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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer
Plasma- oder Serumprobe aus Vollblut, und besonders ein
Verfahren, das es ermöglicht, eine Plasma- oder Serumprobe
aus Vollblut mit hohem Hämatokritwert bei hoher
Trennungsgeschwindigkeit ohne Zerstörung von Blutzellen zu
erhalten.
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Art oder Konzentration von Blutbestandteilen, wie z. B.
Metabolite, Proteine, Lipide, Elektrolyte, Enzyme, Antigene
und Antikörper, wird im allgemeinen unter Verwendung einer
Plasma- oder Serumprobe, die durch Zentrifugieren von
Vollblut gewonnen wurde, gemessen. Das Zentrifugieren
macht jedoch Mühe und erfordert Zeit. Besonders ist das
Zentrifugieren bei einem dringenden Fall, bei dem eine
kleine Anzahl von Proben schnell und vor Ort gemessen
wird, ungeeignet, da eine Zentrifuge und Elektrizität
erforderlich ist. Es wurde deswegen das Trennen des Serums
vom Vollblut durch Filtration untersucht.
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Es sind bereits einige Filtrationsverfahren unter
Verwendung von Glasfaserfiltern bekannt, bei denen Vollblut von
einer Seite der Säule auf Glasfaser, die in einer Säule
eingebracht wurde, geladen wird und Plasma oder Serum wird
von der anderen Seite erhalten (Japanisches Patent KOKOKU
Nr. 44-14673, 5-52463, Japanisches Patent KOKAI Nr. 2-
208565, 4-208856).
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Praktische Filtrationsverfahren, mit denen eine Menge an
Plasma oder Serum aus Vollblut erhalten werden kann, die
notwendig ist, um mit einer automatischen
Analysiervorrichtung zu messen, wurden bisher nicht entwickelt, außer
für wenige Dinge, wie beispielsweise Blutzucker.
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Der Grund hierfür scheint zu sein, daß frühere
Filtrationssysteme die folgenden drei Bedingungen nicht erfüllen:
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1) Es ist schwierig, durch Filtration eine ausreichende
Menge an Plasma, die notwendig ist für die automatische
Analyse, zu erhalten.
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2) Erythrozyten neigen dazu, durch Filtration zerstört
(hämolysiert) zu werden, und es ist daher schwierig,
Analyte zu messen, die einem Einfluß von durch Hämolyse in
das Plasma oder Serum freigesetztem Hämoglobin unterliegen
oder Analyte, bei denen die Menge in Blutzellen größer als
in Plasma oder Serum, wie bei GOT, GPT, LDH, Va und K ist.
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3) Bei hohen Hämatokritwert(50% oder mehr)-Proben ist
das Filtern wegen des Verstopfens des Filtermaterials
durch Erythrozyten schwierig.
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Beispielsweise offenbart JP-A-57/53661 eine
Plasmafiltrationstechnik über Glasfaserfilter, die aus einem
bestimmten Material hergestellt sind, es wird jedoch dort
festgestellt, daß die erhaltbare Plasmamenge auf 1/2 oder
weniger des Glasfaserfiltervolumens beschränkt sein soll. In
dem japanischen Patent wird unter der Voraussetzung, daß
der Hämatokritwert 50% beträgt, vermutet, daß der Raum des
Glasfaserfilters von Erythrozyten ausgefüllt wird, und daß
die Menge des Plasmas, das durch Filtrieren bis zum
Erreichen des ausgefüllten Stadiums erhalten wird, auf maximal
50% des Volumens des Glasfaserfilters begrenzt ist.
Vollblutproben mit einem Hämatokritwert von 55 bis 60% sind
jedoch unter den Vollblutproben, die bei der Organisation
eines klinischen Tests täglich gehandhabt werden, nicht
selten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Eine Aufgabe der Erfindung ist es, ein sicheres Mittel zur
Trennung von Plasma oder Serum durch Filtration auch aus
Vollblutproben mit hohem Hämatokritwert mit einem
Hämatokritwert von 60 bis 70% bereitzustellen, die ein großes
Hindernis bei der Abtrennung von Plasma aus Vollblut
darstellen, und die bei Neugeborenen und bei an Dehydrierung
leidenden Patienten gefunden werden.
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Eine andere Aufgabe der Erfindung ist es, ein sicheres
Mittel zum Trennen von Plasma oder Serum in einer Menge
von 100 ul oder mehr bereitzustellen, welche notwendig ist
zur Messung vieler Werte in einer gewöhnlichen
automatischen Analysiervorrichtung für einen klinischen Test,
ausgehend von einer Probe mit irgendeinem Hämatokritwert,
ohne die zu gewinnende Menge an Plasma auf 1/2 des
Glasfaserfiltervolumens zu begrenzen.
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Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Mittel
bereitzustellen, mit dem Plasma mit guter Qualität ohne
Zerstörung von Blutzellbestandteilen erhalten werden kann,
was für die Messung der meisten Testwerte bei einem
klinischen chemischen Test und einem Immunoserumtest geeignet
ist, und was durch konventionelles Filtern über eine Säule
nur schwer zu verwirklichen ist.
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Probleme bei der Entwicklung von Plasma-trennender Technik
aus Vollblut werden in den folgenden drei Punkten
zusammengefaßt.
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(1) Nicht-Erythrozyten bei der Plasmaseparation zerstören
(hämolysieren). Werden Erythrozyten zerstört, dann werden
Blutzellbestandteile, wie Hb, GOT, LDH und K, in das
Plasma freigesetzt, deren Menge in Blutzellen wesentlich
größer ist als im Plasma, wodurch ein analytischer Fehler
verursacht wird. In das Plasma freigesetztes Hb stört die
optische Messung.
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(2) Sichere Plasmaseparation auch aus Vollblut mit hohem
Hämatokritwert (50% oder mehr) mit Schwierigkeiten bei der
Erythrozytentrennung und der Tendenz zur Hämolyse. Wenn
der Hämatokritwert steigt, wird die Trennung durch
Filtration wegen des scharfen Anstiegs der Blutviskosität
schwierig.
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(3) Eine Änderung der Zusammensetzung tritt bei der
Plasmaseparation nicht auf.
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Die Erfinder forschten, um die obigen Probleme zu lösen,
und um ein Mittel zu entwickeln, mit dem Plasma in einer
hohen Separationsgeschwindigkeit ohne Hämolyse auch aus
Vollblut mit hohem Hämatokritwert separiert werden kann,
und sie haben diese Aufgabe durch Hinzufügen eines Mittels
in einer bestimmten Konzentration, das den Hämatokritwert
von Vollblut herabsenken kann, und anschließendes
Abtrennen des Plasmas gelöst.
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Daher stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur
Herstellung einer Plasma- oder Serumprobe aus Vollblut
bereit, wobei man eine wäßrige Lösung mit einem pH-Wert von
5 bis 8 eines anorganischen Salzes oder einer Aminosäure
oder eines Salzes hiervon mit einer Konzentration von 0,1
bis 5 mol/l mit dem Vollblut in einer Menge von 20% oder
weniger des Vollblutvolumens vermischt, so daß das
anorganische Salz oder die Aminosäure oder das Salz hiervon in
einer Menge von 10 bis 200 umol/ml Vollblut vorliegt, und
wobei man dann das Vollblut filtriert, um
Blutzellbestandteile zu entfernen, wobei das anorganische Salz eine
Kombination aus einwertigem oder zweiwertigem Alkalimetall
oder Erdalkalimetall und einem Mitglied, ausgewählt aus
der Gruppe, bestehend aus Halogen, NO&sub3;, SO&sub4; und CO&sub3; ist,
außer Natriumchlorid.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Fig. 1 ist eine Ansicht eines Schnittes durch eine in den
Beispielen verwendete Filtereinheit.
