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Die vorliegende Erfindung betrifft
die Verwendung von Peptiden, die sich von Filaggrin ableiten, bei
der Behandlung von Autoimmun-Erkrankungen, insbesondere von rheumatoider
Polyarthritis (PR).
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Im Blut von Patienten mit rheumatoider
Polyarthritis wurden zirkulierende Antikörper entdeckt und als spezifische
Marker für
diese Erkrankung vorgeschlagen.
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Diese Antikörper wurden ursprünglich in
zwei Familien eingeteilt:
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- – die
antiperinukleären
Faktoren (APF), bei denen es sich um zirkulierende Immunglobuline
handelt, die durch indirekte Immunfluoreszenz auf Abstrichen von
jugulären
Humanzellen nachweisbar sind; ihre durchschnittliche Diagnoseleistung
bei der Diagnose von PR liegt bei einer Spezifität von etwa 90% bei einer Sensitivität von 70%.
- – die
als "Anti-Keratin"-Antikörper
(AKA) bezeichneten Antikörper,
bei denen es sich um zirkulierende Immunglobuline G handelt, die
durch Immunfluoreszenz auf Kryoschnitten von Ratten-Ösophagus
nachweisbar sind. Diese Antikörper
sind sehr spezifisch für
rheumatoide Polyarthritis, und ihre durchschnittliche Diagnoseleistung
liegt bei einer Spezifität
von 98% bei einer Sensitivität
von etwa 50%.
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Die früheren Arbeiten des Erfinderteams
haben zur Charakterisierung der von diesen Antikörpern erkannten Antigene geführt und
ermöglichten
es so zu zeigen, daß sie
tatsächlich
ein- und dieselbe Familie von Autoantikörpern darstellen und daß sie gegen
verschiedene molekulare Formen der Familie der (Pro)filaggrine gerichtet
waren (für
einen Review siehe beispielsweise SERRE et VINCENT, in: Autoantibodies,
PETER und SHOENFELD Hrsg., Elsevier Science Publishers, 271–276, 1996).
Diese Antikörper
wurden als Anti-Filaggrin-Autoantikörper (AAF) bezeichnet. Die
Patentanmeldung
EP 0 511 116 beschreibt
die Reinigung und die Charakterisierung von Antigenen der Familie
der Filaggrine, die von diesen Antikörpern erkannt werden, und ihre
Verwendung zur Diagnose von rheumatoider Polyarthritis.
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Bei ihren folgenden Arbeiten haben
die Erfinder gezeigt, daß sich
die von diesen Antikörpern
erkannten Epitope auf Regionen des Filaggrinmoleküls befinden,
in denen die Arginine wenigstens zum Teil desiminiert und so in
Citrullin transformiert waren; sie haben also die wesentlichen immunreaktiven
Regionen identifiziert und haben anschließend ausgehend von diesen Peptide
erhalten, die Epitope tragen, die einen Citrullinrest beinhalten
und die spezifisch von den Anti-Filaggrin-Autoantikörpern erkannt
werden. Diese Peptide und ihre Verwendung zur Diagnose von PR sind
Gegenstand der Patentanmeldung FR 96 10651 im Namen von BIOMERIEUX,
eingereicht am 30. August 1996, und der Patentanmeldung PCT/FR 97/01541
im Namen von BIOMERIEUX, eingereicht am 1. September 1997. Die Entdeckungen
der Erfinder betreffend die Rolle von Citrullinresten bei der Reaktivität des Filaggrins
mit den für
PR spezifischen Autoantikörpern
wurden später
durch andere Forscher bestätigt
[SCHELLEKENS et al., Arthritis Rheum., 40, Supplement Nr. 9, S.
5276, Zusammenfassung 1471 (1997); VISSER et al., Arthritis Rheum.,
40, Supplement Nr. 9, S. S289, Zusammenfassung 1551 (1997)]. Die
Patentanmeldung PCT WO 99/28344, die ein älteres Recht nach Artikel 54(3)
EPÜ darstellt, beschreibt
verschiedene Citrullin-haltige Peptide, die von diesen Autoantikörpern erkannt
werden.
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Die Erfinder haben nun die Rolle
untersucht, die die Immunreaktion gegen diese Citrullin-haltigen
Epitope bei der Genese von PR spielt.
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Zu diesem Zweck haben sie das Verhältnis zwischen
den spezifisch gegen diese Epitope gerichteten Anti-Filaggrin-Autoantikörpern der
Klasse G und den gesamten IgG im Serum und in den rheumatoiden Geweben
verglichen und haben gefunden, daß dieses Verhältnis bei
den interstitiellen Immunglobulinen des rheumatoiden Gewebes etwa
10mal höher
war als bei den Serum-Immunglobulinen.
Sie haben weiterhin gezeigt, daß in
den rheumatoiden Geweben eine lokalisierte Synthese dieser Anti-Filaggrin-Autoantikörper der Klasse
G durch spezifische Plasmozyten in diesen Geweben erfolgte.
