DE69804974T2

DE69804974T2 - Opioid-konjugate mit endogenen trägerproteinen

Info

Publication number: DE69804974T2
Application number: DE69804974T
Authority: DE
Inventors: P. Bridon; M. Ezrin; L. Holmes; Peter Milner
Original assignee: ConjuChem Inc
Current assignee: Conjuchem Biotechnologies Inc Montreal Quebec
Priority date: 1997-11-07
Filing date: 1998-11-06
Publication date: 2002-11-07
Anticipated expiration: 2018-11-07
Also published as: JP2001522863A; ATE235513T1; ATE216402T1; WO1999024074A2; CA2301799C; ES2173641T3; AU750387B2; AU1385699A; JP2001522817A; AU1312799A; WO1999024462A2; WO1999024076A2; DE69812727D1; WO1999024074A3; DE69804974D1; EP1028971A2; IL135835A0; EP1007561A2; EP1007561B1; CA2309205A1

Description

BEREICH DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Konjugate von Opiolden und endogenen Trägern, insbesondere Opioide und verschiedene Blutkomponenten, insbesondere Blutproteine.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Opioide umfassen eine große Klasse von Drogen bzw. Medikamenten, welche klinisch zur Linderung von Schmerz verwendet werden, und welche sowohl von Pflanzen abgeleitete wie auch synthetische Alkaloide und Peptide umfassen, welche angeborenerweise in Hirnen von Säugetieren vorgefunden werden. Die letzteren umfassen drei verschiedene Familien: β-Endorphin und andere von Proopiomelanocortin abgeleitete Peptide, die Enkephaline und die Dynorphine. Opioide wechselwirken mit neutralen Zellen und modifizieren bzw. verändern physiologische Funktionen, wie die Schmerzempfindung. Eine der physiologischen Wirkungen, welche dieser Klasse von Verbindungen zugemessen werden, ist die Analgesie.
Während Opioidmedikamente klinisch zur Linderung von Schmerz verwendet werden, ist ihre Nützlichkeit durch die Toleranz und Abhängigkeit beschränkt, welche sich normalerweise bei einer chronischen Behandlung entwickelt. Opioiddrogen, wie Morphin, können süchtig machen und können zentral übertragene Nebenwirkungen besitzen, wie Atmungs- und Kardialdepressionen und Schläfrigkeit bzw. Somnolenz. Es wird erwünscht, Therapeutika zu entwickeln, welche die schmerzlindernden Eigenschaften der Opioide ohne oder mit geringeren zentral bewirkten Nebenwirkungen. Es wäre auch wünschenswert, Therapeutika entwickeln zu können, welche die positiven Eigenschaften von Opioiden für längere Zeiträume wie üblicherweise derzeit der Fall ist, aufrechtzuerhalten.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft neue chemisch reaktive Derivate von Opioiden, welche mit verfügbaren reaktiven Funktionalitäten an Blutkomponenten reagieren können, um kovalente Bindungen zu bilden, und in welchen die resultierenden, kovalent gebundenen Konjugate eine Anti-Schmerzempfindungswirkung besitzen.
Verglichen mit den Eltern-Medikamenten besitzen die konjugierten Moleküle eine verlängerte Lebenszeit im Blutstrom und sind daher dazu in der Lage, die Aktivität für verlängerte Zeiträume aufrechtzuerhalten, verglichen mit dem nicht-konjugierten Eltern-Arzneimitteln und dazu eine solche Aktivität mit minimalen oder keinen zentral bewirkten Nebeneffekten zu versehen.
Die Erfindung umfasst auch die Konjugate dieser Arzneimittel mit Blutkomponenten und Verfahren zum zur Verfügung stellen einer Aktivität für einen Patienten, umfassend die Verabreichung der neuen Anti-Schmerzempfindungsmittelderivate oder der neuen Konjugate an den Blutstrom eines Säugetierwirts.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung der Derivate der vorliegenden Erfindung sowie die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Schmerz sowie zur Modifizierung bzw. Änderung der Immunantwort bei Patienten.

KURZE BESCHREIBUNG DER SEQUENZ-AUFLISTUNG

SEQ ID NR. 1: ist Dynorphin A (1-17).
SEQ ID NR. 2: ist ein Dynorphin-Analog, Dyn A (1-13).
SEQ ID NR. 3: ist ein Dynorphin-Analog, Dyn A (2-13).
SEQ ID NR. 4: ist ein Derivat von Dyn A (1-13).
WO 91 08220 A (G. HOUEN & A. HOLM), 13. Juni 1991: Diese Anmeldung offenbart die Erzeugung von Peptid-Protein-Konjugaten für eine Anzahl von Verwendungen, einschließlich diagnostischen Mitteln, wie Vaccinen, zur Immunisierung und zur Erzeugung von Antikörpern. Die erwähnten Peptide umfassen Endorphin und Dynorphin und eine Liste von Proteinen ist auf den Seiten 13 bis 14 angegeben, welche Blutproteine, wie Albumine, Hämocycanine und Hämoglobuline umfasst. Linker zwischen dem Peptid und dem Protein, welche in der Anmeldung beschrieben sind, umfassen bifunktionale Verbindungen, wie Hydroxymethylcarbonsäuren.
CHEMICAL ABSTRACTS, Bd. 106, Nr. 17, 27. April 1987, Columbus, Ohio, US; Abstract Nr. 136622, G. E. ISOM: "Production and characterization of anti-morphine antiidiotypic antibodies" XP002106421 & METODOL. SURV. BIOCHEM. ANAL., Bd. 15, 1985, Seiten 109-114. Dieses Dokument offenbart 3-O-Carboxymethylmorphin-Rinderserumalbumin und Antikörper, welche gegen dieses Konjugat erzeugt sind.
CHEMICAL ABSTRACTS, Bd. 119, Nr. 19, 8. November 1993, Columbus, Ohio, US; Abstract Nr. 195892, J. A. D. ANAND & A. OOMMEN: "The rat brain delta opioid receptor studied with antiidiotypic antibodies to anti-leucin enkephalin" XP002106422 & INDIAN J. BIOCHEM. BIOPHYS., Bd. 30, Nr. 2, 1993, Seiten 117- 122. Dieses Dokument offenbart Leucin-Enkephaline, welche an Rinderserum-Albumin konjugiert sind, und Antikörper, welche gegen dieses Konjugat erzeugt sind.
CHEMICAL ABSTRACTS, Bd. 102, Nr. 3, 21. Januar 1985, Columbus, Ohio, US; Abstract Nr. 22715, XP002106423 & JP 59 138958 A (MITSUBISHI CHEMICAL INDUSTRIES CO. LTD.), 9. August 1984. Dieses Dokument offenbart ein Opioidpeptid-Rinderserum-Albumin- Konjugat und ein Antiserum gegen dieses Konjugat.
CHEMICAL ABSTRACTS, Bd. 101, Nr. 15, 8. Oktober 1984, Columbus, Ohio, US; Abstract Nr. 123197, A. C. CUELLO ET AL.: "Characterization and immunocytochemical application of monoclonal antibodies against enkephalins" XP002106424 & J. HISTOCHEM. CYTOCHEM., Bd. 32, Nr. 9, 1984, Seiten 945-957. Dieses Dokument offenbart Leucin- und Methionin-Enkephaline, welche mit Rinderserum-Albumin konjugiert sind, und Antikörper, welche gegen diese Konjugate gerichtet sind.
CHEMICAL ABSTRACTS, Bd, 94, Nr. 21, 25. Mai 1981, Columbus, Ohio, US; Abstract Nr. 171603, W. B. WATKINS ET AL.: "Presence of beta-endorphin-like immunoreactivity in the anterior pituitary gland of rat and man and evidence for the differential localization with ACTH" XP002106425 & CELL TISSUE RES., Bd. 215, Nr. 3, 1981, Seiten 577-589. Dieses Dokument offenbart Endorphin-Rinderserumalbumin-Konjugate und Antiseren, welche gegen diese Konjugate erzeugt sind.
CHEMICAL ABSTRACTS, Bd. 91, Nr. 19, 5. November 1979, Columbus, Ohio, US; Abstract Nr. 153781, J. BORVENDEG ST AL.: "Radioimmunoassay of beta-endorphin: immunoreactive substances in the brain and pituitary" XP002106426 & INT. CONGR. SER. EXCERPTA MEDICA, Bd. 471 (Endorphins '78), 1978, Seiten 177-186. Dieses Dokument offenbart Endorphin-Albumin-Konjugate.
CHEMICAL ABSTRACTS, Bd. 86, Nr. 7, 14. Februar 1977, Columbus, Ohio, US; Abstract No. 39691, BA WEISSMANN ET AL.: "Specific antiserum to Leu-enkephalin and its use in radioimmunoassay" XP002106427 & FEBS LETTERS, Bd. 70, Nr. 1, 1976, Seiten 245- 248, AMSTERDAM NL. Dieses Dokument offenbart Leucin- Enkephaline, welche an Albumin konjugiert sind.
B. L. KIEFFER ET AL.: "32P-Labeled opioid peptides with high affinity for the delta opioid receptor"; ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, Bd. 215, Nr. 1, 1993, Seiten 1-8, XP002106420 NEW YORK, US, das in der Anmeldung zitiert ist. Diese Druckschrift offenbart Enkephalin- und Deltorphin-ähnliche Peptide, welche chemisch an RSA gekoppelt sind, unter Verwendung von m-Maleimidobenzoyl-N- hydroxysuccinimid.
SEQ ID NR. 5: ist ein weiteres Derivat von Dyn A (1-13).
SEQ ID NR. 6: ist ein Derivat von Dyn A (2-13).
SEQ ID NR. 7: ist ein Derivat von Dyn A (2-17).

