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DE69735383T2 - Methode zur Inhibierung von HEREGULIN und seines Rezeptors sowie Verwendung zur Inhibierung von Krebszellen - Google Patents

Methode zur Inhibierung von HEREGULIN und seines Rezeptors sowie Verwendung zur Inhibierung von Krebszellen Download PDF

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DE69735383T2
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Shaomeng McLeane WANG
Alan P. Princeton KOZIKOWSKI
Marc E. Bethesda LIPPMAN
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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Mitglieder der EGF-Rezeptorfamilie, einschließlich der Gene EGFR, erbB-2/neu, erbB-3 und erbB-4, werden in wenigstens 60–70% der Fälle von menschlichem Brustkrebs überexprimiert. Über die gezielte Inhibierung des erbB-Rezeptors (der erbB-Rezeptoren) mit monoklonalen Antikörpern, Immunotoxinen oder Antisense-Oligonukleotiden wurde berichtet, und in einigen Fällen gelangte man zu frühen Phasen klinischer Versuche. Mit diesen Ansätzen sind mehrere wesentliche therapeutische Einschränkungen verbunden, einschließlich eine große Molekülgröße, schwache Gewebedurchdringung, Abgabe und Immunantworten des Wirts.
  • Versuche zur Isolierung eines Liganden für erbB-2/neu führten zur Entdeckung von gp30, oder Heregulin (HRG oder NDF) (Lupu et al., Science, 256:1205–1210, 1992; Holmes et al., Science 256:1205–1210, 1992; Peles et al., Cell, 69:205–216, 1992). HRG enthält eine EGF-artige Domäne, die eine Bindung und Stimulierung der p185erbB-Phosphorylierung bewirkt. Die EGF-artige Domäne von HRG enthält 6 Cysteinreste, die für die EGF-Familie der Wachstumsfaktoren charakteristisch sind, jedoch bindet HRG nicht an EGF-Rezeptoren (Holmes et al., Science 256:1205–1210, 1992, Peles et al., Cell, 69:205–216, 1992, Falls et al., Cell, 72:801–815, 1993, Marchionni et al., Nature, 362:312–318, 1993; Peles et al., Bioessays, 15:815–824, 1993). Sowohl erbB-3 als auch erbB-4 sind Rezeptoren für HRG (Plowman et al., Nature, 366:473–475, 1993; Carraway et al., Cell, 78:5–8, 1994; Tzahar et al., J. Biol. Chem. 269:25266–25233, 1994; Carraway et al., J. Biol. Chem. 269:14303–14306, 1994; Kita et al., FEBS Lett., 349:139–143, 1994).
  • Die Hereguline (auch Neureguline, NDF, GGF und ARIA genannt) gehören zu einer Familie membrangebundener oder sekretierter Proteine, die von Neuronen und mesenchymalen Zellen produziert werden. Sie üben auf eine Vielzahl von Zellarten mehrere Wirkungen aus. Lemke, G. Mol, Cell, Neuroscience, Bd. 7, 2996, 247–262; und D. Zhang. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 94, 1997, 9562–9567.
  • Man nimmt inzwischen allgemein an, dass die Homodimere von erbB-4 biologisch aktiv sind, während die Signalübermittlung von HRG durch erbB-3 von einer Heterodimerisierung mit anderen erbB-3-Rezeptoren, vorwiegend erbB-2, abhängt (Carraway et al, Cell, 78:5–8, 1994; Sliwkowski et al., J. Biol. Chem. 269:146; Alimandi et al., Oncogene 1995 10(9):1813–21; Chen et al., J. Biol. Chem 271:7620, 1996).
  • Die Expression von HRG wurde bei Fällen von menschlichem Brustkrebs gezeigt (Normanno et al., Int. J. Onco. 2: 903, 1993; Normanno et al., Breast Cancer Res Treat 1995, 35(3):293–7), und HRG könnte bei der autokrinen Wachstumsregulierung (Carraway et al., Cell, 78:5–8 (1994), dem Übergang zu Östrogen-unabhängigem Wachstum und erhöhter Tumorgenizität von Brustkrebszellen eine Rolle spielen (Pietras et al., Oncogene, 1995, 15:10(12): 2435–46). Immunfärbeuntersuchungen zeigen, dass erbB-3 bei Brustkrebs (Lemoine et al., Br. J. Cancer, 66:1116–1121, 1992; Quinn et al., Histopatho., 25:247–252, 1994; Gasparini et al., Eur. J. Cancer, 30A: 16–22, 1994) und anderen Krebsarten (Simpson et al., Br. J. Cancer, 71:758–762, 1995; Myers et al., J. Natl. Cancer Ins. 86:1140–1145) überexprimiert wird. Die Expression von erbB-4 ist in Brustkrebs-Zelllinien erhöht (Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746–1750, 1993), und erbB-4 wird in invasivem duktalem Karzinom und DCIS der Brust, nicht dagegen in den nahe gelegenen normalen Brustzellen überexprimiert.
