewandelt.
Ein erster Aspekt der Erfindung ist ein Konstrukt, umfassen einen Nukleinsäureanalog-Rest, der an komplementäre Zielsequenzen in der Zelle bindet. Das Nukleinsäureanalog kann von jeglicher Art sein, die für die Verwendung in der Antisense-Technologie vorgeschlagen wird oder verwendet wird, z. B. eine Peptid-Nukleinsäure (PNA).
In einer bevorzugten Ausführungsform hybridisiert das Nukleinsäureanalog mit komplementären, intrazellulären Polynukleotiden. Die Erfindung stellt Konstrukte zur Verfügung, umfassend hybridisierende Nukleinsäureanalog-Reste wie PNA, PNA-DNA-Chimären oder eine PNA-Nukleinsäureanalog-Chimäre die mit der komplementären Sequenz eines intrazellulären Polynukleotids hybridisieren kann.
Das am meisten bevorzugte Nukleinsäureanalog ist eine Peptid-Nukleinsäure (PNA) mit einem 2-Aminoethylglycin-Gerüst (Nielsen et al., 1991).
In einem zweiten Aspekt der Erfindung kann das Nukleinsäureanalog aus Modifikation an der Internukleotidverknüpfung, dem Zucker, oder den Nukleobasenresten einer Nukleinsäure bestehen. Beispiele von geeigneten modifizierten Nukleinsäureanaloga sind 2'-O-Methyl und andere 2'-O-Alkyl-Oligoribonukleotide, Phosphorthioat und andere Phosphatanaloga, und Ähnliche. Das Nukleinsäureanalogon wird nach mehreren Eigenschaften ausgewählt, einschließlich (i) hohe Spezifität, (ii) hohe Affinität, (iii) keine Verlängerbarkeit durch Polymerase, (iv) chemische Stabilität und (v) Nuklease-Resistenz. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Nukleinsäureanaloga ein PNA (Peptide-Nukleinsäure) Oligomer (Nielsen, 1991). Zur Verbesserung der Löslichkeit und zur Reduzierung von Aggregationseffekten können die PNA-Nukleinsäureanaloga an hydrophile Modifikatoren gekoppelt werden, wie Polyethylenoxy, Peptide, Nukleinsäuren, Nukleinsäureanaloga und Ähnliche.
In einem dritten Aspekt ist das erfindungsgemäße Nukleinsäureanalog an ein Peptid gekoppelt, das den Transport durch eine Lipidmembran bewirkt und dann ermöglicht, das Nukleinsäureanalog intrazellulären Polynukleotiden zu präsentieren, wobei Duplex- oder Triplexstrukturen gebildet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung sind das hybridisierende Nukleinsäureanalog und das den Transport vermittelnde Peptid durch eine Bindung gekoppelt, die in der intrazellulären Umgebung schwach ist, so dass das hybridisierende Nukleinsäureanalog gespalten und freigesetzt wird, wodurch die Nukleinsäureanalog- und Peptidreste physikalisch getrennt werden. Ein Beispiel für eine schwache Bindung ist eine Disulfidbrücke, wobei die Disulfidbrücke nach Kontakt mit einem intrazellulären exogenen Enzym oder Reduzierungsmittel, wie Glutathion oder NADPH, aufgebrochen oder gespalten wird, wodurch die Nukleinsäureanalog- und Peptidreste getrennt werden (Stryer, 1981). Konstrukte mit einer Disulfidbrücke zwischen Cystein-Aminosäureresten, die an die Nukleinsäureanaloga und das Peptid gebunden sind, sind bevorzugte Ausführungsformen und werden leicht hergestellt, und sind in geeigneter Weise labil zur Freisetzung der Nukleinsäureanaloga zur Hybridisierung mit Zielpolynukleotiden. Andere schwache Bindungen zur Kopplung der Nukleinsäureanaloga und der Peptidreste umfassen Ester (-CO₂-), Carbamat (-NHCO₂-) und Sulfonat (-SO₃-), welche die Nukleinsäureanaloga durch enzymatische Katalyse oder durch Hydrolyse (Meyer, 1994) freisetzen können.
In einem vierten Aspekt der Erfindung werden in vitro Verfahren und bestimmte Sets von Konstrukten bereitgestellt, die dazu verwendet werden können, DNA-Transkription, RNA-Translation, RNA- oder DNA-Expression, DNA-Replikation, RNA-reverse Transkription oder die regulatorische Funktion von DNA oder RNA auf intrazelluläre Polynukleotide selektiv zu blockieren, z. B. für Forschungszwecke als Hilfsmittel bei der Bestimmung einer Struktur/Funktions-Beziehung auf molekularer Ebene oder für therapeutische Zwecke. Im allgemeinen umfassen die in vitro Verfahren die Schritte der Bereitstellung eines oder eines Satz von Nukleinsäureanaloga, die mit einem oder einer Untergruppe von intrazellulären Polynukleotidsequenzen hybridisieren. Diese Konstrukte werden mit einer Zelle in Kontakt gebracht und können in Konzentrationen wirksam sein, die 10 nM oder weniger betragen, und die, wenn sie durch Zellmembranen transportieren, direkt für die Hybridisierung oder für anderen wechselwirkenden Kontakt mit intrazellulären Molekülen im Zytosol oder anderen subzellulären Kompartimenten exponiert werden, und mit Ziel-DNA oder -RNA hybridisieren können, und typischerweise wenigstens zeitweise die normale Funktion des intrazellulären Polynukleotids hemmen oder blockieren.
In einem fünften Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung eine Chimäre, konjugiert an einen stabilisierenden Rest, der dazu dient, die intermolekulare Stabilität der Duplex zu erhöhen, erhöhte Nachweisbarkeit und/oder Fähigkeit zum „Capture" bereitzustellen. Bevorzugte Reste zur Erhöhung der Stabilität der intermolekularen Duplex umfassen Agenzien, die an die minor groove binden, wie Hoechst 33258 (Wiederholt, 1996), CC-1065 (Hanka, 1978), CDPI3 (Kumar, 1998) und Interkalatoren, wie Acridin, Ethidiumbromid, Spermin, Polykationen und Ähnliche (Blackburn, 1996).
Zur Erhöhung der Nachweisbarkeit des Konstrukts oder der Nukleinsäureanaloga können die Nukleinsäureanaloga an eine Markierung, z. B. an einen Fluoreszenzfarbstoff einschließlich Rhodamin, Fluorescein, Cyanin und Ähnliche konjugiert werden. Zur Erleichterung des Nachweis, des „Capture" oder der Immobilisierung, kann ein Konstrukt mit Biotin, Digoxygenin oder Peptiden konjugiert werden. Die Markierung kann über eine der bekannten Konjugierungsverfahren (Andrus, 1995; Hermanson, 1996) an die Chimäre angeheftet werden.
Ein sechster Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur genauen Echtzeit-Überwachung durch in situ Nachweis von fluoreszenzmarkierten Konstrukten bereit, die mit gewünschten intrazellulären Molekülen wechselwirken durch Spezifizierung von Fluoreszenzreagenzien zur Erzeugung eines stabilen Fluoreszenzsignals, das proportional zur Menge der transkriptionellen oder translationalen Hemmung ist (Houseal, 1993). Die intrazelluläre Position der transportierten Konstrukte kann innerhalb bestimmter Organellen und Eigenschaften lokalisiert und sichtbar gemacht werden, wie z. B. im Nukleus, den Mitochondrien, Membranen und Ähnlichen. In Ähnlicher Weise können chemilumineszierend markierte Konstrukte dazu getriggert werden, Licht auszusenden und ähnliche Nachweissignale bereitzustellen. Adamantyl 1,2-Dioxetan-markierte Konstrukte können nach Dephosphorylierung durch alkalische Phosphatase ring-geöffnet werden, wodurch Licht erzeugt wird, das durch einen Luminometer oder durch eine andere Licht-sammelnde oder lichtempfindliche Vorrichtung (Bronstein, 1990; Bronstein, 1994) messbar ist.
Die Hybridisierung von Fluoreszierer- und Quencher-markierten Konstrukten kann zu einem Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfereffekt (FRET) führen, wodurch man quantitative Information über die Kopiezahl und die Expressionshöhe bestimmter Gene und Sequenzen erhält (Clegg, 1992; Cardullo, 1988; Livak, 1995).
Es ist für den Fachmann verständlich, dass, obwohl die Erfindung hier in Form spezifischer Sequenzen von Aminosäuren verkörpert ist, von denen man entdeckt hat, dass sie wirksam Membrantransport induzieren können, bestimmte Homologa, verkürzte Proteine, Fusionsproteine, konservative Varianten, Speziesvarianten, und andere verwandte Konstrukte, die durch andere Aminosäuresequenzen charakterisiert sind, aber trotzdem die membrandurchgängige Aktivität der hier beschriebenen Sequenzen beibehalten, ohne Ausübung der Erfindung hergestellt werden können und somit als eine der hier offenbarten Ausführungsformen betrachtet werden sollten.
DEFINITIONEN
Die folgenden Begriffe und Ausdrücke haben die folgende Bedeutung, außer ausdrücklich anders angegeben:
Ein „Nukleotid" ist eine Monomereinheit in einer Polymer-Nukleinsäure wie DNA oder RNA und besteht aus drei unterschiedlichen Untereinheiten oder Resten: Zucker, Phosphat und Nukleobase (Blackburn, M., 1996). Sind sie Teil einer Duplex, dann werden Nukleotide auch als „Basen" oder „Basenpaare" bezeichnet. Die gewöhnlichsten natürlicherweise auftretenden Nukleobasen, Adenin (A), Guanin (G), Uracil (U), Cytosin (C) und Thymin (T) tragen die Wasserstoffbrücken-bildende Funktionalität, die einen Nukleinsäurestrang in sequenz-spezifischer Weise an einen anderen bindet. „Nukleosid" bezeichnet ein Nukleotid, dem ein Phosphat fehlt. In DNA und RNA sind Nukleosidmonomere durch Phosphodiester-Verbindungen verknüpft, wobei sich der Begriff „Phosphodiester-Verbindung" auf Phosphodiesterbindungen oder Bindungen bezieht, die ein Phosphatanalog davon einschließen, einschließlich assoziierte Gegenionen, z. B. H⁺, NH₄ ⁺, Na⁺ und Ähnliche.