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Zur Sicherstellung eines vollständigen Verständnisses der vorliegenden Erfindung werden die nachfolgenden Definitionen angegeben:
Opioide: Opioide sind eine große Klasse von Medikamenten bzw. Drogen, welche klinisch als Schmerzkiller verwendet werden und welche sowohl von Pflanzen abgeleitete wie auch synthetische Alkaloide und Peptide, welche endogen in den Säugetierhirnen vorgefunden werden, umfassen. Währenddessen die von Pflanzen abgeleiteten Alkaloide bekannt waren und über Tausende von Jahren verwendet wurden, wurden die endogenen Opioidpeptide erst Mitte der 70er Jahre entdeckt.
Opioide umfassen Endorphine, Enkephaline, Deltorphine, Dynorphine sowie Analoga und Derivate von diesen. Von den Opioiden werden die Dynorphine, und insbesondere Dynorphin A und seine Derivate und Analoga zur Verwendung beider vorliegenden Erfindung bevorzugt.
Dynorphine: Dynorphine sind eine Klasse von endogenen Opioiden, welche in vielfacher Form im Zentralnervensystem existieren. Dynorphine sind von dem Vorläufer Prodynorphin (Proenkephalin B) abgeleitet. Dynorphin, auch bekannt als Dynorphin A1-17, ist ein gut bekanntes Opioid, welches die Sequenz Tyr-Gly-Gly-Phe- Leu&sup5;-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro¹&sup0;-Lys-Leu-Lys-Trp-Asp¹&sup5;-Asn-Gln aufweist. Sequenz ID Nr. 1. Eine Anzahl von Derivaten und Analoga von Dynorphin sind bekannt, einschließlich Dyn A1-13, SEQ ID Nr. 2, Dyn A2-13, SEQ ID Nr. 3, Dyn A1-12, Dyn A2-12 und Dyn A2-17 sowie Amidanaloga, wie jene, welche in der US-PS 4,462,941 von Lee et al. erwähnt sind, N-endständig abgebrochene Dynorphin-Analoga, wie jene, welche in der Internationalen Patentanmeldung WO 96/06626 von Lee et al. beschrieben sind und des-Tyr- oder des-Tyr-Gly-Analoga, wie jene, welche in der Internationalen Patentanmeldung WO 93/25217, ebenfalls von Lee et al., beschrieben sind.
Opioidrezeptoren: Opioidrezeptoren sind Membran-gebundene Rezeptoren, an welche Opioidemoleküle binden. Morphin bindet an u-Opioidrezeptoren. Enkephaline binden an δ-Opioidrezeptoren. Dynorphinpeptide binden an K-Opioidrezeptoren.
Rezeptoragonisten: Rezeptoragonisten sind chemische Substanzen, welche dazu in der Lage sind, einen Rezeptor dazu zu aktivieren, eine vollständige oder teilweise pharmazeutische Antwort zu induzieren.
Rezeptorantagonisten: Rezeptorantagonisten sind chemische Substanzen, welche strukturell mit einer biologisch aktiven Substanz verwandt sind, welche als Inhibitor wirkt.
Reaktive Einheiten: Reaktive Einheiten sind Einheiten, welche zur Ausbildung einer kovalenten Bindung fähig sind. Solche reaktiven Mittel werden an ein therapeutisches oder diagnostisches Mittel von Interesse gekoppelt oder gebunden. Reaktive Einheiten werden im Allgemeinen in einer wässrigen Umgebung stabil sein und gewöhnlicherweise eine Carboxyl-, Phosphoryl- oder geeignete Acylgruppe sein, entweder als ein Ester oder ein gemischtes Arihydrid oder ein Imidat, wobei es zur Ausbildung einer kovalenten Bindung mit einer Gruppe der Targetstelle fähig ist, um ein Derivat zu bilden.
Die reaktiven Funktionalitäten, welche in Gefäßproteinen zur Ausbildung von Kovalentbindungen mit der reaktiven Gruppe befähigt sind, sind hauptsächlich Amino-, Carboxyl-, Hydroxyl- und Thiolgruppen.
Unter Berücksichtigung dieser Definitionen bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Zusammensetzungen, welche Derivate von Antischmerzmitteln, sind, vorzugsweise von Opioiden, bevorzugter von Dynorphinen oder einem Dynorphin-Derivat oder -Analog, welche mit den verfügbaren reaktiven Funktionalitäten an Blutkomponenten über kovalente Bindungen reagieren können. Die Erfindung betrifft auch solche Derivate, solche Kombinationen mit Blutkomponenten und Verfahren für ihre Verwendung. Diese Verfahren umfassen Verfahren, welche die Wirkung der therapeutischen Lebenszeit des fraglichen Arzneimittels im Vergleich zur Verabreichung mit dem Eltern-Arzneimittel per se an einen Patienten und Verfahren zur Schmerzlinderung umfassen.
Das Derivat ist von einer Art, welche als DAC (Drug Affinity Complex) bezeichnet ist, welches das Antischmerzempfindungsmittelmolekül und eine Linkergruppe zusammen mit einer chemisch reaktiven Gruppe, wie hier beschrieben umfasst, welche zur Reaktion mit einer reaktiven Funktionalität einer Blutkomponente, insbesondere eines Blutproteines, fähig ist. Das Blutprotein kann vom Blut abgeleitet sein, aus dem Blut gereinigt oder ein rekombinantes Blutprotein sein. Durch Reaktion mit der Blutkomponente oder einem Protein kann das Derivat oder DAC über das Blut an geeignete Stellen oder Rezeptoren des Patienten abgegeben werden.
Derivate von Opioiden, welche mit Proteinen und anderen Blutkomponenten konjugieren können, werden wie im Stand der Technik für andere therapeutische Arzneimittel bekannt ist, hergestellt, z. B. in der US-PS 5,612,034, unter Verwendung von Linker-Gruppen mit chemisch reaktiven Gruppen, welche an reaktive Funktionalitäten an Proteinen, wie oben beschrieben, kovalent binden. Diese reaktiven Funktionalitäten sind hauptsächlich Amino-, Carboxyl-, Hydroxyl- und Thiolgruppen. Zur Ausbildung von kovalenten Bindungen mit der funktionellen Gruppe am Protein kann man als eine chemisch reaktive Gruppe eine Vielfalt von aktiven Gruppen verwenden. Währenddessen eine Anzahl von verschiedenen reaktiven Gruppen in diesen Linker-Mitteln verwendet werden kann, würde die geeignete N-Hydroxysuccinimidyl (NHS) und -maleimid sein. Die Einführung dieser Gruppen kann beispielsweise unter Verwendung von N-Hydroxysuccinimid (NHS), N- Hydroxysulfosuccinimid (Sulfo-NHS), Maleimidbenzoylsuccinimid (MBS), γ-Maleimidbutyrylsuccinimid (GMBS), Maleimidpropionsäure (MPA) oder eines jeden Mittels, das eine NHS-Ester- oder Maleimidgruppe ermöglicht, verwirklicht werden. Bei den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird die funktionelle Gruppe an diesem Protein eine Thiolgruppe sein und die chemisch reaktive Gruppe wird eine Maleimid enthaltende Gruppe sein.
Weitere Linker-Mittel, welche verwendet werden können, sind in der US-PS 5,612,034 beschrieben.
Die Antischmerzempfindungsmittel, welche gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind jene, welche mit solchen Linker-Gruppen und chemisch reaktiven Gruppen kombiniert werden können, ähnlich zu den Opioiden, um so in der Lage zu sein, kovalente Bindungen mit funktionellen Gruppen an Proteinen auszubilden.
