DE69824597T2

DE69824597T2 - Ikk-beta proteine, nukleinsäuren und verfahren

Info

Publication number: DE69824597T2
Application number: DE69824597T
Authority: DE
Inventors: V. David GOEDDEL; John Woronicz
Original assignee: Tularik Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1997-07-01
Filing date: 1998-07-01
Publication date: 2005-06-09
Anticipated expiration: 2018-07-02
Also published as: AU725477B2; DE69824597D1; EP1005540A4; DK1005540T3; JP2001510347A; US5851812A; EP1005540B1; WO1999001542A1; US5916760A; AU8283798A; ES2218839T3; JP2003274984A; CA2294516A1; ATE269402T1; CA2294516C; JP3472584B2; US5939302A; EP1005540A1

Description

Gebiet der Erfindung
Beim Gebiet dieser Erfindung handelt es sich um Proteine, welche bei der Transkriptionsfaktor-Aktivierung beteiligt sind.
Hintergrund
Cytokine lösen Veränderungen der Genexpression durch Modifizieren der Aktivität von ansonsten latenten Transkriptionsfaktoren aus (Hill und Treisman, 1995). Der Nuklear-Faktor κB (NF-κB) ist ein prominentes Beispiel, wie ein solcher externer Stimulus zu einem aktiven Transkriptionsfaktor umgewandelt wird (Verma et al., 1995). Das NF-κB-System ist aus Homo- und Heterodimeren von Mitgliedern der Rel-Familie verwandter Transkriptionsfaktoren zusammengesetzt, welche die Expression zahlreicher Immun- und Entzündungsantwort-Gene sowie bedeutsamer viraler Gene regulieren (Lenardo und Baltimore, 1989; Baeuerle und Henkel, 1994). Die Aktivität von NF-κB-Transkriptionsfaktoren wird von ihrer subzellularen Lokalisierung reguliert (Verma et al., 1995). In den meisten Zelltypen ist NF-κB als ein Heterodimer, umfassend eine 50 kDa und eine 65 kDa große Untereinheit, vorhanden. Dieses Heterodimer ist im Zytoplasma in Assoziation mit IκBα maskiert, einem Mitglied der IκB-Familie von inhibitorischen Proteinen (Finco und Baldwin, 1995; Thanos und Maniatis, 1995; Verma et., 1995). IκBα maskiert das Kernlokalisierungssignal von NF-κB und verhindert dadurch die Translokation von NF-κB in den Kern. Die Umwandlung von NF-κB zu einem aktiven Trankriptionsfaktor, welcher in den Kern wandert und an kognate DNA-Sequenzen bindet, erfordert die Phosphorylierung und einen anschließenden Ubiquitin-abhängigen Abbau von IκBα in dem 26s-Proteasom. Die signalinduzierte Phosphorylierung von IκBα findet an den Serinen 32 und 36 statt. Eine Mutation eines von diesen Serinen oder beider macht IκBα resistent gegen eine Ubiquitinylierung und den proteolytischen Abbau (Chen et al., 1995).
Die pleiotropen Cytokine Tumor-Nekrosefaktor (TNF) und Interleukin-1 (IL-1) zählen zu den physiologischen Induktoren der IκBα-Phosphorylierung und anschließenden NF-κB-Akti vierung (Osborn et al., 1989; Beg et al., 1993). Obwohl TNF und IL-1 Signalleitungs-Kaskaden, welche zu NF-κB-Aktivierung führen, über unterschiedliche Familien von Zelloberflächenrezeptoren initiieren (Smith et al., 1994; Dinarello, 1996), verwenden beide Wege Mitglieder der TNF-Rezeptor-assoziierten-Faktor(TRAF)-Familie von Adapterproteinen als Signal-Transducer (Rothe et al., 1995; Hsu et al., 1996; Cao et al., 1996b). Von TRAF-Proteinen wurde ursprünglich festgestellt, dass sie direkt mit den zytoplasmatischen Domänen von mehreren Mitgliedern der TNF-Rezeptor-Familie assoziieren, einschließlich des 75 kDa TNF-Rezeptors (TNFR2), CD 40, CD 30 und des Lymphotoxin-β-Rezeptors (Rothe et al., 1994; Hu et al., 1994; Cheng et al., 1995; Mosialos et al., 1995; Song und Donner, 1995; Sato et al., 1995; Lee et al., 1996; Gedrich et al., 1996; Ansieau et al., 1996). Darüber hinaus werden TRAF-Proteine indirekt in den 55 kDa TNF-Rezeptor (TNFR1) durch das Adapterprotein TRADD (Hsu et al., 1996) rekrutiert. Die Aktivierung von NF-κB durch TNF erfordert TRAF2 (Rothe et al., 1995; Hsu et al., 1996). Auch TRAF5 ist mit der NF-κB-Aktivierung durch Mitglieder der TNF-Rezeptorfamilie in Verbindung gebracht worden (Nakano et al., 1996). Im Gegensatz dazu nimmt TRAF6 an der NF-κB-Aktivierung durch IL-1 teil (Cao et al., 1996b). Nach IL-1-Behandlung assoziiert TRAF6 mit IRAK, einer Serin-Threonin-Kinase, welche an den IL-1-Rezeptorkomplex bindet (Cao et al., 1996a).
Die NF-κB-induzierende Kinase (NIK) ist ein Mitglied der MAP-Kinase-Kinasekinase (MAP3K)-Familie, welche als ein TRAF2-interagierendes Protein identifiziert wurde (Malinin et al., 1997). NIK aktiviert NF-κB bei Überexpression, und Kinase-inaktive Mutanten von NIK, umfassend dessen TRAF2-interagierende C-terminale Domäne (NIK(_624–947), oder ohne zwei entscheidende Lysinreste in ihrer Kinasedomäne (NIK_{(KK429–430AA)}), verhalten sich als dominant-negative Inhibitoren, welche TNF-, IL-1- und TRAF2-induzierte NF-κB-Aktivierung unterdrücken (Malinin et al., 1997). Kürzlich wurde von NIK festgestellt, mit weiteren Mitgliedern der TRAF-Familie zu assoziieren, einschließlich TRAF5 und TRAF6. Katalytisch inaktive Mutanten von NIK inhibierten ebenfalls die TRAF5- und TRAF6-induzierte NF-κB-Aktivierung, wodurch ein vereinheitlichendes Konzept für NIK als gemeinsamer Mediator in den NF-κB-Signalleitungs-Kaskaden, ausgelöst von TNF und IL-1 stromabwärts von den TRAFs, bereitgestellt wird.
Zwei IκB-Kinasen von 36 und 40 kDa, welche Stellen in den C-terminalen 40 Resten von IκBα phosphorylieren, sind berichtet worden (Bennett et al. 1996). Auch eine IκB-Kinase, spezifisch für die Reste Ser 293 und Thr 291 in der C-terminalen sauren Domäne von IκBα ist beschrieben worden (Kuno et al., 1995). Von Ser 32 und Ser 36 von Iκβα ist nach Berichten gezeigt worden, in Antwort auf TNFα und IL-1 phosphoryliert zu werden (Mercurio et al., 1996).
Hier beschreiben wir eine neue Kinase-IκB-Kinase, IKK-β, als ein NIK-wechselwirkendes Protein. IKK-β besitzt Sequenzähnlichkeit zu dem konzeptualen Translat eines früher identifizierten offenen Leserasters, welches postuliertermaßen eine Serin-Threonin-Kinase unbekannter Funktion kodiert ('Conserved Helix-loop-helix Ubiquitous Kinase' oder CHUK, Connelly und Marcu, 1995; Mock et al., 1995). Katalytisch inaktive Mutanten von IKK-β unterdrücken gezeigtermaßen die NF-κB-Aktivierung, welche durch TNF- und IL-1-Stimulation sowie durch TRAF- und NIK-Überexpression induziert wird; von vorübergehend exprimiertem IKK-β wird gezeigt, mit dem endogenen IκBα-Komplex zu assoziieren; und von IKK-β wird gezeigt, IκBα an den Serinen 32 und 36 zu phosphorylieren. Wie hierin verwendet bezieht sich Ser 32 und Ser 36 von IκB kollektiv auf die zwei Serinreste, welche ein Teil der Konsensus-Sequenz DSGL/IXSM/L sind (z. B. Ser 32 und 36 in IκBα, Ser 19 und 23 in IκBβ, bzw. Ser 157 und 161, oder 18 und 22, abhängig von der Verwendung der Methionine, in IκBε).
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung sieht Verfahren und Zusammensetzungen vor, welche isolierte IKK-β-Polypeptide und verwandte Nukleinsäuren betreffen. IKK-β-Polypeptide können NF-κB-Aktivierung regulieren und stellen somit bedeutsame Regulatoren der Zellfunktion bereit. Die Polypeptide können rekombinant aus transformierten Wirtszellen aus Nukleinsäuren, kodierend das vorliegende IKK-β-Polypeptid, hergestellt oder aus Säugerzellen gereinigt werden. Die Erfindung sieht Verfahren des Screenens für ein Mittel, welches die Wechselwirkung eines IKK-β-Polypeptids mit einem Bindungsziel moduliert, vor. Die Beschreibung ist nützlich in der Diagnose (z. B. genetische Hybridisierungs-Screens nach IKK-β-Transkripten), Therapie (z. B. IKK-β-Kinase-Inhibitoren zur Inhibition der TNF-Signaltransduktion) und in der biopharmazeutischen Industrie (z. B. als Immunogene, Reagenzien zum Isolieren anderer Transkriptionsregulatoren, Reagenzien zum Screenen von chemischen Bibliotheken nach pharmakologischen Leitsubstanzen bzw. Lead-Compounds etc.).
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung bereit:

– ein isoliertes IKK-β-Polypeptid, umfassend SEQ ID Nr.: 2, welches IκBα an den Serinen 32 und 36 phosphoryliert;
– eine isolierte oder rekombinante Nukleinsäure, umfassend einen Strang von SEQ ID Nr.: 1;
– eine rekombinante Nukleinsäure, kodierend ein Polypeptid gemäß der Erfindung;
– eine Zelle, umfassend eine Nukleinsäure gemäß der Erfindung;
– ein Verfahren zur Herstellung eines IKK-β-Polypeptids, umfassend die Schritte: Einführen einer Nukleinsäure gemäß der Erfindung in eine Wirtszelle oder einen zellulären Extrakt, Inkubieren der Wirtszelle oder des Extrakts unter Bedingungen, bei welchen die Nukleinsäure als ein Transkript exprimiert wird und das Transkript als ein Translationsprodukt, umfassend das Polypeptid, exprimiert wird, und Isolieren des Translationsprodukts; und
– ein Verfahren zum Screenen nach einem Mittel, welches die Wechselwirkung eines IKK-β-Polypeptids an einem Bindungsziel moduliert, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Inkubieren einer Mischung, umfassend: ein isoliertes Polypeptid gemäß der Erfindung, ein Bindungsziel des Polypeptids und ein Kandidatenmittel; unter Bedingungen, unter denen, wenn das Mittel nicht vorhanden ist, das Polypeptid an dem Bindungsziel mit einer Referenzaffinität spezifisch bindet; Nachweisen der Bindungsaffinität des Polypeptids an dem Bindungsziel, um eine durch das Mittel beeinflusste Affinität zu bestimmen, wobei ein Unterschied zwischen der durch das Mittel beeinflussten Affinität und der Referenzaffinität angibt, dass das Mittel die Bindung des Polypeptids an dem Bindungsziel moduliert.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Nukleotidsequenz einer natürlichen cDNA, kodierend ein humanes IKK-β-Polypeptid, ist als SEQ ID Nr.: 1 gezeigt, und das vollständige konzeptuale Translat ist als SEQ ID Nr.: 2 gezeigt.

