DE69717207T2

DE69717207T2 - Mikrobielle Herstellung von Vitamin B12 sowie Herstellung und Verwendung von Zusammensetzungen die Vitamin B12 in hohen Konzentrationen enthalten

Info

Publication number: DE69717207T2
Application number: DE69717207T
Authority: DE
Inventors: Hendrik Louis Bijl
Original assignee: DSM NV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1996-08-12
Filing date: 1997-08-12
Publication date: 2003-07-24
Anticipated expiration: 2017-08-13
Also published as: DE69717207D1; PL331514A1; AU4206597A; WO1998006868A2; US5955321A; US6187761B1; DK0824152T3; AR022986A1; NO990653D0; NO990653L; HUP9903580A2; PT824152E; BR9710884A; EP0824152A3; EP0824152B1; NZ333821A; NL1006764A1; EP0824152A2; HUP9903580A3; KR20000029904A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Zusammensetzungen mit einem Gehalt an natürlichem Vitamin B12.

Hintergrund der Erfindung

Vitamin B12 ist ein wichtiges Vitamin für Mensch und Tier. Es wird zum Behandeln von perniziöser Anämie und peripherer Neuritis eingesetzt sowie als Diätzusatz verwendet. Vitamin B12 ist auch ein wichtiger Zusatz für Tierfutter als Wachstumsverbesserer.
Der Ausdruck "Vitamin B12" wird benutzt, um Verbindungen der Cobaltcorrinoidfamilie, insbesondere jene der Cobalamingruppe, zu beschreiben. Die am meisten verwendete Verbindung dieser Gruppe ist das Cyanocobalamin, und der Ausdruck "Vitamin B12" als solcher wird manchmal für Cyanocobalamin gebraucht. In dieser Beschreibung soll der Ausdruck "Vitamin B12" in seiner breiten Bedeutung verstanden werden, so daß er alle Cobaltcorrinoide der Cobalamingruppe beinhaltet, zu der insbesondere Cyanocobalamin, Hydroxocobalamin, Methylcobalamin und 5'-Desoxyadenosylcobalamin gehören, gekennzeichnet durch eine Cyan-, Hydroxyl-, Methyl- bzw. 5'-Desoxyadenosylgruppe. Die Verbindungen Methylcobalamin und 5'-Desoxyadenosylcobalamin sind in isolierter Form als lichtempfindlich bekannt und werden in wässriger Lösung leicht in Hydroxocobalamin überführt. Aus diesem Grund bestehen fast alle handelsüblichen Vitamin-B12-Präparate aus dem stabilen Cyanocobalamin, das als solches nicht die chemische Form ist, in der Vitamin B12 in der Natur gefunden wird. In der vorliegenden Beschreibung ist der Ausdruck "natürliches Vitamin B12" so definiert, daß er alle in der Natur vorkommenden chemischen Formen von Vitamin B12 umfaßt, so daß Cyanocobalamin ausgeschlossen ist.
Mehrere Mikroorganismen sind in der Lage, durch Fermentation unter speziellen Züchtungsbedingungen Vitamin B12 zu bilden, wie von Fukui et al. (Asahi Garasu Kogyo Gijutsu Shoreikai Kenkyu Hokoku, 1974, Band 24, Seiten 231 bis 241), Tanaka et al. (J. Ferment. Technol., 1974, Band 52, Seiten 921 bis 924), Kvasnikov et al. (Microbiol. Zh. (Kiev), 1975, Band 37, Seiten 573 bis 579), Morikawa und. Kamikubo (J. Ferment. Technol., 1969, Band 47, Seiten 470 bis 477), und Fujii et al. (Hakko Kogaku Zasshi, 1966, Band 44, Seiten 185 bis 191) beschrieben wurde.
Vitamin B12 wird industriell durch mikrobiologische Fermentation hergestellt, wobei fast ausschließlich die Spezies Pseudomonas denitrificans und Propionibacterium eingesetzt werden, die in dem Japanischen Patent 03244376 beschrieben sind, und dann das natürliche Vitamin B12 in die Cyanocobalaminform umgewandelt wird, und zwar durch chemische Verfahren einschließlich Cyanidisierung, gefolgt von Extraktions- und Reinigungsstufen unter Einsatz von organischen Lösungsmitteln (wie in einem Überblick dargestellt ist durch Spalla et al., 1989, "Microbial production of Vitamin B12", Herausgeber E. J. Vandamme, Elsevier, London, New York, Seiten 257 bis 284; Schliwa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, Band 78, Seiten 4329 bis 4333). Die Stufe der chemischen Umwandlung und alle nachfolgenden Reinigungsschritte führen dazu, daß dieses Herstellungsverfahren kostenaufwendig, unsicher für die Benutzer und umweltunfreundlich ist.
Bei der Nahrungsaufnahme wandeln Tiere und Menschen Cyanocobalamin in eine der natürlichen Formen von Vitamin B12 um, z. B. in Methylcobalamin oder 5'-Desoxyadenosylcobalamin, die in ihrer Funktion als Coenzym für mehrere biochemische Umwandlungen erforderlich sind (L. Ellenbogen in "Handbook of vitamins; Nutritional, biochemical and clinical aspects"; Herausgeber L. J. Machlin, Marcel Dekker Inc., New York und Basel). Ferner erfordert ein wirksames Wachstum von Tieren die Anwesenheit einer ausreichenden Menge an Vitamin-B12- Aktivität im Tierfutter. Vitamin-B12-Zusammensetzungen werden häufig als Futtermittelzusätze als solche oder als Teil einer Vormischung, die weitere Vitamine und andere Futtermittelhilfsstoffe enthält, verkauft, wie in Kolhouse et al. (N. Engl. J. Med., 1982, Band 307, Seiten. 255 bis 256), in der Europäischen Patentanmeldung EP 0595006 und in der Internationalen Patentanmeldung WO 9517157 beschrieben ist.
