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Gebiet der
Erfindung
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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich auf ein Verfahren zum Detektieren der Anwesenheit eines interessierenden
Analyten und auf eine Assay-Vorrichtung zur Durchführung des
Verfahrens.
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Hintergrund
der Erfindung
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Es wurden zahlreiche Assays beschrieben, die
von den spezifischen Bindungseigenschaften bestimmter Moleküle Gebrauch
machen, um die Anwesenheit eines interessierenden Analyten in einer
Probe zu detektieren. Typischerweise beinhalten solche Assays die
spezifische Bindung zwischen Immunglobulinen (z. B. Antikörpern oder
funktionellen Bindungsfragmenten derselben) und Haptenen oder Antigenen,
an die die Immunglobuline binden. Beispiele für solche Assays umfassen Enzym-gekoppelte
Immunoassays (ELISAs) und Radioimmunoassay (RIA).
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Um eine Bindung zwischen dem interessierenden
Analyten und einem Bindungspartner, der spezifische Bindungsaktivität dafür hat, zu
detektieren, ist es herkömmlicherweise
notwendig, dass der Bindungspartner markiert wird. Bekannte Markierungen
umfassen Enzyme, radioaktive Markierungen, fluoreszierende oder
chemilumineszierende Markierungen, elektroaktive Markierungen (z.
B. Redoxmarkierungen) und gefärbte
Partikel (z. B. Latexperlen).
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Eine Verfeinerung von Assays der
allgemeinen Art, wie sie oben beschrieben wurden, stellen "Verdrängungs"-Assays dar. In solchen
Assays bewirkt das Vorliegen eines interessierenden Analyten in
einer Probe die Verdrängung
entweder eines markierten Bindungspartners oder eines markierten
Liganden aus einem vorher existierenden Bindungspartner/Ligand-Komplex.
Allgemein ausgedrückt,
die Menge der verdrängten
markierten Substanz wird proportional zur Konzentration des interessierenden Analyten
in der Probe sein. Alternativ kann man "Kompetitions"-Assays anwenden, in denen es einen Wettbewerb
zwischen dem interessierenden Analyten und einem markierten Kompetitor
(z. B. markierter Analyt oder Analogon) bei der Bindung an verfügbare Bindungsstellen
gibt.
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Im Stand der Technik sind mehrere
Assayverfahren beschrieben, die auf einer Kompetition und/oder Verdrängung beruhen.
EP 0 324 540 offenbart z.
B. Assays, die zur Messung der Menge eines freien Liganden (eher
als eines komplexierten Liganden, wobei der komplexierte Ligand
typischerweise proteingebunden ist) in biologischen Proben, wie Plasma
oder Serum, konzipiert sind. Das Assayverfahren erfordert die Verwendung
eines "Signalreagenzes", das ein markierter
monoklonaler Antikörper ist.
Der monoklonale Antikörper
bindet an einen freien Liganden, der in Konkurrenz mit einem Ligandenanalogon
steht (wobei das Analogon nicht an die natürlichen Ligand-komplexierenden
Proteine, die in der Probe vorliegen, bindet). Typischerweise ist
das Analogon immobilisiert (z. B. an Partikeln oder Perlen). Das
Analogon wird so gewählt,
dass es eine niedrigere Affinität
für den
monoklonalen Antikörper gegen
den Liganden hat als der Ligand. Der Assay arbeitet somit auf dem
Prinzip der Immunkompetition, das Vorliegen eines freien Liganden
in der Probe dient zur Verringerung der Menge an markiertem Antikörper, der
mit dem Ligandenanalogon verbunden wird.
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WO 91/05262 offenbart eine Vorrichtung
und ein Verfahren zum Detektieren des Vorliegens von molekularen
Analyten in einem Fluid (speziell z. B. Steroide und andere Analyten
mit niedrigem Molekulargewicht). Typischerweise werden wässrige biologische
Proben durch Kapillarwirkung an einem Teststreifen aufgezogen. Wenn
sich die Probe weiter bewegt, trägt
sie einen markierten Analyten aus einem Speicherungsbereich an einem
Ende des Streifens zu einem ersten Bindungsmittel, das ein Anti-Analyt-Antikörper ist.
In Abwesenheit von freiem Analyten in der Probe wird der markierte
Analyt (z. B. Analyt/Enzym-Konjugat)
an dem ersten Bindungsmittel gebunden zurückbleiben. Wenn allerdings
freier Analyt in der Probe vorliegt, wird dieser versuchen, den markierten
Analyten zu verdrängen
(oder zumindest mit ihm um Bindungsstellen am ersten Bindemittel
zu konkurrieren), so dass etwas markierter Analyt an dem zweiten
Bindungsmittel gebunden wird, welches ein Anti-Enzym-Antikörper ist.
Es wird Farbe entwickelt, indem der Streifen in eine geeignete Substratlösung gegeben
wird.
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EP
0 383 313 offenbart eine Zusammensetzung und ein Assayverfahren "zur Messung von Haptenen,
Antigenen oder Antkörper
durch ein kompetitives Bindungsverfahren". Die darin beschriebene Erfindung verlangt,
dass entweder der Antikörper
oder sein Ligand markiert ist.
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Für
derartige Assays ist das Erfordernis zur Markierung allerdings in
der Praxis ungünstig.
Radioaktive Markierungen stellen bei der Handhabung und Entsorgung
offensichtliche Gefahren dar. Enzyme oder andere aktive Markierungen
können
sich bei der Lagerung verschlechtern, was die Empfindlichkeit des
Assays beeinträchtigt.
Eine Verwendung von gefärbten
Partikeln verursacht dahingehend Probleme, dass die relativ große Oberfläche der
Partikel nicht-spezifische Bindungsstellen einführt, die die Genauigkeit des
Assays beeinträchtigen
können.
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WO 93/25910 betrifft in erster Linie
ein Verfahren zur Analyse mindestens eines Analyten von zwei verschiedenen
Analyten in einer Probe. Das Dokument bezieht sich auf eine "Verdrängung", offenbart aber
keine wahre Verdrängungsreaktion
auf Affinitätsbasis,
sondern eher ein Verfahren, in dem eine einfache Gleichgewichtswirkung
für eine
teilweise Entfernung eines Bindungspartners von einem festen Träger verantwortlich
ist. Außerdem
erfordert WO 93/25910 den Zusatz weiterer spezifischer Reagenzien,
um einen Verlust des Bindungspartners vom festen Träger zu detektieren,
so dass es absolute Zunahme bei der Materialmasse, die an dem festen
Träger
immobilisiert ist, gibt.
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Entsprechend offenbart
EP 0 517 001 keine Verdrängung auf
Affinitätsbasis,
sondern eine reine Kompetition zwischen einem freien Analyten und
einem Oberflächen-gebundenen
konkurrierenden Molekül
zur Bindung an einen Liganden in freier Lösung.