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Diese Ergebnisse zeigen, daß auf der
Ebene der rheumatoiden Gewebe eine lokale Autoimmunreaktion stattfindet,
die gegen Citrullin-haltige Epitope ähnlich denen gerichtet ist,
die von den Anti-Filaggrin-Autoantikörpern erkannt werden und von
denen diese Autoantikörper
eine der Komponenten darstellen. Diese Reaktion humoraler und/oder
zellulärer
Natur könnte
an der rheumatoiden Physiopathogenese beteiligt sein.
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Diese Beobachtungen legen es nahe,
Moleküle,
die die Citrullin-haltigen Epitope tragen, die von diesen Anti-Filaggrin-Autoantikörpern erkannt
werden, dazu zu verwenden, um diese Autoimmunreaktion zu neutralisieren,
und insbesondere, um die Bindung an ihr Antigen-Target der rheumatoiden
Geweben, der humoralen oder zellulären Effektoren dieser Autoimmunreaktion,
zu inhibieren.
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Eine solche in vivo-Neutralisation
dieser Autoimmunreaktion kann zur Behandlung von PR oder anderen
Erkrankungen beitragen, bei denen Läsionen eine Rolle spielen,
die durch eine Immunreaktion induziert sind, die gegen Citrullin-haltige
Epitope gerichtet ist, die Kreuzreaktionen mit denjenigen zeigen,
die von den Anti-Filaggrin-Antikörpern
erkannten werden.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist die Verwendung eines Peptidantigens, das spezifisch von den
Anti-Filaggrin-Autoantikörpern im
Serum von Patienten mit rheumatoider Polyarthritis erkannt wird,
das aus einem Peptid besteht, das sich ganz oder teilweise von der
Sequenz einer Filaggrin-Einheit
ableitet, in der wenigstens ein Argininrest durch einen Citrullinrest
substituiert wurde, und das wenigstens ein Tripeptid-Motiv Ser-Cit-His
umfaßt,
in dem Cit einen Citrullinrest bedeutet, zur Herstellung eines Inhibitormedikaments
zur Behandlung einer Pathologie, die eine Autoimmunreaktion gegenüber Citrullin-haltigen
Epitopen umfaßt,
die von diesen Anti-Filaggrin-Antikörpern erkannt werden, ausgenommen
die Verwendung einer Peptidsequenz:
Gln Gly Ser Cit His Gln
Gln Ala Arg
und von Peptiden, die diese Sequenz enthalten,
abgeleitet von einem der folgenden Peptide:
die in der Patentanmeldung
PCT WO 99/28344 beschrieben sind.
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Im Sine der vorliegenden Erfindung
versteht man unter:
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- – "Sequenz
einer Filaggrin-Einheit" die Sequenz des Translationsprodukts irgendeiner
der Untereinheiten des Gens für
das humane Profilaggrin oder für
das einer anderen Spezies von Lebewesen, das für eine Filaggrindomäne codiert,
oder auch eine theoretische Konsensussequenz, erhalten ausgehend
von den Sequenzen der Filaggrindomänen;
- – "Peptid,
das sich ganz oder teilweise von der Sequenz einer Filaggrin-Einheit
ableitet"
- a) jedes Polypeptid oder Oligopeptid, das diese gesamte Sequenz
oder ein Fragment von dieser umfaßt und das wenigstens einen
Citrullinrest umfaßt;
es kann sich beispielsweise um ein Proteolysefragment des (Pro)filaggrins
oder auch um ein synthetisches oder rekombinantes Peptid handeln;
- b) jedes Peptid, das aus der Modifikation eines wie oben unter
a) definierten Peptids resultiert, unter der Bedingung, daß diese
Modifikation das spezifische Reaktionsverhalten mit den Anti-Filaggrin-Autoantikörpern nicht
beeinträchtigt.
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Modifizierte Peptide, die erfindungsgemäß verwendet
werden können,
sind beispielsweise Mimotope von Peptiden, wie sie oben unter a)
definiert sind.
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Vorteilhaft werden zur Verabreichung
in vivo Peptide eingesetzt, die so modifiziert sind, daß ihre Lebensdauer
im Organismus verlängert
wird, insbesondere indem ihre Resistenz gegen Proteasen verbessert wird;
es kann sich beispielsweise um Pseudopeptide vom retro-Typ handeln,
in denen L-Aminosäuren
in einer Reihenfolge invers zu der des nachzumachenden Peptids miteinander
verknüpft
sind, oder auch um Pseudopeptide vom retro-inverso-Typ, die aus
D-Aminosäuren
(anstelle der L-Aminosäuren
der natürlichen
Peptide) bestehen, die in einer Reihenfolge invers zu der des nachzumachenden
Peptids miteinander verknüpft
sind, oder auch um Pseudopeptide, die eine CH2-NH-Bindung
anstelle einer CO-NH-Peptidbindung enthalten. Diese Pseudopeptide
erlauben es, die dreidimensionale Struktur natürlicher Peptide und demzufolge
ihre immunologische Reaktivität
zu imitieren. Pseudopeptide dieser verschiedenen Typen sind beispielsweise
bei BENKIRANE et al. [J. Biol. Chem., 270, S. 11921–11926,
(1995); J. Biol. Chem., 271, S. 33218–33224, (1996)]; BRIAND et
al. [J. Biol. Chem., 270, S. 20686–20691, (1995); GUICHARD et
al. [J. Biol. Chem., 270, S. 26057–26059, (1995)] beschrieben.