Es ist deshalb klar, daß eine direkte Zugabe von 5'- Desoxyadenosylcobalamin oder Methylcobalamin anstelle von Cyanocobalamin von Vorteil wäre. Im Hinblick auf die Instabilität dieser zwei Verbindungen werden sie nicht in isolierter Form, sondern in einer trockenen Formulierung, zusammen mit der Biomasse des Organismus, in dem sie gebildet werden, hergestellt. Solche Formulierungen sind für den Einsatz als Futtermittelzusatz gut geeignet. Für die Herstellung von Methylcobalamin und 5'-Desoxyadenosylcobalamin sind Bakterien der Gattung Propionibacterium am meisten bevorzugt, da sie im Gegensatz zu P. denitrificans, von der US-Behörde Food and Drug Administration den GRAS- Status ("als sicher allgemein anerkannt") erhalten haben und von ihnen nicht bekannt ist, daß sie Endotoxine bilden. Die Arten von Propionibacterium sind luftverträgliche, nichtbewegliche, nichtsporenbildende, grampositive Bakterien, die ferner durch die Bildung großer Mengen von Propionsäure aus Kohlenhydraten, Milchsäure und mehrwertigen Alkoholen gekennzeichnet sind. Die Art Propionibacterium fällt unter die hohe "GC"-Unterabteilung der grampositiven Bakterien (T. D. Brock, M. T. Madigan, J. M. Martinko und J. Parker in "The Biology of Microorganisms", 7. Auflage, Prentice-Hall International Inc., 1994).
Die Patentanmeldung RU 2001953 (Antibiotics Enzymes Research Technical Institute) bezieht sich auf ein Sprühtrocknungsverfahren für Propionibacterium shermanii, das zur Herstellung von Biomasse mit einem Gehalt an 5'- Desoxyadenosylcobalamin verwendet worden ist. Methylcobalamin in Biomasse aus methanogenen Bakterien ist im Handel von der Firma Gedeon Richter erhältlich. Jedoch ist der Vitamin-B12- Gehalt in diesen Präparaten durch die Menge begrenzt, in der das Vitamin B12 während der Fermentation gebildet wird, und folglich überschreitet der Vitamin-B12-Gehalt in diesen Präparaten nicht den Wert von 0,1% (Gew./Gew.). Die Konzentration von Vitamin B12 in einer Zusammensetzung wird üblicherweise als das Trockengewicht von Vitamin B12 in Form des Prozentsatzes des Trockengewichts der Zusammensetzung gemessen.
Konzentrierte (d. h. über 0,1%ige, Gew./Gew.) Produkte von Cyanocobalamin sind im Handel erhältlich. Jedoch können Futtermittelfabriken und Hersteller von Vormischungen dieses Material nicht einsetzen, weil sich Cyanocobalamin als Folge seiner elektrostatischen Eigenschaften beim Verarbeiten in Futtermittelfabriken und bei Herstellern von Vormischungen von seinem Träger abscheidet, wenn es mit Konzentrationen von über 0,1%, Gew./Gew., formuliert wird. Die Abscheidung ist ein besonderes Problem beim Sieben, Windsichten oder Stehenlassen der Zusammensetzung während eines längeren Zeitraumes.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren, durch das es möglich wird, eine Zusammensetzung herzustellen, die eine relativ hohe Konzentration (über 0,1%, Gew./Gew.) an natürlichem Vitamin B12 aufweist. Diese neuen konzentrierten Produkte können beispielsweise in Tierfutter, Nahrung für den Menschen oder als Bestandteil in Kosmetika verwendet werden. Diese neuen konzentrierten Produkte können beim Gebrauch und beim Transport bequemer sein und erlauben so eine Kostensenkung. Sie können in vorteilhafter Weise von Futtermittelfabriken und Herstellern von Vormischungen benutzt werden, da die Produkte eine verminderte Abscheidung von Vitamin B12 vom Träger während der Verarbeitung aufweisen können. Das Verfahren kann leicht in einem industriellen Maßstab durchgeführt werden und ist relativ umweltfreundlich, da die Verwendung von organischen Lösungsmitteln oder die Cyanidierung nicht nötig sind.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Herstellen einer Zusammensetzung mit einem Gehalt an natürlichem Vitamin B12 zur Verfügung, die eine Vitamin-B12-Konzentration von über 0,1% (Gew./Gew.), bezogen auf den Trockensubstanzgehalt der Zusammensetzung, aufweist. Das Verfahren beinhaltet die folgenden Stufen: a) Bereitstellen von mikrobiellen Zellen mit einem Gehalt an natürlichem Vitamin B12, b) Öffnen der mikrobiellen Zellen derart, daß mindestens ein Teil des löslichen Inhalts der Zellen, der Vitamin B12 enthält, in eine Flüssigkeit freigegeben wird, in der die Zellen vorliegen, c) Trennen der geöffneten Zellen und der das Vitamin B12 enthaltenden Flüssigkeit und d) Herstellen eines Gemisches aus dem Vitamin B12 und mindestens einem Teil der geöffneten Zellen.