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WO 97/04314, die entsprechend EPO
Art. 54(3) für
die vorliegende Anmeldung relevanten Stand der Technik darstellt,
offenbart ein Assayverfahren und eine Apparatur, wobei bewirkt wird,
dass ein freisetzbar gebundener Bindungspartner durch das Vorliegen
eines freien Analyten in der Probe von einer festen Oberfläche verdrängt wird;
außerdem wird
gelehrt, dass der Analyt vorzugsweise eine höhere Affinität für den festen
Träger
haben sollte. Die Entfernung des Bindungspartners vom festen Träger wird
detektiert, indem Änderungen
in der Resonanzfrequenz eines piezoelektrischen Kristalls gemessen werden.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Nach einem Aspekt stellt die vorliegende
Erfindung ein Verfahren zum Detektieren der Anwesenheit eines interessierenden
Analyten in einer Probe bereit, wobei das Verfahren die folgenden
Stufen umfasst: Inkontaktbringen der Probe mit einem festen Träger, wobei
der feste Träger
einen Teil einer Biosensor-Vorrichtung bildet und reversibel daran
entweder einen Bindungspartner, der spezifische Bindungsaffinität für den Analyten
hat, oder ein Analogon des Analyten immobilisiert hat; wobei die
Bindungsaktivität
einer Wechselwirkung, durch die der Bindungsträger oder das Analogon reversibel
an dem festen Träger
immobilisiert werden, niedriger ist als die Bindungsaffinität des Bindungspartners
für den
interessierenden Analyten bzw. die Bindungsaffinität des festen
Trägers
für den
interessierenden Analyten, so dass der Bindungspartner oder das Analogon
bei Anwesenheit des interessierenden Analyten spezifisch von dem
festen Träger
verdrängt wird,
so dass eine nachweisbare Reduzierung der daran immobilisierten
Materialmasse verursacht wird; und Detektieren einer Reduzierung
der am festen Träger
immobilisierten Materialmasse durch ein anderes Mittel als durch
Detektieren einer Änderung der
Resonanzfrequenz eines piezoelektrischen Kristalls.
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Änderungen
in der Masse des Materials, das am festen Träger immobilisiert ist, können nachweisbare
Veränderungen
bei der Anzahl der massenabhängigen
Phänomene
verursachen, welche beispielsweise durch Sensoren des akustischen
Wellentyps oder des abklingenden Wellentyps oder durch Oberflächenplasmonresonanz
(SPR)-Detektoren, die alle auf dem Fachgebiet bekannt sind (siehe
z. B. die, die in
EP 0 341 927 ,
EP 0 416 730 und
EP 0 453 224 offenbart sind)
detektiert werden können.
Ein besonders geeignetes massenabhängiges Phänomen zur Detektion ist der
Brechungsindex der Oberfläche des
festen Trägers,
auf dem Material immobilisert ist.
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In einem zweiten Aspekt stellt die
vorliegende Erfindung eine Biosensor-Assay-Vorrichtung zum Detektieren des Vorliegens
eines interessierenden Analyten in einer Probe bereit, wobei die
Vorrichtung umfasst: einen festen Träger, der reversibel daran entweder
einen Bindungspartner, der spezifische Bindungsaffinität für den Analyten
hat, oder ein Analogon des Analyten immobilisiert hat; wobei die
Bindungsaktivität
einer Wechselwirkung, durch die der Bindungspartner oder das Analogon
reversibel an dem festen Träger
immobilisiert werden, niedriger ist als die Bindungsaffinität des Bindungspartners
für den
interessierenden Analyten bzw. die Bindungsaffinität des festen
Trägers
für den
interessierenden Analyten, so dass der Bindungspartner oder das Analogon
bei Anwesenheit des interessierenden Analyten spezifisch von dem
festen Träger
verdrängt wird,
so dass eine nachweisbare Reduzierung der darin immobilisierten
Materialmasse verursacht wird; und Detektionsmittel zum Detektieren
einer Reduzierung der am festen Träger immobilisierten Materialmasse
durch ein anderes Mittel als durch Detektieren einer Änderung
der Resonanzfrequenz eines piezoelektrischen Kristalls.
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Das Assayverfahren und die Vorrichtung
der Erfindung können
in qualitativer Weise eingesetzt werden, um das Vorliegen eines
interessierenden Analyten zu detektieren. Sie können auch in quantitativer
Weise verwendet werden, um die Menge des vorliegenden Analyten zu
messen.
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In vielen Ausführungsformen umfassen der Bindungspartner
oder ein Analogon des Analyten wünschenswerterweise
keine Markierung (sind weder damit komplexiert, konjugiert noch
in einer Weise daran gebunden). In bestimmten Ausführungsformen,
wie sie unten erläutert
werden, ist es allerdings wünschenswert,
dass der verdrängte
Bindungspartner oder das Analogon eine nicht-herkömmliche
Markierung umfassen.
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Der Ausdruck "herkömmliche
Markierung", wie
sie hier verwendet wird, bezieht sich auf Markierungen, wie Enzyme,
radioaktive Markierungen, fluoreszierende oder chemilumineszierende
Markierungen, elektroaktive Markierungen (z. B. Redoxmarkierungen)
und gefärbte
Partikel (z. B. Latex oder gefärbte
oder metallische Sole). Alle vorstehend genannten Markierungen sind
in erster Linie in irgendeiner anderen Weise als durch einfaches
Detektieren der Masse der Markierungssubstanz detektierbar. In der
vorliegenden Erfindung basiert die nicht-herkömmliche Markierung in erster
Linie auf ihrer Masse, wodurch ein detektierbares Signal erhalten
wird.
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In am meisten bevorzugten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung ist eine Verdrängung des Bindungspartners
oder Analogon des Analyten ein Ereignis, das direkt detektiert wird
(z. B. typischerweise durch Verwendung eines Sensors vom abklingenden
oder akustischen Wellentyp oder eines SPR-Sensors) und führt zu einem
Signal. Es wird betont, dass im Verfahren/der Vorrichtung der Erfindung das
Signal im Wesentlichen an der Verdrängungsstelle des Bindungspartners
oder Analogons erfolgt und weniger in einer markierten Einheit "gespeichert" wird.
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Der Bindungspartner und der Analyt
sind herkömmlicherweise
Glieder eines spezifischen Bindungspaars. Es sind zahlreiche Beispiele
für solche spezifischen
Bindungspaare bekannt (z. B. DNA und DNA-Bindungsproteine, Hormone
und ihre Rezeptoren, Antigene und Antikörper dazu). Typischerweise ist
der Bindungspartner ein Protein, vorzugsweise ein Immunglobulin
(z. B. Antikörper)
oder ein funktionelles Bindungsfragment davon, wobei dieser Ausdruck sich
auch unter anderem auf Fv, scFv, Fab, Fab2 und dergleichen
bezieht. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist der Bindungspartner
ein Protein, das spezifische Bindungsaktivitäten für zwei verschiedene Liganden
hat. Beispiele für
solche Proteine sind bispezifische Antikörper oder "Diabodies"; die dem Fachmann gut bekannt sind.
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Der reversibel immobilisierte Partner
oder das reversibel immobilisierte Analytenanalogon kann in einer
Vielzahl von Arten an den festen Träger gebunden sein; diese werden
dem Fachmann bekannt sein. Der Bindungspartner oder das Analytenanalogon
kann normalerweise durch Anwendung besonderer Chemikalien (z. B.
Lösungen,
wie 50 mM Glycin, gepuffert auf einen sehr niedrigen pH [≈pH2], oder
50 mM Diethylamin, gepuffert auf einen sehr hohen pH [≈pH12] und
dergleichen), allerdings unter Bedingungen, bei denen der Assay
durchgeführt
wird (z. B. die, die allgemein in biologischen Systemen vorgefunden
werden) entfernt werden, wird aber vom festen Träger nur durch Vorliegen des
interessierenden Analyten entfernt. Typischerweise wird die untersuchte
Probe eine biologische Probe sein (z. B. eine Körperflüssigkeit, wie Urin, Vollblut
oder Serum) und die Assay-Bedingungen werden in großem Rahmen physiologisch
sein (z. B. etwa 10–40°C, etwa pH 5–9), so
dass der Bindungspartner oder das Analytenanalogon nur in Gegenwart
des interessierenden Analyten vom festen Träger gelöst wird.