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Fig. 2 zeigt Graphen, die die Variation verschiedener
analytischer Werte aus Plasmen, die aus Vollblut mit
unterschiedlichem Hämatokritwert erhalten wurden, anzeigen.
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1 - Filtereinheit
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2 - Filterhalter
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3 - Spritze
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4 - Halterkörper
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5 - Aufsatz
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6 - Filterkammer
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7 - Probenaufnahme
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8 - Ausguß
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9 - Unterdruckteil
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10 - Glasfaserfilterblatt
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11 - Cellulosefilterblatt
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12 - Doppelschichtiges Klebeband
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13 - Mikroporöse Polysulfonmembran
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14 - Durchflußquerschnitts-regulierendes Bauteil
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die Vollblutprobe, auf die das erfindungsgemäße Verfahren
angewendet werden kann, kann verschiedene Antikoagulantien
oder Glykolyseinhibitoren, wie Heparin, NaF, EDTA oder
Monoiodacetat, enthalten oder nicht. Das erfindungsgemäße
Verfahren ist besonders wirksam bei Blut mit hohen
Hämatokritwerten, z. B. mit einem Hämatokrit (Hct)-Wert von 50
bis 70%, besonders 55 bis 70%.
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Das anorganische Salz und die Aminosäure und das Salz
hiervon sind ein Mittel (HL-Mittel) mit Wirkung, die
Tren
nung zwischen Blutzellen und Plasma zu beschleunigen, um
den Hämatokritwert zu senken.
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Das HL-Mittel, das das anorganische Salz, die Aminosäure
oder das Salz hiervon ist, ist wasserlöslich und hat eine
Löslichkeit von 100 mmol/l oder mehr, vorzugsweise 1 mol/l
oder mehr, besonders 3 mol/l oder mehr. Beispielhafte
anorganische Salze sind Kombinationen von einwertigen oder
zweiwertigen Alkalimetallen oder Erdalkalimetallen und
Halogen, NO&sub3;, SO&sub4; oder CO&sub3;, wie CsCl&sub2;, Li&sub2;SO&sub4;, CaCl&sub2;, Rb&sub2;SO&sub4;
und Cs&sub2;SO&sub4;. Beispielhafte Aminosäuren sind natürliche
Aminosäuren, wie Gly, Ala, Asp, Glu und Glycinamidasparagin.
Das anorganische Salz, die Aminosäure und das Salz hiervon
werden so gemacht, daß der pH-Wert ihrer wäßrigen Lösung 5
bis 8, vorzugsweise 6 bis 7,5, beträgt, und daher kann das
anorganische Salz und das Aminosäuresalz ein Hydrogensalz,
wie NaHCO&sub3; sein. Saure Aminosäuren, wie Asp und Glu, können
als Alkalimetall oder Erdalkalimetallsalz oder ähnliches
vorliegen, und basische Aminosäuren, wie Lys und Arg,
können als Halogen-, NO&sub3;-, SO&sub4;-, CO&sub3;-Salz oder ähnliches
vorliegen.
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Das zu verwendende HL-Mittel wird unter Berücksichtigung
des zu messenden Gegenstandes ausgewählt, d. h. einem zu
messenden Bestandteils. Sollen beispielsweise Natrium oder
Chlorid im Blut gemessen werden, ist NaCl als HL-Mittel
ungeeignet. Phosphat ist als HL-Mittel ungeeignet, wenn
anorganischer Phosphor im Blut gemessen werden soll.
Außerdem kann ein HL-Mittel, welches die Reaktivität von für
bei der Messung verwendeten Reagentien beeinflußt, nicht
verwendet werden.
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Beispielsweise kann ein HL-Mittel, das Magnesium, Eisen,
Kupfer, Barium, Zink oder ähnliches enthält, nicht bei der
Messung von Calcium verwendet werden, da diese die
Calciummessung stören.
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Das HL-Mittel wird als wäßrige Lösung verwendet. Eine
geeignete Konzentration des HL-Mittels ist 0,1 bis 5 mol/l,
vorzugsweise 0,5 bis 3 mol/l, besonders bevorzugt 1 bis
2,5 mol/l.
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Zu der wäßrigen HL-Mittel-Lösung können andere
Bestandteile hinzugefügt werden. Beispielsweise kann Glycerin,
Ethylenglykol, Polyethylenglykol oder ähnliches zur
Verhinderung des Trocknens zugefügt werden. Ein Puffer kann zum
Zwecke der pH-Wert-Einstellung hinzugefügt werden.
Weiterhin können je nach Ziel der Analyse verschiedene
Verbindungen zugefügt werden, um die Trennung des Analyten in
dem filtrierten Plasma zu erleichtern. Beispiele für diese
Verbindungen sind selektiv an LDL-Cholesterin bindende
Reagentien, wie Dextrin und Phosphorwolframsäure, die
Fraktionierungsmittel zur Messung von HDL-Cholesterin
sind. Andere beispielhafte Verbindungen weisen eine
Reaktivität mit einem bestimmten Plasmabestandteil auf, wie
verschiedene Antigene und Antikörper, einschließlich
modifizierter.
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Durch Zusatz des HL-Mittels nimmt die Flexibilität der
Erythrozytenmembran ab, und die Erythrozyten werden
widerstandsfähig gegen eine Deformation. Es ist bekannt, daß
Erythrozyten durch einen wesentlich kleineren Raum, z. B.
einer Kapillare mit einem Durchmesser von 1 bis 2 um, als
die sichtbare Größe der Erythrozyten während des Filterns
von Vollblut gehen. Durch das Hinzufügen des HL-Mittels
kann die Filtration sehr glatt durchgeführt werden, da die
Deformation der Erythrozyten unterdrückt ist.
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Die Senkung des Hämatokritwerts durch das HL-Mittel steht
im Verhältnis zu der molaren Konzentration des HL-Mittels
im Plasmavolumen des Vollbluts, zu dem das HL-Mittel
zugefügt wird. Andererseits beginnt die Zerstörung von
Blutzellen (Hämolyse) bei einer HL-Mittel-Konzentration von
mehr als 200 mmol/l aufzutreten, und Hämoglobin, welches
der Hauptbestandteil der Erythrozyten ist, eluiert in das
Plasma. Entsprechend ist eine geeignete Menge an zu dem
Vollblut zugefügten HL-Mittel 10 bis 200 umol,
vorzugsweise 10 bis 100 umol, und besonders bevorzugt 20 bis 60 umol
pro 1 ml Vollblut. Das Volumen der zuzusetzenden wäßrigen
HL-Mittel-Lösung ist nicht besonders begrenzt. Zu große
Volumen sind jedoch nicht wünschenswert, da die
Verdünnungsrate des Vollbluts die Genauigkeit der
Gewichtsbestimmung stark herabsetzt. Darüber hinaus ist die
Meßgenauigkeit, bezogen auf die Meßempfindlichkeit, ein
Problem, wenn die Verdünnungsrate hoch ist. Deswegen ist ein
geeignetes Volumen der zuzusetzenden wäßrigen HL-Mittel-
Lösung 20% oder weniger, vorzugsweise 10% oder weniger,
besonders bevorzugt 5% oder weniger, des Vollbluts,
ausgedrückt als Volumenverhältnis. Die untere Grenze des
Volumens der wäßrigen HL-Mittel-Lösung hängt von der
Wasserlöslichkeit des HL-Mittels usw., ab und ist im allgemeinen
1% oder mehr. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die
Filtrationsfähigkeit durch Hinzufügen von nur einer
geringen Menge des HL-Mittels verbessert, und der Einfluß auf
die Meßempfindlichkeit und Genauigkeit ist gering.