Die mikrobiellen Zellen mit einem Gehalt an Vitamin B12 werden vorzugsweise durch ein industrielles Fermentationsverfahren unter Einsatz eines Mikroorganismus, der bekanntlich Vitamin B12 bildet, erhalten. Die Mikroorganismen sind beispielsweise Bakterien der Gattung Acetobacterium, Aerobacter, Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Azotobacter, Bacillus, Costridium, Corynebacterium, Escherichia, Eubacterium, Flavobacterium, Methanobacillus, Methanosarcina, Mycobacterium, Propionibacterium, Proteus, Pseudomonas, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Salmonella, Serratia, Streptococcus, Streptomyces und Xanthomonas. Vorzugsweise ist das in dem Verfahren der Erfindung einzusetzende Bakterium für einen Konsum durch Menschen und/oder Tiere sicher und bildet keine Endo- oder Exotoxine. Es ist besonders bevorzugt, daß das Bakterium von der Behörde U.S. Food and Drug Administration den GRAS-Status ("als sicher allgemein anerkannt") erhalten hat. Das am meisten bevorzugte Bakterium für den Einsatz beim Verfahren der Erfindung ist jenes der Gattung Propionibacterium, wobei die bevorzugten Arten P. freudenreichii oder P. shermanii sind.
Es ist Fachleuten gut bekannt, daß die industrielle Herstellung von Vitamin B12, wie jene von vielen anderen mikrobiellen Metaboliten, unter Einsatz von Stämmen erfolgt, die aus Programmen resultieren, die eingerichtet wurden, um die gewünschten Qualitäten irgendeines speziellen Stamms zu verbessern. Diese Programme bestehen im wesentlichen aus der Behandlung des Produktionsstamms mit einem mutagenen Mittel und der Selektion von Mutanten, die eine verbesserte Produktivität oder andere Vorteile aufweisen. Für die rationelle Selektion von Vitamin B12 überproduzierenden Mutanten von Mikroorganismen wurden mehrere Techniken beschrieben (C. Spalla, A. Grein, L. Garofo und G. Ferni, "Microbial production of vitamin B12" in "Biotechnology of vitamins, pigments and growth factors", Seiten 257 bis 284 (Herausgeber E. J. Vandamme), Elsevier, London/NY, 1989). Solche mutanten Stämme werden im bevorzugten Verfahren der Erfindung eingesetzt und sind in der Lage, die Vitamin-B12- Konzentrationen in den erhaltenen Zusammensetzungen weiter zu erhöhen.
Bei der Erfindung ist der Ausdruck "natürliches Vitamin B12" derart definiert, daß er alle Cobaltcorrinoide der Cobalamingruppe, ausgenommen Cyanocobalamin, umfaßt.
Bei dem bevorzugten Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung enthält das natürliche Vitamin B12 5'-Desoxyadenosylcobalamin und/oder Methylcobalamin.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden die das Vitamin B12 enthaltenden mikrobiellen Zellen derart behandelt, daß eine Lyse oder ein anderweitiges Aufbrechen der Zellmembran verursacht wird. Die Lyse beschreibt das Öffnen der mikrobiellen Zellen derart, daß der lösliche Inhalt (oder wenigstens ein Teil davon) der Zellen, die das Vitamin B12 enthalten, in eine Flüssigkeit freigegeben wird, in der die Zellen enthalten sind. Bevorzugte Behandlungen zum Öffnen der Zellen sind das Wärmebehandeln, z. B. das Pasteurisieren oder Erhitzen in einem Autoklaven, das Behandeln mit bakteriolytischen Enzymen, z. B. mit Lysozym, das mechanische Aufreißen der Zellen, z. B. das Mahlen oder die Anwendung von Scherkräften, das Behandeln mit chemischen Stoffen, die eine Zelllyse verursachen, z. B. mit grenzflächenaktiven Stoffen oder organischen Lösungsmitteln, sowie Kombinationen dieser Behandlungsarten. Die Lyse oder anderweitige Membranöffnung bildet ein Lysat, das in eine feste und eine flüssige Phase getrennt werden kann.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird mindestens ein Teil der festen Phase (geöffnete Zellen) der flüssigen Phase zugegeben, die das natürliche Vitamin B12 enthält, so daß sich eine Zusammensetzung ergibt, die ein Gemisch darstellt, in dem Biomasse, d. h. vorzugsweise geöffnete mikrobielle Zellen, und natürliches Vitamin B12, vorliegen. Der Gehalt oder die Konzentration an Vitamin B12 in diesen Zusammensetzungen wird als Gewichtsprozentsatz des Vitamins B12, bezogen auf den Trockensubstanzgehalt der Zusammensetzung, ausgedrückt.
Das erfindungsgemäße Verfahren bildet Zusammensetzungen mit einer Vitamin-B12-Konzentration von über 0,1% (Gew./Gew.), bezogen auf den Trockensubstanzgehalt der Zusammensetzung. Bei bevorzugten Verfahren hat die Zusammensetzung eine Konzentration an natürlichem Vitamin B12 von über 0,2% (Gew./Gew.), vorzugsweise von über 0,4% (Gew./Gew.), noch mehr bevorzugt von über 0,6%, noch mehr bevorzugt von über 0,8% (Gew./Gew.) und am meisten bevorzugt von über 1,0% (Gew./Gew.). Es ist bevorzugt, daß die Vitamin-B12- Konzentrationen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen 10% (Gew./Gew.) nicht übersteigen und insbesondere nicht über 5% liegen.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird die feste Phase des Lysats, welche die Zellreste enthält, die sich durch das Öffnen der Zellen ergeben, von der Flüssigkeit getrennt, die das freigesetzte Vitamin B12 enthält. Dem Fachmann steht eine Anzahl verschiedener Fest-Flüssig-Trenntechniken zur Durchführung dieser Trennung zur Verfügung, beispielsweise Zentrifugier- und Filtriertechniken. Eine bevorzugte Methode zum Trennen der festen Zellreste von der das Vitamin B12 enthaltenden Flüssigkeit ist die Ultrafiltration.