Die IKK-β-spezifische Kinase-Aktivität kann durch zweckmäßige in vitro-, zellbasierte oder in vivo-Assays bestimmt werden: z. B. in vitro-Bindungsassays, Zellkulturassays, in Tieren (z. B. Gentherapie, transgene Tiere) etc. Bindungsassays schließen jeweden Assay ein, worin die molekulare Wechselwirkung eines IKK-β-Polypeptids mit einem Bindungsziel ausgewertet wird. Das Bindungsziel kann ein natürliches intrazelluläres Bindungsziel, wie ein IKK-β-Substrat, ein IKK-β-regulierendes Protein oder ein anderer Regulator, welcher die IKK-β-Aktivität oder ihre Lokalisierung direkt moduliert; oder ein nicht-natürliches Bindungsziel, wie ein spezifisches Immunprotein, wie ein Antikörper, oder ein IKK-β-spezifisches Mittel, wie diejenigen, welche in Screeningassays, wie nachstehend beschrieben, identifiziert wurden, sein. Die IKK-β-Bindungsspezifität kann durch Kinase-Aktivität oder Bindungsgleichgewichtskonstanten (üblicherweise mindestens etwa 10⁷ M^–1, vorzugsweise mindestens etwa 10⁸ M^–1, weiter bevorzugt mindestens etwa 10⁹ M^–1), durch die Fähigkeit des vorliegenden Polypeptids, als negative Mutanten in IKK-β-exprimierenden Zellen zu wirken, IKK-β-spezifischen Antikörper in einem heterologen Wirt (z. B. einem Nager oder Kaninchen) hervorzurufen, etc. getestet werden. In jedem Fall unterscheidet die IKK-β-Bindungsspezifität der vorliegenden IKK-β-Polypeptide notwendigerweise von IKK-α (SEQ ID Nr.: 4). Beispielhafte IKK-β-Polypeptide mit IKK-β-Bindungsspezifität sind in der Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1. Beispielhafte IKK-β-Polypeptide mit IKK-β-Bindungsspezifität

hIKK-βΔ1 (SEQ ID Nr.: 2, Reste 1–9)	hIKK-βΔ1 (SEQ ID Nr.: 2, Reste 217–229)
hIKK-βΔ1 (SEQ ID Nr.: 2, Reste 11–17)	hIKK-βΔ1 (SEQ ID Nr.: 2, Reste 300–350)
hIKK-βΔ1 (SEQ ID Nr.: 2, Reste 21–19)	hIKK-βΔ1 (SEQ ID Nr.: 2, Reste 419–444)
hIKK-βΔ1 (SEQ ID Nr.: 2, Reste 42–51)	hIKK-βΔ1 (SEQ ID Nr.: 2, Reste 495–503)
hIKK-βΔ1 (SEQ ID Nr.: 2, Reste 73–89)	hIKK-βΔ1 (SEQ ID Nr.: 2, Reste 565–590)
hIKK-βΔ1 (SEQ ID Nr.: 2, Reste 90–99)	hIKK-βΔ1 (SEQ ID Nr.: 2, Reste 610–627)
hIKK-βΔ1 (SEQ ID Nr.: 2, Reste 120–130)	hIKK-βΔ1 (SEQ ID Nr.: 2, Reste 677–690)
hIKK-βΔ1 (SEQ ID Nr.: 2, Reste 155–164)	hIKK-βΔ1 (SEQ ID Nr.: 2, Reste 715–740)
hIKK-βΔ1 (SEQ ID Nr.: 2, Reste 180–190)	hIKK-βΔ1 (SEQ ID Nr.: 2, Reste 747–756)

