DE69700561T2

DE69700561T2 - Verfahren zur Entfernung von N-Terminalem Methionin

Info

Publication number: DE69700561T2
Application number: DE69700561T
Authority: DE
Inventors: Osamu Nishimura; Hiroaki Oh Mae; Masato Suenaga; Shinji Tsuji
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1996-06-14
Filing date: 1997-06-05
Publication date: 2000-05-04
Anticipated expiration: 2017-06-06
Also published as: EP0812856B1; CN1158303C; KR100478747B1; CA2207723A1; IL121053A0; ES2136458T3; KR980002062A; IL121053A; US6066470A; EP0812856A1; CA2207723C; US6309859B1; GR3032139T3; DE69700561D1; ATE185146T1; CN1178798A; DK0812856T3

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Entfernung eines gegebenenfalls oxidierten Methionin-Rests am N-Terminus eines Peptids (einschließlich eines Proteins) oder eines Salzes davon.

STAND DER TECHNIK

Bei der Synthese eines Proteins innerhalb einer Zelle wird sein Aminoterminus entsprechend dem mRNA-Initiationscodon, d. h. AUG, immer von Methionin gebildet. In natürlich erzeugten, reifen Proteinmolekülen ist dieser Methionin-Rest jedoch üblicherweise nicht mehr vorhanden, da er durch nachfolgende Verarbeitung entfernt wurde.
Jüngste Fortschritte in der Gen-Rekombinationstchnik haben es ermöglicht, nützliche Proteine unter Verwendung von Mikroben oder Tierzellen, z. B. Escherichia coli, zu produzieren. In manchen Fällen behält das produzierte Protein das oben beschriebene Methionin bei. Beispielsweise erreicht die Methionin-Additionsrate bei von Escherichia coli exprimiertem Human-Wachstumshormon nahezu 100% [Nature 293, 408 (1981)], und bei Interferon-α 50% [Journal of Interferon Research 1, 381 (1981)]. Bei der Produktion von nicht-glykosyliertem Human-Interleukin-2 (rhIL-2) durch Expression in Escherichia coli wurde zusätzlich zu Molekülen, deren Initiations-Aminosäurerest Alanin ist (wie bei natürlichem Interleukin-2), ein zweites Molekül mit einem Methionin-Rest am Aminoterminus (Met-rhIL-2) gefunden.
Dixon berichtete 1964, dass DL-Alanylglycin bei Umsetzung mit Glyoxalsäure, Pyridin und Kupfer(II)-acetat durch Transaminierung Pyruvoylglycin ergibt [Biochemistry Journal 92, 661 (1964)]. Außerdem berichtete Dixon, dass so erhaltenes Pyruvoylglycin bei Umsetzung mit Thiosemicarbazid unter Spaltung einer Amidbindung Glycin ergibt [Biochemistry Journal 90, 2C (1964)]. Weiters berichtete Dixon, dass die obige chemische Reaktion auf Pseudomonas-Cytochrom C-551 angewandt und die N-terminale Glutaminsäure entfernt wurde [Biochemistry Journal 94, 463 (1965)].
Die von Dixon berichteten Reaktionen betreffen jedoch die Entfernung einer N-terminalen Aminosäure von synthetisierten Peptiden oder reifen Proteinen, und es gab in den über 30 Jahren nach diesem Bericht keine weiteren Berichte darüber, dass die obige chemische Reaktion zur Entfernung von N-terminalem Methionin an einem mittels Gen- Rekombinationstechnik erzeugten Protein dienen könnte.
Es kann hypothetisch angenommen werden, dass die dreidimensionale Struktur, die biologische Wirksamkeit und die Stabilität zwischen Molekülen mit Methionin an ihrem N- Terminus und Solchen ohne Methionin differieren können, obwohl sie ansonsten dieselben Moleküle sind; es wird angenommen, dass die Addition von Methionin an den Aminoterminus möglicherweise einen Anstieg der Protein-Antigenität hervorruft. Spmit wäre es zur gewerblichen Anwendung wichtig, ein relativ einfaches und wirksames Verfahren zur selektiven Entfernung derartigen aminoterminalen Methionins zu entwickeln.
Bei früheren Verfahrensweisen zur Lösung dieses Problems wurde ein Verfahren vorgeschlagen, nach dem Methionin mittels Spaltung mit Bromcyan (BrCN) [Science 198, 1056 (1977)] entfernt werden konnte; es wurden jedoch keine zufriedenstellenden Ergebnisse erzielt, da das Verfahren nicht nur das Fehlen eines oder mehrerer anderer Methionin-Reste im Molekül des erforderlichen reifen Proteins voraussetzt, sondern das Protein auch einer heftigen chemischen Reaktion aussetzt.
Ein chemisches Verfahren, nach dem es möglich ist, einen N-terminalen Methionin-Rest selektiv und effizient von einem Peptid oder Protein mit einem Methionin an seinem N- Terminus unabhängig von der Art des Peptids oder Proteins zu entfernen, ist zur Zeit nicht bekannt. Der Grund dafür liegt wohl in der Schwierigkeit, eine geeignete chemische Reaktion zu finden, um ein N-terminales Methionin unter schonenden Bedingun gen ohne Denaturierung des Peptids oder Proteins als Endprodukt zu entfernen. Insbesondere beim Entfernen eines zusätzlich addierten N-terminalen Methionins an einem Protein, das relativ hohes Molekulargewicht aufweist, mittels Gen-Rekombinationstechnik erzeugt wurde und für medizinische Zwecke dienen soll, ist es erforderlich, dass die Aktivität des Proteins nach Entfernung des Methionins nicht verringert ist. Daher ist es üblicherweise notwendig, eine solche Reaktion in schwach saurer bis basischer Lösung ohne Erhitzen durchzuführen. Deswegen wurden nach dem Stand der Technik keine guten Reaktionsbedingungen beschrieben, da die chemische Reaktion zahlreichen Einschränkungen unterliegen muss.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes haben nach Untersuchungen, wie ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit einer natürlichen Aminosäuresequenz durch selektive Entfernung eines N-terminalen Methionins aus einem durch Gen- Rekombinationstechnik produzierten Protein bereitgestellt werden könnte, ein Verfahren zur Entfernung eines N-terminalen Methionins aus einem Protein mit einem zusätzlichen Methionin im Protein entwickelt, indem ein Methionin im Protein mit dem zusätzlichen Methionin in ein α-Diketon übergeführt und weiters das α-Diketon mit einem Derivat eines organischen Diamins umgesetzt wird, wodurch ein Peptid oder Protein ohne zusätzliches Methionin am N-Terminus erhalten wird. Das vorliegende Verfahren zum Erhalt des Peptids oder Proteins ist gekennzeichnet durch die Umsetzung eines Peptids oder Proteins mit einem zusätzlichen Methionin der Formel (I) mit einer Glyoxalsäure als Derivat eines α-Diketons, einem Kupfer(II)-sulfat, das ein Übergangsmetallion bereitstellen kann, und einem Pyridin als Aminderivat, um Transaminierung herbeizuführen und Methionin in ein α-Diketon überzuführen, gefolgt von Hydrolyse des erhaltenen α-Diketons mit einem o-Phenylendiamin als Diaminderivat, und ist ebenso gekennzeichnet durch die Entfernung des N-terminalen Methionins aus dem Peptid oder Protein mit dem zusätzlichen Methionin, ohne die Aktivität des Peptids oder Proteins herabzusetzen.
Auf diese Entdeckung folgten weitere Untersuchungen, die zur Vervollkommnung der vorliegenden Erfindung geführt haben.
In Formel (I) stellt X eine Peptidkette aus zwei oder mehr Aminosäuren dar: Vorzugsweise stellt X eine Peptidkette dar, die Teil eines mittels Gen-Rekombinationstechnik erzeugten Proteins ist. Weiters kann das aus mehreren Aminosäuren bestehende Peptid oder Protein entweder glykosyliert oder nicht-glykosyliert sein.
D. h., die vorliegende Erfindung betrifft:
(1) Verfahren zur Entfernung eines N-terminalen, gegebenenfalls oxidierten, Methionin- Rests, umfassend das Umsetzen eines Peptids oder eines Salzes davon mit dem Methionin-Rest an seinem N-Terminus mit einem α-Diketonderivat und das anschließende Hydrolysieren des erhaltenen Produktes.
(2) Verfahren gemäß obigem Punkt (1), worin das Peptid mit einem gegebenenfalls oxidierten Methionin-Rest an seinem N-Terminus ein mittels Gen-Rekombinationstechnik erzeugtes Peptid ist.
(3) Verfahren gemäß obigem Punkt (2), worin das mittels Gen-Rekombinationstechnik erzeugte Peptid zumindest 30 Aminosäure-Reste aufweist. Eine bevorzugte Gruppe von Peptiden besteht aus Wachstumshormon, Neurotrophin-3, Betacellulin, Parathyreoidhormon und Interleukin-2, die jeweils einen gegebenenfalls oxidierten Methioninrest an ihrem N-Terminus aufweisen.
(4) Verfahren gemäß obigem Punkt (1), worin das α-Diketonderivat in Gegenwart eines Übergangsmetallions umgesetzt wird.
(5) Verfahren gemäß obigem Punkt (1), worin das α-Diketonderivat in Gegenwart einer Base umgesetzt wird.
(6) Verfahren gemäß obigem Punkt (1), worin das α-Diketonderivat in Gegenwart eines Übergangsmetallions und einer Base umgesetzt wird.
(7) Verfahren gemäß obigem Punkt (1), worin das α-Diketonderivat Glyoxalsäure oder ein Salz davon ist.
(8) Verfahren gemäß obigem Punkt (4), worin das Übergangsmetallion ein Kupferion ist.
(9) Verfahren gemäß obigem Punkt (5), worin die Base ein Pyridin ist.
(10) Verfahren gemäß obigem Punkt (1), worin die Hydrolyse unter Verwendung einer Base durchgeführt wird.
(11) Verfahren gemäß obigem Punkt (10), worin die Base ein Aminderivat ist.
(12) Verfahren gemäß obigem Punkt (10), worin die Base ein Diaminderivat oder ein Thio- oder Selenosemicarbazid-Derivat ist.
(13) Verfahren gemäß obigem Punkt (12), worin das Diaminderivat o-Phenylendiamin ist.
(14) Verfahren zur Herstellung von menschlichem Wachstumshormon oder eines Salzes davon, umfassend das Umsetzen von menschlichem Wachstumshormon oder eines Salzes davon mit einem Methionin an seinem N-Terminus, das mittels Gen-Rekombinationstechnik produziert wurde, mit Glyoxalsäure oder einem Salz davon in Gegenwart von Kupfer(II)-sulfat und Pyridin, sowie das anschließende Umsetzen mit o-Phenylendiamin.
(13) Verfahren zur Herstellung von Neurotrophin-3 oder eines Salzes davon, umfassend das Umsetzen von Neurotrophin-3 oder eines Salzes davon mit einem Methionin an seinem N-Terminus, das mittels Gen-Rekombinationstechnik produziert wurde, mit Glyoxalsäure oder einem Salz davon in Gegenwart von Kupfer(II)-sulfat und Pyridin, sowie das anschließende Umsetzen mit o-Phenylendiamin.
(16) Verfahren zur Herstellung von menschlichem Betacellulin oder eines Salzes davon, umfassend das Umsetzen von menschlichem Betacellulin oder eines Salzes davon mit einem Methionin an seinem N-Terminus, das mittels Gen-Rekombinationstechnik produziert wurde, mit Glyoxalsäure oder einem Salz davon in Gegenwart von Kupfer(II)- sulfat und Pyridin, sowie das anschließende Umsetzen mit o-Phenylendiamin.
(17) Verfahren zur Herstellung von menschlichem Interleukin-2 oder eines Salzes davon, umfassend das Umsetzen von menschlichem Interleukin-2 oder eines Salzes davon mit einem Methionin an seinem N-Terminus, das mittels Gen-Rekombinationstechnik produziert wurde, mit Glyoxalsäure oder einem Salz davon in Gegenwart von Kupfer(II)- sulfat und Pyridin, sowie das anschließende Umsetzen mit o-Phenylendiamin.
(18) Verfahren zur Herstellung von Parathyreoidhormon oder eines Salzes davon, umfassend das Umsetzen von Parathyreoidhormon oder eines Salzes davon mit einem Methionin an seinem N-Terminus, das mittels Gen-Rekombinationstechnik produziert wurde, mit Glyoxalsäure oder einem Salz davon in Gegenwart von Kupfer(II)-sulfat und Pyridin, sowie das anschließende Umsetzen mit o-Phenylendiamin.
(19) Verbindungen der Formel:
CH&sub3;-S(O)m-(CH&sub2;)&sub2;-CO-CO-X
worin m eine ganze Zahl von 0-2 ist und X eine Peptidkette ist, die aus 2 bis 1.000 Aminosäureresten besteht, oder Salze davon.
(20) Verfahren zur Herstellung eines Peptids, eines Proteins oder eines Salzes davon, umfassend das Hydrolysieren einer Verbindung gemäß obigem Punkt (19).
(21) Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder eines Salzes davon, umfassend das Hydrolysieren einer Verbindung nach Anspruch 15 durch Umsetzen der Verbindung mit einem α-Diketonderivat.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt das bei der Elektrophorese in Ausführungsbeispiel 2a) erzielte Ergebnis.
Fig. 2 zeigt das bei der Elektrophorese in Ausführungsbeispiel 5a) erzielte Ergebnis.
Fig. 3 zeigt das bei der Elektrophorese in Ausführungsbeispiel 7a) erzielte Ergebnis.
Fig. 4 zeigt das bei der Elektrophorese in Ausführungsbeispiel 9a) erzielte Ergebnis.
Fig. 5 zeigt das bei der Elektrophorese in Ausführungsbeispiel 11a) erzielte Ergebnis.
Fig. 6 zeigt das bei der Elektrophorese in Ausführungsbeispiel 24a) erzielte Ergebnis.
Fig. 7 zeigt das bei der Elektrophorese in Ausführungsbeispiel 38a) erzielte Ergebnis.
Fig. 8 zeigt das bei der Elektrophorese in Ausführungsbeispiel 67a) erzielte Ergebnis.

DETALLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Hierin bezeichnet ein gegebenenfalls oxidierter Methionin-Rest entweder einen Methionin-Rest oder einen solchen Rest mit oxidiertem Schwefel, worin das Methionin mit oxidiertem Schwefel eine Sulfoxid- oder Sulfon-Gruppe darstellt.
Beispielsweise kann ein Peptid mit einem gegebenenfalls oxidierten Methionin-Rest an seinem N-Terminus ein Peptid der Formel:
CH&sub3;-S(O)m-(CH&sub2;)&sub2;-CH(NH&sub2;)-CO-X
sein, worin m eine ganze Zahl von 0-2 ist und X ein Aminosäurerest oder eine Peptidkette ist. Diese Peptide können in Form von Salzen vorliegen. Es kann jedes beliebige Salz eingesetzt werden, das die vorliegende Reaktion nicht hemmt. Darunter werden pharmazeutisch annehmbare Salze bevorzugt. Beispielsweise werden bevorzugt Salze mit anorganischen Säuren, wie z. B. Hydrochloride, Hydrobromide, Nitrate, Sulfate, Phosphate, etc.; Salze mit organischen Säuren, wie z. B. Acetate, Phthalate, Fumarate, Tartrate, Maleate, Citrate, Succinate, Methansulfonate, p-Toluolsulfonate, etc.; Salze mit Alkalimetallen, wie z. B. Natriumsalze, Kaliumsalze, etc.; Salze mit Erdalkalimetallen, wie z. B. Calciumsalze, etc.; oder Ammoniumsalze, etc.; eingesetzt.
In der obigen Formel ist m vorzugsweise 0, und X ist vorzugsweise eine Peptidkette, deren Anzahl an Aminosäuren nicht weniger als 2 beträgt.
Ein dem vorliegenden Entfernungsverfahren zu unterziehendes Peptid kann entweder ein übliches Peptid mit einer Anzahl an Aminosäuren von weniger als 50 oder ein so genanntes Protein mit einer Anzahl an Aminosäuren von nicht weniger als 50 sein. Somit umfasst der in der vorliegenden Beschreibung gebrauchte Begriff "Peptid" nicht nur Moleküle mit weniger als 50 Aminosäuren, sondern auch jene mit 50 oder mehr Aminosäuren. Vorzugsweise werden als Peptide Moleküle (so genannte Proteine) mit 50 oder mehr Aminosäuren eingesetzt.
Beispielsweise umfasst "Peptid" ganz besonders Peptide mit 2-1.000 Aminosäuren, insbesondere 15-500 Aminosäuren. Eine bevorzugte Gruppe von Peptiden umfasst die folgenden Moleküle:
Wachstumshormon (GH), Parathyreoidhormon (PTH), Insulin, Nervenwachstumsfaktor, Neurotrophiefaktor vom Gehirn, Ziliar-Neurotrophiefaktor, Glia-Neurotrophiefaktor, Neurotrophin-3, -4 oder -6, Zentralnervenwachstumsfaktor, Glyozyten-Wachstumsfaktor, Lungen-Neurotrophiefaktor, Epidermiswachstumsfaktor, Fibroblastenwachstumsfaktor, Blutplättchen-Wachstumsfaktor, transformierender Wachstumsfaktor α oder β, Endothelzellwachstumsfaktor, Gewebeplasminogenaktivator, Urokinase, Protein C, Thrombomodulin, knochen-morphogenetisches Protein, Calcitonin, insulinähnliches Wachstumshormon, Interferon-α, -β oder -γ, Interleukin-1(α,β) bis -12, Granulozytenkolonie-Stimulationsfaktor, Granulozyten-Makrophagenkolonie-Stimulationsfaktor, Granulozyten-Makrophagen-Stimulationsfaktor, Thrombopoietin, Somatomedin C, Erythropoietin, PACAP, atrio-natriuretisches Peptid, Endothelin, Megakaryozyten-Wachstumsfaktor, Wachstumsfaktor hämopoetischer Stammzellen, Hepatozyten-Wchastumsfaktor, Motilin, Immunotoxin, Tumornekrosefaktor, Hirudin, Corticotropin, Angiotensin, Angiotensin 2 und Angiotensin 2-Antagonist-Peptide, Angiotensin 3, Bradykinin-Derivate, Bradykinin-Förderungsfaktor, α-, β- oder γ-Endorphin, Enkephalin, Neutrophil-Chemotaxis- Faktor, Gastrin, Glucagon, Wachstumshormon-Freisetzungsfaktor (GH-RF), Kyotorphin, Kallidin, Gonadotropin-Freisetzungshormon, Mastzellen-Degranulationspeptid, Melanozyten-Stimulationshormon, Neurotensin, Trypsin-Inhibitor, Oxytocin, Proinsulin C-Pep tid, Sekretin, Somatostatin, Thyreotropin-Freisetzungshormon, Ubiquitin, Urogastron, Vasopressin-Derivate, Kinin-Derivate, Tuftsin, Somatomedin, Corticotropin-Freisetzungsfaktor, insulinähnlicher Wachstumsfaktor, Calcitonin-Gen-verwandtes Peptid, PTHrP, VIP, DHI, Insulinotropin, GRP, CCK-PZ, Galanin, Antrum-Peptid, Motilin, PPY, Pankreas-Polypeptid, PSP, Pankreastatin, hCG, hCS, Relaxin, Serum-Thyminfaktor, Thymopoietin, Thymosin, Faktor XIII, Faktor VIII, Prourokinase, SOD, Faktor VIIa, Antithrombin, oder deren Muteine (welche dieselbe oder eine höhere biologische oder immunologische Aktivität wie/als das natürliche Protein aufweisen und dadurch gekennzeichnet, sind dass eine oder mehrere Aminosäuren des natürlichen Proteins substituiert, deletiert oder addiert wurden); oder chemisch synthetisierte bekannte oder neue Peptide. Darunter werden mittels Gen-Rekombinationstechnik erzeugte Peptide, insbesondere die mittels Gen-Rekombinationstechnik erzeugten und an ihrem N-Terminus ein zusätzliches, gegebenenfalls oxidiertes, Methionin aufweisenden Peptide Wachstumshormon, Neurotrophin-3, Betacellulin, Parathyroidhormon, Interleukin-2, etc., besonders bevorzugt eingesetzt.
Die oben angeführten natürlichen Peptide können von beliebigen Tierspezies stammen. Insbesondere werden jene vom Menschen eingesetzt.
In der vorliegenden Beschreibung kann das α-Diketonderivat ein Beliebiges sein, das Transaminierung der oben angeführten Peptide oder Salze davon herbeiführen kann. Beispielsweise wird eine Verbindung der Formel R¹-CO-CO-R² eingesetzt, worin R¹ ein Wasserstoffatom oder eine Niederalkyl- oder Phenylgruppe darstellt, die gegebenenfalls mit einer Carboxylgruppe substituiert ist (wobei R¹ vorzugsweise Wasserstoff oder Methyl, insbesondere Wasserstoff ist); und R² eine Hydroxylgruppe, eine Niederalkoxygruppe oder eine Aminogruppe darstellt, die gegebenenfalls mit Niederalkyl substituiert ist (R² ist insbesondere eine Hydroxylgruppe); oder ein Salz davon.
In der obigen Formel werden als durch R¹ dargestellte Niederalkylgruppen Alkylgruppen mit etwa 1-6 Kohlenstoffatomen eingesetzt, wie z. B. Methyl, Ethyl, Propyl, i-Pro pyl, Butyl, i-Butyl, sec-Butyl, t-Butyl, etc., und als durch R² dargestellte Niederalkoxygruppen werden Alkyoxygruppen mit etwa 1-6 Kohlenstoffatomen eingesetzt, wie z. B. Methoxy, Ethoxy, Propoxy, i-Propoxy, Butoxy, i-Butoxy, sec-Butoxy, t-Butoxy, etc. Außerdem werden als gegebenenfalls mit Niederalkyl substituierte Aminogruppen jene Aminogruppen eingesetzt, die gegebenenfalls ein bis zwei Niederalkylgruppen, wie oben beschrieben, aufweisen. Weiters werden Salze, ähnlich jenen, wie sie zuvor für das Peptid beschrieben wurden, eingesetzt.
Beispiele für das α-Diketonderivat sind Glyoxalsäure, Brenztraubensäure, Oxalessigsäure, Phenylglykolsäure, 2-Oxoglutarsäure, etc. Davon wird vorzugsweise Glyoxalsäure eingesetzt.
Die Transaminierungsreaktion zwischen einem Peptid oder einem Salz davon mit einem gegebenenfalls oxidierten Methionin-Rest an seinem N-Terminus und einem α-Diketonderivat wird vorzugsweise für etwa 5 min bis 2 h (noch bevorzugter etwa 15 min bis 1 h) bei etwa 0-70ºC (noch bevorzugter 20-40ºC), üblicherweise unter Verwendung von etwa 1-10.000 Mol (noch bevorzugter etwa 2.000-4.000 Mol) des α-Diketonderivats pro Mol des Peptids oder dessen Salzes durchgeführt. Es kann für die oben beschriebene Transaminierung jede beliebige Pufferlösung (z. B. Phosphatpuffer, Acetatpuffer, Citratpuffer, etc.) eingesetzt werden, solange sie die Reaktion nicht hemmt. Unter anderem wird bevorzugt Acetatpuffer eingesetzt. Der pH der Reaktion wird vorzugsweise im Bereich von etwa 2-9, noch bevorzugter etwa 4-7, insbesondere etwa 5-6, eingestellt, um die Reaktion unter Bedingungen ablaufen zu lassen, bei denen das Peptid oder dessen Salz mit einem gegebenenfalls oxidierten Methionin-Rest an seinem N-Terminus nicht denaturiert.
Zur Beschleunigung der Reaktion wird das α-Diketonderivat vorzugsweise in Gegenwart von Übergangsmetallionen umgesetzt. Üblicherweise wird bevorzugt, etwa 0,01-0,1 Mol (noch bevorzugter 0,01-0,05 Mol) Übergangsmetallionen pro Mol des α-Diketonderivats einzusetzen. Die Übergangsmetallionen umfassen beispielsweise Kupferio nen (Cu&supmin;, Cu²&spplus;, Kobaltionen (Co&supmin;, Co³&supmin;), Nickelionen (Ni²&supmin;, Ni³&supmin;, Eisenionen (Fe²&spplus;, Fe³&supmin;), Zinkionen (Zn²&supmin;), Aluminiumionen (Al³&supmin;), Manganionen (Mn²&spplus; etc.), Galliumionen (Ga³&supmin;),Indiumionen (In³&supmin;), Magnesiumionen (Mg²&spplus;), Calciumionen (Ca²&spplus;), etc. Unter anderem werden Kupfer- und Kobaltionen besonders bevorzugt eingesetzt, insbesondere Kupferionen (Cu²&spplus;) werden eingesetzt. Diese Übergangsmetallionen werden dem Reaktionslösungsmittel vorzugsweise in Form von Salzen mit anorganischen Säuren, wie z. B. Schwefelsäure, Salpetersäure, Salzsäure, Perchlorsäure, etc., oder organischen Säuren, wie z. B. Essigsäure, Oxalsäure, Zitronensäure, Kohlensäure, etc., zugesetzt. Unter anderem werden vorzugsweise Kupfersulfat und Kupferacetat, insbesondere Kupfer(II)-sulfat, eingesetzt.
Das Peptid oder dessen Salz mit einem gegebenenfalls oxidierten Methionin-Rest an seinem N-Terminus wird vorzugsweise mit einem α-Diketonderivat in Gegenwart einer Base umgesetzt. Üblicherweise werden bevorzugt etwa 0,1-2 Mol (insbesondere etwa 0,5-1,0 Mol) Base pro Mol a-Diketonderivat eingesetzt. Als Base können organische Basen, einschließlich von Alkylamin-Derivaten, wie z. B. Triethylamin, Tributylamin, etc., Derivaten von aromatischen Aminen, wie z. B. N,N-Dimethylanilin, Pyridin, Lutidin, Collidin, 4-(Dimethylamino)pyridin, Imidazol, etc., und Harnstoff, eingesetzt werden. Unter anderem werden Derivate von aromatischen Aminen, insbesondere Pyridin, besonders bevorzugt eingesetzt.
Außerdem wird die oben beschriebene Transaminierungsreaktion vorzugsweise durchgeführt, indem das Peptid oder dessen Salz mit einem gegebenenfalls oxidierten Methionin-Rest an seinem N-Terminus der Reaktion mit dem α-Diketonderivat in Gegenwart von Übergangsmetallionen und einer Base unterzogen wird. In der Praxis wird eine drei Komponenten, bestehend aus Übergangsmetallionen, Base und α-Diketonderivat (z. B. Kupfersulfat, Pyridin und Glyoxalsäure), umfassende Lösung zu einer Lösung des Peptids oder Salzes davon mit einem gegebenenfalls oxidierten Methionin-Rest an seinem N-Terminus zugesetzt, um die Transaminierungsreaktion durchzuführen.
Eine Verbindung der Formel -CH&sub3;-S(O)m-(CH&sub2;)&sub2;-CO-CO-X, worin m eine ganze Zahl von 0-2 und X ein Aminosäurerest oder eine Peptidkette sind, oder ein Salz davon, die/das durch die Transaminierungsreaktion erhalten wurde, ist eine neue Verbindung und kann aus der Reaktionslösung nach herkömmlichen Reinigungsverfahren, wie z. B. Extraktion, Aussalzen, Verteilungsreaktion, Umkristallisation, Chromatographie, etc., isoliert oder aber der nachfolgenden Hydrolysereaktion ohne Isolierung oder Reinigung unterzogen werden.
Das mittels Transaminierungsreaktion erhaltene Diketonderivat wird üblicherweise mit einer Base hydrolysiert, um ein Peptid oder ein Salz davon zu erhalten, von dem der gegebenenfalls oxidierte Methionin-Rest am N-Terminus entfernt wurde.
Als Base für die Hydrolyse können beispielsweise ein Aminderivat, einschließlich von Cysteamin, ein Alkylaminderivat, wie z. B. N,N-Dimethylanilin, Pyridin, Lutidin, Collidin, 4-(Dimethylamino)pyridin, Imidazol, etc., ein Diaminderivat, wie z. B. o-Phenylendiamin, Tolylen-3,4-diamin, 3,4-Diaminobenzoesäure, 2,3-Diaminophenol, 4-Chlor-o- phenylendiamin (vorzugsweise ein aromatisches Diamin, insbesondere ein o-Phenylendiamin-Derivat), etc., ein Thiosemicarbazid-Derivat, wie z. B. Acetonthiosemicarbazid, Phenylthiosemicarbazid, etc., ein Selenosemicarbazid-Derivat, wie z. B. Selenosemicarbazid, Acetonselenosemicarbazid, etc., beispielhaft angeführt werden. Unter anderem werden Aminderivate bevorzugt, wobei besonders bevorzugt Diaminderivate und Thiosemicarbazid-Derivate eingesetzt werden. Insbesondere wird o-Phenylendiamin eingesetzt.
Die Menge der Base beträgt üblicherweise etwa 1-10.000 Mol (vorzugsweise etwa 500 -2.000 Mol) pro Mol Diketonderivat. Die Hydrolyse wird vorzugsweise für etwa 1-50 h (insbesondere etwa 10-25 h) bei Temperaturen im Bereich von 0-70ºC (vorzugsweise 20-40ºC) durchgeführt. Die Reaktion wird vorzugsweise unter Verwendung einer Pufferlösung als Lösungsmittel durchgeführt. Beispiele für die Pufferlösung sind Phosphat-, Acetat-, Citrat-Pufferlösung, etc. Für die oben beschriebene Transaminierung kann jede beliebige Pufferlösung eingesetzt werden, solange sie die Reaktion nicht hemmt. Unter anderem wird vorzugsweise Acetatpuffer eingesetzt. Der Reaktions-pH wird vorzugsweise im Bereich von etwa 2-9, noch bevorzugter etwa 3-7, insbesondere auf etwa 4-6 im Bereich neutraler Bedingungen, eingestellt, um die Reaktion unter Bedingungen ablaufen zu lassen, bei denen das erhaltene Peptid oder dessen Salz nicht denaturiert.
Das erhaltene Peptid oder dessen Salz kann aus der Reaktionslösung nach herkömmlichen Reinigungsverfahren, wie z. B. Extraktion, Aussalzen, Verteilungsreaktion, Umkristallisation, Chromatographie, etc., isoliert oder aber der nachfolgenden Hydrolysereaktion ohne jegliche Isolierung oder Reinigung unterzogen werden. Ein bevorzugtes Reinigungsverfahren ist u. a. z. B. Ionenaustauschchromatographie mittels SP-Sepharose (Pharmacia Biotech) oder DEAE-5PW (Tosoh).
Da ein gemäß vorliegender Erfindung produziertes Polypeptid kein Methionin an seinem N-Terminus und dieselbe Aminosäuresequenz wie das natürliche Polypeptid aufweist, zeigt es gleichwertige Aktivität wie das natürliche Polypeptid, und seine Toxizität ist gering; es kann daher sicher als Arzneimittel und Diagnose-Reagens eingesetzt werden. Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur spezifischen Entfernung des N- terminalen Methionins von Methionylpeptiden.
In der Beschreibung und den Zeichnungen der vorliegenden Erfindung basieren die Aminosäure-Abkürzungen auf den von der IUPAC-IUB Kommission für Biochemische Nomenklatur empfohlenen oder den auf dem Fachgebiet herkömmlicherweise gebräuchlichen Abkürzungen.
Nachstehend sind Beispiele angeführt (wobei die Abkürzungen die L-Form darstellen, sofern nicht anders angegeben):
SDS: Natriumdodecylsulfat
Gly: Glycin
Ala: Alanin
Val: Valin
Leu: Leucin
Ile: Isoleucin
Ser: Serin
Thr: Threonin
Cys: Cystein
Met: Methionin
Glu: Glutaminsäure
Gln: Glutamin
Asp: Asparaginsäure
Asn: Asparagin
Lys: Lysin
Arg: Arginin
His: Histidin
Phe: Phenylalanin
Tyr: Tyrosin
Trp: Tryptophan
Pro: Prolin
Asx: Asp + Asn
Glx: Glu + Gln