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Das erfindungsgemäße Assay-Verfahren kann in
irgendeinem von mehreren verschiedenen Formaten durchgeführt werden
oder die Assayvorrichtung kann nach irgendeinem von mehreren verschiedenen
Formaten verwendet wurden. Beispielsweise kann der reversibel immobilisierte
Bindungspartner ein Immunglobolin sein, das über Wechselwirkung mit einem
Antigen, das der interessierende Analyt ist, an einem festen Träger gebunden
ist. Das Vorliegen hoher Konzentrationen des freien Antigens in
der Probe wird die Tendenz zeigen, eine Verdrängung des Immunglobolins vom
festen Träger
zu bewirken. Ein derartiger Assay wird im Allgemeinen nur wirksam
sein, wenn in der Probe eine hohe Konzentration an freiem interessierenden
Analyten vorliegt.
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Zweckdienlicherweise wird in einer
Ausführungsform
ein Analogon des interessierenden Analyten (via kovalente Wechselwirkungen)
an einem festen Träger
immobilisiert. Verfahren, die geeignet sind, dieses zu erreichen,
sind dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt. Ein für den Analyten
spezifischer Bindungspartner wird dann (vergleichsweise lose) an
das Analogon des Analyten (via nicht-kovalente Wechselwirkungen)
binden gelassen, so dass der Bindungspartner reversibel an dem festen
Träger immobilisiert
wird. Eine bevorzugte Ausführungsform der
Erfindung hat daher ein Immunglobulin über einen nicht kovalente Wechselwirkung
mit einem Analogon des interessierenden Analyten an einem festen Träger gebunden
(das Analogon ist typischerweise kovalente an den festen Träger gebunden),
wobei das Immunglobulin eine geringere Affinität für das Analogon als für den Analyten
hat. Dementsprechend wird das Vorliegen des interessierenden Analyten
in der Probe selbst bei niedrigen Konzentrationen die Tendenz zeigen,
eine Verdrängung
des Immunglobulins zu bewirken. Wünschenswerterweise ist die
Bindungsaffinität
des Immunglobulins für
den interessierenden Analyten 5 bis 100 mal größer als seine Affinität für das Analogon,
typischerweise ist sie 10 bis 20 mal größer.
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Aus offensichtlichen Gründen wird
das Verfahren/die Vorrichtung der Erfindung besonders vorteilhaft
sein, wenn es/sie auf die Detektion von Analyten mit relativ niedrigem
Molekulargewicht (z. B. Steroide und dergleichen), die Molekulargewichte von
etwa 5 kD oder weniger haben, angewendet wird. Ein solcher Analyt
ist das Steroidöstradiol
oder Metaboliten davon, wie z. B. Östron-3-glucuronid. Wenn z. B. der interessierende
Analyt Östron-3-glucuronid
ist, so kann ein geeignetes Analogon davon zur Verwendung beim Detektieren
des Vorliegens des Analyten gemäß der Erfindung
Estriol-3-glucuronid sein. Andere möglicherweise geeignete Analoge werden
dem Fachmann auf diesem Gebiet einfallen und umfassen z. B. Östron, Östron-3-sulfat,
Estriol, Estradiol-3-glucuronid.
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In einer alternativen Ausführungsform
kann das Assayverfahren der Erfindung eine Verdrängung nicht eines Bindungspartners
des Analyten, sondern eines Analogon des Analyten beinhalten. Beispielsweise
kann ein Immunglobulin an einem festen Träger derart immobilisiert sein,
dass mindestens eine Antigenbindungsstelle für das Binden des Antigens verfügbar ist.
Typischerweise werden vor Durchführung
des Assays im wesentlichen alle verfügbaren Bindungsstellen durch
ein Analogon des interessierenden Analyten besetzt, wobei das Immunglobulin eine
geringere Bindungsaffinität
für das
Analogon als für
den interessierenden Analyten hat, so dass bei Zugabe einer Probe,
die den interessierenden Analyten enthält, das Analogon von der Bindungsstelle
des Immunglobulins verdrängt
werden wird.
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Das Immunglobulin (z. B. IgM) könnte eine Vielzahl
von Bindungsstellen haben, so dass eine Bindungsstelle mit einem
an einen festen Träger
gebundene Antigen wechselwirkt, eine andere frei bleibt, um vor
einem Assay durch das Analytenanalogon besetzt zu werden. Alternativ
könnte
der Antikörper
eine einzelne Bindungsstelle (wie Fv- oder Fab-Fragmente von Ig)
besetzen, aber an einem festen Träger derart immobilisiert sein,
dass die einzelne Bindungsstelle für die Besetzung verfügbar ist.
Immunglobulinmoleküle
(z. B. IgG) können
zweckdienlicherweise über
einen Anti-Fc-Antikörper
immobilisiert werden, wie es in Beispiel 2 unten beschrieben wird.
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Somit wird in einer Ausführungsform
ein Anti-Fc-Antikörper
(typischerweise über
eine kovalente Wechselwirkung) an einem festen Träger immobilisiert.
Ein zweiter Antikörper,
der für
den interessierenden Analyten spezifisch ist, wird dann durch den Anti-Fc-Antikörper an
dem festen Träger
eingefangen. Die Bindungsstellen des Analyten spezifischen Antikörpers werden
dann im wesentlichen vollständig durch
ein Analogon des interessierenden Analyten besetzt, so dass das
Analogon reversibel an dem festen Träger immobilisiert ist, und
zwar via nicht-kovalenter Wechselwirkung mit dem Analyten-spezifischen
Antikörper.
Die Affinität
des Analyten spezifischen Antikörpers
für den
interessierenden Analyten ist wünschenswerterweise
5 bis 10 mal größer als seine
Affinität
für das
Analogon.
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Der feste Träger bildet einen Teil einer
Biosensorvorrichtung. Ein Biosensor kann als analytische Vorrichtung
definiert werden, die eine biologische molekulare Erkennungskomponente
umfasst, wobei die Vorrichtung typischerweise in Abhängigkeit vom
Vorliegen und/oder der Konzentration eines Analyten, der mit der
biologischen Erkennungskomponente wechselwirkt, ein elektronisches
Signal produziert.
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Solche Biosensorvorrichtungen sind
gut bekannt und werden z. B. in
EP
0 341 927 ,
EP 0 416 730 und
EP 0 453 224 beschrieben.
Vorzugsweise detektiert der Biosensor eine Änderung in einer massenabhängigen Eigenschaft
des festen Trägers
(z. B. Geschwindigkeit der Fortpflanzung einer akustischen Welle,
Weiterleitung einer abklingenden Welle oder Oberflächenplasmonresonanz).
Beispiele einer solchen Vorrichtung, die die abklingende Welle oder
das SPR-Phänomen ausnutzen
(Hutchinson 1995 Molecular Biotechnology 3, 47–54 und darin angegebene Literaturstellen),
umfassen die Vorrichtungen BIAlite
TM und
BIAcore
TM, die von Biacore AB vertrieben werden,
die Vorrichtung IAsys
TM, die von Affinity
Sensors Limited (UK) vertrieben wird und die Vorrichtung BIOS-1,
die von Artificial Sensor Instruments Zürich, Schweiz) vertrieben wird.
