DE69707985T2 - Kodierende sequenzen des menschlichen brca1-gens - Google Patents

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
• Diese Erfindung bezieht sich auf ein Gen, das mit Brust- und Eierstockkrebs in Verbindung gebracht wurde, wobei festzustellen ist, dass das Gen mutiert ist. Genauer bezieht sich diese Erfindung auf die kodierende Sequenz des von menschlichen Testpersonen isolierten BRCA1-Gens BRCA1(omi1).
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
• Es wurde geschätzt, dass etwa 5-10% der Brustkrebserkrankungen ererbt sind. Rowell, S., et al., American Journal of Human Genetics 55: 861-865 (1994). Das am Chromosom 17 lokalisierte BRCA1 ist das erste Gen, das als Überträger eines erhöhten Risikos von Brust- und Eierstockkrebs identifiziert wurde. Miki et al., Science 266: 66-71 (1994). Es wird angenommen, dass Mutationen in diesem "Tumor-Suppressor"-Gen für rund 45% der ererbten Brustkrebserkrankungen und 80-90% der Familien mit erhöhtem Risiko von früh ausbrechendem Brust- und Eierstockkrebs verantwortlich sind. Easton et al., American Journal of Human Genetics 52: 678-701 (1993).
• Das Lokalisieren einer oder mehrerer Mutationen im BRCA1-Bereich des Chromosoms 17 liefert einen vielversprechenden Zugang zur Verringerung der mit Brust- und Eierstockkrebs zusammenhängenden hohen Häufigkeit und Sterblichkeit durch die Frühentdeckung von Frauen mit hohem Risiko. Sind diese Frauen einmal identifiziert, können sie für rigorosere Vorbeugungsprogramme ins Auge gefasst werden. Das Screenen wird mittels einer Vielfalt an Verfahren, die das Karyotypisieren, Sonden-Verbinden und DNA-Sequenzieren einschließen, durchgeführt.
• Bei der DNA-Sequenzierungtechnologie wird genomische DNA aus Vollblut extrahiert, und die kodierenden Sequenzen des BRCA1-Gens werden amplifiziert. Die kodierenden Sequenzen könnten vollständig sequenziert werden, und die Ergebnisse werden mit der DNA-Sequenz des Gens verglichen. Alternativ können die kodierenden Sequenzen des Probengens mit einer Liste bekannter Mutationen verglichen werden, bevor das Gen vollständig sequenziert und mit einer normalen Sequenz des Gens verglichen wird. Wird eine Mutation in der BRCA1-kodierenden Sequenz gefunden, könnte es möglich sein, dem Individuum durch eine Gentransfertherapie eine erhöhte Expression des Gens zu geben. Es wurde gezeigt, dass der Gentransfer der BRCA1-kodierenden Sequenz in Krebszellen deren Wachstum hemmt und die Tumorbildung von menschlichen Krebszellen bei nackten Mäusen verringert. Jeffrey Holt und seine Kollegen folgern, dass das Produkt einer BRCA1- Expression ein abgesonderter Tumorwachstumsinhibitor ist, wodurch BRCA1 zu einem idealen Gen für Gentherapiestudien gemacht wird. Eine Transduktion von nur einem mäßigen Prozentsatz an Tumorzellen erzeugt offenbar genug Wachstumsinhibitor zum Hemmen aller Tumorzellen. Arteaga, CL, und JT Holt Cancer Research 56: 1098-1103 (1996), Holt, JT et al, Nature Genetics 12: 298-302 (1996).
• Die Beobachtung von Holt et al. dass der BRCA1-Wachstumsinhibitor ein verborgenes Protein ist, führt zur möglichen Anwendung einer Injizierung des Wachstumsinhibitors in den Bereich des Tumors zwecks Tumorunterdrückung.
• Das BRCA1-Gen ist in 24 getrennte Exons geteilt. Die Exons 1 und 4 sind nicht kodierend, da sie nicht Teil des endgültigen funktionellen BRCA1-Proteinprodukts sind. Die BRCA1- kodierende Sequenz erstreckt sich über rund 5600 Basenpaare (bp). Jedes Exon besteht aus 200-400 bp, abgesehen vom Exon 11, das ungefähr 3600 bp enthält. Zur Sequenzierung der kodierenden Sequenz des BRCA1-Gens wird jedes Exon getrennt amplifiziert, und die resultierenden PCR-Produkte werden in Vorwärts- und Rückwärtsrichtung sequenziert. Da das Exon 11 so groß ist, haben wir es in zwölf überlappende PCR-Fragmente von jeweils rund 350 bp geteilt (Segmente "A" bis "L" des BRCA1-Exons 11).
• Es wurde bereits über viele Mutationen und Polymorphismen beim BRCA1-Gen berichtet. Eine World-Wide-Webseite wurde erstellt, um die Erfassung und Charakterisierung von Veränderungen bei Brustkrebsempfänglichkeitsgenen zu erleichtern. Derartige Mutationen im BRCA1 sind über das Breast Cancer Information Core auf:
• http://www.nchgr.nih.gov/dir/lab_transfer/bic zugänglich. Diese Datenseite wurde am 1.November 1995 öffentlich zugänglich. Friend, S. et al. Nature Genetics 11: 238, (1995). Die EP-A-0 705 903 beschreibt Verfahren und Materialien, die zur Isolierung und Erfassung eines für menschlichen Brust- und Eierstockkrebs anfällig machenden Gens (BRCA1) eingesetzt werden, von dem manche mutierten Allele eine Empfänglichkeit für Krebs bedingen.
• Friedman et al., Nature Genetics Dezember 1994, Band 8, S. 399-404, beziehen sich auf die Bestätigung von BRCA1 durch eine Analyse von Keimbahnmutationen, die bei zehn Familien mit Brust- und Eierstockkrebs zusammenhängen.
• Durocher et al., Hum. Mol. Gen, Band 5, Nr. 6, 1996, S. 835-842, beschreiben einen Vergleich von BRCA1-Polymorphismen, seltenen Sequenzvarianten und/oder Fehlsinn- Mutationen bei nicht betroffenen und Brust-/Eierstockkrebs-Populationen.
• Couch et al., Human Mutation, Band 8, 1996, S. 8-18, beziehen sich auf Mutationen und Polymorphismen beim Gen für in der Familie liegenden, früh ausbrechenden Brustkrebs (BRCA1).
• Die Genetik des Brust-/Eierstockkrebssyndroms ist autosomal dominant mit reduzierter Penetranz. In einfachen Worten, dies bedeutet, dass das Syndrom in Familien liegt, so dass beide Geschlechter Träger sein können (nur Frauen bekommen die Krankheit, aber Männer können sie weitergeben), voraussichtlich alle Generationen die Brust-/Eierstockerkrankung oder beides haben, manchmal bei ein- und demselben Individuum auftretend, gelegentlich weibliche Träger entweder jung sterben, bevor sie Zeit haben, eine Erkrankung zu zeigen (und dennoch die Nachkommen sie bekommen) oder sie niemals Brust- oder Eierstockkrebs entwickeln und an Altersschwäche sterben (von letzteren Personen heißt es, dass sie eine "reduzierte Penetranz" haben, da sie niemals Krebs entwickeln). Eine Stammbaumanalyse und eine genetische Beratung sind absolut wesentlich für die richtige Vorbereitung einer Familie vor jedweder Laborarbeit.
• Bis heute ist für den Vergleich mit Patientenproben nur eine einzige kodierende Sequenz für das BRCA1-Gen erhältlich. Diese Sequenz ist als GenBank-Zugangsnummer U14680 erhältlich. Im Stand der Technik besteht daher die Notwendigkeit, eine kodierende Sequenz, welche die beim Großteil der Population gefundene BRCA1-kodierende Sequenz, eine "Consensus-kodierende Sequenz", BRCA1(omi1) Seq. ID. NO. 1, ist, verfügbar zu haben. Eine Consensus-kodierende Sequenz ermöglicht eine leichte Identifizierung von echten Mutationen oder deren leichte Unterscheidung von Polymorphismen. Eine Identifizierung von Mutationen des BRCA1-Gens und -Proteins würde ein breiteres diagnostisches Screenen nach erblichem Brust- und Eierstockkrebs gestatten als zur Zeit möglich. Zwei zusätzliche kodierende Sequenzen wurden isoliert und charakterisiert. Die BRCA1(omi2) Seq. ID. NO. 3- und BRCA1(omi3) Seq. ID. NO. 5-kodierenden Sequenzen sind bei der Diagnose, Gentherapie und beim Herstellen von therapeutischem BRCA1-Protein ebenfalls von Nutzen.
• Eine kodierende Sequenz des BRCA1-Gens, das am gewöhnlichsten immenschlichen Genpool auftritt, ist vorgesehen. Die am gewöhnlichsten auftretende kodierende Sequenz gibt die in einer Testperson am wahrscheinlichsten zu findende Sequenz exakter wieder. Die Verwendung der kodierenden Sequenz BRCA1(omi1) Seq. ID. NO. 1 anstatt der zuvor veröffentlichten BRCA1-Sequenz reduziert die Wahrscheinlichkeit einer Missdeutung einer in der Population gefundenen "Sequenzvariation" (d. h. eines Polymorphismus) als pathologische "Mutation" (d. h. verursacht eine Erkrankung beim Individuum oder setzt das Individuum einem hohen Risiko aus, die Erkrankung zu entwickeln). Bei dem großen Interesse an Untersuchungen der Brustkrebsanfälligkeit ist eine Missdeutung besonders beunruhigend. Personen, die bereits Brustkrebs haben, stellen die klinische Frage: "Wurde meine Krankheit durch eine erbliche genetische Mutation hervorgerufen?" Die Verwandten von Personen mit Brustkrebs stellen die Frage: "Bin ich ebenfalls Träger der Mutation, die meine Verwandte hat? Ist somit mein Risiko erhöht, und sollte ich mich einem rigoroseren Überwachungsprogramm unterziehen."
KURZFASSUNG DER ERHNDUNG
• Die vorliegende Erfindung basiert auf der Isolierung einer kodierenden Sequenz des in menschlichen Individuen gefundenen BRCA1-Gens.
• Ein Ziel der Erfindung besteht im Bereitstellen der am gewöhnlichsten auftretenden kodierenden Sequenz des BRCA1-Gens.
• Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in der Schaffung einer Liste der Kodonpaare, welche an jedem von sieben polymorphen Punkten am BRCA1-Gen auftreten.
• Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht im Bereitstellen der Verhältnisse des Auftretens für die Kodone.
• Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in der Schaffung eines Verfahrens, worin BRCA1 oder Teile davon mit einem oder mehr Oligonucleotidprimern amplifiziert werden.
• Ein weiteres Ziel dieser Erfindung besteht in der Schaffung eines Verfahrens zur Identifizierung von Individuen, die keine Mutation(en) der BRCA1-kodierenden Sequenz tragen und daher keine auf ihren BRCA1-Genen basierende, gesteigerte genetische Empfänglichkeit für Brust- oder Eierstockkrebs haben.
• Ein weiteres Ziel dieser Erfindung besteht in der Schaffung eines Verfahrens zur Identifizierung einer zu einer gesteigerten genetischen Empfänglichkeit für Brust- oder Eierstockkrebs führenden Mutation.
• Im Stand der Technik besteht ein Bedarf an einer Sequenz des BRCA1-Gens und an der Proteinsequenz des BRCA1 sowie an einer genauen Liste von an polymorphen Punkten an einer Sequenz auftretenden Kodonen.
• Ein Fachmann im Untersuchen der genetischen Empfänglichkeit erachtet die vorliegende Erfindung als nützlich für das:
• a) Identifizieren von Individuen mit einem BRCA1-Gen ohne kodierende Mutationen, von denen daher nicht gesagt werden kann, dass sie eine gesteigerte genetische Empfänglichkeit für Brust- oder Eierstockkrebs aus ihren BRCA1-Genen haben;
• b) Vermeiden des Missdeutens von im BRCA1-Gen gefundenen Polymorphismen;
• c) Bestimmen des Vorhandenseins einer zuvor unbekannten Mutation im BRCA1-Gen;
• d) Identifizieren einer Mutation, die die genetische Empfänglichkeit für Brust- oder Eierstockkrebs erhöht;
• e) Untersuchen einer menschlichen Probe des BRCA1-Gens;
• f) Durchführen einer Gentherapie;
• g) Herstellen eines von einem der BRCA1omi-Gene kodierten, wirkenden Tumorwachstumsinhibitorproteins.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
• Wie in Fig. 1 gezeigt, können die alternativen Allele an polymorphen (Variationen, die keine Mutation verursachen) Orten entlang eines Chromosoms als "Haplotyp" in einem Gen wie BRCA1 dargestellt sein. Der BRCA1(omi1)-Haplotyp ist in Fig. 1 mit dunkler Schattierung (die an den Nucleotidorten 2201, 2430, 2731, 3232, 3667, 4427 und 4956 gefundenen alternativen Allele einschließend) gezeigt. Zum Vergleich ist der Haplotyp in GenBank ohne Schattierung gezeigt. Wie aus der Figur ersichtlich, wird der allgemeine "Consensus"- Haplotyp in fünf getrennten, mit dem OMI-Symbol (Ziffern 1-5 von links nach rechts) markierten Chromosomen als intakt vorgefunden. Zwei zusätzliche Haplotypen (BRCA1(omi2) und BRCA(omi3) sind mit gemischter dunkler und heller Schattierung (Ziffern 7 und 9 von links nach rechts) dargestellt. Im Gesamten sind 7 von 10 Haplotypen entlang dem BRCA1-Gen nur einmal vorhanden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG DEFINITIONEN
• Die folgenden Definitionen sind zum Zweck des Verstehens dieser Erfindung dargelegt. "Brust- und Eierstockkrebs" wird vom Fachmann als Brust- und Eierstockkrebs bei Frauen und ebenso Brust- und Prostatakrebs bei Männern einschließend verstanden. BRCA1 hängt mit einer genetischen Empfänglichkeit für ererbten Brust- und Eierstockkrebs bei Frauen und ebenso Brust- und Prostatakrebs bei Männern zusammen. Daher beziehen sich die Ansprüche in diesem Dokument, die Brust- und/oder Eierstockkrebs anführen, auf Brust-, Eierstock- und Prostatakrebs bei Männern und Frauen.
• "Kodierende Sequenz" oder "DNA-kodierende Sequenz" bezieht sich auf jene Abschnitte eines Gens, die zusammengenommen ein Peptid (Protein) kodieren oder dessen Nucleinsäure selbst eine Funktion hat.
• "Protein" oder "Peptid" bezieht sich auf eine Sequenz-Aminosäure, die eine Funktion hat.
• "BRCA1(omi)" bezieht sich zusammenfassend auf die "BRCA1(omi1)"- "BRCA1(omi2)"- und
• "BRCA1(omi3)"-kodierenden Sequenzen.
• "BRCA1(omi1)" bezieht sich auf SEQ. ID. NO. 1, eine kodierende Sequenz für das BRCA1- Gen. Die kodierende Sequenz wurde entdeckt durch Von-einem-zum-anderen-Ende- Sequenzieren von BRCA1-Allelen aus Individuen, die zufällig einer kaukasischen Population entnommen wurden, von der festgestellt wurde, dass sie keine Familiengeschichte an Brust- oder Eierstockkrebs hat. Es wurde festgestellt, dass das sequenzierte Gen keine Mutationen enthält. BRCA1(omi1) wurde mittels Berechnung der Frequenz, mit der die kodierende Sequenz unter den sequenzierten Probeallelen auftrat, als Consensus-Sequenz bestimmt.
• "Primer", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine etwa 20 oder mehr Nucleotide des BRCA1-Gens umfassende Sequenz.
• "Genetische Empfänglichkeit" bezieht sich auf die Empfänglichkeit für Brust- oder Eierstockkrebs aufgrund des Vorhandenseins einer Mutation des BRCA1-Gens.
• Ein "Ziel-Polynucleotid" bezieht sich auf die Nucleinsäure-Sequenz von Interesse, z. B. das BRCA1-kodierende Polynucleotid. Andere Primer, die zur Primerhybridisierung verwendet werden können, werden dem Fachmann bekannt oder von diesem leicht in Erfahrung zu bringen sein.
• "Consensus" bedeutet das in der Population am gewöhnlichsten auftretende.
• "Genomische Consensus-Sequenz" bedeutet das Allel des Zielgens, welches mit der größten Frequenz in einer Population von Individuen mit keinerlei Familiengeschichte einer mit dem Zielgen zusammenhängenden Krankheit auftritt.