BEISPIELE

Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Bezugs- und Ausführungsbeispiele detaillierter beschrieben, die jedoch lediglich zur Illustration der Ausführungsformen der Erfindung dienen und diese nicht einschränken sollen.

Bezugsbeispiel 1

Herstellung von Met-rhGH:

Met-rhGH wurde nach dem in Bezugsbeispiel 4 der JP-A-171699/l 987 erzeugt.
(I) Produzent:
Es wurde der Transformant Escherichia coli K12 χ 1776/pHGH107 (ATCC 31538) eingesetzt.
(Ii) Kultivierung:
Escherichia coli K12 χ 1776/pHGH107 (ATCC 31538, IFO 14505) wurde in einen 2 l Kolben eingeimpft, der 1 l flüssiges Keimmedium (pH 7,0) mit 1% Bacto-Trypton, 0,5% Bacto-Hefe, 0,5% Natriumchlorid, 10 mg/l, Tetracyclin-hydrochlorid, 10 mg/l Ampicillin-natrium, 20 mg/l Thymin und 100 mg/l, Diaminopymerinsäure enthielt, und dann auf einer Umlaufschüttelmaschine bei 37ºC über Nacht kultiviert. Die erhaltene Kulturlösung wurde danach in einen 50 l Standfermenter, der 20 l eines flüssigen Produktionsmediums (pH 6,8) mit 1,68% Natriumhydrogenphosphat, 0,30% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,10% Ammoniumchlorid, 0,05% Natriumchlorid, 200 mg/l Antischaummittel, 1,00% Glucose, 1,00% Casaminosäure, 246 mg/l, Magnesiumsulfat, 10 mg/l, Tetracyclin-hydrochlorid, 10 mg/l, Ampicillin-natrium, 20 mg/l Thymin und 100 mg/l Diaminopymerinsäure enthielt, übergeführt, wonach sie unter Belüftung und Agitation bei 37ºC 10 h lang kultiviert wurde. Die so erhaltene Kulturlösung wurde zentrifugiert, um Bakterienzellen zu ernten.