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- – "Molekül mit derselben
Erkennungsspezifität
wie die Anti-Filaggrin-Autoantikörper": jedes
Molekül
(Antikörper
oder zellulärer
Rezeptor), das die Eigenschaft besitzt, spezifisch, in vivo oder
in vitro, an die von den Anti-Filaggrin-Autoantikörpern erkannten
Epitope zu binden.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung verwendet man wenigstens ein Citrullin-haltiges
Peptid, das ganz oder teilweise wenigstens eine Sequenz umfaßt, die
sich von einer der folgenden Regionen einer humanen Filaggrin-Einheit
ableitet:
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- – der
Region, die dem C-terminalen Teil (Aminosäuren 144 bis 324) und insbesondere
den Aminosäuren
144 bis 314 einer humanen Filaggrin-Einheit entspricht, oder
- – der
Region, die den Aminosäuren
76 bis 144 einer humanen Filaggrin-Einheit entspricht, oder
- – der
Region, die den Aminosäuren
71 bis 119 einer humanen Filaggrin-Einheit entspricht.
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Diese Regionen wurden bereits früher als
Regionen identifiziert, die nach Citrullinierung gegenüber Anti-Filaggrin-Autoantikörpern stark
immunreaktiv sind (siehe Patentanmeldung FR 96 10651 und Patentanmeldung
PCT/FR97/01541, wie oben erwähnt).
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Gemäß einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung verwendet man wenigstens ein Citrullinhaltiges
Peptid, das umfaßt:
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- a) wenigstens eine Citrullin-haltige Sequenz, die das Motiv
Ser-Cit-His umfaßt,
abgeleitet von einer der im nachfolgenden Sequenzprotokoll unter
den Nummern SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 dargestellten
Sequenzen, oder
- b) wenigstens ein Fragment, das das Motiv Ser-Cit-His umfaßt und das
wenigstens 3, vorzugsweise wenigstens 5 und vorteilhaft wenigstens
10 aufeinanderfolgende Aminosäuren
dieser Sequenz umfaßt.
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Peptide, die erfindungsgemäß verwendet
werden können,
um eine Immunreaktion gegenüber
Citrullin-haltigen Epitopen, die von den Anti-Filaggrin-Autoantikörpern erkannt
werden, abzuschwächen
oder zu neutralisieren, indem sie die Bindung an ihr Antigen-Target,
humorale oder zelluläre
Effektoren dieser Autoimmunreaktion, reduzieren oder inhibieren,
sind vorteilhaft Peptide, die sich, durch Citrullinierung, von Peptiden ableiten,
die das Pentapeptid-Motiv X1-Ser-Arg-His-X2 umfassen, in dem X1=Ser
oder Gly und X2=Ser oder Pro, und darunter wiederum Peptide, die
das Hexapeptid-Motiv X0-X1-Ser-Arg-His-X2 oder das Heptapeptid-Motiv
X0-X1-Ser-Arg-His-X2-X3 umfassen, in denen X1 und X2 wie oben definiert
sind, X0=Asp und X3=Gly oder Arg.
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Zur Durchführung der vorliegenden Erfindung
verwendet man ein Peptid, das wenigstens 5 Aminosäuren, vorzugsweise
wenigstens 10 Aminosäuren
und vorteilhaft wenigstens 14 Aminosäuren umfaßt. Vorteilhaft kann man auch
Peptide verwenden, die mehrere wie oben definierte Citrullin-haltige
Sequenzen umfassen, die gleich oder voneinander verschieden sein
können.
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Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner
pharmazeutische Zusammensetzungen, insbesondere zur Behandlung von
rheumatoider Polyarthritis, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie als
Wirkstoff wenigstens ein wie oben definiertes antigenes Peptid enthalten.
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Erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen
können
auf jede an sich bekannte geeignete Weise verabreicht werden. Sie
können
beispielsweise systemisch, auf oralem oder parenteralem Weg, als
subkutane, intravenöse
oder intramuskuläre
Injektion verabreicht werden. Sie können auch lokal verabreicht
werden, beispielsweise durch intraartikuläre Injektionen oder durch Mikroinjektionen
unter Arthroskopie in das inflammatorische Synovialgewebe.
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Die vorliegende Erfindung läßt sich
mit Hilfe der folgenden ergänzenden
Beschreibung besser verstehen, die sich auf Beispiele bezieht, die
die Akkumulation von Anti-Filaggrin-Autoantikörpern der Klasse G in rheumatoiden
Geweben und die Synthese dieser Autoantikörper durch die Plasmozyten
in diesen Geweben demonstrieren.
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BEISPIEL 1: VERGLEICH DER
ANTI-FILAGGRIN-ANTIKÖRPER
(AAF)-KONZENTRATIONEN
IM SERUM UND IN DER SYNOVIALFLÜSSIGKEIT
VON PATIENTEN MIT RHEUMATOIDER POLYARTHRITIS.