In dem Umfang, als eine zielgerichtete Bindung verwendet wird, wird die Auswahl der langlebigen Blutkomponenten wenigstens teilweise durch die gewünschte Lebenszeit für das Arzneimittel und die Verfügbarkeit der Blutkomponente zur Bindung an das Opioid-Derivat beeinflusst sein. Die verschiedenen Stellen, mit welchen die chemisch reaktive Gruppe der vorliegenden Opioid- Derivate reagieren können, umfassen Zellen, insbesondere rote Blutzellen (Erythrocyten) und Blutplättchen, Proteine, wie Immunoglobuline, umfassend IgG und IgM, Serumalbumin, Ferritin, Steroid bindende Proteine, Transferrin, Thyroxin bindendes Protein, α-2-Macroglobulin und dergleichen. Diese Proteine, mit welchen die derivatisierten Opioide reagieren und welche nicht langlebig sind, werden im Allgemeinen von dem Wirt innerhalb etwa drei Tagen freigesetzt bzw. entfernt werden. Die oben angegebenen Proteine (einschließlich den Proteinen der Zellen) werden wenigstens drei Tage vorliegen und können fünf Tage oder länger (gewöhnlicherweise nicht mehr als 60 Tage, noch gewöhnlicherweise nicht mehr als 30 Tage) insbesondere zur Lebenszeit verbleiben, basierend auf der Konzentration im Blut.
Größtenteils wird eine Reaktion mit mobilen Komponenten im Blut, insbesondere Blutproteinen und Zellen, und ganz insbesondere Blutproteinen und Erythrocyten, stattfinden. Unter "mobil" wird verstanden, dass die Komponente keine festgelegte Stelle über eine verlängerte Zeit aufweist, im Allgemeinen nicht mehr als 5, noch gewöhnlicherweise 1 Minute, obwohl einige der Blutkomponenten relativ stationär für verlängerte Zeiträume vorliegen können. Anfänglich wird eine relativ heterogene Population von funktionalisierten Proteinen und Zellen vorliegen. Jedoch wird größtenteils die Population innerhalb weniger Tage wesentlich von der ursprünglichen Population abweichen, abhängig von der Halbwertszeit der funktionalisierten Proteine im Blutstrom. Daher wird gewöhnlich innerhalb etwa drei Tagen oder mehr das IgG das vorherrschende funktionalisierte Protein im Blutstrom werden.
Gewöhnlicherweise werden 5 Tage nach Verabreichung IgG, Serumalbumin und Erythrocyten wenigstens etwa 60 Mol-%, gewöhnlich wenigstens etwa 75 Mol-% der konjugierten Komponenten im Blut darstellen, wobei IgG, IgM (in wesentlich geringerem Umfang) und Serumalbumin wenigstens 50 Mol-%, gewöhnlich wenigstens etwa 75 Mol-%, noch gewöhnlicher wenigstens 80 Mol-% der nicht- zellulären, konjugierten Komponenten darstellen.
Vorzugsweise ist das Antischmerzempfindungsmittel oder Opioid- Derivat an Albumin konjugiert. Eine solche Konjugierung wird vorzugsweise durch kovalente Bindung eines Maleimid (z. B. hergestellt aus GMBS, MPA oder anderen Maleimidogruppen) an Thiolgruppen am Albumin verwirklicht. Da nur eine einzige Thiolgruppe am Albumin vorliegt, werden Konjugate etwa ein Verhältnis von 1 : 1 von Opioid-Derivaten zu Albumin aufweisen. Das ist gegenläufig zu typischen Konjugierungstechniken, welche in vielfachen Kopien des fraglichen Medikamentes resultieren, das an ein einziges Albuminmolekül gebunden ist.
Gegebenenfalls können die vorliegenden Konjugate auch ex vivo erzeugt werden, indem Blut mit derivatisierten Opioiden oder anderen Mitteln der vorliegenden Erfindung kombiniert werden, unter kovalenter Bindung der derivatisierten Medikamente an reaktive Funktionalitäten an Blutkomponenten und dann Rückführung oder Verabreichung des konjugierten Blutes an den Wirt. Darüber hinaus kann das auch erreicht werden, indem zunächst eine individuelle Blutkomponente oder eine begrenzte Anzahl von Komponenten gereinigt wird, wie rote Blutzellen, Immunoglobuline, Serumalbumin oder dergleichen und indem die Komponente oder die Komponenten ex vivo mit den chemisch reaktiven Derivaten verbunden werden. Das funktionalisierte Blut oder die funktionalisierte Blutkomponente kann dann dem Wirt wieder zugeführt werden, um in vivo die vorliegenden therapeutisch wirksamen Konjugate zu liefern. Das Blut kann auch ex vivo behandelt werden, um eine Koagulierung während der Behandlung zu vermeiden.
Es sind einige Blutkomponenten, wie Hämoglobin, bekannt, welche eine relativ hohe Permeabilität über die Blut-Nerv- und Blut- Hirn-Schranken aufweisen. Ein Ziel einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet die Fähigkeit von Albumin, in den interstitialen Raum einzudringen und Zugriff zu peripheren Neuronen zu besitzen, um modifizierte Opioidmoleküle an Schmerzrezeptoren abzugeben, um eine Schmerzübertragung über die Stimulierung von peripheren Opioidrezeptoren zu beeinflussen. Klinische Daten schlagen vor, dass periphere Opioidrezeptoren ein potentielles Target für relevante antinociceptive Aktivität von Morphin-artigen Medikamenten sein kann und zur Begrenzung von Schmerz ohne das Erfordernis des Eindringens in das Zentralnervensystem wirksam sein kann (Stein et al., 1991). Die hauptsächlichen Grenzen von existierenden Opioid-ähnlichen Medikamenten umfassen zentral beeinflusste bzw. übertragene Nebeneffekte bzw. -wirkungen (Atmungs- und Kardialdepressionen), Abhängigkeitspotential und Abwärtsregulierung oder Verlust der Leistungsfähigkeit. Im Gegensatz dazu würden an Plasmaproteine, wie Albumin, gebundene Medikamente die Aktivität erhalten und keine zentral beeinflussten Nebenwirkungen, wie Kardial- und Atmungssenkung und Abhängigkeit beinhalten. Vorzugsweise werden die Konjugate dieser Erfindung so konstruiert, dass sie selektiv mit Thiolgruppen an Proteinen reagieren und kovalent binden, am bevorzugtesten mit Proteinen, welche die Blut-Hirn- oder Blut-Nerven-Schranken nicht durchqueren. Solche Konjugate können die Antischmerzwirkung des Medikamentes ohne Einfluss auf das Hirn oder auf das Zentralnervensystem liefern. Sollte es jedoch wünschenswert sein, Konjugate zu erzeugen, welche diese Schranken überschreiten können, wird das Antischmerzmittel mit einer gewöhnlicheren reaktiven Gruppe, wie Succinimid, derivatisiert. Solche Derivate können mit verschiedenen Blutproteinen und anderen Komponenten nicht- selektiv reagieren, so dass die möglichen Konjugate jene umfassen, welche die Schranke durchqueren. Daher wird bei einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung, um die zentral beeinflussten Nebenwirkungen zu minimieren, zusätzlich zur Konstruktion der Derivate, um hauptsächlich mit Albuminen zu konjugieren, das Verhältnis von Antischmerzderivaten im Blut kontrollierten, um so die Vorteile dieser vergleichsweise großen Menge Von Albumin (die bevorzugte Blutkomponente zur Ausbildung von Konjugaten) im Blut ausgenützt. Vorzugsweise beträgt die Menge von Antischmerzderivaten, welche dem Blut in vivo oder ex vivo zugegeben wird, von etwa 0,01 umol/kg bis etwa 100 umol/kg, am bevorzugtesten von etwa 1 umol/kg bis etwa 30 umol/kg.
Demzufolge kann das Derivat entweder für eine zufällige (nicht- selektive) oder gezielte (selektive) Bindung mit Blutkomponenten im Allgemeinen oder mit ausgewählten Komponenten (wie Albumin) entworfen bzw. ausgebildet sein. Eine gezielte oder selektive Bindung kann, wie oben beschrieben, durch Einbringen einer reaktiven Gruppe in das Derivat erreicht werden, welche selektiv an eine gewünschte Blutkomponente binden wird. Alternativ dazu kann man eine kombinatorische Bibliothek anlegen und nach Mitgliedern dieser Bibliothek suchen, welche das gewünschte, mit der Blutkomponente verbundene Spektrum liefern.