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Eine Verdrängung von Antikörpermolekülen von
den Sensoroberflächen
solcher Vorrichtungen verursacht eine relativ große Verringerung
der Masse, die leicht detektierbar ist. In solchen Ausführungsformen,
in denen ein Analogon des Analyten von Interesse durch den Analyten
verdrängt
wird, wird es allerdings für
den Fachmann einzusehen sein, dass das Analogon für Sensoren
des abklingenden Wellentyps und anderer massenabhängiger Biosensoren ein
ausreichend höheres
Molekulargewicht als der Analyt haben muss, anderenfalls kann die
Nettoveränderung
in der Masse sehr gering sein und somit schwer nachzuweisen sein.
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Wenn der Analyt eine Verbindung mit
niedrigem Molekulargewicht ist, z. B. ein Steroid oder ein Peptid,
kann das Analogon mit einer Substanz mit hohem Molekulargewicht
konjugiert werden, so dass eine höhere Molekulargewichtsdifferenz
zwischen dem Analyten und dem Analogon geschaffen wird. Substanzen
mit hohem Molekulargewicht, die für eine Konjugation geeignet
sind, umfassen Proteine wie z. B. Ovalbumin oder Rinderserumalbumin
(BSA) oder andere Einheiten wie Lipide und dergleichen. Es ist zu
betonen, dass diese Substanzen keine herkömmlichen Markierungen wie Enzyme,
radioaktive Markierungen, fluoreszierende oder chemilumineszierende
Tags, Redoxmarkierungen oder gefärbte Partikel
und dergleichen sind, sondern lediglich dazu dienen, eine Ungleichheit
im Molekulargewicht zwischen dem Analyten und dem Analogon zu schaffen.
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Wenn das Analogon alternativ ein
Peptid ist, kann das Molekulargewicht des Analogon bezüglich des
Analyten erhöht
werden, indem ein Peptid als Teil eines Fusionsproteins verwendet
wird. Zweckdienlicherweise kann das Peptid an das N-Ende oder bevorzugter
das C-Ende eines Polypeptids fusioniert werden. Verfahren zur Konstruktion
von DNA-Sequenzen, die für
solche Fusionsproteine codieren, sind dem Fachmann gut bekannt.
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Die angefügte Molekülmasse, die durch das Polypeptid
dargestellt wird, kann als nicht-herkömmliche Markierung angesehen
werden. Allerdings darf das fusionierte oder gegebenenfalls konjugierte
Polypeptid anders als eine Enzymmarkierung keine besondere Aktivität zurückbehalten,
so dass die Assaykomponente infolge eines Aktivitätsverlusts
während der
Lagerung nicht weniger empfindlich wird. Entsprechend wird die Verwendung
eines einzelnen Polypeptid eher als eine vergleichsweise große Latexperle
(wie im Stand der Technik) wenige nicht-spezifische Bindungsstellen einführen, so
dass die Genauigkeit des Assays nicht nachteilig beeinflusst werden wird.
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Kurze Beschreibung
der Figuren
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1 zeigt
die Strukturformeln der Verbindungen (I) Östron-β-D-glucuronid (abgekürzt als Östron-3-glucuronid oder E3G)
und (II) Estriol-3-(β-D-glucuronid)
(abgekürzt
als Estriol-3-glucuronid), wobei diese Verbindungen nachfolgend
im Beispiel 1 verwendet werden;
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2 ist
eine schematische Darstellung des Assayformats, das in Beispiel
1 unten beschrieben wird;
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3 ist
ein Sensorgramm (willkürliche
Resonanzeinheiten, "REs", gegen die Zeit,
gemessen in Sekunden), das die Herstellung eines Estriol-3-glucuronid-Sensorchips
zeigt;
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4 ist
ein Diagramm von Resonanzeinheiten gegen Zeit (Sekunden), das die
Verdrängung des
4155-Antikörpers
durch Östron-3-glucuronid zeigt;
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5 ist
ein Diagramm der Menge an 4155-Antikörper, die verdrängt wird,
(REs), gegen die Konzentration von Östron-3-glucuronid (nM);
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6 ist
eine schematische Darstellung des Assayformats, das in Beispiel
2 unten beschrieben wird;
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7 ist
ein Sensorgramm (willkürliche
Resonanzeinheiten gegen die Zeit in Sekunden), das die Herstellung
eines Kaninchen-Anti-Maus (RAM)-Fc-Sensorchips zeigt;
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8 ein
Sensorgramm (Resonanzeinheiten gegen die Zeit in Sekunden), das
die Bindung von Anti-humanes Milchfettglobulin-HMFG1-Antikörper an
einen RAM-Fc-Sensorchip und die Bindung von CPDTR-Peptid-Konjugat an
den HMFG1-Antikörper zeigt;
und
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9 ist
ein Sensorgramm (Resonanzeinheiten gegen Zeit, in Sekunden), das
die Verdrängung
von CPDTR-Peptid-Konjugat vom HMFG1-Antikörper durch KPDQR-Peptid zeigt.
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BEISPIELE
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Beispiel 1
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In diesem Beispiel wird ein Assay
beschrieben, der Oberflächenplasmonresonanz
(SPR) verwendet. Dieses Phänomen
wurde in verschiedenen Publikationen beschrieben und ist die Basis
von Biosensoren mit abklingender Welle (für eine Übersicht, siehe Hutchinson
1995, wie oben zitiert).
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Zusammenfassend ausgedrückt, Licht,
das auf eine Grenzfläche
zwischen zwei Medien unterschiedlicher Brechungsindizes fällt, wird
bei einem spezifischen Einfallswinkel eine "abklingende" Resonanzwelle erzeugen. Die Resonanz
ist gegenüber Änderungen
im Brechungsindex der Medien extrem empfindlich. Eine Änderung
im Brechungsindex bewirkt, dass Resonanz bei einem neuen Einfallswinkel auftritt.
Die Änderung
im Brechungsindex wird durch Massenbindung an einen dünnen Goldfilm
an der Grenzfläche
zwischen den zwei Medien verursacht: Die Änderung im Brechungsindex ist
proportional zu der Masse, die an dem Goldfilm gebunden ist.
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Dieses Beispiel betrifft einen Assay
für die Detektion
von Östron-3-glucuronid
(ein Steroidhormonmetabolit) und beinhaltet die Verwendung eines Analogon
desselben, Estriol-3-glucuronid. Details der Strukturen dieser Verbindungen
sind in 1 angegeben.
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Außerdem verwendet dieses Beispiel
den Biosensor für
abklingende Wellen Pharmacia BIAliteTM (Jonsson
et al., 1991 BioTechniques II. 620–627).
