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Diese
Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens, zum
Beispiel eines Analyseverfahrens, wobei Mikroorganismen oder ein anderes
biologisches Material mit Bestandteilen eines Fluids wechselwirken.
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Mikroorganismen
werden aufgrund ihrer breiten Vielfalt an Stoffwechselwegen für Untersuchungen
der biologischen Abbaubarkeit verschiedener Substanzen, zu Analysezwecken,
zum Beispiel zum Testen einzelner Substanzen oder von Klassen von
Substanzen, und zur Untersuchung des Ausmaßes der Wasserverschmutzung
mit biologisch abbaubaren Substanzen eingesetzt.
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Oft
erfordern diese Verfahren das Bestimmen der Stoffwechselaktivität der Mikroorganismen unter
Verwendung geeigneter Sensoren. So steigt die Stoffwechselaktivität, wenn
die zu untersuchende Probe Substanzen enthält, die von Mikroorganismen als
Nährstoffe
verwendet werden. So beruht der biologische Sauerstoffbedarf (biological
oxygen demand, BOD), der als Indikator für Wasserverschmutzung verwendet
wird, auf der Bestimmung des Sauerstoffverbrauchs durch die Stoffwechselaktivität von Mikroorganismen,
die mit der zu untersuchenden Probe inkubiert werden.
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Mikroorganismen
können
auch als Toxizitätsindikatoren
verwendet werden, weil die Stoffwechselaktivität in Gegenwart toxischer Substanzen
abnimmt, die zu einer Verringerung der Aktivität oder sogar zum Tod der Zellen
führen.
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Mikroorganismen
können
in den vorstehenden Anwendungen als herkömmliche Kulturen in Minireaktoren
oder Schüttelkulturen
eingesetzt werden, damit man die Stoffwechselaktivität der Zellen,
zum Beispiel auf der Basis des Sauerstoffverbrauchs oder des Zellwachstums, über einen
längeren
Zeitraum verfolgen kann. Seit einigen Jahren gibt es jedoch auch
Ansätze,
die erforderliche Analysedauer durch Automatisierung der Probenabgabe
und Verkürzung der
Inkubationszeit zu verkürzen,
insbesondere wenn kein Gleichgewichtszustand erreicht werden muss.
Zusätzlich
können
Mikroorganismen durch Einschließen
der mikrobiellen Zellen in Polymere direkt auf Elektroden oder zwischen
Membranen direkt mit den Detektoren kombiniert werden. Unter gewissen
Umständen
können
auch Polymere verwendet werden, in welche die Organismen zum zusätzlichen Schutz
eingebettet sind. Diese Membranen können in Nachbarschaft zu einem
Detektor, zum Beispiel einer Elektroden, mit speziellen Montiervorrichtungen, befestigt
werden.
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Mikrobielle
Sensoren, beispielsweise zur Bestimmung eines BOD-Werts, können auf
diese Weise hergestellt werden. Wenn diese Sensoren jedoch als Detektoren
in automatisierten Analysesystemen verwendet werden, müssen spezielle
Konstruktionsformen auf der mikrobiellen Membran bereitgestellt
werden, damit die Probe über
die Membran geleitet werden kann. In der Regel kommt dann nur ein
kleiner Teil der Membran und nur für kurze Zeit mit der Probe in
Kontakt. Die wirksame Oberfläche
der Membran, die durch die Größe der Detektor-
und Probenabgabekonstruktion beschränkt ist, hat eine begrenzende Wirkung,
wodurch nur eine beschränkte
Menge an Mikroorganismen wirksam verwendet werden kann.
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Andere
Konstruktionsformen bestehen aus Kartuschen (aus der Verwendung
immobilisierter Enzyme bekannt), die als kleine Säulen mit
Polymeren oder Glaspartikeln gefüllt
sind, an denen Enzyme oder andere Proteine immobilisiert werden
können. Verglichen
mit Membranen haben sie den Vorteil, dass die Menge an Proteinen,
die wirksam verwendet werden kann, nur durch die Größe der Kartusche
beschränkt
ist. Weil die Probe durch die Kartuschen dieses Typs hindurchfließt, ist
weiterhin ein guter Kontakt zwischen Proteinen und Probe gewährleistet, und
somit wird eine gute Umwandlung des Analyten erzielt, was zu vergleichsweise
hohen Signalen führt. Kartuschen
dieses Typs werden in Durchflusssystemen verwendet, in denen sich
der Detektor dann stromabwärts
befindet.