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Wenn das HL-Mittel zu Vollblut zugefügt wird, wird das HL-
Mittel im Plasma gelöst, wodurch der osmotische Druck des
Plasmas erhöht wird, und ein Unterschied des osmotischen
Drucks zwischen Plasma und dem inneren der Blutzellen
aufgebaut wird. Es wirkt dann eine Kraft, so daß die
Differenz des osmotischen Drucks verloren geht. Das bedeutet,
daß Wasser aus den Blutzellen in das Plasma übertritt, um
den osmotischen Druck (d. h. die Konzentration an gelösten
Stoffen) in Blutzellen erhöht wird und der osmotische
Druck des Plasmas erniedrigt wird. Als Resultat nimmt das
Volumen der Blutzellen ab und das Plasmavolumen steigt,
woraus eine Abnahme des Hämatokritwerts resultiert. Durch
das Hinzufügen des HL-Mittels nimmt das Volumen des
Erythrozyten ab und die Flexibilität der Blutzellenmembran
nimmt ab, und entsprechend wird die Filtration unter
Ver
wendung von Filtermaterial, wie einer porösen Membran,
erleichtert.
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Außerdem wird die Wiedergewinnungsrate von Plasma durch
die Filtration verbessert, da die Menge an freiem Plasma
steigt.
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Obwohl die durch das HL-Mittel verursachte Abnahme des
Hämatokritwerts zusammen mit dem Anstieg der HL-Mittel-
Konzentration zunimmt, wird eine Blutzelle wahrscheinlich
bei einer hohen HL-Mittel-Konzentration zerstört und
hämolysiert, da die Stärke der Blutzellmembran schwach ist. Da
die Wirkung des HL-Mittels hauptsächlich über dessen
osmotischen Druck vermittelt wird, ist die Wirkung
proportional zu der Anzahl der gelösten Moleküle im Gesamtblut
(genauer im Plasma). Falls die zugefügte Menge an HL-
Mittel zu groß ist, wird die Differenz des osmotischen
Drucks zwischen der Innenseite und der Außenseite der
Blutzelle zu groß. Als Resultat wird die Blutzelle
zerissen oder die Blutzellmembran wird punktiert, so daß
Bestandteile aus den Blutzellen in das Plasma übertreten.
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Im allgemeinen basiert ein Bluttest auf der Messung der
Konzentration eines Plasmabestandteils. Wenn Erythrozyten
zerstört werden oder Blutzellmembranen punktiert werden,
treten Bestandteile des Erythrozyteninneren in den
Plasmaanteil über. Da Erythrozyten Hb (Hämoglobin) in einer
hohen Konzentration enthalten, wird das Plasma, wenn ein
solcher Übertritt auftritt, rot (genannt Hämolyse). Selbst
wenn die Zerstörung von Erythrozyten sehr gering ist, kann
die durch den Übertritt von Hb verursachte Färbung des
Plasmas nicht ignoriert werden, und bei bestimmten
Analyten beeinflußt dieser Übertritt den analytischen Wert sehr
stark. Beispielsweise sind in einem Bluttest bei gesunden
Personen die gemessenen Werte der meisten Enzyme, wie CPK
und ALP, nicht genau, wenn 0,1% der Gesamtblutzellen
zerstört sind. Manche Bestandteile (GOT, GPT, LDH, K) kommen
in einem Erythrozyten in einer höheren Konzentration als
im Plasma vor, und die Messung dieser Komponenten wird
durch Hämolyse direkt beeinflußt. Daher ist es notwendig,
die Trennung, Wiedergewinnung von Plasma unter Bedingungen
durchzuführen, unter denen so wenig wie möglich Hämolyse
auftritt.
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Das Gesamtblut einer gesunden Person enthält normalerweise
etwa 15 g/dl Hämoglobin (Hb). Der von übergetretenem
Hämoglobin ausgeübte Einfluß ist je nach Meßmethode und
gemessenem Objekt unterschiedlich.
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Beispielsweise ist der Einfluß der Hämolyse auf die
Messung von Blutzucker und Cholesterin gering, selbst wenn
etwa 150 mg/dl Hämoglobin im Plasma vorkommen
(entsprechend einer Hämolyse von 1% der gesamten Erythrozyten),
werden sie genau gemessen.
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Andererseits ist es bei GOT, GPT, LDH, K und ähnlichen
wahrscheinlich, daß sie durch Hämolyse beeinflußt werden,
und besonders im Fall von LDH oder K, werden die
gemessenen Werte gerade im Hinblick auf eine klinische Diagnose
signifikant beeinflußt, selbst wenn die
Hämoglobinkonzentration 15 mg/dl (entsprechend der Hämolyse von 0,1% der
gesamten Erythrozyten) entspricht.
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Daher kann im Fall der alleinigen Messung von Blutzucker
und Cholesterin die Plasmatrennung unvollständig sein.
Allerdings muß im Falle der Messung von GOT, GPT, LDH, K
etc., die Hämolyse geringer als 0,1% sein.
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Der Hämatokritwert von gesunden Personen beträgt 40 bis
45%, aber Vollblutproben mit einem Hämatokritwert von 55
bis 60% kommen bei einem klinischen Test in einer
Häufigkeit von einigen Prozent vor. Bei solchen Hoch-Hct
(Hämatokrit)-Proben beträgt der Hb-Gehalt 20 bis 25 g/dl.
Falls die Meßtoleranz gegen Hb 15 mg/dl beträgt, muß die
Hämolyse bei Hoch-Hct-Proben auf weniger als 0,07%
begrenzt werden.
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Werden anorganisches Salz, Aminosäure oder ein Salz
hiervon oder ein Agglutinin, wie Lectin, direkt im Blut als
Trockensubstanz oder ausgehend von einem imprägnierten
Filterpapier oder einem porösen Material nach Trocknen
gelöst, tritt das Blut in Kontakt mit der Trockensubstanz.
Es ist wahrscheinlich, daß Blut lokal und temporär in
einer anfänglichen Stufe des Lösens der Trockensubstanz im
Plasma hämolysiert. Entsprechend enthält durch das obige
Verfahren erhaltene Plasma häufig Hämoglobin, wenn auch
nicht sehr viel. Dieses Plasma stellt keine Probleme für
die Messung von Blutzucker oder Cholesterin dar, aber ist
problematisch für die Messung von GOT, GPT, LDH, K und
ähnlichem. Diese Tendenz ist noch ausgeprägter bei Hoch-
Het-Proben.
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Wird andererseits die obige Verbindung in Wasser gelöst,
um eine wäßrige Lösung in geeigneter Konzentration
herzustellen, ist der Grad der lokalen Konzentrationsanhebung
nach Mischen der wäßrigen Lösung im Plasma gering und geht
leicht vonstatten. Als Resultat tritt Hämolyse nur in
geringem Umfang auf.
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Die Menge an Blut, die verwendet werden soll, ist etwa 0,3
bis 3 ml, normalerweise etwa 0,5 bis 1,5 ml, und das
Mischen der wäßrigen HL-Mittel-Lösung mit dem Vollblut kann
einfach durch einige Male Schütteln durchgeführt werden.
Es wird angenommen, daß die Wirkung des HL-Mittels sofort
erfolgt, und daß die Mischung das Gleichgewicht innerhalb
weniger Sekunden erreicht. Dementsprechend ist es nicht
nötig, die Temperatur oder die Zeit des Mischens
einzustellen.