• "Im wesentlichen komplementär zu" bezieht sich auf eine Sonde oder auf Primersequenzen, die mit den unter strikten Bedingungen vorliegenden Sequenzen und/oder mit Sequenzen, die eine genügende Homologie mit BRCA1-Sequenzen haben, hybridisieren, so dass die Allelen-spezifische Oligonucleotidsonde oder die Primer mit den BRCA1-Sequenzen, zu denen sie komplementär sind, hybridisieren.
• "Haplotyp" bezieht sich auf eine Reihe von Allelen in einem Gen auf einem Chromosom.
• "Isoliert", wie hierin verwendet, bedeutet im Wesentlichen frei von anderen Nucleinsäuren, Proteinen, Lipiden, Kohlenhydraten oder anderen Materialien, mit denen sie zusammenhängen können. Eine derartige Verbindung besteht typischerweise entweder in zellulärem Material oder in einem Synthesemedium.
• "Mutation" bezieht sich auf einen Basentausch oder einen Gewinn oder Verlust eines Basenpaars/von Basenpaaren in einer DNA-Sequenz, was zu einer DNA-Sequenz führt, die ein nicht-wirkendes Protein oder ein Protein mit einer im Wesentlichen reduzierten oder geänderten Funktion kodiert.
• "Polymorphismus" bezieht sich auf einen Basentausch, der mit keiner bekannten Pathologie zusammenhängt.
• "Tumorwachstumsinhibitorprotein" bezieht sich auf das Protein, das vom BRCA1-Gen kodiert ist. Es wird angenommen, dass das funktionelle Protein das Brust- und Eierstocktumorwachstum unterdrückt.
• Die Erfindung schließt in mehreren ihrer Ausführungsformen Folgendes ein:
• 1. isolierte Consensus-DNA-Sequenz der BRCA1-kodierenden Sequenz, wie in SEQ. ID. NO. 1 dargestellt.
• 2. Consensus-Proteinsequenz des BRCA1-Proteins, wie in SEQ. ID. NO. 2 dargestellt.
• 3. Verfahren zur Identifizierung von Indivuduen mit einem BRCA1-Gen mit einer BRCA1-kodierenden, nicht mit einer Erkrankung zusammenhängenden Sequenz, umfassend:
• (a) Amplifizieren eines DNA-Fragments einer BRCA1-kodierenden Sequenz eines Individuums unter Verwendung eines Oligonucleotidprimers, der speziell mit Sequenzen in dem Gen hybridisiert;
• (b) Sequenzieren des amplifizierten DNA-Fragments durch Didesoxy- Sequenzierung;
• (c) Wiederholen der Schritte (a) und (b), bis die BRCA1-kodierende Sequenz eines Individuums vollständig sequenziert ist;
• (d) Vergleichen der Sequenz des amplifizierten DNA-Fragments mit einer BRCA1(omi)-DNA-Sequenz, SEQ. ID. NO 1;
• (e) Bestimmen, ob jede der folgenden polymorphen Änderungen in der BRCA1- kodierenden Sequenz eines Individuums vorhanden ist oder fehlt:
• - AGC und AGT bei Position 2201,
• - TTG und CTG bei Position 2430,
• - CCG und CTG bei Position 2731,
• - GAA und GGA bei Position 3232,
• - AAA und AGA bei Position 3667,
• - TCT und TCC bei Position 4427 und
• - AGT und GGT bei Position 4956;
• (f) Bestimmen jeglicher Sequenzunterschiede zwischen den BRCA1-kodierenden Sequenzen eines Individuums und SEQ. ID. NO 1, wobei das Vorhandensein der polymorphen Änderungen und das Fehlen einer Änderung jenseits der Positionen 2201, 2430, 2731, 3232, 3667, 4427 und 4956 mit dem Fehlen einer gesteigerten genetischen Empfänglichkeit für Brust- oder Eierstockkrebs, hervorgerufen durch eine BRCA1-Mutation in der BRCA1- kodierenden Sequenz, korreliert.
• 4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei Kodonvariationen in folgenden Frequenzen bzw. in einer Population von krankheitsfreien Individuen auftreten:
• - Bei Position 2201 treten AGC und AGT in Frequenzen von etwa 35-45% bzw. von etwa 55-65% auf;
• - Bei Position 2430 treten TTG und CTG in Frequenzen von etwa 35-45% bzw. von etwa 55-65% auf;
• - Bei Position 2731 treten CCG und CTG in Frequenzen von etwa 25-35% bzw. von etwa 65-75% auf;
• - Bei Position 3232 treten GAA und GGA in Frequenzen von etwa 35-45% bzw. von etwa 55-65% auf;
• - Bei Position 3667 treten AAA und AGA in Frequenzen von etwa 35-45% bzw. von etwa 55-65% auf;
• - Bei Position 4427 treten TCT und TCC in Frequenzen von etwa 45-55% bzw. von etwa 45-55% auf; und
• - Bei Position 4956 treten AGT und GGT in Frequenzen von etwa 35-45% bzw. von etwa 55-65% auf.
• 5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Oligonucleotidprimer mit einer Radiomarkierung, einer Fluoreszenzmarkierung, einer Biolumineszenzmarkierung, einer Chemilumineszenzmarkierung oder einer Enzymmarkierung markiert ist.
• 6. Verfahren zum Erfassen einer gesteigerten genetischen Empfänglichkeit für Brust- und Eierstockkrebs bei einem Individuum, hervorgerufen durch das Vorhandensein einer Mutation in der BRCA1-kodierenden Sequenz, umfassend:
• (a) Amplifizieren eines DNA-Fragments einer BRCA1-kodierenden Sequenz eines Individuums unter Verwendung eines Oligonucleotidprimers, der speziell mit Sequenzen in dem Gen hybridisiert;
• (b) Sequenzieren des amplifizierten DNA-Fragments durch Didesoxy- Sequenzierung;
• (c) Wiederholen der Schritte (a) und (b), bis die BRCA1-kodierende Sequenz eines Individuums vollständig sequenziert ist;
• (d) Vergleichen der Sequenz des amplifizierten DNA-Fragments mit einer BRCA1(omi)-DNA-Sequenz, SEQ. ID. NO 1;
• (e) Bestimmen jeglicher Sequenzunterschiede zwischen den BRCA1-kodierenden Sequenzen von Individuen und SEQ. ID. NO 1 zum Feststellen des Vorhandenseins oder Fehlens von Basenänderungen in der BRCA1- kodierenden Sequenz von Individuen, wobei eine Basenänderung, die keine der folgenden ist:
• - AGC und AGT bei Position 2201,
• - TTG und CTG bei Position 2430,
• - CCG und CTG bei Position 2731,
• - GAA und GGA bei Position 3232,
• - AAA und AGA bei Position 3667,
• - TCT und TCC bei Position 4427 und
• - AGT und GGT bei Position 4956, mit dem Potential einer gesteigerten genetischen Empfänglichkeit für Brust- oder Eierstockkrebs, hervorgerufen durch eine BRCA1-Mutation in der BRCA1-kodierenden Sequenz, korreliert.
• 7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei Kodonvariationen in folgenden Frequenzen bzw. in einer krankheitsfreien Population auftreten:
• - Bei Position 2201 treten AGC und AGT in Frequenzen von etwa 40% bzw. von etwa 55-65% auf;
• - Bei Position 2430 treten TTG und CTG in Frequenzen von etwa 35-45% bzw. von 55-65% auf;
• - Bei Position 2731 treten CCG und CTG in Frequenzen von etwa 25-35% bzw. von 65-75% auf;
• - Bei Position 3232 treten GAA und GGA in Frequenzen von etwa 35-45% bzw. von 55-65% auf;
• - Bei Position 3667 treten AAA und AGA in Frequenzen von etwa 35-45% bzw. von 55-65% auf;
• - Bei Position 4427 treten TCT und TCC in Frequenzen von etwa 45-55% bzw. von 45-55% auf; und
• - Bei Position 4956 treten AGT und GGT in Frequenzen von etwa 35-45% bzw. von 55-65% auf.
• 8. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Oligonucleotidprimer mit einer Radiomarkierung, einer Fluoreszenzmarkierung, einer Biolumineszenzmarkierung, einer Chemilumineszenzmarkierung oder einer Enzymmarkierung markiert ist.
• 9. Verwendung eines mit einer BRCA1-kodierenden Sequenz von SEQ. ID. NO. 1 transformierten Vektors zum Herstellen einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Durchführung einer Gentherapie, umfassend:
• a) Transfizieren einer Krebszelle in vivo mit einer wirksamen Menge des Vektors,
• b) Ermöglichen, dass die Zellen den Vektor aufnehmen, und
• c) Messen einer Verringerung des Tumorwachstums.
• 10. Verwendung eines das BRCA1-Tumorwachstum verhindernden Proteins von SEQ. ID. NO 2 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zum Durchführen einer Proteintherapie, umfassend:
• a) Injizieren eines Patienten mit einer wirksamen Menge des Proteins,
• b) Ermöglichen, dass die Zellen das Protein aufnehmen, und
• c) Messen einer Verringerung des Tumorwachstums.
SEQUENZIEREN
• Jegliche Probe an Nucleinsäure in reiner oder nicht reiner Form kann als Ausgangsnucleinsäure oder -säuren verwendet werden, vorausgesetzt, dass sie die einen polymorphen Locus enthaltende spezifische Nucleinsäuresequenz enthält oder diese enthalten soll. Somit kann der Vorgang zum Beispiel DNA oder RNA einschließlich Boten- RNA amplifizieren, wobei DNA oder RNA einzel- oder doppelsträngig sein kann. Für den Fall, dass RNA als Matrize verwendet werden soll, würden Enzyme und/oder Konditionen, die für das Rücktranskribieren der Matrize zu DNA optimal sind, verwendet werden.
• Zusätzlich kann ein DNA-RNA-Hybrid, der von jedem jeweils einen Strang enthält, verwendet werden. Eine Mischung von Nucleinsäuren kann auch eingesetzt werden, oder die unter Verwendung desselben oder anderer Primer in einer vorhergehenden Amplifizierungsreaktion hergestellten Nucleinsäuren können derart verwendet werden. Siehe Tabelle 11. Die spezifische zu amplifizierende Nucleinsäuresequenz, d. h. der polymorphe Locus, kann ein Bruchteil eines größeren Moleküls sein oder kann anfänglich als getrenntes Molekül vorliegen, so dass die spezifische Sequenz die gesamte Nucleinsäure bildet. Es ist nicht notwendig, dass die zu amplifizierende Sequenz anfänglich in reiner Form vorliegt; sie kann ein kleiner Bruchteil einer komplexen Mischung sein, wie in der gesamten menschlichen DNA enthalten.
• Hierbei verwendete DNA kann aus einer Körperprobe wie Blut, Gewebematerial und dergleichen mittels einer Vielfalt an Techniken wie jener, die von Maniatis, et al. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, S. 280-281, 1982, beschrieben ist, extrahiert werden. Ist die extrahierte Probe unrein, so kann sie vor der Amplifizierung mit einer Menge eines Reagens behandelt werden, das für das Öffnen der Zellen oder der Tierzellmembrane der Probe oder für das Freilegen und/oder Trennen des Strangs/der Stränge der Nucleinsäure(n) wirksam ist. Dieser Lyse- und Nucleinsäuredenaturierungsschritt zum Freilegen und Trennen der Stränge ermöglicht eine viel leichtere Amplifizierung.
• Die Desoxyribonucleotidtriphosphate dATP, dCTP, dGTP und dTTP werden der Synthesemischung entweder getrennt oder zusammen mit den Primern in passenden Mengen beigegeben, und die resultierende Lösung wird etwa 1 bis 10 Minuten lang, vorzugsweise 1 bis 4 Minuten lang, auf etwa 90º-100ºC erhitzt. Nach dieser Erhitzungsperiode wird die Lösung erkalten gelassen, was für die Primerhybridisierung vorzuziehen ist. Ein zum Auslösen der Primerausdehnungsreaktion geeigneter Wirkstoff (hierin "Polymerisationswirkstoff" genannt) wird der erkalteten Mischung beigegeben, und die Reaktion wird unter im Stand der Technik bekannten Bedingungen eintreten gelassen. Der Polymerisationswirkstoff kann auch zusammen mit dem anderen Reagens beigegeben werden, wenn er hitzebeständig ist. Diese Synthese- (oder Amplifizierungs-)Reaktion kann bei Raumtemperatur bis zu einer Temperatur, über der der Polymerisationswirkstoff nicht mehr wirkt, auftreten. Wird beispielsweise DNA-Polymerase als Wirkstoff verwendet, so liegt die Temperatur somit im Allgemeinen nicht über etwa 40ºC. Am geeignetsten tritt die Reaktion bei Raumtemperatur auf.
• Die zur Durchführung dieser Erfindung verwendeten Primer umfassen Oligonucleotide von ausreichender Länge und geeigneter Sequenz zur Schaffung einer Einleitung der Polymerisation. Der Synthese förderliche Umweltbedingungen schließen das Vorhandensein von Nucleosidtriphosphaten und eines Polymerisationswirkstoffs wie DNA-Polymerase sowie eine geeignete Temperatur und einen geeigneten pH-Wert ein. Der Primer ist zwecks maximaler Wirksamkeit bei der Amplifizierung vorzugsweise einzelsträngig, kann aber doppelsträngig sein. Bei Doppelsträngigkeit wird der Primer zuerst dahingehend behandelt, dass seine Stränge getrennt werden, bevor er zur Herstellung von Ausdehnungsprodukten verwendet wird. Der Primer muss ausreichend lang sein, um die Synthese von Ausdehnungsprodukten unter dem Vorhandesein des die Polymerisation stimulierenden Wirkstoffs zu primen. Die genaue Primerlänge hängt von vielen Faktoren ab, einschließlich der Temperatur, des Puffers und der Nucleotidzusammensetzung. Der Oligonucleotidprimer enthält typischerweise 12-20 oder mehr Nucleotide, obwohl er weniger Nucleotide enthalten kann.
• Zur Durchführung dieser Erfindung verwendete Primer sind dazu ausgelegt, zu jedem Strang des genomischen Locus, der zu amplifizieren ist, im Wesentlichen komplementär zu sein. Dies bedeutet, dass die Primer ausreichend komplementär sein müssen, um unter Bedingungen, die dem Polymerisationswirkstoff das Wirken ermöglichen, mit ihren jeweiligen Strängen zu hybridisieren. In anderen Worten, die Primer sollten mit den die Mutation flankierenden 5'- und 3'-Sequenzen eine ausreichende Komplementärität haben, um mit diesen zu hybridisieren und eine Amplifizierung des genomischen Locus zu ermöglichen.
• Erfindungsgemäße Oligonucleotidprimer werden im Amplifizierungsvorgang eingesetzt, der eine enzymatische Kettenreaktion ist, die exponentielle Mengen an polymorphem Locus in Bezug auf die Anzahl von involvierten Reaktionsschritten liefert. Typischerweise ist ein Primer zum negativen (-) Strang des polymorphen Locus komplementär, während der andere zum positiven (+) Strang komplementär ist. Ein Wiederverbinden der Primer mit denaturierter Nucleinsäure, gefolgt von einer Ausdehnung mit einem Enzym, wie dem großen Fragment einer DNA-Polymerase I (Klenow) und von Nucleotiden, führt zu neu synthetisierten + und -Strängen, die die polymorphe Ziel-Locussequenz enthalten. Da diese neu synthetisierten Sequenzen auch Matrizen sind, führen wiederholte Zyklen aus Denaturieren, Primer-Wiederverbinden und Ausdehnen zu einer exponentiellen Produktion des durch die Primer definierten Bereichs (d. h. der polymorphen Ziel-Locussequenz). Das Produkt der Kettenreaktion ist ein diskreter Nucleinsäuredoppelstrang mit Termini, die den Enden der eingesetzten spezifischen Primer entsprechen.