Bei einem bevorzugten Verfahren der Erfindung werden die geöffneten mikrobiellen Zellen gewaschen, und die Waschflüssigkeiten werden mit dem Vitamin B12 vereinigt, das nach dem Trennen der Zellen und der das Vitamin B12 enthaltenden Flüssigkeit erhalten worden ist. Vorzugsweise geschieht das Waschen durch Diafiltration mit ionenfreiem Wasser, das vorzugsweise für das Waschen der geöffneten Zellen verwendet wird. Das Diafiltrat, welches das Vitamin B12 enthält, wird dann mit der das Vitamin B12 enthaltenden flüssigen Phase vereinigt.
Bei einem bevorzugten Verfahren der Erfindung wird ferner die das natürliche Vitamin B12 enthaltende flüssige Phase einer Trocknungsbehandlung unterworfen. Es kann jede geeignete Trocknungsmethode angewandt werden, z. B. ein Sprühtrocknen, Fließbetttrocknen, Gefriertrocknen oder Trocknen im Vakuum.
Bei einem bevorzugten Verfahren der Erfindung werden die das Vitamin B12 enthaltenden mikrobiellen Zellen gewaschen, bevor sie der Lyse unterworfen werden, damit die Vitamin-B12- Konzentration in der Trockensubstanz durch Entfernen von Mediumkomponenten weiter erhöht wird. Vorzugsweise erfolgt das Waschen unter Anwendung einer Diafiltration, wobei vorzugsweise ionenfreies Wasser benutzt wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Zusammensetzungen mit einem Gehalt an Vitamin B12 zur Verfügung, die gemäß einem Verfahren der Erfindung erhalten werden. Erfindungsgemäße Zusammensetzungen sind dadurch gekennzeichnet, daß sie natürliches Vitamin B12 und Biomasse enthalten, wobei der Ausdruck "natürliches Vitamin B12" alle Cobaltcorrinoide der Cobalamingruppe, ausgenommen Cyanocobalamin, umfaßt und wobei die Biomasse geöffnete bakterielle Zellen enthält und die Zusammensetzung eine Konzentration an natürlichem Vitamin B12 von über 0,1% (Gew./Gew.), bezogen auf den Trockensubstanzgehalt der Zusammensetzung, aufweist.
Bei einer bevorzugten erfindungsgemäßen Zusammensetzung beträgt die Vitamin-B12-Konzentration über 0,2% (Gew./Gew.), vorzugsweise über 0,4% (Gew./Gew.), insbesondere über 0,6%, noch mehr bevorzugt über 0,8% (Gew./Gew.) und am meisten bevorzugt über 1,0% (Gew./Gew.). Jedoch übersteigen die Vitamin-B12-Konzentrationen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen vorzugsweise nicht 10% (Gew./Gew.) und liegen insbesondere nicht über 5%. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen enthalten Vitamin B12 und einen Träger, der vorzugsweise Biomasse, z. B. ganze Zellen und/oder Zellreste, enthält. Die in diesen Zusammensetzungen vorliegende Biomasse stammt vorzugsweise von einem Mikroorganismus, der Vitamin B12 bilden kann, wie beispielsweise von den obengenannten Bakterien, von denen die Propionibacterium-Arten am meisten bevorzugt sind.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind vorzugsweise trockene Zusammensetzungen, wobei "trocken" definiert ist im Sinne eines Wassergehalts von weniger als 15 Gew.-%, vorzugsweise von weniger als 10%, insbesondere von weniger als 5%.
Bei bevorzugten trockenen Zusammensetzungen der Erfindung ist die Vitamin-B12-Aktivität im wesentlichen homogen über das Pulver oder das granulierte Pulver, welches den Träger und das Vitamin B12 enthält, verteilt. Als Ergebnis hiervon scheidet sich die Vitamin-B12-Aktivität in diesen Zusammensetzungen in vorteilhafter Weise nicht in großem Umfang von den anderen Bestandteilen in der Zusammensetzung ab, insbesondere bei Einwirkung von Gravitationskräften, beim Sieden, beim Windsichten oder bei der Einwirkung elektrostatischer Kräfte während der Verarbeitung der Zusammensetzungen, selbst dann, wenn die Vitamin-B12- Konzentrationen über 0,1% (Gew./Gew.) betragen. Unter dem Verarbeiten wird hier verstanden, daß ein Verarbeiten der Zusammensetzungen der Erfindung zu Futtermittel und Futtermittelvormischungen erfolgt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die erfindungsgemäße Zusammensetzung als wachstumsfördernder Futtermittelzusatz für Tiere oder für die Herstellung solcher Zusätze verwendet. Für diesen Zweck werden die das Vitamin B12 enthaltenden Zusammensetzungen den anderen Futterkomponenten zugegeben, entweder direkt oder in Form einer Vormischung, die auch andere Vitamine, Mineralstoffe und/oder bioaktive Bestandteile enthält. Wie in den speziellen Beispielen gezeigt wird, fördert das Füttern eines Tieres mit einer Diät, welche eine erfindungsgemäße Zusammensetzung enthält, dessen Wachstum.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt der Erfindung werden die das Vitamin B12 enthaltenden Zusammensetzungen als Nahrungsmittelzusatz für Menschen oder zur Herstellung dieses Zusatzes verwendet und/oder in kosmetische Präparate, wie Shampoos oder Körperlotionen, eingearbeitet.