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Nach dem Mischen der HL-Mittel-Lösung mit der
Vollblutprobe wird die Vollblutprobe filtriert. Als Filtriermaterial
können verschiedene bekannte Filtriermaterialien, die für
das Trennen von Blutzellen geeignet sind, verwendet
werden. Beispiele für die Filtermaterialien sind
Glasfaserfilter, mikroporöse Membranen mit der Fähigkeit zum
Trennen von Blutzellen geeignet sind, wie solche hergestellt
aus Fluor-enthaltendem Polymer, bei dem die Oberfläche
hydrophil gemacht wurde, oder Polysulfon, Laminate aus
Glasfaserfilter und mikroporöser Membran, Laminate aus
Glasfaserfilter und Cellulosefilter, Laminate aus
Glasfaserfilter, Celluslosefilter und mikroporöser Membran,
Laminate aus fibröser poröser Membran und nicht-fibröser
poröser Membran, offenbart in dem Japanischen Patent KOKAI
Nr. 62-138756-8, 2-105043, 3-16651 etc. Bevorzugte
umfassen Glasfaserfilter, und Laminate aus Glasfaserfilter und
mikroporöser Membran, Laminate aus Glasfaserfilter und
Cellulosefilter; Laminate aus Glasfaserfilter,
Cellulosefilter und mikroporöser Membran werden besonders
bevorzugt. Filtermaterialien, die eine mikroporöse
Polysulfonmembran umfassen, werden ebenso bevorzugt. Die am meisten
bevorzugten sind Laminate aus Glasfaserfilter,
Cellulosefilter und mirkoporöser Membran, besonders solche, bei
denen eine Polysulfonmembran als mikroporöse Membran
verwendet wird.
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Ein bevorzugter Glasfaserfilter besitzt eine Dichte von
etwa 0,02 bis 0,3 g/cm³, vorzugsweise etwa 0,05 bis 0,2
g/cm³, besonders bevorzugt etwa 0,07 bis 0,15 g/cm³,
zurückhaltbare-Teilchengröße von etwa 0,8 bis 9 um,
vorzugsweise 1 bis 5 um. Durch das Behandeln der Oberfläche der
Glasfaser mit einem hydrophilen Polymer, wie in den
Japanischen Patenten KOKAI Nr. 2-208565, 4-208856 offenbart
ist, kann die Filtration wesentlich schneller und
einfacher durchgeführt werden. Die Oberfläche der Glasfaser
kann mit Lectin behandelt werden. Zwei oder mehr
Glasfaserfilter können laminiert sein.
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Mikroporöse Membranen mit der Fähigkeit, Blutzellen zu
trennen, bei denen die Oberfläche hydrophil gemacht wurde,
trennen Vollblut spezifisch in Blutzellen und Plasma ohne
Hämolyse in einem Ausmaß, das analytische Werte
substanziell beeinflußt. Die geeignete Porengröße der
mikroporösen Membran ist geringer als die Größe der rückhaltbaren
Teilchen des Glasfaserfilters und ist 0,2 um oder größer,
vorzugsweise etwa 0,3 bis 5 um, besonders bevorzugt etwa
0,5 bis 4,5 um, ganz besonders bevorzugt etwa 1 bis 3 um.
Der Porenanteil der mikroporösen Anteile ist vorzugsweise
höher, und ein geeigneter Porenanteil ist etwa 40 bis 95%,
vorzugsweise 50 bis 90%, besonders bevorzugt etwa 70 bis
95%. Beispiele für die mikroporösen Membranen sind
Polysulfonmembran, Fluor-enthaltende Polymermembran,
Celluloseacetatmembran, Nitrocellalosemembran etc. Die Oberfläche
der Membran kann hydrolisiert sein, oder sie kann durch
ein hydrophiles Polymer oder ein aktivierendes Mittel
hydrophil gemacht sein.
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Als Fluor-enthaltende Polymermembranen gibt es die aus
Polytetrafluorethylenfibrillen (feinen) zusammengesetzte und
in WO 87/02267 offenbarte mikroporöse Matrixmembran
(mikroporöse Schicht), Gore-Tex (W. L. Gore and
Associates), Zitex (Norton), Poreflon (Sumitomo Denki), etc.
Andere, als mikroporöse Schicht verwendbare
Fluor-enthaltende Polymerfolien umfassen die in U. S. Patent 3 368 872
(Beispiele 3 und 4), U. S. Patent 3 260 413 (Beispiele 3
und 4), U. S. Patent 4 201 548, etc. offenbarten
mikroporösen Polytetrafluorethylenmembranen, in U. S. Patent
3 649 505 offenbarte mikroporöse
Polyvinylidenfluoridmembranen, und ähnliche. Die mikroporöse Membran aus Fluor-
enthaltendem Polymer kann durch Verwendung eines einzigen
Fluor-enthaltenden Polymers oder durch Mischen von zwei
oder mehreren Arten von Fluor-enthaltenden Polymeren, von
weiterem Mischen von einem oder mehreren Polymeren, die
kein Fluor enthalten, oder Fasern hergestellt werden. Als
Struktur gibt es den unverstreckten, uniaxial
verstreck
ten, biaxial verstreckten, nicht-verstreckten laminierten
Einzelschicht-Typ, laminierten Doppelschicht-Typ, wie
beispielsweise eine Membran, laminiert mit einer anderen
Membranstruktur, wie beispielsweise einer Fasermembran. Im
Falle einer mikroporösen Membran vom nicht-laminierten Typ
mit Fibrillenstruktur oder die uniaxial oder biaxial
verstreckt worden ist, können mikroporöse Membrane mit einem
großen Porenanteil und einem kurzen Filterungsdurchgang
durch Verstrecken hergestellt werden. Bei mikroporösen
Membranen mit einem kurzen Filterungsdurchgang, tritt das
Verstopfen durch feste Bestandteile (hauptsächlich rote
Blutzellen) im Blut selten auf, und die Trennungszeit von
Blutzellen und Plasma ist kurz. Als Resultat ist die
Genauigkeit der quantitativen Analyse verbessert. Die
Adhäsionsfestigkeit des für die partielle Adhäsion an die
anliegende mikroporöse Membran verwendeten Adhäsionsmittels
kann durch Bereitstellen der in U. S. Patent 4 783 315
offenbarten physikalischen Aktivierung (vorzugsweise
Glimmentladung oder Koronaentladung) von mindestens einer
Seite der mikroporösen Membran aus Fluor-enthaltendem
Polymer, um diese hydrophil zu machen, verstärkt werden.
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Es ist gut bekannt, daß mikroporöse Membranen aus Fluor-
enthaltendem Polymer ansich eine geringe
Oberflächenspannung aufweisen. Als Resultat werden wäßrige
Flüssigkeitsproben abgestoßen und verbreiten sich nicht über die
Oberfläche oder dringen in das Innere ein. In der Erfindung
wurde das oben angeführte Abstoßungsproblem gelöst, indem
eine genügende Menge an oberflächenaktivem Mittel
eingebaut wurde, um die äußere Oberfläche und die Oberfläche
des inneren Raumes der mikroporösen Membran aus Fluor-
enthaltendem Polymer weitgehend hydrophil zu machen. Um
eine für das Verteilen, das Eindringen oder das Bewegen
einer wäßrigen Flüssigkeitsprobe über die Oberfläche oder
in die Innenseite der mikroporösen Membran aus Fluor-
enthaltendem Polymer ohne Abstoßen von der Membran
ausreichende hydrophile Eigenschaft zu erreichen, ist es im
all
gemeinen nötig, daß die Raumoberfläche der Membran mit
einer Menge an oberflächenaktivem Mittel von etwa 0,01 bis
10%, vorzugsweise etwa 0,1 bis 5%, besonders bevorzugt
etwa 0,1 bis 1%, des Porenvolumens der Membran beschichtet
ist. Beispielsweise ist eine bevorzugte Menge an zu
imprägnierendem Oberflächenmittel im Falle einer mikroporösen
Membran aus Fluor-enthaltendem Polymer mit einer Dicke von
50 um normalerweise im Bereich von 0,05 bis 2,5 g/m².