Die IKK-β-Polypeptide sind isoliert oder rein: ein "isoliertes" Polypeptid ist von wenigstens einigem bzw. einem gewissen Anteil des Materials nicht begleitet, mit welchem es in seinem natürlichen Zustand assoziiert ist, was vorzugsweise mindestens etwa 0,5 Gew.-% und weiter bevorzugt mindestens etwa 5 Gew.-% des Gesamtpolypeptids in einer gegebenen Probe ausmacht, und ein reines Polypeptid macht mindestens etwa 90 Gew.-% und vorzugsweise mindestens etwa 99 Gew.-% des Gesamtpolypeptids in einer gegebenen Probe aus. Die IKK-β-Polypeptide und -Polypeptiddomänen können synthetisiert, durch rekombinante Technologie hergestellt oder aus Säuger-, vorzugsweise Humanzellen gereinigt werden. Eine große Vielzahl von molekularen und biochemischen Verfahren ist für die biochemische Synthese, molekulare Expression und Reinigung der vorliegenden Zusammensetzungen verfügbar, siehe z. B. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook, et al. Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (Hrsg.: Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY) oder diejenigen, welche anderweitig im Fachgebiet bekannt sind.
Für die vorliegenden Kinaseproteine spezifische Bindungsmittel schließen Substrate, Agonisten, Antagonisten, natürliche intrazelluläre Bindungsziele etc., Verfahren zur Identifizierung und Herstellung solcher Mittel und ihre Verwendung in Diagnose, Therapie und pharmazeutischer Entwicklung ein. Zum Beispiel sind spezifische Bindungsmittel in einer Vielzahl von diagnostischen und therapeutischen Anwendungen nützlich, speziell, wo Krankheit oder Krankheits-Prognose mit der inkorrekten Verwendung eines Wegs, welcher die vorliegenden Proteine beteiligt, z. B. NF-κB-Aktivierung, assoziiert ist. Neue IKK-β-spezifische Bindungsmittel schließen IKK-β-spezifische Rezeptoren, wie somatisch rekombinierte Polypeptid-Rezeptoren, wie spezifische Antikörper oder T-Zell-Antigen-Rezeptoren (siehe z. B. Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory) und andere natürliche intrazelluläre Bindungsmittel, identifiziert mit Assays, wie Ein-, Zwei- und Drei-Hybrid-Screens, nicht-natürliche intrazelluläre Bindungsmittel, identifiziert in Screens von chemischen Bibliotheken, wie nachstehend beschrieben, etc., ein. Mittel von besonderem Interesse modulieren die IKK-β-Funktion, z. B. IKK-β-abhängige transkriptionelle Aktivierung. Zum Beispiel kann eine große Vielzahl von Inhibitoren der IKK-β-IκB-Kinase-Aktivität verwendet werden, um die Signaltransduktion, welche IκB beteiligt, zu regulieren. Exemplarische IKK-β-IκB-Kinase-Inhibitoren schließen bekannte Klassen von Serin/Threonin-Kinase(z. B. PKC)-Inhibitoren, wie kompetitive Inhibitoren von ATP- und Substratbindung, Antibiotika, IKK-β-abgeleitete Peptidinhibitoren etc. ein, siehe die Tabellen 2 und 3. Die IKK-β-Spezifität und -Aktivität werden leicht in Hochdurchsatz-Kinase-Assays unter Verwendung von Panels bzw. Reihen von Proteinkinasen quantifiziert (siehe die zitierten Literaturbezugsstellen und Beispiele).
Bevorzugte Inhibitoren schließen natürliche Verbindungen, wie Staurosporin (Omura S, et al., J. Antibiot. (Tokyo), Juli 1995; 48(7): 535–48), hergestellt von einem Meeresorganismus, und synthetische Verbindungen, wie PD 153035, ein, welches ebenfalls wirkungsvoll die EGF-Rezeptor-Proteinkinase inhibiert (Fry DW et al., Science, 19. Aug. 1994; 265 (5175): 1093–5). Mitglieder der Tyrphostin-Familie von synthetischen Proteinkinase-Inhibitoren sind ebenfalls nützlich; diese schließen Verbindungen ein, welche reine ATP-Kompetitoren sind, Verbindungen, welche reine Substrat-Kompetitoren sind, und Verbindungen, welche gemischte Kompetitoren sind und sowohl mit ATP als auch Substrat kompetieren (Levitzki A und Gazit A, Science, 24. März 1995; 267(5205): 1782–8). Weitere IKK-β-Inhibitoren schließen Peptidbasierte Substrat-Kompetitoren, welche endogen von der Säugerzelle hergestellt werden, z. B. PKI (Proteinkinase-Inhibitor, Seasholtz AF et al., Proc Natl Acad Sci USA, 28. Feb. 1995; 92(5): 1734–8), oder Proteine, welche cdc-Kinasen inhibieren (Correa-Bordes, J., und Nurse, P., Cell, 15. Dez 1995; 83(6): 1001–9), ein. Weitere kleine Peptid-basierte substratkompetitive Kinaseinhibitoren und allosterische Inhibitoren (inhibierende Mechanismen unabhängig von ATP- oder Substrat-Kompetition) werden leicht durch etablierte Verfahren erzeugt (Hvalby, O., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 24. Mai 1994; 91(11): 4761–5; Barja, P., et al., Cell Immunol., Jan. 1994; 153 (1): 28–38; Villar-Palasi C, Biochim Biophys Acta, 30. Dez. 1994; 1224(3): 384–8; Liu WZ, et al., Biochemistry, 23. Aug. 1994; 33(33): 10120–6).
Tabelle 2. Ausgewählte kleinmolekülige IKK-β-Kinase-Inhibitoren
Zitate

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hIκBα, Reste 24–39, 32 Ala	hIKK-β, Δ 5–203
hIκBα, Reste 29–47, 36 Ala	hIKK-β, Δ 1–178
hIκBα, Reste 26–46, 32/36 Ala	hIKK-β, Δ 368–756
hIκBβ, Reste 25–38, 32 Ala	hIKK-β, Δ 460–748
hIκBβ, Reste 30–41, 36 Ala	hIKK-α, Δ 1–289
hIκBβ, Reste 26–46, 32/36 Ala	hIKK-α, Δ 12–219
hIκBε, Reste 24–40, 32 Ala	hIKK-α, Δ 307–745
hIκBε, Reste 31–50, 36 Ala	hIKK-α, Δ 319–644
hIκBε, Reste 27–44, 32/36 Ala

