DE69714630T2

DE69714630T2 - Biosensor und Verfahren zur quantitaven Analyse von biochemischen Substraten

Info

Publication number: DE69714630T2
Application number: DE69714630T
Authority: DE
Inventors: Shin Ikeda; Junko Iwata; Shigeki Joko; Shiro Nankai; Tomohiro Yamamoto; Toshihiko Yoshioka
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp
Priority date: 1996-03-12
Filing date: 1997-03-10
Publication date: 2003-08-07
Anticipated expiration: 2017-03-11
Also published as: US6547954B2; DE69714630D1; EP0795748B1; CA2199657A1; EP0795748A1; CA2199657C; US20010052472A1; US5922188A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. GEBIET DER ERFINDUNG:

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Biosensor für die Quantifizierung eines biochemischen Substrats (einer spezifischen Verbindung), enthalten in einer Probenflüssigkeit wie Vollblut, Urin, Fruchtsaft und dergleichen, mit Genauigkeit, Geschwindigkeit und Leichtigkeit sowie ein Verfahren zur Quantifizierung eines biochemischen Substrats mit Hilfe des Biosensors. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung einen Biosensor für die elektrochemische Quantifizierung einer Konzentration eines biochemischen Substrats in einer Probenflüssigkeit durch Umsetzung biochemischer Substrate wie Glucose oder Cholesterin mit einer Oxidoreduktase, die spezifisch mit den biochemischen Substraten reagieren kann, und ein Verfahren zur Quantifizierung eines biochemischen Substrates unter Verwendung desselben.