Ein Konjugat eines Opioids dieser allgemeinen Art wurde von Kieffer et al., Analytical Biochemistry, Bd. 215, S. 1 (1993) aus einem von den Autoren hergestellten Peptid (in der Druckschrift als Peptid B bezeichnet) mit Rinderserumalbumin (BSA) über einen Maleimid-Linker (MBS) hergestellt. Das Peptid B besitzt die Sequenz YdAGFLTPRRASLGC, worin dA für d-Alanin steht. Für das Konjugat wurde bestimmt, dass es ein besseres Bindungspotential für den δ-Opioidrezeptor aufweist als Peptid B selbst. Es wird jedoch keinerlei therapeutische Wirkung dieses Konjugates erwähnt.
Die erwünschten Konjugate von Opioiden oder anderen Antischmerzmedikamenten mit Blutkomponenten können in vivo durch Verabreichung des Opioids oder anderen Derivaten an den Patienten, der ein Mensch oder ein anderes Lebewesen sein kann, hergestellt werden. Die Verabreichung kann in Form eines Bolus erfolgen oder langsam über die Zeit durch Infusion unter Verwendung von kontrolliertem Zustrom oder dergleichen eingeführt werden. Alternativ dazu kann dem Wirt Blut entnommen, ex vivo behandelt und dem Wirt wieder zugeführt werden. Eine weitere Anwendung erfordert eine ex vivo Konjugation des Opioids oder anderen Derivates mit einer kommerziellen Quelle eines Plasmaproteins (zum Beispiel Albumin) mit nachfolgender Infusion an den Wirt.
Bei einer in vivo oder ex vivo Konjugatbildung können die Arzneimittelderivate in einem physiologisch annehmbaren Medium verabreicht werden, zum Beispiel entionisiertem Wasser, Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS), physiologischer Kochsalzlösung, wässrigem Ethanol oder einem anderen Alkohol, Plasma, proteinhaltigen Lösungen, Mannitol, wässriger Glucose, Alkohol, Pflanzenöl oder dergleichen. Falls erforderlich, kann eine kleine Menge eines physiologisch annehmbaren Lösungsmittels oder Co-Lösungsmittels, wie DMSO, enthalten sein. Weitere Additive, welche beinhaltet sein können, umfassen Puffer, wobei die Medien im Allgemeinen bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 5 bis 10 gepuffert werden, wobei der Puffer im Allgemeinen in einer Konzentration von etwa 50 bis 250 mM Salz vorliegt, wobei die Konzentration von Salz im Allgemeinen im Bereich von etwa 5 bis 500 mM liegt, physiologisch annehmbare Stabilisatoren und dergleichen. Die Zusammensetzungen können zur (zum) geeigneten Lagerung und Transport lyophilisiert werden.
Die vorliegenden Medikamentenderivate werden größtenteils parenteral, wie intravaskulär (IV), intraokular (IO), intraarteriell(IA), intramuskulär (IM), subkutan (SC) oder dergleichen verabreicht werden. In geeigneten Situationen kann die Verabreichung durch Transfusion erfolgen. In einigen Fällen, wenn die Reaktion der aktiven funktionellen Gruppe relativ langsam ist, kann die Verabreichung oral, nasal, rektal, transdermal oder durch ein Aerosol erfolgen, wenn die Natur des Konjugates die Übertragung in das Gefäßsystem erlaubt. Im Allgemeinen wird eine einzige Injektion angewendet, obwohl mehr als eine Injektion verwendet werden kann, falls erforderlich. Die Medikamentenderivate können durch alle geeigneten Mittel verabreicht werden, umfassend eine Spritze, einen Trocar, Katheter oder dergleichen. Die besondere Weise der Verabreichung wird von der zu verabreichenden Menge abhängen, entweder ein einziger Bolus oder eine kontinuierliche Verabreichung oder dergleichen. Vorzugsweise wird die Verabreichung intravaskulär sein, wobei die Stelle der Einführung bei dieser Erfindung nicht kritisch ist, vorzugsweise eine Stelle ist, wo ein rascher Blutstrom vorliegt, zum Beispiel intravenös, peripher oder durch die Zentralvene. Es können andere Wege Anwendung finden, wenn die Verabreichung mit langsamen Freigabetechniken oder einer Schutzmatrix gekoppelt sind. Die Absicht ist, dass das Antischmerzmittel, insbesondere Opioid, Dynorphinanaloge oder - derivat wirksam im Blut verteilt wird, um mit den Blutkomponenten reagieren zu können. Die Konzentration des Konjugates wird breit variieren, im Allgemeinen von etwa 1 pg/ml bis 50 mg/ml reichen. Die intravaskuläre Gesamtverabreichung wird im Allgemeinen im Bereich von etwa 0,1 mg/ml bis etwa 10 mg/ml, gewöhnlicher von 1 mg/ml bis etwa 5 mg/ml, liegen.
Durch die Bindung an langlebige Komponenten des Blutes, wie Immunoglobulin, Serumalbumin, rote Blutzellen und Blutplättchen, ergeben sich eine Anzahl von Vorteilen. Die Wirksamkeit bzw. Aktivität des Arzneimittels verlängert sich um Tage bis Wochen. Eine Einmalverabreichung während dieses Zeitraums reicht aus. Eine größere Spezifität kann erreicht werden, da die wirksame bzw. aktive Verbindung hauptsächlich an große Moleküle gebunden sein wird, wobei es weniger wahrscheinlich ist, intrazellulär aufgenommen zu werden, um mit anderen physiologischen Prozessen wechselzuwirken.
Das Blut des Säugetierwirtes kann auf Anwesenheit des Medikamentes einmal oder mehrmals untersucht bzw. überwacht werden. Durch Abnahme einer Blutprobe des Wirtes kann man feststellen, ob das Medikament mit den langlebigen Blutkomponenten in ausreichender Menge gebunden worden ist, um therapeutisch wirksam zu sein und danach der Spiegel dieser Verbindung im Blut. Gegebenenfalls kann man auch bestimmen, an welche der Blutkomponenten das Medikament oder seine derivatisierten Moleküle gebunden sind.
Demzufolge betrifft die Erfindung solche Konjugate von Antischmerzmitteln, insbesondere Opioiden, Opioidanaloga und deren Derivate mit Blutkomponenten, insbesondere Blutproteinen, wie Albumin, sowie Verfahren zu ihrer Verabreichung an Menschen oder andere Lebewesen.
Die Derivate und Konjugate der Antischmerzmittel können auf mehreren verschiedenen Wegen und zur Erreichung mehrerer verschiedener Ziele verwendet werden. Wie oben erwähnt wurde, können diese Materialien anstelle typischer Antischmerzmittel zur Schmerzlinderung verwendet werden. Verglichen mit bisher oder derzeit verfügbaren Medikamenten, können die Materialien der vorliegenden Erfindung Schmerzen ohne zentral beeinflusste Nebenwirkungen oder potentieller Sucht oder Verlust an Leistungsfähigkeit Schmerz lindern und sind zur Schmerzlinderung über eine wesentlich längere Zeit verfügbar wie herkömmlich verabreichte Medikamente. Opioid-Derivate und Konjugate dieser Erfindung können (in Übereinstimmung mit US-PS 5,482,930) auch als antiinflammatorische und/oder Antiirritationsmittel oder im Allgemeinen, um ein Gefäßlecken aus Geweben zu verhindern, verwendet werden. Darüber hinaus können, wie im Stand der Technik bekannt ist, diese Materialien verwendet werden, um Wirte zu behandeln, die Morphin-tolerant sind oder geworden sind (oder zur Behandlung von Patienten, welche Methadonbehandlungsprogramme durchlaufen) sowie zur Behandlung von Narkotikaentzug im Allgemeinen. Die Konjugate und Materialien der vorliegenden Erfindung können darüber hinaus, wenn sie markiert sind, für experimentelle Zwecke verwendet werden, wie Proben zur Untersuchung der biologischen Funktionen verschiedener Rezeptoren.
Die Erfindung wird des Weiteren durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.