„Polynukleotid" oder „Oligonukleotid" beziehen sich auf lineare Polymere von natürlichen Nukleotidmonomeren oder Analoga davon, einschließlich doppel- und einzelsträngigen Desoxyribonukleotiden „DNA", Ribonukleotiden (RNA) und Ähnliches. In anderen Worten, ein „Oligonukleotid" ist eine Kette von Desoxyribonukleotiden oder Ribonukleotiden, die die strukturellen Einheiten darstellen, die Desoxyribonukleinsäure (DNA) bzw. Ribonukleinsäure (RNA) umfassen. Polynukleotide sind typischerweise von einigen monomeren Einheiten, z. B. 8–40 bis zu mehreren tausend monomeren Einheiten groß. Wann immer ein Polynukleotid durch eine Abfolge von Buchstaben dargestellt ist, wie z. B. „ATGCCTG", so ist dies so zu verstehen, das die Nukleotide von links nach rechts in 5'→3'-Richtung vorliegen und dass „A" für Desoxyadenosin, „C" für Desoxycytosin, „G" für Desoxyguanosin und „T" für Thymidin steht, sofern nichts anderes angegeben ist.
„Nukleinsäureanaloga" sind strukturell modifizierte, polymere Analoga von DNA und RNA, die durch chemische Synthese aus monomeren Nukleotidanaloga-Einheiten hergestellt werden, und besitzen einige der Qualitäten und Eigenschaften, die mit Nukleinsäuren assoziiert sind. PNA und Phosphorthioat-Oligonukleotide sind Beispiele für zwei der vielen bekannten Nukleinsäureanaloga.
„Watson-Crick-Basenpaarung" und „Watson-Crick Komplementarität" beziehen sich auf das Muster spezifischer Paare von Nukleotiden, und Analoga davon, die durch Wasserstoffbindungen aneinander binden, z. B. paart A mit T und U, und G paart mit C. Der Vorgang der spezifischen Basenpaarung ist die „Hybridisierung" oder das „hybridisieren". Ein Hybrid bildet sich, wenn zwei oder mehrere komplementäre Stränge von Nukleinsäuren oder Nukleinsäureanaloga Basenpaarung eingehen.
„Konjugat" oder „konjugiert" bezieht sich auf eine kovalente, ionische oder hydrophobe Wechselwirkung, wobei die Reste eines Moleküls zusammengehalten werden und in der Nähe gehalten werden.
„Linker" bezieht sich auf ein oder mehrere Atome, die eine Kette umfassen, die ein Nukleinsäureanalog mit einem Rest wie mit einem Peptid, einer Markierung, einem Modifikator, einer stabilisierenden Gruppe oder mit Ähnlichem verbinden.
„Chimäre" bezieht sich auf ein Oligonukleotid, umfassend eines oder mehrere Nukleotide und eine oder mehrere Nukleotidanalogeinheiten. Die Monomer-Einheiten werden durch Phosphodiester- und Phosphodiesteranalog-Verknüpfungen verbunden.
„Phosphodiesteranalog" oder „Internukleotidanalog" bezieht sich auf Analoga natürlicher Phosphodiester-3',5'-Internukleotidverknüpfungen, die sich in ihrer Zusammensetzung und/oder der Position der Anheftung an ein Nukleotid unterscheiden, die in nicht beschränkender Weise 2',5'-Verknüpfung, 3',3'-Verknüpfung, 5',5'-Verknüpfung, Methylphosphonat, alkylierten Phosphotiester, 3'-N-Phosphoramidat und nicht-brückenbildendes N-substituiertes Phosphoramidat einschließen.
Der Begriff „2-modifizierte RNA" bezeichnet ein Nukleinsäureanalog, das eines oder mehrere Ribonukleotide enthält, in dem eine 2'-Position auf einem Zucker einen Substituenten enthält, der eine Hydroxylgruppe ersetzt. Als Beispiel umfasst eine 2'-O-Alkyl-RNA ein Nukleinsäureanalog, das eines oder mehrere Ribonukleotide enthält, in dem eine 2'-Position auf einem Zucker aus dem Rest -OR besteht, wobei R niederes Alkyl ist (Sproat, 1994).
Die Begriffe „durchgängig" und „permeabel" beziehen sich auf die Fähigkeit eines erfindungsgemäßen Konstrukts, eine zelluläre Membran zu durchtreten, oder werden als Eigenschaften der Empfänglichkeit von Zellmembranen beschrieben, Konstrukte durchzulassen (Alberts, 1989).
„Markierung" bezieht sich auf eine Gruppe, die an einen oder beiden Enden des Nukleobasenoligomers kovalent angeheftet ist. Die Markierung kann eine Funktion haben, wie das Geben eines Signals zum Nachweis des Moleküls durch solche Mittel wie Fluoreszenz, Chemilumineszenz und elektrochemische Lumineszenz. Alternativ dazu ermöglicht die Markierung die Trennung oder Immobilisierung des Moleküls durch eine spezifische oder unspezifische Capture-Methode (Andrus, A. 1995). Markierungen umfassen in nicht-beschränkender Weise Fluoreszenzfarbstoffe, wie Fluorescein und Rhodaminderuivate (Menchen, 1993; Bergot, 1994); Cyanin-Farbstoffe und Energietransfer-Farbstoffe (Clegg, 1992; Cardullo, 1988).
„Nachweis" bezieht sich auf das Nachweisen, das Beobachten oder das Messen eines Konstrukts auf Basis der Eigenschaften einer Nachweismarkierung.
Der Begriff „schwach" bezieht sich auf eine Bindung oder Bindungen in einem Molekül, die durch Reagenzien, Enzyme oder Bestandteile einer Zelle möglicherweise gespalten werden können.
„Nukleobasen-modifiziert" bezieht sich auf basenpaarende Derivate von A, G, C, T, U, d. h., den natürlich auftretenden Nukleobasen, die man in DNA und RNA findet.
„Peptide" sind Polymere von Aminosäuren, deren schriftliche Konvention N, oder Aminoterminus auf der linken Seite und C, oder Carboxyterminus auf der linken Seite ist. Die 20 häufigsten natürlichen L-Aminosäuren werden alternativ durch den Drei-Buchstaben-Code oder den Ein-Buchstaben-Code (Tabelle 1) bezeichnet. Wie hier verwendet umfasst der Begriff „Peptide" auch „Peptidanaloga", strukturelle Modifikationen, die eine oder mehrere Modifikationen an L-Aminoseitenketten oder am α-Aminosäuregerüst enthalten. Ein Beispiel für ein am Gerüst modifiziertes Peptid ist das N-Methyl-Glycin „Peptoid" (Zuckermann, 1992).
Tabelle 1. Drei-Buchstaben-Code und Ein-Buchstaben-Code
Aminosäurereste, die „konservative Varianten" oder „konservative Substitutionen" für entsprechende Reste in einer Referenzsequenz sind, die physikalisch oder funktionell ähnlich sind zu den entsprechenden Referenzresten, die z. B. ähnliche Größe, Form, elektrische Ladung, Hydrophobizität, Hydrophilizität, Polarität, reaktive chemische Eigenschaften einschließlich der Fähigkeit, kovalente oder Wasserstoffbindungen zu bilden, und andere Eigenschaften haben. Besonders bevorzugte konservative Varianten sind jene, die die Eigenschaft für eine „akzeptierte Punktmutation" erfüllen (Dayhoff, 1978). Konservative Varianten von Aminosäuren umfassen typischerweise Substitutionen innerhalb der folgenden Gruppe:

I. Glycin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin
II. Asparaginsäure, Glutaminsäure, Asparagin, Glutamin
III. Serin, Threonin
IV. Lysin, Arginin
V. Phenylalanin, Tyrosin

"Homologe" sind Peptide mit im wesentlichen identischen Aminosäuresequenzen, die die Lipidmembran-durchgängige Funktion beibehalten und die sich von den bevorzugten Sequenzen hauptsächlich oder nur durch konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheiden, z. B. Substitution einer Aminosäure gegen eine andere innerhalb der vorstehend genannten gleichen Gruppe, z. B. I. Valin gegen Glycin oder IV. Arginin gegen Lysin oder durch eine oder mehrere nicht-konservative Substitutionen, Deletionen, oder Insertionen, die an Positionen der Aminosäuresequenz lokalisiert sind, die die Funktion des Proteins nicht zerstören. Vorzugsweise ist solch eine Sequenz wenigstens 85%, bevorzugt wenigstens 90% und insbesondere bevorzugt wenigstens 95% identisch auf Aminosäureebene zur Sequenz des Peptids, mit dem sie verglichen wird.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt Abschnitte von DNA- und PNA-Strukturen.
2 zeigt Basenpaarung in einem Segment einer DNA/PNA-Duplex. Die PNA ist in der stabileren antiparallelen Konfiguration orientiert, wobei der N-Terminus der PNA an den 5'-Terminus der DNA angelagert ist, und der C-Terminus der PNA ist an den 3'-Terminus der DNA angelagert.