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Es
ist im Prinzip möglich,
Mikroorganismen in Kartuschen dieses Typs einzuschließen, weil
Mikroorganismen an poröse
Träger
adsorbiert werden können.
Ein Fluss durch die Reaktoren ist jedoch nur erfolgreich, wenn der
Innendruck in der Kartusche nicht zu hoch ist. Der Innendruck hängt einerseits
von den Partikeln ab, die zur Adsorption der Zellen verwendet werden,
und andererseits von der Maschenweite des Gitterwerks, das zum Zurückhalten
der Partikel in der Kartusche verwendet wird. Die Tatsache, dass
die Zellen nur an die Trägerpartikel
adsorbiert werden, bedeutet, dass sie auch abgewaschen werden können. Wenn
die Maschenweite des Gitterwerks so klein ist, dass nicht nur die
Partikel, sondern auch abgewaschene Mikroorganismen in der Kartusche
zurückgehalten
werden, dann wird der Innendruck so hoch, dass herkömmliche
peristaltische Pumpen und, in noch größerem Ausmaß, Mikropumpen den Transport
der Probe durch die Kartuschen nicht mehr gewährleisten können. Ohne geeignete Membranen
werden die Mikroorganismen jedoch aus dem System entlassen, was
zur Verfälschung
der Signale führen
kann. Ein zusätzlicher
Faktor ist, dass in Kartuschen dieses Typs eine reproduzierbare
Beladung mit Zellen nur mit Schwierigkeit erreicht werden kann,
weil sich die Anzahl der an Träger
adsorbierten Zellen nicht leicht einstellen lässt.
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Daher
liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine neue Vorrichtung
zum in-Kontakt-Bringen von Mikroorganismen oder anderem biologischen
Material mit Fluiden, z.B. zu analysierenden Flüssigkeiten, zu entwickeln.
Die Erfindung betrifft insbesondere mikrobielle Membranreaktoren
zur Verwendung in einem Durchflusssystem, wobei Mikroorganismen
leicht und reproduzierbar eingebracht werden können und das Entlassen der
Organismen aus dem Reaktor verhindert wird.
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Man
wird erkennen, dass, wenn in der folgenden Beschreibung auf Mikroorganismen
Bezug genommen wird, andere biologische Materialien anstelle von
Mikroorganismen als solchen verwendet werden können. So soll der Begriff "Mikroorganismus" nicht nur prokaryotische
und eukaryotische einzellige Organismen, sondern auch Zellen oder
Gewebe menschlichen, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs umfassen.
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Daher
soll, wenn der Begriff "mikrobieller Membranreaktor" verwendet wird,
auf eine Vorrichtung Bezug genommen werden, die eine Membran beinhaltet,
die mit einer der Formen von "Mikroorganismus" ausgestattet ist,
die von der vorstehenden Definition umfasst werden.