Bezugsbeispiel 2

Zu 2 kg der in Bezugsbeispiel 1 erhaltenen Zellen (Nassgewicht) wurden 6 l 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) mit 8 M Guanidin-hydrochlorid zugesetzt. Das Gemisch wurde wurde gerührt, um die Zellen in der Pufferlösung zu lösen, gefolgt von Zentrifugation (10.000 U/min, 60 min), um 6 l Zellextrakt-Lösung zu erhalten. Die so erhaltene Lösung wurde zweimal gegen etwa 70 l 10 mM Tris-HCl (pH 7,0) dialysiert. Nach der Dialyse wurde zu etwa 9 l dialysierter Lösung Ammoniumsulfat bis zu einer Endkonzentration von 20% Sättigung zugesetzt, gefolgt von Zentrifugation (4.200 U/min, 60 min), um etwa 10 l Überstand zu erhalten. Jeweils die Hälfte des Volumens dieses Überstands wurde über eine Phenyl-Toyopearl 650C Säule (5 cm ø · 50 cm) geschickt, gefolgt von Adsorption und Waschen der Säule. Die Met-rhGH-Fraktion wurde durch Elution mit einem linearen Konzentrationsgradienten zwischen 10 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,0), die 40% gesättigtes Ammoniumsulfat enthielt, und 10 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,0) gewonnen und gegen 50 mM Natriumhydrogencarbonat (pH 8,2) dialysiert, gefolgt von Zentrifugation (4.200 U/min, 45 min), um etwa 3,7 l Überstand zu erhalten. Jeweils ein Viertel des Volumens dieses Überstands wurde über eine DEAE-Toyopearl 650M Säule (4 cm ø · 50 cm) geschickt, gefolgt von Adsorption und Waschen der Säule. Die Met-rhGH-Fraktion wurde durch Elution mit einem linearen Konzentrationsgradienten zwischen 10 mM Natriumhydrogencarbonat-Pufferlösung (pH 8,2) und 10 mM Natriumhydrogencarbonat-Pufferlösung (pH 8,2), die 1 M % Natrumchlorid enthielt, gewonnen und gegen 50 mM Natriumhydrogencarbonat (pH 8,2) dialysiert. Etwa 1, 2 l der dialysierten Lösung wurde über eine DEAE-5PW-Säule (55 mm ø · 20 cm, Tosoh) geschickt, gefolgt von Adsorption und HPLC-Elution mit einem linearen Konzentrationsgradienten zwischen 10 mM Natriumhydrogencarbonat-Pufferlösung (pH 8,2) und 10 mM Natriumhydrogencarbonat-Pufferlösung (pH 8,2), die 1 M % Natrumchlorid enthielt, gewonnen und gegen 50 mM Natriumhydrogencarbonat (pH 8,2) dialysiert, um etwa 600 ml Met-rhGH-Fraktion zu erhalten. Diese Lösung wurde mittels Amicon Diaflow (YM-10 Membran, 76 mm ø Amicon) auf 294 ml eingeengt und Gelfiltration mittels einer Toyopearl-Säule HW-50F (8 cm ø · 50 cm), äquilibriert mit 100 mM Natriumhydrogencarbonat (pH 8,2), unterzogen, um die Met-rhGH-Fraktion zu erhalten. Die Fraktion wurde mittels MILLEX-GV-Filter (0,22 pl, Millipore) filtriert, um 869 mg Met-rhGH zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 1

50 mg des in Bezugsbeispiel 2 erhaltenen Human-Wachstumshormons mit Methionin an seinem N-Terminus (Met-rhGH) wurden in 40 ml 50 mM Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0) gelöst. Dem Gemisch wurde eine Lösung aus 5 ml 0,1 M Kupfersulfat, 2,3 g Glyoxalsäure und 5 ml Pyridin zugesetzt und bei 25ºC 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (25 mm Innendurchmesser (ID) · 600 mm Länge (L)), äquilibriert mit 2 M Acetat- auf 2 M Natriumacetatpuffer, geschickt und die Säule mit der gleichen Pufferlösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/min ausgewaschen, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-rhGH zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde o-Phenylendiamin in einer Endkonzentration von 20 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 20 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit 20 mM Tris-HCl- Pufferlösung, geschickt und die Säule mit der gleichen Pufferlösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/min ausgewaschen, um die Fraktion von Human-Wachstumshormon ohne Methionin am N-Terminus (rhGH) zu gewinnen. Die abgenommene Fraktion wurde auf eine DEAE-5PW-Säule (21,5 mm ID · 150 mm L), äquilibriert mit 20 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0), geladen, gefolgt von Elution mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0-100% Lösung B (B = 20 mM Tris-HCl-Pufferlösung + 1 M Natriumchlorid, pH 8,0) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 8,5 ml/min über 30 min, um die rhGH-Fraktion zu gewinnen. Die abgenommene Fraktion wurde über eine Toyopearl HW-50-Säule (20 mm ID · 600 mm L; Tosoh Corporation), äquilibriert mit 5% Ethanollösung, geschickt, gefolgt von Elution mit der gleichen Lösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/min, um die rhGH-Fraktion zu gewinnen. Die abgenommene Fraktion wurde gefriergetrocknet, um rhGH-Pulver zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 2

(Bestimmung der Eigenschaften von rhGH)

a) Analyse mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Das in Ausführungsbeispiel 1 erhaltene rhGH-Pulver wurde in Probenpuffer [Laemmli, Nature 227, 680 (1970)] suspendiert und das Gemisch zusammen mit 100 mM DTT 1 min lang auf 100ºC erhitzt, gefolgt von Elektrophorese mit Multi-Gel 10/20 (Dalichi Pure Chemicals Co., Ltd.). Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie- Brilliantblau gefärbt, und es zeigte sich nur eine einzige Bande des gereinigten Proteins. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt. In Fig. 1 stellen die Spuren 1-3 rhGH (3 ug), Blindprobe bzw. Molekulargewichtsmarker dar.
b) Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz
Die N-terminale Aminosäuresequenz des in Ausführungsbeispiel 1 erhaltenen rhGH wurde mittels eines Gasphasen-Proteinsequenzers (Applied Biosystems, Modell 477A) bestimmt.
Die N-terminale Aminosäuresequenz des in Ausführungsbeispiel 1 erhaltenen rhGH stimmte mit der aus der cDNA-Sequenz von rhGH Vorhergesagten überein. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angeführt. Tabelle 1 Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz
Die Analyse erfolgte unter Einsatz von 1 nmol rhGH.
1) Phenylthiohydantoin
c) Analyse der Aminosäure-Zusammensetzung
Etwa 20 ug des in Ausführungsbeispiel 1 erhaltenen rhGH wurden zur Bestimmung der Aminosäure-Zusammensetzung mittels Aminosäure-Analyzer (Beckman 6300E-System) eingesetzt. Die Aminosäure-Zusammensetzung des in Ausführungsbeispiel 1 erhaltenen rhGH stimmte mit der aus der cDNA-Sequenz von rhGH Vorhergesagten überein. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angeführt. Tabelle 2 Analyse der Aminosäure-Zusammensetzung
Saure Hydrolyse (6 N HCl, 1% Phenol, 110ºC, Mittelwerte der nach 24 und 48 h Hydrolyse erhaltenen Werte)
1) Unter der Annahme einer Hydrolysendauer von 0 h extrapolierter Wert
2) Nicht bestimmt
d) Analyse der C-terminalen Aminosäure
Etwa 15 nmol des in Ausführungsbeispiel 1 erhaltenen rhGH wurden zur Bestimmung der C-terminalen Aminosäure mittels Aminosäure-Analyzer (Beckman 6300E-System) eingesetzt. Die C-terminale Aminosäure des in Ausführungsbeispiel 1 erhaltenen rhGH stimmte mit der aus der cDNA-Sequenz von rhGH Vorhergesagten überein. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angeführt. Tabelle 3 Analyse der C-terminalen Aminosäure
Dampfphasen-Hydrazinolyse (100ºC, 3,5 h)

Ausführungsbeispiel 3

(Bestimmung der rhGH-Aktivität)

Es wurde ein Assay des gereinigten und in Ausführungsbeispiel 1 erhaltenen rhGH unter Verwendung von Nb 2-Zellen gemäß dem in Journal of Endocrinology & Metabolism 51, 1058 (1980), beschriebenen Verfahren durchgeführt, der zeigte, dass das gereinigte und in Ausführungsbeispiel 1 erhaltene rhGH eine nahezu gleiche Aktivität wie ein Standard-Produkt aufwies.

Bezugsbeispiel 3

Produktion von Met-NT-3:

Met-NT-3 wurde nach dem in den Bezugsbeispielen 1-3 und Ausführungsbeispielen 1-2 der JP-A-74775/1996 beschriebenen Verfahren hergestellt.
(1) Klonieren von NT-3-DNA
E. coli Y1090 wurde mit einer von Human-Gliom erhaltenen λ gt 11-cDNA-Bibliothek infiziert, und es wurden etwa 6 · 10&sup5; Phagen in NZCY-Medium eingeimpft ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) und bei 37ºC 5 h lang kultiviert. Eine Nylon-Membran wurde auf die Schale gelegt, für 1 min stehen gelassen und von der Schale abgenommen. Diese Nylon-Membran wurde in eine Lösung von 0,5 M NaOH - 1,5 M NaCl, in eine Lösung von 1,5 M NaCl -0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) und in eine Lösung von 2 · SSC ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual", s.o.) in dieser Reihenfolge eingelegt, gefolgt von Trocknung und Stehenlassen bei 80ºC für 2 h.
DNA (etwa 0,38 kb), die für Human-β-NGF kodierte [Nature 303, 821 (1983)], wurde chemisch synthetisiert, und es wurde eine Sonde hergestellt, indem die DNA mit [α-³²P] dCTP gemäß Nick-Translation markiert wurde.
Die erhaltene Nylon-Membran und die Sonde wurden nach dem in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, beschriebenen Verfahren hybridisiert. D. h., die Nylon-Membran wurde in eine die Probe enthaltende Hybridisierungsiösung eingelegt und bei 65ºC 16 h lang stehen gelassen. Die Nylon-Membran wurde mit 2 · SSC - 0,1 0/0 SDS bei Raumtemperatur und danach mit 1 · SSC - 0,1% SDS bei 65ºC ausgewaschen, gefolgt von Radiographie, um einen positiven Klon zu erhalten. Die mit EcoRI gespaltene cDNA des erhaltenen Klons λβ GN1321 wurde in die EcoRI-Stelle des Plasmids pUC118 (Takara Shuzo Co., Ltd.) insertiert, um das Plasmid pUNKS zu erhalten.
(2) Konstruktion eines NT-Expressionsvektors für E. coli
In der im Plasmid pUNKS insertierten NT-3 cDNA (wie in Bezugsbeispiel 3(1) erhalten) liegen eine ScaI-Stelle in der Nähe des für das Tyr der 11. Aminosäure vom N-Terminus von NT-3 kodierenden Bereich und eine NsiI-Stelle in der Nähe des Bereichs 50 Basen stromab vom Stopcodon von NT-3. Somit wurde ein ScaI-NsiI-Fragment von Plasmid pUNKS isoliert, an das die Adapter NGFTE-1 (35-mer), NGFTE-2 (33-mer), NGFTE-3 (7- mer) und NGFTE-4 (15-mer) mit T4-DNA-Ligase ligiert wurden, gefolgt von der Behandlung mit NdeI und BamHI, um ein 0,3 kb NdeI-BamHI-Fragment zu erhalten.
Die Adapter sind nachstehend dargestellt.
Der Expressionsvektor pET-3C mit dem T7-Promotor [Rosenberg et al., Gene 56, 125 (1987)] wurde mit NdeI und BamHI gespalten, um ein 4,4 kb NdeI-BamHI-Fragment zu erhalten.
Die erhaltenen 4,4 kb und 0,3 kb NdeI-BamHI-Fragmente wurden mit T4-DNA-Ligase ligiert, gefolgt von der Transformation von Escherichia coli DH1. Aus den erhaltenen ampicillinresistenten Transformanten (Escherichia coli DH1/pENGFT103) wurde das Plasmid pENGFT103 isoliert.
(3) Produktion von Met-NT-3 in E. coli
Unter Verwendung des in Bezugsbeispiel 3(2) erhaltenen NT-3 Expressionsvektors pENGFT103 und des T7-Lysozym-Expressionsvektors pLysS wurde Escherichia coli MM294 (DE3) [Melecular Endocrinology 4, 869 (1990)] transformiert, um Escherichia coli MM294 (DE3)/pLysS, pENGFT103 (IFO 15932, FERM BP-5483) zu erhalten.
Escherichia coli MM294 (DE3)/pLysS, pENGFT103 (IFO 15932, FERM BP-5483) wurde in einen 2 l Kolben eingeimpft, der 1 l LB-Medium [1%, Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% Natriumchlorid] mit 50 ug/ml Ampicillin und 15 ug/ml Chloramphenicol enthielt, und anschließend auf einer Umlaufschüttelmaschine bei 30ºC für 8 h kultiviert. Die resultierende Kulturlösung wurde danach in einen 50 l Standfermenter übergeführt, der 20 l eines flüssigen Produktionsmediums [1,68% Natriumhydrogenphosphat, 0,3% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,1% Ammoniumchlorid, 0,05% Natriumchlorid, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,02% Antischaummittel, 0,00025% Eisen(II)-sulfat, 0,0005% Thia min-hydrochlorid, 1,5% Glucose, 1,30% Casaminosäure] enthielt, wonach sie unter Belüftung und Agitation bei 30ºC kultiviert wurde. Als der Klett-Wert der Kulturlösung etwa 300 betrug, wurden 100 mg/l/min Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) dem Medium zugeführt und die Kultivierung weitere 7 h lang fortgesetzt. Die Kulturlösung wurde zentrifugiert, um etwa 340 g Zellen (Nassgewicht) zu erhalten, die bei -80ºC eingefroren wurden.
(4) Produktion von Met-NT-3 in E. coli (Massenproduktion)
Escherichia coli MM294 (DE3)/pLysS, pENGFT103 (IFO 15932, FERM BP-5483) wurde in einen 2 l Kolben eingeimpft, der 1 l LB-Medium [1%, Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% Natriumchlorid] mit 50 ug/ml Ampicillin und 15 ug/ml Chloramphenicol enthielt, und anschließend auf einer Umlaufschüttelmaschine bei 30ºC für 16,5 h kultiviert. Die resultierende Kulturlösung wurde danach in einen 50 l Standfermenter übergeführt, der 20 l LB-Medium [0,02% Antischaummmittel, 50 ug/ml Ampicillin und 15 ug/ml Chloramphenicol] enthielt, wonach sie unter Belüftung und Agitation bei 30ºC 7 h lang kultiviert wurde. Die resultierende Kulturlösung wurde danach in einen 500 l Standfermenter übergeführt, der 360 l eines flüssigen Produktionsmediums [1,68% Natriumhydrogenphosphat, 0,3% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,1% Ammoniumchlorid, 0,05% Natriumchlorid, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,02% Antischaummittel, 0,00025% Eisen(II)- sulfat, 0,0005% Thiamin-hydrochlorid, 1,5% Glucose, 1,5% Casaminosäure] enthielt, wonach sie unter Belüftung und Agitation bei 30ºC kultiviert wurde. Als der Klett-Wert der Kulturlösung etwa 500 betrug, wurden 100 mg/l,/min Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) dem Medium zugeführt und die Kultivierung weitere 5,5 h lang fortgesetzt. Die Kulturlösung wurde zentrifugiert, um etwa 6 kg Zellen (Nassgewicht) zu erhalten, die bei -80ºC eingefroren wurden.
(5) Aktivierung von Met-NT-3
40 g der in Bezugsbeispiel 3(3) erhaltenen Zellen (Nassgewicht) wurden in 240 ml 10 mM EDTA (pH 7,0) suspendiert. Die suspendierten Zellen wurden unter Eiskühlung mittels Ultraschall unter Verwendung von SONIFIER 450 (Branson Inc.) zerstört, gefolgt von Zentrifugation (10.000 U/min, 1 h). Das resultierende Pellet wurde zweimal auf die gleiche Weise wie zuvor beschrieben behandelt und gewaschen. Dem resultierenden Pellet wurden 160 ml 50 mM Tris-HCl / 4 M Harnstoff / 5 mM Dithiothreitol (DTT) zugesetzt und das Gemisch homogenisiert, gefolgt von Zentrifugation. Das resultierende Pellet wurde in 120 ml 20 mM Zitronensäure / 8 M Harnstoff (pH 3,0) gelöst, gefolgt von Zentrifugation, um Überstand und Niederschlag zu trennen. Der Niederschlag wurde auf die gleiche Weise wie zuvor beschrieben behandelt, um Überstand zu erhalten, der mit dem obigen Überstand vermischt wurde, wobei 240 ml Pellet-Lösung erhalten wurden. Die Pellet-Lösung wurde mit 760 ml 100 mM Acetatlösung verdünnt und über eine Sephadex G-25-Säule (11,3 cm ø · 50 cm), äquilibriert mit 100 mM Acetatlösung, geschickt, um 1.640 ml Lösung von denaturiertem Met-NT-3 zu erhalten, aus der der Harnstoff entfernt war. Diese Lösung wurde bei 4ºC 2d lag stehen gelassen, wonach 50 mM Phosphatpuffer / 12,5% Saccharose (pH 6,8) zugesetzt wurden, um 8,5f Lösung zu erhalten. Die Lösung wurde unter Verwendung von 5 M Natriumhydroxid oder konz. Phosphorsäure auf pH 6,0 eingestellt und bei 4ºC 2d lang stehen gelassen, um Met-NT- 3 zu aktivieren. Danach wurden der Lösung 200 mM Kupfersulfat zugesetzt, um eine Endkonzentration von 10 uM zu ergeben, und die Lösung wurde gerührt und danach bei 4ºC 2 d lang stehen gelassen, um die Aktivierung von Met-NT-3 fortzusetzen.
Die in Bezugsbeispiel 3(5) erhaltene Lösung wurde über eine SP-Sepharose-Fast Flow- Säule (2,5 cm ø · 12 cm, Pharmacia Biotech Inc.), äquilibriert mit 100 mM Phosphatpuffer / 0,1% 3-[(3-Colamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat, geschickt, gefolgt von Adsorption und Waschen mit 100 mM Phosphatpuffer / 0,1% CHAPS / 200 mM Natriumchlorid (pH 6,0). Die Säule wurde mit 100 mM Phosphatpuffer / 0,1% CHAPS / 400 mM Natriumchlorid (pH 6,0) eluiert, um eine Met-NT-3 enthaltende Lö sung zu erhalten. Diese Lösung wurde auf eine Resource 15 RPC-Säule (2 cm ø · 30 cm, Pharmacia Biotech Inc.) geladen, gefolgt von Elution unter Einsatz eines linearen Konzentrationsgradienten von 16% Acetonitril / 0,1% TFA - 36% Acetonitril / 0,1 TFA. Die eluierte Lösung wurde gefriergetrocknet, um etwa 28 mg Met-NT-3 als weißes Pulver zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 4

50 mg des in Bezugsbeispiel 3(6) erhaltenen Met-NT-3 wurden in 4,6 ml Wasser gelöst. Dem Gemisch wurde eine Lösung aus 200 ul 100 mM Kupfersulfat, 92,5 mg Glyoxalsäure und 200 ul Pyridin zugesetzt, allmählich gerührt und bei Raumtemperatur 15 min lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (2,5 cm ø · 59 cm), äquilibriert mit 2 M Acetatpufferlösung (pH 4,9), geschickt, um 36 ml des Diketonderivats von Met-NT-3 zu erhalten. Dieser Lösung wurden 78 mg o-Phenylendiamin zugesetzt und die Reaktion bei 37ºC 15 h lang ablaufen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (2,5 cm ø · 59 cm), äquilibriert mit 2 M Acetatpufferlösung (pH 4,9), geschickt, um eine 76 ml Fraktion von NT-3 zu erhalten. Die erhaltene Fraktion wurde auf eine ODP-50-Säule geladen, gefolgt von Elution mit einem linearen Konzentrationsgradienten von (1) 0,1% TFA und (2) 0,1% TFA / 80% Acetonitril und Reinigung mittels HPLC, um die Fraktion von NT-3 zu erhalten. Die erhaltene Fraktion wurde gefriergetrocknet, um NT-3 als Pulver zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 5

(Bestimmung der Eigenschatten von NT-3)

a) Analyse mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Das in Ausführungsbeispiel 4 erhaltene NT-3-Pulver wurde in Probenpuffer [Laemmli, Nature 227, 680 (1970)] suspendiert und das Gemisch zusammen mit 100 mM DTT 1 min lang auf 100ºC erhitzt, gefolgt von Elektrophorese mit Multi-Gel 10/20 (Dalichi Ka gaku Pure Chemicals). Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie-Brilliantblau gefärbt, und es wurde nur eine einzige Bande des gereinigten Proteins erhalten. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt. In Fig. 2 stellen die Spuren 1-2 Molekulargewichtsmarker bzw. NT-3 dar.
b) Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz
Die N-terminale Aminosäuresequenz des in Ausführungsbeispiel 4 erhaltenen NT-3 wurde mittels eines Gasphasen-Proteinsequenzers (Applied Biosystems, Modell 477A) bestimmt. Die N-terminale Aminosäuresequenz des in Ausführungsbeispiel 4 erhaltenen NT-3 stimmte mit der aus der cDNA-Sequenz von NT-3 Vorhergesagten überein. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angeführt. Tabelle 4 Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz
Die Analyse erfolgte unter Einsatz von 1 nmol NT-3.
1) Phenylthiohydantoin
c) Analyse der Aminosäure-Zusammensetzung
Etwa 20 ug des in Ausführungsbeispiel 4 erhaltenen NT-3 wurden zur Bestimmung der Aminosäure-Zusammensetzung mittels Aminosäure-Analyzer (Beckman 6300E-System) eingesetzt. Die Aminosäure-Zusammensetzung des in Ausführungsbeispiel 4 erhaltenen NT-3 stimmte mit der aus der cDNA-Sequenz von NT-3 Vorhergesagten überein. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 angeführt. Tabelle 5 Analyse der Aminosäure-Zusammensetzung
Saure Hydrolyse (6 N HCl, 1% Phenol, 110ºC, Mittelwerte der nach 24 und 48 h Hydrolyse erhaltenen Werte)
1) Unter der Annahme einer Hydrolysendauer von 0 h extrapolierter Wert
2) Nicht bestimmt
d) Analyse der C-terminalen Aminosäure
Etwa 15 nmol des in Ausführungsbeispiel 4 erhaltenen NT-3 wurden zur Bestimmung der C-terminalen Aminosäure mittels Aminosäure-Analyzer (Beckman 6300E-System) eingesetzt. Die C-terminale Aminosäure des in Ausführungsbeispiel 4 erhaltenen NT-3 stimmte mit der aus der cDNA-Sequenz von NT-3 Vorhergesagten überein. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 angeführt. Tabelle 6 Analyse der C-terminalen Aminosäure
Dampfphasen-Hydrazinolyse (100ºC, 3,5 h)

Bezugsbeispiel 4

Produktion von Met-Human-BTC:

Met-Human-BTC wurde nach dem in den Beispielen 4-6, 8 und 13 der JP-A-87894/1994 beschriebenen Verfahren produziert.
(1) Konstruktion von Human-BTC-cDNA-Expressionsplasmid von E. coli
Ein 0,6 kb EcoRI-BamHI-Fragment, das für reifes Human-BTC (Aminosäure-Reste 1-147) kodiert, wurde ausgehend von dem in Beispiel 5 der JP-A-87894/1994 beschriebenen Plasmid pTB1515 isoliert. Nach dem Ligieren synthetischer Adapter mit ATG-Translationsinitiationscodon (Sequenz-ID Nr. 4: 5' TATGGATGGG 3'; Sequenz-ID Nr. 5: 5' AATTCCCATCCA 3') an die EcoRI-Stelle des obigen 0,6 kb Fragments wurde das resultierende 0,6 kb NdeI-BamHI-Fragment in den Plasmid pET-3c tragenden T7-Promotor insertiert [Gene 56, 125 (1987)], um das Plasmid pTB1505 zu konstruieren.
Um ein für die 80 Aminosäurereste von Human-BTC [die Reste 1 (Asp) - 80 (Tyr) der Fig. 10-1 und 10-2 der JP-A-87894/1994] kodierendes Fragment zu erhalten, wurde PCR unter Verwendung des Plasmids pTB1505 als Templat und zweier Oligonukleotide als Primer (Sequenz-ID Nr. 6: 5' ATACATATGGATGGGAATTCCA 3'; Sequenz-ID Nr. 7: 5' CCGGATCCTAGTAAAACAAGTCAACTCT 3') durchgeführt. Die Produkte wurden mit NdeI und BamHI gespalten, mittels 2,0% Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert und das erwartete 0,25 kb DNA-Fragment isoliert. Dieses 0,25 kb NdeI-BamHI-Fragment wurde stromab vom T7-Promotor von pET-3c durch Ligation mit T4-DNA-Ligase insertiert, um das Plasmid pTB1516 zu ergeben (siehe Fig. 13 der JP-A-87894/1994).
(2) Expression von Human-BTC in E. coli
Escherichia coli MM294 wurde mit λ-Phagen DE3 (Studier, s.o.) lysogenisiert, worin das RNA-Polymerase-gen von T7-Phagen rekombiniert worden war. Danach wurde das Plas mid pLysS in E. coli MM294 (DE3) eingeführt, um E. coli MM294 (DE3)/pLysS zu ergeben. In diesen Stamm wurde das in Bezugsbeispiel 4(1) erhaltene Plasmid pTB1516 eingeführt, wodurch E. coli MM294 (DE3)/pLysS, pTB1516 erhalten wurde. Der Transformant wurde in 20 ml L-Brühe mit 100 ug/ml Ampicillin und 10 ug/ml Chloramphenicol bei 37ºC kultiviert. Als der Klett-Wert etwa 180 betrug, wurde dem Medium Isopropyl- β-D-thiogalactosid (IPTG) in einer Endkonzentration von 0,4 mM zugesetzt und die Kultivierung 4 h lang fortgesetzt. Die Bakterienzellen wurden abzentrifugiert und in 0,5 ml Puffer mit 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 10% Saccharose und 0,25 mM PMSF suspendiert, wonach der Suspension Eiweißlysozym in einer Konzentration von 0,5 mg/ml zugesetzt wurde. Nach Aufbewahrung in einem Eisbad für 1 h wurde das Gemisch bei 37ºC für 5 min inkubiert, zentrifugiert (SORVALL, 15.000 U/min für 30 min bei 4ºC), um einen Überstand zu erhalten.
Der Transformant Escherichia coli MM294 (DE3)/pLysS, pTB1516 wurde am 16. April 1992 bei der IFO unter der Hinterlegungsnummer IFO 15282, sowie am 21. April 1992 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministery of International Trade and Industry, Japan (FRI) unter der Zugriffsnummer FERN BP-3836 hinterlegt.
(3) Reinigung des von einem E. coli-Transformanten erzeugten BTC
Der in Bezugsbeispiel 4(2) erhaltene Transformant MM294 (DE3)/pLysS, pTB1516 wurde über Nacht kultiviert, die Kultur in LB-Medium übergeführt und das Medium bei 37ºC 2 h lang kultiviert. Dem System wurde IPTG in einer Endkonzentration von 0,1 mM zugesetzt und die Kultivierung 3 h lang fortgesetzt. Die Zellen wurden abzentrifugiert und bei -20ºC gelagert.
Die gelagerten Zellen wurden in einem Volumen von 5 l aufgetaut und in 300 ml Puffer mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM EDTA, 0,2 M NaCl, 10% Saccharose und 1 mM APMSF suspendiert. Der Suspension wurden 40 mg Eiweißlysozym zugesetzt und ge löst, und die Lösung wurde bei 4ºC 2 h lang inkubiert, mit Ultraschall behandelt und dann bei 20.000 · g 1 h lang zentrifugiert, um einen Überstand zu ergeben. Der Überstand wurde durch ein 200 ml Q-Sepharose-Bett laufen gelassen, dem erhaltenen Produkt wurde TCA in einer Endkonzentration von 4% zugesetzt und 10 min bei 4ºC stehen gelassen. Der Niederschlag wurde in 20 min bei 20.000 · g abzentrifugiert und in einem Puffer mit 100 ml 20 mM Tris (pH 7,4), 1 mM EDTA und 1 mM APMSF suspendiert. Der resultierenden Zusammensetzung wurde 5 N NaOH zugesetzt, um den pH auf 6 einzustellen, während sie in einem Mörser homogenisiert wurde. Dieses Homogenisat wurde bei 100.000 · g 1 h lang zentrifugiert, und der resultierende Überstand wurde auf eine S-Sepharose-Säule (1,6 cm ø · 10 cm; Pharmacia) geladen. Nach dem Waschen der Säule mit einem Puffer mit 0,1 M Kaliumphosphat (pH 6), 1 mM EDTA und 1 mM APMSF wurde Gradientenelution mit 400 ml 0 M bis 1 M NaCl innerhalb von 200 min durchgeführt. Das Eluat wurde in 5 ml Fraktionen abgenommen. Die hochaktiven Fraktionen Nr. 20 bis 27 wurden als E. coli BTC vereinigt.
Den vereinigten Fraktionen wurde TFA in einer Endkonzentration von 0,1% zugesetzt, wonach das Gemisch auf eine C18-RP-HPLC-Säule (Asahipak ODP-50, 1,0 cm ø · 25 cm, Asahi Chemical Industries Co., Ltd.) geladen. Nach dem Waschen der Säule mit 0,1% TFA wurde das so erhaltene Eluat Gradientenelution mit 340 ml Acetonitril (0- 63%) innerhalb von 170 min unterzogen. Dieser Schritt lieferte 630 ug E. coli BTC.
Die N-terminale Aminosäuresequenz von E. coli BTC wurde für 20 Aminosäuren bestimmt. Die BTC-Sequenz wies das erwartete, vom Initiationscodon stammende Met an seinem N-Terminus auf.

Ausführungsbeispiel 6

20 mg des in Bezugsbeispiel 4(3) erhaltenen Human-Betacellulins mit Methionin an seinem N-Terminus (Met-BTC) wurden in 16 ml 50 mM Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0) gelöst. Dem Gemisch wurde eine Lösung aus 2 ml 0,1 M Kupfersulfat, 0,92 g Glyoxal säure und 2 ml Pyridin zugesetzt und bei 25ºC 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit 2 M Acetat - 2 M Natriumacetatpuffer, geschickt und die Säule mit der gleichen Pufferlösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/min ausgewaschen, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-BTC zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde o-Phenylendiamin in einer Endkonzentration von 20 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 20 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit 20 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0), geschickt und die Säule mit der gleichen Pufferlösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/min ausgewaschen, um die Fraktion von Human-Betacellulin ohne Methionin am N-Terminus (BTC) zu gewinnen. Die abgenommene Fraktion wurde auf pH 6,0 eingestellt und auf eine SP-Sepharose-Säule (10 mm ID · 200 mm L), äquilibriert mit 100 mM Phosphat-Pufferlösung (pH 6,0), geladen, gefolgt von Elution mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0-100% Lösung B (B = 100 mM Phosphat-Pufferlösung + 1 M Natriumchlorid, pH 6,0) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 2,0 ml/min über 60 min, um die BTC-Fraktion zu gewinnen. Die abgenommene Fraktion wurde über eine ODP-50-Säule (10 mm ID · 250 mm L; Showa Denko, Inc.), äquilibriert mit 0,1% TFA, geschickt, gefolgt von Elution mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 20-40% Lösung B (B = Acetonitril / 0,1% TFA) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 2 ml/min innerhalb von 40 min, um die BTC-Fraktion zu gewinnen. Die abgenommene Fraktion wurde gefriergetrocknet, um BTC-Pulver zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 7

(Bestimmung der Eigenschaften von BTC)

a) Analyse mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
1 ug des in Ausführungsbeispiel 6 erhaltenen BTC-Pulvers wurde in Probenpuffer [Laemmli, Nature 227, 680 (1970)] suspendiert und das Gemisch zusammen mit 100 mM DTT 1 min lang auf 100ºC erhitzt, gefolgt von Elektrophorese mit Multi-Gel 15/25 (Dalichi Pure Chemicals). Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie-Brilliantblau gefärbt, und es wurde nur eine einzige Bande des gereinigten Proteins erhalten. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt. In Fig. 3 stellen die Spuren 1-2 Molekulargewichtsmarker bzw. BTC dar.
b) Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz
Die N-terminale Aminosäuresequenz von 1 nmol des in Ausführungsbeispiel 6 erhaltenen BTC wurde mittels eines Gasphasen-Proteinsequenzers (Applied Biosystems, Modell 477A) bestimmt. Die N-terminale Aminosäuresequenz des in Ausführungsbeispiel 6 erhaltenen BTC stimmte mit der aus der cDNA-Sequenz von BTC Vorhergesagten überein. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 angeführt. Tabelle 7 Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz
1) Phenylthiohydantoin
c) Analyse der Aminosäure-Zusammensetzung
Etwa 20 ug des in Ausführungsbeispiel 6 erhaltenen BTC wurden zur Bestimmung der Aminosäure-Zusammensetzung mittels Aminosäure-Analyzer (Beckman 6300E-System) eingesetzt. Die Aminosäure-Zusammensetzung des in Ausführungsbeispiel 6 erhaltenen BTC stimmte mit der aus der cDNA-Sequenz von BTC Vorhergesagten überein. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 angeführt. Tabelle 8 Analyse der Aminosäure-Zusammensetzung
Saure Hydrolyse (6 N HCl, 1% Phenol, 110ºC, Mittelwerte der nach 24 und 48 h Hydrolyse erhaltenen Werte)
1) Unter der Annahme einer Hydrolysendauer von 0 h extrapolierter Wert
2) Nicht bestimmt
d) Analyse der C-terminalen Aminosäure
Etwa 15 nmol des in Ausführungsbeispiel 6 erhaltenen BTC wurden zur Bestimmung der C-terminalen Aminosäure mittels Aminosäure-Analyzer (Beckman 6300E-System) eingesetzt. Die C-terminale Aminosäure des in Ausführungsbeispiel 6 erhaltenen BTC stimmte mit der aus der cDNA-Sequenz von BTC Vorhergesagten überein. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 angeführt. Tabelle 9 Analyse der C-terminalen Aminosäure
Dampfphasen-Hydrazinolyse (100ºC, 3,5 h)
e) Bestimmung der biologischen Aktivität von BTC
Es wurde ein Assay des gereinigten und in Ausführungsbeispiel 6 erhaltenen BTC unter Verwendung des Klons 4 von BALB/C3T3 A31-714 [International Journal of Cancer 12, 463 (1973)] gemäß dem in Molecular Cell Biology 8, 588 (1988), beschriebenen Verfahren durchgeführt, der zeigte, dass das gereinigte und in Ausführungsbeispiel 6 erhaltene BTC eine nahezu gleiche Aktivität wie ein Standard-Produkt aufwies.