2. BESCHREIBUNG DES VERWANDTEN STANDES DER TECHNIK:

Jüngst sind Biosensoren vorgeschlagen worden, die eine spezifische Verbindung (ein biochemisches Substrat) in einer Probenflüssigkeit, wie einer biologischen Probe oder einem Nahrungsmittel, leicht ohne Verdünnen oder Rühren der Probenflüssigkeit quantifizieren können.
Beispielsweise offenbart die japanische Patentoffenlegungsschrift Nr. 3-202764 einen Biosensor, umfassend ein Elektrodensystem, ausgebildet auf einem isolierenden Substrat mittels Siebdruck oder dergleichen, eine auf dem Elektrodensystem ausgebildete Reaktionsschicht und einen Abstand, vorgesehen als Probenzufuhrweg unter Verwendung einer Abdeckung und eines Abstandshalters. Die Reaktionsunter Verwendung einer Abdeckung und eines Abstandshalters. Die Reaktionsschicht enthält ein hydrophiles Polymer, eine Oxidoreduktase und einen Elektronenakzeptor. Ein solcher Biosensor kann die Konzentration eines biochemischen Substrats in einer Probenflüssigkeit wie folgt quantifizieren: Zunächst wird die Probenflüssigkeit auf den Aufstand im Biosensor aufgetropft, um diesen so zur Reaktionsschicht aufgrund der Kapillarität bereitzustellen, wodurch die Reaktionsschicht aufgelöst wird. Dieses verursacht eine enzymatische Reaktion zwischen dem biochemischen Substrat in der Probenflüssigkeit und der Oxidoreduktase in der Reaktionsschicht, wodurch der Elektronenakzeptor in der Reaktionsschicht reduziert wird. Nach Abschluss der enzymatischen Reaktion wird der reduzierte Elektronenakzeptor elektrochemisch oxidiert, wodurch die Konzentration des biologischen Substrats in der Probenflüssigkeit durch einen Oxidationsstromwert quantifiziert wird.
In dem oben beschriebenen Biosensor wird häufig Kaliumferricyanid als Elektronenakzeptor verwendet. Kaliumferricyanid verwendende Biosensoren weisen ausgezeichnete Stabilität auf, können zu geringen Kosten produziert werden und sind somit im Hinblick auf die Massenproduktion angemessen. Kaliumferricyanid als Elektronenakzeptor verwendende Biosensoren sind jedoch mit einer Reaktionsgeschwindigkeit zweiter Ordnung zwischen dem Kaliumferricyanid und der Oxidoreduktase assoziiert, was langsamer ist als diejenige eines Biosensors, der einen Elektronenakzeptor wie Chinonderivate oder einen anderen Metallkomplex verwendet, der instabil ist oder zu höheren Kosten produziert wird. Dementsprechend benötigt in dem Biosensor, der Kaliumferricyanid verwendet, eine enzymatische Reaktion eine beachtlich lange Zeit, wodurch ein Problem dahingehend verursacht wird, dass dieser die Konzentration des biochemischen Substrats nicht prompt quantifizieren kann.
Zusätzlich sind zahlreiche Biosensoren bekannt, die Ferrocen als Elektronenakzeptor verwenden, das eine schnellere Reaktionsgeschwindigkeit zweiter Ordnung als diejenige von Kaliumferricyanid oder Derivaten desselben aufweist.
Die japanische Patentoffenlegungsschrift Nr. 2-240555 offenbart einen Glucosesensor, umfassend eine Arbeitselektrode mit einem fotoausgehärteten Harzfilm, enthaltend eine Ferrocenverbindung und einem fotoausgehärteten Harzfilm, enthaltend eine Glucoseoxidase, sequentiell auf der Oberfläche der Arbeitselektrode bereitgestellt. Die japanische Patentoffenlegungsschrift Nr. 2-99851 offenbart einen Glucosesensor, umfassend eine Arbeitselektrode mit einer eine Ferrocenverbindung enthaltenden Schicht und einer Schicht mit immobilisierter Glucoseoxidase auf der die Ferrocenverbindung enthaltenden Schicht auf der Oberfläche der Arbeitselektrode. In den oben genannten Biosensoren wird 1,1 '-Dimethylferrocen, Ferrocen, d. h. Bis(cyclopentadienyl)eisen(II), Vinylferrocen oder dergleichen als Ferrocenverbindung eingesetzt.
Die japanische Patentoffenlegungsschrift der Nr. 5-256812 offenbart einen Glucosesensor, umfassend eine Schicht, die die Glucoseoxidase und eine Ferrocenverbindung trägt, auf einer Arbeitselektrode sowie Mittel zum Aufrechterhalten einer vorbestimmten Temperatur in der Nähe der Arbeitselektrode. In diesem Biosensor wurden Ferrocen und/oder Derivate desselben als Ferrocenverbindung eingesetzt.
Jede der in den oben beschriebenen Glucosesensoren verwendeten Ferrocenverbindungen hegten normalerweise in der reduzierten Form vor. Daher muss die Ferrocenverbindung auf der Elektrode in die oxidierte Form umgewandelt werden, um einen Elektronentransfer vom biochemischen Substrat zur Arbeitselektrode über eine enzymatische Reaktion zu erzielen.
Die japanische Patentoffenlegungsschrift der Nr. 6-3316 offenbart einen Glucosesensor (eine modifizierte Elektrode), modifiziert durch eine hydrophobe Redoxsubstanz (beispielsweise ein Ferrocen), die zuvor in einer wässrigen Lösung ionisiert wurde, und ein hydrophiles Enzym (beispielsweise Glucoseoxidase) auf einer Oberfläche einer leitfähigen Elektrode. Der Glucosesensor wird wie folgt hergestellt: Ferrocen wird in einem Phosphatpuffer elektrolysiert, um eine Lösung zu bilden, die Ferriciniumionen enthält. Anschließend wird eine Glucoseoxidase zu der Lösung zugesetzt. Die erhaltene gemischte Lösung wird auf die Oberfläche der leitfähigen Elektrode aufgetragen oder elektroabgeschieden.
Die oben beschriebene modifizierte Elektrode weist jedoch dahingehend Probleme auf, dass das Phosphation und das Ferriciniumion einen ionenähnlichen Komplex bilden, der die Oberfläche der Elektrode inaktiv macht. Darüber hinaus ist ein Schritt des Elektrolysierens von Ferrocen erforderlich, um die modifizierte Elektrode herzustellen. Im Ergebnis sind erhöhte Produktsionszeiten und erhöhte Kosten erforderlich.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst ein Biosensor: ein isolierendes Substrat; ein Elektrodensystem, ausgebildet auf dem isolierenden Substrat, das eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode umfasst; und eine Reaktionsschicht, ausgebildet auf dem isolierenden Substrat, die eine Oxidoreduktase und einen Ferrocen-Elektrolyten als Elektronenakzeptor enthält. Der Ferrocenelektrolyt besteht aus einem Ferriciniumion und einem Anion; das Ferriciniumion wird in dem Biosensor vor der Anlegung eines Potentials bereitgestellt.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung tritt eine enzymatische Reaktion spontan zwischen einem biochemischen Substrat, der Oxidoreduktase und dem Ferriciniumion des Ferrocenelektrolyten auf, unabhängig vom Potential des Elektrodensystems. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Ferrocenelektrolyt ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ferriciniumhexafluorophosphat und Ferriciniumtetrafluoroborat.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Reaktionsschicht zusätzlich mindestens ein oberflächenaktives Mittel bzw. Detergenz.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Reaktionsschicht zusätzlich mindestens ein hydrophiles Polymer.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Oxidoreduktase ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Glucoseoxidase, Glucosedehydrogenase; Lactatoxidase; Lactatdehydrogenase; Uricase; Cholesterinoxidase; einer Kombination von Cholesterinoxidase und Cholesterinesterase; einer Kombination von Glucoseoxidase und Invertase; einer Kombination von Glucoseoxidase, Invertase und Mutarotase; und einer Kombination von Fructosedehydrogenase und Invertase.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Quantifizieren der Konzentration eines biochemischen Substrats in einer Probenflüssigkeit offenbart durch Verwendung eines Biosensors, umfassend ein isolierendes Substrat, ein Elektrodensystem, ausgebildet auf dem isolierenden Substrat, das eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode sowie eine Reaktionsschicht aufweist, vorgesehen auf dem isolierenden Substrat, die eine Oxidoreduktase und einen Ferrocenelektrolyten als Elektronenakzeptor enthält. Das Verfahren umfasst die Schritte: Zusetzen der Probenflüssigkeit zur Reaktionsschicht; und Detektieren eines Antwortstromwerts durch Anlegen einer Spannung zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode. Der Ferrocenelektrolyt besteht aus einem Ferriciniumion und einem Anion; das Ferriciniumion wird im Biosensor vor dem Anlegen eines Potentials bereitgestellt.
Somit macht die hierin beschriebene Erfindung die Vorteile möglich: (1) Bereitstellen eines Biosensors zum prompten bzw. schnellen Quantifizieren der Konzentration eines biochemischen Substrats mit ausreichend kurzen Enzymreaktionszeiten; (2) Bereitstellen eines Biosensors für die Quantifizierung einer Konzentration eines biochemischen Substrats mit Genauigkeit ohne Verschlechterung einer Detektionsempfindlichkeit; (3) Bereitstellen eines Biosensors, hergestellt zu ausreichend geringen Kosten; und (4) Bereitstellen eines Verfahrens für die Quantifizierung einer Konzentration eines biochemischen Substrats unter Verwendung des oben erwähnten Biosensors mit Genauigkeit und Schnelligkeit.
Diese und andere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann beim Lesen und Verstehen der folgenden genauen Beschreibung unter Bezugnahme auf die angefügten Zeichnungen ersichtlich.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine isometrische Explosionszeichnung, die einen Biosensor gemäß eines Beispiels der vorliegenden Erfindung zeigt, worin die Reaktionsschicht ausgelassen ist; und
Fig. 2 ist eine schematische Querschnittsansicht, die einen Biosensor gemäß eines Beispiels der vorliegenden Erfindung zeigt, worin eine Reaktionsschicht auf einem isolierenden Substrat angeordnet ist.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Ein Biosensor gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst ein isolierendes Substrat, ein Elektrodensystem, ausgebildet auf dem isolierenden Substrat und eine Reaktionsschicht, angeordnet auf dem isolierenden Substrat. Das Elektrodensystem umfasst eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode.
Das isolierende Substrat kann eine Syntheseharz-Platte bzw. Kunstharzplatte sein, hergestellt beispielsweise aus Polyethylenterephthalat.
Das Elektrodensystem, umfassend die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode, kann auf dem isolierenden Substrat über ein bekanntes Verfahren vorgesehen werden. Beispielsweise werden Leitungen auf dem isolierenden Substrat ausgebildet. Anschließend werden die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode so bereitgestellt, dass sie an die jeweiligen Leitungen angeschlossen und voneinander isoliert sind. Die Leitungen und die Elektroden können aus jedem der bekannten leitfähigen Materialien hergestellt werden. Beispiele der leitfähigen Materialien schließen ein Kohlenstoff, Silber, Platin, Gold und Palladium.
Die Reaktionsschicht enthält mindestens eine Oxidoreduktase und mindestens einen Elektronenakzeptor.
Der Elektronenakzeptor, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist ein Ferriciniumion, das sich von einem Ferrocen als Elektrolyten ableitet. Der Ausdruck "Ferrocenelektrolyt" bezieht sich hierin auf ein Salz, das ein Ferriciniumion ([(C&sub5;H&sub5;)&sub2;Fe]&spplus;) bei Herstellung einer Lösung mit einer Oxidoreduktase erzeugt, was später beschrieben wird. Ein Anion, das den Ferrocenelektrolyten bildet, unterliegt keinen spezifischen Einschränkungen. Bevorzugte Ferrocenelektrolyten sind beispielsweise Ferroceniumhexafluorophosphat und Ferroceniumtetrafluoroborat, die von Aldrich Inc. erhältlich sind.
Obwohl die Konzentration des Ferrocenelektrolyten nicht speziell eingeschränkt ist, beträgt diese vorzugsweise etwa 1 bis etwa 100 mM in der Probenflüssigkeit, wenn die Reaktionsschicht in einer Probenflüssigkeit gelöst ist. Wenn die Konzentration des Ferrocenelektrolyten kleiner als 1 mM in der Reaktionsschicht ist, kann ein messbarer Bereich an Konzentrationen eines biochemischen Substrats extrem klein werden. Wenn die Konzentration des Ferrocenelektrolyten 100 mM in der Reaktionsschicht übersteigt, kann der Biosensor erhöhte Produktionskosten erfordern und kann Schwankungen in einem Antwortstromwert und schlechte Stabilität während der Lagerung verursachen, da die Reaktionsschicht während der Bildung derselben brechen kann.