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Als Verfahren zum Imprägnieren des oberflächenaktiven
Mittels in die Fluor-enthaltende mikroporöse Membran umfaßt
ein verbreitetes Verfahren das Eintauchen der Fluor-
enthaltenden mikroporösen Membran in der Lösung des
oberflächenaktiven Mittels, gelöst in einem organischen
Lösungsmittel (z. B. Alkohole, Ester, Ketone) mit geringem
Siedepunkt (ein bevorzugter Siedepunkt ist im Bereich von
etwa 50ºC bis etwa 120ºC), um in die inneren Räume der
Membran im wesentlichen ausreichend einzudringen,
langsames Herausnehmen der Membran aus der Lösung und
nachfolgendes Trocknen mit Luft (vorzugsweise warmer Luft).
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Als oberflächenaktive Substanz zum Hydrophilmachen der
Fluor-enthaltenden mikroporösen Polymermembran kann die
oberflächenaktive Substanz nichtionisch, anionisch,
kationisch oder ampholytisch sein. Nicht-ionische
oberflächenaktive Substanzen sind jedoch für die mehrschichtigen
analytischen Elemente zum Analysieren von Vollblutproben
vorteilhaft, da nichtionische oberflächenaktive Mittel unter
den oben erwähnten oberflächenaktiven Mitteln relativ
geringe hämolytische Aktivität besitzen. Geeignete
nichtionische oberflächenaktive Mittel umfassen
Alkylphenoxypolyethoxyethanol, Alkylpolyetheralkohol,
Polyethylenglykolmonoester, Polyethylenglykoldiester, höheres Alkohol-
Ethylenoxidaddukt (Kondensat),
Polyolester-Ethylenoxidaddukt (Kondensat), höheres Fettsäurealkanolamid, etc.
Beispiele für das nichtionische oberflächenaktive Mittel
sind wie folgt: Als Alkylphenoxypolyethoxyethanol gibt es
Isooctylphenoxypolyethoxyethanole (Triton X-100;
enthaltend 9-10 Hydroxyethyleneinheiten im Durchschnitt, Triton
X-45; enthaltend 5 Hydroxyethyleneinheiten im
Durchschnitt) und Nonylphenoxypolyethoxyethanole (IGEPAL CO-
680; enthaltend 9 Hydroxyethyleneinheiten im Durchschnitt,
IGEPAL CO-710; enthaltend 10-11 Hydroxyethyleneinheiten im
Durchschnitt, LENEX 698; enthaltend 9
Hydroxyethyleneinheiten im Durchschnitt). Als Alkylpolyetheralkohol gibt es
höhere Alkoholpolyoxyethylenether (TRITON X-67; CA-
Registrier-Nr. 59030-15-8), etc.
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Die Fluor-enthaltende mikroporöse Polymermembran kann
hydrophil gemacht werden durch Bereitstellen von einem oder
mehreren wasserunlöslich gemachten wasserlöslichen
Polymeren in ihren Porenräumen. Die wasserlöslichen Polymere
umfassen Sauerstoff-enthaltende Kohlenwasserstoffe, wie
Polyacrylamid, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylamin und
Polyethylenimin, solche mit negativer Ladung, wie
Polyvinylalkohol, Polyethylenoxid, Polyethylenglykol,
Methylcellulose, Ethylcellulose, Hydroxyethylcellulose und
Hydroxypropylcellulose, Stickstoff-enthaltende, wie Polyacrylsäure,
Polymethacrylsäure und Polystyrolsulfonsäure, und
ähnliche. Das Wasserunlöslichmachen kann durch Hitzebehandlung,
Acetal-induzierende Behandlung, Veresterung, chemische
Reaktion mit Kaliumdichromat, Vernetzung mittels
ionisierbarer Strahlung oder ähnlichem, durchgeführt werden. Details
sind in den Japanischen Patenten KOKOKU Nr. 56-2094 und
56-16187 offenbart.
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Die mikroporöse Polysulfonmembran kann durch Lösen von
Polysulfon in Dioxan, Tetrahydrofuran, Dimethylformamid,
Dimethylacetamid, N-Methyl-2-pyrrolidon oder einem hieraus
gemischten Lösungsmittel, hergestellt werden, um eine
Rohflüssigkeit zur Ausbildung eines Films zu erhalten, wobei
diese durch direktes Einfließen in eine
Koagulierungslösung, Waschen und nachfolgendes Trocknen zu einem Film
gegossen wird. Details sind in dem Japanischen Patent KOKAI
Nr. 62-27006 offenbart. Zusätzlich sind mikroporöse
Polysulfonmembranen in den Japanischen Patenten KOKAI Nr.
56-12640, 56-86941, 56-154051 etc., offenbart, und sie
können in der Erfindung verwendet werden. Die mikroporösen
Polysulfonmembranen können hydrophil gemacht werden,
ähnlich dem Fluor-enthaltenden Polymer, durch Einbauen einer
oberflächenaktiven Substanz oder durch Bereitstellen eines
wasserunlöslich gemachten wasserlöslichen Polymers.
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Bevorzugte, nichtfibröse poröse Membranen in dem Laminat
aus einer fibrösen porösen Membran und einer nichtfibrösen
porösen Membran sind beschichtete Polymermembranen, die
aus einem Celluloseester, wie Celluloseacetat,
Celluloseacetat/butyrat oder Cellulosenitrat bestehen und in US 3
992 158 oder US 1 421 341 offenbart sind. Die nichtfibröse
poröse Membran kann eine mikroporöse Membran aus Polyamid,
wie 6-Nylon oder 6,6-Nylon, oder Polyethylen, Polypropylen
oder ähnliches, sein. Andere, für den Blutzell-trennenden
Filter verwendbare nichtfibröse poröse Membranen umfassen
kontinuierliche Mikroraum-enthaltende poröse Membranen,
wobei Polymerteilchen, Glasteilchen, Diatomenerde oder
ähnliches, durch ein hydrophiles oder
nicht-wasseradsorbierendes Polymer, wie in U. S. Patent 3 992 158 und
U. S. Patent 4 258 001 offenbart, verbunden sind.
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Eine bevorzugte effektive Porengröße der nichtfibrösen
porösen Membran beträgt 0,2 bis 10 um, bevorzugt 0,3 bis 5
um, besonders bevorzugt 0,6 bis 5 um. Die effektive
Porengröße der nichtfibrösen porösen Membran in der Erfindung
ist die durch die ASTM F316-70 entsprechende
Blasenbildungsmethode gemessene Porengröße. In dem Falle, daß die
nichtfibröse poröse Membran ein Membranfilter ist, der aus
beschichtetem Polymer, hergestellt durch die
Phasenseparationsmethode, besteht, sind die Flüssigkeitsdurchlässe in
Richtung der Dicke im allgemeinen am schmalsten an der
freien Oberfläche (Glanzfläche) während des
Herstellungsprozesses der Membran, und die Porengröße im Schnitt jedes
Flüssigkeitsdurchlasses, ausgenommen als Kreis, ist nahe
der freien Oberfläche am kleinsten. Die minimale
Porengröße der Durchlässe in Richtung der Dicke pro
Flächeneinheit weist eine Verteilung in Frontrichtung des
Membranfilters auf, und der maximale Wert bestimmt die
Filtrationsleistungsfähigkeit. Im allgemeinen wird dies durch die
begrenzte Blasenbildungsmethode bestimmt.
