DE69726003T2

DE69726003T2 - Immunglobulin-superfamilie domainen und fragmente mit erhöhter löslichkeit

Info

Publication number: DE69726003T2
Application number: DE69726003T
Authority: DE
Inventors: Andreas Plückthun; Lars Nieba; Annemarie Honegger
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-07-16
Filing date: 1997-07-16
Publication date: 2004-08-26
Anticipated expiration: 2017-07-17
Also published as: WO1998002462A1; DE69726003D1; ATE253593T1; EP0938506A1; CA2267620A1; JP2000516452A; EP0938506B1; US6815540B1

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Modifikation von Immunglobulin-Superfamilie (IgSF)-Domänen und Derivaten davon, um ihre Löslichkeit und somit die Ausbeute zu erhöhen und die Handhabung zu vereinfachen.
Stand der Technik
Kleine Antikörperfragmente zeigen sehr vielversprechende Eigenschaften für die Verwendung als Arzneimittel, Diagnostika und in der biochemischen Forschung. Deshalb sind sie in großen Mengen erforderlich, wobei zurzeit in zahlreichen Laboratorien routinemäßig die Expression von Antikörperfragmenten, z. B. Fv, Einzelketten-Fv (scFv) oder Fab, im Periplasma von E. coli eingesetzt wird (Skerra und Plückthun, 1988; Better et al., 1988). Die Ausbeuten solcher Expressionen unterliegen jedoch starken Schwankungen, insbesondere im Fall der scFvs. Während einige Fragmente bis zu mehreren mg eines funktionellen löslichen Proteins pro Liter und OD der Kulturbrühe in Schüttelkolbenkultur ergeben (Carter et al., 1992; Plückthun et al., 1996), können andere Fragmente fast ausschließlich zu einem unlöslichen Material führen, das häufig in sogenannten Einschlusskörpern vorliegt. Aus diesen lässt sich ein funktionelles Protein erst durch einen arbeits- und zeitaufwändigen Umfaltungsprozess in bescheidenen Ausbeuten gewinnen. Die Faktoren, welche die Expressionsraten der Antikörper beeinflussen, sind bisher noch wenig aufgeklärt. Die Faltungseffizienz und Stabilität der Antikörperfragmente, die Empfindlichkeit gegenüber Protease und die Toxizität der exprimierten Proteine für die Wirtszellen schränken häufig die tatsächlichen Produktionsraten stark ein, wobei schon verschiedene Versuche unternommen wurden, die Ausbeuten der Expression zu steigern. Z. B. haben Knappik und Plückthun (1995) in der Gerüstregion von Antikörpern Schlüsselreste identifiziert, welche die Expressionsausbeuten entscheidend beeinflussen. Genauso fanden Ullrich et al. (1995), dass Punktmutationen in den CDRs die Ausbeuten einer periplasmatischen Expression von Antikörperfragmenten steigern können. Jedoch lassen sich diese Strategien nur auf einige wenige Antikörper anwenden.
Die Beobachtungen von Knappik und Plückthun (1995) zeigen, dass durch ein Optimieren derjenigen Teile des Antikörperfragments, die nicht direkt an der Antigenerkennung beteiligt sind, die Faltungseigenschaften und Produktionsausbeuten rekombinanter Fv- und scFv-Konstrukte signifikant verbessert werden können. Die Ursachen für das verbesserte Expressionsverhalten liegen in dem abgeschwächten Aggregationsverhasten dieser Moleküle. Bei anderen Molekülen wird kann auch die Stabilität des Fragments und seine Widerstandsfähigkeit gegenüber Protease beeinflusst werden. Das Wissen, auf welche Weise spezifische Sequenzmodifikationen diese Eigenschaften verändern, ist bisher noch sehr begrenzt, zurzeit wird dieses Gebiet intensiv erforscht.
Beim Exprimieren und Manipulieren von Proteindomänen kann es zu Schwierigkeiten kommen, da Aminosäuren, die normalerweise innerhalb der Proteinstruktur eingebettet sind, in dem Fall exponiert werden, wenn nur ein Teil des ganzen Moleküls exprimiert wird. Es kann zu einer Aggregation kommen, und zwar aufgrund einer Wechselwirkung der jetzt gegenüber dem Lösungsmittel exponierten hydrophoben Resten, die ursprünglich die Kontaktregionen zwischen benachbarten Regionen bildeten. Leistler und Perham (1994) konnten zeigen, dass eine bestimmte Domäne der Glutathion-Reduktase getrennt von ihren benachbarten Domänen exprimiert werden kann, wobei das Protein jedoch in vitro eine unspezifische Assoziation zeigte, wodurch multimere Proteineinheiten erzeugt wurden. Durch die Einführung von hydrophilen Resten anstelle von exponierten hydrophoben Aminosäuren konnte diese Tendenz zur Aggregation abgeschwächt und auf diese Weise die isolierte Domäne stabilisiert werden. Sowohl Wildtyp- als auch modifizierte Domänen wurden ausschließlich in Einschlusskörpern gefunden und mussten neu gefaltet werden. Obwohl in vitro-Experimente viel dazu beigetragen haben, verschiedene intermolekulare Wechselwirkungen zu definieren, welche die Faltungsprozesse steuern, haben sie nur einen begrenzten Wert, wenn das Faltungsverhalten von unterschiedlichen Polypeptidketten in vivo vorausgesagt werden soll (Gething und Ambrook, 1992). Somit bieten Leistler und Perham keine Anleitung oder keinen Hinweis darauf, wie die Expressionsausbeuten von löslichen Proteindomänen gesteigert werden können.
Bei den Antikörpern dimerisieren zwei Ketten, die mehrere Domänen enthalten, wobei jede Domäne aus einem β-Fass besteht, deren zwei β-Faltblätter durch eine Disulfidbindung zusammengehalten werden, wodurch die sogenannte Immunglobulinfaltung („immunoglobulin fold") entsteht. Zwei Domänen, eine variable Domäne (VL) und eine konstante Domäne (CL), liegen entlang der Längsachse in der leichten Kette (VL-CL) nebeneinander, und vier Domänen, eine variable Domäne (VH) und drei konstante Domänen (CH1 bis CH3) liegen entlang der Längsachse der schweren Kette nebeneinander (VH-CH1-CH2-CH3). Im Dimer, das durch die Ketten a und b gebildet wird, lagern sich jeweils zwei solche Domänen seitlich aneinander: VL_a an VH_a, CL_a an CH1_a, VL_b an VH_b, CL_b an CH1_b, CH2_a an CH2_b und CH3_a an CH3_b. In WO 92/01787 (Johnson et al., 1992) wird beschrieben, dass isolierte einzelne Domänen, z. B. VH, in der ehemaligen VL/VH-Grenzflächen-Region durch Austauschen hydrophober Reste durch hydrophile Reste modifiziert werden können, ohne dass die Spezifität der Eltern-Domäne verändert wird. Die Grundlage für WO 92/01787 bestand in der Vermutung, dass exponierte hydrophobe Reste möglicherweise zu einer unspezifischen Bindung, einer Wechselwirkung mit Oberflächen und zu einer verminderten Stabilität führen könnten. Hierbei wurde eine Erhöhung der Bindungsspezifität deutlich gemacht, eine Zunahme der Expressionsrate konnte jedoch nicht gezeigt werden. Außerdem wäre es nicht möglich, WO 92/01787 auf ein Antikörperfragment anzuwenden, das die vollständige Antigen-Bindungsstelle enthält, da diese VL und VH enthalten muss.
Bei den T-Zell-Rezeptoren dimerisieren zwei Ketten (α und β), die jeweils aus einer variablen (V) und einer konstanten (C) Domäne mit der Immunglobulinfaltung und aus einer Transmembrandomäne bestehen. In jeder Kette liegen die variablen und konstanten Domänen entlang der Längsachse in den Ketten nebeneinander (Vα-Cα; Vβ-Cβ) und lagern sich seitlich an die entsprechenden Domänen der zweiten Kette an (Vα-Vβ; Cα-Cβ).
Verschiedene andere Moleküle der Immunglobulin-Superfamilie, wie CD2, CD4, CD16, CD22, umfassen nur eine Kette, in der zwei oder mehrere Domänen (variable und/oder konstante) mit der Immunglobulinfaltung entlang der Längsachse in den Ketten nebeneinander liegen.