Bevorzugte Inhibitoren sind in Säugerwirten oral aktiv. Für diagnostische Zwecke werden die Inhibitoren oder sonstigen IKK-β-Bindungsmittel häufig markiert, wie mit fluoreszierenden, radioaktiven, chemolumineszenten oder anderen leicht nachweisbaren Molekülen, entweder direkt konjugiert an das Bindungsmittel oder konjugiert an eine für das Bindungsmittel spezifische Sonde.
Die Aminosäuresequenzen der beschriebenen IKK-β-Polypeptide werden verwendet, um IKK-β-Polypeptid-kodierende Nukleinsäuren rückzutranslatieren, welche für ausgewählte Expressionssysteme optimiert sind (Holler et al. (1993) Gene 136, 323–328; Martin et al. (1995) Gene 154, 150–166), oder verwendet, um degenerierte Oligonucleotid-Primer und Sonden zur Verwendung in der Isolierung natürlicher IKK-β-kodierender Nukleinsäuresequenzen zu erzeugen ("GCG" Software, Genetics Computer Group, Inc, Madison WI). IKK-β-kodierende Nukleinsäuren werden in IKK-β-Expressionsvektoren verwendet und in rekombinante Wirtszellen, z. B. für Expression und Screening, transgene Tiere, z. B. für funktionelle Untersuchungen, wie der Wirksamkeit von Kandidaten-Arzneimitteln für eine mit IKK-β-modulierter Zellfunktion assoziierte Krankheit, etc. eingebracht.
Nukleinsäure-Hybridisierungssonden und Replikations-/Amplifikations-Primer mit einer IKK-β-cDNA-spezifischen Sequenz, enthalten in SEQ ID Nr.: 1 und ausreichend zur Bewirkung einer spezifischen Hybridisierung daran (d. h. spezifisches Hybridisieren mit SEQ ID Nr.: 1 in Gegenwart von IKK-α-cDNA, SEQ ID Nr.: 3), umfassen mindestens 12, vorzugsweise mindestens 24, weiter bevorzugt mindestens 36 und am stärksten bevorzugt mindestens 96 Basen von SEQ ID Nr.: 1, insbesondere von SEQ ID Nr.: 1, Nukleotide 1–567 und Nukleotide 693–2268. Das Aufzeigen einer spezifischen Hybridisierung erfordert im allgemeinen stringente Bedingungen, beispielsweise das Hybridisieren in einem Puffer, umfassend 30% Formamid in 5 × SSPE(0,18 M NaCl, 0,01 M NaPO₄, pH 7,7, 0,001 M EDTA)-Puffer bei einer Temperatur von 42°C, und das Gebundenbleiben bei Unterziehen unter ein Waschen bei 42°C mit 0,2 × SSPE, vorzugsweise das Hybridisieren in einem Puffer, umfassend 50% Formamid in 5 × SSPE-Puffer bei einer Temperatur von 42°C, und das Gebundenbleiben bei Unterziehen unter ein Waschen bei 42°C mit 0,2 × SSPE-Puffer bei 42°C. IKK-β-Nukleinsäuren können auch unter Anwendung von Alignierungs- bzw. Parallelausrichtungs-Algorithmen wie BLASTX (Altschul et al. (1990), Basic Local Alignment Search Tool, J. Mol. Biol. 215, 403–410) unterschieden werden.
Die vorliegenden Nukleinsäuren sind von synthetischen/nicht-natürlichen Sequenzen und/oder sind isoliert, d. h. nicht-begleitet von wenigstens einigem des Materials, mit welchem sie in ihrem natürlichen Zustand assoziiert sind, was vorzugsweise mindestens etwa 0,5 Gew.-%, bevorzugt mindestens 5 Gew.-% der Gesamtnukleinsäure, welche in einer gegebenen Fraktion vorhanden ist, ausmacht, und üblicherweise rekombinant, was bedeutet, dass sie eine nicht-natürliche Sequenz oder eine natürliche Sequenz, verknüpft an Nukleotid(e), verschieden von denjenigen, an welche sie auf einem natürlichen Chromosom verknüpft sind, umfassen. Rekombinante Nukleinsäuren, umfassend die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr.: 1, enthalten eine derartige Sequenz an einem Terminus, unmittelbar flankiert von einer anderen Sequenz als derjenigen, an welche sie auf einem natürlichen Chromosom verknüpft ist, oder flankiert von einer nativen flankierenden Region von weniger als 10 kb, vorzugsweise weniger als 2 kb, welche an einem Terminus vorliegt oder unmittelbar flankiert ist von einer anderen Se quenz als derjenigen, an welche sie auf einem natürlichen Chromosom verknüpft ist. Während die Nukleinsäuren üblicherweise RNA oder DNA sind, ist es häufig vorteilhaft, Nukleinsäuren zu verwenden, welche andere Basen oder Nukleotidanaloga umfassen, um eine modifizierte Stabilität etc. vorzusehen.
Die vorliegenden Nukleinsäuren finden eine große Vielzahl von Anwendungen, einschließlich der Verwendung als translatierbare Transkripte, Hybridisierungssonden, PCR-Primer, diagnostische Nukleinsäuren etc.; der Verwendung beim Nachweisen des Vorhandenseins von IKK-β-Genen und Gentranskripten und beim Nachweis oder der Amplifizierung von Nukleinsäuren, kodierend zusätzliche IKK-β-Homologe und -Strukturanaloge. Bei der Diagnose finden IKK-β-Hybridisierungssonden Anwendung in der Identifizierung von Wildtyp- und Mutanten-IKK-β-Allelen in klinischen und Laboratoriums-Proben. Mutante Allele werden verwendet, um Allel-spezifische Oligonukleotid (ASO)-Sonden für klinische Hochdurchsatz-Diagnosen zu erzeugen. In der Therapie werden therapeutische IKK-β-Nukleinsäuren verwendet, um die zelluläre Expression oder die intrazelluläre Konzentration oder Verfügbarkeit von aktivem IKK-β zu modulieren.
