DE69720241T2

DE69720241T2 - Ligand (tie ligand-4) vom tie-2 rezeptor und dessen verwendungen

Info

Publication number: DE69720241T2
Application number: DE69720241T
Authority: DE
Inventors: F. Jones; M. Valenzuela; D. Yancopoulos
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1996-06-19
Filing date: 1997-06-19
Publication date: 2003-12-11
Anticipated expiration: 2017-06-20
Also published as: EP0939809A2; CA2258526A1; US6432667B1; JP2000513932A; US6881395B2; FI982745L; IL127623A0; NZ333374A; EP0939809B1; WO1997048804A2; WO1997048804A3; HUP0004320A3; PT939809E; DK0939809T3; FI982745A0; FI982745A7; ES2194203T3; AU3406197A; KR20000022028A; NO985904D0

Description

EINFÜHRUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Genmanipulation und besonders Gene für Rezeptor-Tyrosinkinasen und deren verwandten Liganden, ihre Insertion in rekombinante DNA-Vektoren und die Herstellung der codierten Proteine in Empfängerstämmen von Mikroorganismen und in eukaryotischen Empfängerzellen. Im Besonderen ist die vorliegende Erfindung auf einen neuen Liganden, bekannt als TIE Ligand- 4, der den TIE-2-Rezeptor bindet, gerichtet, als auch auf die Verfahren der Herstellung und Verwendung der neuen Liganden. Die Erfindung stellt weiterhin die den TIE Liganden-4 codierenden Nucleinsäuresequenzen, die Verfahren zur Erzeugung der Nucleinsäuren und die Genprodukte bereit. Der neue TIE Ligand kann ebenso wie die ihn codierenden Nucleinsäuren bei der Diagnose und der Behandlung bestimmter Erkrankungen, die Endothelzellen und damit verbundene TIE-Rezeptoren betreffen, von Nutzen sein, wie zum Beispiel neoplastische Erkrankungen, die Tumorangiogenese einbeziehen, Wundheilung, thrombo-embolische Erkrankungen, Arteriosklerose und Entzündungserkrankungen. Darüber hinaus kann der Ligand verwendet werden, um die Vermehrung und/oder die Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen zu fördern.
Erfindungsgemäße, biologisch aktive Liganden können verwendet werden, um das Wachstum, das Überleben, das Wandern und/oder die Differenzierung und/oder die Stabilisierung oder Destabilisierung von TIE-Rezeptor exprimierenden Zellen zu fördern. Biologisch aktive TIE Liganden können auch für die in vitro-Aufrechterhaltung von TIE- Rezeptor exprimierenden Zellen in Kultur verwendet werden. TIE-Rezeptor exprümierende Zellen und Gewebe schließen zum Beispiel Endothelzellen des Herzens und der Gefäße, Linsenepithel, Herzepikard und frühe hämatopoetische Zellen ein. In einer anderen Ausführungsform können solche Liganden verwendet werden, um Zellen zu unterstützen, die manipuliert wurden, um TIE-Rezeptor zu exprimieren. Weiterhin können die Liganden und ihre verwandten Rezeptoren in Testsystemen verwendet werden, um Agonisten und Antagonisten des Rezeptors zu identifizieren.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Das zelluläre Verhalten, das für die Entwicklung, Aufrechterhaltung und Reparatur differenzierter Zellen und Gewebe verantwortlich ist, wird zu einem großen Teil durch intrazelluläre Signale reguliert, die durch Wachstumsfaktoren und ähnliche Liganden und ihre Rezeptoren übermittelt werden. Die Rezeptoren befinden sich auf der Zelloberfläche der ansprechenden Zellen und sie binden Peptide oder Polypeptide, die als Wachstumsfaktoren bekannt sind, ebenso wie andere Hormonähnliche Liganden. Die Ergebnisse dieser Interaktion sind schnelle biochemische Veränderungen in den ansprechenden Zellen, ebenso wie eine schnelle und eine langfristige Anpassung der zellulären Genexpression. Einige Rezeptoren, die mit verschiedenen Zelloberflächen assoziiert sind, können bestimmte Wachstumsfaktoren binden.
Die Phosphorylierung von Tyrosinresten in Proteinen durch Tyrosinkinasen ist eine der Schlüsselmethoden, durch die Signale durch die Plasmamembran hindurch übermittelt werden. Einige momentan bekannte Protein-Tyrosinkinasegene codieren Transmembranrezeptoren für Polypeptid-Wachstumsfaktoren und Hormone, wie zum Beispiel epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Insulin, Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-I (IGF-I), Plättchen- Wachstumsfaktoren (PDGF-A und -B) und Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGFs). (Heldin et al., Cell Regulation 1: 555-566 (1990); Ullrich et al., Cell 61: 243-54 (1990)). In jedem Fall üben diese Wachstumsfaktoren ihre Aktivität aus, indem sie an den extrazellulären Anteil ihrer verwandten Rezeptoren binden, was zur Aktivierung der intrinsischen Tyrosinkinase führt, die sich in dem cytoplasmatischen Anteil des Rezeptors befindet. Wachstumsfaktor- Rezeptoren von Endothelzellen sind von besonderem Interesse, wegen der möglichen Beteiligung von Wachstumsfaktoren an verschiedenen wichtigen physiologischen und pathologischen Prozessen, wie zum Beispiel Vasculogenese, Angiogenese, Arteriosklerose und Entzündungserkrankungen. (Folkman et al., Science 235: 442-447 (1987)). Auch die Rezeptoren einiger hemätopoietischer Wachstumsfaktoren sind Tyrosinkinasen; diese schließen c-fms ein, welches der Kolonie-stimulierende Faktor-1-Rezeptor ist, Sherr et al., Cell 41: 665-676 (1985), und c-kit, ein primitiver hämatopoetischer Wachstumsfaktor- Rezeptor, von dem in Huang et al., Cell 63: 225-33 (1990) berichtet wird.
Die Rezeptor-Tyrosinkinasen sind auf der Basis der charakteristischen Struktur ihrer Ektodomänen in evolutionäre Unterfamilien unterteilt worden. (Ullrich et al., Cell 61: 243-54 (1990)). Solche Unterfamilien schließen EGF-Rezeptor-ähnliche Kinasen (Unterklasse I) und Insulin-Rezeptor-ähnliche Kinasen (Unterklasse II) ein, die jeweils wiederholte, homologe, Cysteinreiche Sequenzen in ihren extrazellulären Domänen enthalten. Eine einzelne Cysteinreiche Region liegt auch in der extrazellulären Domäne von eph-ähnlichen Kinasen vor. Hirai et al., Science 238: 1717-1720 (1987); Lindberg et al., Mol. Cell. Biol. 10: 6316-24 (1990); Lhotak et al., Mol. Cell. Biol. 11: 2496-2502 (1991). PDGF-Rezeptoren ebenso wie c-fms- und c-kit-Rezeptor-Tyrosinkinasen können in die Unterklasse III gruppiert werden; die FGF- Rezeptoren bilden die Unterklasse 1 V. Typisch für die Mitglieder dieser beiden Unterklassen sind die extrazellulären Faltungseinheiten, die durch zwischenkettige Disulfidbrücken stabilisiert werden. Diese so genannten Immunglobulin (Ig)-ähnlichen Faltungen sind in Proteinen der Immunglobulin-Überfamilie vorhanden, die eine große Vielfalt von anderen Zelloberflächen-Rezeptoren mit Zell-gebundenen oder löslichen Liganden enthält. Williams et al., Ann. Rev. Immunol. 6: 381-405 (1988).
Rezeptor-Tyrosinkinasen unterscheiden sich in ihrer Spezifität und Affinität. Im Allgemeinen sind Rezeptor-Tyrosinkinasen Glycoproteine, bestehend aus (1 einer zur Bindung bestimmter Wachstumsfaktoren fähigen, extrazellulären Domäne; (2) einer Transmembran-Domäne, die üblicherweise ein alpha-helikaler Anteil des Proteins ist; (3) einer Juxtamembran-Domäne, wobei der Rezeptor zum Beispiel durch Proteinphosphorylierung reguliert werden kann; (4) einer Tyrosinkinase-Domäne, welche die enzymatische Komponente des Rezeptors darstellt; und (5) einem carboxyterminalen Schwanz, der in vielen Rezeptoren an der Erkennung und Bindung der Substrate der Tyrosinkinase beteiligt ist.
Wie berichtet wurde besitzen Prozesse wie alternatives Exonenspleißen und alternative Auswahl des Genpromotors oder der Polyadenylierungsstellen die Fähigkeit, mehrere, unterschiedliche Polypeptide aus dem gleichen Gen herzustellen. Diese Polypeptide können oder können nicht die verschiedenen, vorstehend aufgelisteten Domänen enthalten. Als Folge daraus können einige extrazelluläre Domänen als separate, sekretierte Proteine exprimiert werden und einigen Formen der Rezeptoren kann die Tyrosinkinase-Domäne fehlen und sie enthalten nur die extrazelluläre Domäne, die über die Transmembran-Domäne in die Plasmamembran inseriert ist, und einen kurzen carboxyterminalen Schwanz.
Ein Gen, das eine Transmembran-Tyrosinkinase von Endothelzellen codiert und ursprünglich mittels RT-PCR al. s unbekanntes cDNA-Fragment von humanen Leukämiezellen mit Homologie zu Tyrosinkinasen identifiziert wurde, wurde durch Partanen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8913-8917 (1990) beschrieben. Dieses Gen und sein codiertes Protein werden "TIP"genannt, was eine Abkürzung ist für "Tyrosinkinase mit Ig- und EGF- homologen Domänen". Partanen et al., Mol. Cell. Biol. 12: 1698-1707 (1992).
Es ist berichtet worden, dass tie-mRNA in allen humanen, fötalen Geweben und Geweben von Mausembryos vorhanden ist. Bei näherer Prüfung wurde die tie-mRNA in den Endothelzellen des Herzens und der Gefäße lokalisiert. Im Besonderen wurde die tie-mRNA im Endothel der Blutgefäße und des Endokards von 9,5 bis 18,5 Tage alten Mausembryos lokalisiert. Erhöhte tie-Expression wurde gezeigt während der Neovaskularisation in Verbindung mit der Entwicklung von reifen Eifollikeln und von Granulationsgewebe in Hautwunden. Korhonen et al. Blood, 80: 2548-2555 (1992). Daher war es nahe liegend, dass TIEs bei der Angiogenese eine Rolle spielen, was von Wichtigkeit ist für die Entwicklung von Behandlungen von massiven Tumoren und einigen anderen Angiogenese-abhängigen Erkrankungen wie diabetische Retinopathie, Psoriasis, Arteriosklerose und Arthritis.
Es ist berichtet worden, dass zwei strukturell verwandte TIE-Rezeptorproteine von Ratte durch unterschiedliche Gene mit verwandten Expressionsprofilen codiert werden. Ein Gen, genannt tie-1, ist das Homologe der Ratte zu dem humanen tie. Maisonpierre et al., Oncogene 8: 1631-1637 (1993). Das andere Gen, tie-2, kann das Homologe der Ratte zu dem tek-Gen der Maus sein, von dem, wie von tie, berichtet wurde, dass es in der Maus ausschließlich in Endothelzellen und deren mutmaßlichen Vorläufernzellen exprimiert wird. Dumont et al., Oncogene 8: 1293-1301 (1993). Das humane Homologe von tie-2 wird beschrieben in Ziegler, US-Patent Nr. 5,447,860, das am 5. September 1995 erteilt wurde (worin es als "ork" bezeichnet wird).
Es wurde gefunden, dass beide Gene in Endothelzellen von embryonischen und postnatalen Geweben in weitem Maße exprimiert werden. Signifikante Mengen an tie-2- Transkript waren auch in anderen embryonischen Zellpopulationen vorhanden, einschließlich Linsenepithel, Herzepikard und in Bereichen des Mesenchyms. Maisonpierre et al. Oncogene, 8: 1631-1637 (1993).
Die vorwiegende Expression des TIE-Rezeptors in vaskulärem Endothel legt nahe, dass TIE bei der Entwicklung und der Aufrechterhaltung des vaskulären Systems eine Rolle spielt. Dies könnte Rollen einschließen bei Determinierung, Vermehrung, Differenzierung und Zellwanderung von Endothelzellen und der Musterbildung in vaskuläre Elemente. Analysen von Maus-Embryos, denen TIE-2 fehlt, verdeutlichen dessen Wichtigkeit bei der Arigiogenese, besonders bei der Ausbildung eines vaskulären Netzwerks in Endothelzellen. Sato, T. N., et al., Nature 376: 70-74 (1995). Im reifen vaskulären System könnten die TIEs in Endothelzellen beim Überleben, der Aufrechterhaltung und der Antwort auf pathogene Einflüsse eine Rolle spielen.
Die TIE-Rezeptoren werden auch in primitiven hämatopoetischen Stammzellen, B- Zellen und einem Teil der megakaryocytischen Zellen exprimiert, was auf eine Rolle als Liganden hindeutet, die diese Rezeptoren in der frühen Hämatopoese, bei der Differenzierung und/oder Vermehrung von B-Zellen und bei der Differenzierung von Megakaryocyten binden. Iwama et al., Biochem. Biophys. Research Communications 195: 301-309 (1993); Hashiyama et al., Blood 87: 93-101 (1996); Batard et al., Blood 87: 2212-2220 (1996).
Anmelder haben früher einen angiogenischen Faktor identifiziert, der ursprünglich TIE-2 Ligand-1 (TL1) genannt wurde, aber auch als Angiopoietin-1 (Ang1) bezeichnet wird, und der über den TIE-2-Rezeptor Signale weitergibt und für die normale vaskuläre Entwicklung in der Maus erforderlich ist. Durch die Überprüfung von Homologien haben Anmelder auch ein Ang1-Verwandtes, genannt TIE-2 Ligand-2 (TL2) oder Angiopoietin-2 (Ang2), identifiziert, das ein natürlich vorkommender Antagonist von Ang1 und dem TIE-2- Rezeptor ist. Für eine Beschreibung der Clonierung und Sequenzierung von IL1 (Ang1) und TL2 (Ang2) ebenso wie für die Verfahren der Herstellung und Verwendung von diesen wird hierdurch verwiesen auf PCT International Publication WO 96/11269, veröffentlicht am 18. April 1996, und PCT International Publication WO 96/31598, veröffentlicht am 10. Oktober 1996, beide im Namen der Regeneron Pharmaceuticals, Inc.; und auf S. Davis et al., Cell 87: 1161-1169 (1996). Die Abwesenheit von Ang1 verursacht schwere vaskuläre Abnormalitäten in einem sich entwickelnden Mausembryo. C. Suri et al., Cell 87: 1171-1180 (1996). Ang1 und Ang2 sorgen für natürlich vorkommende positive und negative Regulatoren der Angiogenese. Positive oder negative Regulation von TIE2 führt wahrscheinlich zu unterschiedlichen Ergebnissen, in Abhängigkeit von der Kombination der gleichzeitig wirkenden angiogenischen Signale.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt den isolierten TIE Ligand-4 oder ein Fragment oder ein Derivat davon, das aus der Aminosäuresequenz der Fibrinogen-ähnlichen Domäne besteht, bereit. Die Erfindung stellt ebenfalls ein isoliertes Nucleinsäure-Molekül, das TIE Ligand-4 codiert, bereit. Die isolierte Nukleinsäure kann DNA, cDNA oder RNA sein. Die Erfindung stellt ebenfalls einen Vektor, der ein isoliertes, TIE Ligand-4 codierendes Nucleinsäure-Molekül enthält, bereit. Die Erfindung stellt weiterhin transformierte Wirtszellen bereit, die solche Vektoren enthalten. Solche Wirtszellen sind für die Produktion von Polypeptiden mit der biologischen Aktivität des TIE Liganden-4 geeignet. Die geeignete Wirtszelle kann eine bakterielle, Hefe-, Insekten- oder Säuger-Zelle sein. Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren der Produktion eines Polypeptids mit der biologischen Aktivität des TIE Liganden-4, das das Wachsen der Zellen des Wirts-Vektor-Systems unter Bedingungen, die die Produktion des Polypeptids zulassen, und die Gewinnung des auf diese Weise produzierten Polypeptids umfasst, bereit.
Die hier beschriebene Erfindung eines isolierten, TIE Ligand-4 codierenden Nucleinsäure-Moleküls stellt weiterhin die Entwicklung des Liganden oder eines Fragmentes oder Derivates davon als ein Therapeutikum zur Behandlung von Patienten, die an Erkrankungen leiden, die TIE-Rezeptor exprimierende Zellen, Gewebe oder Organe betreffen, bereit. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls einen Antikörper, der spezifisch solch ein therapeutisches Molekül bindet, bereit. Der Antikörper kann monoclonal oder polyclonal sein. Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren der Verwendung eines solchen monoclonalen oder polyclonalen Antikörpers, um die Menge an dem therapeutischen Molekül in einer von dem Patienten genommenen Probe zum Zweck der Überwachung des Therapieverlaufs zu messen, bereit.
Die vorliegende Erfindung sorgt ebenfalls für einen Antikörper, der spezifisch den TIE Ligand-4 bindet. Der Antikörper kann monoclonal oder polyclonal sein. Daher sorgt die Erfindung weiterhin für therapeutische Zusammensetzungen, die einen Antikörper enthalten, der spezifisch TIE Ligand-4 bindet, und eine pharmazeutisch verträgliche Trägersubstanz. Solche Antikörper können bei dem Aufhalten des Wachstums von Blutgefäßen in einem Säuger von Nutzen sein, indem eine wirksame Menge einer therapeutischen Zusammensetzung verabreicht wird, die einen Antikörper, der spezifisch TIE Ligand-4 bindet, in einer pharmazeutisch verträglichen Trägersubstanz enthält.
Die Erfindung sorgt weiterhin für therapeutische Zusammensetzungen, die TIE Ligand-4 in einer pharmazeutisch verträglichen Trägersubstanz enthalten. Ein solcher Ligand kann bei der Förderung der Revaskularisation in einem Patienten von Nutzen sein, indem eine wirksame Menge einer therapeutischen Zusammensetzung verabreicht wird, die TIE Ligand-4 in einer pharmazeutisch verträglichen Trägersubstanz enthält. Der Ligand kann zum Beispiel verwendet werden, um Wundheilung zu fördern oder Ischämie zu behandeln. In noch einer weiteren Ausführungsform kann der TIE Ligand-4, alleine oder in Kombination mit anderen hämatopoetischen Faktoren, verwendet werden, um die Vermehrung oder Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen, B-Zellen oder megakaryocytischen Zellen zu fördern.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung bereit, dass TIE Ligand-4 an ein cytotoxisches Mittel konjugiert werden kann, und eine therapeutische Zusammensetzung, die ein solches Konjugat enthält.
Die Erfindung stellt weiterhin die Verwendung des erfindungsgemäßen TIE Liganden- 4 bei der Herstellung von Medikamenten zum Gebrauch in einem Verfahren zur Induktion von Revaskularisation und Hämatopoese und die Verwendung von Antikörpern gegenüber dem erfindungsgemäßen Liganden bei der Herstellung von Medikamenten zum Gebrauch in einem Verfahren zur Inhibierung von Revaskulärisation und Hämatopoese bereit.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1A und 1B - TIE-2-Rezeptorkörper (TIE-2 RB) inhibiert die Entwicklung von Blutgefäßen in der Chorioallantoinmembran (CAM) von Hühnerembryos. Ein einzelnes Teil von resorbierbarem Gelatine-Schaum (Gelfoam), der mit 6 ug RB getränkt war, wurde unmittelbar unter die CAM eines 1 Tage alten Hühnerembryos eingefügt. Nach drei weiteren Tagen Inkubation wurden die 4 Tage alten Embryos und die umgebende CAM entfernt und untersucht. Fig. 1A: Mit EHK-1 RB (rEHK-1 ecto/hIgG1 Fc) behandelte Embryos waren lebensfähig und besaßen normal entwickelte Blutgefäße in ihrer umgebenden CAM. Fig. 1B: Alle mit TIE-2 KB (rTIE-2 ecto/hIgG1 Fc) behandelten Embryos waren tot, in der Größe verringert und fast vollständig ohne umgebende Blutgefäße.