• Die erfindungsgemäßen Oligonucleotidprimer können unter Anwendung jedes geeigneten Verfahrens, wie der herkömmlichen Phosphotriester- und Phosphodiesterverfahren oder automatisierter Ausführungsformen davon, hergestellt werden. Bei einer solchen automatisierten Ausführungsform werden Diethylphosphoramidite als Ausgangsmaterialien verwendet und können wie von Beaucage, et al., Tetrahedron Letters, 22: 1859-1862, 1981 beschrieben, synthetisiert werden. Ein Verfahren zum Synthetisieren von Oligonucleotiden auf einem modifizierten festen Träger ist im U.S.-Patent Nr. 4,458,066 beschrieben. Der Polymerisationswirkstoff kann jegliche Verbindung oder jegliches System sein, die bzw. das für die Bewerkstelligung der Synthese von Primer-Ausdehnungsprodukten einschließlich Enzymen funktioniert. Zu diesem Zweck geeignete Enzyme umfassen beispielsweise E. coli DNA-Polymerase I, das Klenow-Fragment einer E. coli DNA-Polymerase, mutierte Polymeraseproteine, Reverse Transcriptase, andere Enzyme einschließlich hitzebeständiger Enzyme (d. h. jene Enzyme, die eine Primer-Ausdehnung durchführen, nachdem sie Temperaturen ausgesetzt waren, die ausreichend erhöhnt waren, um eine Denaturierung zu bewirken), so wie Taq-Polymerase. Ein geeignetes Enzym erleichtert die Verbindung der Nucleotide in richtiger Weise, um die Primer-Ausdehnungsprodukte, die zu jedem Nucleinsäurestrang vom polymorphen Locus komplementär sind, zu bilden. Im Allgemeinen wird die Synthese am 3'-Ende jedes Primers eingeleitet und schreitet in 5'-Richtung entlang dem Martizenstrang fort, bis die Synthese aufhört, wobei Moleküle von verschiedenen Längen produziert werden.
• Der neu synthetisierte Strang and sein komplementärer Nucleinsäurestrang bilden unter den obenstehend beschriebenen Hybridisierungsbedingungen ein doppelsträngiges Molekül, und dieser Hybrid wird in den nachfolgenden Schritten des Vorgangs verwendet. Im nächsten Schritt wird das neu synthetisierte doppelsträngige Molekül Denaturierungsbedingungen unterzogen, wobei irgendeiner der obenstehend beschriebenen Vorgänge zur Schaffung von einzelsträngigen Molekülen eingesetzt wird.
• Die Schritte des Denaturierens, des Wiederverbindens und der Synthese des Ausdehnungsprodukts können so oft wie notwendig wiederholt werden, um die polymorphe Ziel-Locus-Nucleinsäuresequenz im für die Erfassung notwendigen Ausmaß zu amplifizieren. Die Menge der produzierten spezifischen Nucleinsäuresequenz wächst in exponentieller Weise an. Die Amplifizierung ist in PCR. A Practical Approach, ILR Press, Hgb. M. J. McPherson, P. Quirke und G. R. Taylor, 1992, beschrieben.
• Die Amplifizierungsprodukte können durch die Southern-Blots-Analyse ohne Verwendung radioaktiver Sonden ermittelt werden. In einem solchen Vorgang wird beispielsweise eine kleine Probe von DNA, die einen sehr geringen Anteil an der Nucleinsäuresequenz des polymorphen Locus enthält, amplifiziert und mittels einer Southern-Blotting-Technik oder auf ähnliche Weise analysiert, wobei die Dot-Blot-Analyse angewendet wird. Die Verwendung von nicht radioaktiven Sonden oder Markierungen wird durch das hohe Level des amplifizierten Signals erleichtert. Alternativ können zur Ermittlung der amplifizierten Produkte verwendete Sonden direkt oder indirekt ermittelbar markiert werden, zum Beispiel mit einem Radioisotop, einer fluoreszierenden Verbindung, einer biolumineszierenden Verbindung, einer chemilumineszierenden Verbindung, einem Metallchelator oder einem Enzym. Der durchschnittliche Fachmann kennt andere geeignete Markierungen zum Binden an die Sonde oder kann solche durch routinemäßiges Experimentieren ermitteln.
• Durch die erfindungsgemäßen Verfahren amplifizierte Sequenzen können weiters ausgewertet, erfasst, geklont, sequenziert und dergleichen werden, entweder in Lösung oder nach dem Binden an einen festen Träger, u. zw. durch jegliches Verfahren, das üblicherweise auf die Erfassung einer spezifischen DNA-Sequenz angewendet wird, wie die PCR- Oligomerrestriktion (Saiki, et. al., Bio/Technology, 3: 1008-1012, 1985), die Alellenspezifische Oligonucleotid(ASO)-Sondenanalyse (Conner, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 278, 1983), Oligonucleotid-Ligasierungsuntersuchungen (OLAs) (Landgren, ei. a/l, Science, 241: 1007, 1988) und dergleichen. Molekulare Techniken zur DNA-Analyse wurden besprochen (Landgren, et. al., Science, 242: 229-237, 1988).
• Vorzugsweise erfolgt das Verfahren zum Amplifizieren durch PCR wie hierin beschrieben und allgemein vom durchschnittlichen Fachmann angewendet. Alternative Verfahren zur Amplifizierung wurden beschrieben und können ebenfalls eingesetzt werden, solange der BRCA1-Locus, der unter Verwendung von erfindungsgemäßen Primern durch PCR amplifiziert wurde, gleichermaßen durch die alternativen Mittel amplifiziert wird. Derartige alternative Amplifizierungssysteme schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, eine selbsterhaltende Sequenzreplikation ein, die mit einer kurzen Sequenz von RNA, das von Interesse ist, und einem T7-Promotor beginnt. Eine Reverse Transcriptase kopiert die RNA in cDNA und baut die RNA ab, gefolgt von einer einen zweiten Strang von DNA polymerisierenden Reverse Transcriptase. Eine weitere Nucleinsäureamplifizierungstechnik ist eine auf der Nucleinsäuresequenz basierende Amplifizierung (NASBA), die eine Reverse Transcription und eine T7-RNA-Polymerase anwendet und zwei Primer beinhaltet, um auf ihr Zyklusschema abzuzielen. Die NASBA kann entweder mit DNA oder RNA beginnen und mit einer von beiden aufhören und amplizifiert in 60 bis 90 Minuten bis zu 10&sup8; Kopien. Alternativ kann durch ligasierungsaktivierte Transcription (LAT) Nucleinsäure amplifiziert werden. Die LAT funktioniert von einer einzelsträngigen Matrize mit einem einzelnen Primer, der teilweise einzelsträngig und teilweise doppelsträngig ist. Eine Amplifizierung wird durch Ligasieren einer cDNA zum Promotor-Oligonucleotid eingeleitet, und innerhalb einiger Stunden ist die Amplifizierung 10&sup8;- bis 10&sup9;-fach. Ein weiteres beim erfindungsgemäßen Verfahren nützliches Amplifizierungssystem ist das QB- Replikasesystem. Das QB-Replikasesystem kann verwendet werden, indem eine MDV-1 genannte RNA-Sequenz an RNA, die zu einer DNA-Sequenz, die von Interesse ist, komplementär ist, angebracht wird. Nach Mischen mit einer Probe findet die Hybrid-RNA ihr Complement unter den mRNAs und Verbindungen der Probe, wodurch die Replikase zur Kopierung der Sequenz entlang der Kennzeichnung, die von Interesse ist, aktiviert wird. Eine weitere Nucleinsäureamplifizierungstechnik, die Ligasekettenreaktion (LCR), funktioniert, indem zwei verschieden markierte Hälften einer Sequenz, die von Interesse ist, verwendet werden, welche bei Vorhandensein der benachbarten Sequenz in einer Probe mittels Ligase kovalent verbunden werden, wobei ein neues Ziel gebildet wird. Die Nucleinsäureamplifizierungstechnik der Reparaturkettenreaktion (RCR) verwendet zwei komplementäre und Ziel-spezifische Oligonucleotid-Sondenpaare, hitzebeständige Polymerase und Ligase und DNA-Nucleotide zur geometrischen Amplifizierung von ins Auge gefassten Sequenzen. Ein 2-Basenspalt trennt die Oligonucleotid-Sondenpaare, und die RCR füllt und verbindet den Spalt, wobei sie eine DNA-Reparatur imitiert. Eine Nucleinsäureamplifizierung mittels Strangverschiebungsaktivierung (SDA) verwendet einen kurzen Primer, der eine Erkennungsstelle für hincII mit einem kurzen Überhang am 5'-Ende, das sich an Ziel-DNA bindet, enthält. Eine DNA-Polymerase füllt den dem Überhang gegenüberliegenden Teil des Primers mit schwefelhältigen Adeninanaloga. Hinchl wird hinzugefügt, schneidet jedoch nur den nicht modifizierten DNA-Strang. Eine DNA- Polymerase ohne 5'-Exonucleaseaktivität tritt am Ort des Einzelstrangbruchs ein und beginnt mit der Polymerisation, wobei sie den anfänglichen Primerstrang stromabwärts verschiebt und einen neuen baut, der als weiterer Primer dient. Die SDA liefert in 2 Stunden bei 37ºC eine mehr als 10&sup7;-fache Amplifizierung. Anders als die PCR und LCR erfordert die SDA keinen instrumentierten Temperaturablauf.
• Ein weiteres Verfahren ist ein Vorgang zur Amplifizierung von Nucleinsäuresequenzen aus einer DNA- oder RNA-Matrize, die gereinigt sein kann oder in einer Mischung aus Nucleinsäuren existieren kann. Die resultierenden Nucleinsäuresequenzen können exakte Kopien der Matrize oder modifiziert sein. Der Vorgang hat Vorteile gegenüber der PCR, da er die Genauigkeit des Kopierens einer spezifischen Nucleinsäuresequenz steigert und die effizientere Erfassung einer bestimmten Punktmutation in einer einzigen Untersuchung ermöglicht. Eine Zielnucleinsäure wird bei gleichzeitiger Vermeidung einer Strangverschiebung enzymatisch amplifiziert. Drei Primer werden verwendet. Ein erster Primer ist zum ersten Ende des Ziels komplementär. Ein zweiter Primer ist zum zweiten Ende des Ziels komplementär. Ein dritter Primer ist dem ersten Ende des Ziels ähnlich und ist im Wesentlichen zu zumindest einem Abschnitt des ersten Primers komplementär, so dass die zur Base am 5'-Ende des ersten Primers komplementäre Position des dritten Primers bei Hybridisierung des dritten Primers an den ersten Primer eine Modifikation enthält, die eine Strangverschiebung im Wesentlichen verhindert. Dieses Verfahren ist im U.S.-Patent 5,593,840 von Bhatnagar et al., 1997, im Detail beschrieben. Obwohl die PCR das bevorzugte erfindungsgemäße Amplifizierungsverfahren ist, können diese anderen Verfahren auch zur Amplifizierung des BRCA1-Locus, wie beim erfindungsgemäßen Verfahren beschrieben, angewendet werden.
• Die BRCA1(omi)DNA-kodierenden Sequenzen wurden durch Von-einem-zum-anderen-Ende- Sequenzieren der BRCA1-Allele von fünf Testpersonen in obenstehend beschriebener Weise erhalten, gefolgt von einer Analyse der erhaltenen Daten. Die erhaltenen Daten gaben uns die Gelegenheit, sieben zuvor veröffentlichte Polymorphismen auszuwerten und die Frequenz des Auftretens von alternativen Kodonen zu bestätigen oder, wo notwendig, zu korrigieren.
GENTHERAPIE
• The kodierenden Sequenzen können zur Gentherapie verwendet werden.
• Eine Vielfalt an Verfahren zum Gentransfer ist bekannt, von denen jedes zur Verwendung verfügbar sein könnte.
Direkte Injizierung von rekombinierter DNA in vivo
• 1. Direkte Injizierung von "nackter" DNA direkt mit Spritze und Nadel in ein spezifisches Gewebe, durch ein vaskuläres Bett eingeflößt oder durch einen Katheder in Endothelzellen übertragen.
• 2. Direkte Injizierung von DNA, die in künstlich erzeugten Lipidbläschen enthalten ist.
• 3. Direkte Injizierung von DNA, die mit einer Ziel-Struktur wie einem Antikörper konjugiert ist.
• 4. Direkte Injizierung durch Partikelbeschuss, wobei die DNA auf Goldpartikel aufgetragen und in die Zellen geschossen wird.
Menschliche künstliche Chromosome
• Dieser neuartige Ansatz der Genzuführung schließt die Verwendung von menschlichen Chromosomen ein, die zerlegt wurden, um nur die für die Replikation wesentlichen Komponenten und die für den Transfer erwünschten Gene zu enthalten.
Receptor-vermittelter Gentransfer
• DNA wird an ein Ziel-Molekül gekoppelt, das sich an spezifische Zellen-Oberflächen- Receptoren bindet, wodurch eine Endocytose und ein Transfer der DNA in Säugetierzellen ausgelöst wird. Eine derartige Technik verwendet Poly-L-Lysin zur Ankopplung von Asialoglycoprotein an DNA. Ein Adenovirus wird dem Komplex ebenfalls beigefügt, um die Lysosomkörperchen zu zerbrechen und somit der DNA zu ermöglichen, den Abbau zu vermeiden und sich zum Zellkern zu bewegen. Eine intravenöse Infusion dieser Partikel führte zum Gentransfer in Leberzellen.
REKOMBINIERTE VIRUSVEKTOREN
• Mehrere Vektoren werden bei der Gentherapie verwendet. Unter diesen befinden sich die Vektoren des Moloney Murine Leukemia Virus (MoMLV), die Adenovirus-Vektoren, die Vektoren des Adeno-assoziierten Virus(AAV), die Vektoren des Herpes simplex-Virus (HSV), die Pockenvirus-Vektoren und die Vektoren des menschlichen Immunschwächevirus (HIV).
GENAUSTAUSCH UND -REPARATUR
• Die ideale genetische Manipulation zur Behandlung einer genetischen Erkrankung wäre der tatsächliche Austausch des defekten Gens durch eine normale Kopie des Gens. "Homologe Rekombination" ist der Begriff, der für das Ausschalten eines Abschnitts von DNA und Ersetzen desselben durch ein neues Stück verwendet wird. Durch diese Technik kann das defekte Gen durch ein normales Gen ersetzt werden, das ein wirkendes BRCA1- Tumorwachstumsinhibitorprotein exprimiert.
• Eine vollständige Beschreibung einer Gentherapie ist auch in "Gene Therapy A Primer For Physicians", 2. Ausgabe, von Kenneth W. Culver, M. D., Publ. Mary Ann Liebert Inc. (1996), zu finden. Zwei Gentherapieprotokolle für BRCA1 werden vom Recombinant DNA Advisory Committee für Jeffrey T. Holt et al. bewilligt. Sie sind als 9602-148 und 9603-149 aufgelistet und beim NIH erhältlich. Das isolierte BRCA1-Gen kann aus Amplifizierungsprodukten synthetisiert oder konstruiert und in einen Vektor wie den LXSN- Vektor eingefügt werden.
• Die BRCA1-Aminosäure- und Nucleinsäuresequenz kann zur Herstellung von diagnostischen Sonden und Antikörpern verwendet werden. Markierte diagnostische Sonden können von jedem Hybridisierungsverfahren angewendet werden, um den Anteil an BRCA1-Protein in einem Serum oder einer lysierten Zellsuspension eines Patienten oder in einer Zellprobe mit fester Oberfläche zu bestimmen.
• Die BRCA1-Aminosäuresequenz kann zur Schaffung eines Grads an Schutz vor dem Brust- oder Eierstockkrebsrisiko für Patienten oder zur Verringerung der Größe eines Tumors verwendet werden. Verfahren zum Herstellen und Extrahieren von Proteinen sind wohlbekannt. Itakura et al. U.S.-Patente 4,704,362, 5,221,619 und 5,583,013. Es wurde gezeigt, dass BRCA1 abgesondert wird. Jensen, R. A. et al. Nature Genetics 12: 303-308 (1996).
BEISPIEL 1 Bestimmung der kodierenden Sequenz eines BRCA1(omi)-Gens von fünf Individuen MATERIALIEN UND VERFAHREN
• Ungefähr 150 Freiwillige wurden gescreent, um Individuen mit keiner Vorgeschichte von Krebs in ihrer unmittelbaren Familie zu identifizieren (d. h. Verwandte ersten und zweiten Grades). Jede Person wurde gebeten, einen Fragebogen zum Vorscreenen nach erblichem Krebs auszufüllen. Siehe Tabelle I unten. Von diesen wurden fünf für ein Von-einem-zum- anderen-Ende-Sequenzieren ihres BRCA1-Gens zufällig ausgewählt. Ein Verwandter ersten Grades ist ein Elternteil, Geschwisternteil oder Nachkomme. Ein Verwandter zweiten Grades ist eine Tante, ein Onkel, ein Großelternteil, ein Enkelkind, eine Nichte, ein Neffe oder eine Halbschwester bzw. ein Halbbruder.
TABELLE 1 Fragebogen zum Vorscreenen nach erblichem Krebs Teil A: Beantworten Sie die folgenden Fragen über Ihre Familie
• 1. Wurde nach Ihrem Wissen bei jemandem in Ihrer Familie eine sehr spezifische erbliche Dickdarmerkrankung, genannt "familiengebundene adenomatöse Polypose" (FAP), diagnostiziert?
• 2. Wurde nach Ihrem Wissen bei Ihnen oder einer Ihrer Tanten vor dem Alter von 35 Brustkrebs diagnostiziert?