Die Erfinder fanden, dass die Probleme bei der Expression größtenteils mit einem Teil des Moleküls zusammenhängen, der bisher bei Expressionsstudien nicht als relevant angesehen wurde und der die Grenzfläche zwischen benachbarten Domänen innerhalb einer Immunglobulinkette umfasst. Dieses erstaunliche Ergebnis bildet die Grundlage der vorliegenden Erfindung, die eine allgemeine Lösung der Probleme bereitstellt, welche mit der Produktion von Domänen oder Fragmenten der Immunglobulin-Superfamilie (IgSF) zusammenhängen, insbesondere von Antikörperfragmenten, die eine geringe Löslichkeit oder reduzierte Expressionsraten aufweisen.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen seitlichen Wechselwirkungen zwischen Domänen unterschiedlicher Ketten gibt es gut dokumentierte Kontakte zwischen den innerhalb einzelner Ketten entlang der Längsachse nebeneinander liegenden Domänen. Z. B. steht im Fall eines Antikörpers (Lesk und Chothia, 1988) das „untere Ende" von VL mit dem „oberen Ende" von CL in Kontakt, und in ähnlicher Weise gibt es Kontakte zwischen VH und CH1. Die Kontakte an diesen Inter-Domänen-Grenzflächen sind möglicherweise essentiell für die kompakte Anordnung des Fab-Fragments und sind, wie es für solche Kontakte typisch ist, zumindest teilweise von hydrophober Natur (Lesk und Chothia, 1988).
Die Grundlage der vorliegenden Erfindung besteht in der erstaunlichen Entdeckung, dass die Löslichkeit (und somit die Ausbeute) von Antikörperfragmenten, die mindestens eine Domäne umfassen, entscheidend erhöht werden kann, indem die Hydrophobie der früheren Grenzflächen am „Ende" der Domäne verringert wird, wo sie innerhalb einer Kette in einem größeren Antikörperfragment oder in einem vollständigen Antikörper normalerweise an eine zweite Domäne angrenzen würde. Dies ist erstaunlich und hätte aus dem Wissen nach dem Stand der Technik nicht vorausgesagt werden können (WO 92/01787), da die Größe der longitudinalen Grenzfläche, z. B. in einem scFv-Fragment, viel kleiner ist als die zwischen VH und VL, und deshalb stellen die Aminosäuren, die die Grenzflächen zwischen VH und CH1 oder zwischen VL und CL in einem Fab-Fragment ausmachen, einen viel kleineren Teil des gesamten Oberflächenbereichs des scFv-Moleküls dar, weshalb man davon ausgehen konnte, dass sie bei der Festlegung der physikalischen Eigenschaften des Moleküls eine weniger wichtige Rolle spielen.
Die vorliegende Erfindung hat den zusätzlichen Vorteil, dass es unwahrscheinlich ist, dass die Anwendung der Erfindung eine nachteilige Wirkung auf die Bindungseigenschaften des Moleküls ausübt, da die im Molekül bewirkten Veränderungen, die zu der verringerten Hydrophobie der früheren Grenzflächen führen, in dem Teil der Domäne liegen, der von den CDRs am weitesten entfernt ist. Dies ist in WO 92/01787 nicht der Fall, in dem mindestens eine Modifikation in der Nähe der CDRs liegt, weshalb man davon ausgehen kann, dass sie eine Wirkung auf die Antigenbindung hat. Außerdem kann WO 92/01787 nicht auf VL/VH-Heterodimere wie vorstehend beschrieben angewendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine modifizierte Immunglobulin-Superfamilie (IgSF)-Domäne oder ein modifiziertes Immunglobulin-Superfamilie (IgSF)-Fragment, die/das sich von einer Eltern-IgSF-Domäne oder einem Eltern-IgSF-Fragment dadurch unterscheidet, dass die Region, die die Grenzfläche mit einer zweiten Domäne umfasste oder umfassen würde, die innerhalb der Proteinkette eines größeren IgSF-Fragments oder eines vollständigen IgSF-Proteins an die Eltern-IgSF-Domäne oder das Eltern-IgSF-Fragment angrenzt und die in Abwesenheit dieser zweiten Domäne in der Eltern-IgSF-Domäne oder dem Eltern-IgSF-Fragment exponiert ist, durch eine Modifikation hydrophiler gemacht wird.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff Immunglobulin-Superfamilie (IgSF)-Domäne auf die Teile von Mitgliedern der lmmunblobulin-Superfamilie, die durch die Immunglobulinfaltung gekennzeichnet sind, wobei die Superfamilie die Immunglobuline oder Antikörper und verschiedene andere Proteine, wie T-Zell-Rezeptoren oder Integrine, umfasst. Der Begriff IgSF-Fragment bezieht sich auf einen beliebigen Teil eines Mitglieds der Immunglobulin-Superfamilie, wobei der Teil mindestens eine IgSF-Domäne umfasst. Der Begriff angrenzende Domäne bezieht sich auf eine Domäne, die an eine erste Domäne grenzt. Der Begriff Grenzfläche bezieht sich auf eine Region der ersten Domäne, in der eine Wechselwirkung mit der angrenzenden Domäne stattfindet. Die Begriffe hydrophob und hydrophil beziehen sich auf eine physikalische Eigenschaft von Aminosäuren, die quantitativ bestimmt werden kann, wobei Tabellen mit Hydrophobie-Werten für die 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren verfügbar sind (Nozaki und Tanford, 1971; Casari und Sippl, 1992; Rose und Wolfenden, 1993).
Die Reste, die modifiziert werden sollen, können durch verschiedene Verfahren identifiziert werden. In einem Verfahren wird z. B. jeweils die Lösungsmittel-Zugänglichkeit (Lee und Richards, 1971) von hydrophoben Grenzflächen-Resten in dem Eltern-IgSF-Fragment im Vergleich zu dem größeren IgSF-Fragment oder zu dem vollständigen IgSF-Protein berechnet, wobei eine hohe Zugänglichkeit einen stark exponierten Rest anzeigt. In einem zweiten Verfahren wird die Zahl der Van-der-Waals-Kontakte von hydrophoben Grenzflächen-Resten in dem größeren IgSF-Fragment oder in dem vollständigen IgSF-Protein berechnet. Eine große Zahl für einen Rest der Eltern-Domäne gibt an, dass er in Abwesenheit einer angrenzenden Domäne stark Lösungsmittel-exponiert sein wird. Es gibt noch andere Verfahren zur Berechnung oder Bestimmung der Reste, die gemäß der vorliegenden Erfindung modifiziert werden sollen, wobei ein Fachmann diese Verfahren auswählen und durchführen kann.
Indem man Computermodelle dieses Eltern-IgSF-Fragments analysiert, kann man Wechselwirkungen dieser stark exponierten Reste innerhalb des Fragments feststellen. Das Eltern-IgSF-Fragment könnte durch solche Wechselwirkungen stabilisiert werden. Reste, die mit anderen hydrophoben Resten eng interagieren und die durch den Fachmann identifiziert werden können, sollten nicht vorzugsweise mutiert werden.
Die vorstehend angesprochene Modifikation kann durch verschiedene Verfahren erreicht werden, die dem Fachmann bekannt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Modifikation aus einer Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren in der exponierten Grenzfläche, die wie vorstehend beschrieben identifiziert wurden, mit Aminosäuren, die hydrophiler sind. Andererseits kann/können eine oder mehrere Aminosäuren in der Grenzfläche eingefügt werden, oder eine oder mehrere Aminosäuren kann/können aus der Grenzfläche deletiert werden, so dass ihre Hydrophilie insgesamt gesteigert wird. Außerdem kann eine beliebige Kombination von Substitution, Insertion und Deletion durchgeführt werden, um die Hydrophobie der Grenzfläche zu reduzieren. Auch ist in der vorliegenden Erfindung die Möglichkeit enthalten, dass die Substitution oder Insertion Aminosäuren mit einem relativ hohen Hydrophobie-Wert umfasst oder dass die Deletion Aminosäuren mit einem relativ niedrigen Hydrophobie-Wert umfasst, so lange der Gesamthydrophilie-Wert in der Grenzflächen-Region erhöht wird. Modifikationen, wie Substitution, Insertion und Deletion, können anhand von Standardverfahren durchgeführt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Z. B. kann der Fachmann entweder eine positionsgerichtete oder eine auf PCR basierende Mutagenese (Ho et al., 1989; Kunkel et al., 1991; Trower, 1994; Viville, 1994) oder eine Gesamt-Gen-Synthese einsetzen (Prodromou und Pearl, 1992), um die notwendige(n) Modifikationen) durchzuführen. In einer weiteren Ausführungsform können die Mutationen durch Zufallsmutagenese und Durchmustern der zufälligen Mutanten erhalten werden, wobei ein geeignetes Expressions- und Durchmusterungssystem verwendet wird (vgl. z. B. Stemmer, 1994; Crameri et al., 1996).