Experimenteller Teil

Allgemeines

Die Synthese aller Dynorphin A-Analoga wurde unter Verwendung einer händischen Festphasensynthese und eines ABI 433A Peptid Synthesizers durchgeführt, unter Verwendung von 0,55 mmol/g eines mit Fmoc geschützten Rink Amide MBHA-Harzes (NovaBiochem), 4 Äqu. von mit Fmoc geschützten Aminosäuren, 4 Äqu. eines 0,45 M O-Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphates (HBTU) und 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) in einer N,N-Dimethylformamid-Lösung als Aktivierung mit 4 Äqu. von 2 M N,N,-Diisopropylethylamin (DIEA) in 1-Methyl-2-pyrrolidinon (NMP) und Entschützen der Fmoc-Gruppen mit Piperidin. Eine Seitenkettenderivatisierung des Carboxy-endständigen Lysinrestes wurde unter Verwendung von Fmoc-Lys(Mtt)-OH (NovaBiochem) und Entschützen der Methyltritylgruppe (Mtt) mit 5% Trifluoressigsäure (TFA)/5% Triisopropylsilan (TIS) in Dichlormethan (DCM) erreicht. Derivate mit freien Amino-endständigen Aminosäureresten wurden unter Verwendung von entweder Boc-Tyr(tBu)-OH (NovaBiochem) oder Boc-Gly-OH (Advanced Chem Tech) synthetisiert. Harzabspaltung und Produktisolierung wurden unter Verwendung von 95% TFA/2,5% TIS/2,5% H&sub2;O mit nachfolgender Fällung durch trockeneiskaltem Et&sub2;O durchgeführt. Alle Dynorphin A-Analoga wurden durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt, indem ein Varian (Rainin) präparatives, binäres HPLC-System verwendet wird: Gradienteneluierung von 5-60% B (0,045% TFA in H&sub2;O (A) und 0,045% TFA in CH&sub3;CN (B)bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Dynamax Clg-Säule von 60 Å, 8 um, 21 mm · 25 cm, ausgerüstet mit einem Dynamax C&sub1;&sub8;-Schutzmodul mit 60 Å, 8 um und einem UV-Detektor (Varian Dynamax UVD II) bei 214 und 254 nm. Analytische HPLCs wurden unter Verwendung eines Varian (Rainin) binären HPLC-Systems durchgeführt: Gradienteneluierung von 5- 60% B (0,045% TFA in H&sub2;O (A) und 0,045% TFA in CH&sub3;CN (3) bei 0,5 ml/min unter Verwendung einer Dynamax C&sub1;&sub8;-Säule mit 16 Å, 8 um, 4,6 mm · 25 cm, ausgerüstet mit einem Dynamax C&sub1;&sub8;- Schutzmodul mit 60 Å, 8 um und einem UV-Detektor (Varian Dynamax UVD II) bei 214 und 254 nm. Massenspektrometrie wurde an einem PE Sciex API III Elektrospray-biomolekularen Massenanalysator durchgeführt.
Es ist zu berücksichtigen, dass TFA für den Einschluss in einem Produkt nicht akzeptierbar wäre, das zur Verwendung am Menschen beabsichtigt ist, so dass ein humankompatibles Schutzmittel, wie HCl, Verwendung findet.