Fig. 2 - Schematische Darstellung der angenommenen Rolle der TIE-2/TIE Liganden in der Angiogenese. TL1 ist dargestellt durch (·), TL2 ist dargestellt durch (*), TIE- 2 ist dargestellt durch (T), VEGF ist dargestellt durch ([]) und flk-1 (ein VEGF-Rezeptor) ist dargestellt durch (Y).
Fig. 3 - Graphische Darstellung der TIE-2 Liganden, die die "coiled coil"- und die Fibrinogen-ähnlichen Domänen zeigt und die Anordnung von Multimeren der Fibrinogen- ähnlichen Domänen unter Verwendung von Antikörpern gegen myc-Markierungen ebenso wie von der Markierung von Fc.
Fig. 4 - Eine typische Kurve einer TIE-2-IgG Bindung an immobilisiertes TL1 in einem quantitativen, Zell-freien Bindungstest.
Fig. 5 - Eine typische Kurve, die den TIE-2 Ligand 1-Ligandenkörper, der die Fibrinogen-ähnliche Domäne des Liganden gebunden an die Fc-Domäne von IgG (TL1-tFc) enthält, bei der Bindung an die immobilisierte TIE-2-Ectodomäne in einem quantitativen, Zell-freien Bindungstest zeigt.
Fig. 6A-6B - Nucleotid- und abgeleitete Aminosäure (Einzelbuchstaben-Code)- Sequenzen von TIE Ligand-3. Die codierende Sequenz beginnt bei Position 47. Die Fibrinogen-ähnliche Domäne beginnt bei Position 929.
Fig. 7 - Vergleich der Aminosäure-Sequenzen der Mitglieder der TIE Liganden- Familie. mAng3 = mTL3 = im Ligand-3 von Maus; hAng4 = hTL4 = TIE Ligand-4 von Mensch; hAng1 = hTL1 = TIE-2 Ligand 1 von Mensch; mAng1 = mTL1 = TIE-2 Ligand 1 von Maus; mAng2 = mTL2 = TIE-2 Ligand 2 von Maus; hAng2 = hTL2 = TIE-2 Ligand 2 von Mensch. Die unterstrichenen Bereiche zeigen konservierte Homologie-Bereiche zwischen den Familienmitgliedern an.
Fig. 8A-8C - Nucleotid- und abgeleitete Aminosäure (Einzelbuchstaben-Code)- Sequenzen von TIE Ligand-4. Pfeil zeigt Nucleotid-Position 569 an.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Wie nachstehend detaillierter beschrieben, haben die Anmelder neue Liganden isoliert und identifiziert, die zu den TIE-2 Liganden, die den TIE-2-Rezeptor binden, verwandt sind. Die neuen Liganden, die aus natürlichen Quellen gereinigt oder rekombinant hergestellt werden können, werden hier als TIE Ligand-3 (TL3) und TIE Ligand-4 (TL4) bezeichnet. Die anderen Mitglieder der TIE Liganden-Familie werden hier als TIE-2 Ligand 1 (TL1), auch bekannt als Angiopoietin-1 (Ang1), und TIE-2 Ligand 2 (TL2), auch bekannt als Angiopoietin-2 (Ang2) bezeichnet. Die Anmelder beschreiben hier eine Familie von TIP Liganden und haben konservierte Homologie-Bereiche zwischen den Familienmitgliedern identifiziert. Daher wird von den neuen Liganden TL3 und TL4 erwartet, dass sie ähnliche Funktionen und Nutzen wie die bekannten Liganden TL1 (Ang1) und TL2 (Ang2) bei der Angiogenese und Hämatopoese aufweisen.
Die vorliegende Erfindung enthält den neuen Ligand TL4 ebenso wie funktionell gleichwertige Varianten davon, enthaltend natürlich vorkommende allelische Variationen ebenso wie Proteine oder Peptide, die Substitutionen, Deletionen oder Insertionsmutanten der beschriebenen Sequenz enthalten, welche den TIE-Rezeptor binden und als Agonisten oder Antagonisten davon wirken. Solche Varianten schließen diejenigen ein, bei denen die Aminosäurereste innerhalb der Sequenz gegen Reste substituiert sind, die zu einem stillen Austausch führen. Zum Beispiel können ein oder mehrere Aminosäurenreste innerhalb der Sequenz durch andere Aminosäuren ähnlicher Polarität, die funktionell gleichwertig wirken, substituiert werden, was zu einer stillen Veränderung führt. Substituenden für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz können aus den anderen Mitgliedern der Klasse, zu der die Aminosäure gehört, ausgewählt werden. Zum Beispiel schließt die Klasse der nichtpolaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin ein. Die polaren, neutralen Aminosäuren schließen Glycin, Sen, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin ein. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin ein. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren schließen Asparaginsäure und Glutaminsäure ein.
Ebenfalls eingeschlossen innerhalb des Umfangs der Erfindung sind Proteine oder Fragmente oder Derivate davon, die die gleiche oder ähnliche biologische Aktivität wie der hier beschriebene TIE Ligand-4 ausüben, und Derivate, die während oder nach der Translation unterschiedlich modifiziert wurden, zum Beispiel durch Glycosylierung, proteolytische Spaltung, Bindung an ein Antikörper-Molekül oder einen anderen zellulären Liganden usw.. Funktionell gleichwertige Moleküle schließen auch Moleküle ein, die Modifikationen enthalten, einschließlich N-terminale Modifikationen, die aus der Expression in einem bestimmten rekombinanten Wirt resultieren, wie zum Beispiel eine N-terminale Methylierung, die in bestimmten bakteriellen (z. B. E. coli) Expressionssystemen vorkommt. Funktionell gleichwertige Moleküle schließen auch Mutanten ein, in denen Aminosäure- Substitutionen für Cystein-Moleküle eingeführt wurden, um die Stabilität der Moleküle zu verbessern und unerwünschtes Quervernetzen zu verhindern.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Nucleotidsequenz, die das hier als TIP Ligand-4 beschriebene Protein codiert ebenso wie die Wirtszellen, einschließlich Hefe, Bakterien, Viren und Säugerzellen, die zur Produktion des Proteins genetisch manipuliert wurden, zum Beispiel durch Transfektion, Transduktion, Infektion, Elektroporation oder Mikroinjektion der den hier beschriebenen TIE Ligand-4 codierenden Nucleinsäure in einem geeigneten Expressionsvektor. Die den TIE Ligand-4 codierende Nucleinsäure kann durch Gentherapie-Techniken eingeführt werden, wie zum Beispiel beschrieben in Finkel und Epstein, FASEB J. 9: 843-851 (1995); Guzman et al., PNAS (USA) 91: 10732-10736 (1994).
Ein Fachmann wird auch erkennen, dass die vorliegende Erfindung DNA- und RNA- Sequenzen umfasst, die an eine abgeleitete TIE Ligand-4 codierende Sequenz unter Bedingungen mäßiger Stringenz hybridisieren, wie sie zum Beispiel in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe Bd. 1, S. 101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) beschrieben sind. Daher schließt ein durch die Erfindung bedachtes Nucleinsäuremolekül eines mit einer Sequenz ein, die von der Aminosäuresequenz eines wie hier beschrieben hergestellten TIE Ligand-4 abgeleitet ist, ebenso wie ein Molekül mit einer Nucleinsäuresequenz, die an eine solche Nucleinsäure hybridisiert und auch eine Nucleinsäuresequenz, die als Ergebnis des genetischen Codes von der vorstehenden Sequenz degeneriert ist, aber die einen Liganden codiert, der TIE-Rezeptoren bindet und der eine Aminosäuresequenz und andere primäre, sekundäre und tertiäre Merkmale aufweist, die zu dem hier beschriebenen ausreichend ähnlich sind, um dem Molekül die gleiche biologische Aktivität wie dem hier beschriebenen TIE Ligand-4 zu verleihen.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein isoliertes und gereinigtes Nucleinsäuremolekül, das eine einen menschlichen TIE Liganden-4 codierende Nucleotidsequenz enthält, wobei die Nucleotidsequenz ausgewählt wird, aus einer Gruppe bestehend aus:
(a) der Nucleinsäuresequenz, die den codierenden Bereich des menschlichen TIE Ligand-4 enthält und in dem als hTL-4 bezeichneten Vektor enthalten ist, der am 2. Juli 1996 hinterlegt wurde (ATCC Zugangs-Nr. 98095);
(b) der Nucleinsäuresequenz, die den codierenden Bereich der Fibrinogen- ähnlichen Domäne des TIE Liganden-4 enthält und in dem als hTL-4 bezeichneten Vektor enthalten ist, der am 2. Juli 1996 hinterlegt wurde (ATCC Zugangs-Nr. 98095); und
(c) einer Nucleotidsequenz, die sich auf Grund der Degeneriertheit des genetischen Codes von der Nucleotidsequenz (a) oder (b) unterscheidet und die einen Liganden codiert, der den TIE-Rezeptor bindet.
Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin ein isoliertes und gereinigtes Nucleinsäuremolekül, das eine den menschlichen TIE Ligand-4 codierende Nucleotidsequenz enthält, wobei die Nucleotidsequenz ausgewählt wird aus einer Gruppe bestehend aus:
(a) der Nucleotidsequenz, die den codierenden Bereich des menschlichen TIE Liganden-4 umfasst, wie dargelegt in Fig. 8A-8C;
(b) der Nucleofidsequenz, die den codierenden Bereich der Fibrinogen- ähnlichen Domäne des menschlichen TIE Liganden-4 umfasst, wie dargelegt in Fig. 8A-8C; und
(c) einer Nucleotidsequenz, die sich auf Grund der Degeneriertheit des genetischen Codes von der Nucleotidsequenz (a) oder (b) unterscheidet und die einen TIE-2 Liganden codiert, der den TIE-2 Rezeptor bindet.
Die vorliegende Erfindung sorgt weiterhin für einen isolierten und gereinigten TIE Liganden-4, der durch ein isoliertes, erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül codiert wird. Die Erfindung sorgt ebenfalls für einen Vektor, der ein isoliertes Nucleinsäuremolekül enthält, das eine den menschlichen TIE Liganden-4 codierende Nucleinsäuresequenz enthält.
Jedes einem Fachmann bekannte Verfahren zur Insertion von DNA-Fragmenten in einen Vektor kann verwendet werden, um TIE Ligand-4 codierende Expressionsvektoren zu konstruieren, unter Verwendung von geeigneten transkriptionellen/translationellen Kontrollsignalen und Protein codierenden Sequenzen. Diese Verfahren können in vitro- Techniken mit rekombinanter DNA, synthetische Techniken und in vivo-Rekombinationen (genetische Rekombination) einschließen. Die Expression einer Nucleinsäuresequenz, die den TIE Ligand-4 oder Peptid-Fragmente davon codiert, kann durch eine zweite Nucleinsäuresequenz reguliert werden, die mit der den TIE Ligand-4 codierenden Sequenz funktionell verbunden ist, sodass das TIE Ligand-4-Protein oder -Peptid in einem mit dem rekombinanten DNA-Molekül transformierten Wirt exprimiert wird. Zum Beispiel kann die Expression des hier beschriebenen TIE Ligand-4 durch irgendein im Fachgebiet bekanntes Promotor-/Enhancer-Element kontrolliert werden. Promotoren, die zur Kontrolle der Expression des Liganden verwendet werden können, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf die lange terminale Wiederholung, wie beschrieben in Squinto et al., (Cell 65: 1-20 (1991)); die frühe SV40-Promotorregion (Bernoist und Chambori, Nature 290: 304-310), den CMV-Promotor, die M-MuLV 5' terminale Wiederholung, den in der 3' langen terminalen Wiederholung des Rous-Sarcoma-Virus enthaltenen Promotor (Yamamoto et al., Cell 22: 787- 797 (1980)), den Herpes-Thymidinkinase-Promotor (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 144-1445 (1981)), den Adenovirus-Promotor, die regulatorischen Sequenzen des Metallothioneingens (Brinster et al., Nature 296: 39-42 (1982)); prokaryotische Expressionsvektoren wie der β-Lactamase-Promotor (Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731 (1978)) oder der tac-Promotor (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25 (1983)), siehe ebenfalls "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 242: 74-94 (1980); Promotorelemente von Hefe oder anderen Pilzen wie der Gal-4-Promotor, der ADH (Alkoholdehydrogenase)-Promotor, PGK (Phosphoglycerinkinase)-Promotor, alkalische Phosphatase-Promotor und die folgenden tierischen, transkriptionellen Kontrollregionen, die gewebespezifisch sind und in transgenen Tieren verwendet wurden; die Elastase I-Genkontrollregion, die in pankreatischen Drüsenzellen aktiv ist (Swift et al., Cell 38: 639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7: 425-515 (1987); die Insulin-Genkontrollregion, die in pankreatischen Beta-Zellen aktiv ist [Hanahan, Nature 315: 115-122 (1985)]; die Immunglobulin-Genkontrollregion, die in Lymphoidzellen aktiv ist (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647-658; Adames et al., 1985, Nature 318: 533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436-1444), die Maus-Brusttumorvirus- Kontrollregion, die in Hoden-, Brust-, Lymphoid- und Mast-Zellen aktiv ist (Leder et al., 1986, Cell 45: 485-495), die Albumin-Genkontrollregion, die in Leber aktiv ist (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268-276), die alpha-Fetoprotein-Genkontrollregion, die in Leber aktiv ist (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235: 53-58); die alpha-1-Antitrypsin-Genkontrollregion, die in Leber aktiv ist (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1: 161-171), die beta-Globin-Genkontrollregion, die in myeloischen Zellen aktiv ist (Mogram et al., 1985, Nature 315: 338-349; Kollias et al., 1986, Cell 46: 89- 94); die Kontrollregion des Myelin-basischen-Protein-Gens, die in den Oligodendrocyten des Gehirns aktiv ist (Readhead et al., 1987, Cell 48: 703-712); die Kontrollregion des Myosin- Leichtketten-2-Gens, die im Skelettmuskel aktiv ist (Shani, 1985, Nature 314: 283-286) und der Kontrollregion des gonadotropes Hormon freigebenden Gens, die im Hypothalamus aktiv ist (Mason et al., 1986, Science 234: 1372-1378). Die Erfindung umfasst weiterhin die Produktion von Antisense-Verbindungen, die zur spezifischen Hybridisierung mit einer TIE Ligand-4 codierenden RNA-Sequenz befähigt sind, um dessen Expression zu modulieren. Ecker, US-Patent Nr. 5,166,195, erteilt am 24. November 1992.
Daher werden der Erfindung entsprechend Expressionsvektoren, die in einem bakteriellen oder eukaryotischem Wirt, der wie hier beschrieben eine TIE Ligand-4 codierende Nucleinsäure enthält, repliziert werden können, verwendet, um einen Wirt zu transfizieren und somit die Expression einer solchen Nucleinsäure zu steuern, um TIE Ligand-4 zu produzieren, welcher anschließend in einer biologisch aktiven Form gewonnen werden kann. Wie hier verwendet schließt eine biologisch aktive Form eine Form ein, die einen TIE- Rezeptor binden und eine biologische Reaktion wie eine differenzierte Funktion hervorrufen oder den Phänotyp der den Rezeptor exprimierenden Zelle beeinflussen kann. Solche biologisch aktiven Formen können zum Beispiel die Phosphorylierung der Tyrosinkinase- Domäne des TIE-Rezeptors induzieren. Als andere Möglichkeit kann die biologische Aktivität als ein Antagonist gegenüber dem TIE-Rezeptor wirken. In anderen Ausführungsformen ist die aktive Form des TIE Liganden-4 eine, die den TIE-Rezeptor erkennen und dadurch als zielführendes Mittel für den Rezeptor zur Anwendung sowohl in der Diagnose als auch der Therapeutik wirken kann. Entsprechend solcher Ausführungsformen muss die aktive Form nicht einer TIE exprimierenden Zelle eine Veränderung des Phänotyps vermitteln.
Geninsertionen enthaltende Expressionsvektoren können durch vier allgemeine Ansätze identifiziert werden: (a) DNA-DNA-Hybridisierung, (b) An- oder Abwesenheit von "Marker"-Genfunktionen, (c) Expression der inserierten Sequenzen und (d) PCR-Detektion. Im ersten Ansatz kann die Anwesenheit eines in einen Expressionsvektor inserierten Fremdgens durch DNA-DNA-Hybridisierung detektiert werden, unter Verwendung von Sonden, die Sequenzen enthalten, die zu einem inserierten, TIE Ligand-4 codierenden Gen homolog sind. Im zweiten Ansatz kann das rekombinante Vektor/Wirtssystem auf der Basis der An- oder Abwesenheit bestimmter "Marker"-Genfunktionen (z. B. Thymidinkinase- Aktivität, Resistenz gegenüber Antibiotika, Transformationsphänotyp, Bildung von Einschlusskörpern in Baculoviren usw.), verursacht durch die Insertion des Fremdgens in den Vektor, identifiziert und ausgewählt werden. Wenn zum Beispiel eine TIE Ligand-4 codierende Nukleinsäure in die Markergensequenz des Vektors inseriert wird, können Rekombinante, die die Insertion enthalten, durch die Abwesenheit der Markergenfunktion identifiziert werden. Im dritten Ansatz können rekombinante Expressionsvektoren identifiziert werden, indem das durch die Rekombinante exprimierte Produkt des Fremdgens getestet wird. Solche Tests können zum Beispiel auf den physikalischen oder funktionellen Eigenschaften des TIE Ligand-4-Genproduktes beruhen, indem zum Beispiel der Ligand an den TIE-Rezeptor oder einen Anteil davon bindet, der zum Beispiel mit einem detektierbaren Antikörper oder einem Anteil davon markiert sein kann, oder an gegen das TIE Ligand-4- Protein hergestellte Antikörper oder einen Anteil davon. Zellen der vorliegenden Erfindung können vorübergehend oder vorzugsweise konstitutiv und dauerhaft den TIE Ligand-4 exprimieren, wie hier beschrieben. Im vierten Ansatz können DNA-Nucleotid-Primer hergestellt werden, die einer tie-spezifischen DNA-Sequenz entsprechen. Diese Primer können anschließend verwendet werden, um ein tie-Genfragment per PCR zu amplifizieren. (PCR Protocols: A Guide To Methods and Applications, herausgegeben durch Michael A. Innis et al., Academic Press (1990)).
Der rekombinante Ligand kann durch jede Technik gereinigt werden, die die nachfolgende Erzeugung eines stabilen, biologisch aktiven Proteins erlaubt. Vorzugsweise wird der Ligand in das Kulturmedium sekretiert, aus dem er dann gewonnen wird. In einer anderen Ausführungsform kann der Ligand aus Zellen gewonnen werden, entweder als lösliches Protein oder als Einschlusskörper, aus dem er entsprechend der weithin bekannten Methodik durch 8 M Guanidiniumhydrochlorid und Dialyse quantitativ extrahiert werden kann. Um den Liganden weiter zu reinigen, können Affinitätschromatographie, herkömmliche Ionenaustauscherchromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie, Umkehrphasenchromatographie oder Gelfiltration verwendet werden.