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst (umfassen) die Aminosäure(n), die die hydrophoberen Aminosäuren ersetzt (ersetzen), Asn, Asp, Arg, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Ser und Thr. Diese zählen zu den hydrophileren der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren und haben sich in der Anwendung der vorliegenden Erfindung als besonders wirksam erwiesen. Diese Aminosäuren, und zwar alleine, in Kombination miteinander oder in Kombination mit anderen Aminosäuren, können auch eingesetzt werden, um die vorstehend erwähnte Insertion zu erzeugen, welche die Grenzflächen-Region hydrophiler macht.
Die Eltern-IgSF-Domäne oder das Eltern-IgSF-Fragment, die/das vorstehend angesprochen wird, kann einer von mehreren unterschiedlichen Typen sein. In einer bevorzugten Ausführungsform stammt die Elterndomäne oder das Elternfragment von einem Antikörper. In einer Ausführungsform umfasst das Eltern-Antikörperfragment ein Fv-Fragment. In diesem Zusammenhang bezieht sich der Begriff Fv-Fragment auf einen Komplex, der VL- (variable leichte) und VH- (variable schwere) Teile des Antikörpermoleküls umfasst. In einer weiteren Ausführungsform kann das Eltern-Antikörperfragment ein Einzelketten-Fv-Fragment sein (scFv; Bird et al., 1988; Huston et al., 1988), in dem die VL- und VH-Ketten, entweder in einer VL-VH- oder in einer VH-VL-Orientierung, durch einen Peptidlinker verbunden sind. In einer weiteren Ausführungsform kann das Eltern-Antikörperfragment ein Fv-Fragment sein, das durch eine Inter-Domänen-Disulfidbindung stabilisiert ist. Dies ist eine Struktur, die hergestellt werden kann, indem in jede Kette ein einzelner Cysteinrest eingefügt wird, wobei diese Cysteinreste aus zwei Ketten durch Oxidation miteinander verbunden werden, so dass ein Disulfid erzeugt wird (Glockshuber et al., 1990; Brinkmann et al., 1993).
In einer am stärksten bevorzugen Ausführungsform umfasst die Grenzflächen-Region der variablen Domänen wie vorstehend erwähnt die Reste 9, 10, 12, 15, 39, 40, 41, 80, 81, 83, 103, 105, 106, 106A, 107, 108 für VL und die Reste 9, 10, 11, 13, 14, 41, 42, 43, 84, 87, 89, 105, 108, 110, 112, 113 für VH, gemäß dem Kabat-Numerierungssystem (Kabat et al., 1991). Dieses Numerierungssystem wurde für die Sequenzen von ganzen Antikörpern aufgestellt, kann jedoch entsprechend angepasst werden, so dass die Sequenzen von isolierten Antikörperdomänen oder Antikörperfragmenten beschrieben werden, auch im Fall von scFv-Fragmenten, in denen VL und VH über einen Peptidlinker verbunden sind und in denen die Proteinsequenz vom N- zum C-Terminus anders numeriert werden muss. Dies bedeutet, dass das Kabat-Numerierungssystem in der vorliegenden Erfindung als eine Beschreibung der Sequenzen eingesetzt wird, bezogen auf die vorliegenden Daten über Antikörpersequenzen, und nicht als eine absolute Beschreibung der tatsächlichen Positionen innerhalb der Sequenzen der Antikörpertragmente von Interesse.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Eltern-Antikörperfragment ein Fab-Fragment. In diesem Zusammenhang bezieht sich der Begriff Fab auf einen Komplex, der die Teile VL-CL (variabler und konstanter leichter) und VH-CH1 (variabler und erster konstanter schwerer) des Antikörpermoleküls umfasst, und der Begriff Grenzflächen-Region bezieht sich auf eine Region in der ersten konstanten Domäne der schweren Kette (CH1), die in einem größeren Antikörperfragment oder in einem vollständigen Antikörper an die CH2-Domäne angrenzt oder angrenzen würde.
In einer weiteren Ausführungsform ist das Eltern-IgSF-Fragment ein Fusionsprotein aus einer beliebigen der angesprochenen Domänen oder Fragmente und einer anderen Proteindomäne, die von einem Antikörper oder einem beliebigen anderen Protein oder Peptid stammt. Durch Einführung der bakteriellen Expression von Antikörperfragmenten wurde die Möglichkeit zur Konstruktion von Proteinen geschaffen, die Fusionen zwischen Antikörperfragmenten und anderen Molekülen umfassen. Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft solche Fusionsproteine, wobei eine DNA-Sequenz bereitgestellt wird, die sowohl die modifizierte IgSF-Domäne oder das modifizierte IgSF-Fragment wie vorstehend beschrieben als auch eine zusätzliche Einheit codiert. Besonders bevorzugt sind Einheiten, die eine nützliche therapeutische Funktion aufweisen. Z. B. kann die zusätzliche Einheit ein Toxinmolekül sein, das in der Lage ist, Zellen abzutöten (Vitetta et al., 1993). Es gibt zahlreiche Beispiele solcher Toxine, die dem Fachmann bekannt sind, z. B. die bakteriellen Toxine Pseudomonas-Exotoxin-A und Diphtheria-Toxin, außerdem die Pflanzentoxine Ricin, Abrin, Modeccin, Saporin und Gelonin. Durch Fusionieren eines solchen Toxins mit einem Antikörperfragment kann das Toxin z. B. zu erkrankten Zellen hingesteuert werden und auf diese Weise eine günstige therapeutische Wirkung ausüben. Andererseits kann die zusätzliche Einheit ein Cytokin sein, z. B. IL-2 (Rosenberg und Lotze, 1986), das eine bestimmte Wirkung (in diesem Fall eine T-Zell-proliferative Wirkung) auf eine Zellfamilie ausübt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die zusätzliche Einheit mindestens ein Teil eines Oberflächenproteins, weiches das Fusionsprotein zu der Oberfläche eines Organismus, z. B. einer Zelle oder eines Phagen, hinsteuern kann, so dass es auf diese Weise den IgSF-Partner präsentiert. Vorzugsweise ist die zusätzliche Einheit mindestens ein Teil eines Hüllproteins von filamentösen Bakteriophagen, am stärksten bevorzugt des Gen-III-Proteins. In einer weiteren Ausführungsform kann die zusätzliche Einheit bewirken, dass ein IgSF-Partner auf diese Weise nachgewiesen und/oder gereinigt werden kann. Z. B. könnte das Fusionsprotein die modifizierte IgSF-Domäne oder das modifizierte IgSF-Fragment und ein Enzym umfassen, das gewöhnlich als Mittel zum Nachweis eingesetzt wird, wie die alkalische Phosphatase (Blake et al., 1984). Es gibt zahlreiche andere Einheiten, die als Markierungen zum Nachweis oder zur Reinigung verwendet werden können, die dem Fachmann bekannt sind. Besonders bevorzugt sind Peptide, die mindestens fünf Histidinreste umfassen (Hochuli et al., 1988), die in der Lage sind, an Metallionen zu binden, diese können somit zur Reinigung des Proteins, mit dem sie fusioniert sind, eingesetzt werden (Lindner et al., 1992). Außerdem werden durch die vorliegende Erfindung die folgenden zusätzlichen Einheiten bereitgestellt, z. B. die herkömmlich eingesetzten Markierungen c-myc und FLAG (Hopp et al., 1988; Knappik und Plückthun, 1994).
Durch die Herstellung einer oder mehrerer fusionierten zusätzlicher Domänen, können IgSF-Domänen oder IgSF-Fragmente zu größeren Molekülen zusammengebaut werden, die auch im Umfang der vorliegenden Erfindung liegen. Dadurch, dass die physikalischen Eigenschaften der IgSF-Domäne oder des IgSF-Fragments die Merkmale des zusammengebauten Produkts bestimmen, bietet die vorliegende Erfindung die Möglichkeit, die Löslichkeit solcher größeren Moleküle zu erhöhen. Z. B. sind Mini-Antikörper (Pack, 1994) Dimere, die zwei Antikörperfragmente umfassen, die jeweils mit einer selbst-assoziierenden Dimerisierungsdomäne fusioniert sind. Dimerisierungsdomänen, die besonders bevorzugt sind, umfassen diejenigen, die von einem Leucin-Zipper (Pack und Plückthun, 1992) oder einem Helix-Schleife-Helix-Motiv (Pack et al., 1993) hergeleitet sind.
Alle vorstehenden Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können anhand von Standardverfahren der Molekularbiologie durchgeführt werden, die dem Fachmann bekannt sind.