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2 erläutert das
Assayverfahren schematisch. In Schritt "A" wurde
ein Analogon (Estriol-3-glucuronid, das in 2 durch einen ausgefüllten Kreis dargestellt ist)
des interessierenden Analyten kovalent an der aktivierten mit Dextran überzogenen Oberfläche eines
festen Trägers
(ein Sensorchip des Pharmacia BIAliteTM -Biosensors)
kovalent immobilisiert. In Schritt "B" wurde dann
ein Antikörper
(monoklonaler 4155, der durch die Y-Form gekennzeichnet wird), der
für Östron-3-glucuronid
spezifisch ist, das immobilisierte Analogon binden gelassen. Der
Antikörper
hat eine vergleichsweise niedrige Bindungsaffinität für das Analogon,
so dass der Antikörper
relativ lose an dem Biosensorchip gehalten wird (reversibel immobilisiert
ist). Eine Einführung
einer Probe, die den interessierenden Analyten enthält (für den der Antikörper eine
vergleichsweise hohe Affinität
hat, wird daher bewirken, dass der Antikörper vorzugsweise eher an den
Analyten (Schritt "C") als an das immobilisierte
Analogon bindet, wodurch eine Verdrängung des Antikörpers vom
Sensorchip verursacht wird; diese Verdrängung kann durch die Sensorvorrichtung
in einfacher Weise detektiert werden.
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Als erster Schritt wurde Estriol-3-glucuronid an
einem Sensorchip im BIAliteTM-Biosensor immobilisiert.
Das Immobilisierungsverfahren war im Wesentlichen so, wie es von
Johnsson et al. (1995, J. Molec. Recognition 8, 125–131) und
von O'Shanessy et
al. (1992, Analytical Biochemistry, 205, 132–136) beschrieben wird. Zusammenfassend
war das Verfahren wie folgt:
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Ein CM5-Sensorchip wurde in das BIAliteTM-Instrument eingebaut und in HBS-Laufpuffer äquilibriert.
Die Instrumentenpumpenströmungsgeschwindigkeit
wurde auf 5 μl/min
eingestellt und die Temperatur wurde bei 25°C gehalten.
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Danach wurde die Dextranoberfläche unter Verwendung
von 1-Ethyl(dimethylaminopropyl)carbodiimid
(EDC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) als aktivierende Chemikalien
aus dem Pharmacia-Aminkupplungskit aktiviert, indem das EDC/NHS-Gemisch in
die Probenschleife injiziert wurde und 35 μl auf die Dextranoberfläche aufgeladen
wurden. Eine EDC/NHS-Aktivierung kann an Position (1) auf dem Sensorgramm
in 3 erkannt werden.
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Nachdem die Oberfläche durch
EDC/NHS, 20% (V/V), aktiviert war, wurde Ethylendiamin (EDA) (Fluka,
Code 03550) in Wasser in die Probenschleife injiziert. 35 μl dieser
Lösung
wurden auf die Oberfläche
aufgebracht. Dies verändert
die Oberflächengruppen
von Carboxyl in derivatisiertes Amin. Dies kann in Position (2)
auf dem Sensorgramm in 3 erkannt
werden.
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Estriol-3-glucuronid (Sigma, Code
E-2002) wurde mit einer Konzentration von 1,1 mg/ml im EDC/NHS-Aktivierungsgemisch
gelöst
und 7 Minuten reagieren gelassen. Diese Lösung wurde dann in die Probenschleife
injiziert und 57 μl
dieser Lösung wurden
auf die Dextran/EDA-Oberfläche
aufgebracht. Dies ist in Position (3) auf dem Sensorgramm in 3 zu erkennen.
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Der Sensorchip wurde dann mit HEPES-gepufferter
Salzlösung
(HBS) gewaschen.
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Der Assay wurde dann folgendermaßen durchgeführt:
- i) Der Estriol-3-glucuronid-Sensorchip wurde
in das BIAliteTM-Gerät eingebaut und mit HBS-Laufpuffer äquilibriert.
Die Temperatur wurde bei 25°C gehalten
und die Pumpenströmungsgeschwindigkeit
wurde bei 5 μl/min
gehalten.
- ii) Monoklonaler Mausantikörper,
der für Östron-3-glucuronid
spezifisch war (produziert durch die Zelllinie "4155"),
wurde in HBS-Puffer auf 30 μg/ml
verdünnt.
Diese Lösung
wurde in die Probenschleife injiziert und 35 μl wurden auf die Biosensorchipoberfläche aufgebracht.
Die monoklonale Zelllinie 4155 wurde hergestellt und nach den Verfahren,
die von Gani et al., (1994, J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 48,
277–282)
beschrieben wurden, durchgemustert. Die Publikation von Gani et
al. bezieht sich auf die Entwicklung von Anti-Progesteron-Antikörpern, allerdings
wurden im Wesentlichen identische Techniken bei der Herstellung
von Antikörpern
verwendet, die mit Östron
und Analoga davon reagieren. Andere Antikörper als die aus der Zelllinie
4155 erhältlichen, können vom
Fachmann in einfacher Weise (unter Anwendung solcher Techniken)
hergestellt werden: solche Antikörper
würden
qualitativ ähnliche Eigenschaften
haben. Darüber
hinaus wird ein im Handel verfügbarer
monoklonaler Anti-Östronglucuronid-Antikörper (von
Wallaceville Animal Research Centre, Neuseeland) in Linscott's Directory of Immunological
and Biological Reagents (9. Ausgabe, 1996–7) beschrieben.
- iii) Östron-3-glucuronid
(Produkt von Sigma, Code E1752) wurde mit 1 mg/ml in HBS-Puffer
gelöst. Dieses
wurde außerdem
mit HBS-Puffer zu Konzentrationen von 20,5 nM, 2,05 nM bzw. 0,205
nM verdünnt.
Die verwendeten Konzentrationen stellen die physiologischen Konzentrationen
von E3G dar, die in Urin gefunden werden (Stancyzk et al., 1930,
Am. J. Obs. & Gynae,
137(4), 443–450). Die
E3G-Lösung mit
20,5 nM wurde in die Probenschleife injiziert und 35 μl wurden
auf die Biosensorchipoberfläche
aufgebracht, um den gebundenen 4155-Antikörper zu verdrängen.
- iv) Nachdem die Injektion beendet war, wurde der restliche Antikörper unter
Verwendung einer 10 μl-Beladung
mit 100 mM HCL auf der Biosensorchipoberfläche entfernt.
- v) Die Schritte (ii) bis (iv) wurden unter Verwendung der Östron-3-glucuronid-Verdünnungen
mit 2,05 nM bzw. 0,205 nM wiederholt.
-
Sensorchipherstellung
-
Das Sensorgramm für die Immobilisierung des Sensorchips
ist in 3 gezeigt. Das
an die Oberfläche
gebundene Steroid kann durch Suchen auf der Sensorgrammbahn und
Vergleichen der Grundlinie vor Immobilisierung und nach Immobilisierung
nicht detektiert werden. Der Grund ist, dass das Molekulargewicht
von Estriol-3-glucuronid unter der Nachweisgrenze des BIAliteTM liegt.
-
Untersuchung der Verdrängungsreaktion
mit dem Estriol-3-glucuronid-Sensorchip
-
Der 4155-Antikörper war fähig, in großen Mengen an das Estriol-3-glucuronid
zu binden, das kovalent an den Sensorchip gebunden worden war. Der
4155-Antikörper wurde
nach Injektion des Östron-3-glucuronids
von der Oberfläche
des Chips verdrängt.