Beispiel 1

Synthese von Dyn A 1-13(MPA)-NH&sub2;

Unter Verwendung einer automatisierten Peptidsynthese wurden die nachfolgenden geschützten Aminosäuren nacheinander Ring- Amid-MBHA-Harz zugegeben:
Fmoc-Lys(Mtt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)- OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH und Boc- Tyr(Boc)-OH. Eine händische Synthese wurde für die restlichen Schritte verwendet: Selektive Entfernung der Mtt-Gruppe und Koppeln von Maleimidpropionsäure (MPA) unter Verwendung von HBTU/HOBt/DIEA-Aktivierung in DMF. Das Target-Dynorphinanaloge wurde vom Harz entfernt; das Produkt wurde durch Ausfällung isoliert und durch präparative HPLC gereinigt, um das gewünschte Produkt als ein weißes Pulver durch Lyophilisierung in 42%iger Ausbeute zu liefern. Analytische HPLC zeigte das Produkt in einer Reinheit von > 95% mit Rt = 33,00 min. ESI-MS m/z für C&sub8;&sub2;H&sub1;&sub3;&sub3;N&sub2;&sub6;O&sub1;&sub7; (MH&spplus;), berechnet 1754,0, gefunden 1754,4, MH³&spplus; 585,8.
Die Struktur des Produktes ist

Beispiel 2

Synthese von Dyn A 2-13(MPA)-NH&sub2;

Unter Verwendung einer automatisierten Peptidsynthese wurden die nachfolgenden geschützten Aminosäuren nacheinander Ring- Amid-MBHA-Harz zugegeben:
Fmoc-Lys(Mtt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)- OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Gly-OH und Boc-Gly-OH. Eine händische Synthese wurde für die restlichen Schritte durchgeführt: Selektive Entfernung der Mtt-Gruppe und Koppeln von MPA unter Verwendung von HBTU/HOBt/DIEA-Aktivierung in DMF. Das Target-Dynorphinanaloge wurde vom Harz entfernt; das Produkt wurde durch Ausfällen isoliert und durch präparative HPLC gereinigt, um das gewünschte Produkt als einen weißen Feststoff beim Lyophilisieren in 35%iger Ausbeute zu liefern. Analytische HPLC zeigte das Produkt in einer Reinheit von > 95% mit Rt = 30,42 min. ESI-MS m/z für C&sub7;&sub3;H&sub1;&sub2;&sub3;N&sub2;&sub5;O&sub1;&sub5; (MH&spplus;), berechnet 1590,0, gefunden MH³&spplus; 531,3.

Beispiel 3

Synthese von Dyn A 1-13(AEA&sub3;-MPA)-NH&sub2;

Unter Verwendung einer automatisierten Peptidsynthese wurden die nachfolgenden geschützten Aminosäuren nacheinander Ring- Amid-MBHA-Harz zugegeben:
Fmoc-Lys(Mtt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)- OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gly-OH und Boc- Tyr(Boc)-OH. Eine händische Synthese wurde für die restlichen Schritte verwendet: Selektive Entfernung der Mtt-Gruppe, Kopplung von Drei-Fmoc-AEA-OH-Gruppen (AEA = Aminoethoxyessigsäure) unter Entfernung von Fmoc zwischen jeder Kopplung und MPA-Säure unter Verwendung von HBTU/HOBt/DIEA-Aktivierung in DMF. Das Target-Dynorphinanaloge wurde vom Harz entfernt; das Produkt wurde durch Ausfällen isoliert und durch präparative HPLC gereinigt, um das gewünschte Produkt als einen weißen Feststoff bei Lyophilisierung in 29%iger Ausbeute zu liefern. Analytische HPLC zeigte das Produkt in einer Reinheit von > 95% mit Rt = 33,06 min. ESI-MS m/z für C&sub9;&sub4;H&sub1;&sub5;&sub4;N&sub2;&sub9;O&sub2;&sub3; (MH&spplus;), berechnet 2057,2, gefunden MH&sup4;&spplus; 515,4, MH³&spplus; 686,9, MH²&spplus; 1029,7:
Die Struktur dieses Produktes ist

Beispiel 4

Synthese von Dyn A 2-13(AEAg-MPA)-NH&sub2;

Unter Verwendung einer automatisierten Peptidsynthese wurden die nachfolgenden geschützten Aminosäuren nacheinander Ring- Amid-MBHA-Harz zugegeben:
Fmoc-Lys(Mtt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)- OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Gly-OH und Fmoc-Gly-OH. Eine händische Synthese wurde für die restlichen Schritte verwendet: Selektive Entfernung der Mtt-Gruppe, Kopplung von Drei-Fmoc- AEA-OH-Gruppen, wobei Fmoc zwischen jeder Kopplung entfernt wurde, und von MPA unter Verwendung von HBTU/HOBt/DIEA- Aktivierung in DMF. Das Target-Dynorphinanaloge wurde vom Harz entfernt; das Produkt wurde durch Ausfällen isoliert und präparative HPLC gereinigt, um das gewünschte Produkt als einen weißen Feststoff bei Lyophilisierung in einer 29%igen Ausbeute zu erhalten. Analytische HPLC zeigte das Produkt in einer Reinheit von > 95% mit Rt = 31,88 min. ESI-MS m/z für C&sub8;&sub5;H&sub1;&sub4;&sub5;N&sub2;&sub5;O&sub2;&sub1; (MH&spplus;), berechnet 1894,3, gefunden MH&sup4;&spplus; 474,6, MH³&spplus; 632,4, MH²&spplus; 948,10.
Die Struktur des Produktes ist

Beispiel 5

Synthese von MPA-AEAg-Dyn A 2-17-NH&sub2;