Die Oxidoreduktase, die in einem herkömmlichen Biosensor verwendet wird, wie einem Glucosesensor, einem Cholesterinsensor, einem Milchsäuresensor, einem Harnsäuresensor und einem Saccharosesensor, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Beispiele der Oxidoreduktase schließen ein Glucoseoxidase (im Folgenden als GOD bezeichnet), Glucosedehydrogenase, Lactatoxidase, Lactatdehydrogenase, Uricase, Cholesterinoxidase (im Folgenden als ChOD bezeichnet), Cholesterinesterase (im Folgenden als ChE bezeichnet), Invertase, Mutarotase und Fructosedehydrogenase und Kombinationen derselben. Wenn es sich bei dem Biosensor gemäß der vorliegenden Erfindung um einen Glucosesensor handelt, können GOD oder Glucosedehydrogenase als Oxidoreduktase verwendet werden. Wenn es sich bei dem Biosensor gemäß der vorliegenden Erfindung um einen Milchsäuresensor handelt, können Lactatoxidase oder Lactatdehydrogenase als Oxidoreduktase verwendet werden. Wenn es sich bei einem Biosensor gemäß der vorliegenden Erfindung um einen Harnsäuresensor handelt, kann Uricase als Oxidoreduktase verwendet werden. Wenn es sich bei einem Biosensor gemäß der vorliegenden Erfindung um einen Cholesterinsensor handelt, können ChOD oder eine Kombination von ChOD und ChE als Oxidoreduktase verwendet werden. Wenn es sich bei einem Biosensor gemäß der vorliegenden Erfindung um einen Saccharosesensor handelt, kann eine Kombination von GOD und Invertase; eine Kombination von GOD, Invertase und Mutarotase; oder eine Kombination von Fructosedehydrogenase und Invertase als die Oxidoreduktase verwendet werden.
Der Gehalt an Oxidoreduktase, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, unterliegt keinen speziellen Einschränkungen und ein geeigneter Gehalt kann üblicherweise vom Fachmann gewählt werden. Beispielsweise beträgt dann, wenn die GOD verwendet wird, der GOD-Gehalt vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 5 Einheiten pro Biosensor. Wenn eine Kombination von ChOD und ChE verwendet wird, beträgt der ChOD-Gehalt vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 5 Einheiten pro Biosensor und der ChE-Gehalt vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 5 Einheiten pro Biosensor. Der Ausdruck " 1 Einheit" bezieht sich hierin auf eine Menge an Oxidoreduktase, die zur Oxidation von 1 umol an zu quantifizierendem biochemischen Substrat in einer Minute erforderlich ist.
Die Reaktionsschicht kann zusätzlich mindestens ein hydrophiles Polymer enthalten. Beispiele für das hydrophile Polymer schließen ein Cellulosederivate wie Carboxymethylcellulose (im Folgenden als CMC bezeichnet), Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Methylcellulose, Ethylcellulose, Ethylhydroxycellulose und Carboxymethylethylcellulose; Polyvinylpyrrolidon; Polyvinylalkohol; Gelatine oder deren Derivate; Acrylsäure oder deren Salze; Methacrylsäure oder deren Salze; Stärke oder deren Derivate; und Maleinsäureanhydrid oder dessen Salze. Insbesondere ist CMC bevorzugt.
Wenn das oben erwähnte Ferriciniumion als Elektronenakzeptor verwendet wird, wird Ferrocen während aufeinanderfolgender Enzymreaktionen erzeugt. Da das Ferrocen im Allgemeinen geringe Wasserlöslichkeit aufweist, werden die erzeugten Ferrocenmoleküle auf der Reaktionsschicht abgeschieden, und zwar aufgrund des in einer Probenflüssigkeit enthaltenden Wassers. Somit enthält die in der vorliegenden Erfindung verwendete Reaktionsschicht vorzugsweise mindestens ein oberflächenaktives Mittel bzw. Detergenz. Beispielsweise für das oberflächenaktive Mittel schließen von Sojabohnen abgeleitetes, raffiniertes Lecithin, Octylthioglucosid, Natriumcholat, Dodecyl-β-maltosid, Natriumdesoxycholsäure, Natriumtaurodesoxycholat, Triton-X (eingetragene Marke), Lubrol PX (eingetragene Marke), DK-Ester (eingetragene Marke), BIGCHAP (eingetragene Marke) und DeoxyCHAP (eingetragene Marke) ein. Genauer sind das raffinierte Lecithin und das Octylthioglucosid bevorzugt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Lecithinschicht, enthaltend das oben erwähnte raffinierte Lecithin, zusätzlich auf der Reaktionsschicht vorgesehen sein. In dem Fall, dass die Lecithinschicht auf der Reaktionsschicht vorgesehen ist, kann eine Probenflüssigkeit leicht zur Reaktionsschicht bereitgestellt werden.
Im Folgenden wird eine bevorzugte Ausführungsform eines Verfahrens zur Herstellung eines Biosensors gemäß der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die Fig. 1 und 2 beschrieben werden.
Zunächst wird ein leitfähiges Material wie eine Silberpaste auf ein isolierendes Substrat 1 mittels Siebdruck zur Ausbildung von Leitungen 2 und 3 aufgedruckt. Anschließend wird ein weiteres leitfähiges Material, enthaltend ein Harzbindemittel, auf dem isolierenden Substrat 1 zur Bildung einer Arbeitselektrode 4 aufgedruckt, die die Leitung 2 kontaktiert.
Anschließend wird isolierende Paste auf das isolierende Substrat 1 aufgedruckt, um eine isolierende Schicht 6 zu bilden. Die isolierende Schicht 6 deckt den Randteil der Arbeitselektrode 4 so ab, dass eine festgelegte Fläche der Arbeitselektrode exponiert wird. Wie in Fig. 1 gezeigt, deckt die isolierende Schicht 6 auch Teile der Leitungen 2 und 3 ab. Um die Arbeitselektrode 4 wird eine ringförmige Gegenelektrode 5 aus einem ein Harzbindemittel enthaltenden leitfähigen Material gebildet. Die Gegenelektrode 5 steht mit der Leitung 3 in Kontakt. Auf diese Weise wird ein Elektrodensystem 13, umfassend die Arbeitselektrode 4 und die Gegenelektrode 5, auf dem isolierenden Substrat 1 gebildet.
Alternativ kann der Biosensor gemäß der vorliegenden Erfindung mit einem Drei- Elektroden-System versehen sein, umfassend eine Referenzelektrode (nicht gezeigt) zusätzlich zur Arbeitselektrode 4 und der Gegenelektrode 5, ausgebildet auf dem isolierenden Substrat 1. Das Drei-Elektroden-System sorgt für einen stabilen Antwortstrom, wodurch die Messgenauigkeit weiter stabilisiert wird.
Eine Reaktionsschicht 7 kann auf dem isolierenden Substrat 1 wie folgt ausgebildet werden:
Eine das hydrophile Polymer enthaltende wässrige Lösung wird auf das Elektrodensystem 13 aufgetropft und getrocknet, um eine hydrophile Polymerschicht zu bilden. Andererseits werden vorbestimmte Mengen an Oxidoreduktase und Ferrocenelektrolyten in Wasser gelöst. Vorzugsweise setzt man einige Tropfen an oberflächenaktivem Mittel zu dieser wässrigen Lösung zu. Anschließend wird die erhaltene wässrige Lösung, enthaltend die Oxidoreduktase und den Ferrocenelektrolyten, tröpfchenweise auf der hydrophilen Polymerschicht zugesetzt. Im Ergebnis wird das hydrophile Polymer in der wässrigen Lösung gelöst. Anschließend wird die gelöste hydrophile Polymerschicht getrocknet, so dass die Reaktionsschicht 7 ausgebildet wird, bei der sich um eine hydrophile Polymerschicht handelt, enthaltend eine Oxidoreduktase und einen Elektronenakzeptor. Da der Einbau der Oxidoreduktase und des Elektronenakzeptors (d. h. des Ferriciniumions) in die hydrophile Polymerschicht keine weiteren Schritte wie Rühren erfordert, liegt nur das hydrophile Polymer an der Grenzfläche zwischen der Reaktionsschicht 7 und dem Elektrodensystem 13 vor. In anderen Worten kann, da die Oxidoreduktase und der Elektronenakzeptor nicht mit der Oberfläche des Elektrodensystems 13 in Kontakt treten, die Inaktivierung der Oberfläche des Elektrodensystems 13 vermieden werden, die durch Adsorption von Protein auf der Oberfläche verursacht wird.
Dann, wenn die hydrophile Polymerschicht nicht verwendet wird, wird eine wässrige Lösung, enthaltend Oxidoreduktase und Ferrocenelektrolyten, tropfenweise auf dem Elektrodensystem 13 zugesetzt und direkt hierauf getrocknet.
Für die wiederholte Anwendung des Biosensors können die Oxidoreduktase und der Ferrocenelektrolyt auf der hydrophilen Polymerschicht durch Quervernetzung mit Glutaraldehyd immobilisiert werden oder können auf der hydrophilen Polymerschicht zusammen mit einem polymeren Material wie Nitrocellulose oder einer herkömmlichen Ionenaustauschmembran immobilisiert werden.
Wie in Fig. 2 gezeigt, ist die Reaktionsschicht 7 so ausgebildet, dass sie das gesamte Elektrodensystem 13 abdeckt.
Anschließend wird, falls erforderlich, eine vorbestimmte Menge einer Lösung an raffiniertem Lecithin in einem organischen Lösungsmittel wie Toluol auf der Reaktionsschicht 7 verteilt und getrocknet, um eine Lecithinschicht 8 zu bilden. Schließlich wird, wie in Fig. 1 gezeigt, ein Abstandhalter 10, versehen mit einem Probenzufuhrweg 12, und eine Abdeckung 9, versehen mit einem Loch 11, in dieser Reihenfolge über dem isolierenden Substrat 1 mittels bekannter Verfahren angeordnet. Somit wird der Biosensor gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt.
Eine Konzentration eines biochemischen Substrats, enthalten in einer Probenflüssigkeit, wird durch Anwendung des Biosensors gemäß der vorliegenden Erfindung beispielsweise auf folgende Weise quantifiziert.
Zunächst wird eine ein biochemisches Substrat enthaltende Probenflüssigkeit zu einer Reaktionsschicht 7 direkt oder über den Probenzufuhrweg 12 zugesetzt. Die Reaktionsschicht 7 wird von der Probenflüssigkeit gelöst. Nach einer vorbestimmten Zeitspanne wird ein vorbestimmter Level einer Pulsspannung (beispielsweise +0,5 V) anodisch an die Arbeitselektrode 4 auf Basis einer Spannung an der Gegenelektrode 5 angelegt. Der Wert des resultierenden Antwortstroms wird auf bekannte Weise gemessen. Anschließend wird der Antwortstromwert in einen Konzentrationswert des biochemischen Substrats umgewandelt, indem man eine Kalibrierungskurve verwendet, die die Beziehung zwischen der Konzentration und dem Antwortstromwert eines biochemischen Substrats repräsentiert. Die Kalibrierkurve wird zuvor durch Messen bekannter Konzentrationen des biochemischen Substrats erhalten.
Im Folgenden wird ein Mechanismus zum Erhalten des Antwortstromwertes unter Verwendung des Biosensors gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben werden.
Beispielsweise wird dann, wenn eine Probenflüssigkeit Glucose als biochemisches Substrat enthält, GOD in der Reaktionsschicht 7 verwendet. Wenn die Probenflüssigkeit mit der Reaktionsschicht 7 in Kontakt gebracht wird, löst sich die Reaktionsschicht 7 in der Probenflüssigkeit auf und wird die Glucose in der Probenflüssigkeit von der GOD oxidiert, wodurch Gluconolacton erzeugt wird. An diesem Punkt reduzieren die Elektronen, die durch eine Oxidationsreaktion der Glucose erzeugt werden, die in der Reaktionsschicht 7 vorliegenden Ferriciniumionen zu Ferrocen. Wenn die oben erwähnte Pulsspannung an die Arbeitselektrode angelegt wird, resultiert hieraus ein Oxidationsstrom, der das Ferrocen oxidiert. Die Menge des Oxidationsstromes wird als Reaktionsstromwert gemessen, der der Konzentration an Glucose, die in der Probenflüssigkeit vorhanden ist, proportional ist.
Dann, wenn eine Probenflüssigkeit Cholesterinester und Cholesterin als biochemische Substrate enthält, werden ChE und ChOD in der Reaktionsschicht 7 verwendet. Wenn die Probenflüssigkeit mit der Reaktionsschicht 7 in Kontakt gebracht wird, löst sich die Reaktionsschicht 7 in der Probenflüssigkeit und wird der Cholesterinester in der Probenflüssigkeit von der ChE zu Cholesterin umgewandelt. Anschließend wird das gesamte Cholesterin in der Probenflüssigkeit durch die ChOD oxidiert, wodurch Cholestenon erzeugt wird. An diesem Punkt reduzieren die Elektronen, die durch eine Oxidationsreaktion des Cholesterins erzeugt werden, die in der Reaktionsschicht 7 vorliegenden Ferriciniumionen zu Ferrocen. Wenn die oben erwähnte Pulsspannung an die Arbeitselektrode angelegt wird, resultiert hieraus ein Oxidationsstrom, der das Ferrocen oxidiert. Die Menge des Oxidationsstroms wird als ein Reaktionsstromwert gemessen, der der Gesamtkonzentration an Cholesterinester und Cholesterin, vorhanden in der Probenflüssigkeit, proportional ist.
Dementsprechend kann die Konzentration eines biochemischen Substrats, enthalten in einer Probenflüssigkeit, über den Biosensor gemäß der vorliegenden Erfindung quantifiziert werden. Darüber hinaus ist der Biosensor gemäß der vorliegenden Erfindung dazu in der Lage, die Konzentration des biochemischen Substrats in der Probenflüssigkeit mit Genauigkeit und Schnelligkeit zu quantifizieren, da das als Elektronenakzeptor verwendete Ferriciniumion eine schnellere Reaktionsgeschwindigkeit zweiter Ordnung als diejenige des herkömmlicherweise verwendeten Ferricyanidions aufweist.
Der Biosensor gemäß der vorliegenden Erfindung kann effektiv für die Quantifizierung der Konzentration des biochemischen Substrats verwendet werden, das in biologischen Proben wie Vollblut, Plasma, Serum und Urin, Materialien, die in der Nahrungsmittelindustrie verwendet werden, und Produkten derselben (beispielsweise Fruchtsaft) oder dergleichen enthalten ist.