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Probenpaare von Serum und Synovialflüssigkeit
wurden von 31 erwachsenen Patienten mit rheumatoider Polyarthritis
erhalten, die nach den klinischen, radiographischen und biologischen
Kriterien der AMERICAN RHEUMATISM ASSOCIATION (ARA) (ARNETT AR 31
315–324
1988) diagnostiziert war. Die Proben der Synovialflüssigkeiten
wurden aus den entzündeten
Gelenken entnommen und dann zentrifugiert und bei –80°C bis zur
Analyse aufbewahrt.
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Die Konzentrationen an gesamtem IgG
und an AAF in den Seren und den Synovialflüssigkeiten wurden gemäß den folgenden
Vorschriften mittels Sandwich-ELISA bestimmt:
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Messung von
gesamtem IgG
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Die Vertiefungen von Mikrotiterplatten
(NUNC IMMONOPLATE MAXISORP) wurden eine Nacht lang bei 4°C mit 100 μl Ziege-Anti-Human-IgG-Antikörper, gereinigt über Affinitätschromatographie
(BIOSYS), in einer Konzentration von 5 μg/ml in PBS inkubiert.
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Die mit Ziegenantikörpern beschichteten
Vertiefungen wurden direkt mit 100 μl einer Verdünnungsreihe von Serum (Verdünnung von
1/400 bis 1/1600) oder von Synovialflüssigkeit (Verdünnung von
1/100 bis 1/10000) und anschließend
mit 100 μl
von mit Peroxydase markiertem Ziege-Anti-Human-IgG-Antikörper inkubiert
und auf 1/5000 verdünnt.
Zur Quantifizierung der Messungen wurde als Eichskala auf jeder
ELISA-Platte eine Verdünnungsskala
(von 500 bis zu 7,8 ng/ml) mit gereinigten humanen IgGs (JACKSON
IMMUNORESEARCH LABORATORIES, West Grove, PE) verwendet.
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Alle Inkubationen erfolgten eine
Stunde lang bei 37°C
und es folgten 3 Waschschritte. Der Puffer zum verdünnen und
Waschen ist PBS, enthaltend 0,5% (W/V) Fischgelatine und 0,05 (V/V)
Tween-20. Die Peroxydase-Aktivität
wurde mit einer chromogenen Lösung
aus O-Phenylendiamin (2 mg/ml, SIGMA)-H2O2 (0,03%, SIGMA) festgestellt.
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Die Reaktion wird durch Zugabe von
4 M H2SO4 gestoppt,
und die optische Dichte bei 492 nm wird mit einem MULTISCAN RC-Plattenlesegerät (LABSYSTEM,
Helsinki, Finnland) bestimmt.
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Bestimmung von Anti-Filaggrin-Autoantikörpern
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ELISA-Test auf neutral/saures
humanes Filaggrin.
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Die Vertiefungen von Mikrotiterplatten
(NUNC IMMUNOPLATE MAXISORP, LIFE TECHNOLOGIES, Paisley, UK) wurden
mit neutral/saurem humanen Filaggrin durch eine Nacht Inkubation
bei 4°C
mit 100 μl
einer Lösung
von neutral/saurem humanen Filaggrin à 2,5 mg/ml in PBS beschichtet.
Diese Vertiefungen wurden anschließend 30 Minuten lang bei 37°C mit 200 μl einer Lösung behandelt,
die 2,5% (W/V) Fischgelatine (SIGMA), 0,05% (V/V) Tween-20 (PIERCE)
in PBS enthielt. Jede der mit Filaggrin beschichteten Vertiefungen
wurde mit 100 μl
einer Serumverdünnung
(1/400 bis 1/1600) oder einer Verdünnung von Synovialflüssigkeit
(1/100 bis 1/1600) und dann mit 100 μl Ziege-Anti-Human-IgG-Antikörper, der
mit Peroxydase (SOUTHERN BIOTECHN INC., Birmingham, AL) markiert
und auf 1/2000 verdünnt
war, inkubiert.
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Die Inkubationszeiten, die eingesetzten
Puffer und das Detektionssystem sind mit den oben im Fall des ELISA
auf Gesamt-IgG angegebenen identisch.
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Um die Anti-Filaggrin-Antikörper zu
quantifizieren, wurde ein Pool verwendet, der 13 PR-Seren mit erhöhten Titern
für Anti-Filaggrin-Antikörper vereinigte,
die zuvor durch Immunfluoreszenz und Immuntransfer bestimmt worden
waren. Dieser Pool wurde bezüglich
gereinigter Anti-Filaggrin-Antikörpern kalibriert.
Die Immunreaktivität
des Pools war äquivalent
zu einer Anti-Filaggrin-Antikörper-Konzentration
von 1600 μg/ml.