Die Erfindung sieht effiziente Verfahren zum Identifizieren von Mitteln, Verbindungen oder Leitverbindungen für Mittel vor, welche auf der Ebene einer IKK-β-modulierbaren zellulären Funktion wirksam sind. Im allgemeinen beinhalten diese Screeningverfahren das Testen hinsichtlich Verbindungen, welche IKK-β-Wechselwirkung mit einem natürlichem IKK-β-Bindungsziel, insbesondere die IKK-β-Phosphorylierung von IκB-abgeleiteten Substraten, insbesondere IκB- und NIK-Substraten, modulieren. Eine große Vielzahl von Assays für Bindungsmittel wird vorgesehen, einschließlich markierten in vitro-Protein-Protein-Bindungsassays, Immunoassays, zellbasierten Assays etc. Die Verfahren sind geeignet für ein automatisiertes, kostengünstiges Hochdurchsatz-Screening von chemischen Bibliotheken nach Leitverbindungen. Identifizierte Reagenzien finden Anwendung in der pharmazeutischen Industrie für Tier- und Humanversuche; beispielsweise können die Reagenzien derivatisiert und in in vitro- und in vivo-Assays erneut gescreent werden, um die Aktivität zu optimieren und die Toxizität für eine pharmazeutische Entwicklung zu minimieren.
In vitro-Bindungsassays verwenden eine Mischung von Komponenten, einschließlich eines IKK-β-Polypeptids, welches ein Teil eines Fusionsprodukts mit einem anderen Peptid oder Polypeptid, z. B. einem 'Tag' bzw. Markierer zum Nachweis oder Verankern, etc. sein kann. Die Assaymischungen umfassen ein natürliches intrazelluläres IKK-β-Bindungsziel. In einer besonderen Ausführungsform ist das Bindungsziel ein Substrat, das die IκB-Serine 32 und/oder 36 umfasst. Derartige Substrate umfassen ein IκBα-, -β- oder -ε-Peptid, einschließ lich des Serin-32- und/oder -36-Rests und mindestens 5, vorzugsweise mindestens 10 und weiter bevorzugt mindestens 20 natürlich vorkommender unmittelbar flankierender Reste auf jeder Seite (z. B. für Serin-36-Peptide die Reste 26–46, 22–42 oder 12–32, bzw. 151–171 für von IκBα, -β oder -ε abgeleitete Substrate). Obgleich native Volllängen-Bindungsziele verwendet werden können, wird es häufig bevorzugt, Abschnitte (z. B. Peptide) davon zu verwenden, solange der Abschnitt Bindungsaffinität und -avidität zu dem vorliegenden IKK-β-Polypeptid vorsieht, welche einfach in dem Assay messbar ist. Die Assay-Mischung umfasst ebenfalls ein pharmakologisches Kandidatenmittel. Kandidatenmittel umfassen zahlreiche chemische Klassen, obwohl sie typischerweise organische Verbindungen sind, vorzugsweise kleine organische Verbindungen, und aus einer großen Vielzahl von Quellen, einschließlich Bibliotheken von synthetischen oder natürlichen Verbindungen erhalten werden. Eine Vielzahl anderer Reagenzien kann ebenfalls in die Mischung eingeschlossen werden. Diese schließen Reagenzien wie ATP oder ATP-Analoga (für Kinase-Assays), Salze, Puffer, neutrale Proteine, z. B. Albumin, Detergenzien, Proteaseinhibitoren, Nukleaseinhibitoren, antimikrobielle Mittel etc. ein, welche verwendet werden können.
Die resultierende Mischung wird unter Bedingungen inkubiert, bei welchen, wenn das pharmakologische Kandidatenmittel nicht vorhanden ist, das IKK-β-Polypeptid spezifisch an das zelluläre Bindungsziel, einen Abschnitt oder ein Analog, mit einer Referenz-Bindungsaffinität bindet. Die Mischungskomponenten können in jedweder Reihenfolge zugegeben werden, welche die erforderlichen Bindungen vorsieht, und Inkubationen können bei jedweder Temperatur durchgeführt werden, welche eine optimale Bindung erleichtert. Inkubationsperioden werden gleicherweise für eine optimale Bindung gewählt, aber ebenfalls minimiert, um ein rasches Hochdurchsatz-Screening zu erleichtern.
Nach der Inkubation wird die von dem Mittel beeinflusste Bindung zwischen dem IKK-β-Polypeptid und einem oder mehreren Bindungszielen auf jedwede zweckmäßige Weise nachgewiesen. Für IKK-β-Kinase-Assays wird eine "Bindung" im allgemeinen durch eine Änderung in der Phosphorylierung eines IKK-β-Substrats nachgewiesen. In dieser Ausführungsform kann die Kinaseaktivität durch den Transfer eines markierten Phosphats auf das Substrat quantifiziert werden, wobei die Markierung den direkten Nachweis als Radioaktivität, Lumineszenz, optische oder Elektronen-Dichte etc. oder einen indirekten Nachweis, wie als Epitop-Tag, etc. bereitstellen kann. Eine Vielzahl von Verfahren kann angewandt werden, um die Markierung in Abhängigkeit von der Natur der Markierung und anderen Assay-Komponenten, z. B. durch optische oder Elektronen-Dichte, Strahlungsemissionen, nicht-radioaktive Energie-Transfers etc. oder indirekt detektiert mittels Antikörperkonjugaten etc. nachzuweisen.
Ein Unterschied in der Bindungsaffinität des IKK-β-Polypeptids zu dem Ziel in Abwesenheit des Mittels im Vergleich zu der Bindungsaffinität in Gegenwart des Mittels, gibt an, dass das Mittel die Bindung des IKK-β-Polypeptids an das IKK-β-Bindungsziel moduliert. In analoger Weise gibt, in dem ebenfalls untenstehend beschriebenen zellbasierten Assay, ein Unterschied in der IKK-β-abhängigen Transkriptionsaktivierung in Gegenwart und Abwesenheit eines Mittels an, dass das Mittel die IKK-β-Funktion moduliert. Ein Unterschied, wie hierin benutzt, ist statistisch signifikant und repräsentiert vorzugsweise einen Unterschied von wenigstens 50%, weiter bevorzugt mindestens 90%.