Die Menge an Antikörper,
die durch Östron-3-glucuronid
verdrängt
wurde, war von der Steroidkonzentration abhängig (siehe 4: die durchgezogene Linie hat Resultate
unter Verwendung von 0,2 nM E3G, die unterbrochene Linie zeigt Resultate, die
mit 2,0 nM E3G erhalten wurden, und die gepunktete Linie zeigt Resultate,
die unter Verwendung von 20 nM E3G erhalten wurden). Um zu zeigen,
dass eine lineare Korrelation bestand, wurde ein Diagramm (5) gezeichnet, indem die
Steroidkonzentration gegen (i) die Menge an verdrängtem Antikörper in
REs (vertikale Achse links) und (ii) der %- Gehalt an verdrängten Antikörpern im Vergleich zur Menge,
die an der Oberfläche
gebunden war (vertikale Achse rechts) aufgetragen wurde.
-
Die Konzentrationen an Östron-3-glucuronid (E3G),
die im Experiment verwendet wurden, umspannen den physiologischen
Bereich der E3G-Konzentrationen, die in humanen Urinproben gefunden wurden.
Im Verdrängungsexperiment
ist klar zu sehen, dass die Menge an Antikörper, die durch E3G-Steroid
verdrängt
wird, proportional zur Konzentration des E3G ist (siehe 5).
-
Die Verdrängungsreaktion demonstriert
die Möglichkeit
einer Messung kleiner molekularer Liganden mit dem Biosensor, welche
unterhalb der Mindestschwelle zur Detektion durch Oberflächenplasmonresonanz
mit dem BIAliteTM-Instrument liegen. Die
Verdrängungsreaktion
kann die Basis für neue
Immunoassayformate bilden, die keine Markierung von Reagenzien mit
Enzymen oder radioaktiven Molekülen
erfordert. Alles was für
diesen Assaytyp notwendig ist, um zu arbeiten, ist ein Antigenanalogon
mit niedriger Affinität,
das an dem Dextran immobilisiert werden kann.
-
Beispiel 2
-
Verdrängung von kreuzreaktiven synthetischen
Peptid-Ovalbumin-Konjugaten vom HMFG1-Antikörper
-
In 6 ist
eine schematische Darstellung dieser Verdrängungsreaktion zu sehen.
-
Was 6 angeht,
so ist der feste Träger
der Sensorchip des Pharmacia BIAliteTM-Biosensors,
der mit aktiviertem Dextran überzogen
ist. Ein erster Antikörper
(polyklonales Kaninchen-Anti-Mausimmunglobulin G ["RAM"], das für den Fc-Teil
von IgG spezifisch ist) wurde kovalent am aktivierten Dextran immobilisiert
("A"). Als Nächstes wurde
ein zweiter (Maus-)Antikörper,
der für
den interessierenden Analyten spezifisch ist, zugesetzt ("B"). Der interessierende Analyt ist in
diesem Beispiel ein Peptid (KPDQR), abgeleitet vom humanen Milchfettglobulin (HMFG)1-Protein.
Der monoklonale Antikörper
gegen HMFG1 wird von Taylor-Papadimitriou et al (1981, Int. J. Cancer
28, 17) beschrieben. Der monoklonale Anti-HMFG1-Antikörper wird
durch den ersten Antikörper
RAM am Sensorchip eingefangen. Die Moleküle des ersten und zweiten Antikörpers sind
in der Figur durch die Y-Formen dargestellt.
-
Als Nächstes wurde ein Analogon (Peptid CPDTR
unter Verwendung des Einbuchstabenaminosäurecodes) des interessierenden
Peptidanalyten eingeführt.
In diesem Beispiel sind sowohl der Analyt als auch das Analogon
Peptide mit niedrigem Molekulargewicht, die durch Unterschiede im
Molekulargewicht nicht leicht unterschieden werden können. Folglich
wurde ein Polypeptid mit hohem Molekulargewicht (Ovalbumin) chemisch
an das Peptidanalogon konjugiert. Dieses Peptid-Ovalbumin-Konjugat (in 6 als ausgefüllte ovale
Form dargestellt) wurde mit relativ niedriger Affinität durch
den Anti-HMFG1-Antikörper
gebunden, so dass das Analogon reversibel am festen Träger (C)
immobilisiert war. Als der interessierende Peptidanalyt (KPDQR,
in 6 als ausgefülltes Dreieck
dargestellt) eingeführt wurde,
tendierte der Anti-HMFG1 dazu, vorzugsweise daran zu binden (mit
einer höheren
Affinität
für den
interessierenden Analyten als für
das Analogon). Folglich ("D") wurde der Analyt
an den Sensorchip gebunden und das Analogon-Ovalbumin-Konjugat mit
höherem
Molekulargewicht wurde verdrängt.
Die Änderung
bei der Masse, die an den Sensorchip gebunden war, kann durch die
BIAliteTM-Vorrichtung detektiert werden.
-
a) Herstellung eines polyklonalen
Kaninchen-Anti-Maus-Immunglobulin G(Fc-spezifischen)-Sensorchips
-
- i) Ein Carboxymethyldextran (CM5)-Sensorchip (Pharmacia,
Code BR-1000-14)
wurde in das BIAliteTM-Instrument eingebaut
und in der HEPES-gepufferten Salzlösung (HBS) (Pharmacia, Code
BR-1001-88) äquilibriert.
Die Instrumentenströmungsgeschwindigkeit
wurde auf 5 μl/min
eingestellt und die Temperatur wurde bei 25°C gehalten.
- ii) Die Dextranoberfläche
wurde dann unter Verwendung der Aktivierungschemikalien EDC und NHS
aus dem Aminkupplungskit (Pharmacia, Code BR-1000-50) aktiviert.
Das EDC/NHS-Gemisch wurde in die Probenschleife injiziert und 35 μl dieser
Lösung
wurden auf die Dextranoberfläche
aufgebracht. Die EDC/NHS-Aktivierung kann in Position (1) am Sensorgramm
in 7 erkannt werden.
- iii) Polyklonales Kaninchen-Anti-Maus-Immunglobulin G (Fc-spezifisch)
(RAM-Fc) (Pharmacia, Code
BR-1000-57) wurde in 10 mM Acetatpuffer, pH 5,0, auf 50 μg/l verdünnt und
in die Probenschleife injiziert. 35 μl dieser Lösung wurden auf die Dextranoberfläche aufgetragen.
Die Kopplung des RAM-Fc an Dextran kann in Position (2) am Sensorgramm
in 7 erkannt werden.
- iv) Sobald die RAM-Fc-Auftragung vollständig war und ungebundenes RAM-Fc
mit HBS-Laufpuffer von der Dextranoberfläche gewaschen war, wurden die
verbleibenden aktivierten Esterstellen an der Dextranoberfläche mit
Ethanolamin umgesetzt. 1M Ethanolamin, pH 8,5 (Pharmacia Aminkupplungskit,
Code BR-1000-50)
wurde in die Probenschleife injiziert und 35 μl auf die Dextran/RAM-Fc-Oberfläche aufgetragen.
Dies ist in Position (3) auf dem Sensorgramm in 7 zu erkennen.
- v) Um nicht-kovalent gebundenes RAM-Fc von der Oberfläche zu entfernen,
wurden 100 mM HCl in die Probenschleife injiziert und 10 μl dieser
Lösung
wurden auf die Dextran/RAM-Fc-Oberfläche aufgetragen. Dies kann
in Position (4) auf dem Sensorgramm in 7 gesehen werden.
