DE69725297T2

DE69725297T2 - Immuno-magnetische zelltrennung zur erkennung von krebsmetastasenbildung-assozierten genen

Info

Publication number: DE69725297T2
Application number: DE69725297T
Authority: DE
Inventors: Oystein Fodstad; Olav Engebraten; Hansen Anne REE; Eivind Johannes Hovig
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-03-26
Filing date: 1997-03-25
Publication date: 2004-08-05
Anticipated expiration: 2017-03-26
Also published as: ATE251223T1; RU2180963C2; AU2311697A; HUP9901786A2; PL329038A1; EP0894146A1; TR199801916T2; KR19990087833A; WO1997036004A1; BR9708256A; SK141698A3; IL126257A0; DE69725297D1; NZ331920A; JP2000509250A; NO961221D0; CZ286598A3; PL185182B1; CN1214738A; HUP9901786A3

Description

Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen neuen Ansatz zum Nachweis von neuen Genen mit positionsspezifischen Expressionsmustern in Tumorzellen zur Verfügung zu stellen, die in verschiedenen Geweben vorliegen.
Es ist wohl bekannt, dass viele Krebsarten typische Ausbreitungsmuster dahingehend aufzeigen, dass Metastasen vorzugsweise in bestimmten Geweben oder Organen, oft in einer geordneten Weise, vorkommen. Dementsprechend entwickeln sich Brustkrebsmetastasen normalerweise zuerst in Achsellymphknoten, wohingegen Knochenmarks/ Knochenmetastasen die erste und häufigste Stelle (50%) von entfernter Ausbreitung darstellen. Von den anderen Geweben werden Leber Lunge und das zentrale Nervensystem (bis zu 20%) werden Wirte der Brustkrebsmetastasen. In ähnlicher Weise ergibt Prostatakrebs Skelettmetastasen; Mastdarmkrebs breitet sich auf Lymphknoten und Leber aus; Osteosarkom auf die Lunge; und maligne Melanome auf Lymphknoten, Leber, Lunge und Gehirn. Es ist sehr wenig über die Faktoren bekannt, die eine solche Gewebe-bevorzugte Krebsausbreitung bestimmen, aber sicherlich sind bestimmte Eigenschaften von Tumorzellen involviert, durch die z. B. Tumorzellen in die Lage versetzt werden, sich auf Zielorgane zu richten, sich dahin zu bewegen und in das Wirtsgewebe einzuwandern, auf lokale Wachstumsfaktoren zu reagieren, Angiogenese zu induzieren oder in bisher unbekannten Weisen zu reagieren. Diese Eigenschaften müssen mit der Expression spezifischer Proteine, die durch bekannte und unbekannte Gene exprimiert werden, assoziiert sein. Um solche Gene zu identifizieren kann es daher von besonderer Bedeutung sein, die Mechanismen der Metastase zu verstehen und dadurch neue Hinweise für die Diagnose und Therapie zur Verfügung zu stellen.
Es werden verschiedene Verfahren in der Suche nach Genen verwendet, die in bestimmten Zellpopulationen hochexprimiert sind und nicht in anderen, einschließlich Verfahren wie das subtrahierende Hybridisierungsklonieren und die Verwendung eines Differential-Display-Ansatzes. Die meisten derartigen Klonierungsprojekte involvierten die Verwendung von in vitro-Zelllinien oder Klonen als Ausgangsmaterial. Jedoch ist be kannt, dass sich Zelllinien deutlich von den Tumorzellen unterscheiden können, aus denen sie stammen und das in vitro-Kulturbedingungen die Expression von Genen, die in die Bestimmung der Fähigkeit der Zellen in extrazelluläre Matrizen und stromales Gewebe einzuwandern sowie deren gesamte metastatische Kapazität involviert sind, rauf oder runter regulieren können.