Die vorstehend beschriebenen Zusammensetzungen können verschiedenartig eingesetzt werden. Besonders bevorzugt sind diagnostische und therapeutische Zusammensetzungen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zum Herstellen der Zusammensetzungen und der darin enthaltenen Verbindungen wie vorstehend beschrieben bereit. Besonders bevorzugt ist ein Verfahren, das die folgenden Schritte umfasst:

i) Analysieren der Grenzflächen-Region einer IgSF-Domäne auf hydrophobe Reste, die Lösungsmittel-exponiert sind, unter Verwendung eines Verfahrens zur Bestimmung der Lösungsmittel-Zugänglichkeit (Lee und Richards, 1971), einer Analyse von Van-der-Waals-Wechselwirkungen in der Grenzflächen-Region oder ähnlicher Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind;
ii) Identifizieren eines oder mehrerer hydrophober Reste, die mit hydrophileren Reste substituiert werden sollen, oder einer oder mehrerer Positionen, an denen hydrophile Reste oder Aminosäurebereiche, welche die Gesamthydrophilie der Grenzflächen-Region erhöhen, in die Grenzflächen-Region eingefügt werden können, oder einer oder mehrerer Positionen, an denen hydrophobe Reste oder Aminosäurebereiche, welche die Gesamthydrophobie der Grenzflächen-Region erhöhen, aus der Grenzflächen-Region deletiert werden können, oder einer beliebigen Kombination dieser Substitutionen, Insertionen und Deletionen, so dass eine oder mehrere Mutanten der Eltern-IgSF-Domäne erhalten wird/werden;
iii) Herstellen einer DNA, die Mutanten der IgSF-Domäne codiert, die durch die in ii) identifizierten Veränderungen gekennzeichnet sind, unter Verwendung z. B. herkömmlicher Mutagenese- oder Gensyntheseverfahren, wobei die DNA entweder einzeln oder als ein Gemisch hergestellt wird;
iv) Einführen der DNA oder des DNA-Gemisches in ein Vektorsystem, das für die Expression der Mutanten geeignet ist;
v) Einführen des Vektorsystems in geeignete Wirtszellen und Expression der Mutante oder des Gemisches aus Mutanten;
vi) Identifizieren und Charakterisieren von Mutanten, die in größerer Ausbeute in löslicher Form erhalten werden; und
vii) wenn notwendig, Wiederholen der Schritte iii) bis vi), um die Hydrophilie der identifizierten Mutante oder Mutanten noch weiter zu erhöhen.

Der vorstehend angesprochene Wirt kann ein beliebiger Vertreter von verschiedenen, üblicherweise bei der Herstellung von heterologen Proteinen verwendeten Wirten sein, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf Bakterien, z. B. E. coli (Ge et al., 1995) oder Bacillus subtilis (Wu et al., 1993), Pilze, z. B. Hefen (Horwitz et al., 1988; Ridder et al., 1995) oder ein filamentöser Pilz (Nyyssönen et al., 1993), Pflanzenzellen (Hiatt, 1990; Hiatt und Ma, 1993; Whitelam et al., 1994), Insektenzellen (Potter et al., 1993; Ward et al., 1995) oder Säugerzellen (Trill et al., 1995).
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung einer IgSF-Domäne oder eines IgSF-Fragments der Erfindung, umfassend das Züchten einer Wirtszelle der Erfindung und das Isolieren der Domäne oder des Fragments.
Die Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele verdeutlicht, die lediglich zur Erläuterung angegeben sind und in keiner Weise den Umfang der Erfindung einschränken sollen.
Beispiele
i) Abkürzungen
Abkürzungen: CDR: „complementarity determining region" (hypervariable Region); dsFV: Disulfid-gekoppeltes Fv-Fragment; IMAC: Affinitäts-Chromatographie mit immobilisierten Metallionen; IPTG: Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid; i/s: Verhältnis unlöslich/löslich; H(X): Rest-Nummer X der schweren Kette; L(X): Rest-Nummer X der leichten Kette; NTA: Nitrilotriessigsäure; OD₅₅₀: optische Dichte bei 550 nm; PDB: Protein-Datenbank; scFv: Einzelketten-Fv-Fragment; SDS-PAGE: Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel-Eletkrophorese; v/c: variabel/konstant; wt: Wildtyp.
ii) Material und Methoden
(a) Berechnung der Lösungsmittel-Zugänglichkeit
Die Lösungsmittel-zugänglichen Oberflächenbereiche für 30 nicht redundante Fab-Fragmente und die aus diesen durch Deletieren der konstanten Domäne nach den Koordinaten aus dem PDB-File hergeleiteten Fv-Fragmente wurden unter Verwendung der letzten Version, d. h. vom März 1996, des Programms NACCESS berechnet (http://www.biochem.ucl.ac.uk/~roman/naccess/naccess), das auf dem von Lee und Richards (1971) beschriebenen Algorithmus beruht.
(b) Synthese des scFv-Gens
Das Einzelketten-Fv-Fragment (scFv) in der Orientierung VL-Linker-VH des Antikörpers 4-4-20 (Bedzyk et al., 1990) wurde durch Gensynthese erhalten (Prodromou und Pearl, 1992). Die VL-Domäne trägt eine drei Aminosäuren lange Markierung FLAG (Knappik und Piückthun, 1994). Wir verwendeten zwei unterschiedliche Linker mit einer Länge von 15 (Gly₄Ser)₃ bzw. 30 Aminosäuren (Gly₄Ser)₆. Das auf diese Weise erhaltene Gen wurde in ein Derivat des Vektors p1G6 cloniert (Ge et al., 1995). Die mutierten Antikörperfragmente wurden durch positionsgerichtete Mutagenese konstruiert (Kunkel et al., 1987), wobei eine einzelsträngige DNA und bis zu drei Oligonucleotide pro Reaktion eingesetzt wurden.
(c) Expression
Wachstumskurven wurden wie folgt erstellt: 20 ml eines 2xYT-Mediums, das 100 μg/ml Ampicillin und 25 μg/ml Streptomycin enthielt, wurden mit 250 μl einer Übernachtkultur von E. coli JM83, welches das Plasmid enthielt, das das entsprechende Antikörperfragment codierte, beimpft und bei 24,5°C so lange inkubiert, bis eine OD₅₅₀ von 0,5 erreicht war. Danach wurde IPTG (Biomol Feinchemikalien GmbH) bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben und die Inkubation weitere drei Stunden fortgesetzt. Die OD wurde jede Stunde gemessen, außerdem die β-Lactamase-Aktivität im Kulturüberstand, um das Ausmaß des Auslaufens der Zellen quantitativ zu bestimmen. Drei Stunden nach der Induktion wurde ein Aliquot der Kultur entnommen und die Zellen genauso lysiert, wie von Knappik und Plückthun (1995) beschrieben. Die β-Lactamase-Aktivität wurde im Überstand, in der unlöslichen und in der löslichen Fraktion gemessen. Die Fraktionen wurden durch reduzierende SDS-PAGE auf Antikörperfragmente getestet, wobei die Proben auf OD und β-Lactamase-Aktivität standardisiert wurden, um einem möglichen Verlust des Plasmids und außerdem einem Auslaufen der Zellen Rechnung zu tragen. Die Gele wurden geblottet und immungefärbt, wobei der FLAG-Antikörper M1 (Prickett et al., 1989) als der erste Antikörper und ein Fc-spezifisches Anti-Maus-Antiserum, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase (Pierce), als der zweite Antikörper in einem an anderer Stelle beschriebenen Chemolumineszenz-Nachweistest verwendet wurde (Ge et al., 1995).
(d) Reinigung
Mutierte scFv-Fragmente wurden durch ein Zwei-Säulen-Verfahren gereinigt. Nach Lyse der Zellen in einer French-Press wurden die E. coli-Rohextrakte zuerst durch IMAC laufen gelassen (Ni-NTA Superflow, Qiagen) (20 mM HEPES, 500 mM NaCl, pH 6,9; Stufengradient von Imidazol 10, 50, 200 mM) (Lindner et al., 1992) und nach Dialysieren des IMAC-Eluats gegen 20 mM MES, pH 6,0, schließlich durch eine Kationenaustausch-Chromatographie gereinigt (S-Sepharose, schnelllaufende Säule, Pharmacia) (20 mM MES, pH 6,0; Salzgradient 0 bis 500 mM NaCl). Die Reinheit wurde durch Coomassie-gefärbte SDS-PAGE kontrolliert. Die Funktionsfähigkeit des scFv wurde durch einen Kompetitions-ELISA getestet.