  • Somit besteht ein Bedarf für spezifische Antagonisten von HRG, die als wirksame Inhibitoren des Krebszellwachstums wirken können.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt bereit ein in vitro-Verfahren zur Antagonisierung der Wirkungen eines Heregulins oder des Rezeptors davon durch Inkontaktbringen des erwähnten Rezeptors mit einer wirksamen Menge einer Verbindung der Formel (I):
    Figure 00020001
    worin
    R1 für OH oder -CH2C(O)N((C1-C4)alkyl)2 steht;
    R2 für -CH=N-N(R7)(R8), -CH=NO((C1-C12)alkyl), -CH=NOCH(phenyl)2, -CH=NO(CH2)n-phenyl, -CH=N-NHR9, -CH=N-R10
    Figure 00030001
    steht;
    n für 1–6 steht;
    R3 und R4 jeweils unabhängig für H, (C1-C4)-Alkyl (vorzugsweise -CH3), Halogen, Halogen-(C1-C4)-alkyl oder (C5-C7)-Aryl, das gegebenenfalls 1–2 N, S oder nicht-peroxidische O umfasst und gegebenenfalls mit (C1-C4)-Alkyl oder Halogen substituiert ist, steht;
    R5 und R6 jeweils unabhängig für H, OH, -NH2, -C(O)OH oder -C(O)NH2 steht;
    R7 für H oder (C1-C4)-Alkyl steht; und R8 einen bi- oder tricyclischen Ring bedeutet, wobei der Ring 7–10 Kohlenstoffatome umfasst (vorzugsweise Adamantan), gegebenenfalls ein oder mehrere (z.B. 1–4) Heteroatome umfasst, die ausgewählt sind unter S, N oder nicht-peroxidischem O, wobei der Ring gegebenenfalls mit (C1-C4)-Alkyl, Halogen oder Halogen-(C1-C4)-alkyl substituiert ist; oder R7 und R8 zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 10–20 Kohlenstoffatome (vorzugsweise 17) umfassenden Ring bilden, der gegebenenfalls ein oder mehrere (z.B. 1–4) Heteroatome umfasst, die ausgewählt sind unter S, N oder nicht-peroxidischem O, wobei der Ring gegebenenfalls mit (C1-C4)-Alkyl, Halogen oder Halogen-(C1-C4)-alkyl substituiert ist;
    R9 für (C1-C4)-Alkyl, einen Peptidylrest einer natürlich vorkommenden Aminosäure oder ein Di-, Tri- oder Tetrapeptid steht; und
    R10 für einen Piperazin-1-yl-Ring steht, der gegebenenfalls an einem Kohlenstoffatom mit einem oder zwei Substituenten substituiert ist, die ausgewählt sind unter den für R3 und R4 angegebenen Bedeutungen und der gegebenenfalls in der 4-Position mit einer Gruppe R11 substituiert ist, wobei R11 für (C1-C4)-Alkyl, Phenyl, Benzyl, einen Peptidylrest einer natürlich vorkommenden Aminosäure oder ein Di-, Tri- oder Tetrapeptid steht,
    oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon;
    wobei die erwähnte Menge zur Antagonisierung der Wirkungen eines Heregulins oder des Rezeptors davon wirksam ist.
  • Die Erfindung stellt weiterhin bereit die Verwendung einer Verbindung der Formel (I) zur Herstellung eines Medikaments, das brauchbar ist zur Behandlung einer Krankheit oder eines Zustandes, bei der/dem eine Zellsignalübermittlung durch Heregulin oder dessen Rezeptoren) beteiligt ist. Die Erfindung stellt weiterhin bereit die Verwendung einer Verbindung der Formel (I) zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung von Zellwachstum in einem Säuger (z.B. einem Menschen).
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt die Inhibierung der Proliferation von 32D-Zellen durch erfindungsgemäße Verbindungen.
  • 2 zeigt die Inhibierung der Proliferation von 32D-Zellen durch erfindungsgemäße Verbindungen.
  • 3 zeigt die kompetitive Blockierung der Wirkung einer erfindungsgemäßen Verbindung durch HRGα.
  • 4 zeigt die Inhibierung der Proliferation menschlicher Brustkrebszellen durch erfindungsgemäße Verbindungen.
  • 5 zeigt die Inhibierung der Koloniebildung von MDA-231-Brustkrebszellen auf Weichagar durch erfindungsgemäße Verbindungen.
  • 6 zeigt die Struktur und Bindungsaktivität von erfindungsgemäßen Verbindungen und einiger anderer Rifamycin-Analoga.
  • 7 zeigt die Struktur und Bindungsaktivität von erfindungsgemäßen Verbindungen und einiger anderer Rifamycin-Analoga.
  • 8 zeigt Struktur und Bindungsaktivität von erfindungsgemäßen Verbindungen und einiger anderer Rifamycin-Analoga.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Es wurden bestimmte Analoga von Rifamycin entdeckt, die spezifische Antagonisten von HRG bei Rezeptorbindungskompetition, HRG-induzierter Phosphorylierung und HRG-abhängigen Zellproliferationsassays sind. Untersuchungen mit molekularem Modellieren zeigten, das die erfindungsgemäßen Rifamycin-Analoga unter Verwendung ihres großen Ring-Rückgrats als Matrize überlagert werden können. An der C9-Position, an die unterschiedliche Substituenten gebunden sein können, gibt es strukturelle Unterschiede.
  • Da Verbindungen mit unterschiedlichen Substitutenten an dieser Stelle Aktivititäten zeigten, die von nahezu inaktiv bis ziemlich aktiv (10–100facher Unterschied bei der Bindung, der Phosphorylierung und in HRG-abhängigen Wachstumsinhibierungsassays) reichten, ist klar, dass diese Stelle eine wichtige Rolle für deren antagonistische Aktivitäten spielt. Untersuchungen mit molekularem Modellieren, bei denen die Strukturen von Rifamycin- Analoga mit dem von der 3D-Struktur von HRG abgeleiteten Pharmacophor-Modell verglichen wurden, zeigten, dass Substituenten an dieser Stelle in der von den Resten 177 bis 180 (Ser-His-Leu-Val) besetzten Region in HRG liegen. Es wurde gezeigt, dass die Reste 177–180 eine wichtige Rolle bei der Bindung von HRG an dessen Rezeptor spielen (Barbacci et al., J. Biol. Chem. 1995; 270(16) 9585–9). Eine Deletion der Reste 177 bis 181 inaktiviert den Liganden vollständig. Ein Austausch der Reste 177 bis 181 durch eine Acetylgruppe verringert die Bindungsaffinität von HRG an dessen Rezeptor um mehr als das 50fache (Barbacci et al., J. Biol. Chem. 1995; 270(16) 9585–9).