• 3. Hatten Sie eine entzündliche Darmerkrankung, auch Morbus Crohn oder Colitis ulcerosa genannt, mehr als 7 Jahre lang? Teil B: Beziehen Sie sich auf die untenstehende Liste an Krebserkrankungen nur beim Beantworten von Frauen in Teil B
• 4. Hatten Ihre Mutter oder Ihr Vater, Ihre Schwestern oder Brüder oder Ihre Kinder irgendeine der aufgelisteten Krebserkrankungen?
• 5. Wurden bei den Brüdern oder Schwestern Ihrer Mutter oder den Eltern Ihrer Mutter mehr als eine der Krebserkrankungen aus der obenstehenden Liste diagnostiziert?
• 6. Wurden bei den Brüdern oder Schwestern Ihres Vaters oder den Eltern Ihres Vaters mehr als eine der Krebserkrankungen aus der obenstehenden Liste diagnostiziert?
Teil C: Beziehen Sie sich auf die untenstehende Verwandtenliste nur beim Beantworten von Fragen in Teil C
• Sie Ihre Mutter
• Ihre Schwestern oder Brüder die Schwestern oder Brüder Ihrer Mutter (Tanten und Onkeln mütterlicherseits)
• Ihre Kinder die Eltern Ihrer Mutter (Großeltern mütterlicherseits)
• 7. Wurden bei diesen Verwandten 2 oder mehr identische Arten von Krebs diagnostiziert? Zählen Sie nicht den "einfachen" Hautkrebs, auch Basalzellen- oder Schuppenzellenhautkrebs genannt.
• 8. Gibt es von irgendeiner Krebserkrankung eine Gesamtheit von 4 oder mehr in der obenstehenden Verwandtenliste, abgesehen von "einfachen" Hautkrebserkrankungen?
Teil D: Beziehen Sie sich auf die untenstehende Verwandtenliste nur beim Beantworten von Fragen in Teil D
• Sie Ihr Vater
• Ihre Schwestern oder Brüder die Schwestern oder Brüder Ihres Vaters (Tanten und Onkeln väterlicherseits)
• Ihre Kinder die Eltern Ihres Vaters (Großeltern väterlicherseits)
• 9. Wurden bei diesen Verwandten 2 oder mehr identische Arten von Krebs diagnostiziert? Zählen Sie nicht den "einfachen" Hautkrebs, auch Basalzellen- oder Schuppenzellenhautkrebs genannt.
• 10. Gibt es von irgendeiner Krebserkrankung eine Gesamtheit von 4 oder mehr in der obenstehenden Verwandtenliste, abgesehen von "einfachen" Hautkrebserkrankungen?
• Copyright 1996, OncorMed, Inc.
• Genomische DNA wurde aus den weißen Blutkörperchen von fünf Testpersonen, die durch Analyse ihrer Antworten auf die obenstehenden Fragen ausgewählt wurden, isoliert. Nach einer Polymerase-Kettenreaktionsamplifizierung wurde eine Didesoxy-Sequenzanalyse durchgeführt.
• Alle Exons des BRCA1-Gens wurden mittels asymmetrischer Amplifizierung und unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) einer direkten Didesoxy-Sequenzanalyse unterzogen, um ein aus dieser DNA-Probe amplifiziertes, einzelsträngiges Produkt zu erzeugen. Shuldiner, et al., Handbook of Techniques in Endocrine Research, S. 457-486, DePablo, F., Scanes, C., Hgb., Academic Press, Inc., 1993. Fluoreszierender Farbstoff wurde unter Verwendung des Taq Dye Terminator® Kits (Perkin-Elmer cat# 401628) zum automatisierten Sequenzieren angebracht. Das DNA-Sequenzieren wurde auf einem automatisierten Modell 377®-Sequenzierer von Applied Biosystems, Inc. (ABI) sowohl in Vorwärts- als auch in Rückwärtsrichtung durchgeführt. Die zur Analyse der resultierenden Daten verwendete Software war durch ABI erworbene Sequence Navigator®-Software.
1. Polymerase-Kettenreaktion(PCR)-Amplifizierung
• Aus den weißen Blutkörperchen von fünf Testpersonen extrahierte genomische DNA (100 Nanogramm). Jede der fünf Proben wurde von einem zum anderen Ende sequenziert. Jede Probe wurde in einem letztendlichen Volumen von 25 Mikroliter, enthaltend 1 Mikroliter (100 Nanogramm) genomische DNA, 2,5 Mikroliter 10X PCR-Puffer (100 mM Iris, pH- Wert 8,3, 500 mM KCl, 1,2 mM MgCl&sub2;), 2,5 Mikroliter 10X dNTP-Gemisch (jeweils 2 mM Nucleotid), 2,5 Mikroliter Vorwärtsprimer, 2,5 Mikroliter Reverse-Primer und 1 Mikroliter Taq-Polymerase (5 Einheiten) und 13 Mikroliter Wasser, amplifiziert.
• Die Primer in der untenstehenden Tabelle 11 wurden zur Durchführung einer Amplifizierung der verschiedenen Abschnitte der BRCA1-Genproben verwendet. Die Primer wurden auf einem DNA/RNA-Modell 394®-Synthetisierer synthetisiert. TABELLE II BRCA1-PRIMER UND SEQUENZIERUNGSDATEN
• 35 Zyklen wurden durchgeführt, wobei jeder aus Denaturieren (95ºC; 30 Sekunden), Wiederverbinden (55ºC, 1 Minute) und Verlängern (72ºC, 90 Sekunden) bestand, abgesehen vom ersten Zyklus, in dem die Denaturierungszeit auf 5 Minuten erhöht wurde, und vom letzten Zyklus, in dem die Verlängerungszeit auf 5 Minuten erhöht wurde. Die PCR-Produkte wurden unter Verwendung von Qia-quick®-PCR-Reinigungskits (Qiagen cat# 28104; Chatsworth, CA) gereinigt. Ertrag und Reinheit des PCR-Produkts wurden spektralphotometrisch bei OD&sub2;&sub6;&sub0; auf einem Beckman DU 650-Spektralphotometer bestimmt.
2. Didesoxy-Sequenzanalyse
• Fluoreszierender Farbstoff wurde unter Verwendung des Taq Dye Terminator® Kits (Perkin-Elmer cat# 401628) zum automatisierten Sequenzieren an den PCR-Produkten angebracht. Das DNA-Sequenzieren wurde auf einem automatisierten Modell 377®- Sequenzierer von Applied Biosystems, Inc. (ABI) Foster City, CA., sowohl in Vorwärts- als auch in Rückwärtsrichtung durchgeführt. Die zur Analyse der resultierenden Daten verwendete Software war durch ABI erworbene "Sequence Navigator®-Software".
3. ERGEBNISSE
• Unterschiede bei den Nucleinsäuren der zehn Allele von fünf Individuen wurden an sieben Standorten am Gen gefunden. Die Veränderungen und ihre Positionen sind in der untenstehenden Tabelle III zu finden. TABELLE III LISTENTYPISIERUNG
• Die Tabellen 3 und 4 stellen einen Aspekt der Erfindung dar, u. zw. Sets von zumindest zwei alternativen Kodonpaaren, wobei die Kodonpaare in folgenden Frequenzen bzw. in einer Population von krankheitsfreien Individuen auftreten:
• - Bei Position 2201 treten AGC und AGT in Frequenzen von etwa 35-45% bzw. von etwa 55-65% auf;
• - Bei Position 2430 treten TTG und CTG in Frequenzen von etwa 35-45% bzw. von etwa 55-65% auf;
• - Bei Position 2731 treten CCG und CTG in Frequenzen von etwa 25-35% bzw. von etwa 65-75% auf;
• - Bei Position 3232 treten GAA und GGA in Frequenzen von etwa 35-45% bzw. von etwa 55-65% auf;
• - Bei Position 3667 treten AAA und AGA in Frequenzen von etwa 35-45% bzw. von etwa 55-65% auf;
• - Bei Position 4427 treten TCT und TCC in Frequenzen von etwa 45-55% bzw. von etwa 45-55% auf; und
• - Bei Position 4956 treten AGT und GGT in Frequenzen von etwa 35-45% bzw. von etwa 55-65% auf.
• Die Daten zeigen dies für jede der Proben. Das BRCA1-Gen ist außer im Bereich von sieben Polymorphismen identisch. Diese polymorphen Bereiche zusammen mit ihren Standorten, die Aminosäuregruppen jedes Kodons, die Frequenz ihres Auftretens und die von jedem Kodon kodierte Aminosäure sind in der untenstehenden Tabelle IV zu finden. TABELLE IV KODON- UND BASENVERÄNDERUNGEN AN SIEBEN POLYMORPHEN STELLEN DES BRCA1-GENS
• ²Bezugsziffern entsprechen der untenstehenden Referenzliste.
BEISPIEL 2 Bestimmung eines Individuums unter Verwendung von BRCA1(omi) und der sieben Polymorphismen als Referenz
• Ein Fachmann im Untersuchen der genetischen Empfänglichkeit erachtet die vorliegende Erfindung als nützlich für das:
• a) Identifizieren von Individuen mit einem BRCA1-Gen, die daher keine gesteigerte genetische Empfänglichkeit für Brust- oder Eierstockkrebs aus einer BRCA1-Mutation haben;
• b) Vermeiden von Missdeutungen von im BRCA1-Gen gefundenen Polymorphismen.
• Das Sequenzieren wird wie in Beispiel 1 unter Verwendung einer Blutprobe vom fraglichen Patienten durchgeführt. Eine BRCA1(omi)-Sequenz wird jedoch als Referenz verwendet, und die polymorphen Stellen werden mit den Nucleinsäuresequenzen verglichen, die obenstehend für Kodone an jeder polymorphen Stelle aufgelistet sind. Eine Probe ist eine, die mit einer BRCA1(omi)-Sequenz vergleichbar ist und eine der an jeder der polymorphen Stellen auftretenden Basenvariationen enthält. Die an jeder der polymorphen Stellen auftretenden Kodone sind im Folgenden als Referenz gepaart.
• - AGC und AGT bei Position 2201,
• - TTG und CTG bei Position 2430,
• - CCG und CTG bei Position 2731,
• - GAA und GGA bei Position 3232,
• - AAA und AGA bei Position 3667,
• - TCT und TCC bei Position 4427 und
• - AGT und GGT bei Position 4956.
• Die Verfügbarkeit dieser polymorphen Paare schafft die zusätzliche Sicherheit, dass ein Fachmann die polymorphen Änderungen richtig auswerten kann, ohne eine Änderung mit einer Mutation zu verwechseln.
• Exon 11 des BRCA1 -Gens wird mittels asymmetrischer Amplifizierung und unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) einer direkten Didesoxy-Sequenzanalyse unterzogen, um ein aus dieser DNA-Probe amplifiziertes, einzelsträngiges Produkt zu erzeugen. Shuldiner, et al., Handbook of Techniques in Endocrine Research, S. 457-486, DePablo, F., Scanes, C., Hgb., Academic Press, Inc., 1993. Fluoreszierender Farbstoff wird unter Verwendung des Taq Dye Terminator® Kits (Perkin-Elmer cat# 401628) zum automatisierten Sequenzieren angebracht. Das DNA-Sequenzieren wird auf einem automatisierten Modell 377®-Sequenzierer von Applied Biosystems, Inc. (ABI) sowohl in Vorwärts- als auch in Rückwärtsrichtung durchgeführt. Die zur Analyse der resultierenden Daten verwendete Software ist durch ABI erworbene "Sequence Navigator®-Software".
1. Polymerase-Kettenreaktion(PCR)-Amplifizierung
• Aus den weißen Blutkörperchen der Testperson extrahierte genomische DNA (100 Nanogramm) wird in einem letztendlichen Volumen von 25 Mikroliter, enthaltend 1 Mikroliter (100 Nanogramm) genomische DNA, 2,5 Mikroliter 10X PCR-Puffer (100 mM Tris, pH-Wert 8,3, 500 mM KCl, 1,2 mM MgCl&sub2;), 2,5 Mikroliter 10X dNTP-Gemisch (jeweils 2 mM Nucleotid), 2,5 Mikroliter Vorwärtsprimer (BRCA1-11K-F, 10 mikromolare Lösung), 2,5 Mikroliter Reverse-Primer (BRCA1-11K-R, 10 mikromolare Lösung) und 1 Mikroliter Taq-Polymerase (5 Einheiten) und 13 Mikroliter Wasser, amplifiziert. Die zur Amplifizierung des BRCA1-Gens einer Patientenprobe verwendeten PCR-Primer sind in der Tabelle 11 aufgelistet. Die Primer wurden auf einem DNA/RNA-Modell 394®-Synthetisierer synthetisiert. 35 Amplifizierungszyklen werden durchgeführt, wobei jeder aus Denaturieren (95ºC; 30 Sekunden), Wiederverbinden (55ºC, 1 Minute) und Verlängern (72ºC, 90 Sekunden) besteht, abgesehen vom ersten Zyklus, in dem die Denaturierungszeit auf 5 Minuten erhöht wird, und vom letzten Zyklus, in dem die Verlängerungszeit auf 5 Minuten erhöht wird.
• Die PCR-Produkte werden unter Verwendung von Qia-quick®-PCR-Reinigungskits (Qiagen cat# 28104; Chatsworth, CA) gereinigt. Ertrag und Reinheit des PCR-Produkts werden spektralphotometrisch bei OD&sub2;&sub6;&sub0; auf einem Beckman DU 650-Spektralphotometer bestimmt.
2. Didesoxy-Sequenzanalyse
• Fluoreszierender Farbstoff wird unter Verwendung des Taq Dye Terminator® Kits (Perkin- Elmer cat# 401628) zum automatisierten Sequenzieren an den PCR-Produkten angebracht. Das DNA-Sequenzieren wird auf einem automatisierten Modell 377®-Sequenzierer von Applied Biosystems, Inc. (ABI) Foster City, CA., sowohl in Vorwärts- als auch in Rückwärtsrichtung durchgeführt. Die zur Analyse der resultierenden Daten verwendete Software ist durch ABI erworbene "Sequence Navigator®-Software". Die BRCA1(omi1) SEQ. ID. NO. 1-Sequenz wird als Vergleichsstandard in die Sequence Navigator®-Software eingegeben. Die Sequence Navigator®-Software vergleicht Base für Base die Probensequenz mit dem BRCA1(omi1) SEQ. ID. NO. 1-Standard. Die Sequence Navigator®- Software hebt alle Unterschiede zwischen der BRCA1(omi1) SEQ. ID. NO. 1-DNA-Sequenz und der Probensequenz des Patienten hervor.
• Ein erster Technologe überprüft die Computer-berechneten Ergebnisse durch visuelles Vergleichen des BRCA1(omi1) SEQ. ID. NO. 1-Standards mit der Patientenprobe und hebt Weder alle Unterschiede zwischen dem Standard und der Probe hervor. Der erste Haupttechniker wertet dann die Sequenzvariationen bei jeder Position entlang der Sequenz aus. Mittels der Sequence Navigator®-Software werden Chromatogramme von jeder Sequenzvariation erstellt und auf einem Farbdrucker ausgedruckt. Die Spitzenwerte werden vom ersten Haupttechnologen und von einem zweiten Haupttechnologen ausgewertet. Ein untergeordneter Technologe prüft dann die Chromatogramme nach. Die Ergebnisse werden schließlich von einem Genetiker ausgewertet. In jedem Fall wird eine Variation hinsichtlich einer Positions- und Basenänderung mit bekannten Polymorphismen verglichen. Wenn die Proben-BRCA1-Sequenz mit dem BRCA1(omi1) SEQ. ID. NO. 1-Standard übereinstimmt, wobei nur Variationen aus der bekannten Liste an Polymorphismen vorkommen, so wird diese als Gensequenz interpretiert.
BEISPIEL 3 BESTIMMEN DES FEHLENS EINER MUTATION IM BRCA1-GEN UNTER VERWENDUNG VON BRCA1(omi1) UND VON SIEBEN POLYMORPHISMEN ALS REFERENZ
• Ein Fachmann im Untersuchen der genetischen Empfänglichkeit erachtet die vorliegende Erfindung als nützlich für das Bestimmen des Vorhandenseins einer bekannten oder zuvor unbekannten Mutation im BRCA1-Gen. Eine Liste von BRCA1-Mutationen ist im Breast Cancer Information Core auf http://www.nchgr.nih.gov/dir/lab transfer/bic öffentlich zugänglich. Diese Datenseite wurde am 1.November 1995 öffentlich zugänglich. Friend, S. et at Nature Genetics 11: 238, (1995).
• Das Sequenzieren wird wie in Beispiel 1 unter Verwendung einer Blutprobe vom fraglichen Patienten durchgeführt. Eine BRCA1(omi)-Sequenz wird jedoch als Referenz verwendet, und polymorphe Stellen werden mit den Nucleinsäuresequenzen verglichen, die obenstehend für Kodone an jeder polymorphen Stelle aufgelistet sind. Eine Probe ist eine, die mit der BRCA1(omi2)-SEQ. ID. NO. 3-Sequenz vergleichbar ist und eine der an jeder der polymorphen Stellen auftretenden Basenvariationen enthält. Die an jeder der polymorphen Stellen auftretenden Kodone sind im Folgenden als Referenz gepaart.
• - AGC und AGT bei Position 2201,
• - TTG und CTG bei Position 2430,
• - CCG und CTG bei Position 2731,
• - GAA und GGA bei Position 3232,
• - AAA und AGA bei Position 3667,
• - TCT und TCC bei Position 4427 und
• - AGT und GGT bei Position 4956.
• Die Verfügbarkeit dieser polymorphen Paare schafft die zusätzliche Sicherheit, dass ein Fachmann die polymorphen Änderungen richtig auswerten kann, ohne eine Änderung mit einer Mutation zu verwechseln.