Ein rekombinantes, TIE Ligand-4 codierendes Gen kann verwendet werden, um das endogene Gen durch homologe Rekombination zu inaktivieren oder "auszuknocken" und dadurch eine Zelle, ein Gewebe oder ein Tier, dem der TIE Ligand-4 fehlt, zu erschaffen. Zum Beispiel und nicht zur Einschränkung kann das rekombinante, TIE Ligand-4 codierende Gen manipuliert werden, sodass es eine Insertionsmutation wie zum Beispiel das neo-Gen enthält, welches das ursprüngliche, TIE Ligand-4 codierende Gen inaktivieren würde. Eine solche Konstruktion könnte unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors mittels einer Technik wie Transfektion, Transduktion oder Injektion in eine Zelle, wie zum Beispiel eine embryonale Stammzelle, eingeführt werden. Die Konstruktion enthaltende Zellen können dann durch Resistenz gegen G418 selektiert werden. Zellen, denen ein intaktes, TIE Ligand-4 codierendes Gen fehlt, können dann zum Beispiel durch "Southern blotting", PCR-Detektion, "Northern blotting" oder Testen der Expression identifiziert werden. Zellen, denen ein intaktes, TIE Ligand-4 codierendes Gen fehlt, können dann mit frühen Embryozellen fusioniert werden, um transgene Tiere zu erzeugen, denen ein solcher Ligand fehlt. Ein solches Tier kann verwendet werden, um bestimmt in vivo-Prozesse, die normalerweise von dem Liganden abhängen, festzulegen.
Die vorliegende Erfindung sorgt ebenfalls für Antikörper gegen den hier beschriebenen TIE Ligand-4, die zur Detektion des Liganden in zum Beispiel diagnostischen Anwendungen von Nutzen sind. Zur Herstellung der monoclonalen, gegen TIE Ligand-4 gerichteten Antikörper kann jede Technik verwendet werden, die für die Produktion der Antikörpermoleküle durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur sorgt. Zum Beispiel sind die ursprünglich durch Kohler und Milstein (1975, Nature 256: 495-497) entwickelte Hybridomtechnik, ebenso wie die Triomtechnik, die menschliche B-Zellen-Hybridomtechnik (Kozbor et al., Immunology Today 4: 72) und die EBV-Hybridomtechnik zur Produktion menschlicher, monoclonaler Antikörper (Cole et al., 1985, in "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R. Liss, Inc., S. 77-96) und ähnliche im Umfang der vorliegenden Erfindung enthalten.
Die monoclonalen Antikörper können menschliche, monoclonale Antikörper oder chimäre Mensch-Maus (oder andere Spezies)-, monoclonale Antikörper sein. Menschliche, monoclonale Antikörper können durch jede der zahlreichen, im Fachgebiet bekannten Techniken hergestellt werden (z. B Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 7308- 7312; Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72-79; Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92: 3-16). Chimäre Antikörpermoleküle können hergestellt werden, wobei sie eine Antigenbindende Domäne der Maus mit menschlichen, konstanten Regionen enthalten (Mornson et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851, Takeda et al., 1985, Nature, 314: 452).
Verschiedene, im Fachgebiet bekannte Prozeduren können zur Produktion von polyclonalen Antikörpern gegen Epitope des hier beschriebenen TIE Liganden-4 verwendet werden. Zur Produktion von Antikörpern können verschiedene Wirtstiere, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Kaninchen, Mäuse und Ratten, durch Injektion mit dem TIE Ligand-4 oder einem Fragment oder Derivat davon immunisiert werden. Verschiedene Hilfsmittel können abhängig von der Wirtsspezies verwendet werden, um die Immunantwort zu erhöhen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Freunds Adjuvans (vollständig oder unvollständig), Mineralgele wie Aluminiumhydroxid, Oberflächenaktive Substanzen wie Lysolecithin, pluronische Polyole, Polyanione, Peptide, Ölemulsionen, Hämocyanine, Dinitrophenol und potentiell nützliche menschliche Hilfsmittel wie BCG (Bacille Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum.
Ein molekularer Clon eines Antikörpers gegen ein ausgewähltes TIE Ligand-4-Epitop kann durch bekannte Techniken hergestellt werden. Rekombinante DNA-Methodik (siehe z. B. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) kann verwendet werden, um Nucleinsäuresequenzen zu konstruieren, die ein monoclonales Antikörpermolekül oder eine Antigenbindende Region davon codieren.
Die vorliegende Erfindung sorgt für Antikörpermoleküle ebenso wie für Fragmente solcher Antikörpermoleküle. Antikörperfragmente, die den Idiotyp des Moleküls enthalten, können durch bekannte Techniken erzeugt werden. Zum Beispiel schließen solche Fragmente ein, sind aber nicht beschränkt auf das F(ab')&sub2;-Fragment, das durch Spaltung des Antikörpermoleküls mit Pepsin hergestellt werden kann; die Fab'-Fragmente, die durch die Reduktion der Disulfidbrücken des F(ab')&sub2;-Fragmentes erzeugt werden können und die Fab- Fragmente, die durch die Behandlung des Antikörpermoleküls mit Papain und einem reduzierenden Mittel erzeugt werden können. Antikörpermoleküle können durch bekannte Techniken gereinigt werden, z. B. Immunabsorption oder Immunaffinitätschromatographie, chromatographische Verfahren wie HPLC (Hochleistungs-Flüssigchromatographie) oder einer Kombination davon.
Ein Immuntest zur Messung der Menge des TIE Liganden-4 in einer biologischen Probe kann erreicht werden durch
(a) das Kontaktieren der biologischen Probe mit mindestens einem Antikörper, der TIE Ligand-4 spezifisch bindet, sodass der Antikörper mit jedem in der Probe vorhandenen TIE Ligand-4 einen Komplex ausbildet; und
(b) das Messen der Menge an Komplex und dadurch das Messen der Menge an TIE Ligand-4 in der biologischen Probe.
Ein Test zur Messung der Menge des TIE-Rezeptors in einer biologischen Probe kann erreicht werden durch
(a) das Kontaktieren der biologischen Probe mit mindestens einem erfindungsgemäßen Liganden, sodass der Ligand mit dem TIE-Rezeptor einen Komplex ausbildet; und
(b) das Messen der Menge an Komplex und dadurch das Messen der Menge an TIE- Rezeptor in der biologischen Probe.
Der TIE Ligand-4 kann auch verwendet werden, um das Überleben und/oder das Wachstum und/oder die Wanderung und/oder die Differenzierung von TIE-Rezeptor- exprimierenden Zellen zu unterstützen. Somit kann der Ligand als eine Ergänzung verwendet werden, um zum Beispiel Endothelzellen in Kultur zu unterstützen.
Weiterhin ermöglicht die Entdeckung zusätzlicher Liganden für den TIE-Rezeptor durch die Anmelder die Anwendung von Testsystemen, die zur Identifikation von Agonisten und Antagonisten des TIE-Rezeptors von Nutzen sind. Solche Testsysteme wären bei der Identifizierung von Molekülen von Nutzen, die die Angiogenese fördern oder inhibieren können. In einer Ausführungsform können zum Beispiel Antagonisten des TIE-Rezeptors als Testmoleküle identifiziert werden, die zur Störung der Interaktion des TIE-Rezeptors mit dem biologisch aktiven TIE Ligand-4 befähigt sind. Solche Antagonisten werden durch ihre Fähigkeit identifiziert, (1) die Bindung des biologisch aktiven TIE Ligand-4 mit dem Rezeptor zu blockieren, gemessen zum Beispiel mittels BIAcore-Biosensor-Technologie (Biacore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ); oder (2) die Fähigkeit des biologisch aktiven TIE Liganden-4 zu blockieren, eine biologische Antwort hervorzurufen. Solche biologischen Antworten schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf die Phosphorylierung des TIE-Rezeptors oder von stromabwärts befindlichen Komponenten des TIE- Signalübertragungsweges oder das Überleben, das Wachstum oder die Differenzierung von TIE-Rezeptor tragenden Zellen.
In einer Ausführungsform kann das Wachstum der Zellen, die zur Expression des TIE- Rezeptors manipuliert wurden, von der Zugabe des TIE Liganden-4 abhängig sein. Solche Zellen stellen nützliche Testsysteme dar, um weitere Agonisten des TIE-Rezeptors zu identifizieren oder Antagonisten, die zur Störung der Aktivität des TIE Liganden-4 auf solche Zellen befähigt sind. In einer anderen Ausführungsform können autokrine Zellen, die manipuliert wurden, um den TIE Ligand-4 und den Rezeptor co-exprimieren zu können, nützliche Systeme darstellen, um mögliche Agonisten oder Antagonisten zu testen.
Ein TIE-Rezeptor kann in Zellen eingeführt werden, die normalerweise diesen Rezeptor nicht exprimieren, was diesen Zellen erlaubt, tiefgehende und einfach erkennbare Reaktionen auf einen Ligand zu zeigen, der diesen Rezeptor bindet. Die Art der hervorgerufenen Reaktion hängt von der verwendeten Zelle ab und nicht von dem in die Zelle eingeführten, spezifischen Rezeptor. Geeignete Zelllinien können ausgewählt werden, um eine Reaktion mit dem größten Nutzen zu erzielen, um Moleküle zu testen und zu entdecken, die auf Tyrosinkinase- Rezeptoren wirken können. Die Moleküle können von jeglicher Art sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Peptid- und Nichtpeptid-Moleküle, die in noch zu beschreibenden Systemen in Rezeptor-spezifischer Art und Weise wirken werden.
Eines der für die Anwendung nützlicheren Systeme beinhaltet die Einführung eines TIE- Rezeptors (oder eines chimären Rezeptors, der die extrazelluläre Domäne einer anderen Rezeptor-Tyrosirikinase, wie zum Beispiel trkC, und die intrazelluläre Domäne eines TIE- Rezeptors enthält) in eine Fibroblasten-Zelllinie (z. B. NIH3T3-Zellen), sodass ein solcher Rezeptor, der normalerweise keine proliferativen oder anderen Antworten vermittelt, nach der Einführung in Fibroblasten dennoch durch eine Vielzahl etablierter Verfahren getestet werden kann, um die Wirkungen von Fibroblasten-Wachstumsfaktoren zu quantifizieren (z. B. Thymidin-Einbau oder andere Arten von Vermehrungstests; siehe von Zoelen, 1990, "The Use of Biological Assays For Detection of Polypeptide Growth Factors" in Progress Factor Research, Bd. 2, S. 131-152; Zhan und M. Goldfarb, 1986, Mol. Cell. Biol., Bd. 6, S. 3541- 3544). Diese Tests haben den zusätzlichen Vorteil, dass jede Präparation sowohl in der Zelllinie mit dem eingeführten Rezeptor, als auch in der parentalen Zelllinie ohne den Rezeptor gestestet werden kann; nur spezifische Wirkungen auf die Zelllinie mit dem Rezeptor würden als durch den eingeführten Rezeptor vermittelt gewertet werden. Solche Zellen können weiter manipuliert werden, um den TIE Ligand-4 zu exprimieren, sodass ein autokrines System geschaffen wird, das zum Testen von Molekülen von Nutzen ist, die als Antagonisten/Agonisten dieser Interaktion wirken. Somit sorgt die vorliegende Erfindung für Wirtszellen, die TIE Ligand-4 codierende und TIE-Rezeptor codierende Nucleinsäuren enthalten.
Die TIE-Rezeptor/TIE Ligand-4-Interaktion stellt auch ein nützliches System bereit, um kleine Moleküle als Agonisten oder Antagonisten des TIE-Rezeptors zu identifizieren. Zum Beispiel können Fragmente, Mutanten oder Derivate des TIE Ligand-4 identifiziert werden, die den TIE-Rezeptor binden, aber keine andere biologische Aktivität induzieren. Als andere Möglichkeit ermöglicht die Charakterisierung des TIE Ligand-4 die Ermittelung der aktiven Abschnitte des Moleküls. Weiterhin ermöglicht die Identifizierung eines Liganden die Bestimmung der Röntgenkristallstruktur des Rezeptor/Liganden-Komplexes, womit die Identifzierung der Bindungsstelle am Rezeptor ermöglicht wird. Kenntnisse über die Bindungsstelle werden nützliche Einsichten in das rationale Entwerfen neuer Agonisten und Antagonisten gewähren.
Die spezifische Bindung eines Testmoleküls an den TIE-Rezeptor kann auf zahlreiche Arten gemessen werden. Zum Beispiel kann die tatsächliche Bindung des Testmoleküls an TIE-exprimierende Zellen detektiert oder gemessen werden, indem detektiert oder gemessen wird (i) das an die Oberfläche intakter Zellen gebundene Testmolekül; (ii) das in Zelllysaten mit dem TIE-Protein quervernetzte Testmolekül; oder (iii) das in vitro an TIE gebundene Testmolekül. Die spezifische Interaktion zwischen dem Testmolekül und TIE kann beurteilt werden, indem Reagentien verwendet werden, die die einzigartigen Eigenschaften dieser Interaktion aufzeigen.
Als ein bestimmtes, nicht einschränkendes Beispiel können die erfindungsgemäßen Verfahren wie folgt verwendet werden. Man denke an einen Fall, in dem der TIE Ligand-4 in einer Probe gemessen werden soll. Verschiedene Verdünnungen der Probe (des Testmoleküls) können parallel zu einer Negativkontrolle (NC), die keine TIE Ligand-4-Aktivität enthält, und zu einer Positivkontrolle, die eine bekannte Menge an TIE Ligand-4 enthält, Zellen ausgesetzt werden, die TIE in Anwesenheit eines detektierbar markierten TIE Ligand-4 exprimiert (in diesem Beispiel mit radioaktivem Iod markierter Ligand). Die Menge an TIE Ligand-4 in der Testprobe kann bewertet werden, indem die Menge an ¹²&sup5;I-markiertem TIE Ligand-4, die an die Kontrollen und jede der Verdünnungen bindet, bestimmt wird und die Probenwerte anschließend mit einer Standardkurve verglichen werden. Je mehr TIE Ligand-4 in der Probe ist, desto weniger ¹²&sup5;I-Ligand wird an TIE binden.
Die Menge des gebundenen ¹²&sup5;I-Liganden kann gemessen werden, indem die Radioaktivitätsmenge pro Zelle gemessen wird oder der TIE Ligand-4 mit Zelloberflächenproteinen unter Verwendung von DSS quervernetzt wird, wie beschrieben in Meakin und Shooter, 1991, Neuron 6: 153-163, und die Menge an markiertem Protein in Zellextrakten unter der Verwendung von zum Beispiel SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese detektiert wird, was ein markiertes Protein mit einer TIE-Rezeptor/TIE Ligand-4 entsprechenden Größe erkennen lassen kann. Die spezifische Testmolekül/TIE-Interaktion kann weiter getestet werden, indem den Tests verschiedene Verdünnungen an unmarkiertem Kontrollligand zugegeben wird, der den TIE-Rezeptor nicht bindet und daher keinen bedeutenden Einfluss auf die Konkurrenz zwischen markiertem TIE Ligand-4 und dem Testmolekül um die TIE-Bindung ausüben sollte. Als andere Möglichkeit kann von einem Molekül, von dem bekannt ist, dass es die TIE Ligand-4-Bindung aufbrechen kann, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf anti-im-Antikörper oder den hier beschriebenen TIE- Rezeptorkörper, erwartet werden, dass es die Konkurrenz zwischen ¹²&sup5;I-TIE Ligand-4 und dem Testmolekül um die Bindung des TIE-Rezeptors beeinflusst.
Ein detektierbar markierter TIE Ligand-4 schließt ein, ist aber nicht beschränkt auf einen TIE Ligand-4, der kovalent oder nicht-kovalent verbunden ist mit einer radioaktiven Substanz, einer fluoreszierenden Substanz, einer Substanz, die enzymatische Aktivität aufweist, einer Substanz, die als Substrat für ein Enzym dienen kann (Enzyme und Substrate verbunden mit kolorimetrisch detektierbaren Reaktionen werden bevorzugt) oder mit einer Substanz, die durch ein Antikörpermolekül erkannt wird, das vorzugsweise ein detektierbar markiertes Antikörpermolekül ist.
In einer anderen Ausführungsform kann die spezifische Bindung des Testmoleküls an TIE gemessen werden, indem die sekundären biologischen Wirkungen der TIE Ligand-4/TIE- Rezeptor-Bindung bewertet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Zellwachstum und/oder Differenzierung oder unmittelbar frühe Genexpression oder Phosphorylierung von TIE. Zum Beispiel kann die Fähigkeit des Testmoleküls, Differenzierung zu induzieren, in Zellen getestet werden, denen tie fehlt, und in vergleichbaren Zellen, die tie exprimieren; Differenzierung in tie-exprimierenden Zellen, aber nicht in vergleichbaren Zellen, denen tie fehlt, wäre ein Indiz für eine spezifische Interaktion zwischen Testmolekül und TIE. Eine ähnliche Analyse könnte durchgeführt werden, indem die Induktion von unmittelbar frühen Genen (z. B. fos und jun) in tie-negativen und tie-positiven Zellen detektiert wird oder indem die Phosphorylierung von TIE unter der Verwendung von im Fachgebiet bekannten Standard- Phosphorylierungstests detektiert wird. Eine solche Analyse könnte bei der Identifizierung von Agonisten oder Antagonisten von Nutzen sein, die nicht vollständig an TIE binden.
In ähnlicher Weise beinhaltet ein Verfahren zur Identifizierung eines Moleküls, das die biologische Aktivität des TIE Liganden-4 aufweist, (i) das Aussetzen einer tie- exprimierenden Zelle gegenüber einem Testmolekül und (ii) das Detektieren der spezifischen Bindung des Testmoleküls an den TIE-Rezeptor, wobei die spezifische Bindung an TIE in positiver Beziehung mit einer TIE-ähnlichen Aktivität steht. Spezifische Bindung kann detektiert werden, indem entweder die direkte Bindung oder die sekundären biologischen Wirkungen, wie vorstehend angesprochen, getestet werden. Eine solche Methode kann besonders bei der Identifizierung neuer Mitglieder der TIE Ligandenfamilie von Nutzen sein oder in der pharmazeutischen Industrie bei der Durchmusterung einer großen Sammlung von Peptid- oder Nicht-Peptid-Molekülen (z. B. Peptidomimetik) hinsichtlich TIE-assoziierter biologischer Aktivität. In einer bevorzugten, spezifischen, nicht eingeschränkten Ausführungsform der Erfindung wird ein großes Gitter an Kultur-Löchern hergestellt, die in alternierenden Reihen PC12-Zellen (oder Fibroblasten, siehe nachstehend) enthalten, die entweder tie-negativ oder nach Manipulation tie-positiv sind. Eine Vielzahl von Testmolekülen kann dann zugegeben werden, sodass jede Reihe des Gitters oder ein Anteil davon ein unterschiedliches Testmolekül enthält. Jedes Loch kann anschließend hinsichtlich der An- oder Abwesenheit von Wachstum und/oder Differenzierung ausgewertet werden. Auf diese Art und Weise kann eine extrem hohe Anzahl an Testmolekülen hinsichtlich dieser Aktivität durchmustert werden.