Eine logische Alternative zu Zelllinien zum Vergleich der Expression von Gentranskripten oder Proteinen von Interesse wäre die Verwendung von Spezies des Tumorgewebes von primären Tumoren und Metastasen aus Patienten. Solche Ansätze umfassen jedoch verschiedene Möglichkeiten für Fehler und zudem technische Schwierigkeiten. Wenn Tumorzellen aus verschiedenen Patienten verwendet werden, muß die Expression der Gene, die für jedes Individuum charakteristisch sind, subtrahiert werden, bevor die Muster der Genexpression, auf die sich die Aufgabe der Studie bezieht, verglichen werden. Dieses trägt zur immensen Komplexizität solcher Genklonierung bei. Es wäre daher vorteilhaft, in der Lage zu sein, Expressionsmuster in Krebszellen zu vergleichen, die aus Tumormanifestationen erhalten werden, die an verschiedenen Zellen in ein und dem selben Individuum lokalisiert sind. Dies wäre durch das Sammeln von Tumorgewebe aus sowohl primärem Tumor wie auch Metastasen möglich, die nachgewiesen und durch Chirurgie entfernt werden und/oder durch Chirurgie oder Biopsie von wiederaufkommender Erkrankung oder aus sekundären Tumoren in Patienten mit progressivem Krankheitsverlauf, welche andere Behandlungsmodalitäten nach erstem chirurgischen Eingriff erhalten haben oder auch nicht.
Es ist wichtig in jeglichem Genklonierungsprojekt mit so reinen Populationen von Zielzellen wie nur möglich zu arbeiten, wodurch man versucht, irrelevante Signale von Nichtzielzellen zu vermeiden, die die zu vergleichenden Expressionsmuster abschwächen. In Spezies mit festen Tumoren ist dieses schwer zu erreichen, da chirurgische Proben und Biopsien der Tumorzellen mit normalem fibrösen Gewebe, einschließlich stromalen und Endothelzellen vermischt sind, die konventionelle Verfahren zur Gewebeaufbereitung nicht befriedigend entfernen können. In hämatologischen Krebsarten haben die malignen Zellen ähnliche Determinanten wie eine korrespondierende Subpopulation von normalen Zellen, was die Auftrennung der beiden Zelltypen verhindert.
In Versuchen zur Identifizierung von Genen, die in die frühen Stadien der Tumorentwicklung involviert sind, wäre es wichtig, Tumorzellen aus den relevanten Positionen zu erhalten, wenn die Größe des sekundären Tumors noch klein ist oder wenn möglich sogar aus subklinischen Tumorfoci und Zellen. Ein Beispiel wären maligne Zellen, die in Blut oder in Knochenmark vorhanden sind, bevor konventionelle Diagnosemaßnahmen eine feste Manifestation der Metastase zeigen können. Ein anderes Beispiel wären Krebszellen, die in zerebraler Spinalflüssigkeit, in Urin oder im Effusionen von pleuralen oder abdominalen Räumen vorhanden sind, bevor konventionelle morphologische Verfahren solche Zellen nachweisen können. Zudem werden bei dem ersten chirurgischen Eingriff oder, wenn eine metastatische Ausbreitung vermutet wird, Lymphknoten oft entfernt, bevor sie vergrößert sind. Die morphologische Untersuchung kann jedoch immer noch in solchen Fällen negativ ausfallen, bei denen eine eingeschränkte Anzahl an Tumorzellen gegebenenfalls vorhanden sein könnte. In all diesen Beispielen beschreibt die vorliegende Erfindung ein Mittel zum Nachweis und zur Auswahl der Zieltumorzellen für Genklonierungszwecke.
Zusätzlich zur Verwendung von Krebszellen, die aus verschiedenen Geweben oder Organen in Patienten erhalten wurden, beschreibt die Erfindung auch einen anderen Weg zur Gewinnung von metastatischen menschlichen Tumorzellen zur Verwendung in der Suche nach Genen mit positionsspezifischer Expression. Zellen aus verschiedenen menschlichen Tumoren wurden in vitro oder in immundefizitären Tieren in vivo wachsen gelassen und solche Zellen wurden verwendet, um experimentelle Metastasemodelle zu etablieren oder Modelle, in denen Zellen orthotopisch wachsen, d. h. in klinisch relevanten Ursprungsgeweben; malignem Melanom der Haut; Osteosarkom im Knochen; rektaler Krebs in der Darmwand; Brustkrebs in dem Brustfettpolster, etc.. In experimentellen Metastasemodellen können verschiedene Muster der Tumorausbreitung, abhängig von der Zelllinie, dem Weg der Zellinjektion und der Art des verwendeten Wirtes gesehen werden. Typischerweise simulieren die Metastasenmuster die des korrespondierenden Tumortyps in der Klinik. Durch die Verwendung solcher Modelle wird es möglich, auch Tumorzellen aus metastatischen Positionen zu erhalten, die normalerweise nicht in Patienten zugänglich sind, wie der Spinalstrang oder Gehirngewebe. Noch einmal, für Klonierungszwecke wäre es wichtig, menschliche Tumorzellen aus tierischen Zellen auszuwählen, um Probleme mit Genen zu vermeiden, die in normalen Wirtszellen exprimiert werden.