Bezugsbeispiel 5

Produktion von Methionyl-Human-Interleukin-2:

Met-IL-2 wurde nach dem in Bezugsbeispielen 2 der JP-A-171699/1987 beschriebenen Verfahren produziert.
(i) Konstruktion des Expressionsplasmids
Ein 1.294 bp DNA-Fragment wurde mit dem Restriktionsenzym HgiAl von einem das Human-IL-2-Gen enthaltenden Plasmid pILOT 135-8 [siehe Beispiel 1 (vii) der JP-A- 11528/1985] abgespalten. Das abgespaltene 1.294 bp DNA-Fragment wurde mit T4- DNA-Polymerase behandelt, um die Enden abzustumpfen, und mit dem EcoRI-Linker dTGCCATGAATTCATGGCA (Sequenz-ID Nr. 8) unter Verwendung von T4-DNA-Ligase verbunden. Die resultierende DNA wurde mit EcoRI gespalten, was ein DNA-Fragment mit dem Translationsinitiationscodon ATG und einem Human-IL-2-Gen lieferte.
Unter Verwendung von T4-DNA-Ligase wurde das erhaltene DNA-Fragment in Plasmid ptrp781 [Nucleic Acids Research 11, 3077 (1983)] insertiert, das an der EcoRI-PstI-Stelle gespalten worden war. Das resultierende Expressionsplasmid pTF1 wies sowohl das Translationsinitiationscodon als auch ein Human-IL-2-Gen stromab vom trp-Promotor auf (Fig. 4 der JP-A-1 71699/1987).
Mittels Restriktionsenzym StuI wurde ein DNA-Fragment vom pTF1-Plasmid abgespalten und anschließend mit BamHI-Linker verbunden. Die resultierende Plasmid-DNA wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI behandelt, gefolgt von Insertion in Plasmid pTB281, das einen λPL-Promotor aufweist, in dessen EcoRI-BamHI-Stelle (Fig. 5 der JP-A-171699/1987).
(ii) Produktion eines Transformanten
Unter Verwendung des wie oben beschrieben erhaltenen Plasmids pTB285 wurde Escherichia coli N4830 gemäß dem Verfahren von Cohen et al. [Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 69, 2110 (1972)], was einen Transformanten mit dem Plasmid pTB285 ergab; dieser Transformant wurde Escherichia coli N4830/pTB285 genannt.
(iii) Kultivierung des Transformanten
Der Transformanten Escherichia coli N4830/pTB285 (IFO 14437, FERM BP-852) wurde in einen 250 ml Kolben eingeimpft, der 50 ml eines flüssigen Mediums (pH 7,0) mit 1% Bacto-TRYPTON (Difco Laboratories, USA), 0,5% Bacto-HEFEEXTRAKT (Difco Laboratories, USA) 0,5% Natriumchlorid und 50 ug/ml Ampicillin enthielt, und anschließend auf einer Umlaufschüttelmaschine bei 37ºC über Nacht kultiviert. Die erhaltene Kulturlösung wurde danach in einen 5 l Standfermenter, der 2,5 l eines M9-Medium mit 0,5% Casaminosäure, 0,5% Glucose, und 50 ug/ml Ampicillin enthielt, übergeführt, wonach sie unter Belüftung und Agitation bei 35ºC 6 h lang und bei 42ºC 3 h lang kultiviert wurde, was 2,5 l Kulturlösung ergab, die danach zentrifugiert wurde, um Bakterienzellen zu ernten. Die Zellen wurden bei -80ºC eingefroren und gelagert.
(iv) Extraktion
20 g der eingefrorenen Zellprobe wurden in 100 ml eines Extraktionslösungsmittels (pH 7,0) mit 7 M Guanidin-hydrochlorid und 0,1 M Tris-HCl gleichmäßig suspendiert und bei 4ºC 1 h lang gerührt. Die resultierende Suspension wurde anschließend bei 28.000 · g 20 min lang zentrifugiert, was einen Überstand ergab:
(v) Partielle Reinigung des Methionyl-Interleukin-2-Proteins
Der erhaltene Überstand wurde nach Dialyse gegen 0,01 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,5) bei 19.000 · g 10 min lang zentrifugiert, was wiederum einen Überstand ergab. Der erhaltene Überstand wurde über eine mit DE52 (DEAE-Cellulose, Wattman, UK) gepackte 50 ml Säule, äquilibriert mit 0,01 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,5), geschickt, um das Protein zu adsorbieren; anschließend wurde IL-2 unter Verwendung eines linearen NaCl-Konzentrationsgradienten (0-0,15 M NaCl, 1 l) eluiert, was eine aktive Fraktion lieferte.
(vi) Reinigung Reinigung des Methionyl-Interleukin-2-Proteins
Nach Einengung auf 5 ml unter Verwendung einer YM-5-Membran (Amicon, USA) wurde die oben erhaltene aktive Fraktion Gelfiltration unter Verwendung einer mit Sephacryl S-200 (Pharmacia, Schweden) gepackten Säule (500 ml Kapazität) unterzogen, die zuvor mit 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0) - 1 M NaCl-Puffer äquilibriert worden war. 40 ml der obigen aktiven Fraktion wurden unter Verwendung einer YM-5-Membran auf 3 ml eingeengt. Das erhaltene Konzentrat wurde an eine Ultrapore-RPSC-Säule (altex, USA) adsorbiert und mit dem Trifluoressigsäure-Acetonitril-System als Elutionsmittel HPLC unterzogen. Es wurden die folgenden Bedingungen eingehalten.
Säule: Ultrapore RPSC (4,6 · 75 mm)
Säulentemperatur: 30ºC
Elutionsmittel A: 0,1% Trifluoressigsäure - 99,9% Wasser
Elutionsmittel B: 0,1% Trifluoressigsäure - 99,9% Acetonitril
Elutionsprogramm: 0 min (68% A + 32% B) - 25 min (55% A + 45% B) - 35 min (45% A + 55% B) -45 min (30% A + 70% B) - 48 min (100% B)
Durchflussgeschwindigkeit: 0,8 ml/min
Detektionswellenlänge: 230 nm
Die Met-IL-2-Fraktion wurde nach etwa 39 min Retentionszeit abgenommen.
(vii) Reinigung von Met-IL-2 unter Verwendung einer SP-5PW-Säule
0,5 ml eines 0,005 M Ammoniumacetatpuffers, der das oben erhaltene Gemisch enthielt (pH 5,0, Proteinkonzentration: 1,03 mg/ml), wurden an eine SP-5PW-HPLC-Säule (0,75 · 7,5 cm, Tosoh) adsorbiert, die zuvor mit 0,025 M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,4) äquilibriert worden war, um das Protein zu eluieren. Die Säulentemperatur und die Durchflussgeschwindigkeit wurden auf 35ºC bzw. 0,5 ml/min gehalten. Es wurde ein Varian-Flüssigchromatograph, Modell 5.500 eingesetzt.
Die Met-IL-2-Fraktion wurde nach etwa 70 min Retentionszeit abgenommen.

Ausführungsbeispiel 8

20 mg des in Bezugsbeispiel 5 erhaltenen Methionyl-Human-Interleukin-2 (Met-IL-2) wurden in 27 ml 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) gelöst. Dem Gemisch wurde eine Lösung aus 3,375 ml 25 mM Kupfersulfat, 1,55 g Glyoxalsäure und 3,375 ml Pyridin zugesetzt und bei Raumtemperatur 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 300 ml/h über eine Sephadex G- 25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0), geschickt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-IL-2 zu gewin nen. Dieser Fraktion wurde o-Phenylendiamin in einer Endkonzentration von 20 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 21 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 300 ml/h über eine Sephadex G-25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0), geschickt, um die Fraktion von Human-Interleukin-2 (IL-2) zu gewinnen. Die abgenommene IL-2- Fraktion wurde auf eine SP-5PW-Säule, äquilibriert mit 25 mM Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0), geladen, gefolgt von Elution mit einem pH-Gradienten von 30-80% Lösung B (B = 25 mM Phosphat, pH 8,0) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 1,0 ml/min über 25 min, um die IL-2-Fraktion zu gewinnen. Die abgenommene Fraktion wurde über eine ODP-50-Säule (4,6 mm ID · 150 mm L), äquilibriert mit (1) 0,1% TFA und (2) 0,1% TFA + 80% Acetonitril (80%: 20%), geschickt, gefolgt von Elution mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 20-100% Lösung B mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,8 ml/min innerhalb von 15 min, um die IL-2-Fraktion zu gewinnen. Die abgenommene Fraktion wurde gefriergetrocknet, um gefriergetrocknetes IL-2-Pulver zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 9

(Bestimmung der Eigenschaften von IL-2)

a) Analyse mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
3 ug des in Ausführungsbeispiel 6 erhaltenen IL-2-Pulvers wurden in Probenpuffer [Laemmli, Nature 227, 680 (1970)] suspendiert und das Gemisch zusammen mit 100 mM DTT 5 min lang auf 100ºC erhitzt, gefolgt von Elektrophorese mit Multi-Gel 10/20 (Dalichi Pure Chemicals). Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie-Brilliantblau gefärbt, und es wurde nur eine einzige Bande des gereinigten Proteins erhalten. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt. In Fig. 4 stellen die Spuren 1-2 Molekulargewichtsmarker bzw. IL-2 dar.
b) Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz
Die N-terminale Aminosäuresequenz von 1 nmol des in Ausführungsbeispiel 8 erhaltenen IL-2 wurde mittels eines Gasphasen-Proteinsequenzers (Applied Biosystems, Modell 477A) bestimmt. Die N-terminale Aminosäuresequenz des in Ausführungsbeispiel 8 erhaltenen IL-2 stimmte mit der aus der cDNA-Sequenz von IL-2 Vorhergesagten überein. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 angeführt. Tabelle 10 Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz
1) Phenylthiohydantoin
c) Analyse der Aminosäure-Zusammensetzung
Etwa 20 ug des in Ausführungsbeispiel 8 erhaltenen IL-2 wurden zur Bestimmung der Aminosäure-Zusammensetzung mittels Aminosäure-Analyzer (Beckman 6300E-System) eingesetzt. Die Aminosäure-Zusammensetzung des in Ausführungsbeispiel 8 erhaltenen IL-2 stimmte mit der aus der cDNA-Sequenz von IL-2 Vorhergesagten überein. Die Ergebnisse sind in. Tabelle 11 angeführt. Tabelle 11 Analyse der Aminosäure-Zusammensetzung
Saure Hydrolyse (6 N HCl, 1% Phenol, 110ºC, Mittelwerte der nach 24 und 48 h Hydrolyse erhaltenen Werte)
1) Unter der Annahme einer Hydrolysendauer von 0 h extrapolierter Wert
n.b. = nicht bestimmt
d) Analyse der C-terminalen Aminosäure
Etwa 15 nmol des in Ausführungsbeispiel 8 erhaltenen IL-2 wurden zur Bestimmung der C-terminalen Aminosäure mittels Aminosäure-Analyzer (Beckman 6300E-System) eingesetzt. Die C-terminale Aminosäure des in Ausführungsbeispiel 8 erhaltenen IL-2 stimmte mit der aus der cDNA-Sequenz von IL-2 Vorhergesagten überein. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 angeführt. Tabelle 12 Analyse der C-terminalen Aminosäure
Dampfphasen-Hydrazinolyse (100ºC, 3,5 h)
e) Bestimmung der biologischen Aktivität von IL-2
Es wurde ein Assay des gereinigten und in Ausführungsbeispiel 8 erhaltenen IL-2 unter Verwendung von Interleukin-2-abhängigen Zellen gemäß dem in Biochem. Biophys. Res. Commun. 109, 363 (1982), beschriebenen Verfahren durchgeführt, der zeigte, dass das gereinigte und in Ausführungsbeispiel 8 erhaltene IL-2 eine nahezu gleiche Aktivität wie ein Standard-Produkt aufwies.
Nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann ein N-terminaler Methionin-Rest selektiv, spezifisch und effizient von einem Peptid (einschließlich von Proteinen) oder einem Salz davon mit einem Methionin-Rest an seinem N-Terminus entfernt werden. Nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann unabhängig von der Art des Peptids ein N-terminaler Methionin-Rest unter schonenden Bedingungen chemisch entfernt werden. Somit dient das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur gewerblichen Produktion eines Peptids mit einer natürlichen Aminosäuresequenz, ausgehend vom entsprechenden durch Gen-Rekombinationstechnik erzeugten Peptid, d. h. mit einem zu entfernenden N-terminalen Methionin-Rest.