• Exon 11 des BRCA1-Gens wird mittels asymmetrischer Amplifizierung und unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) einer direkten Didesoxy-Sequenzanalyse unterzogen, um ein aus dieser DNA-Probe amplifiziertes, einzelsträngiges Produkt zu erzeugen. Shuldiner, et al., Handbook of Techniques in Endocrine Research, S. 457-486, DePablo, F., Scanes, C., Hgb., Academic Press, Inc., 1993. Fluoreszierender Farbstoff wird unter Verwendung des Taq Dye Terminator® Kits (Perkin-Elmer cat# 401628) zum automatisierten Sequenzieren angebracht. Das DNA-Sequenzieren wird auf einem automatisierten Modell 377®-Sequenzierer von Applied Biosystems, Inc. (ABI) sowohl in Vorwärts- als auch in Rückwärtsrichtung durchgeführt. Die zur Analyse der resultierenden Daten verwendete Software ist durch ABI erworbene "Sequence Navigator®-Software".
1. Polymerase-Kettenreaktion(PCR)-Amplifizierung
• Aus den weißen Blutkörperchen der Testperson extrahierte genomische DNA (100 Nanogramm) wird in einem letztendlichen Volumen von 25 Mikroliter, enthaltend 1 Mikroliter (100 Nanogramm) genomische DNA, 2,5 Mikroliter 10X PCR-Puffer (100 mM Tris, pH-Wert 8,3, 500 mM KCl, 1,2 mM MgC 2), 2,5 Mikroliter 10X dNTP-Gemisch (jeweils 2 mM Nucleotid), 2,5 Mikroliter Vorwärtsprimer (BRCA1-11K-F, 10 mikromolare Lösung), 2,5 Mikroliter Reverse-Primer (BRCA1-11K-R, 10 mikromolare Lösung) und 1 Mikroliter Taq-Polymerase (5 Einheiten) und 13 Mikroliter Wasser, amplifiziert. Die zur Amplifizierung des BRCA1-Gens einer Patientenprobe verwendeten PCR-Primer sind in der Tabelle 11 aufgelistet. Die Primer wurden auf einem DNA/RNA-Modell 394®-Synthetisierer synthetisiert. 35 Amplifizierungszyklen werden durchgeführt, wobei jeder aus Denaturieren (95ºC; 30 Sekunden), Wiederverbinden (55ºC, 1 Minute) und Verlängern (72ºC, 90 Sekunden) besteht, abgesehen vom ersten Zyklus, in dem die Denaturierungszeit auf 5 Minuten erhöht wird, und vom letzten Zyklus, in dem die Verlängerungszeit auf 5 Minuten erhöht wird.
• Die PCR-Produkte werden unter Verwendung von Qia-quick®-PCR-Reinigungskits (Qiagen cat# 28104; Chatsworth, CA) gereinigt. Ertrag und Reinheit des PCR-Produkts werden spektralphotometrisch bei OD&sub2;&sub6;&sub0; auf einem Beckman DU 650-Spektralphotometer bestimmt.
2. Didesoxy-Sequenzanalyse
• Fluoreszierender Farbstoff wird unter Verwendung des Taq Dye Terminator® Kits (Perkin- Elmer cat# 401628) zum automatisierten Sequenzieren an den PCR-Produkten angebracht.
• Das DNA-Sequenzieren wird auf einem automatisierten Modell 377®-Sequenzierer von Applied Biosystems, Inc. (ABI) Foster City, CA., sowohl in Vorwärts- als auch in Rückwärtsrichtung durchgeführt. Die zur Analyse der resultierenden Daten verwendete Software ist durch ABI erworbene "Sequence Navigator®-Software". Die BRCA1(omi2) SEQ. ID. NO. 3-Sequenz wird als Vergleichsstandard in die Sequence Navigator®-Software eingegeben. Die Sequence Navigator®-Software vergleicht Base für Base die Probensequenz mit dem BRCA1(omi2) SEQ. ID. NO. 3-Standard. Die Sequence Navigator®- Software hebt alle Unterschiede zwischen der BRCA1(omi2) SEQ. ID. NO. 3-DNA-Sequenz und der Probensequenz des Patienten hervor.
• Ein erster Technologe überprüft die Computer-berechneten Ergebnisse durch visuelles Vergleichen des BRCA1(omi2) SEQ. ID. NO. 3-Standards mit der Patientenprobe und hebt wieder alle Unterschiede zwischen dem Standard und der Probe hervor. Der erste Haupttechniker wertet dann die Sequenzvariationen bei jeder Position entlang der Sequenz aus. Mittels der Sequence Navigator®-Software werden Chromatogramme von jeder Sequenzvariation erstellt und auf einem Farbdrucker ausgedruckt. Die Spitzenwerte werden vom ersten Haupttechnologen und auch von einem zweiten Haupttechnologen ausgewertet. Ein untergeordneter Technologe prüft dann die Chromatogramme nach. Die Ergebnisse werden schließlich von einem Genetiker ausgewertet. In jedem Fall wird eine Variation hinsichtlich einer Positions- und Basenänderung mit bekannten Polymorphismen verglichen. Wenn die Proben-BRCA1-Sequenz mit dem BRCA1(omi2) SEQ. ID. NO. 3-Standard übereinstimmt, wobei nur Variationen aus der bekannten Liste an Polymorphismen vorkommen, so wird diese als Gensequenz interpretiert.
BEISPIEL 4 BESTIMMEN DES VORHANDENSEINS EINER MUTATION IM BRCA1-GEN UNTER VERWENDUNG VON BRCA1(omi) UND VON SIEBEN POLYMORPHISMEN ALS REFERENZ
• Ein Fachmann im Untersuchen der genetischen Empfänglichkeit erachtet die vorliegende Erfindung als nützlich für das Bestimmen des Vorhandenseins einer bekannten oder zuvor unbekannten Mutation im BRCA1-Gen. Eine Liste von BRCA1 -Mutationen ist im Breast Cancer Information Core auf http://www.nchgr.nih.gov/dir/lab transfer/bic öffentlich zugänglich. Diese Datenseite wurde am 1. November 1995 öffentlich zugänglich. Friend, S. et al. Nature Genetics 11: 238, (1995). In diesem Beispiel wird eine Mutation im Exon 11 durch Amplifizierung des Bereichs der Mutation mit einem Primer, der mit dem Bereich der Mutation übereinstimmt, charakterisiert.
• Exon 11 des BRCA1-Gens wird mittels asymmetrischer Amplifizierung und unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) einer direkten Didesoxy-Sequenzanalyse unterzogen, um ein aus dieser DNA-Probe amplifiziertes, einzelsträngiges Produkt zu erzeugen. Shuldiner, et al., Handbook of Techniques in Endocrine Research, S. 457-486, DePablo, F., Scanes, C., Hgb., Academic Press, Inc., 1993. Fluoreszierender Farbstoff wird unter Verwendung des Taq Dye Terminator® Kits (Perkin-Elmer cat# 401628) zum automatisierten Sequenzieren angebracht. Das DNA-Sequenzieren wird auf einem automatisierten Modell 377®-Sequenzierer von Applied Biosystems, Inc. (ABI) sowohl in Vorwärts- als auch in Rückwärtsrichtung durchgeführt. Die zur Analyse der resultierenden Daten verwendete Software ist durch ABI erworbene "Sequence Navigator®-Software".
1. Polymerase-Kettenreaktion(PCR)-Amplifizierung
• Aus den weißen Blutkörperchen der Testperson extrahierte genomische DNA (100 Nanogramm) wird in einem letztendlichen Volumen von 25 Mikroliter, enthaltend 1 Mikroliter (100 Nanogramm) genomische DNA, 2,5 Mikroliter 10X PCR-Puffer (100 mM Tris, pH-Wert 8,3, 500 mM KCl, 1,2 mM MgCl&sub2;), 2,5 Mikroliter 10X dNTP-Gemisch (jeweils 2 mM Nucleotid), 2,5 Mikroliter Vorwärtsprimer (BRCA1-11K-F, 10 mikromolare Lösung), 2,5 Mikroliter Reverse-Primer (BRCA1-11K-R, 10 mikromolare Lösung) und 1 Mikroliter Taq-Polymerase (5 Einheiten) und 13 Mikroliter Wasser, amplifiziert. Die zur Amplifizierung von Segment K von Exon 11 (wo die Mutation zu finden ist) verwendeten PCR-Primer sind wie folgt:
• Die Primer werden auf einem DNA/RNA-Modell 394®-Synthetisierer synthetisiert. 35 Zyklen werden durchgeführt, wobei jeder aus Denaturieren (95ºC; 30 Sekunden), Wiederverbinden (55ºC, 1 Minute) und Verlängern (72ºC, 90 Sekunden) besteht, abgesehen vom ersten Zyklus, in dem die Denaturierungszeit auf 5 Minuten erhöht wird, und vom letzten Zyklus, in dem die Verlängerungszeit auf 5 Minuten erhöht wird. Die PCR- Produkte werden unter Verwendung von Qia-quick®-PCR-Reinigungskits (Qiagen cat# 28104; Chatsworth, CA) gereinigt. Ertrag und Reinheit des PCR-Produkts werden spektralphotometrisch bei OD&sub2;&sub6;&sub0; auf einem Beckman DU 650-Spektralphotometer bestimmt.
2. Didesoxy-Sequenzanalyse
• Fluoreszierender Farbstoff wird unter Verwendung des Taq Dye Terminator® Kits (Perkin- Elmer cat# 401628) zum automatisierten Sequenzieren an den PCR-Produkten angebracht. Das DNA-Sequenzieren wird auf einem automatisierten Modell 377®-Sequenzierer von Applied Biosystems, Inc. (ABI) Foster City, CA., sowohl in Vorwärts- als auch in Rückwärtsrichtung durchgeführt. Die zur Analyse der resultierenden Daten verwendete Software ist durch ABI erworbene "Sequence Navigator®-Software". Die BRCA1(omi2) SEQ. ID. NO. 3-Sequenz wird als Vergleichsstandard in die Sequence Navigator®-Software eingegeben. Die Sequence Navigator®-Software vergleicht Base für Base die Probensequenz mit dem BRCA1(omi2) SEQ. ID. NO. 3-Standard. Die Sequence Navigator®- Software hebt alle Unterschiede zwischen der BRCA1(omi2) SEQ. ID. NO. 3-DNA-Sequenz und der Probensequenz des Patienten hervor.
• Ein erster Technologe überprüft die Computer-berechneten Ergebnisse durch visuelles Vergleichen des BRCA1(omi2) SEQ. ID. NO. 3-Standards mit der Patientenprobe und hebt wieder alle Unterschiede zwischen dem Standard und der Probe hervor. Der erste Haupttechniker wertet dann die Sequenzvariationen bei jeder Position entlang der Sequenz aus. Mittels der Sequence Navigator®-Software werden Chromatogramme von jeder Sequenzvariation erstellt und auf einem Farbdrucker ausgedruckt. Die Spitzenwerte werden vom ersten Haupttechnologen und von einem zweiten Haupttechnologen ausgewertet. Ein untergeordneter Technologe prüft dann die Chromatogramme nach. Die Ergebnisse werden schließlich von einem Genetiker ausgewertet. In jedem Fall wird eine Variation hinsichtlich einer Positions- und Basenänderung mit bekannten Polymorphismen verglichen. Mutationen werden mittels der Länge einer nicht abgestimmten Variation verzeichnet. Ein derartiges Muster einer sehr langen Fehlabstimmung tritt bei Deletionen und Substitutionen auf.
3. Ergebnis
• Bei Anwendung der obenstehenden PCR-Amplifizierungs- und fluoreszierenden Standard- Sequenzierungstechnologie kann die 388BdelGA-Mutation gefunden werden. Die 388BdelGA-Mutation. Das BRCA1-Gen liegt im Segment "K" von Exon 11. Die DNA- Sequenzergebnisse zeigen das Vorhandensein einer Zweibasenpaar-Deletion an den Nucleotiden 3888 und 3889 der veröffentlichten BRCA1(omi)-Sequenz. Diese Mutation unterbricht den Leseraster des BRCA1-Transcripts, was zum Aufscheinen eines im Raster liegenden Terminators (TAG) bei Kodonposition 1265 führt. Es wird daher vorausgesagt, dass diese Mutation zu einem kegelstumpfartigen und, am wahrscheinlichsten, nicht funktionellen Protein führt. Der formelle Name der Mutation ist 3888delGA. Diese Mutation ist gemäß der für das Benennen von Mutationen vorgeschlagenen Nomenklatur, Baudet, A et al., Human Mutation 2: 245-248, (1993), benannt.
BEISPIEL 5 ANWENDUNG DER BRCA1(omi1)-GENTHERAPIE
• Das Wachstum von Eierstock-, Brust- oder Prostatakrebs kann durch Erhöhung der Expression des BRCA1-Gens, wo eine unzulängliche Expression dieses Gens für erblichen Eierstock-, Brust- und Prostatakrebs verantwortlich ist, aufgehalten werden. Es wurde gezeigt, dass eine Transfektion von BRCA1 in Krebszellen deren Wachstum hemmt und die Tumorbildung verringert. Eine Gentherapie wird an einem Patienten durchgeführt, um die Größe eines Tumors zu verringern. Der LXSN-Vektor wird mit irgendeinem der BRCA1(omi1) SEQ. ID. NO. 1-, BRCA1(omi2) SEQ. ID. NO. 3- oder BRCA1(omi3) SEQ. ID. NO. 5- kodierenden Bereiche transformiert.
Vektor
• Der LXSN-Vektor wird mit einer BRCA1(omi1) SEQ. ID. NO. 1-kodierenden Sequenz vom Wildtyp transformiert. Der LXSN-BRCA1(omi1)-Retroviren-Expressionsvektor wird durch Klonen einer SaH-verbundenen BRCA1(omi1) cDNA (Nucleotide 1-5711) in die XhoI-Stelle des Vektors LXSN konstruiert. Die Konstrukte werden mittels DNA-Sequenzierung bestätigt. Holt et al. Nature Genetics 12: 298-302 (1996).
• Retrovirenvektoren werden bei Anwendung von Serumfreien und Phenolrot-freien Bedingungen aus Virus-Produktionszellen hergestellt und mittels Standarduntersuchungen auf Sterilität, Fehlen von spezifischen Krankheitserregern und Fehlen von replikationsfähigen Retroviren getestet. Die Retroviren werden gefroren gelagert, u. zw. in Aliquoten, die getestet wurden.
• Die Patienten erhalten eine umfassende physische Untersuchung, Blut- und Urintests zur Bestimmung des allgemeinen Gesundheitszustands. Sie können auch ein Bruströntgen, ein Elektrokardiogramm und geeignete radiologische Verfahren zur Bestimmung des Tumorstadiums erhalten.
• Patienten mit metastasischem Eierstockrebs werden behandelt mittels Retroviren- Gentherapie durch Infusion von rekombinierten LXSN-BRCA1(omi1)-Retrovirenvektoren, zwischen 10&sup9; und 10¹&sup0; Viruspartikel pro Dosis, in peritoneale Stellen, die den Tumor enthalten. Jeden Tag werden Blutproben genommen und mittels auf einer empfindlichen Polymerase-Kettenreaktion(PCR) basierenden Untersuchungen auf das Vorhandensein eines Retrovirusvektors getestet. Die entnommene Flüssigkeit wird analysiert, um zu bestimmen:
• 1. Den Prozentsatz an Krebszellen, die die rekombinierte LXSN-BRCA1(omi1)- Retrovirenvektoren-Kombination aufnehmen. Ein erfolgreicher Transfer eines BRCA1-Gens in Krebszellen wird sowohl durch eine RT-PCR-Analyse als auch eine in situ- Hybridisierung gezeigt.
• RT-PCR wird mittels des Verfahrens von Thompson et al. Nature Genetics 9: 444-450 (1995) durchgeführt, wobei vom BRCA1(omi1) SEQ. ID. NO. 1 abgeleitete Primer verwendet werden. Zelllysate werden hergestellt, und Immunoblotting wird mittels des Verfahrens von Jensen et al. Nature Genetics 12: 303-308, 1996, und Jensen et al. Biochemistry 31: 10887- 10892 (1992) durchgeführt.
• 2. Das Vorkommen eines programmierten Zelltods unter Anwendung des ApoTAG® in situ-Apoptose-Erkennungskits (Oncor, Inc., Gaithersburg, Maryland) und einer DNA- Analyse.
• 3. Die Messung einer BRCA I-Genexpression mittels Gleit-Immunfluoreszenz oder Western-Blot.
• Patienten mit messbarer Erkrankung werden ebenfalls hinsichtlich einer klinischen Reaktion auf LXSN-BRCA1 ausgewertet, insbesondere jene, die unmittelbar nach der Retrovirusvektor-Therapie keinem palliativen Eingriff unterzogen werden. Eine Flüssigkeitszytologie, eine Bauchumfangmessung, CT-Abtastungen des Abdomens und örtliche Symptome folgen.
• Für andere Erkrankungsstellen werden herkömmliche Reaktionskriterien wie die folgenden angewendet:
• 1. Vollständige Reaktion (CR), vollständiges Verschwinden aller messbarer Läsionen und aller Anzeichen und Symptome einer Erkrankung für zumindest 4 Wochen.
• 2. Teilweise Reaktion (PR), Herabsetzung um zumindest 50% der Produktsumme der 2 größten senkrechten Durchmesser aller messbaren Läsionen, wie sie in 2 nicht weniger als 4 Wochen auseinanderliegenden Beobachtungen bestimmt werden. Um als PR angesehen zu werden, sollten während dieses Zeitraums keine neuen Läsionen aufgetreten sein und keine sollten an Größe zugenommen haben.
• 3. Stabile Erkrankung, weniger als 25% Veränderung beim Tumorvolumen gegenüber vorhergehenden Auswertungen.