Zuvor war es unmöglich, sinnvolle Genklonierungsexperimente mit Spezies von festen Tumoren oder Metastasen und mit malignen Zellen in Blut und Knochenmark mit dem Ziel der Identifizierung von Genen durch positionsspezifische Expression durchzuführen. Dieses ist dadurch bedingt, dass ein bedeutender Anteil von festem Tumor und Metastasen keine malignen Zellen aufweisen, sondern Bindegewebe, das zwischen den malignen Zellen unterstützt und wächst und welches auch Blutgefäße enthält, die den nötigen Zustrom an Nährstofffaktoren und Sauerstoff zum Tumor enthält. Es wird als nicht möglich angesehen, Tumorzellen von normalen Zellen adäquat abzutrennen ohne einen Zwischenschritt der Kultivierung der Zellen in vitro mit einzubeziehen, der eine Manipulationen zum Entfernen der normalen Zellen involviert. Jedoch würde eine solche in vitro-Kultivierung in einer Auswahl einer Subpopulation von Tumorzellen in einer Umgebung, die sich von der Situation in vivo deutlich unterscheidet, resultieren, wodurch wesentliche Änderungen in den Genexpressionsmustern induziert werden. Daher kann für die Zwecke der Identifizierung von Genen, die mit dem metastatischen Prozess assoziiert sind, eine Kultivierung von Tumorzellen aus festen Metastasen nicht verwendet werden. Zudem wurde es von den Personen, die auf dem Gebiet der Genklonierung bekannt sind, nicht als interessant angesehen, Genexpressionsmuster in malignen Zellen in unbehandelten festen primären und metastatischen Tumoren zu vergleichen. Des Weiteren konstituieren in Proben aus Blut und Knochenmark die Tumorzellen, wenn sie überhaupt vorhanden sind, eine sehr geringe Fraktion der Gesamtanzahl an Zellen mit Nuclei, und maligne Zellen aus Blut und Knochenmark wurden für Genklonierungsversuche als nicht interessant angesehen. Dieses liegt daran, dass Tumorzellen nicht adäquat von normalen Zellen abgetrennt werden konnten und wichtigerweise auch, weil die Leute, die auf dem Gebiet der Genklonierung bekannt sind, nicht erwartet haben, dass derartige maligne Zellen sich ausreichend in den Genexpressionsmustern von solchen in den Elterntumoren unterscheiden.
Krebszellen, die aus menschlichen Tumoren isoliert wurden, die in verschiedenen und klinisch relevanten Zielgeweben und Organen in immundefizitären Tieren metastasieren, wurden einfach nur nicht in Versuchen verwendet, tumorassoziierte Gene mit positionsspezifischer Expression zu identifizieren, weil solche menschlichen Tumormodelle sehr selten sind, aber auch wegen des Mangels an Verfahren zur Herstellung reiner Populationen von Krebszellen.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Identifizierung von Genen, die differenziell zwischen Zielzellen exprimiert werden, die aus Tumormanifestationen gewonnen werden, die an verschiedenen Stellen in ein und dem selben Individuum lokalisiert sind.
Dieses Ziel wurde durch die vorliegende Erfindung erreicht, die durch die beigefügten Ansprüche charakterisiert ist.