Eine serielle Verdünnungsreihe
(1/100 bis 1/12800) dieses Pools, entsprechend Konzentrationen von
0,125 bis 16 μg
Anti-Filaggrin-Antikörper
pro ml, wurde auf jeder ELISA-Platte als Eichskala für die auf
derselben Platte analysierten Proben verwendet. Die Eichkurve wurde
mittels Log/Logit linearisiert und zur Umrechnung der optischen
Dichten der Proben in Anti-Filaggrin-Antikörper-Konzentrationen
verwendet. Eine unter eine Konzentration von 0,125 μg/ml verdünnte Probe
(niedrigster Punkt der Eichkurve) wurde als Null angesehen, und
für eine
Konzentration oberhalb von 4 μg/ml
wurde der Analyt erneut bei einer höheren Verdünnung getestet. Ein PR-Kontrollserum
wurde ebenfalls auf jede ELISA-Platte gegeben, um die Inter-Assay-Variabilität abzuschätzen. Alle
Messungen erfolgten wenigstens zweifach.
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Ergebnisse
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Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt (1A: IgG; 1B:
AAF), die zeigt, daß die
Konzentration an Gesamt-IgG im Serum bei allen Patienten höher ist
(14,2 ± 0,7
mg/ml) als in der Synovialflüssigkeit
(8,9 ± 0,8
mg/ml). Der Wert für
das Verhältnis
der Gesamt-IgG-Konzentration im Serum im Verhältnis zur Synovialflüssigkeit
für einen
gegebenen Patienten variiert zwischen 1 und 3.
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Um einen akzeptablen Vergleich zu
erhalten, wurde die Konzentration an Anti-Filaggrin-Antikörpern in der Synovialflüssigkeit
eines jeden Patienten ausgewertet, indem das Verhältnis der
Gesamtkonzentration an IgG in der Synovialflüssigkeit zur Gesamtkonzentration
an IgG im Serum desselben Patienten berücksichtigt wurde. Die Ergebnisse
der Serum/Synovialflüssigkeit-Paare
wurden verglichen und als verschieden angesehen, wenn die Immunreaktivität der Anti-Filaggrin-Antikörper in
der Synovialflüssigkeit
2mal höher
oder 2mal niedriger als im Serum war.
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Unter diesen Bedingungen waren die
Konzentrationen von Anti-Filaggrin-Antikörpern im Serum und in der Synovialflüssigkeit
von allen außer
von 3 Patienten ähnlich
oder lagen sehr nahe beieinander. Für diese 3 Patienten waren die
Konzentrationen an Anti-Filaggrin-Antikörpern in der Synovialflüssigkeit
signifikant (4- bis 16mal) niedriger als im Serum. Dennoch sind
die Anti-Filaggrin-Antikörper-Konzentrationen im
Serum und in der Synovialflüssigkeit
im Ergebnisdurchschnitt nicht signifikant verschieden. Dies zeigt,
daß der
Anteil an IgGs, die für
das Filaggrin spezifisch sind, in der Synovialflüssigkeit nicht bedeutender
ist als im Serum.
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BEISPIEL 2: VERGLEICH DER
ANTI-FILAGGRIN-ANTIKÖRPER-KONEZNTRATIONEN IM
SERUM UND IM SYNOVIALGEWEBE VON PATIENTEN MIT RHEUMATOIDER POLYARTHRITIS
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Verletztes Synovialgewebe wurde während chirurgischer
Eingriffe bei 4 Patienten mit rheumatoider Polyarthritis als Probe
entnommen und von der Kapsel und dem Gelenkknorpel abgetrennt. Ein
Extrakt dieses Gewebes wurde wie folgt hergestellt:
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Fragmente von Synovialgewebe wurden
20 bis 30 Sekunden lang bei 0°C
mit einem ULTRA-TURRAX-Homogenisator (JANKE & KUNKEL, Staufen, Deutschland) bei
höchster
Geschwindigkeit in 3 ml des folgenden Puffers pro g Gewebe homogenisiert
(5 Homogenisierungsdurchgänge):
40 mM Tris-HCl, pH 7,4, enthaltend 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,02
Natriumnitrat, 2 μg/ml
Aprotinin (SIGMA) und 1 mM PMSF.
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Nach jeder Extraktion wurden die
Homogenate bei 4°C
20 Minuten lang bei 15.000 g zentrifugiert, und die Überstände wurden
entnommen und dann bei –80°C bis zur
Analyse aufbewahrt. Die Proteinkonzentrationen wurden mit Hilfe
des Coomassie Plus-Tests
(PIERCE CHEMICALS, Rockford, IL) bestimmt.
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Die Konzentrationen an Gesamt-IgG
und an Anti-Filaggrin-Antikörpern des
für jeden
der 4 Patienten erhaltenen Synovialgewebe-Extrakts wurden wie oben
in Beispiel 1 beschrieben mittels ELISA bestimmt. Der Synovialgewebe-Extrakt
wurde zur Bestimmung der gesamten IgGs in einer Verdünnung von
1/400 bis 1/32000 und zur Bestimmung der Anti-Filaggrin-Antikörper in
einer Verdünnung
von 1/2 bis 1/20 verwendet.
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Diese Konzentrationen an Gesamt-IgG
und an Anti-Filaggrin-Antikörpern wurden
mit denen verglichen, die in den Seren der gleichen Patienten bestimmt
wurden.
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Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden
Tabelle I dargestellt.