Beispiele

Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung mit Hilfe von veranschaulichenden Beispielen unter Bezugnahme auf die angefügten Zeichnungen beschrieben werden. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf die folgenden Beispiele beschränkt. In den angefügten Zeichnungen bezeichnen gleiche Bezugsziffern gleiche Komponenten und die Beschreibung derselben wird zur Vereinfachung teilweise ausgelassen.

Beispiel 1

Ein Glucosesensor wurde wie folgt als ein Beispiel eines Biosensors gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt.
Wie in Fig. 1 gezeigt, wurde eine Silberpaste durch Siebdruck auf ein isolierendes Substrat 1 aus Polyethylenterephthalat aufgedruckt, um Leitungen 2 und 3 zu bilden. Anschließend wurde eine einen Harzbinder enthaltende leitfähige Kohlenstoffpaste auf das isolierende Substrat 1 zur Bildung einer Arbeitselektrode 4 aufgedruckt. Die Arbeitselektrode 4 war so ausgebildet, dass sie in Kontakt mit der Leitung 2 stand.
Als Nächstes wurde isolierende Paste auf das isolierende Substrat 1 gedruckt, um eine isolierende Schicht 6 zu bilden. Die isolierende Schicht 6 bedeckte die Randteile der Arbeitselektrode 4, um eine festgelegte Fläche der Arbeitselektrode 4 zu exponieren. Darüber hinaus wurde eine einen Harzbinder enthaltende leitfähige Kohlenstoffpaste auf das isolierende Substrat 1 aufgedruckt, um eine ringförmige Gegenelektrode 5 so auszubilden, dass die ringförmige Gegenelektrode 5 in Kontakt mit der Leitung 3 stand.
Anschließend wurde eine wässrige Lösung, enthaltend GOD und Ferroceniumhexafluorophosphat (hergestellt von Aldrich Inc.) auf dem Elektrodensystem 13 zugesetzt und getrocknet (d. h. der Arbeitselektrode 4 und der Gegenelektrode 5), um eine Reaktionsschicht 7 zu bilden. Eine Lecithin enthaltende Toluollösung wurde tropfenweise auf die Reaktionsschicht 7 zugesetzt, um sich über der gesamten Oberfläche der Reaktionsschicht 7 zu verteilen, und getrocknet, um eine Lecithinschicht 8 zu bilden. Ein Abstandhalter und eine Abdeckung 9 wurden in dieser Reihenfolge auf der Lecithinschicht 8 angeheftet, wodurch der Glucosesensor hergestellt wurde.
3 ul einer wässrigen Glucoselösung (30 mg/dl) wurde zu dem oben beschriebenen Glucosesensor über einen Probenzufuhrweg 12 in dem Abstandhalter 10 zugesetzt. Die Probenflüssigkeit erreichte die Höhe des Lochs 11, vorgesehen in der Abdeckung 9, und löste die Reaktionsschicht 7. Anschließend wurde 60 s nach Zusatz der Probenflüssigkeit eine Pulsspannung von +0,5 V auf Basis einer Spannung an der Gegenelektrode 5 anodisch an die Arbeitselektrode 4 angelegt. Ein Antwortstromwert wurde 5 s nach Anlegen der Spannung gemessen.
Darüber hinaus wurden Antwortstromwerte für wässrige Glucoselösungen von 45 mg/dl bzw. 90 mg/dl auf dieselbe Weise, wie oben beschrieben, gemessen unter Verwendung eines frischen Glucosesensors für jede Messung. Die so erhaltenen Antwortstromwerte waren den jeweiligen Konzentrationen der wässrigen Glucoselösungen proportional.

Beispiel 2

Ein Glucosesensor wurde auf dieselbe Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt mit der Ausnahme, dass Ferroceniumtetrafluoroborat (hergestellt von Aldrich Inc.) anstelle des Ferroceniumhexafluorophosphats verwendet wurde. Unter Verwendung dieses Glucosesensors wurden Antwortstromwerte für wässrige Glucoselösungen mit denselben Konzentrationen, wie die im Beispiel 1 beschriebenen, auf dieselbe Weise wie in Beispiel beschrieben gemessen. Die erhaltenen Antwortstromwerte waren den jeweiligen Konzentrationen der wässrigen Glucoselösungen proportional.

Beispiel 3

Ein Elektrodensystem 13 wurde auf einem isolierenden Substrat 1 auf dieselbe Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, ausgebildet.
Anschließend setzte man eine wässrige Lösung, enthaltend 0,5 Gew.-% CMC, tropfenweise auf dem Elektrodensystem 13 (d. h. Arbeitselektrode 4 und Gegenelektrode 5) zu und trocknete zur Bildung einer CMC-Schicht. Eine wässrige Lösung, enthaltend GOD und Ferroceniumhexafluorophosphat, wurde tropfenweise zugesetzt und auf der CMC-Schicht getrocknet, um eine Reaktionsschicht 7 zu bilden. Darüber hinaus wurde eine Lecithin enthaltende Toluollösung tropfenweise auf der Reaktionsschicht 7 zugesetzt, um sich über die gesamte Oberfläche der Reaktionsschicht 7 zu verteilen, und zur Bildung einer Lecithinschicht 8 getrocknet. Ein Abstandhalter 10 und eine Abdeckung 9 wurden in dieser Reihenfolge auf der Lecithinschicht 8 angeheftet, wodurch der Glucosesensor hergestellt wurde.
3 ul einer wässrigen Glucoselösung von 30 mg/dl wurden als Probenflüssigkeit zu dem oben beschriebenen Glucosesensor über einen Probenzufuhrweg 12 im Abstandhalter 10 zugesetzt. Die Probenflüssigkeit reichte bis zu einer Höhe eines Lochs 11, vorgesehen in der Abdeckung 9, und löste die Reaktionsschicht 7. Anschließend wurde 60 s nach Zusetzen der Probenflüssigkeit eine Pulsspannung von +0,5 V auf Basis einer Spannung an der Gegenelektrode 5 anodisch an die Arbeitselektrode 4 angelegt. Ein Antwortstromwert wurde 5 s nach Anlegen der Spannung gemessen.
Darüber hinaus wurden Antwortstromwerte für wässrige Glucoselösungen mit 45 mg/dl bzw. 90 mg/dl auf dieselbe Weise, wie oben beschrieben, unter Verwendung von frischen Glucosesensoren für jede Messung gemessen. Die so erhaltenen Antwortstromwerte waren den jeweiligen Konzentrationen der wässrigen Glucoselösungen proportional.