  • Der Zusammenhang zwischen Struktur und Aktivität von Rifamycin-Analoga weist ebenfalls auf die Bedeutung dieser Region hin (6 und 7). Beipielsweise zeigen Verbindungen mit einem sperrigen hydrophoben Substitutenten an dieser Stelle, wie die Verbindungen A3 und A4, ziemlich gute Aktivitäten, während die Verbindungen A5–A7, die eine hydrophile Gruppe an dieser Stelle aufweisen, praktisch inaktiv sind. Untersuchungen mit molekularem Modellieren legten nahe, dass die hydrophobe Gruppe an dieser Stelle die hydrophoben Reste Leu 179 und vielleicht Val 180 nachahmen. Modellierungsuntersuchungen der Verbindungen A1 und A2 zeigten, dass 1,5-Dimethylpiperazin den hydrophoben Rest Leu 179 und die Hydroxylbenzylgruppe His 178 und vielleicht Ser 177 in HRG nachahmen.
  • Die unten angeführten spezifischen und bevorzugten Werte für Reste, Substitutenten und Bereiche dienen lediglich der Veranschaulichung; sie schließen weitere definierte Werte oder weitere Werte innerhalb definierter Bereiche für die Reste und Substitutenten nicht aus.
  • R2 kann insbesondere
    Figure 00050001
    sein. Insbesondere können R3 und R4 jeweils -CH3 sein; R5 kann OH sein; und R6 kann H sein.
  • Eine spezifische Gruppe von Verbindungen sind Verbindungen der Formel (I), worin R5 und R6 jeweils unabhängig für H, -NH2, -C(O)OH oder -C(O)NH2 steht. Eine weitere spezifische Gruppe von Verbindungen sind Verbindungen der Formel (I), worin R2 für -CH=N-N(R7)(R8) oder -CH=NO(CH2)n-phenyl steht. Eine weitere spezifische Gruppe von Verbindungen sind Verbindungen der Formel (I), worin R2 für -CH=NHR9 steht. Eine weitere spezifische Gruppe von Verbindungen sind Verbindungen der Formel (I), worin R2 für -CH=N-R10 steht. Eine weitere spezifische Gruppe von Verbindungen sind Verbindungen der Formel (I), worin R9 ein Peptidrest ist, der ausgewählt ist unter -Val-Leu-His-Ser, -Leu-His-Ser, -Val-Leu-His, -Val-Leu, -Leu-His, -His-Ser, -Asn-Ser-Asp-Ser, -Asn-Ser-Asp, -Asn-Ser, oder Ser-Asp-Ser. Eine weitere spezifische Gruppe von Verbindungen sind Verbindungen der Formel (I), worin R11 ein Peptidrest ist, der ausgewählt ist unter -Val-Leu-His-Ser, -Leu-His-Ser, -Val-Leu-His, -Val-Leu, -Leu-His, -His-Ser, -Asn-Ser-Asp-Ser, -Asn-Ser-Asp, -Asn-Ser, oder -Ser-Asp-Ser.
  • Eine bevorzugte Gruppe von Verbindungen sind Verbindungen der Formel (I), worin R1 OH ist.
  • Eine weitere bevorzugte Gruppe von Verbindungen sind Verbindungen der Formel (I), worin R2
    Figure 00060001
    ist.
  • Basierend auf Modellierungsuntersuchungen kann der hydrophobe Rest Leu 179 nachgeahmt werden durch Hinzufügen kleiner hydrophober Gruppen, wie beispielsweise Methyl, Trifluormethyl, ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, t-Butyl, Phenyl, Fluor, Chlor und Brom, zum Piperazinring eines solchen R2. Weiterhin können kleine hydrophile Gruppen, wie beispielsweise Hydroxy, Amino, Carboxy und Aminocarbonyl, gegebenenfalls am Phenylring eines solchen R2 substituiert sein. In einer Verbindung kann mehr als ein Substitutent an die Piperazin- und Phenylringe gebunden sein. Modifizierungen können somit an den Positionen 1, 2, 4, 5 des Piperazinrings und an den Positionen 1', 2', 3', 4', 5' des Phenylrings vorgenommen werden:
    Figure 00060002
  • Frühere Untersuchungen zeigten, dass diese Stelle auch die Spezifität der Bindung von HRG oder EGF an deren Rezeptor steuert. Somit können an dieser Stelle Tetra-, Tri-, Di- oder Monopeptidsegmente an den Rifamycin-Kern gebunden sein, wobei die Sequenz entweder von HGRs (Reste 177–180, SHLV) oder EGF (Reste 1–4, NSDS) stammt, wodurch sich Verbindungen mit spezifischer antagonistischer Aktivität gegen HRG-Rezeptor oder EGRF ergeben.