Verfahren zur Detektion oder Messung TIE Ligand-ähnlicher Aktivität oder zur Identifizierung eines Moleküls mit einer solchen Aktivität enthalten (i) das Aussetzen eines Testmoleküls gegenüber einem TIE-Rezeptorprotein in vitro unter Bedingungen, die das Stattfinden einer Bindung erlauben und (ii) das Detektieren der Bindung des Testmoleküls an das TIE-Rezeptorprotein, wobei das Binden des Testmoleküls an den TIE-Rezeptor mit der TIE Ligand-ähnlichen Aktivität korreliert. Entsprechend solcher Verfahren kann der TIE- Rezeptor im wesentlichen gereinigt werden oder nicht, kann an eine feste Unterlage angebracht werden (z. B. an eine Affinitätssäule oder einen ELISA-Test) oder kann in eine künstliche Membran integriert werden. Die Bindung eines Testmoleküls an einen TIE- Rezeptor kann durch jedes im Fachgebiet bekannte Verfahren bewertet werden. In bevorzugten Ausführungsformen kann die Bindung des Testmoleküls detektiert oder gemessen werden, indem seine Fähigkeit bewertet wird, mit detektierbar markierten, bekannten TIE Liganden um die TIE-Rezeptorbindung zu konkurrieren.
Ein Verfahren zur Detektion der Fähigkeit eines Testmoleküls, als ein Antagonist der TIE Ligand-ähnlichen Aktivität zu fungieren, enthält die Detektion der Fähigkeit des Moleküls, die Wirkung eines an einen TIE-Rezeptor bindenden TIE Liganden auf eine Zelle zu inhibieren, die den Rezeptor exprimiert. Ein solcher Antagonist kann oder kann nicht die TIE- Rezeptor/TIE Ligand-4-Bindung beeinflussen. Die Wirkungen der Bindung des im Liganden-4 an den TIE-Rezeptor sind vorzugsweise biologische oder biochemische Wirkungen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf das Überleben oder das Vermehren einer Zelle, die Transformation einer Zelle, die Induktion von unmittelbar frühen Genen oder die Phosphorylierung von TIE.
Ein Verfahren zur Identifizierung von Antikörpern oder anderen Molekülen, die den Liganden neutralisieren oder die Bindung an den Rezeptor blockieren können, ebenso wie die durch das Verfahren identifizieren Moleküle kann mit Hilfe eines Tests durchgeführt werden, der konzeptionell einem ELISA-Test ähnlich ist. Zum Beispiel kann der TIE-Rezeptorkörper an eine feste Unterlage, wie eine Mehrlochplatte aus Kunststoff, gebunden sein. Als Kontrolle kann eine bekannte Menge Myc-markierter TIE Ligand-4 in ein Loch eingebracht werden und jeder markierte TIE Ligand-4, der den Rezeptorkörper bindet, kann dann mit Hilfe eines gegen die Myc-Markierung gerichteten Reporter-Antikörper identifiziert werden. Dieses Testsystem kann anschließend verwendet werden, Testproben auf Moleküle zu durchmustern, die befähigt sind zur (i) Bindung an den markierten Liganden oder (ii) Bindung an den Rezeptorkörper und dadurch zum Blockieren der Bindung an den Rezeptorkörper durch den markierten Liganden. Zum Beispiel kann eine Testprobe, die ein mutmaßlich interessantes Molekül zusammen mit einer bekannten Menge eines markierten Liganden enthält, in ein Loch gegeben und die Menge des markierten Liganden gemessen werden, die an den Rezeptorkörper bindet. Durch den Vergleich der Menge an gebundenem, markierten Ligand in der Testprobe mit der Menge in der Kontrolle können Proben identifiziert werden, die Moleküle enthalten, die die Bindung des Liganden an den Rezeptor blockieren können. Die auf diese Weise identifizierten interessanten Moleküle unter der Verwendung von unter Fachleuten bekannten Verfahren isoliert werden.
Wenn ein die Ligandenbindung blockierendes Molekül gefunden wurde, würde ein Fachmann wissen, welche sekundären Tests durchzuführen wären, um festzustellen, ob das blockierende Molekül den Rezeptor oder den Liganden bindet, und auch welche Tests, um festzustellen, ob das blockierende Molekül die biologische Aktivität des Liganden neutralisieren kann. Zum Beispiel wäre ein Fachmann in der Lage, unter Verwendung eines Bindungstests, der die BIAcore-Biosensor-Technologie (oder etwas Gleichwertiges) einsetzt und in dem entweder der TIE-Rezeptorkörper oder der TIE Ligand-4 kovalent an eine feste Oberfläche (z. B. Carboxymethyldextran auf einer Goldoberfläche) gebunden ist, festzustellen, ob das blockierende Molekül den Liganden, den Ligandenkörper oder den Rezeptorkörper spezifisch bindet. Um festzustellen, ob das blockierende Molekül die biologische Aktivität des Liganden neutralisieren kann, könnte ein Fachmann einen Phosphorylierungstest durchführen (siehe Beispiel 5 in der internationalen Offenlegung WO 96/31598, veröffentlicht am 10. Oktober 1996) oder als andere Möglichkeit einen funktionellen Biotest, wie einen Überlebenstest, unter der Verwendung von Primärkulturen von zum Beispiel Endothelzellen. In einer anderen Ausführungsform könnte ein blockierendes Molekül, das den Rezeptorkörper bindet, ein Agonist sein und ein Fachmann würde wissen, wie das festzustellen sei, indem ein geeigneter Test zur Identifizierung weiterer Agonisten des TIE- Rezeptors durchgeführt wird.
Darüber hinaus könnte der TIE Ligand die Rezeptor-bindende Domäne des hier beschriebenen TIE Liganden-4 sein. Beispielsweise enthält der TIE-2 Ligand 1 eine "coiled coil"- Domäne und eine Fibrinogen-ähnliche Domäne. Man glaubt, dass die Fibrinogen- ähnliche Domäne des TIE-2 Liganden 2 an oder um die gleiche Aminosäuresequenz wie in Ligand 1 (FRDCA) beginnt. Man glaubt, dass die Fibrinogen-ähnliche Domäne des TIE Liganden-3 an oder um die Aminosäuresequenz beginnt, die durch die um Position 929 beginnenden Nucleotide codiert wird, wie in Fig. 6A-6B dargelegt. Die Multimerisierung der "coiled coil"-Domänen während der Produktion des Liganden behindert die Reinigung. Wie Beispiel 7 beschrieben haben die Anmelder jedoch entdeckt, dass die Fibrinogen- ähnliche Domäne die TIE-2-Retzeptor bindende Domäne enthält. Die monomeren Formen der Fibrinogen-ähnlichen Domäne scheinen jedoch nicht den Rezeptor zu binden. Untersuchungen mit myc-markierten, Fibrinogen-ähnlichen Domänen, die mit Hilfe von anti- myc-Antikörpern "gruppiert" wurden, zeigen, dass diese den TIE-2 Rezeptor binden. [Verfahren zur Produktion von "gruppierten Liganden und Ligandenkörpern" werden beschrieben in Davis et al., Science 266: 816-819 (1994)]. Auf diesem Ergebnis beruhend stellten die Anmelder "Ligandenkörper" her, die die Fibrinogen-ähnliche Domäne der TIE-2 Liganden gekoppelt an die Fc-Domäne von IgG ("fFc's") enthalten. Diese Ligandenkörper, die Dimere ausbilden, binden wirksam an den TIE-2-Rezeptor. TIE Ligand-4-Ligandenkörper können als zielgerichtete Mittel in der Diagnose oder in therapeutischen Anwendungen verwendet werden, so wie auf Tumore und/oder auf damit verbundene Gefäße abzielende Mittel, wodurch ein TIE-Antagonist angezeigt wird.
Der Ligand, ein Fragment oder ein Derivat davon, oder ein anderes Molekül, das ein Rezeptoragonist oder -antagonist ist, kann als ein Therapeutikum zur Behandlung von Patienten entwickelt werden, die an Erkrankungen leiden, die Zellen, Gewebe oder Organe betreffen, die den TIE-Rezeptor exprimieren. Solche Moleküle können in einem Verfahren zur Behandlung des Körpers von Mensch oder Tier verwendet werden, oder in einem Diagnoseverfahren.
Da der TIE-Rezeptor in Verbindung mit Endothelzellen identifiziert wurde und, wie hier demonstriert, das Blockieren des TIE-2 Liganden 1 die Vaskularisierung zu verhindern scheint, erwarten die Anmelder, dass der TIE Ligand-4 bei der Induktion der Vaskularisierung bei Erkrankungen und Störungen von Nutzen sein kann, wo eine solche Vaskularisierung angezeigt wird. Solche Erkrankungen und Störungen würden Wundheilung, Ischämie und Diabetes einschließen. Die Liganden können in Tiermodellen getestet und therapeutisch eingesetzt werden, wie für andere Mittel beschrieben, wie dem vaskulären Endothel- Wachsumsfaktor (VEGF), einem anderen für Endothelzellen spezifischen Faktor, der angiogenisch ist. Ferrara et al., US-Patent Nr. 5,332,671, erteilt am 26. Juli 1994. Die Referenz von Ferrara beschreibt ebenso wie andere Studien in vivo- und in vitro- Untersuchungen, die verwendet werden können, um die Wirkung eines angiogenischen Faktors bei der Erhöhung des Blutflusses zu ischämischem Myokard, bei der Verbesserung der Wundheilung und bei anderen therapeutischen Situationen zu zeigen, bei denen Neuangiogenese erwünscht ist. [siehe Sudo et al., Europäische Patentanmeldung 0 550 296 A2, veröffentlicht am 7. Juli 1993; Banal et al., Circulation 89: 2183-2189 (1994); Unger et al., Am. J. Physiol. 266: H1588-H1595 (1994); Lazarous et al., Circulation 91: 145-153 (1995)]. Der Erfindung entsprechend kann der TIE Ligand-4 alleine oder in Kombination mit einer oder mehreren zusätzlichen pharmazeutisch aktiven Verbindungen verwendet werden, wie zum Beispiel VEGF oder der basische Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), ebenso wie Cytokine, Neutrophine usw.
Im Gegensatz dazu wären Antagonisten des TIE-Rezeptors, wie die hier in den Beispielen 2 und 3 beschriebenen Rezeptorkörper und der TIE-2 Ligand 2, wie beschrieben in Beispiel 9 der am 10. Oktober 1996 offengelegten internationalen Offenlegung WO 96/31598, von Nutzen, um Vaskularisierung zu verhindern oder abzuschwächen und damit zum Beispiel Tumorwachstum zu verhindern oder abzuschwächen. Diese Mittel können alleine oder in Kombination mit anderen Verbindungen, so wie anti-VEGF-Antikörpern verwendet werden, von denen gezeigt wurde, dass sie bei der Behandlung von Krankheitszuständen von Nutzen sind, bei denen die therapeutische Absicht in dem Blockieren der Angiogenese besteht. Die Anmelder erwarten, dass der hier beschriebene TIE Ligand-4 auch in Kombination mit Mitteln wie Cytokin-Antagonisten, so wie IL-6-Antagonisten, verwendet werden kann, die bekanntlich Entzündungen hemmen.
Die Anmelder haben beispielsweise festgestellt, dass TIE Liganden in Zellen innerhalb von oder in naher Verbindung mit Tumoren exprimiert werden. Zum Beispiel scheint der TIE-2 Ligand 2 eng mit Tumor-Endothelzellen verbunden zu sein. Dementsprechend können dieser und andere TIE-Antagonisten auch bei der Verhinderung oder Abschwächung von zum Beispiel Tumorwachstum von Nutzen sein. Darüber hinaus können Liganden oder Ligandenkörper bei der Abgabe von Toxinen an Rezeptor-tragende Zellen nützlich sein. In einer anderen Ausführungsform können andere Moleküle, wie Wachstumsfaktoren, Cytokine oder Nährstoffe mit Hilfe von TIE Liganden oder Ligandenkörpern an TIE-Rezeptor-tragende Zellen abgegeben werden. TIE Liganden oder Ligandenkörper wie der TIE Ligand-4 können auch als diagnostische Mittel für TIE-Rezeptoren verwendet werden, um den Rezeptor in vivo oder in vitro zu detektieren. Wenn der TIE-Rezeptor mit einem Krankheitszustand assoziiert ist, können TIE Liganden und Ligandenkörper wie der TIE Ligand-4 als diagnostische Reagentien verwendet werden, um die Erkrankung zum Beispiel durch Anfärben von Gewebe oder Ganzkörper-Diagnostik zu detektieren. Solche Reagentien schließen Radioisotope, Fluorochrome, Farbstoffe, Enzyme und Biotin ein. Solche Diagnostika oder abzielende Mittel können hergestellt werden wie beschrieben in Alitalo et al., WO 95/26364, veröffentlicht am 5. Oktober 1995, und Burrows, F. und P. Thorpe, PNAS (USA) 90: 8996-9000 (1993).
In anderen Ausführungsformen wird der hier beschriebene TIE Ligand-4 als hämatopoetischer Faktor verwendet. Verschiedenste hämatopoetische Faktoren und ihre Rezeptoren sind an der Vermehrung und/oder Differenzierung und/oder Wanderung der verschiedenen im Blut enthaltenen Zelltypen beteiligt. Da die TIE-Rezeptoren in frühen hämatopoetischen Zellen exprimiert werden, wird von den TIE Liganden erwartet, dass sie eine vergleichbare Rolle in der Vermehrung oder Differenzierung oder Wanderung dieser Zellen spielen. Daher können zum Beispiel TIE-enthaltende Zusammensetzungen hergestellt, getestet, in biologischen in vivo- und in vitro-Systemen untersucht und therapeutisch verwendet werden, wie in jeder der folgenden Referenzen beschrieben: Sousa, US-Patent Nr. 4; 810, 643, Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 4360-4364 (1985); Wong et al., Science 228: 810-814 (1985); Yokota et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1070 (1984); Bosselman et al., WO 91 05795, offengelegt am 2. Mai 1991, mit dem Titel "Stem Cell Factor" und Kirkness et al., WO 95/19985, offengelegt am 27. Juli 1995, mit dem Titel "Haemopoietic Maturation Factor". Dementsprechend kann der TIE Ligand-4 verwendet werden, um Krankheitszustände zu diagnostizieren oder zu behandeln, in denen die normale Hämatopoese unterdrückt ist, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Anämie, Thrombocytopenie, Leukopenie und Granulocytopenie. In einer bevorzugten Ausführungsform kann der TIE Ligand-4 verwendet werden, um die Differenzierung von Vorläufer-Blutzellen in Situationen zu stimulieren, in denen der Patient eine Erkrankung wie das erworbene Immundefekt- Syndrom (AIDS) aufweist, die eine Reduzierung der normalen Biutzellenmengen verursacht hat, oder in klinischen Situationen, in denen eine Erhöhung der hämatopoetischen Populationen erwünscht ist, wie in Verbindung mit einer Knochenmarkstransplantation, oder bei der Behandlung von Aplasie oder Myelosuppression, die durch Strahlung, chemische Behandlung oder Chemotherapie verursacht wurde.
Der TIE Ligand-4 der vorliegenden Erfindung kann alleine verwendet werden oder in Kombination mit anderen pharmazeutisch aktiven Mitteln, wie zum Beispiel Cytokinen, Neutrophinen, Interleukinen usw.. In einer bevorzugten Ausführungsform kann der Ligand zusammen mit jedem der Vielzahl der vorstehend erwähnten Faktoren verwendet werden, die bekanntlich die Vermehrung von Stammzellen oder von anderen hämatopoetischen Vorläuferzellen induzieren, oder von Faktoren, die auf spätere Zellen des hämatopoetischen Weges wirken, einschließlich, aber nicht beschränkt auf hämopoetischen Reifungsfaktor, Thrombopoetin, Stammzellenfaktor, Erythropoetin, G-CSF, GM-CSF usw..
TIE-Rezeptor-Antagonisten können verwendet werden, um Patienten zu diagnostizieren oder zu behandeln, bei denen das erwünschte Ergebnis eine Hemmung einer hämatopoetischen Weges ist, so wie bei der Behandlung von Myelin-proliferativen oder anderen proliferativen Erkrankungen der Blutbildenden Organe wie Thrombocytämie, Polycytämie und Leukämie. In einer solchen Ausführungsform kann die Behandlung die Verwendung von therapeutisch wirksamen Mengen des TIE Liganden-4, TIE-Antikörpers, TIE-Rezeptorkörpers, eines Konjugats von TIE Ligand-4 oder eines Ligandenkörpers oder fFc, wie hier beschrieben, beinhalten.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Arzneimittel bereit, die den hier beschriebenen TIE Ligand-4 oder Peptidfragmente oder Derivate davon, die die Aminosäuresequenz der Fibrinogen-ähnlichen Domäne enthalten, in einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten. Die TIE Ligand-4-Proteine, Peptidfragmente oder Derivate können systemisch oder lokal verabreicht werden. Jegliche in Fachgebiet bekannte, geeignete Verabreichungsart kann verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf intravenös, intrathecal, intraarteriell, intranasal, oral, subkutan, intraperitoneal oder durch lokale Injektion oder operatives Implantieren. Formulierungen zur andauernden Freigabe werden ebenfalls bereitgestellt.
Die vorliegende stellt ebenfalls einen Antikörper bereit, der spezifisch solch ein therapeutisches Molekül bindet. Der Antikörper kann monoclonal oder polyclonal sein. Solch ein monoclonaler oder polyclonaler Antikörper kann verwendet werden, um die Menge an dem therapeutischen Molekül in einer Probe zu messen, die einem Patienten zum Zweck der Überwachung des Therapieverlaufs entnommen wurde.
Die Erfindung stellt weiterhin eine therapeutische Zusammensetzung bereit, die den TIE Ligand-4 und ein damit konjugiertes cytotoxisches Mittel enthält. In einer Ausführungsform kann das cytotoxische Mittel ein Radioisotop oder ein Toxin sein.
Die Erfindung stellt ebenfalls einen Antikörper bereit, der spezifisch den TIE Ligand-4 bindet. Der Antikörper kann monoclonal oder polyclonal sein.
Ein Verfahren zur Reinigung des TIE Liganden-4 enthält:
a) die Kopplung von mindestens einem TIE-bindenden Substrat an eine feste Matrix;
b) das Inkubieren des Substrats von a) mit einem Zelllysat, sodass das Substrat mit jedem TIE Ligand-4 in dem Zelllysat einen Komplex ausbildet;
c) das Waschen der festen Matrix; und
d) das Eluieren des TIE Liganden-4 von dem gekoppelten Substrat.
Das Substrat kann jede Substanz sein, die spezifisch den TIE Ligand-4 bindet. Das Substrat kann ausgewählt sein aus der Gruppe, bestehend aus anti-TIE Ligand-4-Antikörper, TIE-Rezeptor und TIE-Rezeptorkörper.
Ein Verfahren zur Identifizierung einer TIE-Rezeptor-exprimierenden Zelle enthält das Kontaktieren einer Zelle mit einem detektierbar markierten TIE Ligand-4 unter Bedingungen, die die Bindung des detektierbar markierten Liganden an den TIE-Rezeptor erlauben, und das Feststellen, ob der detektierbar markierte Ligand an den TIE-Rezeptor gebunden ist, wodurch die Zelle als eine TIE-Rezeptor exprimierende identifiziert wird.
Ein Verfahren zur Detektion der Expression des TIE Liganden-4 durch eine Zelle enthält das Erhalten von mRNA von der Zelle, das Kontaktieren der so erhaltenen mRNA mit einem TIE Ligand-4 codierenden Nucleinsäuremolekül unter Hybridisierungsbedingungen, das Feststellen der Anwesenheit von an das markierte Molekül hybridisierter mRNA und dadurch das Detektieren der Expression von TIE Ligand-4 in der Zelle.
Ein Verfahren zur Detektion der Expression des TIE Liganden-4 in Gewebeschnitten enthält das Kontaktieren der Gewebeschnitte mit einem TIE Ligand-4 codierenden Nucleinsäuremolekül unter Hybridisierungsbedingungen, das Feststellen der Anwesenheit von an das markierte Molekül hybridisierter mRNA und dadurch das Detektieren der Expression von TIE Ligand-4 in Gewebeschnitten.