3 veranschaulicht ein Beispiel einer Konjugation eines Nukleinsäureanalogs, menschlicher Galaninrezeptor Biotin-Cys-cPNA 15mer 1 an ein Peptid, Cys(Npys)pAntp(43-58) 2 zur Bildung des Konstrukts cPNA(18-32)-S-S-pAntp(43-58).
4 zeigt die Strukturen zweier Konstrukte: pAntp(43-58)-S-S-(Biotinyl PNA21) A und Transportan-S-S-(Biotinyl PNA21) B.
5 zeigt weitere Details der Struktur von pAntp(43-58)-S-S-(Biotinyl PNA21) A.
6 zeigt Ergebnisse der Herab-Regulierung der Bindung von ¹²⁵K-Galanin an den menschlichen Galaninrezeptor in Bowes zellulären Membranen durch die cPNA-Oligomere, cPNA-Peptidkonstrukte, Phosphorthioate, Oligonukleotide, die komplementär zu menschlichen und/oder GalR1 mRNA und den Transportpeptiden sind. Die halbmaximalen inhibitorischen Effekte in μM sind aufgelistet. CPNAr und cPNAh bezeichnen die komplementären PNA-Sequenzen der kodierenden Bereiche von Ratten- bzw. menschlicher GalR1 mRNA. Sequenzen von PNA-Oligomeren sind gemäß der Peptidnomenklatur mit dem N-Terminus auf der linken Seite und dem C-Terminus auf der rechten Seite dargestellt. Der C-Terminus ist in allen Beispielen amidiert.
7 zeigt die Konzentrationsabhängigkeit der Herabregulierung von GalR1 durch die Konstrukte der Antisense-PNA mit den Trägerpeptiden Transportan und pAntp. Bowes Zellen werden in Anwesenheit von Konstrukten für 36 h bei 37°C kultiviert und die Menge an Rezeptoren wird als spezifische Bindung des ¹²⁵I-Galanin an die zellulären Membranen und durch Western Blot abgeschätzt. Zellen werden behandelt mit:

μ cPNA h(18-38)-S-S-pAntp A

λ cPNA h(18-38)-S-S-Transportan B

ν cPNA h(1-21)-S-S-pAntp

σ Phosphorthioat h(18-38)

Δ scrambled PNA h(18-38)-S-S-pAntp

∇ cPNA h(18-38)
8 zeigt die Effekte verschiedener Dosierungen von intrathekalem Galanin auf den Reflex-erleichterenden Effekt von C-Faser konditionierender Stimulierung (CS) in 7 unbehandelten Ratten (☐), 3 Ratten, die das Konstrukt scrambled PNA r(18-38)-S-S-pAntp (Δ) erhielten, und 5 Ratten, die das Konstrukt cPNA r(18-38)-S-S-pAntp (σ) erhielten. Die Ergebnisse sind als Prozentsatz der Kontrollerleichterung nach der CS ohne vorhergehende Galanin-Behandlung dargestellt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Es wird jetzt detailliert Bezug genommen auf die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, wobei Beispiele in den begleitenden Zeichnungen veranschaulicht sind. Während die Erfindung in Zusammenhang mit den bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wird, ist es nicht beabsichtigt, die Erfindung auf diese Ausführungsformen zu beschränken. Im Gegensatz ist die Erfindung darauf gerichtet, Alternativen, Modifikationen, und Äquivalente zu umfassen, die in der Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, umfasst sind.
I. STRUKTUR UND SYNTHESE VON NUKLEINSÄUREANALOGA
Im allgemeinen folgt der Aufbau und die Synthese der erfindungsgemäßen Nukleinsäureanaloga herkömmlichen Lehren. Vorzugsweise werden Nukleinsäureanaloga auf einem automatisierten, Festphase-DNA-Synthesegerät mit Phosphoramiditchemie (Beaucage et al., 1992; Caruthers, 1983), z. B. mit einem ABI 392 oder einem 394 DNA-Synthesegerät (PE Applied Biosystems, Foster City, CA), synthetisiert oder auf einem automatisierten, Festphase-Peptidsynthesegeräz, z. B. ABI 433 Peptid-Synthesegerät (PE Applied Biosystems, Foster City, CA).
PNA
Ein bevorzugtes Nukleinsäureanalog der vorliegenden Erfindung ist Peptid-Nukleinsäure (PNA), eine besonders vielversprechende Klasse von Nukleinsäureanaloga mit möglicher Verwendbarkeit als Antisensereagenzien der nächsten Generation (Nielsen, 1991, Bennet, 1998). Die PNA verwendet die natürlichen Nukleobasen, die eine Watson-Crick-Basenpaarung eingehen, verbunden durch ein neutrales, achirales, poly (2-Aminoethylglycin)-Amidgerüst, was zu höheren Hybridisierungseigenschaften führt, d. h. zu extrem hoher Spezifität und Affinität (Egholm, 1993; Peffer, 1993). PNA ist kein Substrat für irgendeine der bekannten Nukleasen, Proteasen, Peptidasen, oder anderen modifizierenden Enzymen (Demidov et al., 1994), eine wichtige Eigenschaft, da native Nukleinsäuren, DNA und RNA, durch Nukleasen schnell abgebaut werden und somit keinen günstigen in vivo Antigen- oder Antisense-Effekt hervorrufen können (Akhtar, 1991). Durch Hybridisierung an das Zielpolynukleotid können die so gebildeten Hybridduplices, PNA/DNA und PNA/RNA die normale Funktionsweise der intrazellulären DNA auf der transkriptionellen und von RNA auf der translationalen Ebene wirksam hemmen. PNAs wurden zur Blockierung der Proteinexpression auf der transkriptionellen und der translationalen Ebene verwendet, und mikroinjizierte PNA zeigt einen starken Antisense-Effekt in intakten Zellen (Knudsen, 1996; Knudsen, 1997). Man fand auch große Verwendbarkeit von PNA-Oligomeren in der genetischen Analyse und diagnostischen Tests als verstärkte Sonden, und in Werkzeugen der Molekularbiologie, ie z. B. die Erhöhung der Genauigkeit der Polymeraseaktivität in der PCR (Demers, 1997). Weiterhin wurde PNA in der PCR als „Clamping Element" zur Einzel-Basenpaar-Mutationsanalyse (Orum, 1993) verwendet, wobei die PNA die Amplifikation von komplementären Zielsequenzen, typischerweise Wildtypsequenzen, unterdrückt, wodurch die selektive Amplifikation von Sequenzen in niedriger Kopiezahl oder von mutierten Zielsequenzen mit kompetitiven DNA-Primern ermöglicht wird. PNA-Oligomere werden selbst nicht wirksam in das Zellinnere transportiert, was bis jetzt die in vivo Anwendung von PNA als Antisense-Reagenzien behindert hat (Nielsen, 1993; Hanvey, 1992; Knudsen, 1997).
1 zeigt einen Vergleich der Strukturen von DNA und PNA. Wie veranschaulicht, ist das Zucker-Phosphat-Gerüst der natürlichen DNA in der PNA durch ein 2-Aminoethylglycin-Gerüst ersetzt, wobei die DNA-Nukleobasen bestehen bleiben. Eine Hybridduplex zwischen PNA und DNA, die in 2 gezeigt wird, veranschaulicht die Watson-Crick-Basenpaarung in einer DNA/PNA-Duplex (Egholm, 1993). Die bemerkenswert hohe Affinität von PNA für DNA-Ziele, beispielhaft gezeigt durch die hohen Wärmeschmelzwerte (T_m) von Duplizes aus PNA und Nukleinsäuren, beruht hauptsächlich auf dem nicht-ionischen Charakter der PNA, die die elektronische Abstoßung zwischen Strängen in DNA/DNA und DNA/RNA-Duplizes verhindert. PNA-Oligomere sind sowohl hydrolytisch als auch gegen enzymatischen Abbau innerhalb von Zellen stabil. PNA-Oligomere sind kein Substrat für bekannte Nukleasen, Polymerasen, Peptidasen, oder andere Enzyme, die andere Nukleinsäuren oder Nukleinsäureanaloga durch Abbau oder Prozessierung inaktiv machen könnten. PNA-Oligomere können mit herkömmlichen Verfahren auf käuflichen, automatisierten Synthesegeräten synthetisiert werden, z. B. auf dem Modell 394 DNA/RNA Synthesegerät oder dem Modell 433 Peptidsynthesegerät (PE Applied Biosystems, Foster City, CA), mit käuflich erwerbbaren Reagenzien (Vinayak, 1997; van der Laan, 1997).
MODIFIZIERTE ZUCKER-ANALOGA
In einer ersten Ausführungsform ist der Zuckerrest eines Teils der Nukleotide des Nukleinsäureanalogs modifiziert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die 2'-Position eines Nukleosids modifiziert. Oligonukleotide, die 2'-modifizierte Nukleoside tragen, wurden als Ribozyme untersucht, Nuklease-resistente-Antisense-Analoga, und andere Sonden für zelluläre Mechanismen (Lamond, 1989; Goodchild, 1992). Erwünschte Eigenschaften von 2'-O-Alkyl-Oligoribonukleosiden umfassen hohe chemische Stabilität, wesentliche RNA- und DNA-Nuklease-Resistenz (einschließlich RNaseH), und erhöhte Wärme-Duplexstabilität (Ohtsuka, 1991).