Beispiele

Experimentelles

Vitamin-B12-Probe

Die Vitamin-B12-Aktivität wurde unter Anwendung der turbidimetrischen Bioprobe auf der Basis der Wachstumsreaktion von Lactobacillus leichmanii ATCC 7830 geprüft, wie im einzelnen in "The United States Pharmacopoeia, The National Formulary", 1995, Seiten 1719 bis 1721, United States Pharmacopoeial Convention, Inc., Rockville, MD, beschrieben ist.

Plasma-BI2-Konzentrationen

Das Plasma B12 wurde unter Einsatz einer handelsüblichen Strahlungsprobenanordnung (Bio-Rad Laboratories Ltd, Hemel Hempstead, Vereinigtes Königreich) gemessen. Die Plasmaprobe wird mit Vitamin B12 (&sup5;&sup7;Co) in einer Lösung, die Dithiothreitol und Cyanid enthält, vereinigt. Das Gemisch wird 30 Minuten gekocht, um endogene Bindungsproteine zu inaktivieren und die verschiedenen Formen von Vitamin B12 in Cyanocobalamin überzuführen. Das Gemisch wird abgekühlt und dann mit immobilisiertem (an Polymerperlen gebundenen) affinitätsgereinigten Intrinsic-Faktor vom Schwein zusammengegeben. Dies ergibt eine Einstellung und Pufferung des pH-Werts des Reaktionsgemisches auf 9,35. Das Reaktionsgemisch wird dann während 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Während der Inkubation konkurrieren die endogenen und markierten Vitamine auf der Grundlage ihrer relativen Konzentrationen um die begrenzte Anzahl von Bindungsstellen. Das Reaktionsgemisch wird dann 10 Minuten mit 1500 g zentrifugiert. Die markierten und unmarkierten Vitamine, die an die immobilisierten Bindungsproteine gebunden sind, werden am Boden des Röhrchens in Form eines Pellets konzentriert, und die ungebundenen Vitamine bleiben im Überstand. Der Überstand wird abgesaugt, und die mit den Pellets zuzuschreibende Radioaktivität wird gezählt. Unter Einsatz von Vitamin-B12-Standards in einer Serum-Albumin-Base vom Menschen werden Standardkurven angefertigt. Die Konzentration von Vitamin B12 in der Plasmaprobe wird aus den Standardkurven ermittelt. Die Standardkurven wurden aufgezeichnet, und Unbekanntes wurde unter Anwendung eines AssayZap-Universalprobenrechners (AssayZap universal assay calculator), Version 2.32 (Biosoft, Cambridge, Vereinigtes Königreich) bestimmt.
Es war erforderlich, die Plasmaproben auf das 10-50fache zu verdünnen, um sie in den empfindlichsten Bereich der Untersuchung zu bringen.

Vergleichsbeispiel 1

Unter Anwendung eines dem Fachmann bekannten Verfahrens (siehe z. B. Spalla et al., 1989, "Microbial production of vitamin B12" in "Biotechnology of vitamins, pigments and growth factors", Herausgeber E. J. Vandamme, Elsevier, London, New York, Seiten 257 bis 284) wurde eine Fermentation mit Propionibacterium freudenreichii durchgeführt. Ein geeigneter Stamm P. freudenreichii ist von der American Type Culture Collection unter der Zugangsnummer ATCC 6207 erhältlich. Am Ende der Fermentation wurde eine Brühe erhalten, die eine 5'- Desoxyadenosylcobalamin-Potenz von 10 mg/l und einen Trockensubstanzgehalt von 7,5% aufwies. Das Sprühtrocknen dieser Brühe ergab ein Produkt mit einer Vitamin-B12- Konzentration von 0,01%.
Um eine höhere Vitamin-B12-Konzentration zu erhalten, wurde eine Fest-Flüssig-Trennung der Brühe versucht. Vitamin B12 befindet sich intrazellular in P. freudenreichii, weshalb ein Entfernen von (extrazellulären) Mediumkomponenten und ein nachfolgendes Sprühtrocknen der Biomasse ein sprühgetrocknetes Produkt mit einer höheren Vitamin-B12- Konzentration ergeben sollte.
Im Labormaßstab wurde eine Zentrifugierungsstufe bei einer maximalen g-Kraft von 5000 bis 6000 g durchgeführt. Diese g- Kraft ist vergleichbar mit den Zentrifugalkräften von Zentrifugen, die im industriellen Maßstab verwendet werden. Gleiche Mengen von 1000 ml Brühe wurden in einer Beckmann- JM/6E-Zentrifuge während 10 Minuten bei 5000 U/min zentrifugiert. Jedoch wurde unter diesen Bedingungen keine Trennung von Biomasse und Brühe erreicht.
Da höhere Zentrifugalkräfte im industriellen Maßstab aus wirtschaftlichen Gründen weniger interessant sind, haben wir geprüft, ob es vernünftig sei, die Flüssigkeit und die Feststoffe~in der Brühe unter Anwendung einer Ultrafiltration zu trennen.
Mit Hilfe eines spiralförmig gewundenen Moduls kD AMICON (0,09 m²) mit einem Beschickungsdruck von 1 bar wurden 2000 ml Brühe mit einer Anfangskonzentration von 4,5 mg Vitamin B12/l (Vitamin B12 in der Trockensubstanz 0,02%) ultrafiltriert. Unter diesen Bedingungen war es möglich, die Vitamin-B12- Probe auf das 5-fache zu konzentrieren. Der durchschnittliche Permeatfluß betrug 30 l/m² h. Die Vitamin-B12-Konzentration in dem Konzentrat lag bei 20 mg/l, während in dem Permeat weniger als 0,2 mg/l Vitamin B12 gefunden wurden. Die Vitamin-B12-Konzentration in dem Konzentrat, ausgedrückt als Trockensubstanzgehalt, betrug 0,05%, verglichen mit 0,02 vor der Ultrafiltration.
Um den Gehalt an Vitamin B12 in der Trockenmasse weiter zu erhöhen, überprüften wir als nächstens eine Diafiltration der Biomasse.
Das im oben beschriebenen Versuch erhaltene Ultrafiltrationskonzentrat wurde sechsmal mit ionenfreiem Wasser gewaschen, was zu einer Vitamin-B12-Potenz in dem Konzentrat von 20 mg/l führte. In dem Diafiltrat wurde keine Vitamin- B12-Aktivität gefunden. Das nachfolgende sprühtrocknen des Konzentrats führte zu einem sprühgetrockneten Produkt mit einer Vitamin-B12-Konzentration von 0,06%.
Wir schließen aus den obigen Versuchen, daß es nicht möglich ist, ein Produkt mit einer Vitamin-B12-Konzentration von über 0,06%, bezogen auf die Trockensubstanz, zu erhalten, wenn von einer Brühe mit einem Vitamin-B12-Gehalt von 5 bis 10 mg/l ausgegangen wird.