-
b) Herstellung der synthetischen
Peptide Cys-Pro-Asp-Thr-Arg (CPDTR) und Lys-Pro-Asp-Gln-Arg (KPDQR) für die Verdrängungsreaktion
-
Die hier verwendeten Peptide waren
modifizierte Varianten der natürlichen
Epitopsequenz Pro-Asp-Thr-Arg CPDTR) im humanen Milchfettglobulin
1-Protein, an die der Antikörper
Anti-HMFG1 bindet (Briggs et al., 1991, Immunology 73, 505–507). Das
Cys (C) in CPDTR wurde hinzugefügt, damit
das Peptid an im Handel verfügbares
Maleimid-aktiviertes Ovalbumin koppeln kann und ein nützliches
Konjugat bilden kann. Dieses Konjugat ist notwendig, da das Peptid
alleine keine ausreichende Masse hat, um durch das BIAliteTM-Instrument detektiert zu werden. Es gibt
eine Schwelle von etwa 5000 Dalton für die Masse, die notwendig
ist, damit Moleküle
mit dem BIAliteTM-Instrument nachgewiesen werden.
-
Während
sich die in diesem Beispiel beschriebene Arbeit auf Experimente
bezieht, die mit dem monoklonalen Antikörper HMFG1 durchgeführt wurden,
können
vom Fachmann auf diesem Gebiet in einfacher Weise anderer Antikörper mit
qualitativ ähnlichen
Eigenschaften produziert werden. Darüber hinaus wird ein im Handel
verfügbarer
monoklonalen Antimilchfettglobulin-Antikörper (von Paesel & Lorei GmbH, Hanau,
Deutschland) in Linscott's
Directory of Immunological and Biological Reagents (9. Ausgabe,
1996–7)
beschrieben.
-
Bei der Arbeit zur Identifizierung
der kritischen Aminosäurereste
innerhalb des HMFG1-Epitops (Price et al., 1991 J. Immunological
Methods 139, 83–90)wurde
eine Reihe von Varianten geschaffen, die Affinitäten hatten, die sich von denen
der nativen PDTR-Sequenz unterschieden. Pro-Asp-Gln-Arg (PDQR) ist
ein Analogon der PDTR-Sequenz, die eine höhere Affinität für den HMFG1-Antikörper hat
als PDTR. Das Peptid KPDQR wurde mit einem N-terminalen Lysin synthetisiert,
um die Löslichkeit
des Peptids zu verbessern. Da dieses Peptid allerdings die PDQR-Sequenz
enthielt, war es auch zur Untersuchung der Immunverdrängungsreaktion
geeignet. Das N-terminale Lysin könnte ohne wesentliche schädliche Effekte
weggelassen werden.
- i) Peptide wurden an einem
halbautomatischen Synthesizer Novabiochem GEM unter Verwendung von
Standardtechniken, wie sie früher
veröffentlicht
worden waren, synthetisiert (Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc.
85, 2149–2154).
Kurz ausgedrückt,
Fmoc-Aminosäurereagenzien
(Novabiochem) wurden sequentiell unter Verwendung der PyBOP-Chemie
aktiviert (Grant, 1992, "Synthetic
peptides. A user's
guide" pub. W. H. Freeman & Co. New York).
Diese aktivierten Aminosäuren
wurden an den festen Träger
Novasyn TGR-Harz (0,8 g) (Novabiochem) gekoppelt, um das geschützte Peptid
zu produzieren, das an eine feste Matrix gebunden war. Während der Synthese
wurde das Lösungsmittel
Dimethylformamid (DMF) verwendet. Die Peptide wurden mit Essigsäureanhydrid
(10% in DMF) umgesetzt, um die N-Termini zu blockieren.
- ii) Die Schutzgruppen wurden vom Peptid entfernt und abgespalten,
wobei Standardspaltungsbedingungen mit 20 ml Spaltungslösung pro
Peptid verwendet wurden [92,5% (V/V) Trifluoressigsäure (TFA)
(Aldrich), 2,5% (V/V) Ethandithiol (Aldrich), 2,5% (V/V) Wasser,
2,5% (V/V) Triisopropylsilan (Aldrich)]. Die Lösung wurde filtriert, um das
Harz zu entfernen, und dann im Vakuum bei 30°C mit einer Kühlfalle
(Trockeneis/Aceton) einer Rotationsverdampfung unterzogen, um überschüssige Lösungsmittel
zu entfernen. Dieses Verfahren nahm 30 Minuten in Anspruch.
- iii) Restliche chemische Kontaminanten wurden durch Präzipitieren
des Peptids mit Diethylether und wiederholte Extraktion dieses Präzipitats
mit einem Überschuss
an Diethylether entfernt.
- iv) Das Peptidpräzipitat
wurde dann mit Wasser solubilisiert und gefriergetrocknet. Das resultierende
Pulver wurde bei –20°C gelagert,
bis es benötigt
wurde.
-
c) Herstellung des CPDTR-Peptid-Ovalbumin-Konjugats
-
Das Peptid wurde in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS)
in einer Konzentration von 5 mg/ml aufgelöst und 5 Milligramm voraktiviertem
Maleimidovalbumin (Pierce), gelöst
in 1 ml PBS, vermischt. Dieses Gemisch wurde 2,5 Stunden bei Raumtemperatur
reagieren gelassen. Das überschüssige Peptid wurde
dann durch Dialysieren der Probe gegen 5L PBS + 0,1% Natriumazid
(Sigma) für
16 Stunden bei 4°C
entfernt.
-
Das Konjugat wurde dann aus der Dialyse entfernt
und bei 4°C
gelagert, bis es benötigt
wurde.
-
d) Verdrängung des
CPDTR-Peptid-Ovalbumin-Konjugats vom monoklonalen HMFG1-Antikörper mit KPDQR-Peptid
-
Der polyklonale Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper (Fc-spezifisch)-Biosensorchip
wurde in das BIAliteTM-Instrument gegeben
und das Verfahren des Anschließens
durchgeführt.
Der HEPES-gepufferte Kochsalz (HBS)-Laufpuffer (Pharmacia-Produkt, Code BR-1001-88)
wurde auf eine Strömungsgeschwindigkeit
von 5 μl/min
eingestellt.
-
Ein typisches Sensorgramm für die Herstellung
des RAM-Fc-Sensorchips ist in 7 gezeigt. Was 7 angeht, so stellt 1 die
EDC/NHS-Aktivierung der Dextranoberfläche dar, stellt 2 die RAM-Fc-Kupplung
an das aktivierte Dextran dar, stellt 3 die Blockierung der restlichen
aktivierten Dextranstellen mit Ethanolamin dar und stellt 4 einen
100 mM HCl-Impuls zur Entfernung nicht kovalent gebundener Substanzen
dar.
-
Monoklonaler Mausantikörper, der
für humanes
Milchfettglobulin 1 spezifisch ist, wurde in HBS-Puffer auf 50 μg/ml verdünnt und
35 μl dieser Lösung wurden
in den Biosensorchip injiziert. Nach der Injektion wurde der Biosensorchip
automatisch gewaschen und 1040 RE des spezifischen Maus-HMFG1-Antikörpers waren
durch den polyklonalen Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper (Fc-spezifisch) gebunden
worden.
-
Das CPDTR-Ovalbumin-Konjugat wurde 10-fach
mit HBS-Puffer verdünnt
und 35 μl
dieser Lösung
wurden in den Biosensorchip injiziert. Etwa 204 Resonanzeinheiten
wurden durch den spezifischen Maus-HMFG1-Antikörper gebunden. Peptid KPDQR wurde
in HBS-Puffer auf 200 μg/ml
verdünnt
und 35 μl
dieser Lösung
wurden in den Biosensorchip injiziert, um das CPDTR-Ovalbumin-Konjugat zu verdrängen.