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Diese Ergebnisse zeigen, daß die mittlere
Gesamt-IgG-Konzentration
in den Seren 10,4 ± 1,9
mg/ml beträgt,
was einem normalen physiologischen Wert für die IgG-Serumkonzentration
entspricht, mit Ausnahme eines einzigen Patienten (Patient 3), der
eine niedrige Gesamt-IgG-Serumkonzentration aufwies (5,6 mg/ml). Die
mittlere Anti-Filaggrin-Antikörper-Konzentration beträgt 51,8 ± 12,9 μg/ml. Die
Anti-Filaggrin-Antikörper entsprechen
also im Durchschnitt 0,52 ± 0,1%
des Gesamt-IgG, wobei der Patient 3 wenig von diesem Durchschnitt
abweicht.
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In den Synovialextrakten werden die
Antikörperkonzentrationen
in mg Gesamt-IgG oder in μg
Anti-Filaggrin-Antikörper pro
Gramm Synovialgewebe ausgedrückt.
Die mittlere synoviale Gesamt-IgG-Konzentration ist 5mal niedriger
als die, die in den Seren gemessen wurde (2,4 ± 0,8 mg/g). Dagegen ist die
mittlere Anti-Filaggrin-Antikörper-Konzentration im
Synovialgewebe zweimal höher
als die, die in den Seren gemessen wurde: 101,4 ± 52,2 μg/g. Folglich beträgt das durchschnittliche
Verhältnis
von AAF/IgG im Synovialgewebe 3,56 ± 0,67% gegenüber 0,52 ± 0,10
im Serum.
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Es ist also möglich, den relativen durchschnittlichen
Anteil an Anti-Filaggrin-Antikörpern
im Synovialgewebe zu berechnen, der gleich dem Verhältnis der
2 Verhältnisse
von AAF/IgG in den Synovialextrakten bzw. im Serum ist. Dieser relative
durchschnittliche Anteil an AAF beträgt 7,5 ± 1,7%. Anders ausgedrückt ist die
durchschnittliche Menge an Anti-Filaggrin-Antikörpern im
Synovialgewebe für
die 4 Patienten 7 1/2 mal größer als
die Menge, die im Serum gemessen wurde.
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BEISPIEL 3: HISTOLOGISCHER
NACHWEIS VON PLASMOZYTEN IM SYNOVIALGEWEBE
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Es wurden 5 mm3-Proben
von Synovialgewebe hergestellt und 24 Stunden lang bei Umgebungstemperatur
in einer 10% Formol-Salzlösung fixiert.
Diese Fragmente wurden anschließend
in Alkohol entwässert und
in Paraffin eingelegt. Es wurden Schnitte von 4 Mikron Dicke hergestellt
und in Hämatoxylin/Eosin
gefärbt. Diese
gefärbten
Schnitte wurden unter dem Mikroskop untersucht.
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Diese Untersuchung machte eine Hyperplasie
der Umgrenzungsschicht der Synovia und eine bedeutsame Infiltration
mit mononukleären,
in nodulären
Aggregaten um germinale Zentren angeordneten Zellen (lymphoide Follikel)
deutlich. Die Plasmozyten wurden durch ihren exzentrischen Kern
identifiziert, der ein Chromatincluster enthielt und von abundantem
Zytoplasma umgeben war. Der größte Teil
der Zellen war in unmittelbarer Nähe der Blutgefäße lokalisiert
sowie mit Synovialzellen der Umgrenzung vermischt und kapselte die
lymphoiden Follikel ein. Die Plasmozyten scheinen der in den mononukleären Infiltraten
der Synovialzotten vorherrschende Zelltyp zu sein, und sie machen
in den meisten untersuchten Proben einen signifikanten Teil der
mononukleären
Zellpopulation aus. Die Zahl der mononukleärer Zellen pro untersuchtem
Feld variiert zwischen 580 und 560 und die der Plasmozyten zwischen
68 und 280; diese letzteren machen also etwa 10 bis 50% der Gesamtpopulation
der mononukleären
Zellen aus.
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Immunfluoreszenzuntersuchung
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Proben von Synovialgewebe wurden
auch zur Immunfluoreszenzuntersuchung präpariert. Gewebefragmente, eingefroren
in Isopentan, das zuvor mit flüssigem
Stickstoff gekühlt
war, wurden bis zur Untersuchung bei –80°C aufbewahrt. Die eingefrorenen
Fragmente wurden in TISSUE-TEK-Medium (REICHERT-JUNG, Heidelberg,
Deutschland) eingebracht und in einem Kryostaten wurden Schnitte
mit 4 Mikron Dicke hergestellt und auf Glasobjektträger aufgebracht.
Die Schnitte wurden 10 Minuten lang an der Luft getrocknet und bis
zur immunhistochemischen Analyse bei –80°C aufbewahrt.
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Zur Immunfluoreszenz wurden die Schnitte
zunächst
15 Minuten in PBS hydratisiert, dann 30 Minuten bei 37°C in einer
Feuchtekammer mit einer 1/50-Verdünnung von Ziege-Fab-Fragmenten in PBS
inkubiert, die gegen die schwere γ-Kette
der humanen IgGs gerichtet waren und mit Fluorescein markiert waren.