• 4. Fortschreitende Erkrankung, mehr als 25% Zunahme der Tumorabmessungen gegenüber früheren Auswertungen.
• Die Anzahl an Dosierungen hängt von der Reaktion auf die Behandlung ab.
• Weitere Informationen zu diesem Gentherapieansatz entnehmen Sie: "BRCA1 Retroviral Gene Therapy for Ovarian Cancer" a Human Gene Transfer Protocol: NIH ORDA Registration #: 9603-149 Jeffrey Holt, JT, M. D. und Carlos L. Arteaga, M. D. Referenzliste
• 1. Sanger, F., et al., J. Mol. Biol. 42: 1617, (1980).
• 2. Beaucage, et al., Tetrahedron Letters 22: 1859-1862, (1981).
• 3. Maniatis, et. al. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, S. 280-281, (1982).
• 4. Conner, et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 278, (1983)
• 5. Saiki, et. al.., Bio/Technology 3: 1008-1012, (1985)
• 6. Landgren, et. al., Science 241: 1007,(1988)
• 7. Landgren, et. al., Science 242: 229-237, (1988).
• 8. PCR. A Practical Approach, ILR Press, Hgb. M. J. McPherson, P. Quirke, und G. R Taylor, (1992).
• 9. Easton et al., American Journal of Human Genetics 52: 678-701, (1993).
• 10. U.S. Patent Nr. 4,458,066.
• 11. Rowell, S., et al., American Journal of Human Genetics 5: 861-865, (1994)
• 12. Miki, Y. et al., Science 266: 66-71, (1994).
• 13. Friedman, L. et al., Nature Genetics 8: 399-404, (1994).
• 14. Baudet, A et al., Human Mutation 2: 245-248, (1993).
• 15. Friend, S. et al., Nature Genetics 11: 238, (1995).
• 16. Arteaga, CL und JT Holt Cancer Research 56: 1098-1103 (1996).
• 17. Holt, JT et al., Nature Genetics 12: 298-302 (1996).
• 18. Jensen, RA et al., Nature Genetics 12: 303-308 (1996).
• 19. Steeg, P. Nature Genetics 12: 223-225 (1996).
• 20. Thompson, ME et al., Nature Genetics 9: 444-450 (1995)
• 21. Holt, JT, und C. Arteaga, Gene Therapy Protocol ORDA #: 9603-149 ORDA- bewilligtes Protokoll für BRCA1-Gentherapie
• "Brust- und Eierstockkrebs" wird vom Fachmann als Brust- und Eierstockkrebs bei Frauen und ebenso Brust- und Prostatakrebs bei Männern einschließend verstanden. BRCA1 hängt mit einer genetischen Empfänglichkeit für ererbten Brust- und Eierstockkrebs bei Frauen und ebenso Brust- und Prostatakrebs bei Männern zusammen. Daher beziehen sich die Ansprüche in diesem Dokument, die Brust- und/oder Eierstockkrebs anführen, auf Brust-, Eierstock- und Prostatakrebs bei Männern und Frauen. Obwohl die Erfindung unter Bezugnahme auf die derzeit bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, sollte zu verstehen sein, dass verschiedene Modifikationen durchgeführt werden können, ohne vom Geist der Erfindung abzuweichen. Demgemäß beschränkt sich die Erfindung nur auf die nachfolgenden Ansprüche.
SEQUENZAUFLISTUNG
• (1) Allgemeine Informationen:
• (i) Anmelder: Murphy, Patricia D.
• Allen, Antonette C.
• Alvares, Christopher P.
• Critz, Brenda S.
• Olson, Sheri J.
• Schelter, Denise B.
• Zeng, Bin
• (ii) Titel der Erfindung: Eine Sequenz des menschlichen BRCA1-Gens
• (iii) Anzahl an Sequenzen: 78
• (iv) Korrespondenzadresse:
• (A) Adressat: ONCORMED
• (B) Straße: 200 Perry Parkway
• (C) Stadt: Gaithersburg
• (D) Bundesstaat: MD
• (E) Land: U.S.A.
• (F) Postleitzahl: 20877
• (v) Computerlesbare Form:
• (A) Art des Datenträgers: Floppy Disk
• (B) Computer: IBM PC compatible
• (C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
• (D) Software: PatentIn Release # 1.0, Version #1.30
• (vi) Derzeitige Anmeldungsdaten:
• (A) Anmeldenummer: zu erteilen
• (B) Anmeldedatum: hiermit
• (C) Klassifikation:
• (viii) Informationen zum Anwalt/Vertreter:
• (A) Name: R. Thomas Gallegos
• (B) Registrierungsnummer: 32,692
• (C) Referenz-/Registernummer: PA-0054
• (ix) Informationen zur Telekommunikation:
• (A) Telefon: 301-527-2051
• (B) Telefax: 301-208-6997
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 1:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 5711 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: cDNA
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (A) Organisums: Homo sapiens
• (B) Stamm: BRCA1
• (viii) Position im Genom:
• (A) Chromosom/Segment: 17
• (B) Kartenposition: 17q21 (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 1:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 2:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 1863 Aminosäuren
• (B) Typ: Aminosäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: nicht relevant
• (ii) Molekültyp: Protein
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (A) Organisums: Homo sapiens
• (B) Stamm: BRCA1
• (viii) Position im Genom:
• (A) Chromosom/Segment: 17
• (B) Kartenposition: 17q21 (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 2:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 7:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 24 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 2F-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 7:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 8:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 22 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 2R-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 8:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 9:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 21 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft
• (B) Stamm: 3F-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 9:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 10:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 21 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 3R-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 10:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 11:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 20 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 5F-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 11:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 12:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 20 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 5R-M13*-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 12:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 13:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 23 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 6/7F-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 13:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 14:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 22 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 6R (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 14:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 15:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 23 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft
• (B) Stamm: 7F-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 15:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 16:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 20 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 6/7R-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 16:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 17:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 21 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 8F1-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 17:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 18:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 21 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 8R1-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 18:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 19:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 23 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 9F-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 19:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 20:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 23 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 9R-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 20:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 21:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 20 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 10F-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 21:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 22:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 24 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 10R-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 22:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 23:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 19 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 11AF-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 23:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 24:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 20 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 11AR-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 24:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 25:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 22 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 11BF1-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 25:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 26:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 22 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 11BR1-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 26:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 27:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 20 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 11CF1-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 27:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 28:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 22 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 11CR1-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 28:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 29:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 20 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 11DF1-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 29:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 30:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 20 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 11DR1-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 30:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 31:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 22 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
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• (2) Informationen zu SEQ ID NO 32:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 23 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 11ER-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 32:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 33:
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• (B) Typ: Nucleinsäure
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• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 11FF-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 33:
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• (i) Sequenzkennzeichen:
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• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
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• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
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• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
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• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
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• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
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• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
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• (2) Informationen zu SEQ ID NO 47:
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• (C) Art des Strangs: nicht relevant
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• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft
• (B) Stamm: 12R-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 48:
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• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 21 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 13F-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 49:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 50:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 21 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 13R-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 50:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 51:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 22 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 14F-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 51:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 52:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 21 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 14R-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 52:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 53:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 19 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 15F-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 53:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 54:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 23 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 15R-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 54:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 55:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 22 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 16F-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 55:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 56:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 22 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 16R-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 56:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 57:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 20 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 17F-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 57:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 58:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 18 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 