Beispiel 4

Ein Glucosesensor wurde auf dieselbe Weise, wie in Beispiel 3 beschrieben, hergestellt mit der Ausnahme, dass Ferroceniumtetrafluoroborat anstelle des Ferroceniumhexafluorophosphats verwendet wurde. Unter Verwendung dieses Glucosesensors wurden Antwortstromwerte auf dieselbe Weise, wie in Beispiel 3 beschrieben, für Glucoselösungen mit denselben Konzentrationen, wie den in Beispiel 3 beschriebenen, gemessen. Die erhaltenen Antwortstromwerte waren den jeweiligen Konzentrationen der wässrigen Glucoselösungen proportional.

Beispiel 5

Ein Glucosesensor wurde auf dieselbe Weise, wie in Beispiel 3 beschrieben, hergestellt mit der Ausnahme, dass rafiniertes Lecithin, abgeleitet von Sojabohnen (erzeugt von SIGMA Chemical Co.), als oberflächenaktives Mittel zur wässrigen Lösung, enthaltend GOD und Ferroceniumhexafluorophosphat, zugesetzt wurde. Diese wässrige Lösung wurde tropfenweise auf der CMC-Schicht zugesetzt. Unter Verwendung dieses Glucosesensors wurden Antwortstromwerte auf dieselbe Weise, wie in Beispiel 3 beschrieben, für wässrige Glucoselösungen mit denselben Konzentrationen, wie den in Beispiel 3 beschriebenen, gemessen. Die erhaltenen Antwortstromwerte waren den jeweiligen Konzentrationen der wässrigen Glucoselösungen proportional.

Beispiel 6

Ein Glucosesensor wurde auf dieselbe Weise, wie in Beispiel 3 beschrieben, hergestellt mit der Ausnahme, dass Ferroceniumtetrafluoroborat anstelle von Ferroceniumhexafluorophosphat verwendet und raffiniertes Lecithin, abgeleitet von Sojabohnen, als ein oberflächenaktives Mittel zur wässrigen Lösung, enthaltend GOD und Ferroceniumtetrafluoroborat, zugesetzt wurde. Diese wässrige Lösung wurde tropfenweise auf der CMC-Schicht zugesetzt. Unter Verwendung dieses Glucosesensors wurden Antwortstromwerte auf dieselbe Weise, wie in Beispiel 3 beschrieben, für wässrige Glucoselösungen mit denselben Konzentrationen, wie den in Beispiel 3 beschriebenen, gemessen. Die erhaltenen Antwortstromwerte waren den jeweiligen Konzentrationen der wässrigen Glucoselösungen proportional.

Beispiel 7

Ein Elektrodensystem 13 wurde auf einem isolierenden Substrat auf dieselbe Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, ausgebildet.
Anschließend wurde eine wässrige Lösung, enthaltend 0,5 Gew.-% CMC, tropfenweise zugesetzt und auf dem Elektrodensystem 13 (d. h. der Ärbeitselektrode 4 und der Gegenelektrode 5) getrocknet, um eine CMC-Schicht zu bilden. Octylthioglucosid wurde als oberflächenaktives Mittel zu einer wässrigen Lösung zugesetzt, enthaltend ChE, ChOD und Ferroceniumhexafluorophosphat. Die erhaltene wässrige Lösung wurde tropfenweise auf der CMC-Schicht zugesetzt und getrocknet, um eine Reaktionsschicht 7 zu bilden. Zusätzlich wurde eine Lecithin enthaltende Toluollösung tropfenweise auf der Reaktionsschicht 7 zugesetzt, um sich über die gesamte Oberfläche der Reaktionsschicht 7 zu verteilen, und zur Bildung einer Lecithinschicht 8 getrocknet. Ein Abstandhalter 10 und eine Abdeckung 9 wurden in dieser Reihenfolge auf der Lecithinschicht 8 angeheftet, wodurch der Cholesterinsensor hergestellt wurde.
3 ul einer standardisierten Lösung, enthaltend 50 mg/dt an Cholesterin und 150 mg/dl Cholesterinester, wurden als eine Probenflüssigkeit zu dem oben beschriebenen Cholesterinsensor über einen Probenzufuhrweg 12 im Abstandhalter 10 zugesetzt. Die Probenflüssigkeit reichte bis zur Höhe eines Lochs 11, vorgesehen in der Abdeckung 9, und löste die Reaktionsschicht 7. Anschließend legte man 180 s nach Zusetzen der Probenflüssigkeit eine Pulsspannung von +0,5 V auf Basis einer Spannung an der Gegenelektrode 5 des Elektrodensystems 13 anodisch an die Arbeitselektrode 4 an. Ein Antwortstromwert, entsprechend der Gesamtkonzentration an Cholesterinester und Cholesterin, wurde 5 s nach Anlegen der Spannung gemessen.
Darüber hinaus wurden Antwortstromwerte für eine Standardlösung, enthaltend 300 mg/dl an Cholesterinester und 100 mg/dl Cholesterin, bzw. eine Standardlösung, enthaltend 450 mg/dt Cholesterinester und 150 mg/dl Cholesterin, auf dieselbe Weise, wie oben beschrieben, unter Verwendung von frischen Cholesterinsensoren für jede Messung gemessen. Die so erhaltenen Antwortstromwerte waren den jeweiligen Gesamtkonzentrationen des Cholesterinesters und Cholesterins, vorhanden in den Probenflüssigkeiten, proportional.

Beispiel 8

Ein Cholesterinsensor wurde auf dieselbe Weise, wie in Beispiel 7 beschrieben, hergestellt mit der Ausnahme, dass ChE nicht in der Reaktionsschicht 7 enthalten war. Unter Verwendung dieses Cholesterinsensors wurden Reaktionsstromwerte für dieselben Standardlösungen, enthaltend Cholesterinester bzw. Cholesterin, gemessen. Die so erhaltenen Antwortstromwerte waren nur den jeweiligen Konzentrationen an Cholesterin in den Standardlösungen proportional.