  • Die Verbindungen der Formel (I) können unter Verwendung von 3-Formylrifamycin O-n-octyloxim (Verbindung I in Schema 1) synthetisiert werden, das unter Metallionenkatalyse hydrolysiert wird, wodurch der entsprechende Aldehyd erhalten wird. Beispielsweise kann Molybdän- oder Eisencarbonyl verwendet werden, um die erforderliche Umsetzung herbeizuführen. Die Reaktion des Aldehyds (Verbindung II in Schema 1) mit ausgewählten Alkyl- und Arylhydrazinen stellt die entsprechenden Hydrazone bereit (Verbindung III in Schema 1). Diese Reaktionen können unter milden Bedingungen unter Verwendung von p-Toluolsulfonsäure als Katalysator in Methylenchlorid als Lösungsmittel durchgeführt werden. Detallierte Syntheseschemata für die vorgeschlagenen Verbindungen sind in den Schemata 1 und 2 gezeigt. Schema 1
    Figure 00070001
    • (Siehe Nitta el al., Bull. Chem. Soc. Jpn, 59, 2365, 1986; Nitta et al., Bull. Chem. Soc. Jpn, 57, 3357, 1984).
    Schema 2
    Figure 00080001
    • (wobei Alloc -C(O)OCH2CH=CH2 ist). Siehe Gosl et al., Org. Syn. 43, 1, 1963; und Kunz et al., Angew. Chem., Int. Ed Engl. 23, 436, 1984.
  • Pharmazeutisch akzeptable Salze von Säuren der Formel (I) können unter Verwendung organischer oder anorganischer Basen, wie beispielsweise NaOH, Na2(CO3), NaHCO3, KOH und dergleichen gebildet werden. Aminsalze können aus organischen oder anorganischen Säuren wie beispielsweise HCl, H2SO4, TsOH, Citronensäure, Maleinsäure, Apfelsäure, Weinsäure und dergleichen hergestellt werden. Peptidylderivate wie beispielsweise N-geschützte (z.B. NAc, NBz, usw. ...) Derivate können ebenfalls bei den erfindungsgemäßen Ausführungsformen verwendet werden.
  • Obwohl das aus den Verbindungen der Formel (I) und/oder deren Salzen hergestellte Medikament nur die reinen chemischen Verbindungen enthalten kann, liegt der aktive Inhaltsstoff vorzugsweise als pharmazeutische Zusammensetzung vor, beispielsweise eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine oder mehrere Verbindungen der Formel (I) und/oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon umfasst, zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägern dafür und, gegebenenfalls, weiteren therapeutischen und/oder prophylaktischen Inhaltsstoffen. Der (die) Träger muss (müssen) dergestalt „akzeptabel" sein, dass sie mit den weiteren Inhaltsstoffen der Zusammensetzung verträglich sind und nicht schädlich sind für deren Empfänger.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen für orale oder parenterale (einschließlich intramuskuläre, subkutane und intravenöse) Verabreichung geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen. Falls angebracht können die Zusammensetzungen praktischerweise in einzelnen Einheitsdosisformen vorliegen und über jedes beliebige der dem Fachmann auf dem Gebiet der Pharmazie bekannten Verfahren hergestellt werden.
  • Solche Verfahren umfassen den Schritt, die aktive Verbindung mit flüssigen Trägern, festen Matrizes, halbfesten Trägern, fein geteilten festen Trägern oder Kombinationen davon zusammenzubringen und dann, falls erforderlich, das Produkt in das gewünschte Abgabesystem zu formen.
  • Für orale Verabreichung geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen können vorliegen als einzelne Einheitsdosisformen wie beispielsweise Hart- oder Weichgelantinekapseln, Cachets oder Tabletten, die jeweils eine vorbestimmte Menge des aktiven Inhaltsstoffes enthalten; als Pulver oder Granula; als Lösung, Suspension oder Emulsion. Der aktive Inhaltsstoff kann auch als Bolus, Electuarium oder Paste vorliegen. Tabletten und Kapseln für orale Verabreichung können übliche Exzipienten wie Bindemittel, Füllmittel, Gleitmittel, Zerfallhilfsmittel oder Benetzungsmittel enthalten. Die Tabletten können über dem Fachmann allgemein bekannte Verfahren beschichtet werden, z.B. mit magensaftresistenten Beschichtungen.
  • Orale flüssige Zubereitungen können in Form von wässrigen oder öligen Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirups oder Elixieren vorliegen, oder als Trockenprodukt zur Konstituierung mit Wasser oder anderen geeigneten Vehikeln vor der Verwendung. Solche flüssigen Zubereitungen können übliche Zusatzstoffe wie Suspensionsmittel, Emulsionsmittel, nicht-wässrige Vehikel (die verzehrbare Öle umfassen können) oder Konservierungsmittel enhalten.
  • Die Verbindungen können auch für parenterale Verabreichung formuliert werden (z.B. über Injektion, beispielsweise Bolusinjektion oder kontinuierliche Infusion) und können vorliegen in Einheitsdosisform in Ampullen, vorgefüllten Spritzen, kleinen Bolusinfusionsbehältern oder Behältern für Mehrfachdosen mit zugegebenem Konservierungsmittel. Die Zusammensetzungen können in Form von Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Vehikeln vorliegen, und können Formulierungsmittel wie beispielsweise Suspensions-, Stabilisierung- und/oder Dispersionsmittel enthalten. Der flüssige Träger ist vorzugsweise eine nicht-alkalische Lösung. Der aktive Inhaltsstoff kann alternativ in durch aseptische Isolierung eines sterilen Feststoffs oder durch Lyophilisierung aus einer Lösung erhaltener Pulverform zur Konstitution mit einem geeigneten Vehikel, z.B. sterilem, pyrogenfreiem Wasser vor der Verwendung vorliegen.