Beispiel 2

Um die Anwesenheit von lebensfähigen Produktionsorganismen, d. h. von lebenden Zellen, in dem getrockneten Produkt zu verhindern, wurde eine gemäß dem Beispiel 1 erhaltene Brühe während 30 Minuten einer Pasteurisierungsstufe bei 65ºC unterworfen. Die behandelte Brühe wurde ultrafiltriert, wie oben beschrieben.
Es wurde ein rosa gefärbtes Permeat mit einer Vitamin-B12- Konzentration (Trockensubstanz) von 0,2 bis 0,4% erhalten. Es wird angenommen, daß die Pasteurisierung eine Lyse der P. freudenreichii-Zellen (oder eines Teils hiervon) verursacht und das intrazellulare Vitamin B12 in das Medium freigibt. Dies kann es ermöglichen, getrocknete Produkte zu erhalten, die Vitamin B12 in Konzentrationen im Bereich von 0,06 bis 0,3% (bezogen auf Trockensubstanz) zu erhalten, und zwar durch Vereinigen des Permeats und der pasteurisierten Brühe vor dem Sprühtrocknen.
Im Einzelnen wurden 350 ml der wärmebehandelten Brühe unter den oben im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen ultrafiltriert. Das Konzentrat wurde mit 2500 ml ionenfreiem Wasser diafiltriert. Das klare rosafarbene Permeat und das Diafiltrat wurden vereinigt und mit 750 ml pasteurisiertem Ultrafiltrationskonzentrat gemischt. Das Gemisch wurde in einem Labor-Büchi-Sprühtrockner sprühgetrocknet, wobei die Einlaßtemperatur auf 180ºC und der Auslaß auf eine Temperatur von 104ºC eingestellt wurde. Die Vitamin-B12-Konzentration des so erhaltenen sprühgetrockneten Produkts betrug 0,13%.

Beispiel 3

1200 l einer Brühe mit einer Vitamin-B12-Konzentration von 8 mg/l wurden durch Fermentation von P. freudenreichii in einer Pilotanlage erhalten und in einem DDS-Ultrafiltrationsmodul M37 unter Einsatz von 20-kD-Membranen und einem anfänglichen Wasserdurchfluß von 38 l/m² h ultrafiltriert. Die Temperatur während der Ultrafiltration wurde auf Umgebungstemperatur gehalten. Der Kreislaufstrom lag bei etwa 15 m³/h. Der Einspeisungsdruck wurde auf etwa 7 bar eingestellt. Die Brühe wurde 11,5-fach konzentriert (durchschnittlicher Durchfluß 23 1/m² h). Das Konzentrat wurde bei Umgebungstemperatur mit 500 l ionenfreiem Wasser gewaschen, bis eine Leitfähigkeit von etwa 3 mS/cm erreicht war.
Das erhaltene Konzentrat wurde 6 Stunden bei 90ºC behandelt. Ein Teil des wärmebehandelten Konzentrats wurde diafiltriert und ergab etwa 300 l eines Vitamin B12 enthaltenden Permeats. Das Retentat wurde bei 4ºC gelagert.
Das Permeat wurde im Pilotmaßstab in einem Glasverdampfer bei 40ºC unter Vakuum konzentriert und ergab etwa 6 l Konzentrat.
Durch Vereinigen und Mischen einer geeigneten Menge des Retentats mit dem konzentrierten Permeat stellten wir ein Gemisch zusammen, das in einem NIRO-Sprühtrockner sprühgetrocknet wurde. Die Lufttemperatur am Einlaß wurde auf 160ºC und die Auslaßtemperatur auf etwa 90 bis 95ºC eingestellt. In einer fünfstündigen Betriebszeit wurden etwa 45 l des Gemisches sprühgetrocknet (etwa 9 kg/Stunde). Dies ergab 1307 g sprühgetrocknetes Material mit einer Vitamin- B12-Aktivität von 1100 mg/kg, d. h. 0,11%.