In einer bevorzugten Ausführungsform sind ein Teil der Ribonukleotide 2'-O-Alkyl-Ribonukleotide, vorzugsweise 2'-O-Methyl-Ribonukleotide. Zusätzliche bevorzugte modifizierte Ribonukleotide umfassen 2'-O-Allyl-Ribonukleotide, 2'-Allyl-Ribonukleotide, 2'-Halo-Ribonukleotide, 2'-O-Methoxyethyl-Ribonukleotide, 2'-verzweigende Gruppe-Ribonukleotide, und 2'-O- verzweigende Gruppe- Ribonukleotide. Die nachstehende Struktur veranschaulicht einige bevorzugte Zuckermodifikationen.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung sind eines oder mehrere Nukleotide an der 1'-Position modifiziert. In einer bevorzugten Modifikation umfasst die 1'-Position eine α-anomere Nukleotidbase, in der die natürliche Stereochemie der 1'-Position des Zuckers invertiert ist, d. h., der Heterozyklus und das 5'-Atom sind in Trans-Orientierung anstelle einer Cis-Orientierung (Morvan, 1986). Die 1'-Position kann auch eine verzweigende Gruppe tragen (Azhayeva, 1995). Alternativ ist das modifizierte Zuckeranalog ein carbozyklisches Nukleotid in dem das 4'-Sauerstoffatom des Zuckers mit Kohlenstoff, Schwefel oder einem Stickstoffatom ersetzt ist (Perbost, 1989).
Modifizierte Internukleotidanaloga
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind einige oder alle Nukleotide, aus denen der Nukleinsäureanalogrest besteht, durch nicht standardmäßige Internukleotidverknüpfungen verbunden. Bevorzugte nicht standardmäßige Internukleotidverknüpfungen umfassen 2'-5'-Verknüpfungen, invertierte 3'-3' und 5'-5'-Verknüpfungen, Methylphosphonat, nicht-verzweigendes N-substituiertes Phosphoramidat, alkylierte Phosphotriester verzweigte Strukturen, 3'-N-Phosphoramidat, Peptid-Nukleinsäure (PNA) und nicht-nukleosidisches Polymer. Der Begriff „nicht-nukleosidisches Polymer" bezieht sich auf ein Polymer, das kein Polynukleotid ist, z. B. Polyethylenoxid, Polypeptid, Polyacrylamid und Polycarbohydrat.
Insbesondere bevorzugt sind die Verbindungen PNA oder 3'-N-Phosphoramidat aufgrund der hohen Affinität der Nukleinsäureanaloga, die solche Verknüpfungen enthalten.
Nukleobasen-Analoga
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthalten einige oder alle Nukleotide in den Nukleinsäureanaloga modifizierte Nukleobasen. Bevorzugte Nukleobasenmodifikationen umfassen C-5-Alkylpyrimidin, 2,6-Diaminopurin, 2-Thiopyrimidin, C-5-Propynpyrimidin, 7-Deazapurin, Isocytosin und Isoguanin, und universelle Base, die eine verringerte basenspezifische Unterscheidung in einer Watson-Crick-Basenpaarungs-Hybridisierungswechselwirkung zeigt, z. B. 3-Nitropyrrol (Nichols, 1994) und 5-Nitroindole (Loakes, 1994).
Modifikation des 5'- und 3'- Ende
In einem dritten Aspekt der Erfindung werden verbesserte physikochemische und biologische Eigenschaften der chimären Vektoren durch Modifikation der 5'-Enden und 3'-Enden der Chimären erzielt. Solche Modifikationen stellen eine erhöhte Resistenz gegen Abbau durch Nukleasen bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts wird ein 3'-Ende der Chimäre durch Einbau eines 2',3'-Didesoxynukleotid als 3'-terminales Nukleotid modifiziert. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird das 5'-Ende der Chimäre durch Einbau einer 5'-5'-Verknüpfung, einer 2'-5'-Verknüpfung, oder einer Markierung, vorzugsweise ein Fluoreszenzfarbstoff oder Biotin modifiziert.
Im allgemeinen werden Nukleinsäureanaloga gemäß bekannten Syntheseverfahren synthetisiert. Ausführliche Beschreibungen der Chemie, die dazu verwendet wird, Polynukleotide zu bilden, werden von Beaucage, 1992, bereitgestellt. Das Phosphoramiditverfahren der Polynukleotidsynthese zur Herstellung der erfindungsgemäßen Chimären ist ein bevorzugtes Verfahren aufgrund seiner wirksamen und schnellen Kopplung und der Stabilität der Start-Nukleosidmonomere. Die Synthese wird typischerweise durchgeführt, indem die wachsende Polymerkette an einen festen Träger angeheftet ist, so dass überschüssige Reagenzien, die in der flüssigen Phase sind, leicht durch Filtration entfernt werden können, wodurch die Notwendigkeit für Reinigungsschritte zwischen den Zyklen aufgehoben wird (Caruthers, 1984).
Verfahren der Analyse und der Aufreinigung
Hohe Auflösung und Auftrennungseffizienz sind eine Herausforderung bei der Analyse und der Aufreinigung von Molekülen mit hohem Molekulargewicht wie Nukleinsäureanaloga, Peptiden und Konstrukten, die oft multiple, stabile Konformationen aufgrund von Ladungen und intramolekularer Wasserstoff-Bindung einnehmen. Unter den nicht-denaturierenden, reverse-Phasebedingungen, die in einer herkömmlichen HPLC-Trennung verwendet werden, können multiple Peaks anwesend sein, wodurch die Identifikation des Produkts und seine Gewinnung erschwert wird. Slab-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE(mit 7 M Harnstoff als denaturierendes Agens kann für die Analyse und die Aufreinigung von Konstrukten verwendet werden. Einige odu (A_260nm, etwa 100 μg) können aus einem Elektrophorese-Lauf durch Beladung von 10–20 Roh-odu auf einem 3 mm dicken Gel isoliert werden, wobei die Elektrophorese unter Standardbedingungen durchgeführt wird, mit Ausschneiden der Bande nach Sichtbarmachen unter UV-Licht gegen eine fluoreszierenden TLC-Platte (EM Science, Teil #5735), Eintauchen in Wasser über Nacht bei Raumtemperatur, und Entsalzen/Konzentrieren auf einer Oligonukleotid-Aufreinigungs-Kartusche (PE Applied Biosystems, Teil # 400771). Anionenaustausch-HPLC auf einem polymeren Adsorbens (Dionex NucleoPac PA-100; 4 × 250 mm, Dionex, Co) kann eine gute Auflösung ergeben, vorhersehbare Elutionsmuster und reproduzierbare Retentionszeiten. Ein nützliches Protokoll für Konstrukte sieht folgendes vor: mobile Phase – Lösungsmittel A: 100 mM NaCl, 10 mM NaOH in 10% Acetonitril (pH 12); Lösungsmittel B: 800 mM NaCl, 10 mM NaOH in 10% Acetonitril (pH 12); Elutionsflußrate = 1,0 ml/min; und ein linearer Gradient von 0% B bei 0 min bis 80% B bei 25 min (Andrus, 1998).
II. STRUKTUR UND SYNTHESE VON PEPTIDEN
Peptide in den erfindungsgemäßem zelldurchdringenden Konstrukten umfassen die dritte Helix der Antennapedia-Homöodomäne, pAntp(43-58), beschrieben von Derossi, 1994, und Transportan, beschrieben von Pooga, (FASEB), 1998: Beide Peptide können durch die in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren synthetisiert werden, und können durch das Verfahren gemäß Beispiel 6 an PNA und andere Nukleinsäureanaloga konjugiert werden. Beide Peptide, und ihre Homologen und konservativen Varianten werden durch verschiedene Zelllinien wirksam internalisiert und ihre intrazelluläre Verteilung wurde charakterisiert. Die Peptide, und konservative Varianten davon sind bevorzugt und werden nachstehend gezeigt:
Transportan: GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL-Amid (SEQ ID NO: 3)
pAntp(43-58): RQIKIWFQNRRMKWKK-Amid (SEQ ID NO: 4)
Transportan (Galparan ist ein 27 Aminosäuren langes Peptid vom N-Terminus des Neuropeptids Galanin (Bartfai, 1993; Habert-Ortoli, 1994), und Mastoparan im C-Terminus, beide Fragmente über Lysin verknüpft. Transportan ist nach indirekter Immunfluoreszenz mit dem biotinylierten Analog, Nε13-biotinyl-Transportan ein zellpenetrierendes Peptid. Die Aufnahme von Transportan ist schnell und in allen getesteten Zelllinien effektiv. Die Internalisierung von Biotinyl-Transportan ist energieunabhängig und findet bei 0–37°C wirksam statt und die maximale intrazelluläre Konzentration wird in etwa 20 Minuten bei 37°C erreicht. Die zellpenetrierende Fähigkeit von Transportan ist nicht nach Zelltyp beschränkt, sondern ist eine allgemeine Eigenschaft der Peptidsequenz.
Im Antennapedia-Fragment wird die Anwesenheit von einem oder zwei Tryptophan-Resten bevorzugt, um die Internalisierung zu fördern. Transportan enthält zwei Reste, Trp² und Tyr⁹, die eine invertierte Mizellenbildung induzieren können. Transportan ist ein nützlicher Peptidvektor zur Einführung verschiedener Makromoleküle, einschließlich hydrophober oder hydrophiler Nukleinsäureanaloga. Die Internalisierung von Transportan ist Rezeptor/Protein-unabhängig und beeinflusst in moderaten Konzentrationen nicht das Wachstum von Zellen in Kultur. Die energieunabhängigen zellpenetrierenden Eigenschaften von Transportan verleihen wichtige und unerwartete Ergebnisse, wenn sie für die sequenzspezifische Hybridisierung an intrazelluläre Polynukleotide, wie nukleäre DNA oder mRNA, an ein Nukleinsäureanalog gekoppelt sind.