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Erfindungsgemäß wird eine
Vorrichtung zur Durchführung
eines Verfahrens bereitgestellt, wobei Mikroorganismen oder andere
biologische Materialien mit Bestandteilen eines Fluids wechselwirken, umfassend
eine semipermeable, sterile Membran, die zwischen gegenüberliegenden
Oberflächen
eines ersten und eines zweiten strukturellen Elements in Form eines
Sandwichs eingelagert ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen
oder anderen biologischen Materialien sich zwischen dem ersten strukturellen
Element und der Membran befinden und die innere Oberfläche des
zweiten strukturellen Elements, das an die Membran grenzt, mit einem oder
mehreren Durchflusskanälen
für den
Fluss des Fluids über
die Oberfläche
der Membran ausgestattet ist. Die Membran ist steril sowie permeabel
für das Fluid
und die im Fluid gelösten
Substanzen, z.B. gelöste
Gase und Substanzen, die durch die Mikroorganismen metabolisiert
werden oder anderweitig mit ihnen wechselwirken können.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft insbesondere einen mikrobiellen Membranreaktor
zur Verwendung in Durchflusssystemen, der ein erstes Element mit
einer ebenen inneren Oberfläche
für das
Aufnehmen der Mikroorganismen und ein zweites Element umfasst, das
ebenfalls mit einer ebenen inneren Oberfläche ausgestattet ist und auf
dem mindestens ein Durchflussweg ausgebildet ist, wobei das erste und
das zweite Element mit ihren Innenseiten in Kontakt angeordnet sind
und eine semipermeable, sterile Membran zwischen den Elementen angeordnet
ist.
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Die
Porengröße der semipermeablen,
sterilen Membran wird vorzugsweise so gewählt, dass sie für die verwendeten
Mikroorganismen undurchlässig ist.
Die Mikroorganismen sind vorzugsweise in einer mikrobiellen Membran
angeordnet, die sich zwischen der inneren Oberfläche des ersten Elements und
der semipermeablen, sterilen Membran befindet. Anders gesagt, bedeckt
die sterile Membran die mikrobielle Membran in Bezug auf die Durchflusswege.
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Die
Erfindung umfasst auch Reaktoren, die keine mikrobielle Membran
verwenden. Dies kann beispielsweise durch direktes Aufbringen der
Mikroorganismen auf die Seite der semipermeablen, sterilen Membran,
die dem ersten Element zugewandt ist, erfolgen. Dies kann durch
Filtrieren der Zellen durch die semipermeable, sterile Membran erreicht
werden. Es ist weiterhin auch möglich,
die Mikroorganismen direkt auf die ebene Innenseite des ersten Elements
aufzubringen, beispielsweise durch Aufbringen einer Lösung, eines
Gels oder einer Paste usw., welche die Mikroorganismen umfassen.
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Die
Elemente des Membranreaktors können vorzugsweise
durch Befestigungsmittel miteinander verbunden werden, zum Beispiel
durch Schrauben, die durch geeignete, in die Elemente gebohrte Durchgänge greifen,
so dass die Elemente zusammengepresst werden. Andere Verbindungstechniken,
wie Verleimen oder Verkleben, sind jedoch möglich.
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Die
Durchflusswege werden vorzugsweise als Durchflusskanäle ausgeführt, wobei
es möglich ist,
die Kontaktfläche
zwischen dem Durchflusskanal und den in der mikrobiellen Membran
vorhandenen Mikroorganismen durch die Abmessungen des Durchflusskanals
und dessen Geometrie zu verändern.
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Zusätzlich führen Verbindungsbohrungen am
Beginn und Ende jedes Durchflusskanals zur Oberseite des zweiten
Elements, damit der Flüssigkeitsfluss
mit dem Durchflusskanal verbunden und somit der Durchflussweg festgelegt
werden kann.
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Die
Durchflusswege werden vorzugsweise in der inneren Oberfläche des
Substrats des zweiten Elements zum Beispiel durch Ätzen, Schneiden
oder eine andere Materialabtragungstechnik gebildet. Die Durchflusswege
können
jedoch auch in einer Platte gebildet werden, die an der ebenen inneren
Oberfläche
des zweiten Elements angebracht wird, in welchem Fall das zweite
Element entsprechende Verbindungskanäle zum Verbinden der Durchflusswege
der Platte mit dem Flüssigkeitsfluss
besitzt. Die Durchflusskanäle
können
auch durch Materialhinzufügungsverfahren
auf der ebenen Innenseite des zweiten Elements hergestellt werden,
das dann die Funktion eines Substrats annimmt. Eine strukturelle
Beschichtung dieser Art wäre
beispielsweise das Aufbringen einer Paste durch eine Siebdrucktechnik
mit anschließendem
Härten
durch Trocknen oder Backen usw. Verfahren dieses Typs sind dem Fachmann
aus der Dickfilmtechnologie bekannt und müssen daher hier nicht im Einzelnen
erläutert
werden.