Beispiel 4

In einem Versuch, der dem im Beispiel 3 beschriebenen ähnlich war, wurde eine Fermentation unter Einsatz des verbesserten Stamms P. freudenreichii CBS 929.97 durchgeführt. Die erhaltene Vitamin-B12-Konzentration in der Fermentationsbrühe betrug 40 mg/l. Die Ultrafiltration und die Diafiltration wurden notwendigerweise durchgeführt, wie im Beispiel 3 beschrieben ist.
Unter Anwendung der Ultrafiltration wurden 100 l der 40-mg/l- Brühe auf etwa 40 l konzentriert. Unter Anwendung der Diafiltration wurde das Konzentrat mit 200 l ionenfreiem Wasser gewaschen. Das erhaltene gewaschene Konzentrat hatte eine Vitamin-B12-Aktivität von 96,5 mg/kg und enthielt 6,72% Trockensubstanz (das Sprühtrocknen dieses gewaschenen Konzentrats hätte eine Vitamin-B12-Aktivität von 0,14% ergeben).
Das gewaschene Konzentrat wurde nachfolgend während 5 Minuten bei 90ºC lysiert, gefolgt von einer Trennung der Zellreste und der Flüssigkeit durch Ultrafiltration. Die potentielle Vitamin-B12-Konzentration des Permeats erreichte 0,87% in der Trockensubstanz (berechnet aus einer Vitamin-B12-Aktivität von 52,1 mg/kg und einem Trockensubstanzgehalt von 0,6%). Nach einer Vorkonzentrierung des Permeats im Vakuum bei 65ºC wurden verschiedene Mengen von Permeat und Konzentrat vereinigt und getrocknet. Die Vitamin-B12-Potenzen der erhaltenen getrockneten Produkte sind nachfolgend angegeben.
Der Stamm P. freudenreichii CBS 929.97 wurde am 10. Juli 1997 beim Zentralbüro für Schimmelkulturen, Baarn, Niederlande, hinterlegt.

Beispiel 5

Anwendung von natürlichem Vitamin B12 in Tierfutter

Es wurde ein Versuch mit Hühnern durchgeführt, um die Wirksamkeit von natürlichem Vitamin B12 mit Cyanocobalamin zu vergleichen. Einen Tag alte männliche Hühner wurden statistisch Käfigen zugeordnet. Acht Tiere wurden pro Käfig gehalten. Die Käfige wurden in einem künstlich erhitzten, belüfteten und beleuchteten Hühnerstall untergebracht. Die Tiere wurden gegen NewCastle-Krankheit im Alter von einem und von vierzehn Tagen geimpft. Die Tiere erhielten die Versuchsdiät ad libitum vom Tag 1 an, und zwar während der ersten zehn Tage in Form von Krümeln, später in Form von Pellets. Wasser stand frei zur Verfügung. Der Versuch dauerte 28 Tage. Am Tag 28 wurden die Tiere gewogen, der Futterverbrauch wurde bestimmt und es wurden Blutproben entnommen. Die Blutproben wurden pro Käfig von vier statistisch ausgewählten Hühnern genommen. Das Blut wurde in heparinisierten Röhrchen gesammelt. Die Röhrchen wurden zentrifugiert, und das Plasma wurde eingefroren (-18ºC), bis die Vitamin-B12-Analyse durchgeführt wurde. Diese Analyse erfolgte, wie oben unter "Experimentelles (Plasma-B12- Konzentrationen)" beschrieben wurde.
In diesem Versuch waren drei Behandlungen enthalten:
I. Basaldiät ohne Zugabe von Vitamin B12;
II. Basaldiät mit Zugabe von Cyanocobalamin (30 ppb Wirkstoff);
III. Basaldiät mit Zugabe von natürlichem Vitamin B12 (30 ppb Wirkstoff).
Jede Behandlung wurde fünfmal repliziert.
Die Zusammensetzung der Basaldiät ist in der Tabelle 1 angegeben, die Ergebnisse zeigt die Tabelle 2:

Tabelle 1

Zusammensetzung der Basaldiät (in %)

Mais 55
Tapioca 1
Sojabohnenmehl 30
Sojabohnen, wärmebehandelt 5
Federmehl 1
Sojaöl 2
Tierfett 1
Vitamine*, Mineralstoffe, Aminosäuren 3
Berechnete Inhalte:
Metabolische Energie 13,3 MJ/kg
Rohprotein 22,0%
Lysin, gesamt 1,27%
Methionin + Cystein (gesamt) 0,95%
*: Ohne Vitamin B12. Tabelle 2 Wirkung von Cyanocobalamin und natürlichem Vitamin B12 auf Durchschnittswachstum, Futteraufnahme und Futterumwandlungsverhältnis zwischen den Tagen 1 und 28 des Alters sowie auf die Blutplasma-Vitamin-B12-Gehalte am Tag 28