Da es die Aufgabe der Erfindung ist, Gene zu identifizieren, die spezifisch während der frühen Stadien der Tumorausbreitung exprimiert werden, sollten feste Tumore und Metastasen von geringer Größe und maligne Zellen in Blut und Knochenmark eine so genannte mikrometastatische Erkrankung darstellen, d. h. eine kleine Anzahl von Tumorzellen sollte vorhanden sein. Falls möglich, sollten solche Tumorzellen auch in Fällen gesammelt werden, in denen besagte Zellen nicht durch konventionelle morphologische Untersuchungen oder mit diagnostischen Verfahren wie Radiologie und magnetischer Resonanzbildentwicklung nachgewiesen werden können. Da solche Zellen nicht erkannt wurden, waren sie offensichtlich für Genklonierungszwecke nicht von Interesse. Die Verwendung von immunmagnetischen Techniken ermöglicht die Isolierung besagter maligner Zellen sogar, wenn sie in sehr geringen Anzahlen vorhanden sind. Verschiedene Verfahren zur Amplifizierung von DNA- und RNA-Sequenzen machen die Genklonierung mit solchen geringen Zahlen von malignen Zellen unter der Voraussetzung, dass diese Zellpopulation ausreichend rein ist, möglich.
Die positive Auswahl von Zieltumorzellen kann durch die Verwendung von per se bekannten Techniken, wie sie in der Patentanmeldung PCT/NO93/00136 (WO 94/07139) und in PCT/NO95/00052 beschrieben werden, erhalten werden. Da im vorliegenden Fall die Reinheit der fertigen Zielzellpopulation wichtig ist, kann der immunmagnetische Auswahlprozess mehr als einmal durchgeführt werden oder als eine Kombination mit der positiven (mit Zielzell-erkennenden monoklonalen Antikörpern) und negativen (mit Antikörpern, die unerwünschte Zellen bilden) Selektion durchgeführt werden. Diese Techniken wurden erfolgreich verwendet, um Zielzellen aus Blut, Knochenmark, malignen Effusionen und aus Einzelzellsuspensionen, die aus festem Tumorgewebe von primären Tumoren und Lymphknoten und anderen Metastasen hergestellt wurden, zu iso lieren. In gleicher Weise wurde die Selektion von menschlichen malignen Zellen aus normalen stromalen oder hämatopoetischen Zellen in tierischen Wirten nachgewiesen, sogar in Fällen, bei denen Tumorzellen in Knochen, Knochenmark, Rückenmark oder Gehirngewebe residieren. Da es eine Aufgabe wäre, Gene mit Produkten zu suchen, die in die frühen Stadien der Metastasenbildung involviert sind, kann es sein, dass nur relativ wenig Tumorzellen erhalten werden können, deren Reinheit besonders wichtig ist. Bei diesem Ansatz ist es möglich, eine bessere aufgereinigte Zielzellpopulation aus Patienten und tierischen Wirten zu erhalten als durch jede andere bekannte Technik, was einzigartige Möglichkeiten zur Klonierung von Genen mit positionspezifischer Expression zur Verfügung stellt.
Der nächste Schritt der Erfindung involviert die Verwendung von bekannten Genklonierungsverfahren wie die Verwendung des Differential-Display-Verfahrens, das zuerst durch Liang, A. und Pardee, A. B. (Science, Vol. 257, 967–971, 1992) beschrieben wurde. In diesem Verfahren werden Polymerasekettenreaktionen mit Enzymen und Primern durchgeführt, die eine reverse Transkription und eine zufällige Amplifizierung von Gentranskripten ergeben, die in der Zielzelle vorhanden sind. Zu vergleichende resultierende cDNA-Fragmente aus den Zellpopulationen werden danach auf einem Sequenziergel untersucht und die positionsspezifischen Fragmente extrahiert und sequenziert. Die Genfragmente von Interesse können dann weiter untersucht werden, einschließlich der Untersuchung ihrer Expressionsmuster in Material, das dem ähnlich ist, das zur Klonierung verwendet wurde. Wiederum ist es wichtig, dass man Zugang zu aufgereinigten Tumorzellpopulationen ohne relevante Nichtzielzellen, die mit den Ergebnissen interferieren, hat. Die Möglichkeit der Verwendung von menschlichen Tumorzellen, die aus Metastasemodellen in immundefizitären Tieren isoliert wurden, ist auch vorteilhaft, weil die Modelle eine zuverlässige und dauerhafte Quelle von Zieltumorzellen für längere Studien zur Verfügung stellen. Es ist auch wichtig, dass die Zielzellen entweder aus Patienten oder aus Tiermodellen direkt und sehr schnell isoliert und für DNA- und RNA-Studien behandelt werden, um unerwünschte Änderungen in der Genexpression zu vermeiden, die nicht mit der Identifizierung von Genen mit positionsspezifischer Expression in Verbindung stehen.