Unter Verwendung einer automatisierten Peptidsynthese wurden die nachfolgenden geschützten Aminosäuren und Maleimid nacheinander Ring-Amid-MBHA-Harz zugegeben:
Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc- Trp(Boc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc- Gly-OH, Fmoc-AEA-OH, Fmoc-AEA-OH, Fmoc-AEA-OH und MPA. Das Target-Dynorphinanaloge wurde vom Harz entfernt; das Produkt wurde durch Ausfällung isoliert und durch präparative HPLC gereinigt, um das gewünschte Produkt als einen blassgelben Feststoff beim Lyophilisieren in 32%iger Ausbeute zu liefern. Analytische HPLC zeigte das Produkt in einer Reinheit von > 95%, mit Rt = 33,44 min. ESI-MS m/z für C&sub1;&sub0;&sub9;H&sub1;&sub7;&sub2;N&sub3;&sub5;O&sub2;&sub9; (MH&spplus;), berechnet 2436,8, gefunden MH³&spplus; 813,6.
Die Struktur des Produktes ist

Beispiel 6

Herstellung von Dynorphin-Humanserum-Albumin-Konjugaten (Ex- Vivo-Herstellung)

In 10 ml Reaktionsgefäßen wurde 4,95 ml 20%ige HSA vorgelegt. Dem wurden 50,0 ul einer 10 mM Lösung des Dynorphinderivates, das in Beispiel 1, 3, 4 oder 5 hergestellt worden war, gelöst in Wasser, zugegeben. Diese Mischungen wurden bei Raumtemperatur 3 Stunden stehengelassen, dann durch Umkehrphasen-HPLC analysiert, welche die Abwesenheit bzw. das Fehlen des Ausgangsdynorphinderivates zeigten.

Beispiel 7

Untersuchung nicht-selektiver Bindung

Nicht-selektive Bindung der oben hergestellten Konjugate wurde unter Verwendung von Naloxon wie folgt untersucht:

Bindungsreaktion

1. In jedem Rohr werden die folgenden Komponenten vorgelegt:
25 ul Medikament oder Träger
25 ul ³H-Naloxon
200 ul Gewebesuspension (homogenisiertes Rattenhirn)
2. Initiierung der Bindungsreaktion bei Zugabe von Gewebe und Inkubieren während 90 Minuten bei 25ºC:
3. Beendigung der Bindungsreaktion durch rasche Vakuumfiltration der Versuchsinhaltsstoffe auf unbehandelte GF/B-Filter.
4. Einmaliges Waschen der Rohre mit eiskaltem 50 mM TRIS·HCl (pH 7,4 bei 25ºC), dann Waschen der Filter mit etwa 7 ml/Rohr des selben eiskalten Waschpuffers.
5. Auf den Filtern eingefangene Radioaktivität wird unter Verwendung von Flüssigscintillationsspektrophotometrie bewertet.

Materialien und Reagenzien

1. [³H]-Naloxon wird in 50 mM Tris-HCl (pH 7,4 bei 25ºC) auf eine Konzentration von 10 nM verdünnt, so dass die resultierende Radioliganden-Konzentration in dem Test 1,0 nM beträgt.
2. Nicht-spezifische Bindung wird als diejenige definiert, welche in Gegenwart von 1 uM Naloxon bleibt.
3. Referenzverbindung ist Naloxon bei Endkonzentrationen von 3 · 10&supmin;¹¹, 1 · 10&supmin;¹&sup0;, 3 · 10&supmin;¹&sup0;, 1 · 10&supmin;&sup9;, 3 · 10&supmin;&sup9;, 1 · 10&supmin;&sup8;, 3 · 10&supmin;&sup8;, 1 · 10&supmin;&sup7; und 3 · 10&supmin;&sup7; M.
4. Die positive Kontrolle ist Naloxon in Endkonzentrationen von 3 · 10&supmin;&sup9;, 3 · 10&supmin;&sup8; und 3 · 10&supmin;&sup7; M.
5. Der Kd-Wert des mu-Opiatrezeptors für [³H]-Naloxon ist 2,0 nM.
Der Test wurde unter Verwendung von HSA durchgeführt und der ursprünglichen Dynorphine (A 1-13, A 2-13 und A 2-17) als Referenzstandards für Naloxoninhibierung. Auf Inhibierung wurden die Konjugate, welche in Beispiel 6 hergestellt wurden, untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst und zeigen, dass drei der vier Konjugate eine Naloxon-Inhibierung verglichen mit dem Eltern-Dynorphin zeigten.
Das einzige Konjugat, das keine Inhibierung zeigte, war CCI-H. Dieses Konjugat (und sein in Beispiel 5 hergestelltes Vorläuferderivat) unterscheidet sich von den anderen, indem das Konjugat durch Derivatisierung der endständigen Aminogruppe des Dynorphins anstelle der endständigen Carboxylgruppe derivatisiert wurde.
Darüber hinaus wurde CCI-H aus einem des-Tyr-Dynorphinderivat, Dyn A 2-17, hergestellt.
Die Tatsache, dass die Konjugate CCI-E und -G sowie Dyn A 1-13- NH&sub2; in diesem Versuch funktionieren, ist überraschend. Ähnlich wirksam war CCI-F, welches ähnlich inhibiert wie Dyn A 2-13- NH&sub2;. Diese Daten suggerieren, dass die Dynorphin-Konjugate equipotent mit den nativen Dynorphinpeptiden sind.

Beispiel 8

In-Vivo-Versuche

Die folgenden Untersuchungen wurden durchgeführt, um eine Antischmerzwirkung von Dynorphin-Albumin-Konjugaten zu zeigen, welche in vivo und ex vivo mit 20% HSA in Mäusen hergestellt wurden.
Die untersuchten Materialien waren:
Gruppe A: Morphin (10 umol/kg oder 3 mg/kg), 20% HSA (1 Dosis, d. h. 250 ul), 0,9% physiologische Kochsalzlösung.
Gruppe B: Dynorphin A 1-13-NH&sub2;-Salz (10 umol/kg oder 20 mg/kg), CCI-1017 (10 umol/kg oder 696 mg/kg) als ex-vivo-Konjugat, und CCI-1008 (30 umol/kg oder 70 mg/kg) als in-vivo-Konjugat.
Gruppe C: Dynorphin A 2-13-NH&sub2;-Salz (10 umol/kg oder 18 mg/kg), CCI-1018 (10 umol/kg oder 697 mg/kg) als ex-vivo-Konjugat, und CCI-1010 (30 umol/kg oder 77 mg/kg) als in-vivo-Konjugat.
Gruppe D: CCI-1019 (10 umol/kg oder 699 mg/kg) als ex-vivo- Konjugat, und CCI-1009 (30 umol/kg oder 79 mg/kg) als in-vivo- Konjugat.
Gruppe E: Dynorphin A 2-17-HN&sub2;-Salz (10 umol/kg oder 25 mg/kg), CCI-1020 (10 umol/kg oder 70 mg/kg) als ex-vivo-Konjugat, und CCI-1011 (30 umol/kg oder 90 mg/kg) als in-vivo-Konjugat.
Jede Behandlungsgruppe bestand aus vier Zeitpunkten (5 min, 1 Stunde, 3 Stunden und 24 Stunden) mit drei männlichen Mäusen/Dosis/Zeitpunkt.