III. KONJUGATION VON PEPTIDEN UND NUKLEINSÄUREANALOGA
Die allgemeine Strategie für die Konjugation zur Herstellung eines Konstrukts besteht darin, das Nukleinsäureanalog und die Peptidreste separat zu synthetisieren. Reagenzien und automatisierte Synthesegeräte sind für die Synthese von Peptiden und vielen Nukleinsäureanaloga käuflich zu erwerben. Jeder Rest kann weiter derivatisiert werden, um eine reaktive Funktionalität zur Bildung einer Verknüpfung zu enthalten. Nukleinsäureanaloga können durch jede geeignete Bindung kovalent an Peptide gekoppelt werden. Bevorzugte Bindungen umfassen schwache Bindungen, wie ein Disulfid. Zur Bildung einer Disulfidbindung in einem Konstrukt zwischen dem Nukleinsäureanalog und dem Peptid können die beiden Reste derivatisiert werden, um Thiolgruppen zu enthalten, wobei eine davon eine „leaving group" enthalten kann.
Im Schema für die Konjugation oder für die Kopplung der nachstehend und in Beispiel 5 gezeigten Nukleinsäureanaloga und der Peptidreste wird ein Peptid mit einer Nitropyridyl-leaving Gruppe (Npys) auf einer Cysteinaminosäure derivatisiert. Das Nukleinsäureanalog trägt ein ungeschütztes Cysteinthiol, und kann weiter mit einer Markierung, wie ein Fluoreszenzfarbstoff oder Biotin derivatisiert sein.
Nukleophile Verdrängung durch das Nukleinsäureanalog-Thiol der Npys-Gruppe des Peptid erzeugt das Disulfid-gekoppelte Konstrukt.
Cys(Npys)-Peptid + Markierung-(Cys)-NAA → Peptid-Cys-S-S-Cys-Markierung-NAA
Markierung = z. B. Biotin, Fluoreszenzfarbstoff
NAA = Nukleinsäureanalog, z. B. PNA, 2'-O-Methyl-RNA
IV. INTRAZELLULÄRER TRANSPORT VON KONSTRUKTEN
Eine Anwendung der vorliegenden Erfindung besteht im intrazellulären Transport von hydrophoben Substanzen, z. B. von Peptidbibliotheken, die gegen intrazelluläre Ziele gerichtet sind, Cytotoxine, Cytostatika, anti-mikrobielle Substanzen, antivirale Substanzen, Plasmiden und Proteinen. Mögliche Anwendungen würden umfassen: Krebstherapie, Signaltransduktionsuntersuchungen (es gibt gut bekannte peptiderge Inhibitoren von G-Proteinen, Proteinkinasen/Phosphatasen etc), das Auffinden neuer intrazellulärer Arzneistofftargets (mit einem Bibliotheks-Ansatz), Transfektion (oder Gentherapie) und Untersuchungen der Ergebnisse erhöhter intrazellulärer Proteinkonzentrationen (Alberts, 1989). Die Erfindung stellt ein effektives neues Werkzeug zur Untersuchung de grundlegenden Molekularbiologie bereit. Die hier beschriebenen Konstrukte und in vitro Verfahren können in Zellen aus jeder lebenden Spezies verwendet werden. Die Erfindung erlaubt die verbesserte, effektivere Arzneistoffentdeckung, Hilfe bei der Unterscheidung neuer Punkte für die therapeutische Intervention, und stellt ein generalisiertes in vitro Verfahren für die Einbringung eines Moleküls in im wesentlichen jede Art von Zelle aufgrund der membrangängigen Aktivität der erfindungsgemäßen Peptidkonstrukte bereit.
Konstrukte der Erfindung treten leicht in Zellen ein (Beispiele 6 und 7). Zellen, die mit 1 μM bestimmter Konstrukte inkubiert werden (4) zeigen schnell Biotinyl-PNA, nachgewiesen durch indirekte Immunfluoreszenz, die fast gleichmäßig verteilt ist, die Kerne eingeschlossen.
Galanin ist ein weitverbreitetes Neuropeptid von 29 oder 30 Aminosäuren Länge mit einem breiten Spektrum von biologischen Effekten (Pooga (FASEB), 1998, Bartfai, 1995). Der Galaninrezeptor Typ 1 GalR1 wurde zuerst aus menschlichen Bowes Melanomzellen und dann aus Rattenhirn kloniert (Habert-Ortoli, 1994). GalR1 ist zwischen Spezies hoch konserviert und ist im Hypothalamus, Hippocampus und in Rückenmark abundant vorhanden. Beispiele des Antisense-Effekts von PNA-S-S-Peptid-Konstrukten (z. B. A und B) durch Herabregulierung der Expression von GalR1 sind hier dargestellt. In Beispiel 9 wird auch die in vivo Suppression des Galaninrezeptor im Rückenmark von Ratten dargestellt und die Tatsache, dass die verminderte Expression von Galaninrezeptoren signifikant die Schmerzantwort vermindert. Die verminderte Schmerzübertragung korreliert mit der reduzierten Menge an ¹²⁵I-Galanin-Bindung (d. h., funktioneller Galaninrezeptor).
Die Expression des menschlichen Galaninrezeptors in cos-7-Zellen wurde durch Antisense-Effekte von PNA, nativer DNA-Oligonukleotide und Konstrukte von A und B (4 und 5) untersucht. Die transiente Expression des Galaninrezeptors in cos-7 Zellen ist vermindert, wenn die PNA-Sequenz mit dem Plasmid in Zellen kotransfiziert wird (Beispiel 7). Eine stärkere Hemmung der Synthese des Galaninrezeptors wird durch Präinkubation des Plasmids mit der PNA erreicht.
Signifikant stärkere Antisense-Effekte werde erhalten, wenn die Konstrukte A und B in die Zellen eingebracht werden, wahrscheinlich aufgrund der höheren erhaltenen intrazellulären Konzentration (6). Die Abnahme des Galaninrezeptor-Gehalts ist dosisabhängig, proportional zur Konzentration der Konstrukte A und B (7). Die Kontrollkonstrukte von A und B, wobei scrambled, nonsense PNA verwendet wurde hatte keine Auswirkungen auf die spezifische ¹²⁵I-Galaninbindung.
V. BEISPIELE
Die Erfindung wird weiter erklärt durch Betrachtung der folgenden Beispiele. Die lediglich beispielhaft und in keiner Weise beschränkend zu verstehen sind.
BEISPIEL 1
Synthese von PNA
Automatisierte Synthese von PNA kann auf einem Applied Biosystems Modell 394 DNA/RNA-Synthesegerät oder 433A Peptidsynthesegerät (The Perkin-Elmer Corporation, PE Applied Biosystems Division) gemäß den Anweisungen des Herstellers oder auch nach Egholm, 1993, durchgeführt werden.
Synthese von PNA kann auf einem MBHA (Methylbenzhydrylamin)-Linker, hochbeladenenen Polystyrol-Träger im Maßstab von 2–50 μmol mit der Abfolge von Schritten wie in Tabelle 2 durchgeführt werden. Der Zyklus wird für jede Boc-PNA-Monomer-Addition (Dueholm, 1994) durchgeführt.
Tabelle 2. PNA Synthesezyklus auf dem Modell 433 Synthesegerät

DIPEA: Diisopropylethylamin
TFA: Trifluoressigsäure
HATU: 1-Hydroxy-7-Azabenzotriazol-tetramethyluronium Hexafluorphosphat
DCM: Dichlormethan
DMF: Dimethylformamid

Die Synthese von PNA wird mit standardmäßigen Synthesetechniken und Nukleobasen- (A^bz, C^bz, G^ibu, T) und primären Amino- (MMT, Fmoc oder Boc) Schutzgruppen durchgeführt. Die Nitropyridylsulfid-Schutzgruppe (Npys) für Cystein wird mit Piperidin gespalten, was die MMT oder Boc-Verfahren notwendig macht, wenn Npys in der Sequenz vorhanden ist. Auf der 5 μmol-Skala wird ein 3 ml Reaktionsgefäß verwendet, mit einem Gesamtreaktionsvolumen von 440 μl. AM Ende der Synthese wird die PNA mit TFMSA (Trifluormethansulfonsäure) bei Raumtemperatur für 1 Stunden gespalten, gefolgt von Ätherpräzipitation der Roh-PNA.
Die 21mer cPNA(18-32) wurde mit einem Cysteinrest am Aminoterminus synthetisiert. Die PNA-Sequenz liegt in der antiparallelen Orientierung vor, komplementär zu den Nukleotiden 18-38 der Typ 1 menschlichen Galaninrezeptor mRNA.
HGalR1 cDNA: GTC GGG AAC CTC AGC GAG GGC AAC GC (SEQ ID NO: 5)
21mer: C TTG GAG TCG CTC CCG TTG CG (SEQ ID NO: 6)
16mer: C TTG GAG TCG CTC CCG (SEQ ID NO: 7)
6mer: C TTG GA (SEQ ID NO: 8)
BEISPIEL 2
Synthese der PNA/DNA-Chimäre
Automatisierte Synthese von PNA/DNA-Chimären kann auf einem Applied Biosystems Modell 394 DNA/RNA-Synthesegerät oder 433A Peptidsynthesegerät (The Perkin-Eimer Corporation, PE Applied Biosystems Division) gemäß den Anweisungen des Herstellers oder auch nach Uhlmann, 1996; Van der Laan, 1997 und Vinayak, 1997 durchgeführt werden.