  • Für topische Verabreichung auf die Epidermis können die Verbindungen als Salben, Cremes oder Lotionen oder als die aktiven Inhaltsstoffe eines transdermalen Pflasters formuliert werden. Geeignete transdermale Verabreichungssysteme sind beispielsweise offenbart in Fisher et al. (US-Patent Nr. 4,788,603) oder Bawas et al. (US-Patent Nr. 4,931,271, 4,668,504 und 4,713,224). Salben und Cremes können beispielsweise mit einer wässrigen oder öligen Grundlage unter Zugabe geeigneter Verdickungs- und/oder Gelierungsmittel formuliert werden. Lotionen können mit einer wässrigen oder öligen Grundlage formuliert werden und enthalten im Allgemeinen ein oder mehrere Emulsionsmittel, Stabilisierungsmittel, Dispersionsmittel, Suspensionsmittel, Verdickungsmittel oder farbgebende Mittel. Der aktive Inhaltsstoff kann, wie beispielsweise in den US-Patenten 4,140,122, 4,383,529 oder 4,051,842 offenbart, auch über Iontophorese verabreicht werden.
  • Für topische Verabreichung im Mund geeignete Zusammensetzungen umfassen Einheitsdosisformen wie Pastillen, die aktiven Inhaltsstoff in einer geschmackstragenden Grundlage umfassen, üblicherweise Saccharose und Akazie oder Traganth; Pastillen, die den aktiven Inhaltsstoff in einer inerten Grundlage wie beispielsweise Gelatine und Glycerin oder Saccharose und Akaziagummi umfassen; mukoadhärente Gele, und Mundspülungen, die den aktiven Inhaltsstoff in einem geeigneten flüssigen Träger umfassen.
  • Falls gewünscht können die oben beschriebenen Zusammensetzungen für eine anhaltende Freisetzung des verwendeten aktiven Inhaltsstoffes angepasst werden, z.B. durch deren Kombination mit bestimmten hydrophilen polymeren Matrizes, z.B. umfassend natürliche Gele, synthetische Polymergele oder Mischungen davon.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch weitere Adjuvantien wie beispielsweise Geschmacksstoffe, Farbstoffe, antimikrobielle Mittel oder Konservierungsmittel enthalten.
  • Weiterhin ist ersichtlich, dass die bei Verwendung zur Behandlung erforderliche Menge der Verbindung oder des Salzes oder Derivats davon nicht nur in Abhängigkeit von dem bestimmten gewählten Salz, sondern auch in Abhängigkeit vom Verabreichungsweg, der Art des behandelten Zustandes und dem Alter und dem Zustand des Patienten variiert, und letztendlich von der Beurteilung des behandelnden Arztes oder Klinikarztes abhängt.
  • In Allgemeinen liegt jedoch eine geeignete Dosis im Bereich von etwa 0,5 bis etwa 100 mg/kg, z.B. von etwa 10 bis etwa 75 mg/kg Körpergewicht pro Tag, wie beispielsweise 3 bis etwa 50 mg pro Kilogramm Körpergewicht des Empfängers pro Tag, vorzugsweise im Bereich von 6 bis 90 mg/kg/Tag, insbesondere im Bereich von 15 bis 60 mg/kg/Tag.
  • Die Verbindung wird geeigneterweise in Dosiseinheitsform verabreicht, die beispielsweise 5 bis 1000 mg, geeigneterweise 10 bis 750 mg, ganz besonders geeignet 50 bis 500 mg des aktiven Inhaltsstoffes pro Dosiseinheitsform enthält.
  • Idealerweise sollte der aktiven Inhaltsstoff so verabreicht werden, dass Plasmakonzentrationshöchstwerte der aktiven Verbindung von etwa 0,5 bis etwa 75 μM, vorzugsweise etwa 1 bis 50 μM, besonders bevorzugt etwa 2 bis 30 μM erreicht werden. Dies kann beispielsweise erreicht werden durch intravenöse Injektion einer 0,05%igen bis 5%igen Lösung des aktiven Inhaltsstoffes, gegebenenfalls in Kochsalzlösung, oder orale Verabreichung als Bolus, der etwa 1–100 mg des aktiven Inhaltsstoffes enthält.
  • Wünschenswerte Konzentrationen im Blut können aufrecht erhalten werden durch kontinuierliche Infusion, die etwa 0,01–5,0 mg/kg/h bereitstellen, oder durch Infusionen mit Unterbrechungen, die etwa 0,4–15 mg/kg des aktiven Inhaltstoffes (der aktiven Inhaltsstoffe) enthalten.
  • Die gewünschte Dosis kann geeigneterweise als einzelne Dosis vorliegen, oder als aufgeteilte Dosen, die in geeigneten Intervallen verabreicht werden, beispielsweise in zwei, drei, vier oder mehr Teildosen pro Tag. Die Teildosis selbst kann weiter aufgeteilt werden, z.B. in eine Anzahl einzelner, lose verteilter Verabreichungen, beispielsweise mehrere Inhalationen von einem Insufflator oder durch Auftragung einer Vielzahl von Tropfen auf das Auge.
  • Die nachfolgenden Beispiels sollen die Erfindung veranschaulichen, nicht dagegen beschränken.
  • Beispiele
  • Beispiel I – In vitro-biologische Aktivitäten und Spezifitäten auf menschlichen Brustkrebszellen
  • Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Inhibierung von Krebszellwachstum kann unter Verwendung hochmaligner menschlicher MDA-231-Brustkrebszellen gemessen werden, die HRG sekretieren. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass das Wachstum dieser Zellen durch neutralisierenden Antikörper blockiert werden kann (Lupu et al., Breast Cancer Res. & Treat. 1996, 38:57–66). SKOV-3-Zellen, die nicht auf HRG oder HRG-PE-Toxine reagieren, können als Negativkontrolle verwendet werden. Das HRG kann über dem Fachmann bekannte Techniken in MCF-7-Zellen transfiziert werden, siehe beispielsweise Tang et al., Cancer Res., Juli 1996.