Aufgrund seiner sehr geringen Löslichkeit im periplasmatischen System wurde der wt 4-4-20 in dem auf T7 basierenden System als cytoplasmatische Einschlusskörper exprimiert (Studier und Moffatt, 1986; Ge et al., 1995). Die Umfaltungsprozedur wurde wie an anderer Stelle beschrieben durchgeführt (Ge et al., 1995). Zur Reinigung wurde die Umfaltungslösung (2 l) innerhalb von zehn Stunden ohne vorherige Dialyse auf eine Fluorescein-Affinitäts-Säule aufgetragen, worauf ein Waschschritt mit 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5, folgte. Zwei Säulenvolumina von 1 mM Fluorescein (Natriumsalz, Sigma Chemicals Co.), pH 7,5, wurden eingesetzt, um alle funktionellen scFv-Fragmente zu eluieren. Sodann war eine gründliche Dialyse erforderlich (sieben Tage mit zwölfmaligem Pufferwechsel), um das gesamte Fluorescein zu entfernen. Alle gereinigten scFv-Fragmente wurden in einer Gelfiltration getestet (Superose-12-Säule, Pharmacia SMART-System, 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5).
(e) Bestimmung des K_D-Werts durch Fluoreszenztitration
Die Konzentrationen der Proteine wurden photometrisch bestimmt, indem ein Extinktionskoeffizient verwendet wurde, der gemäß Gill und von Nippel (1989) berechnet worden war. Die Fluoreszenztitrations-Experimente wurden durchgeführt, indem die intensive Fluoreszenz von Fluorescein genutzt wurde. 2 ml von 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5, enthaltend 10 oder 20 nM Fluorescein, wurden in eine Küvette mit einem eingebauten Rührer gegeben. Die Anregungswellenlänge betrug 485 nm, die Emissionsspektren wurden von 490 bis 530 nm aufgenommen. Gereinigtes scFv (in 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5) wurde in Aliquots von 5 bis 100 μl zugegeben, sodann wurde nach einer Äquilibrierungszeit von drei Minuten ein Spektrum aufgenommen. Alle Spektren wurden bei 20°C aufgenommen. Das Maximum der Emission bei 510 nm wurde eingesetzt, um den Grad der Komplexierung von scFv an Fluorescein, die als Löschung zu sehen war, als eine Funktion der Konzentration des Antikörperfragments zu bestimmen. Der K_D-Wert wurde durch Scatchard-Analyse bestimmt.
(f) Messung der Gleichgewichtsdenaturierung
Die Gleichgewischtsdenaturierungs-Kurven wurden durch Denaturierung von 0,2 μM Protein in HEPES-gepufferter Kochsalzlösung (HBS)-Puffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) und zunehmenden Mengen Harnstoff (1,0 bis 7,5 M; 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4; Schritte zu 0,25 M) in einem Gesamtvolumen von 1,7 ml erhalten. Nach Inkubieren der Proben zwölf Stunden bei 10°C und weiteren drei Stunden bei 20°C vor den Messungen wurden die Fluoreszenzspektren bei 20°C von 320 bis 360 nm mit einer Anregungswellenlänge von 280 nm aufgenommen. Die Emissionswellenlänge des Fluoreszenzpeaks stieg während der Denaturierung von 341 auf 347 nm an und wurde verwendet, um die Fraktion der ungefalteten Moleküle zu bestimmen. Die Kurven wurden gemäß Pace (1990) erstellt.
(g) Thermische Denaturierung
Zur Messung der Raten der thermischen Denaturierung wurde das gereinigte scFv in 2 ml HBS-Puffer bis zu einer Endkonzentration von 0,5 μM gelöst. Die Aggregation erfolgte 2,5 Stunden bei 40°C und bei 44°C durch Lichtstreuung bei 400 nm.
iii) Ergebnisse
(a) Vergleich bekannter Antikörpersequenzen
Im Vergleich zu anderen Domäne/Domäne-Grenzflächen in Proteinen ist die Grenzfläche zwischen den variablen und konstanten Domänen von Immunglobulinen nicht sehr dicht gepackt. Ein Vergleich von 30 nicht-redundanten Fab-Strukturen in der PDB-Datenbank zeigte, dass zwischen der variablen und der konstanten Domäne der leichten Kette ein Bereich von 410 ± 90 Å² pro Domäne liegt, während die variablen und konstanten Domänen der schweren Kette über einen Bereich von 710 ± 180 Å² miteinander interagieren. Einige, jedoch nicht alle der Grenzflächen-Reste sind hydrophob, vorzugsweise aliphatisch. Im Allgemeinen ist die Sequenzkonservierung der Reste, die an der v/c-Domänen-Grenzfläche beteiligt sind, nicht besonders hoch. Trotzdem sticht die v/c-Domänen-Grenzfläche auf der Oberfläche eines Fv-Fragments als ein deutlicher hydrophober Bereich hervor (1).
Lösungsmittel-zugängliche Oberflächenbereiche für 30 nicht-redundante Fab-Fragmente und ihre entsprechenden Fv-Fragmente (hergeleitet aus dem Fab-Fragment durch Deletieren der konstanten Domäne nach den Koordinaten aus dem PDB-File) wurden anhand des Programms NACCESS berechnet (Lee und Richards, 1971). Die Reste, die an der v/c-Domänen-Grenzfläche beteiligt waren, wurden durch Vergleich des Lösungsmittel-zugänglichen Oberflächenbereichs jeder Aminosäuren-Seitenkette im Zusammenhang eines Fv-Fragments mit seiner zugänglichen Oberfläche im Zusammenhang eines Fab-Fragments identifiziert. 2 zeigt eine Darstellung der relativen Änderung der Zugänglichkeit der Seitenketten bei einer Deletion der konstanten Domänen als Funktion der Position in der Sequenz. Die Reste, die eine signifikante Reduktion der Zugänglichkeit der Seitenkette zeigen, sind in der Sequenzanordnung hervorgehoben. Um die Sequenzvariabilität in den in 2 identifizierten Positionen zu ermitteln, wurden die in der Kabat-Datenbank (Stand: März 1996) gesammelten Sequenzen der variablen Domänen analysiert (Tabelle 1). Von den 15 Grenzflächen-Resten, die in der VL-Domäne des Antikörpers 4-4-20 identifiziert wurden (1 und Tabelle 1), sind L9(leu), L12(pro), L15(leu), L40(pro), L83(leu) und L106(ile) hydrophob und stellen deshalb Kandidaten für einen Austausch dar. Von den 16 Grenzflächen-Resten in der VH-Domäne wurden H11(leu), H14(pro), H41(pro), H84(val), H87(met) und H89(ile) als mögliche Kandidaten für eine Substitution mit hydrophilen Resten in dem scFv-Fragment des Antikörpers 4-4-20 identifiziert (1 und Tabelle 1).
Jedoch stellen nicht alle diese hydrophoben Reste gleich gute Kandidaten für einen Austausch dar. Während die Reste, die in einer bestimmten Sequenz hydrophob, in vielen anderen Sequenzen jedoch hydrophil sind, vielleicht am attraktivsten erscheinen, wurden auch die konservierten hydrophoben Reste, die in Tabelle 1 aufgeführt sind, uniersucht, da der Evolutionsdruck, unter dem diese konservierten Reste beibehalten wurden, auf das Fab-Fragment innerhalb des gesamten Antikörpers wirkte, nicht jedoch auf den isolierten Fv-Teil. In dieser Studie ersetzten wir nicht die Prolinreste, da pro L40 und pro H41 die Haarnadelkurven im unteren Teil der Gerüstregion II bilden, während die konservierten Reste VL-cis-Prolin L8 und Prolin H9 und H14 die Gestalt der Gerüstregion I der variablen Domänen des Immunglobulins bestimmen.
Wenn man die Prolinreste ausschließt, bleiben die Reste L9 (leu in 4-4-20, ser in den meisten kappa-Ketten), L15 (leu, üblicherweise hydrophob), L83 (leu, üblicherweise val oder phe) und L106 (lle, wie in 86% aller kappa-Ketten) in der VL-Domäne und H11 (leu, wie in 60% aller schweren Ketten), H84 (val, in anderen VH-Domänen häufig ala oder ser), H87 (met, üblicherweise ser) und H89 (ile, meistens val) in VH als mögliche Kandidaten für einen Austausch im scFv-Fragment von 4-4-20.
(b) Mutationen im scFv von 4-4-20
Bei dem scFv-Fragment von 4-4-20 sind einige der entscheidenden Reste, die in der vorstehend beschriebenen Sequenzanalyse identifiziert wurden, bereits hydrophil, jedoch sind noch neun Reste von hydrophober Natur (einschließlich pro 12 in der leichten Kette) (Tabelle 1). Wir wählten drei Reste für eine nähere Analyse durch Mutationen aus.