Nach Spülen
in PBS, das 0,05% TWEEN-20 enthielt, und anschließendem Spülen in PBS
allein werden die Objektträger mit
FLUOPREP-Milieu (BIOMERIEUX, Lyon, Frankreich) montiert. Die mikroskopische
Untersuchung mit Ultraviolett-Auflicht zeigt eine intensive Fluoreszenz
des Synovialgewebeverbands, die die Anwesenheit der interstitiellen
IgGs widerspiegelt, die dieses infiltrieren.
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BEISPIEL 4: IN VITRO-SYNTHESE
UND -SEKRETION VON ANTI-FILAGGRIN-ANTIKÖRPERN DURCH DIE
SYNOVIALEN PLASMOZYTEN
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Um festzustellen, ob von den synovialen
Plasmozyten Anti-Filaggrin-Antikörper produziert
worden waren, wurden Synovialgewebekulturen von Patienten mit rheumatoider
Polyarthritis wie folgt durchgeführt:
Das frische Synovialgewebe wurde in kleine Fragmente mit etwa 1
bis 2 mm Durchmesser geteilt, die unverzüglich auf Kulturplatten mit
24 Vertiefungen transferiert (ein Fragment pro Vertiefung) und mit
2 ml RPMI 1640-GLUTAMAX aufgefüllt
wurden, das mit 10% fötalem
Kälberserum
und 50 μg/ml
Gentamycin (LIFE TECHNOLOGIES) supplementiert war.
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Die Kulturplatten wurden bei 37°C unter einer
Atmosphäre
von 5% CO2 und 95% Feuchtigkeit inkubiert.
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Um die in vitro-Produktion der gesamten
IgGs und der Anti-Filaggrin-Antikörper zu
bestimmen, wurde das Synovialgewebe 34 Tge lang in Kultur gehalten.
Das gesamte Kulturmedium wurde am 1. Tag, am 6. Tag, am 13. Tag,
am 20. Tag und am 27. Tag der Kultivierung ausgetauscht. Die entsprechenden
Kulturüberstände wurden
bis zur Analyse bei –30°C aufbewahrt.
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Die Gesamt-IgG- und die Anti-Filaggrin-Antikörper-Konzentration in
diesen Kulturüberständen wurde wie
oben in Beispiel 1 beschrieben mittels ELISA bestimmt. Die Kulturüberstände wurden
zur Bestimmung des Gesamt-IgG in einer Verdünnung von 1/100 und zur Bestimmung
der Anti-Filaggrin-Antikörper in
einer Verdünnung
von 1/10 eingesetzt.
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Um die Wiederabgabe von Immunglobulinen
zu bestimmen, die das Synovialgewebe infiltrieren, wurden Schnitte,
die nach 24 Stunden Kultur hergestellt worden waren, wie oben in
Beispiel 4 beschrieben präpariert
und mittels Immunfluoreszenz untersucht. Die Fluoreszenz des Synovialgewebeverbands
war verschwunden, was eine Wiederabgabe der Immunglobuline, die
ihn infiltrierten, erkennen läßt; dafür beobachtet
man Zellen mit plasmozytärer
Morphologie, die in Clustern gruppiert sind und eine intrazytoplasmatische
Fluoreszenz zeigen, die von ihrer plasmozytären Natur zeugt, und Produktion
von Immunglobulinen durch diesen Zellen.
-
Insofern zeigen diese Immunfluoreszenzuntersuchungen,
daß die
während
des 1. Tags der Kultivierung abgegebenen IgGs zum größten Teil
den das Gewebe infiltrierenden Antikörpern entsprechen, wobei die Konzentration
an Anti-Filaggrin-Antikörpern und
an IgG, die in den Kulturüberständen von
Tag 0 und von Tag 1 gemessen wurden, zur Berechnung der kumulierten
Konzentrationen, die während
der gesamten Daauer der Kultivierung produziert wurden, nicht berücksichtigt
wurden.
-
Die Konzentrationen von Anti-Filaggrin-Antikörpern oder
von IgG, die für
den Patienten Nr. 3 bestimmt wurden, sind in 2 dargestellt.
-
2a stellt
die Konzentrationen von Anti-Filaggrin-Antikörpern (?) und von IgG (?) dar,
die in den Kulturüberständen an
Tag 0 und an Tag 1 gemessen wurden. Die Anti-Filaggrin-Antikörper entsprechen
2,8% des gesamten IgG im Kulturüberstand
der Tage 0 und 1, was den Ergebnissen entspricht, die mit den Synovialgewebe-Extrakten
desselben Patienten erhalten wurden.
-
2b stellt
die Konzentrationen an Anti-Filaggrin-Antikörpern (untere Kurve) und an
IgG (obere Kurve) dar, die während
der Dauer der Kultivierung produziert wurden.
-
Man stellt fest, daß die Produktion
der IgG und der AAF am 6. Tag niedrig ist, dann ansteigt und am 27.
Tag einen Peak erreicht. Dieses Produktionsprofil läßt sich
nur mit einer "de novo"-Synthese von IgG erklären, die sich ab dem 27. Tag
abschwächt.