  • Zellproliferationsassays – Die Fähigkeit erfindungsgemäßer Verbindungen zum Abtöten von Zellen kann direkt über einen Assay mit löslichem Tetrazolium/Formazan (XTT) gemessen werden, der dem Fachmann bekannt ist, siehe Alley et al., Cancer Res., 48:589–601, 1988. Daten für repräsentative erfindungsgemäße Verbindungen sind in 4 gezeigt.
  • Inhibierung der HRG-abhängigen Zellproliferation – Da die meisten menschlichen Krebszellen mehr als einen der erbB-Rezeptoren exprimieren und eine unterschiedliche Heterodimerisierung die Bindungsaffinität und/oder Internalisierung verändern könnte, ist es schwierig, die genaue Korrelation der Rezeptorexpression und der antagonistischen Aktivität der kleinen Moleküle zu definieren. Um diese Schwierigkeit zu überwinden, kann ein Modellsystem mit 32D-Zellen (murin, hämatopoetisch) verwendet werden, bei dem die 32D-Zellen mit erbB-4-Rezeptor transfiziert wurden. Wildtyp-32D-Zellen exprimieren keine erbB-Rezeptoren und hängen somit für das Überleben und die Proliferation nur von IL-3 ab (Ruggiero et al., FEBS, 291, 203, 1991). Mit erbB-4 transfizierte 32D-Zellen proliferieren in Gegenwart von HRG oder IL-3. Mit diesem Modellsystem aus 32D-Zellen können erfindungsgemäße Verbindungen auf ihre antagonistische Aktivität und Spezifität sowohl bei HRG-abhängigem als auch bei HRG-unabhängigem Wachstum untersucht werden. Aktive Verbindungen wie beispielsweise A1 inhibieren nur das HRG-abhängige Zellwachstum in 32D/erbB-4-Zellen, aber nicht IL-3-stimuliertes Wachstum in 32D- oder 32D/erbB-4-Zellen. Daten für repräsentative erfindungsgemäße Verbindungen sind in den 1 und 2 gezeigt.
  • Wie in 3 gezeigt, verringert die Zugabe eines Überschusses von Heregulin die antiproliferativen Wirkungen erfindungsgemäßer Verbindungen. Dies legt nahe, dass erfindungsgemäße Verbindungen Heregulin-Antagonisten sind.
  • Beispiel II – Koloniebildung in Weichagar
  • Der Weichagar-Koloniebildungsassay misst direkt das Tranformierungsvermögen eines Liganden und korreliert gut mit der in vivo-Tumorgenizität. Dieser Assay kann durchgeführt werden unter Anwendung von Vorgehensweisen, die den von Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 2237–2241, 1992, beschriebenen ähneln. Daten für repräsentative erfindungsgemäße Verbindungen sind in 5 gezeigt.
  • Beispiel III – Rezeptordimerisierungsassay und Kinaseaktivitätsassay (Tyrosinphosphorylierungsassay)
  • Die zugrundeliegenden Mechanismen, welche die Inhibierung der Dimerisierung oder die Inhibierung von Rezeptortyrosinkinaseaktivität beinhalten, können wie von Chen et al., J. Biol. Chem. 271:7620, 1996 beschrieben bei Brustkrebszellen untersucht werden.
  • Inhibierung der Rezeptorbindung – Um zu untersuchen, ob eine Verbindung die Bindung zwischen HRG und dessen Rezeptoren inhibieren kann, wurden Bindungsassays unter Verwendung von 125I-markierter EGF-Domäne von HRG-β1 (HED-β1) durchgeführt. Die Bindungsaffinität von Iod-markiertem HED-β1 in T47D- oder MDA-453-Zellen wurde zuvor bestimmt. Unmarkierte Verbindungen wurden mit dem radiomarkierten Liganden 2 Stunden bei 4°C co-inkubiert und die Zellen dreimal mit eiskaltem Bindungspuffer gewaschen. Die markierten Zellen wurden lysiert und in einem Gammazähler ausgezählt. Verbindungen, die mehr als 50% des markierten HED-β1 von den HRG-Rezeptoren verdrängten, wurden dann in dosisabhängiger Weise erneut untersucht.
  • Inhibierung HRG-induzierter Tyrosinphosphorylierung – Rekombinantes HRG-α1 und HRG-β1, die in T47D-Zellen eine Phosphorylierung in dosisabhängiger Weise über einen Bereich von 0,01 nM bis 1 uM induzieren, wurden hergestellt. Die Fähigkeit erfindungsgemäßer Verbindungen zur Blockierung HRG-induzierter Phosphorylierung wurde durch Co-Inkubation mit 10 nM HRG (maximale Induktion) untersucht, und die Ergebnisse mit der aktiven Verbindung A28 und den Verbindungen A1–A7 sind unten in „A" gezeigt. (Die Ergebnisse der mit weiteren Rifamycin-Analoga durchgeführten Inhibierungsstudien sind in den 6 und 7 gezeigt.)