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Die
Mikroorganismen befinden sich vorzugsweise auf oder in der mikrobiellen
Membran, die auf der inneren Oberfläche des ersten Elements angebracht
ist. Sie kann die Form von Filterpapier annehmen, durch das eine
Zellsuspension filtriert wurde. Die Anzahl an das Filterpapier adsorbierter
Zellen hängt
von der Anzahl der Zellen in der Suspension ab. Dies kann leicht
durch die Trübung
der Suspension, d.h. ihre optische Dichte, untersucht und daher auch
leichter reproduzierbar eingestellt werden, als mit den Membran-
oder Kartuschenreaktoren des Standes der Technik.
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Die
mikrobielle Membran kann in Bezug zum Durchflussweg oder zu den
Durchflusskanälen
mit einer semipermeablen, sterilen Membran bedeckt werden, die ausreichend
feine Poren hat, dass die Mikroorganismen nicht aus dem System entlassen
werden, aber so, dass Nährstoffe
und andere Substanzen, die abgebaut werden können, hindurch gelangen können. Weil
der Flüssigkeitsfluss
nicht durch die Membranen fließt,
sondern aufgrund der Konstruktion der Kanäle oder der Platte nur an ihnen
vorbei fließt,
führen
diese Membranen nicht zu einem erhöhten Druckaufbau im System.
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Mit
diesem Reaktortyp ist es daher nicht nur möglich, dass die Zellzahlen
sehr reproduzierbar eingestellt werden, sondern auch, dass die Zellzahl
sich nicht aufgrund des Entlassens aus dem System verändert. Im
Gegensatz zu Kartuschenreaktoren ist der Druckaufbau durch den Reaktor
sehr viel kleiner, weil keine Partikel im Membranreaktor vorhanden
sind. Dies bedeutet, dass sich dieser Reaktortyp auch für die Kombination
mit Mikropumpen mit nur kleinen Kapazitäten eignet. Zusätzlich ist
die Kontaktfläche
zwischen dem Durchflussweg und den Mikroorganismen sehr viel größer und
kann durch die Abmessung des Durchflusskanals, d.h. seinen Durchmesser,
seine Länge
oder die geometrische Form, leicht verändert werden. Dies bedeutet,
dass effiziente Nutzung der eingeschlossenen Zellen sogar bei einer
mit dem System zusammenhängenden
Veränderung
in den beschränkenden
Bedingungen möglich
ist. Es ist außerdem
leicht möglich,
Mehrkanalreaktoren herzustellen, die zur Gewährleistung längerer Betriebszeiten
und zur Verkürzung
der Zeit zwischen aufeinander folgenden Analyseschritten vorteilhaft
sind. Der Grund dafür
ist, dass sich die Zellen nach der Inkubation mit einer Probe von
dieser Verschmutzung erholen und Spülschritten unterworfen werden
müssen. Diese
Spülschritte
beschränken
oft die Häufigkeit, mit
der aufeinander folgende Analyseverfahren durchgeführt werden
können.
Bei Verwendung eines Mehrkanalsystems ist es möglich, dass die Inkubation
mit der Probe in einem Kanal erfolgt, während die Regeneration der
Zellen in einem anderen Kanal stattfindet.
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Die
erfindungsgemäß bereitgestellten
Vorrichtungen haben daher die folgenden Vorteile gegenüber dem
Stand der Technik:
- – Die Mikroorganismen können sich
auf einer Membran befinden, die mit einer als sterile Schranke wirkenden
semipermeablen Membran bedeckt ist. Dies verhindert das Entlassen
von Zellen aus dem Reaktor.
- – Die
Mikroorganismen können
auf die "mikrobielle" Membran durch Filtration
einer Zellsuspension aufgebracht werden, wodurch die Zellbeladung leicht
variiert werden kann und gleichzeitig eine gute Reproduzierbarkeit
der Zellbeladung möglich
ist.