Verschiedene Verfahren, die zur Klonierung neuer Gene verwendet werden, haben ihre inhärenten Einschränkungen. Die auf Polymerasekettenreaktionstechniken basierenden Differential-Display-Verfahren können an Problemen leiden, die mit der Repräsentierbarkeit und Reproduzierbarkeit in Verbindung stehen. Mit unserem Ansatz haben wir konsequenterweise Schritte eingeschlossen, die auf die Minimierung solcher Probleme gerichtet sind. Dieses wurde hauptsächlich durch die Verwendung der Immunkügelchenselektionstechnik erreicht, welche es möglich macht, spezifische biologisch repräsentative Zellen zu untersuchen, nicht nur für den ersten Differential-Display-Schritt, sondern auch in solchen Schritten, in denen die Kandidatengene auf Expressionsmengen in relevanten Zellen und Geweben untersucht werden.
Beispiel 1:
Tumorzellen aus dem primären Tumor und Achsellymphknoten aus einem Brustkrebspatienten wurden durch physikalische und enzymatische Verfahren hergestellt, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Eine Knochenmarksprobe (50 ml) wurde aspiriert und eine periphere Blutprobe wurde durch venöses Punktieren erhalten und die mononuclearen Zellen aus beiden Gegebenheiten wurden auf Lymphoprep (Nycomed Pharma, Oslo, Norwegen) isoliert. Die Zellsuspensionen wurden unabhängig voneinander mit MOC-31- und BM7 monoklonalen Antikörpern inkubiert, die jeweils ein pan-epitheliales Antigen und das MUC-1 Genprodukt erkennen. Nach Waschen und Inkubation wurden Dynabeads M-450 SAM SD (Dynal, Oslo, Norwegen) hinzugefügt, welche an die Fc-Region der primären Antikörper binden. Tumorzellen mit gebundenen Antikörper-Dynabeads M-450 SAM SD-Komplex konnten danach aus den normalen mononuclearen Zellen durch Verwendung eines starken Magneten isoliert werden. Die Natur der ausgewählten Zellen wurde mikroskopisch bestätigt. Aus den verschiedenen Zellpopulationen wurde RNA extrahiert und das Material einem Differential-Display-klonierungsverfahren unterzogen (Liang und Pardee, 1992), bei dem Teil- cDNA Sequenzen aus mRNA-Subpopulationen, die durch reverse Transkription erhalten wurden, durch Polymerasekettenreaktion amplifiziert wurden. cDNA-Fragmente aus verschiedenen Tumorzellpopulationen wurden auf einem Sequenziergel verglichen und Fragmente, die spezifisch in Zellen expremiert werden, die aus einer dieser Positionen erhalten wurden, wurden extrahiert und sequenziert. Unter einer Anzahl von interessanten Gensequenzen mit spezifischer Expression in den mit unserer magnetischen Immunkügelchentechnologie isolierten Tumorzellen, aus Knochenmark- oder in Tumorzellen, die immunmagnetisch aus Lymphknotenmetastasen isoliert wurden, haben wir zusätzlich zu bisher nicht iden tifizierten Genen einen Zellzyklus-verwandten Transformationsfaktor, ein Onkogenprodukt gefunden. Die Expression der zwei identifizierten Gensequenzen in biologisch relevanten Modellsystemen und das klinische Material wird derzeit analysiert.