  • Die dosisabhängige Inhibierung erfindungsgemäßer Verbindungen (A1 und A3) wurde in MDA-453-Zellen bestimmt, und die Spezifität wurde durch Inkubation mit der EGF und EGF-Rezeptor überexprimierenden Zelllinie (MDA-468) bestimmt. Wie unten in „B" und „C" gezeigt üben diese aktiven Verbindungen keine oder nur eine sehr geringe Wirkung auf den EGF-vermittelten Signalweg aus, was nahe legt, dass diese aktiven Verbindungen, anders als Herbimycin, vermutlich nicht als allgemeine Kinaseinhibitoren wirken (Satoh et al., J. Biol. Chem., 1992, 267(4):2537–41; Current Med. Chem., 167–194, 1996).
    Figure 00130001
    Fig. 3 Phosphorylierungsinhibierung.
    • A. T47D-Zellen, 100 uM cpds; B. MDA-453-Zellen C. MDA-453-Zellen mit EGF.HGR = 10 nM; EGF = 50 ng/ml
  • Beispiel IV – In vivo-Antitumoraktivitäten und Toxizitäten.
  • Tiertoxizitätsuntersuchungen können durchgeführt werden, um die Menge einer Verbindung zu bestimmen, die Tieren für therapeutische Untersuchungen verabreicht werden können. Gruppen von 4–5 weiblichen Nacktmäusen wurden i.v. über die Schwanzvene 100 μl ansteigender Mengen der Verbindung verabreicht. Der LD50 kann durch Verzeichnen der Dosen ermittelt werden, die den Tod bei 50% der Tiere hervorrufen. Einige Tiere können über H/E-Färbung auf Gewebetoxizität untersucht werden.
  • Untersuchungen zur in vivo-Antitumoraktivität können mit MDA-231-Nacktmaus-Heterotransplantaten oder HRG-transfizierten MCF-7-Zellen durchgeführt werden. Ein geeigneter Dosisplan und eine Behandlungsroute für eine Verbindung können bestimmt werden, wobei man mit der LD10-Dosis beginnt.
  • Die Erfindung wurde unter Bezugnahme auf verschiedene nicht-einschränkende spezifische und bevorzugte Ausführungsformen und Techniken beschrieben.

Claims (12)

  1. In vitro-Verfahren zur Antagonisierung der Wirkungen eines Heregulins oder des Rezeptors davon durch Inkontaktbringen des erwähnten Rezeptors mit einer wirksamen Menge einer Verbindung der Formel (I)
    Figure 00140001
    worin R1 für OH oder -CH2C(O)N((C1-C4)alkyl)2 steht; R2 für -CH=N-N(R7)(R8), -CH=NO((C1-C12)alkyl), -CH=NOCH(phenyl)2, -CH=NO(CH2)n-phenyl, -CH=N-NHR9, -CH=N-R10
    Figure 00140002
    steht; n für 1–6 steht; R3 und R4 jeweils unabhängig für H, (C1-C4)-Alkyl (vorzugsweise -CH3), Halogen, Halogen-(C1-C4)-alkyl oder (C5-C7)-Aryl, das gegebenenfalls 1–2 N, S oder nicht-peroxidische O umfasst und gegebenenfalls mit (C1-C4)-Alkyl oder Halogen substituiert ist, steht; R5 und R6 jeweils unabhängig für H, OH, -NH2, -C(O)OH oder -C(O)NH2 steht; R7 für H oder (C1-C4)-Alkyl steht; und R8 einen bi- oder tricyclischen Ring bedeutet, wobei der Ring 7–10 Kohlenstoffatome umfasst (vorzugsweise Adamantan), gegebenenfalls ein oder mehrere (z.B. 1–4) Heteroatome umfasst, die ausgewählt sind unter S, N oder nicht-peroxidischem O, wobei der Ring gegebenenfalls mit (C1-C4)-Alkyl, Halogen oder Halogen-(C1-C4)-alkyl substituiert ist; oder R7 und R8 zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 10–20 Kohlenstoffatome (vorzugsweise 17) umfassenden Ring bilden, der gegebenenfalls ein oder mehrere (z.B. 1–4) Heteroatome umfasst, die ausgewählt sind unter S, N oder nicht-peroxidischem O, wobei der Ring gegebenenfalls mit (C1-C4)-Alkyl, Halogen oder Halogen-(C1-C4)-alkyl substituiert ist; R9 für (C1-C4)-Alkyl, einen Peptidylrest einer natürlich vorkommenden Aminosäure oder ein Di-, Tri- oder Tetrapeptid steht; und R10 für einen Piperazin-1-yl-Ring steht, der gegebenenfalls an einem Kohlenstoffatom mit einem oder zwei Substituenten substituiert ist, die ausgewählt sind unter den für R3 und R4 angegebenen Bedeutungen und der gegebenenfalls in der 4-Position mit einer Gruppe R11 substituiert ist, wobei R11 für (C1-C4)-Alkyl, Phenyl, Benzyl, einen Peptidylrest einer natürlich vorkommenden Aminosäure oder ein Di-, Tri- oder Tetrapeptid steht, oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon; wobei die erwähnte Menge zur Antagonisierung der Wirkungen eines Heregulins oder des Rezeptors davon wirksam ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei R2 für -CH=N-N(R7)(R8) oder -CH=NO(CH2)n-phenyl steht.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei R2 für -CH=N-NHR9 steht.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei R1 für OH steht.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei R2 für
    Figure 00150001
    steht.