Beispiel 9

Ein Cholesterinsensor wurde auf dieselbe Weise, wie in Beispiel 7 beschrieben, hergestellt mit der Ausnahme der Verwendung von Ferroceniumtetrafluoroborat anstelle von Ferroceniumhexafluorophosphat. Unter Verwendung dieses Cholesterinsensors wurden Antwortstromwerte auf dieselbe Weise, wie in Beispiel 7 beschrieben, für Standardlösungen, enthaltend Cholesterinester und Cholesterin in denselben Konzentrationen, wie den in Beispiel 7 beschriebenen, gemessen. Die erhaltenen Antwortstromwerte waren den jeweiligen Gesamtkonzentrationen von Cholesterinester und Cholesterin in den Probenflüssigkeiten proportional.

Beispiel 10

Ein Cholesterinsensor wurde auf dieselbe Weise, wie in Beispiel 7 beschrieben, hergestellt mit der Ausnahme, dass keine ChE in der Reaktionsschicht 7 enthalten war und dass Ferroceniumtetrafluoroborat anstelle des Ferroceniumhexafluorophosphats verwendet wurde. Unter Verwendung dieses Cholesterinsensors wurden Antwortstromwerte gemessen für dieselben Standardlösungen, enthaltend Cholesterinester bzw. Cholesterin. Die so erhaltenen Antwortstromwerte waren nur den jeweiligen Konzentrationen an Cholesterin in den Standardlösungen proportional.
Verschiedene andere Modifikationen werden dem Fachmann ersichtlich sein und können von diesen leicht angestellt werden, ohne vom Bereich dieser Erfindung abzuweichen. Dementsprechend ist es nicht intendiert, dass der Bereich der angefügten Ansprüche auf die vorstehende Beschreibung beschränkt ist, sondern dass die Ansprüche breit ausgelegt werden.

Claims

1. Biosensor, umfassend:

ein isolierendes Substrat (1);

ein Elektrodensystem (13), ausgebildet auf dem isolierenden Substrat (1), das eine Arbeitselektrode (4) und eine Gegenelektrode (5) umfasst, und

eine Reaktionsschicht (7), ausgebildet auf dem isolierenden Substrat (I), die eine Oxidoreduktase und einen Ferrocen-Elektrolyten als Elektronenakzeptor enthält,

worin der Ferricen-Elektrolyt aus einem Ferricinium-Ion und einem Anion besteht, und

worin das Ferricinium-Ion in dem Biosensor vor dem Anlegen eines Potentials bereitgestellt wird.

2. Biosensor gemäß Anspruch 1, in dem eine enzymatische Reaktion spontan zwischen einem biochemischen Substrat, der Oxidoreduktase und dem Ferricinium-Ion des Ferrocen-Elektrölyten auftritt, unabhängig von einem Potential des Elektrodensystems.

3. Biosensor gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Ferrocen-Elektrolyt ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Ferriciniumhexafluorphosphat und Ferriciniumtetrafluoroborate.

4. Biosensor gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die Reaktionsschicht zusätzlich mindestens ein oberflächenaktives Mittel umfasst.

5. Biosensor gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die Reaktionsschicht zusätzlich mindestens ein hydrophiles Polymer umfasst.

6. Biosensor gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die Oxidoreduktase ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Glukoseoxidase, Glukosedehydrogenase, Lactatoxidase, Lactatdehydrogenase, Uricase, Cholesterinoxidase, einer Kombination aus Cholesterinoxidase und Cholesterinesterase; einer Kombination von Glukoseoxidase und Invertase, einer Kombination von Glukoseoxidase, Invertase und Mutarotase, sowie einer Kombination von Fructosedehydrogenase und Invertase.

7. Verfahren zur Quantifizierung der Konzentration eines biochemischen Substrats in einer Probenflüssigkeit durch Verwendung eines Biosensors, umfassend ein isolierendes Substrat (1), ein Elektrodensystem (13), ausgebildet auf dem isolierenden Substrat, das eine Arbeitselektrode (4) und eine Gegenelektrode (5) umfasst, und eine Reaktionsschicht (7), vorgesehen auf dem isolierenden Substrat (1), die eine Oxidoreduktase und einen Ferrocen-Elektrolyten als Elektronenakzeptor enthält, umfassend die Schritte:

Zusetzender Probenflüssigkeit zur Reaktionsschicht; und

Detektieren eines Antwortstromwertes durch Anlegen einer Spannung zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode,

worin der Ferrocen-Elektrolyt aus einem Ferricinium-Ion und einem Anion besteht, und

worin das Ferricium-Ion in dem Biosensor vor der Anlegung eines Potenzials bereitgestellt wird.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, worin der Ferrocen-Elektrolyt ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Ferriciniumhexafluorophosphat und Ferriciniumtetrafluoroborate.

9. Verfahren gemäß Anspruch 7, worin die Reaktionsschicht zusätzlich mindestens ein oberflächenaktives Mittel umfasst.

10. Verfahren gemäß Anspruch 7, worin die Reaktionsschicht zusätzlich mindestens ein hydrophiles Polymer umfasst.

11. Verfahren gemäß Anspruch 7, worin die Oxidoreduktase ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Glukoseoxidase, Glukosedehydrogenase, Lactatoxidase, Lactatdehydrogenase, Uricase, Cholesterinoxidase, einer Kombination aus Cholesterinoxidase und Cholesterinesterase; einer Kombination von Glukoseoxidase und Invertase, einer Kombination von Glukoseoxidase, Invertase und Mutarotase, sowie einer Kombination von Fructosedehydrogenase und Invertase.

12. Verfahren gemäß Anspruch 7, worin das biochemische Substrat ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Glukose, Cholesterin, Milchsäure, Harnsäure und Saccharose.