Leu15 in VL ist in 98% aller kappa-Ketten eine hydrophobe Aminosäure (Tabelle 1). Leu11 ist in VH konserviert (Tabelle 1) und an den v/c-Inter-Domänen-Kontakten beteiligt (Lesk und Chothia, 1988). Im Gegensatz dazu tritt Valin an der Position H84 sehr selten auf; hauptsächlich werden an dieser Position Threonin oder Serin und Alanin gefunden (Tabelle 1). Wie aus 1 ersichtlich ist, trägt val84 zu einem großen hydrophoben Bereich an der neu exponierten Oberfläche von VH bei. Alle drei Positionen wurden zu sauren Resten mutiert, und außerdem wurde L11 zu Asparagin geändert (Tabelle 2).
Das scFv-Fragment wurde mit zwei unterschiedlichen Linkern getestet und exprimiert, dem 15-Mer-Linker (Gly₄Ser)₃ (Huston et al., 1995) und dem gleichen Motiv, das auf 30 Aminosäuren erweitert worden war (Gly₄Ser)₆. Alle Mutationen wurden in beiden Konstrukten getestet. Die in vivo-Ergebnisse der Wirkung der unterschiedlichen Mutationen auf die Löslichkeit waren identisch, weshalb nur die Ergebnisse des 30-Mer-Linkers ausführlicher beschrieben werden. Die Experimente mit der periplasmatischen Expression erfolgten bei 24,5°C, und alle Konstrukte wurden durch Immunblotting auf lösliches und unlösliches Protein getestet. Für jede Mutante wurde das Verhältnis von unlöslichem zu löslichem (i/s) Protein bestimmt. In 3A bis D sind unlösliche (Bahn 1) und lösliche (Bahn 2) Fraktionen des wt scFv dargestellt. Bei der periplasmatischen Expression tritt nahezu kein lösliches Material auf, dies stimmt mit früheren Berichten von Bedzyk et al. (1990) und Denzin et al. (1991) überein, die schon damals beschrieben, dass die periplasmatische Expression des wt scFv hauptsächlich zu periplasmatischen Einschlusskörpern führt.
Die einzelne Punktmutation L15E in VL (Flu1) zeigt keine Wirkung auf das Verhältnis i/s, wenn man sie mit dem wt vergleicht (3A, Bahn 3, 4). Die Mutation von leu an der Position 11 in der schweren Kette zu Asparagin (Flu2) zeigt auch praktisch keine Wirkung im Vergleich zum wt, während die Substitution mit Asparaginsäure (Flu3) das Verhältnis i/s zu mehr löslichem Protein hin verändert, wobei diese Wirkung jedoch immer noch nicht sehr entscheidend ist. Im Gegensatz dazu hatte die Punktmutation an der Position 84 (Flu4, 3B, Bahn 3, 4, und 3D, Bahn 3, 4) einen entscheidenden Einfluss auf die Löslichkeit des scFv-Fragments des Antikörpers 4-4-20. Das Verhältnis i/s wird auf etwa 1 : 1 verändert, dies führt im Vergleich zum wt zu einem 25-fachen Anstieg des löslichen Proteins.
Die Kombination von V84D mit L11N oder L11D (Flu5, Flu6) verändert auch das Verhältnis i/s im Vergleich zum wt, wobei dieses Verhältnis jedoch im Vergleich zu V84D alleine nicht weiter verbessert wird (3B). Interessanterweise führt die Kombination von Flu5 mit der Mutation der leichten Kette an Position 15 (Flu9) zu einem weniger löslichen Material (3C, Bahn 7, 8) als Flu5 selbst (3B, Bahn 5, 6). Der negative Einfluss der Mutationen L15E ist auch in Flu8 (3C, Bahn 5, 6) im Vergleich mit Flu3 zu sehen (3A, Bahn 7, 8). In 3D ist der Vergleich des wt (Bahn 1, 2 und 5, 6) und Flu4 (Bahn 3, 4 und 7, 8) sowohl in dem 15-Mer- als auch in dem 30-Mer-Konstrukt dargestellt.
Die negative Wirkung von L15E kann man erklären, indem man ein Modell des scFv-Fragments von 4-4-20 betrachtet. L15 bildet zusammen mit den Resten A80, L83 und L106 eine hydrophobe Tasche. Offensichtlich stabilisiert L15 das scFv-Fragment durch hydrophobe Wechselwirkungen mit seinen nächsten Nachbarn. Somit geht der Austausch L15E, mit dem das scFv-Fragment hydrophiler und löslicher gemacht werden soll, auf Kosten der Stabilität des Fragments. Im Fall eines beliebigen anderen Antikörperfragments sollten deshalb erst die hydrophoben Wechselwirkungen innerhalb eines Fragments analysiert werden, wenn die Lösungsmittel-exponierten Reste ausgewählt werden, die mutiert werden sollen.
Kombinationen verschiedener Serin-Mutationen in VH führten zu weiteren Verbesserungen im Verhältnis i/s. Die Mutanten FH15 (V84S, M87S, I89S) und FH20 (L11S, V84S, M87S, 189S) zeigten in Immunblots beide mehr als 70% lösliches Protein (Ergebnisse nicht dargestellt).
Die negative Wirkung von L15E
(c) Funktionelle Expression und Reinigung
Früher war schon die Oligomerisierung von scFv-Fragmenten als Funktion der Linkerlänge untersucht worden. Dabei war eine kontinuierliche Abnahme der Dimer- und Multimerbildung als Funktion der Linkerlänge beschrieben worden (Desplancq et al., 1994; Whitlow et al., 1994). Während für den Linker (Gly₄Ser)₃ gezeigt wurde, dass er in vielen Fällen zu monomeren scFvs in der VH-VL-Richtung führte, ist dies in der VL-VH-Richtung selten der Fall. Dies beruht auf einer Asymmetrie in der VL/VH-Anordnung, die zu einem längeren Abstand zwischen dem Ende von VH und dem N-Terminus von VL führt als zwischen dem C-Terminus von VL und dem N-Terminus von VH (Huston et al., 1995). Folglich kann ein Linker mit identischer Länge unterschiedliche Eigenschaften der resultierenden Moleküle zur Folge haben.
Wir haben uns entschieden, in unseren Konstrukten das möglichst wenig störende FLAG (Knappik und Plückthun, 1994) am N-Terminus von VL und somit die VL-Linker-VH-Orientierung zu nutzen, und damit untersuchten wir die Verwendung längerer Linker. Bei der periplasmatischen Expression in E. coli ist kein Unterschied zwischen dem 15-Mer- und dem 30-Mer-Linker in den entsprechenden Mutanten zu sehen (3D), wenn wir jedoch versuchten, die zwei Flu4-scFvs mit dem langen und mit dem kurzen Linker zu reinigen, fanden wir eine große Diskrepanz zwischen den zwei Konstrukten. Die Reinigung der Flu4-Mutante (V84D) mit dem 15-Mer-Linker ergibt sehr kleine Mengen eines teilweise gereinigten Proteins (etwa 0,015 mg pro Liter und OD; abgeschätzt aus der SDS-PAGE nach IMAC-Reinigung), während das Konstrukt mit dem 30-Mer-Linker etwa 0,3 mg pro Liter und OD eines hochreinen funktionellen Proteins ergibt. Alle Mutanten mit dem 30-Mer-Linker wurden in einer Gelfiltration getestet, wobei sie als monomer befunden wurden (Ergebnisse nicht dargestellt).
Für eine weitere in vitro-Charakterisierung wurden fünf Mutanten mit dem 30-Mer-Linker gereinigt, V84D (Flu4), V84D/L11D (Flu6), L11D (Flu3) und die Serinmutanten FH15 und FH20 (vgl. iii (b)). Eine zweistufige Chromatographie, bei der zuerst eine IMAC und danach eine Kationenaustausch-Chromatographie eingesetzt wurde, ergab ein homogenes Protein. Das Verhältnis i/s der Antikörperfragmente (3) wirkte sich auch auf die Reinigungsausbeute des funktionellen Proteins aus. Die stark lösliche Mutante Flu4 (V84D) (3B, Bahn 3, 4) ergab etwa 0,3 mg des gereinigten und funktionellen Proteins pro Liter und OD, Flu6 (L11D/V84D) (3B, Bahn 7, 8) ergab etwa 0,25 mg pro Liter und OD, und Flu3 (weniger lösliches Material auf dem Blot in 3A, Bahn 7, 8) ergab 0,05 mg pro Liter und OD. Die Serinmutanten FH15 und FH20 ergaben 0,3 mg bzw. 0,4 mg pro Liter und OD. Das wt scFv des Antikörpers 4-4-20 ergab bei der periplasmatischen Expression mit beiden Linkern keinerlei lösliches Protein, es wurde also als cytoplasmatische Einschlusskörpern exprimiert, hierauf folgte eine Umfaltung in vitro und eine Fluorescein-Affinitäts-Chromatographie. Für das umgefaltete wt scFv wurde durch Gelfiltration gezeigt, dass es mit dem 30-Mer-Linker monomer war (Ergebnisse nicht dargestellt).