-
Bei Kulturende machen die Anti-Filaggrin-Antikörper 34%
des gesamten IgG aus.
-
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Anti-Filaggrin-Antikörper einen
sehr hohen Anteil des von dem rheumatoiden Pannus sekretierten Gesamt-IgG
ausmachen.
-
BEISPIEL 5: INHIBITORISCHE
EIGENSCHAFTEN VON PEPTIDEN, DIE DAS MOTIV SER-CIT-HIS ENTHALTEN,
AUF DIE REAKTION VON SEREN VON PATIENTEN MIT PR GEGENÜBER CITRULLIN-HALTIGEN
FILAGGRINEN
-
Zwei Antigenpräparate, nämlich: rekombinantes, durch
Desiminierung citrulliniertes Filaggrin (erhalten nach der in der
Patentanmeldung PCT/FR97/01541 beschriebenen Vorschrift) oder ein
teilweise gereinigtes Präparat
von sauer/neutralem humanem Filaggrin (erhalten nach der bei SIMON
et al., J. Clin. Invest., 92, 1387, 1993 beschriebenen Vorschrift)
wurden auf ein Elektrophoresegel (PHAST®-SDS-Gel,
PHARMACIA) aufgetragen (0,2 μg
pro Auftrag); nach Elektrophorese mit einer PHAST-SYSTEM®-Apparatur
(PHARMACIA) unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen wurden
die Proteine auf Nitrocellulose transferiert. Die Nitrocellulosemembranen
wurden mit einem Serum (verdünnt
auf 1/4000) eines Patienten mit PR und in Gegenwart von 40 μl/ml eines
jeden der Peptide E12Hcit und E12Dcit (bzw. Derivaten der Peptide
SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 durch Ersatz des zentralen Arginins
des Motivs Ser-Arg-His durch ein Citrullin) oder einer Mischung
dieser Peptide inkubiert (1 Nacht, 4°C). Für jedes Antigen wurden 2 Seren
mit einem erhöhten
Anti-Filaggrin-Antikörper-Titer
getestet, die von zwei verschiedenen Patienten stammten.
-
Als Kontrolle wurden ferner Inkubationen
durchgeführt:
-
- – in
Gegenwart eines Citrullin-haltigen Peptids (T12Ecit), das sich von
Peptid SEQ ID NO: 4 ableitet, das das Motiv Ser-Arg-His nicht enthält;
- - in Abwesenheit jeglicher Peptide.
-
Für
jeden Assay wurde das Reaktionsprodukt aus den Anti-Filaggrin-Antikörpern des
Serums des Patienten und dem auf die Nitrocellulose aufgebrachten
Antigen mittels Ziege-Anti-Human-IgG-Antikörpern, die mit
Peroxidase markiert waren, nachgewiesen.
-
Die Ergebnisse sind wie folgt:
-
- – Für jedes
der zwei getesteten PR-Seren beobachtet man eine starke Markierung,
wenn die Inkubation in Abwesenheit von Peptid oder in Gegenwart
des Peptids T12Ecit erfolgte. Wenn die Inkubation in Gegenwart des Peptids
E12Hcit oder E12Dcit erfolgte, beobachtet man im Fall des einen
getesteten Serums nur eine schwache Markierung und im Fall des anderen
Serums keine Markierung.
-
Wenn die Inkubation überdies
in Gegenwart einer Mischung aus den Peptiden E12Dcit und E12Hcit erfolgte,
beobachtet man unabhängig
vom jeweils betroffenen PR-Serum keine Markierung.
-
Die gefundenen Ergebnisse sind für die zwei
getesteten Antigene (rekombinantes desiminiertes Filaggrin oder
sauer/neutrales Filaggrinpräparat)
identisch.
-
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Peptide
E12Dcit und E12Hcit, die das Motiv Ser-Cit-His umfassen, in der
Lage sind, die Reaktion der "Anti-Filaggrin"-Antikörper, die
im Serum von Patienten mit PR vorliegen, mit den von diesen Antikörpern erkannten
Epitopen kompetitiv zu inhibieren.
-
SEQUENZPROTOKOLL
-
<110> UNIVERSITE PAUL SABATIER/TOULOUSE
III
SERRE, Guy
GIBRAL-NEUHAUSER, Elisabeth
VINCENT,
Christian
SIMON, Michel
SEBBAG, Mireille
DALBON,
Pascal
JOLIVET-REYNAUD, Colette
ARNAUD, Michel
JOLIVET,
Michel
-
<120> VERWENDUNG CITRULLIN-HALTIGER
PEPTIDE, DIE SICH VON FILAGGRIN ABLEITEN, IM RAHMEN DER BEHANDLUNG
VON AUTOIMMUN-ERKRANKUNGEN
-
<130> MJPcb1249/1
<140>
<141>
-
<150> FR9716672
-
<151> 1997-12-30
<160> 4
-
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 49
<212>
-
<213> Homo sapiens
<400> 1
<210> 2
<211> 14
<212>
-
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 14
<212>
-
<213> Homo sapiens
<400> 3
<210> 4
<211> 14
<212>
-
<213> Homo sapiens
<400> 4