-
Das restliche gebundene CPDTR-Peptid-Konjugat
und Maus-Anti-HMFG1 wurde dann entfernt, indem der Sensorchip kurz
mit 100 mM HCl gewaschen wurde.
-
In identischer Weise wurde ein Kontrollexperiment
durchgeführt,
außer
dass kein Peptid Lys-Pro-Asp-Gln-Arg injiziert wurde.
-
Resultate
-
Herstellung eines RAM-Fc-Sensorchigs
-
Die Kupplung des Sensorchips führte zu
einem RAM-Fc-spezifischen Sensorchip hoher Kapazität, der am
Ende des Verfahrens etwa 8000 RE RAM-Fc immobilisiert hatte (siehe 7). RAM-Fc bindet den Maus-HMFG1-Antikörper mit
mehreren Bindungsstellen für
jedes Antikörpermolekül, wodurch
eine hohe Avidität
für das Molekül erreicht
wird. Der Effekt der hohen Avidität ist eine vernachlässigbare
Dissoziation des monoklonalen Antikörpers von der RAM-Fc-Schicht.
Dies kann an Position (2) in 8 gesehen
werden, wo es fast eine flache Linie für die Dissoziation von HMFG1
von RAM-Fc gibt. Dieser Zustand ist erforderlich, um sicherzustellen, dass
ein Verlust an REs im Verdrängungsexperiment infolge
einer immunspezifischen Verdrängung
von CPDTR-Ovalbumin durch das KPDQR-Peptid erfolgt und dass der
monoklonale HMFG1-Antikörper
nicht von der RAM-Fc-Schicht
dissoziiert.
-
In 8 stellt
(1) die HMFG1-Bindung an den RAM-Fc-Sensorchip dar, stellt (2) die
Dissoziation des HMFG1-Antikörpers
von der RAM-Fc-Schicht dar, stellt (3) die CPDTR-Ovalbumin-Konjugat-Bindung
an HMFG1-Antikörper
dar und stellt (4) eine Dissoziation von CPDTR-Ovalbumin-Konjugat
vom HMFG1-Antikörper
dar.
-
Das SPR-Signal aus molekularen Bindungsvorgängen wird
durch die Masse des Moleküls
und den Abstand, in dem der Vorgang von der Resonanzgoldschicht
auftritt, reduziert. Molekulare Wechselwirkungsstudien, die eine
Anordnung mehrerer Schichten erfordern, müssen die Reduktion der Signale,
die auftritt, wenn jede Molekülschicht
angefügt wird
und der Abstand von der Goldschicht erhöht wird, kompensieren. Eine
Kompensation dieses Problems wird erreicht, indem große Mengen
an Ligand in der ersten Schicht des Testsystems immobilisiert werden.
Dies überwindet
die Signalreduktionen und die endgültigen molekularen Bindungsevents
werden einfach beobachtet.
-
Der RAM-Fc-Sensorchip war fähig, 1000
RE an monoklonalem Maus-HMFG1-Antikörper zu
binden. Dies war ausreichend, um sicherzustellen, dass eine Bindung
des CPDTR-Ovalbumin-Peptid-Konjugats an HMFG1-Antikörper oder
ein Verdrängungseffekt
durch das Peptid KPDQR an dem CPDTR-Ovalbumin-Konjugat, das an den
HMFG1-Antikörper
gebunden war, in einfacher Weise beobachtet wird (siehe 8).
-
Verdrängung von CPDTR-Ovalbumin-Konjugat
vom HMFG1-Antikörper
durch das Peptid KPDQR
-
Um zu beobachten, ob eine Verdrängung des
CPDTR-Ovalbumins durch das Peptid KPDQR erfolgte, wurden die Rohdaten
im BIA-Bewertungspaket analysiert. Im Wesentlichen wurden die zwei Regionen
an Daten zur Bindung von CPDTR-Ovalbumin-Konjugat
an HMFG1-Antikörper
mit und ohne die folgende Peptidverdrängung als getrennte Diagramme
aufgetragen und übereinander
gelegt. Um die Daten synchronisiert zu halten, wurden die Diagramme
am Injektionspunkt für
das CPDTR-Ovalbumin-Konjugat ausgerichtet (siehe 9).
-
Die Kurve ohne Peptidinjektion (durchgezogene
Linie in 9) zeigt die
normale Dissoziation des CPDTR-Ovalbumin-Konjugats vom HMFG1-Antikörper. Dies
ist im Wesentlichen die Basislinie, von der die immunspezifische
Verdrängung
gemessen wird.
-
Die Kurve mit zugesetztem Peptid
(unterbrochene Linie in 9)
zeigt die Immunverdrängung. Unmittelbar
nach Beginn der Injektion des Peptids KPDQR (gekennzeichnet durch
einen nach unten gerichteten senkrechten Pfeil in der Figur) gibt
es einen scharfen Anstieg im Signal der Resonanzeinheiten. Dies
erfolgt durch den Wechsel von Instrumenten-HBS-Laufpuffer zu dem
KPDQR-Peptidpuffer und
wird als "Massenbrechungsindexänderung" bezeichnet. (Massenbrechungsindexänderungen
treten auf, wenn Proben mit einer Pufferzusammensetzung, die sich
von dem HBS-Laufpuffer des Instruments unterscheidet, über den
Sensorchip injiziert werden. Der Unterschied in der Ionenstärke des
HBS- und des Probenpuffers führt
zu einer Änderung
des Brechungsindex, wenn die abklingende Welle die Dextranschicht
sondiert. Die Brechungsindexänderung liefert
eine unverzügliche
Verschiebung beim Resonanzsignal, die im Sensorgramm beobachtet
wird.) Die Zunahme bei den Resonanzeinheiten, die durch die Massenbrechungsindexveränderung
verursacht wird, geht schnell verloren, da eine Immunverdrängung des
CPDTR-Ovalbumin-Konjugats vom HMFG1-Antikörper auftritt und der Verlust
an Masse infolge dieser Verdrängung
verursacht einen Abfall beim Resonanzsignal. Gegebenenfalls flacht
die Signalkurve ab, da das Peptid das ganze CPDTR-Ovalbumin-Konjugat
entfernt hat und was bleibt, ist mehrfach gebundenes CPTTR-Ovalbumin-Konjugat,
das eine solche Affinität
hat, dass es nicht verdrängt
werden kann. Am Ende der Peptidinjektion gibt es einen unverzüglichen
Abfall beim Resonanzeinheitensignal, das durch die Schaltung vom
Probenpuffer zum HBS-Instrumentenlaufpuffer bewirkt wird. Ein Vergleich
der Kurven mit und ohne injiziertes Peptid, d.h. Immunverdrängung gegen
normale Dissoziation, zeigt, dass es einen zusätzlichen Verlust von 100 RE an
CPDTR-Ovalbumin-Konjugat
vom HMFG1-Antikörper
gibt, verursacht durch das KPDQR-Peptid (angezeigt
durch den vertikalen Doppelpfeil in 9).
-
Aus den in diesen Beispielen angegebenen Daten
kann man sehen, wie die Erfindung besonders vorteilhaft verwendet
werden kann, um Analyten mit niedrigem Molekulargewicht zu analysieren,
z. B. Steroide oder Peptide, ohne dass die Notwendigkeit besteht,
eine der Assaykomponenten zu markieren.