(d) Biophysikalische Eigenschaften der mutierten scFvs
Da wir Aminosäuren austauschten, die konserviert sind, kann nicht ausgeschlossen werden, dass Änderungen an diesen Positionen möglicherweise durch die Struktur hindurch weitergeleitet werden und eine Wirkung auf die Bindungskonstante haben, auch wenn sie von der Bindungsstelle sehr weit entfernt sind (Chatellier et al., 1996). Um diese Möglichkeit auszuschließen, bestimmten wir die Bindungskonstante der Mutanten Flu3, Flu4, Flu6 und des wt scFv. Eine Fluoreszenztitration wurde eingesetzt, um den K_D-Wert in Lösung zu bestimmen, dabei wurde die Tatsache genutzt, dass die eigene Fluoreszenz von Fluorescein gelöscht wird, wenn es an den Antikörper bindet. Die Fluoreszenzlöschung bei 510 nm wurde als Funktion des zugegebenen scFv gemessen. Die K_D-Werte (Tabelle 3 und 4), die für alle drei mutierten svFvs und das wt scFv erhalten wurden, sind sehr ähnlich und entsprechen sehr gut dem kürzlich korrigierten K_D-Wert des monoclonalen Antikörpers 4-4-20 (Miklasz et al., 1995).
Um zu bestimmen, ob die Mutationen einen Einfluss auf die thermodynamische Stabilität des Proteins haben, ermittelten wir durch die Denaturierung mit Harnstoff die Gleichgewichtskurven der Auffaltung. Für diese Analyse wurden die Mutante V84D und das wt svFv eingesetzt, wobei in 5 ist eine überlagerte Darstellung gezeigt wird. Der Mittelpunkt der beiden Kurven liegt bei 4,1 M Harnstoff. Beide Kurven wurden durch einen Algorithmus für ein Zwei-Zustands-Modell erstellt, wie von Pace (1990) beschrieben, wobei jedoch der offensichtliche kleine Unterschied zwischen der Mutante V84D und dem wt scFv nicht von statistischer Signifikanz ist.
Eine andere Erklärung für die unterschiedlichen in vivo-Ergebnisse zwischen den mutierten scFvs und dem wt scFv könnte die Aggregation von Faltungs-Zwischenstufen sein (3). Im Periplasma von E. coli sind die Proteinkonzentrationen vermutlich ziemlich hoch (van Wielink und Duine, 1990), wodurch die Aggregationseffekte möglicherweise verstärkt werden. Um das Aggregationsverhalten in vitro abzuschätzen, bestimmten wir die Raten der thermischen Aggregation bei unterschiedlichen Temperaturen. In 6 ist deutlich zu sehen, dass das wt scFv bereits bei 44°C signifikant aggregiert, während die Mutante V84D die Tendenz zeigt, langsamer zu aggregieren. Das wt scFv neigt somit deutlich stärker zur Aggregation als das mutierte scFv. Dieses Ergebnis ist den Beobachtungen sehr ähnlich, die mit verschiedenen Mutationen beim Antikörper McPC603 gemacht wurden (Knappik und Plückthun, 1995), wobei kein Zusammenhang zwischen den Gleichgewichtskurven der Denaturierung und dem Expressionsverhalten gefunden wurde, wobei jedoch eine gute Korrelation mit den Raten der thermischen Aggregation gefunden wurde.
Figuren und Tabellen
1: Räumliche Darstellung des Fv-Fragments des Antikörpers 4-4-20.
2: Reste der variable/konstante Domäne-Grenzfläche für VL (2a) und VH (2b). Für 30 nicht-redundante Fab-Fragmente, die aus der Brookhaven-Datenbank entnommen wurden, wurde die Lösungsmittel-zugängliche Oberfläche der Aminosäure-Seitenketten bei einem Fv- und einem Fab-Fragment berechnet. Die Darstellung zeigt die relative Reduktion der zugänglichen Oberfläche beim Kontakt mit den konstanten Domänen (überlagerte Darstellung für alle 30 Fv-Fragmente). In der Anordnung der Sequenz sind diejenigen Reste hervorgehoben, die zur v/c-Grenzfläche beitragen. Die Symbole zeigen die relative Reduktion der Lösungsmittelzugänglichen Oberfläche beim Entfernen der konstanten Domänen (Symbole: kein Symbol < 1%; • < 20%;
< 40%;
< 60%;
< 80% und ⧫ ≥ 80%). Die Kreise bezeichnen die Positionen, die noch weiter analysiert werden (vgl. Tabelle 1).
3: Western-Blots, die die unlöslichen (i) und die löslichen (s) Fraktionen von Zellextrakten zeigen, hergestellt wie in Material und Methoden beschrieben, welche die scFv-Fragmente des Antikörpers 4-4-20 exprimieren. Die Aminosäuren, die in den verschiedenen Mutanten substituiert sind, sind in Tabelle 2 angegeben.
4: Scatchard-Darstellung der Fluoreszenztitration von Fluorescein (20 nM) mit dem Antikörper (4 bis 800 nM), gemessen bei 510 nm. Der Wert r wurde aus (F – F₀)/(F_∞ – F₀) erhalten, wobei F die gemessenen Fluoreszenz von Fluorescein bei einer bestimmten Antikörperkonzentration ist, F₀ die Fluoreszenz in Abwesenheit eines Antikörpers bedeutet und F_∞ die Fluoreszenz darstellt, wenn der Antikörper in einem großen Überschuss vorliegt. Es ist zu beachten, dass r die Sättigung von Fluorescein durch den Antikörper ergibt. (a) Titration von wt scFv; (b) Titration von Flu4 (V84D).
5: Eine überlagerte Darstellung der Harnstoff-Denaturierungskurven wird gezeigt. (X) wt scFv; (o) Flu4.
6: Zeitverläufe der thermischen Denaturierung bei 40 und 44°C für das wt scFv-Fragment und für das scFv-Fragment Flu4 sind dargestellt. (a) wt scFv bei 40°C; (b) Flu4 bei 40°C; (c) Flu4 bei 44°C; (d) wt scFv bei 44°C.
Tabelle 1: Sequenzvariabilität von Resten, die zu der v/c-Grenzfläche beitragen: Die Statistiken der Reste beruhen auf den Sequenzen der variablen Domänen in der Kabat-Datenbank (März 1996). Sequenzen, die zu < 90 vollständig waren, wurden von der Analyse ausgeschlossen. Anzahl der Sequenzen, die analysiert wurden: menschliche VL kappa: 404 von 881; murine VL kappa: 106 von 2239; menschliche VL lambda: 223 von 409; murine VL lambda: 71 von 206; menschliche VH: 663 von 1756; murine VH: 1294 von 3849. Die Position bezieht sich auf die Sequenzposition gemäß Kabat et al., 1991, % exp. (Fab) auf die relative Seitenketten-Zugänglichkeit in einem Fab-Fragment, wie durch das Programm NACCESS berechnet (NACCESS v2.0 von Simon Hubbard (http://www.biochem.ucLac.uk/~roman/naccess/naccess.html)), % exp. (ind.) auf die relative Seitenketten-Zugänglichkeit in der isolierten VL- oder VH-Domäne, eingebettet auf den relativen Unterschied in der Seitenketten-Zugänglichkeit zwischen dem Fv- und dem Fab-Fragment. Consensus bezieht sich auf den Sequenz-Consensus, und Verteilung auf die Verteilung der Typen von Resten.
Tabelle 2: Mutationen, die in das scFv-Fragment des Antikörpers 4-4-20 eingeführt wurden. Jede Linie stellt ein anderes Protein dar, das die bezeichnete Mutationen trägt. Die Reste sind gemäß Kabat et al. (1991) numeriert.
Tabelle 3: K_D-Werte der verschiedenen scFv-Mutanten, die durch eine Fluoreszenztitration bestimmt wurden. Die K_D-Werte sind in nM angegeben, der Fehler wurde aus der Scatchard-Analyse berechnet (4), # wurde durch Miklasz et al. (1995) bestimmt.
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Claims

DNA-Sequenz, die eine Immunglobulin-Superfamilien (IgSF)-Domäne oder ein Immunglobulin-Superfamilien (IgSF)-Fragment codiert, die/das sich von einer Eltern-IgSF-Domäne oder einem Eltern-IgSF-Fragment dadurch unterscheidet, dass die longitudinale Grenzfläche mit einer zweiten Domäne, die innerhalb der Kette eines größeren IgSF-Fragments oder -Proteins an die Eltern-IgSF-Domäne oder das -IgSF-Fragment direkt angrenzt und die in Abwesenheit dieser zweiten Domäne in der Eltern-IgSF-Domäne oder in dem -IgSF-Fragment exponiert ist, durch Modifikation hydrophiler gemacht wird.
DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei die Modifikation eine Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren an der Grenzfläche mit hydrophileren Aminosäuren ist.
DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei die Modifikation eine Insertion einer oder mehrerer hydrophiler Aminosäuren an der Grenzfläche oder eine Insertion von Aminosäuren, die die Gesamthydrophilie in der Grenzfläche erhöhen, oder eine Deletion einer oder mehrerer hydrophober Aminosäuren in der Grenzfläche oder eine Deletion von Aminosäuren ist, wobei die Deletion zu einer Erhöhung der Gesamthydrophilie in der Grenzfläche führt.
DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei die Modifikation aus zwei oder mehreren der folgenden Schritte besteht: a) Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren in der Grenzfläche mit hydrophileren Aminosäuren, b) Insertion einer oder mehrerer hydrophiler Aminosäuren in der Grenzfläche oder Insertion von Aminosäuren, die die Gesamthydrophilie in der Grenzfläche erhöhen, c) Deletion einer oder mehrerer hydrophober Aminosäuren in der Grenzfläche oder Deletion von Aminosäuren, wobei die Deletion zu einem Anstieg der Gesamthydrophilie in der Grenzfläche führt.
DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei die substituierte oder inserierte Aminosäure ausgewählt ist aus der Liste bestehend aus Asn, Asp, Arg, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Ser und Thr.
DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Eltern-IgSF-Domäne Teil eines IgSF-Fragments ist.
DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Domäne oder das Fragment von einem Antikörper abgeleitet ist.
DNA-Sequenz nach Anspruch 7, wobei das Fragment ein Fab-Fragment ist.
DNA-Sequenz nach Anspruch 7, wobei das Fragment ein Fv-Fragment ist.
DNA-Sequenz nach Anspruch 7, wobei das Fragment ein scFv-Fragment ist.
DNA-Sequenz nach Anspruch 7, wobei das Fragment ein durch eine Inter-Domänen-Disulfidbindung stabilisiertes Fv-Fragment ist.
DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei die Grenzflächen-Region die Reste 9, 10, 12, 15, 39, 40, 41, 80, 81, 83, 103, 105, 106, 106A, 107, 108 für VL und die Reste 9, 10, 11, 13, 14, 41, 42, 43, 84, 87, 89, 105, 108, 110, 112, 113 für VH umfasst.
DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 12, mit einer angrenzenden Sequenz, die eine oder mehrere zusätzliche Einheiten codiert.
DNA-Sequenz nach Anspruch 13, wobei mindestens eine der zusätzlichen Einheiten ein Toxin, ein Cytokin oder ein Reporterenzym ist.
DNA-Sequenz nach Anspruch 13, wobei mindestens eine der zusätzlichen Einheiten mindestens ein Teil eines Oberflächenproteins eines Organismus ist.
DNA-Sequenz nach Anspruch 15, wobei der Organismus ein filamentöser Bakteriophage ist.
DNA-Sequenz nach Anspruch 16, wobei das Oberflächenprotein das genelll-Protein ist.
DNA-Sequenz nach Anspruch 13, wobei mindestens eine der zusätzlichen Einheiten in der Lage ist, ein Metallion zu binden.
DNA-Sequenz nach Anspruch 18, wobei mindestens eine der zusätzlichen Einheiten mindestens fünf Histidine umfasst.
DNA-Sequenz nach Anspruch 13, wobei die Einheit ein Peptid ist.
DNA-Sequenz nach Anspruch 20, wobei das Peptid ein markierter Tag ist.
DNA-Sequenz nach Anspruch 21, wobei der markierte Tag c-myc oder FLAG ist.
DNA-Sequenz nach Anspruch 20, wobei das Peptid eine Assoziationsdomäne umfasst, die zu einer Selbstassoziation von zwei oder mehreren der Antikörperfragmente führt.
DNA-Sequenz nach Anspruch 23, wobei die Assoziationsdomäne von einem Leucin-Zipper oder von einem Helix-Turn-Helix-Motiv abgeleitet ist.
DNA-Sequenz nach Anspruch 20, wobei das Peptid eine erste Assoziationsdomäne umfasst, die zu einer Heteroassoziation einer oder mehrerer der Antikörperfragmente mit einem oder mehreren Peptiden oder Proteinen führt, das/die eine zweite Hetereoassoziationsdomäne umfasst/umfassen, die in der Lage ist/sind, mit der ersten Hetereoassoziationsdomäne zu assoziieren.
Vektor, der die DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 25 umfasst.
Wirtszelle, die einen Vektor nach Anspruch 26 umfasst.
IgSF-Domäne oder -Fragment oder ein Fusionsprotein, das eine IgSF-Domäne oder ein -Fragment umfasst, das von einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 25, einem Vektor nach Anspruch 26 codiert wird oder das von einer Wirtszelle nach Anspruch 27 hergestellt wird.
Diagnostische Zusammensetzung, umfassend eine IgSF-Domäne oder ein IgSF-Fragment oder ein Fusionsprotein, das eine IgSF-Domäne oder ein IgSF-Fragment umfasst, nach Anspruch 28.
Therapeutische Zusammensetzung, umfassend eine IgSF-Domäne oder ein IgSF-Fragment oder ein Fusionsprotein, das eine IgSF-Domäne oder ein IgSF-Fragment umfasst, nach Anspruch 28.
Verfahren zum Ableiten einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 25, umfassend die folgenden Schritte: i) Analyse der Grenzflächen-Region einer Eltern-IgSF-Domäne auf hydrophobe Reste, die einem Lösungsmittel ausgesetzt sind, ii) Identifizieren eines oder mehrerer hydrophober Reste, der/die mit hydrophileren Resten substituiert werden soll/sollen, oder einer oder mehrerer Positionen, an denen hydrophile Reste oder Aminosäurespannen, die die Gesamthydrophilie der Grenzflächen-Region erhöhen, in die Grenzflächen-Region inseriert werden können, oder einer oder mehrerer Positionen, an denen hydrophobe Reste oder Aminosäurespannen, die die Gesamthydrophobizität der Grenzflächen-Region erhöhen, aus der Grenzflächenregion deletiert werden können, oder irgendeine Kombination der Substitutionen, Insertionen und Deletionen, um eine oder mehrere Mutanten der Eltern-IgSF-Domäne zu erzeugen.
Verfahren zum Herstellen einer IgSF-Domäne oder eines (gSF-Fragments oder eines Fusionsproteins, umfassend eine IgSF-Domäne oder ein IgSF-Fragment, nach Anspruch 28, umfassend die folgenden Schritte: i) Ableiten einer DNA-Sequenz nach Anspruch 31, ii) Herstellen einer DNA, die die Mutante(n) codiert, wobei die DNA entweder einzeln oder als eine Mischung hergestellt wird, iii) Einführen der DNA oder der DNA-Mischung in ein Vektorsystem, das für die Expression der Mutante(n) geeignet ist, wobei das Vektorsystem gegebenenfalls eine oder mehrere zusätzliche DNA-Sequenzen, die zur Expression zusätzlicher IgSF-Domänen oder -Fragmente geeignet ist/sind, oder eine oder mehrere DNA-Sequenzen, die zur Expression eines Fusionsproteins geeignet ist/sind, das eine Mutante oder Mutanten umfasst, oder eine beliebige Kombination der zusätzlichen DNA-Sequenzen umfasst, iv) Einführen des Vektorsystems in geeignete Wirtszellen und Expression der Mutante oder der Mischung aus Mutanten oder Expression der Mutanten oder Mischung aus Mutanten in Kombination mit den Expressionsprodukten der zusätzlichen DNA-Sequenzen, v) Identifizieren und Charakterisieren einer oder mehrerer Mutanten, alleine oder in Kombination, die in größerer Ausbeute in löslicher Form erhalten werden, und vi) wenn notwendig, Wiederholen von Schritt ii) bis vi), um die Hydrophilie der identifizierten Mutante/Mutanten, alleine oder in der Kombination, weiter zu erhöhen.
Verfahren nach Anspruch 32, bei dem der Wirt ein Bakterium, ein Pilz, eine Pflanze, eine Insektenzelle oder eine von einem Säuger stammende Zelllinie ist.
Verfahren für die Herstellung einer IgSF-Domäne oder eines IgSF-Fragments nach Anspruch 28, umfassend das Züchten einer Wirtszelle nach Anspruch 27 und das Isolieren der Domäne oder des Fragments.