- – Der
Reaktor enthält
keine Partikel, auf die Mikroorganismen aufgebracht werden, so dass
kein zusätzlicher
Innendruck aufgebaut wird.
- – Es
ist durch Verändern
der Geometrie des Durchflusswegs möglich, die Kontaktdauer zwischen
der Probe und den Zellen zu variieren und an die praktischen Anforderungen
anzupassen.
- – Der
Reaktor kann auf unterschiedliche Weisen hergestellt werden, so
dass beispielsweise Kombinationen mit Mikrosystemen leicht möglich sind.
- – Der
kompakte Einbau einer Mehrzahl von Kanälen ist möglich.
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Es
ist weiterhin möglich,
notwendige Sensoren stromabwärts
des Reaktors anzubringen, oder sie werden zur differenziellen Messung
vor und hinter dem Reaktor angebracht. Beispiele für geeignete Sensoren
sind Sauerstoffelektroden, aber je nach dem zu bestimmenden Analyten
und den verwendeten Mikroorganismen können auch andere Sensoren eingesetzt
werden, wie pH-, CO2-, NH3-
oder Cl–-Elektroden.
Die Auswahl der Detektoren hängt von
den besonderen Erfordernissen der durchführten Analyseverfahren ab.
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Die
Erfindung wird jetzt beispielhaft anhand der beigefügten Zeichnungen
beschrieben, wobei
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1 einen
Querschnitt durch einen erfindungsgemäßen mikrobiellen Membranreaktor
zeigt,
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2a eine
Draufsicht der Innenseite des zweiten Elements des mikrobiellen
Membranreaktors zeigt,
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2b einen
Querschnitt durch das zweite Element des mikrobiellen Membranreaktors
entlang der Linie A–B
in 2a zeigt und
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3 eine
schematische Darstellung des Querschnitts eines mikrobiellen Membranreaktors mit
schematisch dargestellten Membranen zeigt.
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Unter
Bezugnahme auf die Zeichnungen zeigt 1 im Querschnitt
die schematische Anordnung des mikrobiellen Membranreaktors 1,
bestehend aus einem ersten, oder in der Zeichnung unteren, Teil 2,
der zum Aufnehmen einer Membran (nicht dargestellt) dient, und einem
zweiten, entsprechend oberen, Element 3, das die später erläuterten
Durchflusskanäle
trägt oder
enthält.
Aus dem Querschnitt ist ersichtlich, dass die jeweiligen Innenseiten 4 und 5 des
entsprechenden unteren und oberen Elements 2, 3 eine
ebene Oberfläche
bilden. In dem Spalt 6 zwischen diesen ebenen Oberflächen 4, 5 sind
eine so genannte semipermeable, sterile Membran (nicht dargestellt)
und die mikrobielle Membran angeordnet.
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Die
Elemente 2, 3 des mikrobiellen Membranreaktors 1 werden
beispielsweise mittels Schrauben, die durch die Bohrungen 7, 8 und 9 reichen,
die sich durch die zwei Elemente 2 und 3 erstrecken,
zusammengepresst, wobei die Membranen zwischen ihnen angeordnet
sind. Die Durchflusskanäle
können in
diesem Fall entweder direkt in der Oberfläche 5 des Elements 3 in
Form von Vertiefungen oder Rinnen angeordnet sein oder können durch
Rinnen in einer Platte gebildet werden, die zusätzlich zu den Membranen auf
der Oberfläche 5 des
Elements 3 vor dem Zusammenbau der Elemente 2, 3 in
den Spalt 6 eingebracht wird. Die Membranen und die wahlfreie Platte
oder die Durchflusskanäle
sind in dieser Figur aus Gründen
der Klarheit weggelassen.
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2a zeigt
eine Draufsicht der inneren Oberfläche 5 des oberen oder
zweiten Elements 3, welche die Durchflusskanäle enthält. Für den Zusammenbau
des mikrobiellen Membranreaktors 1 enthalten das zweite
Element 3 und das hier nicht dargestellte erste Element 2 die
Bohrungen 7, 8, 9, 10 und 11.