  6. Verwendung einer Verbindung der Formel I
    Figure 00160001
    worin R1 für OH oder -CH2C(O)N((C1-C4)alkyl)2 steht; R2 für -CH=N-N(R7)(R8), -CH=NO((C1-C12)alkyl), -CH=NOCH(phenyl)2, -CH=NO(CH2)n-phenyl, -CH=N-NHR9, -CH=N-R10
    Figure 00160002
    steht; n für 1–6 steht; R3 und R4 jeweils unabhängig für H, (C1-C4)-Alkyl (vorzugsweise -CH3), Halogen, Halogen-(C1-C4)-alkyl oder (C5-C7)-Aryl, das gegebenenfalls 1–2 N, S oder nicht-peroxidische O umfasst und gegebenenfalls mit (C1-C4)-Alkyl oder Halogen substituiert ist, steht; R5 und R6 jeweils unabhängig für H, OH, -NH2, -C(O)OH oder -C(O)NH2 steht; R7 für H oder (C1-C4)-Alkyl steht; und R8 einen bi- oder tricyclischen Ring bedeutet, wobei der Ring 7–10 Kohlenstoffatome umfasst (vorzugsweise Adamantan), gegebenenfalls ein oder mehrere (z.B. 1–4) Heteroatome umfasst, die ausgewählt sind unter S, N oder nicht- peroxidischem O, wobei der Ring gegebenenfalls mit (C1-C4)-Alkyl, Halogen oder Halogen-(C1-C4)-alkyl substituiert ist; oder R7 und R8 zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 10–20 Kohlenstoffatome (vorzugsweise 17) umfassenden Ring bilden, der gegebenenfalls ein oder mehrere (z.B. 1–4) Heteroatome umfasst, die ausgewählt sind unter S, N oder nicht-peroxidischem O, wobei der Ring gegebenenfalls mit (C1-C4)-Alkyl, Halogen oder Halogen-(C1-C4)-alkyl substituiert ist; R9 für (C1-C4)-Alkyl, einen Peptidylrest einer natürlich vorkommenden Aminosäure oder ein Di-, Tri- oder Tetrapeptid steht; und R10 für einen Piperazin-1-yl-Ring steht, der gegebenenfalls an einem Kohlenstoffatom mit einem oder zwei Substituenten substituiert ist, die ausgewählt sind unter den für R3 und R4 angegebenen Bedeutungen und der gegebenenfalls in der 4-Position mit einer Gruppe R11 substituiert ist, wobei R11 für (C1-C4)-Alkyl, Phenyl, Benzyl, einen Peptidylrest einer natürlich vorkommenden Aminosäure oder ein Di-, Tri- oder Tetrapeptid steht, oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon; zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung oder eines Zustands, bei der oder bei dem Zellsignalübermittlung durch Heregulin oder dessen Rezeptor(en) beteiligt ist.
  7. Verwendung einer Verbindung nach Formel I
    Figure 00170001
    worin R1 für OH oder -CH2C(O)N((C1-C4)alkyl)2 steht; R2 für -CH=N-N(R7)(R8), -CH=NO((C1-C12)alkyl), -CH=NOCH(phenyl)2, -CH=NO(CH2)n-phenyl, -CH=N-NHR9, -CH=N-R10
    Figure 00180001
    steht; n für 1–6 steht; R3 und R4 jeweils unabhängig für H, (C1-C4)-Alkyl (vorzugsweise -CH3), Halogen, Halogen-(C1-C4)-alkyl oder (C5-C7)-Aryl, das gegebenenfalls 1–2 N, S oder nicht-peroxidische O umfasst und gegebenenfalls mit (C1-C4)-Alkyl oder Halogen substituiert ist, steht; R5 und R6 jeweils. unabhängig für H, OH, -NH2, -C(O)OH oder -C(O)NH2 steht; R7 für H oder (C1-C4)-Alkyl steht; und R8 einen bi- oder tricyclischen Ring bedeutet, wobei der Ring 7–10 Kohlenstoffatome umfasst (vorzugsweise Adamantan), gegebenenfalls ein oder mehrere (z.B. 1–4) Heteroatome umfasst, die ausgewählt sind unter S, N oder nicht-peroxidischem O, wobei der Ring gegebenenfalls mit (C1-C4)-Alkyl, Halogen oder Halogen-(C1-C4)-alkyl substituiert ist; oder R7 und R8 zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 10–20 Kohlenstoffatome (vorzugsweise 17) umfassenden Ring bilden, der gegebenenfalls ein oder mehrere (z.B. 1–4) Heteroatome umfasst, die ausgewählt sind unter S, N oder nicht-peroxidischem O, wobei der Ring gegebenenfalls mit (C1-C4)-Alkyl, Halogen oder Halogen-(C1-C4)-alkyl substituiert ist; R9 für (C1-C4)-Alkyl, einen Peptidylrest einer natürlich vorkommenden Aminosäure oder ein Di-, Tri- oder Tetrapeptid steht; und R10 für einen Piperazin-1-yl-Ring steht, der gegebenenfalls an einem Kohlenstoffatom mit einem oder zwei Substituenten substituiert ist, die ausgewählt sind unter den für R3 und R4 angegebenen Bedeutungen und der gegebenenfalls in der 4-Position mit einer Gruppe R11 substituiert ist, wobei R11 für (C1-C4)-Alkyl, Phenyl, Benzyl, einen Peptidylrest einer natürlich vorkommenden Aminosäure oder ein Di-, Tri- oder Tetrapeptid steht, oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon; zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung des Krebszellwachstums in einem Säuger.
  8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei es sich bei den Krebszellen um Brustkrebszellen handelt.
  9. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei R2 für -CH=N-N(R7)(R8) oder -CH=NO(CH2)n-phenyl steht.
  10. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei R2 für -CH=N-NHR9 steht.
  11. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei R1 für OH steht.
  12. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei R2 für
    Figure 00190001
    steht.
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