Der für die PNA/DNA-Chimären-Synthese verwendete Träger ist ein nicht-quellendes, stark quervernetztes Polystyrolkügelchen mit einem Hydroxymethylbenzoesäure-Linker (Vinayak, 1997). PNA-Monomere für die Chimärensynthese verwenden die Monomethoxytritylgruppe (MMT) für den primären Aminosäureschutz. In dem ersten Schritt werden das Monomer, HATU und DIPEA, jeweils gelöst in DMF/Acetonitril, 1/1, gleichzeitig in die Reaktionskartusche gegeben. Nach 16 min werden Capping-Reagenzien zugegeben. Zur Minimierung der Tendenz der primären Aminofunktion von PNA zu wandern oder zu zyklisieren, wird das 5'(N)-Ende der PNA und der PNA-DNA-Chimäre nach Entfernung der letzten MMT-Gruppe acetyliert. Reagenzien, die dazu notwendig sind, die DNA- und PNA-Reste zu verbinden, und andere Prozeduren für die Chimärensynthese, Spaltung, Entschützung und Aufreinigung werden von Van der Laan, 1997 beschrieben. IN diesem Ansatz können die Chimären als ein Molekül hergestellt werden, in einer einzelnen Kartusche und einem einzelnen Synthesegerät.
Nach der Synthese werden die Chimären von dem Träger mit Ammoniumhydroxid (1,5 ml) oder mit einem Gemisch aus MeOH : t-BuNH₂ : H₂O (1 : 1 : 2) gespalten und die exocyclischen Amin-Schutzgruppen werden durch Erhitzen der Lösung für 1 bis 16 h auf 55 bis 85°C entfernt. Die Lösung wird dann auf ½ des ursprünglichen Volumens konzentriert, Wasser (1 ml) wird zugegeben und die Chimäre wird dann durch Gelfiltration (Sephadex^TM, Pharmacia) entsalzt. Die Chimären können durch reverse Phase HPLC, Anionenaustausch-HPLC, Kapillargelelektrophorese, Polyacrylamid-Gelelektrophorese und andere herkömmliche Techniken (Andrus, 1992) analysiert und aufgereinigt werden.
BEISPIEL 3
Synthese eines 5'-Amino, 2'-O-Methyl RNA-Oligonukleotids
Automatisierte Synthese eines 5'-Amino, 2'-O-Methyl RNA-Oligonukleotids kann auf einem Applied Biosystems Modell 394 DNA/RNA-Synthesegerät (The Perkin-Elmer Corporation, PE Applied Biosystems Division) gemäß den Anweisungen des Herstellers oder auch nach Sproat, 1994, durchgeführt werden. Die Oligonukleotide werden mit DNA (d^Abz, dG^dmf, dC^bz, T) und 2'-O-Me RNA (A^bz, G^dmf, C^bz, U) Phosphoramidit-Nukleosidmonomeren durchgeführt. Die acht Monomere werden mit trockenem Acetonitril auto-verdünnt (< 50 ppm H₂O) und haben auf dem Synthesegerät nützliche Lebenszeiten von 2–3 Wochen. Für jeden Zyklus im Maßstab von 0,2 μmol werden 40 μl von 0.1 M Phosphoramidit-Nukleosid (ca. 3,5 mg) in Acetonitril gleichzeitig mit 120 μl von 0,5 M 5-H Tetrazol in Acetonitril für die Kopplung zugegeben. Die Synthese und die Spaltung von dem festen Träger erfolgen ohne Unterbrechung automatisiert, wobei alle 8 Monomer-Positionen und spezifische 25-Sekunden (DNA) und 4 Minuten (2-Ome RNA) Kopplungszeiten verwendet werden. Die 5'-Aminogruppe wird an das an den Träger gebundene Oligonukleotid gekoppelt, mit N-Trifluoracetyl, 6-Aminohexyl, Cyanoethyldiisopropylaminophosphoramidit als letztes Monomer. Die Synthese-Effizienz wird in Echtzeit mit einem Trityl-Leitfähigkeitsmonitor gemessen und zeigt im allgemeinen einen schrittweisen Ertrag von > 98% durchschnittlich. Stark quervernetztes, 1000 Å Porendurchmesser Polystyrol, welches bei 12 μmol 3' Nukleosid/gm Träger beladen wird, wird dazu verwendet, etwa 40 rohes odu Oligonukleotid im Maßstab von 0,2 μmol (ca. 1,6 mg) zu erzeugen. Die Hochstufung auf 1 μmol ergibt 200 rohes odu (ca. 8 mg) mit 1000 Å, 3'-Nukleosid-CPG-Träger. Die Nukleobasen-Schutzgruppen für A, G und C werden nach vergleichbarem Entschützungsraten in konzentriertem Ammoniumhydroxid (1 Stunde bei 65°C) ausgewählt. Nach Spaltung, Entschützung und Aufreinigung durch HPLC können 5'-Amino, 2'-O-methyl-RNA-Oligonukleotide bis zu 50 Basen Länge routinemäßig in hoher Reinheit und mit hohem Ertrag erhalten werden.
BEISPIEL 4
Synthese des Biotin-Transportan-Peptids
Die Peptide und die PNA werden auf einem ABI 431A und 433 Peptid-Synthesegerät (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) mit der t-BOC Reagenzienstrategie der Festphasen-Synthese durchgeführt (Geiser, 1988).
Peptide wurden mit schrittweiser Aminosäureaddition im 0,1 mmol Maßstab auf einem MBHA-Polystyrol-Träger (1,1 mmol Amino/g Beladung, Bachem, Schweiz) synthetisiert um C-terminale Amidpeptide zu erhalten. Die Aktivierung von Aminosäuremonomeren wurden mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCC)/Hydroxybenzotriazol (HOBT) durchgeführt. Die Entschützung der Formyl- und Benzylgruppen von Seitenketten wurde mit TFMSA (Trifluormethansulfonsäure) durchgeführt. Die DNP-Schutzgruppen auf dem Histidin können mit 20% (v/v) Thiophenol/DMF bei Raumtemperatur für 1 h entfernt werden. Zur Synthese von Biotin-Transportan wurden N^ε13FMoc-Transportan-MBHA-Harz verwendet. Die N-Fmoc-Schutzgruppen wurden mit 20% Piperidin in DMF entfernt. Biotin wurde manuell an das Peptid durch Addition von 3 × Überschuss von HOBT und DCC-aktiviiertem Biotin in DMF zu dem Peptid-Harz zugegeben. Die Kopplungsreaktion war vollständig nach 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die Peptide wurden schließlich von dem Harz mit flüssiger HF bei 0°C für 30 min gespalten. Die Reinheit der Peptide wurde als > 99% bewertet, nach der reversen Phase HPLC-Aufreinigung, durch HPLC-Analyse auf Nukleosil 120-3 C18 Säule (0,4 × 10 cm). Die Identität wurde durch eine molekulare Massenbestimmung auf einem Plasma-Desorptions-Massenspektrometer (BioIon 20, Applied Biosystems) verifiziert.
BEISPIEL 5
Konjugation von Peptid und PNA
Ein 15mer PNA H₂N-CCC TCG CTG AGG TCC-Amid (SEQ ID NO: 9) wird als Antisense-Sequenz gegen den menschlichen Galaninrezeptor MRNA entworfen und synthetisiert. Die PNA wurde am N-Terminus an ein Cystein gekoppelt. Um den Nachweis der intrazellulären Lokalisation des Konstrukts in der Zelle zu ermöglichen, wurde der Aminoteil des Cysteins biotinyliert, um Biotin-Cys-CCC TCG CTG AGG TCC-Amid zu ergeben. Das Transporterpeptid pAntp(43-58), ein 16 Aminosäuren langes dritte Helix-Peptid der Homöodomäne von Antennapedia pAntp(43-58) von dem man weiß, dass es durch biologische Membranen transloziert (Derossi, 1996) wurde als 2 synthetisiert, so dass es am N-Terminus einen Nitropyridylsulfid-Cysteinrest enthält. Das gereinigte Cys(Npys)-Peptid 2 wurde mit Cys-PNA 1 in einem molaren Verhältnis von 1 : 1 (oder mit einem leichten Überschuss von PNA) in entgastem 40% Dimethylformamid in DMSO vermischt. Zwischen dem Cystein der ONA und dem Cystein des Peptids wurde eine Disulfidbrücke gebildet um das Konstrukt cPNA (18-32)-S-S-pAntp(43-58) zu ergeben, das nach einer HPLC-Aufreinigung (3) in einem reinen Zustand vorlag, um ein über Disulfid verbundenes Konstrukt, z. B. A (3 und 5) zu ergeben. Die Konzentration der Reagenzien sollte so hoch wie möglich sein, z. B. 0,02–0,10 mM. Die Reaktion erfolgte bei leichtem Schütteln unter Stickstoff und Ausschluss von Licht für 18–24 Stunden. Das Rohprodukt wurde durch reverse Phase HPLC aufgereinigt. Die Identität wurde wie in Beispiel 4 durch molekulare Massenspektroskopie verifiziert.
BEISPIEL 6
Infusion der Konstrukte in Zellen
Menschliche Bowes Melanomzellen (ATCC CRL-9607) wurden in Eagles Minimal Essential Medium (MEM) („Gibco") kultiviert, ergänzt mit 10% fetalem Kälberserum, 2 mM Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin. Die Zellen wurden in den Mikrokammern auf einem Präparatglas bis zu etwa 5% Konfluenz kultiviert. Die Konstrukte und Kontrollen (PNA und Peptid) wurden direkt zum Zellmedium zugegeben und bei 5% CO₂ bei 37°C für spezifizierte Zeiträume inkubiert. Die Zellen auf dem Glas wurden kurz mit PBS gespült und mit einem Gemisch aus 4% Paraformaldehyd und 1% Glutaraldehyd in PBS fixiert. Fixierte Zellen wurde in Methanol für 10 min permeabilisiert bei –20°C und Stellen für die unspezifische Bindung wurden mit 5% BSA in PBS blockiert. Internalisierte biotinylierte PNA und Peptide wurden mit Streptavidin-FITC (Amersham, 1 : 100 verdünnt) oder Avidin-TRITC (Sigma, 1 : 200 verdünnt) nachgewiesen.