BEISPIEL 1- IDENTIFIZIERUNG DER ABAE-ZELLINIE ALS REPORTER-ZELLEN FÜR DEN TIE-2-REZEPTOR

Adulte BAE-Zellen sind in dem Europäischen Zell-Kultur-Magazin unter ECACC#92010601 registriert. (Siehe PNAS 75: 2621 (1978)). Northern (RNA)-Analysen zeigten gemäßigte Mengen an tie-2 Transkript in der ABAE (adulten, arteriellen Rinder- Endothel)-Zelllinie, in Übereinstimmung mit Ergebnissen von in situ-Hybridisierungen, die eine fast ausschließliche Lokalisierung der tie-2 RNAs in vaskulären Endothelzellen demonstrierten. Wir untersuchten daher ABAE-Zelllysate hinsichtlich der Anwesenheit des TIE-2 Proteins, als auch des Ausmaßes, mit dem dieses TIE-2 Protein unter normalen, gegenüber Serum-freien Wachstumsbedingungen Tyrosin-phosphoryliert ist. ABAE- Zelllysate wurden geerntet und einer Immunpräzipitation unterzogen, gefolgt durch Westernblot-Analysen der immunpräzipitierten Proteine mit TIE-2-spezifischen und Phosphotyrosinspezifischen Antiseren. Das Weglassen oder Einsetzen von TIE-2 Peptiden als spezifische blockierende Moleküle bei der Immunpräzipitation erlaubte die eindeutige Identifizierung von TIE-2 als ein in mäßigen Mengen detektierbares Protein mit einer Größe von ~150 kD, dessen Mengen an Phosphotyrosin des Normalzustandes sich auf nahezu undetektierbare Mengen verringern, wenn die Zellen vorher Serum-gehungert waren.
Die Kultur der ABAE-Zellen und die Ernte der Zelllysate wurden wie folgt durchgeführt. ABAE-Zellen mit geringen Passagen wurden als Einzelschicht bei einer Dichte von 2 · 10&sup6; Zellen/150 mm-Plastik-Petrischale (Falcon) plattiert und in Dulbecco's modifiziertem Eagle's-Medium (DMEM) gezüchtet, das 10% Rinderkälberserum (10% BCS), 2 mM L-Glutamin (Q) und jeweils 1% Penicillin und Streptomycin (p-S) in einer Atmosphäre von 5% CO&sub2; enthält. Vor der Ernte der Zelllysate wurden die Zellen für 24 Stunden in DMEM/Q/P-S Serum-gehungert, gefolgt durch eine Belüftung des Mediums und das Spülen der Platten mit eiskalter Phosphat-gepufferter Saline (PBS), supplementiert mit Natriumorthovanadat, Natriumfluorid und Natriumbenzamidin. Die Zellen wurden in einem kleinen Volumen des Spülpuffers lysiert, der mit 1% NP40-Detergenz und den Protease- Inhibitoren PMSF und Aprotinin supplementiert worden war. Unlösliche Zellteile wurden von dem Zelllysat durch Zentrifugation bei 14000 · g und 4ºC entfernt und die Überstände wurden einer Immunpräzipitation mit TIE-2-Rezeptor-spezifischen Antiseren unterzogen, in An- oder Abwesenheit von blockierenden Peptiden, die in einer Menge von ~20 ug/ml Lysat zugegeben wurden. Immunpräzipitierte Proteine wurden durch PAGE (7,5% Laemmli-Gel) aufgetrennt und anschließend auf eine PVDF-Membran elektrotransferiert und entweder mit verschiedenen TIE-2- oder Phosphotyrosinspezifischen Antiseren inkubiert. Das TIE-2- Protein wurde sichtbar gemacht, indem die Membran mit HRP-konjugierten sekundären Antiseren inkubiert und darauf folgend mit ECL-Reagenz (Amersham) behandelt wurde.

BEISPIEL 2- CLONIERUNG UND EXPRESSION DES TIE-2- REZEPTORKÖRPERS FÜR AFFINITÄTS-BASIERTE UNTERSUCHUNGEN DER TIE-2 LIGANDEN-INTERAKTIONEN