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Wie oben erwähnt, werden Flüssigkeitsdurchlässe bei einem
Membranfilter, der aus beschichtetem Polymer, hergestellt
nach der Phasentrennungsmethode, besteht, in der Richtung
der Dicke bei dem Herstellungsprozeß der Membran an der
freien Oberfläche (Glanzfläche) am engsten. Im Falle der
Verwendung der Membran als die nichtfibröse Membran des
erfindungsgemäßen Filtermaterials, ist es bevorzugt, die
Glanzschicht des Membranfilters zu der Seite zu richten,
an der der Plasmateil entladen wird.
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Das Material, aus dem die fibröse poröse Membran aufgebaut
ist, kann Filterpapier, Vliesgewebe, gewebtes Gewebe, wie
Leinengewebe, gestricktes Gewebe, wie Trikotstoff, etc.,
sein. Unter diesen werden gewebtes Gewebe und gestricktes
Gewebe bevorzugt. Das gewebte Gewebe oder ähnliches kann
durch Blasentladung, wie in dem Japanischen Patent KOKAI
Nr. 57-66359 offenbart, behandelt werden.
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Das Porenvolumen (pro Flächeneinheit) der fibrösen porösen
Membran kann gleich oder unterschiedlich zu dem der
nichtfibrösen porösen Schicht sein. Die Porenvolumenbeziehung
zwischen diesen kann durch Ändern von Porengehalt und/oder
Dicke eingestellt werden.
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Im Falle, daß das erfindungsgemäß verwendete
Filtriermaterial ein Laminat ist, können die entsprechenden Schichten
zusammengefügt werden durch Aneinanderbinden unter
Verwendung von partiell verteiltem (z. B. aufgetropftem)
Kleb
stoff, entsprechend den Offenbarungen in den Japanischen
Patenten KOKAI Nr. 62-138756-8, 2-105043, 3-16651, etc.
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Bei dem erfindungsgemäßen Filtriermaterial wird
angenommen, daß das Filtriermaterial die Blutzellen nicht nur an
der Oberfläche zurückhält, sondern daß es, um Blutzellen
zu entfernen, schrittweise zuerst große
Blutzellbestandteile und dann kleinere Blutzellbestandteile in der
Raumstruktur abfängt, unter Eindringen in die Richtung der
Dicke in das gesamte Filtriermaterial, was volumentrische
Filtration genannt wird.
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In dem erfindungsgemäßen System kann die Dichte, Dicke,
Fläche, etc., des Filtermaterials entsprechend des
bereitgestellten, d. h. des zu separierenden Blutvolumens,
eingestellt werden. Im Falle der Verwendung eines
Glasfaserfilters wird das wiederzugewinnende Volumen Plasma oder Serum
10% oder mehr, vorzugsweise 20 bis 100%, besonders
bevorzugt 30 bis 70% des Glasfaserfiltervolumens. Tatsächlich
ist es vorzuziehen, einen Glasfaserfilter zu verwenden,
der ein doppelt so großes Volumen als das
zurückzugewinnende Plasmavolumen hat.
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Ein Zuführvolumen von zu filtrierendem Vollblut ist nicht
beschränkt. Obwohl das Vollblutvolumen kleiner ist als das
Volumen des Glasfaserfilters, kann Plasma getrennt werden.
Jedoch ist das Verhältnis (Wiedergewinnung)
wiedergewonnenes Plasmavolumen zu Vollblutvolumen klein. Im Falle, daß
das Vollblutvolumen größer ist als das Volumen des
Glasfaserfilters, wird der Raum des Glasfaserfilters mit
Blutzellen ausgefüllt, und dann tritt ein Durchbruch von
Blutzellen durch den Glasfaserfilter auf. Wird eine
mikroporöse Membran bereitgestellt, werden die durchgebrochenen
Blutzellen von der mikroporösen Membran aufgefangen. Als
Resultat steigt das Volumen des wiedergewonnenen Plasmas,
verglichen mit der Verwendung von Glasfaserfilter alleine,
an. Im allgemeinen ist ein geeignetes Volumenverhältnis
von Vollblut zu Glasfaserfilter 0,5 bis 10 : 1, vorzugsweise
0,7 bis 5 : 1, besonders bevorzugt 0,8 bis 3 : 1.
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Beim Filtrieren ist es vorzuziehen, die Filtration durch
Pressen von der Blutzuführungsseite oder Saugen von der
gegenüberliegenden Seite zu beschleunigen. Ein bevorzugtes
Volumen (z. B. Schnittfläche des Kolbens X Hub in Spritze)
zum Hervorrufen der Pressungs- oder Saug-Bedingungen ist
doppelt bis 5 Mal so groß wie das Volumen des
Filtermaterials. Die Preß- oder Saugdauer ist nicht strikt
beschränkt. Die Dauer liegt jedoch innerhalb von 60
Sekunden, um Hämolyse zu verhindern, wobei die Filtration
vorzugsweise schnell durchgeführt wird. Beispielsweise ist im
Falle des Filtrierens von 1 ml Vollblut eine geeignete
Preß- oder Saugphase 1 bis 60 Sekunden, vorzugsweise 2 bis
30 Sekunden, besonders bevorzugt 5 bis 20 Sekunden lang,
und danach wird der Druck schnell auf atmosphärischen
Druck zurückgeführt.
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Wie oben erwähnt, wird in dem erfindungsgemäßen System das
Plasmavolumen, das wiedergewonnen werden soll,
voreingestellt und das Glasfaserfiltervolumen wird entsprechend
eingestellt. Dann wird ein geeignetes Blutvolumen
zugeführt und gepreßt oder gesaugt. Sobald ein vorbestimmtes
Plasmavolumen erhalten ist oder eine vorbestimmte
Zeitdauer vorüber ist, wird der Druck wieder auf atmosphärischen
Druck zurückgeführt. Das so erhaltene Plasma oder Serum
wird einer Analyse auf konventionelle Art unterzogen. Das
erfindungsgemäße Verfahren ist für die Analyse vieler
Daten unter Verwendung von Trockenanalyseelementen geeignet.
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Entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die
Plasmatrennung aus Vollblut effizient erreicht werden, und
das wiedergewonnene Plasmavolumen kann vergrößert werden.
Durch die Auswahl des Reagens kann gutes Plasma, das keine
Abweichung hinsichtlich eines Bestandteils aufweist und
welches mit demselben Grad an Genauigkeit wie Plasma, das
durch Zentrifugieren erhalten wird, gemessen werden kann,
durch eine einfache Filtrierung erhalten werden.
BEISPIELE
Beispiel 1
1 Zusammenbau der Filtereinheit
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Eine in Fig. 1 gezeigte Filtereinheit wurde verwendet.
Die Filtereinheit 1 bestand aus einem Filterhalter 2 und
einer Spritze 3. Der Filterhalter 2 besaß die Form eines
kurzen Zylinders mit einem äußeren Durchmesser von 25 mm
, einem inneren Durchmesser von 20 mm und bestand aus
einem Haltekörper 4, der Filtermaterial enthält, und einem
Aufsatz 5, der auf den Haltekörper 4 aufgeschraubt war.
Das untere Ende des Haltekörpers war geöffnet, und im
Inneren war eine Filterkammer b ausgeformt. Auf dem unteren
Teil der äußeren peripheren Wand des Haltekörpers 4 war
ein Gewinde zum Schrauben des Aufsatzes 5 ausgebildet.
Andererseits war das obere Ende des Haltekörpers 4
geschlossen, und eine Probenaufnahme 7 ragte in der Mitte des
oberen Endes nach außen. Ein Gewinde, welches mit dem Gewinde
des Haltekörpers 4 veschraubt ist, war an dem oberen Teil
der inneren peripheren Wand des Aufsatzes 5 ausgebildet.