Beispiel 6

Trennung der Vitamin-B12-Aktivität von einem Träger

Die Trennung der aktiven Verbindung von dem Träger kann durch die Teilchenform, die Dichte und die Schüttdichte, die Fließfähigkeit, die Haftungseigenschaften und die elektrostatischen Eigenschaften, den Feuchtigkeitsgehalt und die Hygroskopizität verursacht werden. Diese Trennvorgänge können während der Herstellung von Vormischungen, der Komponentenzufuhr und nachträglich bei Transport und Lagerung auftreten.
Diese Trennung ist besonders kritisch im Fall von Vormischungen, die Mikrokomponenten, wie Vitamine und Spurenelemente, sowie Makrokomponenten, wie Mineralstoffe und Trägerstoffe, enthalten.
Die Entmischungseigenschaften von existierenden handelsüblichen Cyanocobalaminpräparaten (erhalten von Rhone-Poulenc unter der Marke Microvit® B12) wurden mit Präparaten von natürlichem Vitamin B12, die gemäß dem Beispiel 4 hergestellt worden sind, verglichen. Als Träger für die existierenden handelsüblichen Cyanocobalaminpräparate wird Kalk verwendet.
Die Testsubstanzen wurden über einen Vibrationskanal aus einem Lagerbehälter herausgeführt, um einen Haufen zu bilden, wie in Fig. 1 dargestellt ist.
Es wurden aus der Mitte drei Proben entnommen und gemischt. Der Vorgang wurde mit Proben vom Grund des Haufens wiederholt. Die Proben wurden hinsichtlich der Vitamin-B12- Aktivität analysiert, wie oben beschrieben, und mit dem ursprünglichen homogenen Gemisch verglichen. Abweichungen der Proben von dem ursprünglichen homogenen Gemisch werden wie folgt berechnet:
Abweichung am Grund (%) = {(Konzentration am Grund - Konzentration der Originalmischung)/ Konzentration der Originalmischung}·100
Abweichung in der Mitte (%) = {(Konzentration in der Mitte - Konzentration in der Originalmischung)/Konzentration in der Originalmischung}·100.
Ein Vergleich der Abweichungen am Grund des Haufens und in der Mitte des Haufens von Cyanocobalaminzusammensetzungen und natürlichem Vitamin B12 gemäß der Erfindung ist in der Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3

Claims

1. Verfahren zum Herstellen einer Zusammensetzung mit einem Gehalt an natürlichem Vitamin B12, wobei der Ausdruck "natürliches Vitamin B12" alle Cobaltcorrinoide der Cobalamingruppe, ausgenommen Cyanocobalamin, umfasst und wobei die Zusammensetzung eine Konzentration an natürlichem Vitamin B12 von über 0,1% (Gew./Gew.), bezogen auf den Trockensubstanzgehalt der Zusammensetzung, aufweist sowie das Verfahren folgende Stufen beinhaltet:

(a) Bereitstellen von mikrobiellen Zellen mit einem Gehalt an dem natürlichen Vitamin B12,

(b) Öffnen der mikrobiellen Zellen derart, daß mindestens ein Teil des löslichen Gehalts der Zellen, die das natürliche Vitamin B12 enthalten, in eine Flüssigkeit freigegeben wird, in der die Zellen vorliegen,

(c) Trennen der geöffneten Zellen und der das natürliche Vitamin B12 enthaltenden Flüssigkeit und

(d) Herstellen eines Gemisches aus dem natürlichen Vitamin B12 und mindestens einem Teil der geöffneten Zellen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, das ferner das Waschen der mikrobiellen Zellen vor ihrem Öffnen beinhaltet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Waschen der mikrobiellen Zellen durch Diafiltration erfolgt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das ferner das Trocknen des Gemisches aus dem natürlichen Vitamin B12 und mindestens einem Teil der geöffneten Zellen beinhaltet.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die mikrobiellen Zellen von einer oder mehreren der Bakteriengattungen Acetobacterium, Acetobacter, Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Azotobacter, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Escherichia, Eubacterium, Flavobacterium, Methanobacillus, Methanosarcina, Mycobacterium, Propionibacterium, Proteus, Pseudomonas, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Salmonella, Serratia, Streptococcus, Streptomyces und Xanthomonas stammen.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin die mikrobiellen Zellen von der Bakteriengattung Propionibacterium stammen.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das Öffnen der Zellen durch Wärmebehandlung, Pasteurisierung, Behandlung mit bakteriolytischen Enzymen, mechanischem Aufreissen oder chemischer Behandlung, entweder einzeln oder mit einer Kombination solcher Behandlungen, erfolgt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin das Trennen der festen und der flüssigen Phase des Lysats durch Ultrafiltration oder Mikrofiltration erfolgt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin das natürliche Vitamin B12 5'-Desoxyadenosylcobalamin oder Methylcobalamin ist.

10. Zusammensetzung, enthaltend natürliches Vitamin B12 und Biomasse, wobei der Ausdruck "natürliches Vitamin B12" alle Cobaltcorrinoide der Cobalamingruppe, ausgenommen Cyanocobalamin, umfasst und die Biomasse geöffnete Bakterienzellen enthält sowie die Zusammensetzung eine Konzentration an natürlichem Vitamin B12 von über 0,1% (Gew./Gew.), bezogen auf den Trockensubstanzgehalt der Zusammensetzung, aufweist.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 20, worin das natürliche Vitamin B12 5'-Desoxyadenosylcobalamin oder Methylcobalamin ist.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 10, worin das natürliche Vitamin B12 im wesentlichen homogen über die Zusammensetzung verteilt ist und sich nicht von den anderen Komponenten der genannten Zusammensetzungen abscheidet, wenn es einem Sieben, Windsichten, Schwerkräften oder elektrostatischen Kräften ausgesetzt ist.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 10, worin die Biomasse von Bakterien der Gattung Acetobacterium, Acetobacter, Agröbacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Azotobacter, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Escherichia, Eubacterium, Flavobacterium, Methanobacillus, Methanosarcina, Mycobacterium, Propionibacterium, Proteus, Pseudomonas, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Salmonella, Serratia, Streptococcus, Streptomyces und Xanthomonas stammt.

14. Zusammensetzung nach Anspruch 13, worin die Gattung Propionibacterium ist.

15. Verwendung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 14 bei der Herstellung eines Nahrungsmittelzusatzstoffes.

16. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 14 bei der Herstellung eines Kosmetikpräparats.