Beispiel 2:
In diesem Beispiel wurden Zellen aus einem Modell für die experimentelle Metastase eines menschlichen Brustkrebses verwendet. In athymischen nackten Ratten resultiert die Injektion von MA-11 menschlichen Brustkrebszellen in die Cisterna magna (CM) in einer leptomeningealen Ausbreitung und Wachstum der malignen Zellen. Zudem bilden MA-11 Zellen, die in den linken Herzventrikel (LV) injiziert wurden, Metastasen im Rückenmark, was in der Entwicklung einer Hinterbeinparalyse in Tieren nach ungefähr 35 Tagen resultiert. Tumorzellen aus beiden Positionen wurden durch das Zerkleinern von Wirtsgewebe das Herstellen von Einzelzellsuspensionen erhalten und die unter Beispiel 1 beschriebene Immunkügelchentechnik wurde verwendet, um maligne Zellen positiv zu selektieren. Danach wurde eine RNA-Extraktion der Zellen aus beiden Positionen zusammen mit in vitro kultivierten MA-11 Zellen durchgeführt und das Material in ähnlicher Weise, wie bereits beschrieben wurde, dem Differential-Display-Klonierungsverfahren ausgesetzt. Zusätzlich wurde mRNA, die aus relevanten normalen Geweben in Ratten extrahiert worden war, als Kontrolle mitaufgenommen. Es ist zu beachten, dass die MA-11 Zelllinie aus mikrometastatischen Tumorzellen etabliert wurde, die mit dem immunmagnetischen Verfahren aus dem Knochenmark eines Brustkrebspatienten im Stadium II isoliert wurden. Verschiedene Kandidatenfragmente, die spezifisch für Zellen sind, die in Leptomeninges oder als Metastasen in Rückenmark wachsen, wurden nachgewiesen. Die Sequenzanalyse zeigte, dass diese Fragmente sowohl neue als auch bekannte Gene darstellen. Unter den Fragmenten, die als in MA-11-Zellen differenziell exprimiert bestätigt wurden, die aus einer metastatischen Zelle ausgewählt wurden, wurden vier Kandidatengene bisher detaillierter untersucht. Zwei von diesen, die als LV1 und LV12 bezeichnet werden, sind von besonderem Interesse. LV1 zeigt eine sehr hohe Expressionsselektivität in Tumorzellen aus Rückenmarksmetastasen, wobei LV12 in leptomeningeal wachsenden Zellen runterreguliert ist. LV1 wird in einer Anzahl von Zelllinien als hoch reguliert festgestellt, von denen bekannt ist, dass sie eine hohe Kapazität haben, experimentelle Metastasen in immundefizitären Tieren auszubilden. In einer Reihe primärer Tumore aus Brustkrebspatienten ging die geringe Expression von LV12 mit der kurzen Überlebensrate der korrespondierenden Patienten einher. Obwohl diese Ergebnisse zeigen, dass LV1 mRNA scheinbar in stark metastatischen Zellen hochreguliert ist und die LV12 mRNA Menge invers mit der Progression und der Metastase von Brustkrebs korreliert ist. Beide Gene sind neu. Zusätzlich ist auch ein drittes viel versprechendes Kandidatengen, CM13, ein neues Gen, das in Tumorzellen hochreguliert ist, die in Leptomeninges wachsen. Verschiedene weitere Kandidaten müssen noch analysiert werden. Für beide, sowohl für LV1- wie auch LV12 cDNA, wurde die Klonierung in voller Länge begonnen.
Beispiel 3:
In einem zu dem in Beispiel 2 beschrieben ähnlichen Modell führen MT1 menschliche Brustkrebszellen zu einem Wachstum in Leptomeninges nach CM Injektion, wobei LV injizierte Zellen zum Knochenmark und zu Knochen in den Wirbeln des Rückgrats und in die langen Knochen metastasieren. Zellen aus diesen beiden Positionen sowie in vitro gewachsene Zellen wurden isoliert und es wurde RNA aus den verschiedenen Zellenpopulationen extrahiert. Ähnliche zu den in Beispiel 2 beschriebene Verfahren können auf dieses Material angewendet werden.
Beispiel 4:
Tumorzellen, die durch das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren isoliert wurden, wurden aus anderen Brustkrebspatienten isoliert, aus Patienten mit kolorektalen Krebsarten, bei denen Tumorzelten aus primären und wieder aufkommenden Tumoren isoliert wurden, aus Lymphknoten und Lebermetastasen und Blut- und Knochenmarksproben und aus Prostatakrebspatienten mit Zellen, die aus primären und wieder vorkommenden Tumorspezies ausgewählt wurden, aus Lymphknoten zusätzlich zu Spezies aus Blut und Knochenmark. Die isolierten Zellen können für Genklonierungszwecke verwendet werden.