Ein Expressionskonstrukt wurde erzeugt, das ein sekretiertes Protein hervorbringen würde, das aus dem gesamten extrazellulären Anteil des TIE-2-Rezeptors von Ratte fusioniert an die konstante Region des menschlichen Immunglobulin gamma-1 (IgG1 Fc) besteht. Dieses Fusionsprotein wird TIE-2-"Rezeptorkörper" (RB) genannt und es würde normalerweise erwartet werden, dass es in Lösung beruhend auf der Ausbildung von Disulfidbrücken zwischen einzelnen IgG1 Fc-Ketten als Dimer vorliegt. Der Fc-Anteil des TIE-2-RB wurde wie folgt hergestellt. Ein den Fc-Anteil des menschlichen IgG1 codierendes DNA-Fragment, das sich von der Gelenksregion bis zum Carboxy-Terminus des Proteins erstreckt, wurde aus menschlicher Plazenta-cDNA durch PCR mit Oligonucleotiden amplifiziert, die der veröffentlichten Sequenz des menschlichen IgG1 entsprechen; das resultierende DNA-Fragment wurde in einen Plasmidvektor cloniert. Geeignete DNA- Restriktionsfragmente von einem den TIE-2-Rezeptor in voller Länge codierenden Plasmid und von dem menschlichen IgG1 Fc-Plasmid wurden an jede Seite eines kurzen PCR- stämmigen Fragmentes ligiert, das so konstruiert wurde, dass es im Leserahmen die Proteincodierenden Sequenzen von TIE-2 und von dem menschlichen IgG1 Fc fusioniert. Somit ersetzte das resultierende TIE-2-Ectodomänen-Fc-Fusionsprotein exakt das IgG1 Fc an Stelle der Region, die die cytoplasmatische und die Transmembran-Domäne von TIE-2 ausmacht. Ein alternatives Verfahren zur Herstellung von RBs wird beschrieben in Goodwin et al., Cell 73: 447-456 (1993).
Milligramm-Mengen an TIE-2-RB wurden erhalten, indem das TIE-2-RB-DNA- Fragment in den pVL1393-Baculovirus-Vektor cloniert und nachfolgend die SF-21AE- Insektenzelllinie von Spodoptera frugiperda infiziert wurde. In einer anderen Ausführungsform kann die Zelllinie SF-9 (ATCC Zugangs-Nr. CRL-1711) oder die Zelllinie BTI-TN-5b1-4 verwendet werden. TIE-2-RB codierende DNA wurde als ein EcoRI-NotI- Fragment in das Baculovirus-Transfer-Plasmid pVL1393 cloniert. Durch Caesiumchlorid- Dichtegradientenzentrifugation gereinigte Plasmid-DNA wurde durch das Mischen von 3 ug Plasmid-DNA mit 0,5 ug Baculo-Gold-DNA (Pharminigen) in die virale DNA rekombiniert, gefolgt durch eine Einbringung in Liposomen unter der Verwendung von 30 ug Lipofectin (GIBCO-BRL). DNA-Liposomen-Gemische wurden für 5 Stünden bei 27ºC zu SF-21AE- Zellen (2 · 10&sup6; Zellen/60 mm-Platte) in TMN-FH-Medium (modifiziertes Grace's Insektenzellmedium, GIBCO-BRL) gegeben, gefolgt durch eine Inkubation für 5 Tage bei 27ºC in TMN-FH-Medium, das mit 5% fötalem Kälberserum supplementiert wurde. Das Gewebekulturmedium wurde zur Reinigung der rekombinanten Viren geerntet, was unter Verwendung früher beschriebener Verfahren durchgeführt wurde (O'Reilly, D. R., L. K. Miller und V. A. Luckow, Baculovirus Expression Vectors - A Laboratory Manual. 1992, New York: W. H. Freeman), außer, dass die Agarose-Überschichtung 125 ug/ml X-Gal (5-Brom-4- Chlor-3-Indolyl-β-D-Galactopyranosid; GIBCO-BRL) enthielt. Nach 5 Tagen Inkubation bei 27ºC wurden nicht-rekombinante Plaques durch eine positive chromogene Reaktion des X- Gal-Substrats erkannt und ihre Positionen markiert. Rekombinante Plaques wurden dann durch die Zugabe einer zweiten Überschichtung sichtbar gemacht, die 100 ug/ml MTT enthielt (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid; Sigma). Vermutlich rekombinante Viren-Plaques wurden durch Pfropfenabsaugung isoliert und durch verschiedene Runden der Plaque-Isolierung gereinigt, um die Homogenität sicherzustellen. Virus-Bestände wurden durch aufeinander folgendes Passagieren der Plaque-gereinigten Viren in geringer Vielzahl erzeugt. Durch eine geringe Anzahl von Passagen erzeugte Bestände eines Virus-Clons (vTIE-2-Rezeptorkörper) wurden hergestellt.
SF-21AE-Zellen wurden in Serum-freien Medium (SF-900 II, Gibco BRL) gezüchtet, das 1 x antibiotische/antimycotische Lösung (Gibco BRL) und 25 mg/l Gentamycin (Gibco BRL) enthält. Pluronisches F-68 wurde als Surfactant zu einer Endkonzentration von 1 g/l zugegeben. Kulturen (4 l) wurden vor der Infektion für mindestens drei Tage in einem Bioreaktor (Artisan Cell Station System) angezogen. Zellen wurden bei 27ºC wachsen gelassen, mit einer Gaszufuhr bis 50% gelöstem Sauerstoff bei einer Gasflussgeschwindigkeit von 80 ml/min (Belüftung durch Belüftungsring). Umrühren wurde mittels eines Magnetrührers bei einer Geschwindigkeit von 100 U/min durchgeführt. Die Zellen wurden in der Mitte der logarithmischen Wachstumsphase geerntet (~2 · 10&sup6; Zellen/ml), durch Zentrifugation aufkonzentriert und mit 5 Plaque-bildenden Einheiten des vTIE-2- Rezeptorkörpers pro Zelle infiziert. Die Zellen und das Animpfmaterial wurden mit frischem Medium auf 400 ml gebracht und der Virus wurde für zwei Stunden bei 27ºC in einer Rundflasche adsorbiert. Die Kultur wurde dann in einem Endvolumen von 8 l in frischem Serum-freien Medium resuspendiert und die Zellen wurden in einem Bioreaktor unter den vorher beschriebenen Bedingungen inkubiert.
Das Kulturmedium von vTIE-2-Rezeptorkörper-infizierten SF21AE-Zellen wurde 72 Stunden nach der Infektion durch Zentrifugation (500 · g, 10 Minuten) gesammelt. Die Zellüberstände wurden mit NaOH auf einen pH-Wert von 8 gebracht. EDTA wurde bis zu einer Endkonzentration von 10 mM zugegeben und der pH-Wert des Überstandes wieder auf 8 eingestellt. Die Überstände wurden filtriert (0,45 um, Millipore) und auf eine Protein A- Säule geladen (Protein A-Sepharose 4 fast flow oder HiTrap Protein A, beide von Pharmacia). Die Säule wurde mit 0,5 M NaCl enthaltender PBS gewaschen bis die Absorption bei 280 nm auf die Nulllinie abgesunken war. Die Säule wurde mit PBS gewaschen und mit 0,5 M Essigsäure eluiert. Säulenfraktionen wurden unmittelbar neutralisiert, indem sie in Röhrchen eluiert wurden, die 1 M Tris pH9 enthielten. Die den TIE-2-Rezeptorkörper enthaltenden Spitzenfraktionen wurden vereinigt und gegen PBS dialysiert.

BEISPIEL 3- DEMONSTRATION, DASS TIE-2 BEI DER ENTWICKLUNG DER VASKULATUR EINE WICHTIGE ROLLE SPIELT

Einsicht in die Funktion von TIE-2 wurde erhalten, indem ein "Überschuss" an löslichem TIE-2-Rezeptorkörper (TIE-2-RB) in ein sich entwickelndes System eingebracht wurde. Die potentielle Fähigkeit von TIE-2-RB, zugängliche TIE-2 Liganden zu binden und dadurch zu neutralisieren, könnte zu einer beobachtbaren Störung der normalen vaskulären Entwicklung und einer Charakterisierung des Liganden führen. Um zu untersuchen, ob TIE-2- RB verwendet werden kann, um die vaskuläre Entwicklung in frühen Hühnerembryos zu stören, wurden kleine Teile eines biologisch resorbierbaren Schaums mit TIE-2-RB eingeweicht und unmittelbar unter die Chorioallantoin-Membran eingeführt, an Positionen direkt seitlich des primitiven Embryos.
Frühe Hühnerembryos entwickeln sich oberhalb des Eigelbes aus einer kleinen Schicht von Zellen, die durch die Chorioallantoin-Membran (CAM) bedeckt ist. Die Endothelzellen, die auftreten werden, um die Vaskulatur in dem Embryo auszubilden, entstehen sowohl aus extra-embryonischen, als auch aus intra-embryonischen Ursprungszellen. Extra-embryonisch abstammende Endothelzellen, die die Hauptquelle von Endothelzellen im Embryo bereitstellen, stammen von Verwachsungen des Mesenchyms, die sich seitlich um den eigentlichen Embryo befinden, direkt unterhalb der CAM. Wenn diese Mesenchymzellen reifen, geben sie den Anstoss zu einem gemeinsamen Vorläufer von sowohl Endothel-, als auch von hämatopoetischen Zelllinien, genannt den Hämangioblast. Umgekehrt gibt der Hämangioblast Anstoss für eine gemischte Population von Angioblasten (die Vorläufer der Endothelzellen) und von Hämatoblasten (die pluripotenten hämatopoetischen Vorläufer). Die Erzeugung der Grundlagen des zirkulatorischen Systems beginnt, wenn sich die Endothelzellen-Nachkommenschaft trennt, um ein Vesikel mit der Dicke einer Zelle zu bilden, das die primitiven Blutzellen umschließt. Die Vermehrung und die Wanderung dieser zellulären Komponenten stellt schließlich ein ausgedehntes Netzwerk blutgefüllter Mikrogefäße unter der CAM her, das letztlich in den Embryo eindringen wird, um sich mit begrenzten, intra-embryonal abstammenden vaskulären Elementen zu verbinden.
Frisch befruchtete Hühnereier, erhalten von Spafas, Inc. (Boston, MA), wurden bei 99,5ºF und 55% relativer Luftfeuchtigkeit inkubiert. Nach einer Entwicklungszeit von etwa 24 Stunden wurde die Eierschale mit 70%-igen Ethanol abgerieben und es wurde ein. Zahnarzt-Bohrer verwendet, um in das stumpfe Ende jedes Eies ein Loch mit einer Größe von 1,5 cm zu machen. Die Schalenmembran wurde entfernt, um einen Luftraum direkt über dem Embryo zu erhalten. Kleine, rechteckige Stücke von sterilem Gelschaum (Upjohn) wurden mit einem Skalpell geschnitten und in gleichen Konzentrationen von TIE-2- oder EHK-1- Rezeptorkörper getränkt. Der EHK-1-Rezeptorkörper wurde wie in Beispiel 2 dargelegt hergestellt, unter der Verwendung der extrazellulären Domäne von EHK-1, an Stelle von der extrazellulären Domäne von TIE-2 (Maisonpierre et al., Oncogene 8: 3277-3288 (1993)). Jedes Gelschaumstück hat ungefähr 6 ug Protein in 30 ul absorbiert. Sterile Uhrmacherpinzetten wurden verwendet, um an einer Stelle, die sich einige Millimeter seitlich von dem primitiven Embryo befindet, einen kleinen Riss in die CAM zu machen. Der Großteil des RB-getränkten Cielschaumstückes wurde unter die CAM inseriert und die Eierschale wurde mit einem Stück Klebstreifen zugeklebt. Andere ähnlich alten Eier wurden parallel mit RB von der nicht verwandten, neuronal exprimierten Rezeptortyrosinkinase EHK-1 behandelt (Maisonpierre et al., Oncogene 8: 3277-3288 (1993)). Man ließ die Entwicklung für vier Tage fortschreiten und dann wurden die Embryos durch visuelle Prüfung untersucht. Die Embryos wurden entfernt, indem die Schalen in Schüsseln mit erwärmten PBS vorsichtig aufgebrochen wurden und der Embryo mit der umgebenden CAM vorsichtig abgeschnitten wurde. Von jeweils zwölf mit RB behandelten Eiern, hatten sich 6 mit TIE-2- RB und 5 mit EHK-1-RB behandelte Embryos über den Zustand weiterentwickelt, der bei Beginn des Experiments beobachtet wurde. Wie in Fig. 1A und 1B gezeigt, traten zwischen diesen entwickelten Embryos dramatische Unterschiede auf. Die mit EHK-1-RB behandelten schienen sich relativ normal entwickelt zu haben. Vier von fünf EHK-1-Embryos waren lebensfähig, beurteilt nach der Anwesenheit eines schlagenden Herzens. Darüber hinaus war die extra-embryonische Vaskulatur, die offensichtlich durch die Anwesenheit von roten Blutkörperchen sichtbar ist, reichlich vorhanden und erstreckte sich einige Zentimeter seitlich unter die CAM. Im Gegensatz dazu waren die mit TIE-2-RB behandelten deutlich verkümmert, in einem Bereich von 2-5 mm im Durchmesser im Vergleich zu mehr als 10 mm im Durchmesser bei EHK-1-RB-Embryos. Alle TIE-2-RB behandelten Embryos waren tot und ihren CAMs fehlten Blutgefäße. Die Fähigkeit von TIE-2-RB, vaskuläre Entwicklung im Huhn zu blockieren, demonstriert, dass der TIE-2 Ligand für die Entwicklung der Vaskulatur notwendig ist.

BEISPIEL 4- KONSTRUKTION DER TIE-2 LIGANDENKÖRPER

Ein Expressionskonstrukt wurde erzeugt, das ein sekretiertes Protein hervorbringen würde, das aus der gesamten codierenden Sequenz des menschlichen TIE-2 Liganden 1 (TL1) oder TIE-2 Ligand 2 (TL2) fusioniert an die konstante Region des menschlichen Immunglobulin gamma-1 (IgG1 Fc) besteht. Diese Fusionsproteine werden TIE-2- "Ligandenkörper" (TL1-Fc oder TL2-Fc) genannt. Der Fc-Anteil von TL1-Fc und von TL2- Fc wurde wie folgt hergestellt. Ein den Fc-Anteil des menschlichen IgG1 codierendes DNA- Fragment, das sich von der Gelenksregion bis zum Carboxy-Terminus des Proteins erstreckt, wurde aus menschlicher Plazenta-cDNA durch PCR mit Oligonucleotiden amplifiziert, die der veröffentlichten Sequenz des menschlichen IgG1 entsprechen; das resultierende DNA- Fragment wurde in einen Plasmidvektor cloniert. Geeignete DNA-Restriktionsfragmente von einem TL1 oder TL2 in voller Länge codierenden Plasmid und von dem menschlichen IgG1 Fc-Plasmid wurden an jede Seite eines kurzen PCR-stämmigen Fragmentes ligiert, das so konstruiert wurde, dass es TL1 und TL2 im Leserahmen mit den Protein-codierenden Sequenzen des menschlichen IgG1 Fc fusioniert.
Milligramm-Mengen an TL2-Fc wurden erhalten, indem das TL2-Fc-DNA-Fragment in den pVL1393-Baculovirus-Vektor cloniert und nachfolgend die SF-21AE-Insektenzelllinie von Spodoptera frugiperda infiziert wurde. In einer anderen Ausführungsform kann die Zelllinie SF-9 (ATCC Zugangs-Nr. CRL-1711) oder die Zelllinie BTI-TN-5b1-4 verwendet werden. TL2-Fc-codierende DNA wurde als ein EcoRI-NotI-Fragment in das Baculovirus- Transfer-Plasmid pVL1393 cloniert. Plasmid-DNA wurde durch das Mischen von 3 ug Plasmid-DNA mit 0,5 ug Baculo-Gold-DNA (Pharminigen) in die virale DNA rekombiniert, gefolgt durch eine Einbringung in Liposomen unter der Verwendung von 30 ug Lipofectin (GIBCO-BRL). DNA-Liposomen-Gemische wurden für 5 Stunden bei 27ºC zu SF-21AE- Zellen (2 · 10&sup6; Zellen/60 mm-Platte) in TMN-FH-Medium (modifiziertes Gräce's Insektenzellmedium, GIBCO-BRL) gegeben, gefolgt durch eine Inkubation für 5 Tage bei 27ºC in TMN-FH-Medium, das mit 5% fötalem Kälberserum supplementiert wurde. Das Gewebekulturmedium wurde zur Reinigung der Plaques der rekombinanten Viren geerntet, was unter Verwendung früher beschriebener Verfahren durchgeführt wurde (O'Reilly, D. R., L. K. Miller und V. A. Luckow, Baculovirus Expression Vectors - A Laboratory Manual. 1992, New York: W. H. Freeman), außer, dass die Agarose-Überschichtung 125 ug/ml X-Gal (5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-D-Galactopyranosid; GIBCO-BRL) enthielt. Nach 5 Tagen Inkubation bei 27ºC wurden nicht-rekombinante Plaques durch eine positive chromogene Reaktion des X-Gal-Substrats erkannt und ihre Positionen markiert. Rekombinante Plaques wurden dann durch die Zugabe einer zweiten Überschichtung sichtbar gemacht, die 100 ug/ml MTT enthielt (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid; Sigma). Vermutlich rekombinante Viren-Plaques wurden durch Pfropfenabsaugung isoliert und durch verschiedene Runden der Plaque-Isolierung gereinigt, um Homogenität sicherzustellen. Virus- Bestände wurden durch aufeinander folgendes Passagieren in geringer Vielzahl der Plaquegereinigten Viren erzeugt. Durch eine geringe Anzahl von Passagen erzeugte Bestände eines Virus-Clons (vTIE-2-Rezeptorkörper) wurden hergestellt.
SF-21AE-Zellen wurden in Serum-freien Medium (SF-900 II, Gibco BRL) gezüchtet, das 1 · antibiotische/antimycotische Lösung (Gibco BRL) und 25 mg/l Gentamycin (Gibco BRL) enthält. Pluronisches F-68 wurde als Surfactant zu einer Endkonzentration von 1 g/l zugegeben. Kulturen (4 l) wurden vor der Infektion für mindestens drei Tage in einem Bioreaktor (Artisan Cell Station System) angezogen. Zellen wurden bei 27ºC wachsen gelassen, mit einer Gaszufuhr bis 50% gelöstem Sauerstoff bei einer Gasflussgeschwindigkeit von 80 ml/min (Belüftung durch Belüftungsring). Umrühren wurde mittels eines Magnetrührers bei einer Geschwindigkeit von 100 U/min durchgeführt. Die Zellen wurden in der Mitte der logarithmischen Wachstumsphase geerntet (~2 · 10&sup6; Zellen/ml), durch Zentrifugation aufkonzentriert und mit 5 Plaque-bildenden Einheiten des vTIE-2- Rezeptorkörpers pro Zelle infiziert. Die Zellen und das Animpfmaterial wurden mit frischem Medium auf 400 ml gebracht und der Virus wurde für zwei Stunden bei 27ºC in einer Rundflasche adsorbiert. Die Kultur wurde dann in einem Endvolumen von 8 l in frischem Serum-freien Medium resuspendiert und die Zellen wurden in einem Bioreaktor unter den vorher beschriebenen Bedingungen inkubiert.
Das Kulturmedium von vTL2-Fc-infizierten SF21AE-Zellen wurde 72 Stunden nach der Infektion durch Zentrifugation (500 · g, 10 Minuten) gesammelt. Die Zellüberstände wurden mit NaOH auf einen pH-Wert von 8 gebracht. EDTA wurde bis zu einer Endkonzentration von 10 mM zugegeben und der pH-Wert des Überstandes wieder auf 8 eingestellt. Die Überstände wurden filtriert (0,45 um, Millipore) und auf eine Protein A-Säule geladen (Protein A-Sepharose 4 fast flow oder HiTrap Protein A, beide von Pharmacia). Die Säule wurde mit 0,5 M NaCl enthaltender PBS gewaschen bis die Absorption bei 280 nm auf die Nulllinie abgesunken war. Die Säule wurde mit PBS gewaschen und mit 0,5 M Essigsäure eluiert. Säulenfraktionen wurden unmittelbar neutralisiert, indem sie in Röhrchen eluiert wurden, die 1 M Tris pH9 enthielten. Die den TIE-2-Rezeptorkörper enthaltenden Spitzenfraktionen wurden vereinigt und gegen PBS dialysiert.