Wenn man menschliche Bowes Melanomzellen mit 1 μM von jedem der Konstrukte A oder B (4) für 4 Stunden bei 37°C inkubiert, dann wird die Biotinyl-PNA in jeder Zelle durch Immunfluoreszenz nachgewiesen und ist fast gleichmäßig, einschließlich in den Kernen verteilt. Das Färbemuster ist ähnlich, wenn nicht sogar identisch für beide Transportpeptide, obwohl die Peptide selbst, pAntp(43-58) und Transportan unterschiedliche Präferenzen in der intrazellulären Lokalisation haben. Transportan sitzt hauptsächlich in den membranartigen Strukturen, während pAntp(43-58) eine Präferenz für den Nukleus hat. PNA wird vom Peptid abgespalten, da die Färbemuster der Konstrukte und der Peptide allein unterschiedlich sind. Innerhalb von Zellen ist es wahrscheinlich, dass die schwachen Disulfidbrücken der Konstrukte A und B, die das Peptide an die PNA koppeln, schnell gespalten werden, was zu Dissoziation der PNA vom Peptid führt, und somit die Assoziation der Ziel-mRNA im Cytosol oder die Translokation in den Nukleus erlaubt. Die drei Konstrukte der PNA mit den Längen von 6, 16 und 21 Einheiten werden mit gleichen Effizienzen in die Zellen transportiert (Beispiel 1).
BEISPIEL 7
Inkubation von cos-7 Zellen mit PNA allein
Cos-7 Zellen wurden durch Elektroporation mit 2 μg Galaninrezeptor-tragenden pRK8-Plasmid und 2 μg cPNA₂₁ und 50 μg Lachssperma-DNA als Träger in 5 × 10⁶ Zellen kotransfiziert. Zum Vergleich wurden identische Transfektionen ohne PNA und nur mit der Träger-DNA durchgeführt. Die transfizierten Zellen wurden für 48 Stunden kultiviert und die Menge an exprimierten Galaninrezeptoren wurde durch die Bindung von ¹²⁵I-Galanin abgeschätzt.
Die Zelle wurden durch Suspension in hypotonische, eiskaltem 5 mM HEPES-Puffer, der 2,5 mM MgCl₂, 0,5 mM EDTA (pH 7,3) enthielt lysiert, und danach für 10 Minuten auf Eis inkubiert. Die entstehende mikrosomale Membranfraktion wurde durch Zentrifugation bei 10000xg für 10 min bei 4°C gewonnen und gewogen. Die Membranen wurden in HEPES-gepufferter Krebs-Ringer-Lösung (HKR) resuspendiert, die mit 0,05% (W/v) Rinderserumalbuminergänzt war und 0,1% (w/v) Bacitracin und mit einem Glas-Teflon-Homogenisator homogenisiert. Die Äquilibrium-Bindeexperimente wurden in einem Endvolumen von 300 μl HKR durchgeführt, die 200 pM [¹²⁵I]-Galanin (NEN), Zellmembranen und Galanin enthielt. Die Proben wurden für 30 Minuten bei 37°C in einem Schüttler-Wasserbad inkubiert. Die Inkubation wurde durch Zugabe von 2 × 10 ml eisgekühlter HKR beendet, gefolgt von der schnellen Filtration über Whatman GF/C Glassfaser-Filtern, die für 2–3 h in 0,3% (v/v) Polyethylenimin-Lösung vorbeschichtet wurden. Die Radioaktivität, die auf den Filtern verblieb, wurde in einem Gammazähler bestimmt (Packard). Die spezifische Bindung wurde bestimmt als der Teil der gesamten Bindung, die mit einem großen Überschuss an unmarkiertem Galanin (1 μM) verdängt werden konnte. Die Proteinkonzentration wurde nach Peterson, 1977 bestimmt.
BEISPIEL 8
Herabregulierung von menschlichem Galaninrezeptor Typ 1 in der Bowes Zelllinie
Eine Vielzahl von Konstrukten und Kontrollnukleinsäuren wurde in Bowes Melanomzellen transportiert (6), um die Antisense-Effekte der PNA-Konstrukte bei der Herabregulierung der Translation des menschlichen Galaninrezeptors zu zeigen. Starke hemmende Effekt auf die ¹²⁵I-Galaninbindung werden erhalten, wenn die menschliche cPNA Sequenz der Nukleinsäureanalog-Rest der Konstrukte mit Transportan und pAntp ist. Die maximale Abnahme in spezifische Bindung von ¹²⁵I-Galanin Bindung sieht man mit Konstrukten, die auf die Nukleotide 18-38 in der kodierenden Region der Galaninrezeptor Typ 1 mRNA gerichtet sind. Die Behandlung von Bowes Zellen mit 3 μM cPNA h(18-38)-S-S-pAntp A oder 1,5 μM cPNA h(18-38)-S-S-Transportan B führt zu 91% bzw. 83% Abnahme in der Bindung (6). Die maximale Abnahme, um 91% (3 μM A) oder 83% (1,5 μM B) der spezifischen Bindung von ¹²⁵I-Galanin durch Galaninrezeptoren wurde nach 36 h Inkubation bei 37°C der Zellen mit den Konstrukten A und B nachgewiesen. PNA alleine, die komplementär zu der Translations-Startstelle der GalR1 mRNA ist, und auf die Nukleotide 1–21 gerichtet ist, hat weniger Einfluss. Vorhersagen über die RNA Sekundärstruktur zeigen, das die Bereiche 1–21 und 18–38 der kodierenden Region der Galaninrezeptor Typ 1 mRNA hauptsächlich in ungepaarten Schleifenstrukturen vorliegen, wodurch die Möglichkeit bestätigt wird, das entsprechende Bereiche wirksam mit PNA erreicht werden.
Menschlicher und Ratten-GalR1 sind hoch homolog, die mRNAs unterscheiden sich jedoch an den Positionen 1–21 und 18–38 um 6 bzw. 5 Nukleotide. Die Möglichkeit für die Wechselwirkung rattenspezifischer PNA mit mRNA für den menschlichen Galaninrezeptor könnte einige schwache Antisense-Effekte der entsprechenden Konstrukte erklären. Die Inkubation mit 1 μM cPNA r(1-21)-S-S-pAntp und cPNA r(18-38)-S-S-pAntp (A) führt zu 13% und 18% Abnahme der spezifischen Bindung von ¹²⁵I-Galanin an die Galaninrezeptoren nach 36 h.
Als Vergleich wurde der Effekt eines unmodifizierten Phosphodiester-Antisense 21 mer-Oligonukleotids gemessen, das zur Region 18-38 komplementär war. Bei einer Oligonukleotidkonzentration von 10 μM wurde nur eine 5%-Reduzierung der ¹²⁵I-Galaninbindung beobachtet (6), aufgrund der relativ geringen Nukleasestabilität von Phosphodiester-DNA. Ein Phosphorthioat-21mer, das komplementär zu den Nukleotiden 18-38 der menschlichen GalR1 mRNA ist, zeigt einen deutlicheren Antisense-Effekt, jedoch bei signifikant höheren Konzentrationen als die entsprechende PNA. Die Inkubation mit 12 μM Phosphorthioat h(18-38) für 36 h führt zu einer 37% Abnahme der Galanin-Bindung.
Western Blot zeigt, dass eine Abnahme der spezifischen Bindung von ¹²⁵I-Galanin an die Galaninrezeptoren nach der Behandlung mit PNA-S-S-Peptidkonstrukten, z. B. A und B, von einer Abnahme des Gehalts an Galaninrezeptor in zellulären Membranen (Ergebnisse nicht gezeigt) begleitet wird, was die Korrelation zwischen der Attenuierung der Proteinexpression und der ¹²⁵I-Galaninbindung zeigt.
BEISPIEL 9
Herabregulierung des Ratten-Galaninrezeptor Typ 1 im Rückenmark von Ratten in vivo
Das Konstrukt A und das entsprechende scrambled 21mer PNA-enthaltende Konstrukt wurden intrathekal bei 150 μM in Ratten über dauerhaft implantierte Katheter verabreicht. Drei Injektionen wurden während eines Zeitraums von 36 h gegeben und akute elektrophysiologische Experimente wurden etwa 12 h nach der letzten Injektion durchgeführt.
In keinem Fall wurden irgendwelche Anzeichen von Toxizität, Paralyse oder motorischer Störung nachgewiesen. Der nocizeptive Flexor-Reflex wurde als EMG von den ipsolateralen Kniesehnen-Muskeln als Antwort auf eine hochschwellige elektrische Stimulierung registriert. Die Auswirkungen der Verabreichung von Galanin auf den Grundlinien-Flexor-Reflex und auf die Erleichterung des Reflex, der durch repetitive C-Faser-Stimulierung induziert wurde, wurde ausgewertet und zwischen Ratten verglichen, die Konstrukt A und die scrambled Sequenz erhielten (8). Die konditionierende Stimulierung (CS) von C-Fasern führt zu einer leichten Erleichterung des Flexor-Reflexes, ähnlich wie in Ratten, die die Konstrukte mit einem 21mer cPNA oder die Konstrukte mit der scrambled PNA-Sequenz erhielten. Injiziertes Galanin hemmt dosisabhängig die Reflexerleichterung durch C-Fasern CS im Falle von unbehandelten Ratten und jenen, die mit den Konstrukten mit scramble 21mer PNA behandelt wurden. Dieser Effekt von Galanin wird in Ratten, die das Konstrukt A erhalten, um etwa 100-fach reduziert (8).
Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass Konstrukte wie A die Dosis-Reaktionskurve für den blockierenden Effekt des intrathekalen Galanins auf die C-Faser CS-induzierte Zunahme der Anregungsfähigkeit im Rückenmark etwa 100-fach anheben, was eine deutliche Herabregulierung der Typ 1 Galaninrezeptoren nahe legt, die scheinbar den hemmenden Effekt von Galanin zu vermitteln.
BEISPIEL 10
Kontroll-Herabregulierung des Galaninrezeptors mit DNA-Phosphodiester-Oligonukleotiden in RINm5F-Zellen
Als Vergleich wurden drei unterschiedliche Antisense-Phosphodiester-Oligonukleotide mit dem Polyaminsurfaktans LIPOFECTAMIN^TM formuliert und in Galaninrezeptor-enthaltende RINm5F Zellen transfiziert. RINm5F Insuloma-Zellen wurden in RPMI 1640 Medium kultiviert, das zusätzlich 5% (v/v) fetales Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 100 IU/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin enthielt, in 5% CO₂-angereicherter Luft bei 37°C. Zum Zeitpunkt der Zugabe der Oligodesoxynukleotide wurde Serum- und Antibiotika-freie Optim-MEM®1 reduziertes Serummedium verwendet. Alle Zellkulturmedien wurden von GIBCO erhalten.
Die Sequenzen der Oligonukleotide waren komplementär zu dem Bereich, der auf das ATG-Kodon des Ratten Typ 1 Galaninrezeptors folgt:
5' CAC CGC AGC CAG TTC CAT 3' Basen 1-18 (SEQ ID NO: 10)
5' GGT CGC TCC CAT TCC CTT 3' Basen 15-32 (SEQ ID NO: 11)
5' GGT CGC TCC CAT TCC CTT 3' Basen 29-46 (SEQ ID NO: 12)
Endkonzentrationen im Bereich von 0,2 bis 20 μM wurden in Inkubationen verschiedener Dauer (4–24 h), gefolgt von 24-stündigem Wachstum in Arzneistofffreiem Medium und nachfolgender Ernte und ¹²⁵I-Galanin-Bindeexperiment getestet. Unter keiner Bedingung konnte ein Effekt dieser Oligonukleotide auf die Höhe der Expression des Rezeptorproteins nachgewiesen werden. Das Fehlen eines Effekts könnte durch die relativ geringe Stabilität der Phosphodiester-Oligonukleotide aufgrund Nukleaseverdau erklärt werden. Alternativ dazu könnten die Galaninrezeptoren in den RINm5F-Zellen ein anderer Subtyp sein. Nichtsdestotrotz zeigen diese negativen Ergebnisse in RINm5F-Zellen deutlich die Notwendigkeit für die erfindungsgemäßen Aspekte; ein stabiles Nukleinsäureanalog zur Ausrichtung auf intrazelluläre Polynukleotide und zellpenetrierende Transportpeptide.
Obwohl vorstehend nur wenige Ausführungsformen ausführlich beschrieben wurden, ist es für den Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie ersichtlich, dass viele Modifikationen der bevorzugten Ausführungsformen möglich sind, ohne von deren Lehre abzuweichen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Membranpermeables Konstrukt zum Transport durch eine Lipidmembran, umfassend: ein Nukleinsäureanalogon, das mit einem intrazellullären Polynukleotid hybridisieren kann; ein Peptid; und eine labile Verbindung, die das Nukleinsäureanalogon und das Peptid verknüpft, wobei das Peptid die Sequenz INLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 1) umfasst; einschließlich Homologa und konservative Varianten davon, wobei konservative Varianten aus Substitutionen innerhalb der Gruppen I. Glycin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, II. Asparaginsäure, Glutaminsäure, Asparagin, Glutamin, III. Serin, Threonin, IV. Lysin, Arginin, V. Phenylalanin, Tyrosin, bestehen, wobei Homologa Peptide sind, die die Lipidmembran-durchdringende Funktion beibehalten und sich von SEQ ID NO: 1 durch Substitutionen innerhalb einer Klasse der Gruppen I–V, oder durch eine oder mehrere nicht-konservative Substitutionen, Deletionen oder Insertionen unterscheiden, wobei die Membran-durchdringende Funktion des Proteins nicht zerstört wird, und wobei die Sequenz des Homologons auf der Aminosäureebene 85–95% identisch zur Sequenz des Peptids SEQ ID NO: 1 ist.
Konstrukt gemäß Anspruch 1, umfassend die Sequenz GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 3); einschließlich Homologa und konservativer Varianten davon, wobei konservative Varianten aus Substitutionen innerhalb der Gruppen I. Glycin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, II. Asparaginsäure, Glutaminsäure, Asparagin, Glutamin, III. Serin, Threonin, IV. Lysin, Arginin, V. Phenylalanin, Tyrosin, bestehen, wobei Homologa Peptide sind, die die Lipidmembran-durchdringende Funktion beibehalten und sich von SEQ ID NO: 1 durch Substitutionen innerhalb einer Klasse der Gruppen I–V, oder durch eine oder mehrere nicht-konservative Substitutionen, Deletionen oder Insertionen unterscheiden, wobei die Membran-durchdringende Funktion des Proteins nicht zerstört wird, und die Sequenz des Homologons auf der Aminosäureebene 85–95% identisch zur Sequenz des Peptids SEQ ID NO: 1 ist.
Konstrukt gemäß Anspruch 1, wobei das Nukleinsäureanalogon PNA oder eine PNA/DNA-Chimäre ist.
Konstrukt gemäß Anspruch 1, wobei das Nukleinsäureanalogon eine 2'-O-Alkyl RNA oder eine 2'-O-Alkyl RNA/DNA-Chimäre ist.
Konstrukt gemäß Anspruch 1, wobei das Nukleinsäureanalogon ein Nukleobasen-modifiziertes Oligonukleotid ist.
Konstrukt gemäß Anspruch 1, wobei das Peptid und das Nukleinsäureanalogon durch eine Bindung verknüpft sind, die nachdem Transport in eine Zelle gespalten wird.
Konstrukt gemäß Anspruch 6, wobei die Bindung eine Disulfidbindung ist.
Konstrukt gemäß Anspruch 6, wobei die Bindung eine Esterbindung ist.
Konstrukt gemäß Anspruch 1, weiter umfassend eine Markierung.
Konstrukt gemäß Anspruch 9, wobei die Markierung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Biotin, Dinitrophenyl, Acridin, Fluorescein, Rhodamin, Cyanin, Digoxigenin, Interkalator, minor-groove Bindeagens und chemilumineszenter Vorläufer mit der Struktur
wobei R₁ Wasserstoff oder Halogen ist, R₂ ist Phosphat, Galaktosid, Glucosid, Glucuronid, Trialkylsiloloxy, Acyloxy, oder Wasserstoff; und R₃ ist Methyl, Ethyl und Niederalkyl.
Konstrukt gemäß Anspruch 1, wobei das Peptid R₁-INLKALAALAKKIL-R₂ (SEQ ID NO: 1) umfasst, wobei R₁ und R₂ jeweils ein Peptid, eine Aminosäure, NH₂, H oder OH sind, wobei wenigstens einer von R₁ und R₂ ein Peptid ist, und wobei das Nukleinsäureanalogon an einen von R₁ und R₂ gebunden ist, der ein Peptid ist.
Konstrukt gemäß Anspruch 11, wobei einer von R₁ und R₂ Cystein umfasst und wobei das Nukleinsäureanalogon an das Cystein über Disulfidbrücken gebunden ist.
Konstrukt gemäß Anspruch 1, umfassend die Struktur
wobei R₁ ein Peptid und NAA das Nukleinsäureanalogon ist.
Konstrukt gemäß Anspruch 13, wobei NAA eine PNA oder eine PNA/DNA Chimäre ist, die über eine Disulfidbrücke an K gebunden ist.
Konstrukt gemäß Anspruch 13, wobei R₁ GWT oder GWTLNSAGYLLG (SEQ ID NO: 2) umfasst.
Konstrukt gemäß Anspruch 13, wobei das C-terminale L amidiert ist.
Konstrukt gemäß Anspruch 13, wobei die Disulfidbrücke zwischen einem Paar von Cysteinresten angeordnet ist.
In vitro Verfahren zur selektiven Hemmung der DNA-Transkription, RNA-Translation, RNA- oder DNA-Expression, DNA-Replikation oder der DNA- oder RNA-regulatorischen Funktion einer vorab ausgewählten DNA- oder RNA-Sequenz oder einer Teilgruppe von DNA- oder RNA-Sequenzen in einer lebenden Zelle, umfassend die Schritte: Bereitstellen eines membranpermeablen Konstruktes gemäß Anspruch 1 zum Transport durch eine Lipidmembran, umfassend: eine PNA mit einer Sequenz, die zu intrazellulären Polynukleotiden komplementär ist und eine labile Bindung, die die PNA und das Peptid verknüpft; und In-Kontakt-bringen einer Zelle mit dem Konstrukt, so dass das Konstrukt durch die äußere Membran transportiert wird und wenigstens die äußere Membran der Zelle durchdringt, und die PNA mit den darin angeordneten intrazellulären Polynukleotiden hybridisiert.
Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei das Konstrukt eine Markierung umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 19, wobeidie Markierung eine Fluoreszenzmarkierung ist.
Verfahren gemäß Anspruch 20, weiter umfassend den Schritt des Nachweises der Fluoreszenzmarkierung, nachdem das Konstrukt in die Zelle transportiert wurde, und bevor oder nachdem die labile Bindung gespalten wurde.
Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei die Markierung eine Biotinmarkierung ist.
Verfahren gemäß Anspruch 22, weiter umfassend den Schritt des Nachweises der Biotinmarkierung, nachdem das Konstrukt in die Zelle transportiert wurde, und bevor oder nachdem die labile Bindung gespalten wurde.