Der folgende experimentelle Abschnitt und die Beispiele werden auf dem Wege der Veranschaulichung und nicht zur Einschränkung angeboten.
Experimente
Identifikation von IKK-β
Um den Mechanismus der NIK-vermittelten NF-κB-Aktivierung zu untersuchen, identifizierten wir anfänglich Proteine, welche direkt mit NIK assoziieren, durch Hefe-Zwei-Hybrid-Proteinwechselwirkungs-Klonierung (Fields und Song, 1989). Es wurde ein Expressionsvektor erzeugt, welcher NIK, fusioniert an die DNA-Bindungsdomäne des Hefe-Transkriptionsfaktors GAL4, erzeugt. Dieser Vektor wurde als Köder in einem Zwei-Hybrid-Screen einer humanen B-Zell-cDNA-Bibliothek verwendet. Aus ungefähr 6 Millionen Transformanten wurden acht positive Klone erhalten, wie bestimmt durch die Aktivierung von his- und lacZ-Reportergenen. Von diesen Klonen kodierten 3 ein Mitglied der TRAF-Familie, TRAF3 (Hu et al., 1994; Cheng et al., 1995, Mosialos et al., 1995; Sato et al., 1995) und einer kodierte ein neues Protein, welches wir als IKK-α bezeichnen. Eine Retransformation in Hefezellen bestätigte die Wechselwirkung zwischen NIK und IKK-α. Ein humaner Volllängen-IKK-α-Klon wurde durch Screening einer Jurkat-cDNA-Bibliothek mit einer Sonde isoliert, welche aus dem 5'-Ende des IKK-α-Zwei-Hybrid-Klons erzeugt worden war. IKK-α umfasst eine N-terminale katalytische Serin-Threonin-Kinasedomäne, eine C-terminale Helix-Loop-Helix-Domäne und eine Leucin-Zipper-ähnliche amphipatische α-Helix, welche zwischen der Helix-Loop-Helix- und der Kinasedomäne angeordnet ist.
Um potenzielle IKK-α-verwandte Gene zu identifizieren, durchsuchten wir eine öffentliche Datenbank von humanen exprimierten Sequenz-Tags (ESTs). Wir identifizierten zwei ESTs (W68756 und AA128064), von welchen wir ermittelten, dass sie zum Kodieren verschiedener Peptide mit Sequenzähnlichkeit zu IKK-α in der Lage waren. IKK-α-verwandte cDNA wurde kloniert durch Sondieren einer Jurkat-cDNA-Bibliothek (humane T-Zellen) mit einer Oligonucleotid-Sonde, entsprechend einer Sequenz aus einem der ESTs. Eine Sequenzanalyse zeig te, dass die zwei ESTs verschiedene Fragmente desselben Gens beinhalteten. Die längsten erhaltenen cDNA-Klone wiesen ein ~3,2 kb großes Insert (SEQ ID Nr.: 1) und ein offenes Leseraster von 756 Aminosäuren (SEQ ID Nr.: 2) auf. Wir bezeichneten das von dieser cDNA kodierte Protein als IKK-β.
Wechselwirkung von IKK-β und NIK in humanen Zellen
Die Wechselwirkung von IKK-β mit NIK wurde in Säugerzell-Coimmunpräzipitations-Assays bestätigt. Humanes IKK-β, enthaltend ein C-terminales Flag-Epitop-Tag wurde transient in 293 humanen Embryo-Nierenzellen mit Myc-Epitop-ge'taggt'em NIK coexprimiert. Die Zell-Lysate wurden unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen das Flag-Epitop immunpräzipitiert, und ein copräzipitierendes NIK wurde durch Immunoblot-Analyse mit einem monoklonalen Anti-Myc-Antikörper nachgewiesen. In diesem Assay war IKK-β in der Lage, NIK zu copräzipitieren, was die Wechselwirkung zwischen beiden Proteinen bestätigt, wie nachgewiesen für IKK-α durch Hefe-Zwei-Hybrid-Analyse. Auch ein Deletetionsmutanten-IKK-β-Protein, dem der Großteil der N-terminalen Kinasedomäne fehlte (IKK-β_{(Δ5–203, d.
h. 1–4 & 204–756)}), war in der Lage, mit NIK zu assoziieren, was anzeigt, dass die α-helicale C-terminale Hälfte von IKK-β die Wechselwirkung mit NIK vermittelt.
Effekt von IKK-β und IKK-β-Mutanten auf die NF-κB-Aktivierung
Um eine mögliche Rolle für IKK-β in der NF-κB-Aktivierung zu untersuchen, untersuchten wir, ob eine transiente Überexpression von IKK-β ein NF-κB-abhängiges Reportergen aktivieren könnte. Ein E-Selectin-Luziferase-Reporter-Konstrukt (Schindler und Baichwal, 1994) und ein IKK-β-Expressionsvektor wurden in HeLa-Zellen cotransfiziert. Die IKK-β-Expression aktivierte das Reportergen in einer dosisabhängigen Weise, bei einer Maximal-Induktion der Luziferase-Aktivität von etwa dem 20fachen im Vergleich zur Vektorkontrolle. Ähnliche Ergebnisse wurden in 293 Zellen erhalten, worin die IKK-β-Überexpression die Reportergen-Aktivität ungefähr 20fach induzierte. Daher induziert IKK-β eine NF-κB-Aktivierung bei Überexpression.
Als Nächstes bestimmten wir den Effekt einer Überexpression von Kinase-inaktivem IKK-β_(Δ5–203), welches noch mit NIK assoziiert, auf die signalinduzierte NF-κB-Aktivierung in Reportergen-Assays in 293 Zellen. Die Überexpression von IKK-β_(Δ5–203) blockierte die TNF- und IL-1-induzierte Reportergen-Aktivierung, ähnlich zur Überexpression von NIK_(624–947). Es wurde ebenfalls festgestellt, dass IKK-β_(Δ5–203) die NF-κB-abhängige Reportergen-Aktivität inhibierte, welche von einer Überexpression von TRAF2, TRAF6 und NIK hervorrufen wurde. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass eine katalytisch inaktive IKK-β- Mutante ein dominant-negativer Inhibitor von TNF-, IL-1, TRAF- und NIK-induzierter NF-κB-Aktivierung ist. Dies zeigt, dass IKK-β als ein gemeinsamer Mediator der NF-κB-Aktivierung durch TNF und IL-1 stromabwärts von NIK wirkt.
In Klammern angegebene Bezugsstellen