Die hier dargestellte Ausführungsform
des zweiten Elements enthält
eine Mehrzahl Kanäle 12, 15, 18 und 21,
die mäanderförmig gestaltet
sind, wobei jeder Kanal durch entsprechende Bohrungen 13, 14; 16, 17; 19, 20; 22, 23 mit
der Oberseite des zweiten Elements 3 verbunden ist, welche
vorzugsweise ebenfalls eben ist, so dass ein Element 2, 3 des
mikrobiellen Membranreaktors 1 in der bevorzugten Ausführungsform
eine rechteckige flache Gestalt in Form eines Blocks besitzt. Diese
Gestalt ist jedoch nicht obligatorisch; vielmehr sind nur ebene innere Oberflächen der
Elemente 2, 3 des mikrobiellen Membranreaktors 1 eine
Voraussetzung.
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Die
Gestalt oder Anzahl der Durchflusskanäle 12, 15, 18, 21 hängt von
den besonderen Anforderungen der Verwendung ab, der die Vorrichtung
zugeführt
werden soll. Das Innenvolumen der Durchflusskanäle 12, 15, 18, 21 (Länge, Weite,
Tiefe) lässt sich
durch geeignete Herstellungstechniken angemessen auswählen. Dies
kann beispielsweise unter Verwendung von Mikrofabrikationstechniken
erfolgen, in welchem Fall durch angemessene Verfahrenskontrolle "Durchflussmikrokanäle" in Wafern hergestellt
werden. Die geometrische Form der Kanäle selbst, die hier dargestellt
ist, muss nicht notwendigerweise in der Oberfläche der Innenseite des zweiten
Elements 3 angebracht werden, sondern kann durch geeignete
Rinnen in einer separaten Platte (nicht dargestellt) erzielt werden,
die dann auf der Innenseite 5 des zweiten Elements 3 derart
angebracht wird, dass die Kanäle 12, 15, 18, 21 der
Platte mit den entsprechenden Bohrungen 13, 14; 16, 17; 19, 20; 22, 23 übereinstimmen.
In diesem Fall hängt
die Tiefe der Kanäle
von der Dicke der verwendeten Platte ab. In einer Draufsicht würde daher
eine Platte ebenfalls der Darstellung in 2a entsprechen.
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2b zeigt
das zweite Element 3 des mikrobiellen Membranreaktors 1 im
Querschnitt entlang der Linie A–B
in 2a. Die entsprechenden Kanäle 12, 18 sind
in die innere Oberfläche 5 des
ersten Elements 3 beispielsweise durch Ätzen oder eine andere Materialabtragungstechnik
eingekerbt. Die Verbindungspunkte und Endpunkte der Kanäle sind
mit den entsprechenden gebohrten Durchgängen 13, 14, 19, 20 verbunden,
die zur Oberseite 24 des zweiten Elements führen. Diese
gebohrten Durchgänge
dienen als Verbindungselemente zur Anbindung des externen Flüssigkeitsflusses.
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3 zeigt
einen Querschnitt durch den mikrobiellen Membranreaktor 1 mit
schematisch dargestellten Membranen entlang der Linie A–B in 2a. Eine
mikrobielle Membran 25, welche die Mikroorganismen enthält, wird
auf das erste oder untere Element 1 des Reaktors aufgebracht.
Die Membran 25 kann beispielsweise durch ein herkömmliches
Filterpapier gebildet werden. Die semipermeable, sterile Membran 26,
die für
Mikroorganismen undurchlässig ist,
ist über
dieser mikrobiellen Membran 25 angeordnet und hält die Mikroorganismen
von den Durchflusskanälen 12, 18 des
zweiten oder oberen Elements 3 fern. Das obere und das
untere Element 2, 3 werden durch Schrauben, die
entlang des dargestellten Durchgangslochs 8 eingesetzt
werden, zusammengepresst, so dass der in 3 dargestellte
Spalt 6 natürlich
in dem gebrauchsfertigen Reaktor 1 fehlt.