Der zentrale Teil des Bodens des Aufsatzes 5 war nach
unten erweitert, und ein Ansaugteil 9, welches mit einer
Tülle 8 der Spritze 3 versehen ist, ragte hervor.
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Der obige Filterhalter 2 wurde umgedreht, und zwei
übereinander angeordnete Glasfaserfilter-10-Blätter (Whatman
GF/D) als Scheibe ausgestanzt mit einem Durchmesser von
20,1 mm wurden in die Filterkammer 6 gelegt. Der
Glasfaserfilter 10 hatte ein Flächengewicht von 122,4 g/m³, eine
Dicke von 1,3 mm und eine Dichte von 0,094 g/cm³. Ein
Cellulosefilter ("Cytosep", hergestellt von Cytosep) 11 mit
einer Dicke von 1 mm und einem Durchmesser von 20,1 mm
wurde hierauf befestigt unter Verwendung eines
doppelseitigen Klebebandes 12 mit einem Durchmesser von 20,1 mm
und mit einer 13 mm -Öffnung im Querschnitt. Eine
mikroporöse Polysulfonmembran ("PS", Fuji Photo Film Co, Ltd.)
13, mit einer Porengröße von 2 um, einer Dicke von 0,15 mm
und einem Durchmesser von 20,1 mm wurde hierauf
angeordnet, und ein Vinylklebeband 14 mit einem Durchmesser von
20, 1 mm und einer Öffnung mit 8 mm im Durchmesser in
der Mitte wurde weiter darauf angebracht und angedrückt,
um es zu verbinden.
2 Blutentnahme
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5 ml Vollblut wurden von einem gesunden Mann mit Heparin
entnommen. Der Hämatokritwert des Blutes wurde gemessen
und mit 44% bestimmt.
3 Herstellung des HL-Mittels
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Lithiumsulfatmonohydrat (Li&sub2;SO&sub4; · H&sub2;O) wurde gewogen und in
destilliertem Wasser gelöst, wodurch eine 2 mol/l wäßrige
Lithiumsulfatlösung erhalten wurde.
4 Probe mit zugesetztem HL-Mittel
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Vollblut 30 ul der in 3 hergestellten HL-Mittel-Lösung
wurden in ein 2 ml-Probenröhrchen pipettiert, und 1,5 ml
des Vollbluts mit Heparin wurden zugefügt. Der
Hämatokritwert wurde gemessen und mit 30% bestimmt.
5 Filtration des Blutes
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Das in 4 hergestellte Vollblut wurde in die unter 1
zusammengebaute Filtereinheit überführt und 20 Sekunden bei
einer Sauggeschwindigkeit von 600 ul/min. durchgesaugt.
Als Resultat wurde das Plasma abgetrennt und an der
Poly
sulfonmembran in dem erweiterten Teil des Aufsatzes
gesammelt.
6 Wiedergewinnung des abgetrennten Plasmas
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Abgetrenntes Plasma wurde mit einer Mikropipette
entnommen, und das Volumen des Plasmas wurde gemessen. Das
Volumen war etwa 395 ul. Hämolyse trat nicht auf. Die LDH-
Aktivität des Plasmas wurde gemessen und mit 179 U/l
bestimmt. Da die LDH-Aktivität des Kontrollplasmas, das
durch Zentrifugieren ohne HL-Mittel abgetrennt wurde, 173
U/l war, war die LDH-Aktivität des Plasmas, das nach dem
erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurde, praktisch im
selben Bereich wie die des Kontrollplasmas.
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Da das Volumen des Glasfaserfilters 628 mm³ betrug, war die
Hälfte 314 mm³ (d. h. 314 ul). Mittels dieses Beispiels
wurde bestätigt, daß das Plasma in einer Menge von der Hälfte
oder mehr des Glasfaserfiltervolumens einfach und sicher
wiedergewonnen werden kann.
Vergleichsbeispiel 1
1 Herstellung eines Li&sub2;SO&sub4;-imprägnierten
Glasfaserfilterblattes
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10 ml einer wäßrigen 1 mol/l Li&sub2;SO&sub4;-Lösung wurden
hergestellt und in eine Petrischale mit einem Durchmesser von
50 mm überführt und in Scheiben von 20 mm im
Durchmesser gestanzte Glasfaserfilter (Whatman GF/D) wurden in die
wäßrige Li&sub2;SO&sub4;-Lösung eingetaucht, um mit etwa 1 ml/cm²
imprägniert zu werden, und sie wurden bei Raumtemperatur
stehen gelassen, gefolgt von Trocknen bei 60ºC für 3
Stunden.
2 Zusammenbau der Filtereinheit
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Zwei der in 1 hergestellten Li&sub2;SO&sub4;-imprägnierten
Glasfaserfilterblätter wurden in die Filterkammer 6 überführt,
und eine Filtereinheit wurde auf gleiche Weise wie in
Beispiel 1 hergestellt.
3 Herstellung von Vollblut
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5 ml Vollblut wurden einem gesunden Mann mit Heparin
entnommen, und 1,5 ml des Vollbluts wurde in ein
Probenröhrchen überführt.
4 Filtration des Blutes
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Unter Verwendung der in 2 zusammengebauten Filtereinheit
wurde das Vollblut unter Saugen in gleicher Weise wie in
Beispiel 1 filtriert. Als Resultat wurden etwa 230 ul
Plasma erhalten, aber das Plasma war durch Hämolyse rot
gefärbt. Die Hb-Konzentration des Plasmas betrug etwa 150
bis 200 mg/dl. Die LDH-Aktivität des Plasmas wurde
gemessen und mit 350 IU/l bestimmt. Andererseits betrug die
LDH-Aktivität des Vollbluts, zu dem kein Li&sub2;SO&sub4; hinzugefügt
worden war, 192 IU/l.
Vergleichsbeispiel 2
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Anstelle der wäßrigen 2 mol/l Li&sub2;SO&sub4;-Lösung aus Beispiel 1
wurde zu dem Vollblut Kochsalzlösung hinzugefügt, und der.
Abnahmegrad des Hämatokrit (Hct) wurde untersucht, zu 1,5
ml des Vollbluts mit Heparin wurde Kochsalzlösung
hinzugefügt und nach Mischen wurde der Hämatokritwert gemessen.
Zwei Spiegel des Vollbluts einer gesunden Person (Hct 44%)
und ein Hoch-Hämatokrit-Vollblut (Hct 54%) wurden
untersucht.
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Die Resultate sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Im Falle
der Verwendung von Kochsalzlösung war der niedrigste Grad
des Hämatokritwerts nahezu in Übereinstimmung mit dem
Wert, der basierend auf einer bloßen Verdünnung errechnet
worden war, da die Kontraktion der Erythrozyten nicht
auftrat.
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Es wurde bestätigt, daß eine Abnahme des Hct bei den
obigen Konzentrationen nicht auftritt.
Tabelle 1
Beispiel 2
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Von gesunden Frauen wurde Blut entnommen, um 20 ml
Vollblut mit Heparin zu erhalten. Der Hämatokritwert des
Blutes wurde gemessen und mit 41% bestimmt. Ein Teil des
Blutes wurde zentrifugiert, um Plasma abzutrennen, um Hoch-
Hämatokrit-Vollblutproben herzustellen. Das Plasma wurde
zu dem ursprünglichen Vollblut hinzugefügt, um Niedrig-
Hämatokrit-Vollblut herzustellen. Auf diese Weise wurden 5
Arten (Nr. 1-Nr. 5) Vollblutproben mit unterschiedlichen
Hämatokritwerten hergestellt.