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Beispiele

1. Protokoll für einen IKK-β-IκBα-Phosphorylierungs-Assay.
A. Reagenzien:
– Neutralit-Avidin: 20 μg/ml in PBS.
– Kinase: 10^–8–10^–5 M IKK-β (SEQ ID Nr.: 2) bei 20 μg/ml in PBS.
– Substrat: 10^–7–10^–4 M biotinyliertes Substrat (21-Reste-Peptid, bestehend aus den Resten 26–46 von humanem IκBα) bei 40 μg/ml in PBS.
– Blocking-Puffer: 5% BSA, 0,5% Tween 20 in PBS; 1 Stunde bei Raumtemperatur.
– Assay-Puffer: 100 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM MnCl₂, 20 mM HEPES pH 7,4, 0,25 mM EDTA, 1% Glycerol, 0,5% NP-40, 50 mM BME, 1 mg/ml BSA, Cocktail von Protease-Inhibitoren.
– [³²P]γ-ATP 10×-Stammlösung: 2 × 10^–5 M kaltes ATP mit 100 μCi [³²P]γ-ATP. Einbringung in einen Mikro-Kühlschrank von 4°C während des Screenings.
– Protease-Inhibitor-Cocktail (1000X): 10 mg Trypsin-Inhibitor (BMB # 109894), 10 mg Aprotinin (BMB # 236624), 25 mg Benzamidin (Sigma # B-6506), 25 mg Leupeptin (BMB # 1017128), 10 mg APMSF (BMB # 917575), und 2 mM NaVO₃ (Sigma # S-6508) in 10 ml PBS.
B. Herstellung von Assay-Platten:
– Beschichten mit 120 μl Stammlösung-N-Avidin je Vertiefung über Nacht bei 4°C.
– Zweimaliges Waschen mit 200 μl PBS.
– Blockieren mit 150 μl Blocking-Puffer.
– Zweimaliges Waschen mit 200 μl PBS.
C. Assay:
– Zusetzen von 40 μl Assay-Puffer/Vertiefung.
– Zusetzen von 40 μl biotinyliertem Substrat (2–200 pmol/40 μl in Assay-Puffer)
– Zusetzen von 40 μl Kinase (0,1–10 pmol/40 μl in Assay-Puffer)
– Zusetzen von 10 μl Verbindung oder Extrakt.
– Zusetzen von 10 μl [³²P]γ-ATP, 10 × Stammlösung.
– Schütteln bei 25°C während 15 Minuten.
– Inkubieren während weiterer 45 Minuten bei 25°C.
– Anhalten der Reaktion durch viermaliges Waschen mit 200 μl PBS.
– Zusetzen von 150 μl Szintillations-Cocktail.
– Zählen in der Topcount-Vorrichtung.
D. Kontrollen für alle Assays (auf jeder Platte befindlich):
a. Nicht-spezifische Bindung
b. Kaltes bzw. nicht-radioaktives ATP bei 80% Inhibition.
2. Protokoll für einen Hochdurchsatz-IKK-β-NIK-Bindungsassay.
A. Reagenzien:
– Neutralit-Avidin: 20 μg/ml in PBS.
– Blocking-Puffer: 5% BSA, 0,5% Tween 20 in PBS; 1 Stunde bei Raumtemperatur.
– Assay-Puffer: 100 mM KCl, 20 mM HEPES pH 7,6, 1 mM MgCl₂, 1% Glycerol 0,5% NP-40, 50 mM β-Mercaptoethanol, 1 mg/ml BSA, Cocktail von Protease-Inhibitoren.
– ³³P IKK-β-Polypeptid, 10 × Stammlösung 10^–8–10^–6 M "kaltes" IKK-β, ergänzt mit 200 000–250 000 cpm markiertem IKK-β (Beckman-Zähler). Einbringen in den 4°C-Kühlschrank während des Screenings.
– Protease-Inhibitor-Cocktail (1000X): 10 mg Trypsin-Inhibitor (BMB # 109894), 10 mg Aprotinin (BMB # 236624), 25 mg Benzamidin (Sigma # B-6506), 25 mg Leupeptin (BMB # 1017128), 10 mg APMSF (BMB # 917575), und 2 mM NaVO₃ (Sigma # S-6508) in 10 ml PBS.
– NIK: 10^–7–10^–5 M biotinyliertes NIK in PBS.
B. Herstellung von Assay-Platten:
– Beschichten mit 120 μl Stammlösung-N-Avidin je Vertiefung über Nacht bei 4 °C.
– Zweimaliges Waschen mit 200 μl PBS.
– Blockieren mit 150 μl Blocking-Puffer.
– Zweimaliges Waschen mit 200 μl PBS.
C. Assay:
– Zusetzen von 40 μl Assay-Puffer/Vertiefung.
– Zusetzen von 10 μl Verbindung oder Extrakt.
– Zusetzen von 10 μl ³³P-IKK-β (20–25000 cpm/0,1–10 pmol/Vertiefung = 10^–9–10^–7 M Endkonzentration).
– Schütteln bei 25°C während 15 Minuten.
– Inkubieren während weiteren 45 Minuten bei 25°C.
– Zusetzen von 40 μM biotinyliertem NIK (0,1–10 pmoles/40 μl in Assay-Puffer)
– Inkubieren während 1 Stunde bei Raumtemperatur.
– Anhalten der Reaktion durch viermaliges Waschen mit 200 μM PBS.
– Zusetzen von 150 μM Szintillations-Cocktail.
– Zählen in der Topcount-Vorrichtung.
D. Kontrollen für alle Assays (auf jeder Platte befindlich):
a. nicht-spezifische Bindung
b. Löslichkeit bzw. lösliche Substanz (nicht-biotinyliertes NIK) bei 80% Inhibition.

Claims

Isoliertes IKK-β-Polypeptid, umfassend die SEQ ID Nr.: 2, welches IκBα auf den Serinen 32 und 36 phosphoryliert.
Isolierte oder rekombinante Nukleinsäure, umfassend einen Strang der SEQ ID Nr.: 1.
Rekombinante Nukleinsäure, die ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 codiert.
Zelle, welche eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 3 umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines IKK-β-Polypeptids, welches die folgenden Schritte umfasst: Einführen einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 3 in eine Wirtszelle oder einen zellulären Extrakt, Inkubieren der Wirtszelle oder des Extraktes und Bedingungen, unter denen die Nukleinsäure als ein Transkript expremiert wird und das Transkript als ein Translationsprodukt, umfassend das Polypeptid, expremiert wird, und Isolieren des Translationsproduktes.
Verfahren des Screenens für ein Mittel, welches die Wechselwirkung eines IKK-β-Polypeptids an einem Bindungsziel moduliert, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Inkubieren einer Mischung, umfassend: ein isoliertes Polypeptid gemäß Anspruch 1, ein Bindungsziel des Polypeptids und ein Kandidatenmittel; unter Bedingungen, unter denen, wenn das Mittel nicht vorhanden ist, das Polypeptid an dem Bindungsziel mit einer Referenzaffinität spezifisch bindet; und Nachweisen der Bindungsaffinität des Polypeptids an dem Bindungsziel, um eine durch das Mittel beeinflusste Affinität zu bestimmen; wobei ein Unterschied zwischen der durch das Mittel beeinflussten Affinität und der Referenzaffinität angibt, dass das Mittel die Bindung des Polypeptid an dem Bindungsziel moduliert.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das Bindungsziel ein natürliches intrazelluläres Substrat ist und die Referenz- und die durch das Mittel beeinflusste Bindungsaffinität als Phosphorylierung des Substrates nachgewiesen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei das Substrat eine IκB-Polypeptid-Domäne umfasst.