Experimentelles Verfahren:

Writhing assay (Hooke, L. P.; Lee, N. M., J. Pharmacol. Exp. Ther. 1995, 273, 802-807 und Hayashi, G.; Takemori, A. E. Eur. J. Pharmacol. 1971, 16, 63-66).
Etwa 1 Stunde vor dem Writhing-Versuch werden die Mäuse einzeln in durchsichtige Beobachtungskammern für einen Anpassungszeitraum verbracht.
Die Anzahl abdominaler Streckungen (Krümmungen) werden über einen Zeitraum von 6 Minuten gezählt. Das wird die Basisantwort des Versuches sein.
Testsubstanz (250 ul Volumen) wurde als Bolus über die Schwanzvene injiziert. Bei den gegebenen Zeiträumen (5 min, 1 Stunde, 3 Stunden, 24 Stunden) nach Injektion des Testmaterials wird den Mäusen 2 mg/kg Essigsäure (AcOH) injiziert.
Fünf Minuten nach der AcOH-Gabe werden die Mäuse in transparente Zylinder verbracht und die Anzahl abdominaler Streckungen (Krümmungen) werden über einen Zeitraum von 6 Minuten gezählt. Die durchschnittlichen Streckungen werden mit jener der Kontrollgruppe (0,9% Kochsalzlösung) verglichen. Antischmerzwirkung ist als % Inhibierung der durchschnittlichen Krümmungen in der Kontrollgruppe (typisch 18-25) ausgedrückt.
Die Daten sind in der nachfolgenden Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
a Bei 30 umol/kg starben drei von drei Tieren innerhalb 5 min nach i.v. Injektion von TA
b Bei 10 umol/kg starben drei von drei Tieren innerhalb 5 min nach i.v. Injektion von TA
c Bei 10 umol/kg starb ein von drei Tieren innerhalb 5 min nach i.v. Injektion von TA
d Bei 30 umol/kg starb ein von drei Tieren innerhalb 5 min nach i.v. Injektion von TA
Die Daten in dieser Tabelle zeigen, dass die Konjugate CCI-E und G, ex vivo hergestellt in Beispiel 6, nach einem verzögerten Einsetzen potent waren und eine ununterbrochene Dauer der Wirkung zeigen. Interessanterweise zeigten die des-Tyrosin- Derivate, CCI-F und CCI-H geringe anfängliche Wirkung und keine ununterbrochene Dauer. Des Weiteren zeigte eine in vivo- Verabreichung eine moderate anfängliche Aktivität und über die Zeit wurde die Dauer unterstütz und das Aktivitätsprofil ähnelte dem von Morphin, was die Fähigkeit zeigt, das Konjugat mit dem nativen Albumin in vivo zu bilden.

SEQUENZ-LISTE

< 110> MILNER, PETER
EZRIN, ALAN
BRIDON, DOMINIQUE
HOLMES, DARREN
< 120> NEUE KONJUGATE VON OPIOIDEN UND ENDOGENE TRÄGER
< 130> REDC-600
< 150> US 60/064, 705
< 151> 1997-11-07
< 160> 7
< 170> PC-DOS/MS-DOS
< 2I0> 1
< 211> 17
< 212> PRT
< 213> Künstliche Sequenz
< 220>
< 221>
< 222>
< 223> Dynorphin Analoges (A 1-17).
< 210> 2
< 211> 13
< 212> PRT
< 213> Künstliche Sequenz
< 220>
< 221>
< 222>
< 223> Dynorphin Analoges (A 1-13).
210> 3
< 211> 12
< 212> PRT
< 213> Künstliche Sequenz
< 220>
< 221>
< 222>
< 223> Dynorphin Analoges A (2-13).
< 210> 4
< 211> 13
< 212> PRT
< 213> Künstliche Sequenz
< 220>
< 221> Xaa bei Position 1 ist TFA-Tyr; Xaa bei Positionen 6, 7 und 9 sind TFA-Arg; Xaa bei Position 11 ist TFA-Lys und Xaa bei Position 13 ist MPA-Lys. MPA ist Maleimidpropionsäure. TFA ist Trifluoressigsäure.
< 222>
< 223> Dynorphin Analoges A (1-13).
< 210> 5
< 211> 13
< 212> PRT
< 213> Künstliche Sequenz
< 220>
< 221> Xaa bei Position 1 ist TFA-Tyr; Xaa bei Positionen 6, 7 und 9 sind TFA-Arg; Xaa bei Position 11 ist TFA-Lys und Xaa bei Position 13 ist MPA-Lys. MPA ist Maleimidpropionsäure. TFA ist Trifluoressigsäure.
< 222> <
223> Dynorphin Analoges A (1-13).
< 210> 6
< 211> 12
< 212> PRT
< 213> Künstliche Sequenz
< 220>
< 221> Xaa bei Position 1 ist TFA-Gly; Xaa bei Positionen 5, 6 und 8 sind TFA-Arg; Xaa bei Position 12 ist MPA-Lys. MPA ist Maleimidpropionsäure. TFA ist Trifluoressigsäure.
< 222>
< 223> Dynorphin Analoges A (2-13).
< 210> 7
< 211> 16
< 212> PRT
< 213> Künstliche Sequenz
< 220>
< 221> Xaa bei Position 1 ist MPA-Gly; Xaa bei Positionen 5, 6 und 8 sind TFA-Arg; Xaa bei Position 10 ist TFA-Lys; Xaa bei Position 12 ist TFA-Lys. MPA ist Maleimidpropionsäure. TFA ist Trifluoressigsäure.
< 222>
< 223> Dynorphin Analoges A (2-17).

Claims

1. Verwendung einer Zusammensetzung für die Herstellung eines Medikaments zur Linderung von Schmerzen oder um einen analgetischen Effekt zu erzielen, wobei die Zusammensetzung ein Opioidderivat und Analoga davon umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass das Derivat eine reaktive funktionelle Gruppe umfasst, welche mit Aminogruppen, Hydroxylgruppen oder Thiolgruppen auf Blutbestandteilen reagiert, um stabile kovalente Bindungen zu bilden, wobei die reaktive funktionelle Gruppe ausgewählt ist aus N-Hydroxysuccinimid, N- Hydroxysulfosuccinimid und einer Maleimidgruppe.

2. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Opioid ausgewählt ist aus Dynorphinen, Endorphinen, Deltorphinen, Enkephalinen und Analoga davon.

3. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Opioid ausgewählt ist aus Dynorphinen und Analoga davon.

4. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Opioid ausgewählt ist aus Endorphinen und Analoga davon.

5. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Opioid ausgewählt ist aus Deltorphinen und Analoga davon.

6. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Opioid ausgewählt ist aus Enkephalinen und Analoga davon.

7. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Dynorphinderivat

ist.

8. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Derivat mit Blutproteinen reagiert.

9. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Derivat mit den Thiolgruppen auf einem Blutprotein reagiert.

10. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Derivat mit Albumin unter Ausbildung einer stabilen kovalenten Bindung reagiert.

11. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die reaktive funktionelle Gruppe N-Hydroxysuccinimid oder N-Hydroxysulfosuccinimid ist.

12. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die reaktive funktionelle Gruppe eine Maleimidgruppe ist.

13. Verwendung einer Verbindung mit der Formel

für die Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung zur Linderung von Schmerzen oder Bereitstellung eines analgetischen Effekts.