17R-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 58:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 59:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 21 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 18F-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 59:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 60:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 20 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 18R-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 60:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 61:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 20 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 19F-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 61:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 62:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 21 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 19R-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 62:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 63:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 20 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 20F-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 63:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 64:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 20 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 20R-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 64:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 65:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 22 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 21F-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 65:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 66:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 22 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 21R-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 66:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 67:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 20 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 22F-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 67:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 68:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 20 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 22R-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 68:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 69:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 21 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 23F-1-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 69:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 70:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 23 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 23R-1-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 70:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 71:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 22 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 24F-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 71:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 72:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 21 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 24R-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 72:
ANHANG SEQUENZAUFLISTUNG
• (1) Allgemeine Informationen:
• (i) Anmelder:
• (A) Name: ONCORMED
• (B) Straße: 200 Perry Parkway
• (C) Stadt: Gaithersburg
• (D) Bundesstaat: MD
• (E) Land: U.S.A.
• (F) Postleitzahl: 20877
• (ii) Titel der Erfindung: Eine Sequenz des menschlichen BRCA1-Gens
• (iii) Anzahl an Sequenzen: 72
• (iv) Korrespondenzadresse:
• (v) Computerlesbare Form:
• (A) Art des Datenträgers: Floppy Disk
• (B) Computer: IBM PC compatible
• (C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
• (D) Software: PatentIn Release # 1.0, Version #1.30
• (vi) Derzeitige Anmeldungsdaten:
• (A) Anmeldenummer: 97907894.6
• (vii) Frühere Anmeldungsdaten:
• (A) Anmeldenummer: PCT/US97/03038
• (B) Anmeldedatum: 12. Feb. 1997
• (viii) Informationen zum Anwalt/Vertreter:
• (A) Name:
• (ix) Informationen zur Telekommunikation:
• (A) Telefon:
• (B) Telefax:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 1:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 5711 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: cDNA
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (A) Organisums: Homo sapiens
• (B) Stamm: BRCA1
• (viii) Position im Genom:
• (A) Chromosom/Segment: 17 (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO. 1:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO. 2:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 1863 Aminosäuren
• (B) Typ: Aminosäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: nicht relevant
• (ii) Molekültyp: Protein
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (A) Organisums: Homo sapiens
• (B) Stamm: BRCA1
• (viii) Position im Genom:
• (A) Chromosom/Segment: 17
• (B) Kartenposition: 17q21 (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 2:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 3:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 5711 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: cDNA
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (A) Organisums: Homo sapiens
• (B) Stamm: BRCA1
• (viii) Position im Genom:
• (A) Chromosom/Segment: 17
• (B) Kartenposition: 17q21 (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO. 3:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 4:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 1863 Aminosäuren
• (B) Typ: Aminosäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: nicht relevant
• (ii) Molekültyp: Protein
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (A) Organisums: Homo sapiens
• (B) Stamm: BRCA1
• (viii) Position im Genom:
• (A) Chromosom/Segment: 17
• (B) Kartenposition: 17q21 (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 4:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 5:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 5711 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: cDNA
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (A) Organisums: Homo sapiens
• (B) Stamm: BRCA1
• (viii) Position im Genom:
• (A) Chromosom/Segment: 17
• (B) Kartenposition: 17q21 (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 5:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO. 6:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 1863 Aminosäuren
• (B) Typ: Aminosäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: nicht relevant
• (ii) Molekültyp: Protein
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (A) Organisums: Homo sapiens
• (B) Stamm: BRCA1
• (viii) Position im Genom:
• (A) Chromosom/Segment: 17
• (B) Kartenposition: 17q21 (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 6:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 7:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 24 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 2F-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 7:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 8:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 22 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 2R-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 8:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 9:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 21 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 3F-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 9:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 10:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 21 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 3R-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 10:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 11:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 20 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 5F-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 11:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 12:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 20 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 5R-M13*-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 12:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 13:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 23 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 6/7F-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 13:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 14:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 22 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 6R (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 14:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 15:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 23 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 7F-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 15:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 16:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 20 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 6/7R-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 16:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 17:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 21 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 8F1-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 17:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 18:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 21 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 8R1-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 18:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 19:
• (i) Sequenzkennzeichen:
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• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 9F-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 19:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 20:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 23 Basenpaare
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• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
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• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 10R-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 22:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 23:
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• (2) Informationen zu SEQ ID NO 49:
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• (i) Sequenzkennzeichen:
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• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
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• (i) Sequenzkennzeichen:
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• (B) Stamm: 17F-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 57:
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• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 17R-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 58:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 59:
• (i) Sequenzkennzeichen:
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• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
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• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 18R-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 60:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 61:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 20 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 19F-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 61:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 62:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 21 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 19R-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 62:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 63:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 20 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
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• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 20F-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 63:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 64:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 20 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 20R-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 64:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 65:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 22 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 21F-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 65:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 66:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 22 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 21R-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 66:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 67:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 20 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 22F-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 67:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 68:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 20 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 22R-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 68:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 69:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 21 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 23F-1-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 69:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 70:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 23 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 23R-1-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 70:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 71:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 22 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 24F-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 71:
• (2) Informationen zu SEQ ID NO 72:
• (i) Sequenzkennzeichen:
• (A) Länge: 21 Basenpaare
• (B) Typ: Nucleinsäure
• (C) Art des Strangs: nicht relevant
• (D) Topologie: linear
• (ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
• (vi) Ursprüngliche Herkunft:
• (B) Stamm: 24R-Primer (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 72:

Claims (8)

1. Isolierte Consensus-DNA-Sequenz der BRCA1-kodierenden Sequenz, wie in SEQ. ID. NO 1 dargestellt.

2. Consensus-Proteinsequenz des BRCA1-Proteins, wie in SEQ. ID. NO 2 dargestellt.

3. Verfahren zur Identifizierung von Individuen mit einem BRCA1-Gen mit einer BRCA1-kodierende nicht mit einer Erkrankung zusammenhängenden Sequenz, umfassend:

(a) Amplifizieren eines DNA-Fragments einer BRCA1-kodierenden Sequenz eines Individuums unter Verwendung eines Oligonucleotidprimers, der speziell mit Sequenzen in dem Gen hybridisiert;

(b) Sequenzieren des amplifierten DNA-Fragments durch Didesoxy-Sequenzierung;

(c) Wiederholen der Schritte (a) und (b), bis die BRCA1-kodierende Sequenz eines Individuums vollständig sequenziert ist;

(d) Vergleichen der Sequenz des amplifierten DNA-Fragments mit einer BRCA1(omi)-DNA-Sequenz, SEQ. ID. NO 1;

(e) Bestimmen, ob jede der folgenden polymorphen Änderungen in der BRCA1-kodierenden Sequenz eines Individuums vorhanden ist oder fehlt:

- AGC und AGT bei Position 2201,

- TTG und CTG bei Position 2430,

- CCG und CTG bei Position 2731,

- GAA und GGA bei Position 3232,

- AAA und AGA bei Position 3667,

- TCT und TCC bei Position 4427 und

- AGT und GGT bei Position 4956;

(f) Bestimmen jeglicher Sequenzunterschiede zwischen den BRCA1-kodierenden Sequenzen eines Individuums und SEQ. ID. NO1, wobei das Vorhandensein der polymorphen Änderungen und das Fehlen einer Änderung jenseits der Positionen 2201, 2430, 2731, 3232, 3667, 4427 und 4956 mit dem Fehlen einer gesteigerten genetischen Empfänglichkeit für Brust- oder Eierstockkrebs bei Frauen oder Brust- oder Prostatakrebs bei Männern, hervorgerufen durch eine BRCA1-Mutation in der BRCA1-kodierenden Sequenz, korreliert.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Oligonucleotidprimer mit einer Radiomarkierung, einer Fluoreszenzmarkierung, einer Biolumineszenzmarkierung, einer Chemilumineszenzmarkierung oder einer Enzymmarkierung markiert ist.

5. Verfahren zum Erfassen einer gesteigerten genetischen Empfänglichkeit für Brust- und Eierstockkrebs bei Frauen und Brust- und Prostatakrebs bei Männern, hervorgerufen durch das Vorhandensein einer Mutation in der BRCA1-kodierenden Sequenz, umfassend:

(a) Amplifizieren eines DNA-Fragments einer BRCA1-kodierenden Sequenz eines Individuums unter Verwendung eines Oligonucleotidprimers, der speziell mit Sequenzen in dem Gen hybridisiert;

(b) Sequenzieren des amplifizierten DNA-Fragments durch Didesoxy-Sequenzierung;

(c) Wiederholen der Schritte (a) und (b), bis die BRCA1-kodierende Sequenz eines Individuums vollständig sequenziert ist;

(d) Vergleichen der Sequenz des amplifizierten DNA- Fragments mit einer BRCA1(omi)-DNA-Sequenz, SEQ. ID. NO1,

(e) Bestimmen jeglicher Sequenzunterschiede zwischen den BRCA1-kodierenden Sequenzen von Individuen und SEQ. ID. NO1 zum Feststellen des Vorhandensein oder Fehlens von Basenänderungen in der BRCA1-kodierenden Sequenz von Individuen, wobei eine Basenänderung, die keine der folgenden ist:

- AGC und AGT bei Position 2201

- TTG und CTG bei Position 2430,

- CCG und CTG bei Position 2731,

- GAA und GGA bei Position 3232,

- AAA und AGA bei Position 3667,

- TCT und TCC bei Position 4427 und

- AGT und GGT bei Position 4956, mit dem

Potential einer gesteigerten genetischen Empfänglichkeit für Brust- oder Eierstockkrebs bei Frauen und Brust- oder Prostatakrebs bei Männern, hervorgerufen durch eine BRCA1-Mutation in der BRCA1-kodierenden Sequenz, korreliert.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Oligonucleotidprimer mit einer Radiomarkierung, einer Fluoreszenzmarkierung, einer Biolumineszenzmarkierung, einer Chemilumineszenzmarkierung oder einer Enzymmarkierung markiert ist.

7. Verwendung eines mit einer BRCA1-kodierenden Sequenz von SEQ. ID. NO1 transformierten Vektors zum Herstellen einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Durchführung einer Gentherapie, umfassend:

a) Transfizieren einer Krebzelle in vivo mit einer wirksamen Menge des Vektors,

b) Ermöglichen, dass die Zellen den Vektor aufnehmen, und

c) Messen einer Verringerung des Tumorwachstums.

8. Verwendung eines das BRCA1-Tumorwachstum verhindernden Proteins von SEQ. ID. NO2 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zum Durchführen einer Proteintherapie, umfassend:

a) Injizieren eines Patienten mit einer wirksamen Menge des Proteins,

b) Ermöglichen, dass die Zellen das Protein aufnehmen, und

c) Messen einer Verringerung des Tumorwachstums.