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Zu jeder der Nr. 1-Nr. 5-Proben wurden 2 mol/l Li&sub2;SO&sub4; in
einer Menge von 50 ul pro 1 ml Vollblut hinzugefügt. Die
Probe wurde unter Saugen und unter Verwendung der gleichen
Filtereinheit wie in Beispiel 1 gefiltert, vorausgesetzt,
daß die Vollblutprobe von der oberen Seite eingeführt
wurde und eine 5 ml-Spritze wurde an dem Ansaugteil, das sich
an der Unterseite befindet, befestigt. Das Saugen wurde in
einem Hubvolumen von 800 ul 30 Sekunden durchgeführt. Das
Volumen des Glasfaserfilters war 185 mm³ (d. h. 185 ul). Die
wiedergewonnenen Volumina jeder Probe sind in Tabelle 2
zusammengefaßt.
Tabelle 2
Vergleichsbeispiel 3
-
Unter Verwendung der gleichen Filtereinheit wurden die
gleichen Vollblutproben ohne Zusatz von Li&sub2;SO&sub4; gefiltert.
Die Resultate sind ebenso in Tabelle 2 gezeigt. Je höher
der Hämatokritwert des Vollblutes war, desto größer war
der Effekt des HL-Mittels. Im Falle des Hämatokritwerts
von 48% oder weniger betrug das wiedergewonnene Plasma
etwa 1/4 bis 1/2,7 dessen unter Verwendung des HL-Mittels,
im Falle von 59% jedoch war das Verhältnis 1/7. Im Falle
von 68% war die Menge des wiedergewonnenen Plasmas sehr
klein. Im Falle des Hämatokritwertes von 48% oder mehr
wurde mehr oder weniger Hämolyse beobachtet.
Beispiel 3
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In einem Experiment ähnlich zu Beispiel 1 wurden 15 ml
wäßrige 2 mol/l Li&sub2;SO&sub4;-Lösung zu 1,5 ml Vollblut zugefügt,
und das Blut wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1
gefiltert. Als Resultat wurden 228 ul Plasma ohne Hämolyse
wiedergewonnen. Der Hct-Wert war 48% vor Zusetzen des HL-
Mittels und 42% nach Zusatz dessen.
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Die Bestandteile des Plasmas, das so wiedergewonnen worden
war, wurden unter Verwendung von zwei
Analysiervorrichtungen ("Fuji Drichem 5500", "Fuji Drichem 800", Fuji Photo
Film Co., Ltd.) gemessen. Unter Verwendung einer
Kalibrierungskurve, die gezeichnet wurde unter Verwendung von
Plasma, das durch Zentrifugieren von Vollblut, dem Li&sub2;SO&sub4;
in derselben Konzentration zugefügt worden war, erhalten
wurde, wurde die Konzentration jedes Bestandteiles aus den
gemessenen Werten bestimmt. Die Resultate sind in Tabelle
3 zusammengefaßt. Als Kontrolle wurden Bestandteile des
Plasmas gemessen, das durch Zentrifugieren des Vollbluts
ohne Zusatz von HL-Mittel erhalten wurde. Es wurde
bestätigt, daß alle 23 analytischen Werte im selben Grad an
Genauigkeit wie die Kontrolle gemessen werden können.
Tabelle 3
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Das Vollblut wurde auch ohne HL-Mittel filtriert, und in
diesem Falle wurde kein Plasma ohne Hämolyse
wiedergewonnen.
Beispiel 4
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Vollblut wurde in Blutzellen und Plasma aufgetrennt, und
dann wurden beide in unterschiedlichem Verhältnis
gemischt, um Vollblutproben mit einem Hämatokritwert von
20%, 40%, 48% und 60% herzustellen. Die Proben wurden wie
in Beispiel 3 behandelt und unter Verwendung der
Analysiervorrichtung "Hitachi 7150" und einer Elektrolyt-
Analysiervorrichtung "Fuji Drichem 800" gemessen.
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Die Resultate sind in Fig. 2 gezeigt. Wie in Fig. 2
gezeigt, beträgt die Abweichung der gemessenen Resultate der
Kontrolle, bezogen auf alle analytischen Werte, innerhalb
des Bereiches von +10% über dem gesamten
Hämatokritwertbereich von 20 bis 60%. Darüber hinaus lag die Abweichung
auf Basis des gemessenen Wertes bei Hct 48% innerhalb von
± 5% nur für einen Teil der analytischen Werte.
Beispiel 5
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In einem zu Beispiel 1 gleichartigen Experiment, wurde
Cs&sub2;SO&sub4; als HL-Mittel anstelle von Li&sub2;SO&sub4; verwendet. 60 ul 2
mol/l wäßrige Cs&sub2;SO&sub4;-Lösung wurden zu 1,5 ml Vollblut mit
Heparin zugefügt. Der Hct-Wert betrug 38% vor Zusatz des
HL-Mittels und 31% nach dessen Zusatz.
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Das Vollblut mit dem HL-Mittel wurde unter Saugen, wie in
Beispiel 1, filtriert, und 320 ul Plasma ohne Hämolyse
wurden erhalten. Plasmabestandteile wurden mit einer
Analysiervorrichtung ("Fuji Drichem 3000", Fuji Photo Film
Co., Ltd.) gemessen. Im Vergleich dazu wurde das obige
Vollblut vor Zusatz des HL-Mittels zentrifugiert, um
Plas
ma zu erhalten, und Plasmabestandteile wurden ebenso
gemessen. Die Resultate sind in Tabelle 4 zusammengefaßt.
Tabelle 4
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In der obigen Tabelle scheint die Abnahme der gemessenen
Werte von der Verdünnung durch Wasser abzuhängen, welches
aus den Blutzellen in das Plasma aufgrund des Zusatzes des
HL-Mittels abgegeben wurde. Entsprechend wurde der Meßwert
jedes Bestandteils um den in Tabelle 4 angegebenen
Korrekturfaktor korrigiert, und die korrigierten Werte sind
ebenso angegeben. Die Bewertung basierte auf der
Zulässigkeit im klinischen Test wie folgt: : Sehr exzellent, O:
Exzellent, Δ: gut, x: Fehler.
Beispiel 6
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Sieben HL-Mittel, die gute Resultate hinsichtlich der
Messung von Elektrolyten ergaben, besonders von Na, K, Cl und
Ca, die im klinischen Test wichtig sind, wurden
ausgewählt.
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Unter Verwendung dieser HL-Mittel wurden zu Beispiel 1
ähnliche Experimente durchgeführt und die Einflüsse auf
die gemessenen Na-, K- und Cl-Werte wurden untersucht. Die
Resultate sind in Tabelle 5 zusammengefaßt.
Tabelle 5
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Wie in Tabelle 5 gezeigt, waren Li&sub2;SO&sub4; und Cs&sub2;SO&sub4; besonders
exzellente HL-Mittel. In Tabelle 5 sind HL-Mittel, die die
gleiche Ionenart enthalten wie der Zielanalyt, ungeeignet.
Beispielsweise ist Asp·Na ungeeignet für die Messung von
Na, da es Na enthält. Selbst wenn ein HL-Mittel nicht
dieselbe Ionenart wie der Zielanalyt enthält, ist ein HL-
Mittel, das ein analoges Ion enthält, welches die Messung
des Targetanalyts durch eine Ionen-selektive Elektrode
stört, ebenso ungeeignet. Entsprechend können die HL-
Mittel, die in Tabelle 5 mit einem X bezeichnet sind,
durch Ersetzen einer für die Messung geeigneten Ionenart
anstelle der gleichen oder analogen Ionenart in jedem HL-
Mittel verwendet werden. Alle HL-Mittel in Tabelle 5 sind
verwendbare HL-Mittel, außer wenn Elektrolyte gemessen
werden.