Zusätzlich zur Verwendung des in den Beispielen 1–4 zur Genklonierung beschriebenem Material kann es auch zur Untersuchung der Expressionsmuster aller vielversprechenden Gensequenzen verwendet werden.

Claims

Verfahren zur Identifizierung von Genen, die differentiell zwischen Zielzellen exprimiert werden, die aus Tumormanifestationen gewonnen werden, die an verschiedenen Stellen in ein und dem selben Individuum lokalisiert sind, dadurch gekennzeichnet, dass die Zielzellen anfänglich durch wiederholte immunmagnetische Verfahren nachgewiesen und isoliert werden, um bis zu 100% spezifische Zielzellen zu erhalten, bevor die besagten Zielzellen bekannten Genklonierungsverfahren ausgesetzt werden, bei denen die Mengen der mRNA-Expressionen in den Zielzellen verglichen werden, die aus verschiedenen Geweben isoliert wurden, und Gene identifiziert werden, die differentiell zwischen den verschiedenen Geweben exprimiert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Mengen der mRNA-Expressionen durch Vergleichen der Genexpressionsmuster der Zielzellen, die aus verschiedenen Geweben isoliert werden, verglichen werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die Genklonierungsverfahren die zufällige Amplifikation von Gentranskripten, die in den Zielzellen vorhanden sind, umfassen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, Anspruch 2 oder Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendeten Zielzellen maligne Zellen sind, die aus festen primären oder wiederkehrenden Tumoren und/oder aus Metastasen von solchen Tumoren in Lymphknoten und/oder Blut und/oder Knochenmark und/oder Knochengewebe und/oder Leber und/oder Lungen und/oder dem zentralen Nervensystem und/oder malignen pleuralen Effusionen und Ascites, Urin und/oder zerebraler Spinalflüssigkeit und/oder anderen Organstellen gewonnen werden.
Verfahren gemäß jeglichem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die malignen Zellen aus einzelnen Zellsuspensionen isoliert werden, die aus festen Tumormanifestationen hergestellt werden und/oder aus mononuklearen Zellfraktionen, die aus Knochenmark oder Blutproben und/oder aus Zellen, die in anderen Körperflüssigkeiten vorhanden sind, gewonnen werden.
Verfahren zur Identifizierung von Genen, die differentiell zwischen Zielzellen exprimiert werden, die aus Tumormanifestationen gewonnen werden, die an verschiedenen Stellen in ein und dem selben Individuum lokalisiert sind, dadurch gekennzeichnet, dass die Zielzellen anfänglich durch wiederholte immunmagnetische Verfahren nachgewiesen und isoliert werden, um bis zu 100 spezifische Zielzellen zu erhalten, bevor die besagten Zielzellen bekannten Genklonierungsverfahren ausgesetzt werden, bei denen die Mengen der mRNA-Expressionen in den Zielzellen verglichen werden, die aus verschiedenen Geweben isoliert wurden, und Gene identifiziert werden, die differentiell zwischen den verschiedenen Geweben exprimiert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Mengen der mRNA-Expressionen durch Vergleichen der Genexpressionsmuster der Zielzellen, die aus verschiedenen Geweben isoliert werden, verglichen werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die Genklonierungsverfahren die zufällige Amplifikation von Gentranskripten, die in den Zielzellen vorhanden sind, umfassen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, Anspruch 2 oder Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendeten Zielzellen maligne Zellen sind, die aus festen primären oder wiederkehrenden Tumoren und/oder aus Metastasen von solchen Tumoren in Lymphknoten und/oder Blut und/oder Knochenmark und/oder Knochengewebe und/oder Leber und/oder Lungen und/oder dem zentralen Nervensystem und/oder malignen pleuralen Effusionen und Ascites, Urin und/oder zerebraler Spinalflüssigkeit und/oder anderen Organstellen gewonnen werden.
Verfahren gemäß jeglichem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die malignen Zellen aus einzelnen Zellsuspensionen isoliert werden, die aus festen Tumormanifestationen hergestellt werden und/oder aus mononuklearen Zellfraktionen, die aus Knochenmark oder Blutproben und/oder aus Zellen, die in anderen Körperflüssigkeiten vorhanden sind, gewonnen werden.