BEISPIEL 5- DAS TIE-REZEPTORILIGANDEN-SYSTEM IN DER ANGIOGENESE

Obwohl das TIE-2/TIE Liganden-System in der Biologie der Endothelzellen eine wichtige Rolle zu spielen scheint, wurde nicht gezeigt, dass es eine bedeutende, aktive Rolle in den frühen bis mittleren Stadien der Vaskularisierung spielt (z. B. Vermehrung und Wanderung von Angioblasten und Endothelzellen, Röhrenbildung und andere früh stattfindende Ereignisse bei der vaskulären Strukturierung). Im Gegensatz zu den Rezeptoren und Faktoren, von denen bekannt ist, dass sie diese Aspekte der vaskulären Entwicklung vermitteln, lässt das zeitlich späte Expressionsmuster von TIE-2 und TL1 im Verlauf der Vaskularisierung darauf schließen, dass dieses System eine unterschiedliche Rolle in den späteren Stadien der vaskulären Entwicklung spielt, einschließlich der strukturellen und funktionellen Differenzierung und Stabilisierung neuer Blutgefäße. Das Exprssionsmuster von TIE-2/TL1 ist auch in Übereinstimmung mit einer ständigen Rolle innerhalb der Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität und/oder von physiologischen Merkmalen einer bestehenden Vaskulatur.
TIE Ligand-2 (TL2) scheint ein kompetetiver Inhibitor von TL1 zu sein. Die räumlichen und zeitlichen Merkmale der TL2-Expression legen nahe, dass dieses einzelne, inhibitorische Molekül viele, vom Zusammenhang abhängige Rollen spielen kann, die für eine günstige, vaskuläre Entwicklung oder Restrukturierung erforderlich sind (z. B. Destabilisierung/De-Differenzierung von reifen Endothelzellen, was die Erzeugung neuer Gefäße aus vorhandener Vaskulatur erlaubt, Inhibition der Erzeugung ungeeigneter Blutgefäße und Zurückentwicklung/Rückbildung reifer Blutgefäße). Fig. 2 ist eine schematische Darstellung der hypothetischen Rolle der TIE-2/TIE Liganden in der Angiogenese. In dieser Figur ist TL1 symbolisiert durch (·), TL2 durch (*), TIE-2 durch (T), VEGF durch ([]) und flk-1 (ein VEGF-Rezeptor) durch (Y).

BEISPIEL 6- KONSTRUKTION UND HERSTELLUNG DER CYS&supmin;-TL1- MUTANTE

Die TIE-2 Liganden besitzen zwei große strukturelle Domänen, eine beschrieben als "Fibrinogen-ähnliche" Domäne, die in etwa das C-terminale Drittel des Proteins ausmacht, und die andere, eine "coiled coil"-Domäne, die in etwa die N-terminalen zwei Drittel enthält. Obwohl die TIE-2 Liganden, bezeichnet als TL1 und TL2, ähnliche strukturelle Homologie besitzen, zeigen sie unterschiedliche physikalische und biologische Eigenschaften. Unter nicht-reduzierenden elektrophoretischen Bedingungen zeigen beide Proteine kovalent gebundene, multimere Strukturen, wobei TL1 in erster Linie als Trimer und TL2 in erster Linie als Dimer vorkommt. Fig. 3 ist eine schematische Darstellung, wie die TIE Liganden bei der Ausbildung von Multimeren interagieren könnten. Hinsichtlich ihrer biologischen Aktivität ist von TL1 gezeigt worden, dass es ein Agonist des TIE-2-Rezeptors ist, was durch die Induktion der Phosphorylierung in TIE-2-exprimierenden Zellen demonstriert wurde. Auf der anderen Seite scheint TL2 ein kompetetiver Inhibitor von In zu sein. Untersuchungen zur Klärung, welche Faktoren zu den verschiedenen physikalischen und biologischen Eigenschaften der zwei Moleküle beitragen könnten, erbrachten die Anwesenheit eines Cysteinrestes (CYS265), der in TL1 der Fibrinogen-ähnlichen Domäne vorangeht, aber in TL2 nicht vorhanden ist. Dieser CYS265-Rest in TL1 ist codiert durch TGC und befindet sich bei den Nucleotiden 1102-1104 an der ungefähren Verbindung zwischen der "coiled coil"- und der Fibrinogen-ähnlichen Domäne. Da Cysteinreste im Allgemeinen an der Ausbildung von Disulfidbrücken beteiligt sind, deren Anwesenheit sowohl die Tertiärstruktur, als auch die biologischen Eigenschaften eines Moleküls beeinflussen kann, wurde geglaubt, dass die Anwesenheit von CYS265 in TL1 vielleicht zumindest teilweise für die unterschiedlichen Eigenschaften der zwei Moleküle verantwortlich sein könnte. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde ein Expressionsplasmid konstruiert, das eine Mutation in TL1 enthielt, durch die das CYS gegen eine Aminosäure ausgetauscht wurde, die keine Disulfidbrücken ausbildet. Zusätzlich zu dieser TL1/CYS&supmin;-Mutante wurde ein zweites Expressionsplasmid konstruiert, in dem die entsprechende Position in TL2 mutiert wurde, sodass dieser Rest jetzt ein Cystein war. Sowohl das nicht-mutierte, als auch das mutierte Expressionsplasmid von TL1 und TL2 wurden vorübergehend in COS-Zellen transfiziert. Die die rekombinanten Proteine enthaltenden Zellüberstände wurden geerntet und die Proben wurden sowohl einer reduzierenden, als auch einer nicht-reduzierenden SDS/PAGE-Elektrophorese und anschließendem Western blotting unterzogen. Western-blots von sowohl nicht-mutierten, als auch von mutierten TL1- und TL2-Proteinen zeigten, dass sich die TL1/CYS&supmin;-Mutante eher TL2-ähnlich verhält, dadurch dass sie als ein Dimer läuft, und dass sich die TL2/CYS&spplus;- Mutante eher TL1-ähnlich verhält, dadurch dass sie fähig ist, ein Trimer ebenso wie Multimere höherer Ordnung zu erzeugen. Wenn die zwei mutierten Proteine hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet wurden, Phosphorylierung in TIE-2-exprimierenden Zellen zu induzieren, konnte interessanterweise die TL1/CYS&supmin;-Mutante den TIE-2-Rezeptor aktivieren, wohingegen die TL2/CYS&spplus;-Mutante keine aktivierende Aktivität hinzugewann.

BEISPIEL 7- KONSTRUKTION UND CHARAKTERISIERUNG VON MIR IN DER FIBRINOGEN-ÄHNLICHEN DOMÄNE VERÄNDERTEN MUTANTEN

Um herauszufinden, ob die Fibrinogen-ähnliche Domäne (F-Domäne) der TIE-2 Liganden die TIE-2-aktivierende Aktivität enthält, wurden Expressionsplasmide konstruiert, in denen die "coiled coil"-Domäne deletiert war und nur der die F-Domäne codierende Anteil der DNA-Sequenz übrig blieb (etwa beginnend bei Nucleotid 1159, Aminosäure ARG284). Dieses mutierte Konstrukt wurde vorübergehend in COS-Zellen transfiziert. Der das rekombinante Protein enthaltende Überstand wurde geerntet. Die TL1/F-Domänen-Mutante wurde auf ihre Fähigkeit geprüft, den TIE-2-Rezeptor zu binden. Die Ergebnisse zeigten, dass die TL1/F-Domänen-Mutante als Monomer TIE-2 nicht mit einer detektierbaren Menge binden konnte. Wenn jedoch das TL1F-Domänen-Monomer durch myc markiert und darauf folgend mit einem Antikörper gegen die myc-Markierung vernetzt wurde, zeigte es eine detektierbare Bindung von TIE-2. Jedoch war die Antikörpervernetzte TL1/F-Domänen- Mutante nicht fähig, Phosphorylierung in einer TIE-2-exprimierenden Zelllinie zu induzieren. Fig. 3 zeigt eine schematische Darstellung des F-Domänenkonstrukts und seine Bindungsfähigkeit mit und ohne Vernetzung durch Antikörper.

BEISPIEL 8- EIN REZEPTORKÖRPER-BINDUNGSTEST UND EIN LIGANDEN- BINDUNGS- UND KOMPETITIONSTEST

Ein quantitativer, Zell-freier Bindungstest in zwei abwechselnden Formen ist entwickelt worden zur Detektion von entweder der Rezeptorkörperbindung oder von der Ligandenbindung und Kompetition. In der Rezeptorbindung detektierenden Version des Tests wird eine ELISA-Platte mit TIE-2 Liganden (gereinigt oder partiell gereinigt; entweder TL1 oder TL2) beschichtet. Rezeptorkörper wird dann in verschiedenen Konzentrationen zugegeben, der an den immobilisierten Liganden in einer mengenabhängigen Art und Weise bindet. Nach zwei Stunden wird der Überschuss an Rezeptorkörper weggewaschen, dann wird die an die Platte gebundene Menge ermittelt durch die Verwendung eines spezifischen antimenschlichen Fc-Antikörper, der mit alkalischer Phosphatase markiert ist. der Überschuss an Reporter-Antikörper wird weggewaschen, dann wird die AP-Reaktion unter Verwendung eines gefärbten Substrates entwickelt. Der Test wird unter Verwendung eines Spektrophotometers quantifiziert. Fig. 4 zeigt eine typische TIE-2-IgG-Bindungskurve. Dieser Test ist verwendet worden, um die Integrität von TIE-2-IgG nach der Injektion in Ratten und Mäuse zu beurteilen. Der Test kann in dieser Form ebenfalls als Liganden- Kompetitionstest verwendet werden, in dem gereinigte oder partiell gereinigte TIE Liganden mit dem immobilisierten Ligand um den Rezeptorkörper kompetetieren. In der Ligandenbindung- und Kompetitions-Version des Bindungstests wird die ELISA-Platte mit TIE-2-Ectodomäne beschichtet. Die Fc-markierten Fibrinogen-ähnlichen Domänenftagmente der TIE Liganden (TL1-fFc und TL2-fFc) binden dann an die Ectodomäne und können unter Verwendung des gleichen, vorstehend beschriebenen, antimenschlichen Fc-Antikörpers detektiert werden. Fig. 5 zeigt ein Beispiel einer TL1-fFc-Bindung an die TIE-2- Ectodomäne. Diese Version des Tests kann ebenfalls verwendet werden, um die Mengen an TL1-fFc in Serum oder anderen Proben zu quantifizieren. Wenn ein unmarkierter Ligand (wiederum entweder gereinigt oder ungereinigt) zur gleichen Zeit wir TL1-fFc zugegeben wird, dann ist eine Kompetition zwischen markiertem Ligandenfragment und Ligand in voller Länge verursacht. Der Ligand in voller Länge kann das Fc-markierte Fragment ersetzen und eine Kompetitionskurve wird generiert.

BEISPIEL 9- EA.hy926-ZELLLLNIE KANN ALS REPORTERZELLLINIE FÜR TIE LIGAND-AKTIVITÄT VERWENDET WERDEN

EA.hy926 ist eine hybride Zelllinie, die durch die Fusion von HUVEC mit der von menschlichem Lungenkarzinom stammenden Linie A549 geschaffen wurde [Edgell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3734-3737 (1983)]. Es wurde gefunden, dass EA.hy926-Zellen bedeutende Mengen an TIE-2-Rezeptorprotein mit niedrigen basalen Phosphotyrosin-Mengen exprimieren. Die Dichte, bei der EA.hy926-Zellen vor ihrem Gebrauch in Rezeptortests passagiert werden, ebenso wie ihr Grad an Dichte zum Zeitpunkt des Tests kann die Menge an TIE-2-Rezeptor und die relative Induzierbarkeit als Antwort auf die Behandlung mit Ligand beeinflussen. Durch die Übernahme des folgenden Schemas zum Wachstum dieser Zellen kann die EA.hy926-Zelllinie als verlässliches System zum Testen von TIE-2 Liganden-Aktivitäten verwendet werden.
EA.hy926-Zellen werden bei 1,5 · 10&sup6; Zellen in T-75-Flaschen (Falconware) ausgesät und jeden Tag erneut mit Hoch-Glucose-Dulbecco's MEM, 10% fötalem Rinderserum, L- Glutamin, Penicillin-Streptomycin und 1 · Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin (HAT, GibcoßRL) gefüttert. Nach einem Wachstum von drei oder vier Tagen werden die Zellen ein weiteres mal bei 1,5 · 10&sup6; Zellen pro T-75-Flasche passagiert und für weitere drei oder vier Tage gezüchtet. Für Phosphorylierungstests werden die Zellen, die wie vorstehend beschrieben hergestellt wurden, durch den Austausch des Kulturmediums gegen Hoch- Glucose-DMEM und einer Inkubation für 2-3 Stunden bei 37ºC Serum-gehungert. Dieses Medium wurde aus der Flasche gesaugt und Proben von Medium oder gereinigtem Ligand wurden der Flasche in einem Gesamtvolumen von 1,5 ml zugegeben, gefolgt von einer Inkubation für 5 Minuten bei 37ºC. Die Flaschen wurden aus dem Inkubator genommen und auf ein Eisbett gestellt. Das Medium wurde entfernt und durch 1,25 ml Lyse-Puffer ersetzt, enthaltend 1% Nonidet P-40, 0,5% Natriumoxycholat, 0,1% SDS in 20 mM Tris, pH 7,6, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 1 mM Natriumorthovanadat, 5 mM Benzamidin und 1 mM EDTA, das die Protease-Inhibitoren PMSF, Aprotinin und Leupeptin enthält. Nach 10 Minuten auf Eis, um die Auflösung der Membran zu erlauben, wurden die Platten abgekratzt und die Zelllysate wurden durch Mikrozentrifugation bei höchster Geschwindigkeit für 10 Minuten bei 4ºC geklärt. TIE-2-Rezeptor wurde aus dem geklärten Überstand immunpräzipitiert durch die Inkubation in der Kälte mit einem anti-TIE-2 polclonalen Antiserum und Protein G- konjugierten Sepharose-Kügelchen. Die Kügelchen wurden drei mal mit kaltem Zelllyse- Puffer gewaschen und 5 Minuten in Laemmli-Probenpuffer gekocht, welche dann auf 7,5%- ige SDS-Polyacrylamidgele geladen wurden. Aufgetrennte Proteine wurden auf eine PVDF (Lamblia-P)-Membran elektrotransferiert und dann einer Western blot-Analyse unter Verwendung von anti-Phosphotyrosin-Antikörpern und ECL-Reagenz unterzogen. Der nachfolgende Vergleich der Gesamtmengen des TJE-2-Proteins auf den gleichen blots wurde durchgeführt, indem die anti-Phosphotyrosin-Antikörper abgewaschen wurden und die blots erneut mit einem für die Ectodomäne von TIE-2 spezifischen, polyclonalen Antiserum inkubiert wurden.

BEISPIEL 10- ISOLIERUNG UND SEQUENZIERUNG EINES SÄUGER-TIE LIGAND-3 CODIERENDEN VOLLLÄNGEN-cDNA-CLONS

TIE Ligand-3 (TL3) wurde aus einer Maus-BAC-Genbank (Research Genetics) cloniert, indem Genbank-Duplikate entweder mit Maus-TL1- oder Maus-TL2-Sonden, die der gesamten codierenden Sequenz dieser Gene entsprachen, hybridisiert wurden. Jede Kopie der Genbank wurde unter der Verwendung von Phosphatpuffer über Nacht bei 55ºC hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Filter mit 2 · SSC, 0,1% SDS bei 60ºC gewaschen und nachfolgend einem Röntgenfilm ausgesetzt. Starke Hybridisierungssignale, die Maus-TL1 und Maus-TL2 entsprachen, wurden identifiziert. Darüber hinaus wurden Signale identifiziert, die schwach mit sowohl Maus-TL1, als auch mit Maus-TL2 hybridisierten. Diesen Clonen entsprechende DNA wurde gereinigt, dann mit Restriktionsenzymen gespalten und zwei Fragmente, die mit den ursprünglichen Sonden hybridisierten, wurden in ein bakterielles Plasmid subcloniert und sequenziert. Die Sequenz der Fragmente enthielt zwei Exone mit Homologie zu Maus-TL1 und Maus-TL2. Für diese Sequenzen spezifische Primer wurden als PCR-Primer verwendet, um Gewebe zu identifizieren, die TL3-entsprechende Transkripte enthalten. Eine TL3-entsprechende PCR-Bande wurde in einer Mausuterus-cDNA-Genbank in lambda gt-11 identifiziert (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA).
Plaques wurden mit einer Dichte von 1,25 · 10&sup6;/20 · 20 cm-Platte plattiert und Filterkopien nach den folgenden Standardprozeduren genommen (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Seite 8.46, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Filter-Duplikate wurden bei "normaler" Stringenz (2 · SSC, 65ºC) mit einer 200 bp langen, radioaktiven PCR-Sonde überprüft, die gegen die Maus-TL3- Sequenz hergestellt wurde. Die Hybridisierung fand bei 65ºC in einer Lösung statt, die 0,5 mg/ml Lachssperma-DNA enthielt. Die Filter wurden in 2 · SSC bei 65ºC gewaschen und für 6 Stunden einem Röntgenfilm ausgesetzt. Zwei positive Clone wurden isoliert, die in beiden Fällen hybridisierten. Eine Spaltung der von diesen Clonen erhaltenen Phagen-DNA mit EcoRI wies auf zwei unabhängige Clone mit Insertionsgrößen von ungefähr 1,2 kb und ungefähr 2,2 kb hin. Die 2,2 kb-EcoRI-Insertion wurde in die EcoRI-Stelle von pBLUESCRIPT KS (Stratagene) subcloniert. Eine Sequenzanalyse zeigte, dass dem längeren Clon ein initiierendes Methionin und ein Signalpeptid fehlte, dass er aber andererseits eine zu sowohl Maus-TL1, als auch zu Maus-TL2 homologe Sonde codierte.
Zwei TL3-spezifische PCR-Prirner wurden dann wie folgt synthetisiert:
US2: cctctgggctcgccagtttgttagg
US1: ccagctggcagatatcagg
Die folgenden PCR-Reaktionen wurden unter der Verwendung von Expressions- Genbänken durchgeführt, die von den Maus-Zelllinien C2C12ras und MG87 stammten. In der primären PCR-Reaktion wurde der spezifische Primer US2 zusammen mit Vektorspezifischen Oligonucleotiden verwendet, um die Amplifikation in jeder Orientierung zu ermöglichen. Die PCR fand in einem Gesamtvolumen von 100 ul statt, mit 35 Zyklen bei 94ºC für 1 min. 42ºC oder 48ºC für 1 min. 72ºC für 1 min. Die sekundäre PCR- Reaktionschloß den zweiten spezifischen Primer US1, der in dem primären PCR-Produkt enthalten ist, ein, zusammen mit den gleichen Vektor-Oligonucleotiden. Die sekundären Reaktionen umfassten 30 Zyklen, unter Verwendung der gleichen Temperaturen und Zeiten wie vorher. Die PCR-Produkte wurden aus dem Gel isoliert und einer Sequenzanalyse unterzogen. Auf der Basis der Sequenzen, die von insgesamt vier unabhängigen PCR- Reaktionen mit zwei unterschiedlichen cDNA-Genbänken erhalten wurden, wurde das 5'- Ende der TL3-Sequenz abgeleitet. Northern-Analysen zeigten mäßige bis niedrige Mengen an Maus-TL3-Transkript in der Maus-Plazenta. Die Expression von Maus-TL3 bestand aus einem Transkript von ungefähr 3 kb. Die TL3-codierende Sequenz in voller Länge ist in Fig. 6A-6B dargelegt.
Die Maus-TL3-Sequenz kann dann verwendet werden, um einen menschlichen Clon zu erhalten, der die codierende Sequenz des menschlichen Gegenstücks enthält, indem entweder eine menschliche, genomische oder eine cDNA-Genbank mit einer Maus-TL3- entsprechenden Sonde hybridisiert wird, wie schon früher beschrieben, zum Beispiel in Beispiel 8 in der internationalen Offenlegung WO 96/31598, offengelegt am 10. Oktober 1996.

BEISPIEL 11- ISOLIERUNG EINES GENOMISCHEN VOLLLÄNGEN- CLONS, DER MENSCHLICHEN TIE LIGAND-4 CODIERT

TIE Ligand-4 (TL4) wurde aus einer genomischen Maus-BAC-Genbank cloniert (BAC HUMAN (II), Genome Systems Inc.), indem Genbank-Duplikate entweder mit einer menschlichen, radioaktiven TL1-Sonde hybridisiert wurden, die der gesamten Fibrinogen- codierenden Sequenz von TL1 entsprach (Nucleotide 1153 bis 1806) oder mit einer radioaktiven Maus-TL3-Sonde, die einem Segment von 186 Nucleotiden aus der Fibrinogen- Region von Maus-TL3 entsprach (Nucleotide 1307 bis 1492 in Fig. 6A-6B). Jede Sonde wurde mittels PCR unter Verwendung exakter Oligonucleotide und Standard-PCR- Bedingungen markiert, außer, dass dCTP durch P³²dCTP ersetzt wurde. Das PCR-Gemisch wurde dann über eine Gelfiltrationssäule gegeben, um die Sonde von freiem P³²dCTP zu trennen. Jede Kopie der Genbank wurde unter der Verwendung von Standard- Hybridisierungsbedingungen in Phosphatpuffer bei 55ºC über Nacht mit der radioaktiven Sonde hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Filter mit 2 · SSC, 0,1% SDS bei 55ºC gewaschen und nachfolgend einem Röntgenfilm ausgesetzt. Starke Hybridisierungssignale, die menschlichem TL1 entsprachen, wurden identifiziert. Darüber hinaus wurden Signale identifiziert, die schwach sowohl mit menschlichem TL1, als auch mit Maus-TL3 hybridisierten. Diesen Clonen entsprechende DNA wurde mit Hilfe von Standardprozeduren gereinigt, dann mit Restriktionsenzymen gespalten und ein Fragment, das mit den ursprünglichen Sonden hybridisierte, wurden in ein bakterielles Plasmid subcloniert und sequenziert. Die Sequenz der Fragmente enthielt ein Exon mit Homologie zu menschlichem TL1 und Maus-TL3 und anderen Mitgliedern der TIE Ligandenfamilie. Für diese Sequenzen spezifische Primer können als PCR-Primer verwendet werden, um Gewebe zu identifizieren, die TL4-entsprechende Transkripte enthalten.
Die vollständige Sequenz des menschlichen TL4 kann erhalten werden, indem der in den hinterlegten, bakteriellen Zellen enthaltene BAC-Clon sequenziert wird. Exone können durch die Homologie zu bekannten Mitgliedern der TIE Ligandenfamilie, wie TL1, TL2 und TL3, identifiziert werden. Die vollständige, codierende Sequenz von TL4 kann dann bestimmt werden, indem die Exone des genomischen TL4-Clons zusammengespleißt werden, der seinerseits zur Produktion des TL4-Porteins verwendet werden kann. In einer anderen Ausführungsform können die Exone als Sonden verwendet werden, um einen VolllängencDNA-Clon zu erhalten, der dann zur Produktion des TL4-Proteins verwendet werden kann. Exone können auch aus der Sequenz des BAC-Clons durch die Homologie zu Proteindomänen identifiziert werden, wie zum Beispiel Fibrinogen-Domänen, "coiled coil"- Domänen oder Proteinsignalen wie Signalpeptidsequenzen. Fehlende Exone des BAC-Clons können durch die Identifizierung aufeinander folgender BAC-Clone erhalten werden, zum Beispiel indem die Enden des hinterlegten BAC-Clons als Sonden verwendet werden, um eine menschliche, genomische Genbank wie die hier verwendete zu durchmustern, indem die in dem BAC-Clon enthaltene Exonsequenz verwendet wird, um eine cDNA-Genbank zu durchmustern, oder indem eine 5'- oder 3'-RACE-Prozedur durchgeführt wird, unter Verwendung von auf die TL4-Exonsequenzen beruhenden Oligonucleotidprimern.

Identifizierung zusätzlicher Mitlieder der TIE Ligandenfamilie

Die neue TIE Ligand-4-Sequenz kann bei einer rationalen Suche nach weiteren Mitgliedern der TIE Ligandenfamilie unter Verwendung eines Ansatzes verwendet werden, der den Vorteil des Vorhandenseins von konservierten Segmenten mit starker Homologie zwischen den bekannten Familienmitgliedern nutzt. Zum Beispiel zeigt ein Vergleich der Aminosäuresequenzen der TIE Liganden einige Bereiche konservierter Sequenz (siehe unterstrichene Bereiche in Fig. 7). Degenerierte Oligonucleotide, die im wesentlichen auf diesen Bereiche zusammen mit entweder vorher bekannten oder neuen Homologiesegmenten von TIE Liganden beruhen, können verwendet werden, um neue TIE Liganden zu identifizieren.
Die hochkonservierten Bereiche zwischen TL1, TL2 und TL3 können für das Design degenerierter Oligonucleotidprimer für den Einsatz in PCR-Reaktionen mit cDNAs verwendet werden. cDNA-Matrizen können durch reverse Transkription von Gewebe-RNAs unter der Verwendung von oligo-d(T)- oder anderen geeigneten Primern generiert werden. Aliquots der PCR-Reaktion können dann einer Elektrophorese auf einem Agarosegel unterzogen werden. Die resultierenden, amplifizierten DNA-Fragmente können durch Insertion in Plasmide cloniert, sequenziert und die DNA-Sequenzen mit denen aller bekannten TIE Liganden verglichen werden.
Nach Größe ausgewählte, amplifizierte DNA-Fragmente aus diesen PCR-Reaktionen können in Plasmide cloniert, durch Elektroporation in E. coli eingebracht und die Transformanten auf selektivem Agar ausplattiert werden. Bakterielle Kolonien der PCR- Transformation können durch das Sequenzieren der Plasmid-DNAs analysiert werden, die durch Standard-Plasmid-Prozeduren gereinigt wurden.
Clonierte Fragmente, die ein Segment eines neuen TIE Liganden enthalten, können als Hybridisierungssonden verwendet werden, um Volllängen-cDNA-Clone aus einer cDNA- Genbank zu erhalten. Zum Beispiel kann die genomische Sequenz des menschlichen TL4 verwendet werden, um einen menschlichen cDNA-Clon zu erhalten, der die vollständige, codierende Sequenz des menschlichen TL4 enthält, indem eine menschliche cDNA-Genbank mit einer dem menschlichen TL4 entsprechenden Sonde hybridisiert wird, wie es bereits vorher beschrieben wurde.

BEISPIEL 12- Clonierung der vollständig codierenden Sequenz von hTL4

Sowohl die 5'-, als auch die 3'-codierende Sequenz von dem genomischen, menschlichen TL4-Clon, der den menschlichen TIE Ligande 4 codiert (hTL-4 ATCC Zugangs-Nr. 98095), wurde erhalten durch Spaltung mit Restriktionsenzymen, Southern blotting und Hybridisierung des hTL-4-Clons mit codierenden Sequenzen von Maus-TL3, gefolgt durch Subclonierung und Sequenzierung der hybridisierenden Fragmente. Die den Nterminalen und C-terminalen Aminosäuren entsprechenden, codierenden Sequenzen von hTL4 wurden für das Design von PCR-Primern (nachstehend gezeigt) verwendet, die ihrerseits für die PCR-Amplifikation von TL4 aus menschlicher Eierstock-cDNA verwendet wurden. Eine PCR-Bande wurde durch DNA-Sequenzierung mit Hilfe des ABI 373A-DNA- Sequenzierers und des Taq-Didesoxy-Terminationszyklus-Sequenzierkits (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) als die dem menschlichen TL4 entsprechende identifiziert. Die PCR-Bande wurde anschließend in den Vektor pCR-script subcloniert und verschiedene Plasmid-Clone wurde durch Sequenzierung analysiert. Die vollständige, das menschliche TL4 codierende Sequenz wurde dann zusammengesetzt und ist in Fig. 8A-8C gezeigt. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist das Nucleotid an Position 569 von A in G geändert, was zu einem Aminosäureaustausch von Q nach R führt.
Die wie vorstehend beschrieben verwendeten PCR-Primer wurden wie folgt konstuiert:
hTL4atg 5'-gcatgctatctcgagccaccATGCTCTCCCAGCTAGCCATGCTGCAG 3'
hTL4not 5'-gtgtcgacgcggccgctctagatcagacTTAGATGTCCAAAGGCCGTATCATCAT-3'
Kleinbuchstaben stehen für "Rand"-Sequenzen, die den Primern hinzugefügt wurden, um das Clonieren der amplifizierte PCR-Fragmente zu erleichtern.

HINTERLEGUNGEN

Die folgenden Stämme sind in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag in der amerikanischen Typenkultursammlung, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 hinterlegt worden. Der rekombinante Autographa californica-Baculovirus, der den TIE-2- Rezeptorkörper codiert, ist am 7. Oktober 1994 in der ATCC hinterlegt und als "vTIE-2 receptorbody" unter der ATCC-Zugangs-Nr. VR2484 bezeichnet worden. Der E. coli-Stamm DH10B, der das Plasmid pBeLoBac11 mit einer menschlichen TL4-Geninsertion enthält, die den menschlichen TIE Liganden-4 codiert, wurde am 2. Juli 1996 in der ATCC hinterlegt und als "hTL-4" unter der ATCC-Zugangs-Nr. 98095 bezeichnet.

Claims

1. Isoliertes und gereinigtes Nucleinsäuremolekül, umfassend eine Nucleotidsequenz, die menschlichen TIE Liganden-4 codiert, wobei die Nucleotidsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

(a) der Nucleotidsequenz, die den codierenden Bereich des menschlichen TIE Liganden-4 umfasst, wie in Fig. 8A-8C dargelegt oder enthalten in dem hTL-4 benannten Vektor, der als ATCC 98095 hinterlegt ist;

(b) der Nucleotidsequenz, die den codierenden Bereich der Fibrinogen- ähnlichen Domäne des menschlichen TIE Liganden-4 umfasst, wie in Fig. 8A-8C dargelegt oder enthalten in dem hTL-4 benannten Vektor, der als ATCC 98095 hinterlegt ist; und

(c) einer Nucleotidsequenz, die sich auf Grund der Degeneriertheit des genetischen Codes von der Nucleotidsequenz von (a) oder (b) unterscheidet, und die einen TIE-2 Liganden codiert, der den TIE-2 Rezeptor bindet.

2. Vektor, umfassend ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1.

3. Vektor nach Anspruch 2, wobei das Nucleinsäuremolekül funktionell mit einer Expressionskontrollsequenz verknüpft ist, die dessen Expression in einer Wirtszelle regeln kann.

4. Vektor nach Anspruch 3, der ein Plasmid ist.

5. Isolierter TIE Ligand-4 mit der Aminosäuresequenz wie in Fig. 8A-8C dargelegt, oder ein Fragment oder Derivat davon, umfassend die Aminosäuresequenz der Fibrinogen-ähnlichen Domäne.

6. Isolierter TIE Ligand-4, der von einem Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 codiert wird.

7. Transformierte Wirtszelle, die einen Vektor nach Anspruch 2, 3 oder 4 umfasst.

8. Zelle nach Anspruch 7, die eine Bakterien-, Hefe-, Insekten- oder Säugerzelle ist.

9. Zelle nach Anspruch 7 oder 8, ferner umfassend eine Nucleinsäure, die den TIE-Rezeptor codiert.

10. Verfahren zur Herstellung von TIE Ligand-4, umfassend das Züchten von Zellen nach Anspruch 7 unter Bedingungen, die die Herstellung des TIE Liganden-4 erlauben, und Gewinnen des so hergestellten TIE Liganden-4.

11. Antikörper, der spezifisch den Liganden nach Anspruch 5 oder 6 bindet.

12. Antikörper nach Anspruch 11, der ein monoclonaler Antikörper ist.

13. Konjugat, umfassend den Liganden nach Anspruch 5 oder 6 konjugiert mit einem cytotoxischen Agens.

14. Konjugat nach Anspruch 13, wobei das cytotoxische Agens ein Radioisotop oder Toxin ist.

15. Arzneimittel, umfassend den Liganden nach Anspruch 5 oder 6 und eine pharmazeutisch verträglichen Träger.

16. Arzneimittel, umfassend einen Antikörper nach Anspruch 11 oder 12 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

17. Arzneimittel, umfassend ein Konjugat nach Anspruch 13 oder 14 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

18. Ligand nach Anspruch 5 oder 6 zur Verwendung in einem Diagnoseverfahren oder Therapieverfahren, das an einem Menschen oder Tier ausgeführt wird.

19. Ligand nach Anspruch 5 oder 6 zur Verwendung in einem Verfahren zur Induktion der Revaskularisation oder Hämatopoese in einem Menschen oder Tier.

20. Antikörper nach Anspruch 11 oder 12 zur Verwendung in einem Diagnoseverfahren oder Therapieverfahren, das an einem Menschen oder Tier ausgeführt wird.

21. Antikörper nach Anspruch 11 oder 12 zur Verwendung in einem Verfahren zur Hemmung der Revaskularisation oder Hämatopoese in einem Menschen oder Tier.

22. Verwendung des Liganden nach Anspruch 5 oder 6 für die Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung in einem Verfahren zur Induktion der Revaskularisation oder Hämatopoese in einem Menschen oder Tier.

23. Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 11 oder 12 für die Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung in einem Verfahren zur Hemmung der Revaskularisation oder Hämatopoese in einem Menschen oder Tier.