Bezugsbeispiel 6

(Konstruktion eines Expressionsvektors für Human-Wachstumshormon (hGH) unter Einsatz des T7-Promotors)

Das Struktur-Gen von hGH wurde als etwa 0,75 kb EcoRI-EcoRV-Fragment des in der JP- A-12996/1994 beschriebenen Plasmids pHGH107 (ATCC 31538 oder ATCC 40011) isoliert. Andererseits wurden T7-Promotor und Ampicillin-Resistenz-Gen als etwa 4,6 kb NdeI-BamHI-Fragment von pET-3C [Rosenberg et al., Gene 56, 125 (1987)] isoliert. Beide isolierten Fragmente wurden mit T4-DNA-Polymerase (DNA-Blunting-Set; Takara Shuzo, Inc.) behandelt und mit T4-DNA-Ligase ligiert, gefolgt von Einführung in Escherichia coli JM109 und Selektion von ampicillinresistenten Transformanten. Aus den 12 erhaltenen Kolonien wurden Plasmide erhalten und mit PstI gespalten. In der Folge wurde bestätigt, dass in Plasmiden von 6 Kolonien das hGH-Gen in korrekter Richtung insertiert war. Ein von einem Transformanten aus den 6 Kolonien erhaltenes Plasmid wurde mit pTGA201 bezeichnet.

Bezugsbeispiel 7

(Expression von Met-hGH in Escherichia coli)

Escherichia coli JM109 wurde mit λ-Phagen (Studie, Supura) transformiert, der das RNA- Polymerase-Gen von T7-Phagen aufwies. Danach wurde in das erhaltene Escherichia coli JM109 (DE3) der in Bezugsbeispiel 6 erhaltene hGH-Expressionsvektor pTGA201 eingebracht, um Escherichia coli JM109 (DE3)/pTGA201 zu erhalten [FERM BP-5632; IFO 16001].
Escherichia coli JM109 (DE3)/pTGA201 wurde in einen 2 l Kolben eingeimpft, der 1 l LB-Medium [1%,'º, Pepton, 0,5% Hefextrakt, 0,5% Natriumchlorid] mit 50 ug/ml Ampicillin enthielt, und anschließend auf einer Umlaufschüttelmaschine bei 30ºC für 16 h kultiviert. Die resultierende Kulturlösung wurde danach in einen 50 l Standfermenter übergeführt, der 20 l LB-Medium [0,02% Antischaummittel (New Pole LB-625; San-yo Kasei Kogyo), 50 ug/ml Ampicillin] enthielt, wonach sie unter Belüftung und Agitation bei 37ºC 6 h lang kultiviert wurde. Die resultierende Kulturlösung wurde danach in einen 500 l Standfermenter übergeführt, der 360 l eines flüssigen Produktionsmediums [1,68% Natriumhydrogenphosphat, 0,3% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,1% Ammoniumchlorid, 0,05% Natriumchlorid, 0,024% Magnesiumsulfat, 0,02% Antischaummittel (New Pole LB-625), 0,0005% Thiamin-hydrochlorid, 1,5% Glucose, 1,5% Casaminosäure] enthielt, wonach sie unter Belüftung und Agitation bei 37ºC kultiviert wurde. Als der Klett-Wert der Kulturlösung etwa 500 betrug, wurden 5,95 mg/l/min Isopropyl-β-D- thiogalactopyranosid (IPTG) dem Medium zugeführt und die Kultivierung weitere 4 h lang fortgesetzt. Die Kulturlösung wurde zentrifugiert, um etwa 4,5 kg Zellen (Nassgewicht) zu erhalten, die bei -80ºC eingefroren wurden.

Bezugsbeispiel 8

(Aktivierung von Met-hGH)

2 g der in Bezugsbeispiel 7 erhaltenen Zellen (Nassgewicht) wurden in 6 l 50 mM Tris- HCl und Guanidin-hydrochlorid (pH 8,0) suspendiert, gefolgt von Zentrifugation (10.000 U/min, 120 min). Zu 6 l des rersultierenden Überstands wurden 18 l einer Lösung (pH 8,0) mit 50 mM Tris-HCl, 0,28 mM GSSG und 0,7 M Arg zugesetzt, um den pH auf 8,0 einzustellen, gefolgt von Stehenlassen bei 4ºC für 5 d, um die Aktivierung von Met-hGH fortzusetzen.

Bezugsbeispiel 9

(Reinigung von Met-hGH)

Die in Bezugsbeispiel 8 erhaltene Lösung wurde mittels eines Pellicon-Kassetten-Systems (PTGC-Membran; Millipore Corporation) unter Zusatz einer Lösung (pH 8,0) mit 20 mM Tris-HCl und 2,5 M Harnstoff ausgesalzt und eingeengt, bis die elektrische Leitfähigkeit nicht mehr als 10 mS betrug. Das erhaltene Konzentrat wurde zentrifugiert (10.000 U/min, 60 min), um 5 l Überstand zu erhalten. Der Überstand wurde auf eine DEAE-Toyopearl 650M-Säule (20 cm ø · 84 cm; Tosoh), äquilibriert mit einer Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris-HCl und 2,5 M Harnstoff, geladen, gefolgt von Adsorption und Waschen. Die Säule wurde unter Einsatz eines linearen Konzentrationsgradienten aus 0- 25% Lösung B (B = 20 mM Tris-HCl, 2,5 M Harnstoff, 1 M NaCl, pH 8,0) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 300 ml/min innerhalb von 100 min eluiert. Die Met- hGH enthaltende eluierte Lösung (10 l) wurde erneut mittels des Pellicon-Kassetten-Systems (PTGC-Membran; Millipore) ausgesalzt und eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde über eine DEAE-5PW-Säule (21 cm ø · 30 cm; Tosoh) nach dem HPLC-Verfahren (Gilson HPLC-System; Gilson) geschickt. Die Säule wurde unter Einsatz eines pH- Gradienten aus 70-85% Lösung B (A = 50 mM Tris-HCl und 2,5 M Harnstoff (pH 8,0); B = 50 mM MES [2-(N-Morpholino)ethansulfonat] und 2,5 M Harnstoff (pH 4,0)) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 320 ml/min innerhalb von 70 min eluiert. Der erhaltenen Met-hGH-Fraktion (6 l) wurde 2 M Tris-HCl (pH 7,8) zugesetzt, um den pH auf 7,2 einzustellen, gefolgt von Aussalzen und Einengen mittels des Pellicon-Kassetten- Systems (PTGC-Membran; Millipore), um 9,979 mg Met-hGH zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 10

(Entfernung des N-terminalen Met)

Zu 1.650 ml einer Lösung des in Bezugsbeispiel 9 erhaltenen Met-hGH wurden 413 ml einer Lösung mit 35 mM Kupfersulfat, 2,5 M Glyoxalsäure und 6 M Pyridin zugesetzt, das Gemisch gerührt und bei 252C 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 l/h über eine Sephadex G-25-Säule (11,3 cm ø · 125 cm; Pharmacia), äquilibriert mit einer Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris-HCl und 2.3 M Harnstoff, geschickt und die Säule mit der gleichen Lösung ausgewaschen, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-hGH zu gewinnen. Diese eluierte Fraktion wurde unter Rühren direkt zu 4 l einer Lösung von 4 M Essigsäure, 4 M Natriumacetat, 80 mM o-Phenylendiamin und 3 M Harnstoff zugesetzt. Nach der Elution wurde die Reaktionslösung (8 l) bei 4ºC 3d lang stehen gelassen. Die Lösung wurde mittels eines Pellicon-Kassetten-Systems (PTGC-Membran; Millipore) ausgesalzt und eingeengt. Die eingeengte Lösung (4 l) wurde mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 3 l/h über eine Sephadex G-25-Säule (11,3 cm ø · 140 cm, Pharmacia), äquilibriert mit einer Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris-HCl und 2,5 M Harnstoff, geschickt, um die hGH-Fraktion (4,7 l) zu gewinnen. Die abgenommene Fraktion wurde durch eine DEAE-5PW-Säule (21 cm ø · 30 cm; Tosoh) nach dem HPLC-Verfahren (Gilson HPLC-System; Gilson) geschickt. Die Säule wurde unter Einsatz eines pH-Gradienten aus 70-85% Lösung B (A = 50 mM Tris-HCl und 2,5 M Harnstoff (pH 8,0); B = 50 mM MES [2-(N-Morpholino)ethansulfonat] und 2,5 M Harnstoff (pH 4,0)) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 320 ml/min innerhalb von 70 min eluiert, um 10 l hGH-Fraktion zu gewinnen. Der erhaltenen hGH- Fraktion wurden 500 ml einer Lösung von 2 M Tris-HCl (pH 7,8) zugesetzt, um den pH auf 7,2 einzustellen, gefolgt von Einengung mittels Minitan II (PTGC-Membran; Millipore). 500 ml der eingeengten Lösung wurden mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 2 l/h über eine Sephacryl S-100-Säule (11,3 cm ø · 50 cm; Pharmacia), äquilibriert mit destilliertem Wasser, geschickt, um die hGH-Fraktion (1.651 ml) zu gewinnen, gefolgt von Filtration mittels Millipack 60 (Millipore), um 1.487 ml hGH-Lösung (3.309 mg hGH) zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 11

(Bestimmung der Eigenschaften von hGH)

a) Analyse mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Der in Ausführungsbeispiel 10 erhaltenen hGH-Lösung wurde das gleiche Volumen an Probenpuffer [Laemmli, Nature 227, 680 (1970)] mit 100 mM DTT zugesetzt und das Gemisch 2 min lang auf 95ºC erhitzt, gefolgt von Elektrophorese mit Multi-Gel 10/20 (Dalichi Pure Chemicals). Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie-Brilliantblau gefärbt, und es wurde nur eine einzige Bande des gereinigten Proteins erhalten. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 dargestellt. In Fig. 5 stellen die Spuren 1-2 Molekulargewichtsmarker bzw. hGH dar.
b) Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz
Die N-terminale Aminosäuresequenz des in Ausführungsbeispiel 10 erhaltenen hGH wurde mittels eines Gasphasen-Proteinsequenzers (Applied Biosystems, Modell 477A) bestimmt. Die N-terminale Aminosäuresequenz des in Ausführungsbeispiel 10 erhaltenen hGH stimmte mit der aus der cDNA-Sequenz von hGH Vorhergesagten überein. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 angeführt. Tabelle 13 Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz
Die Analyse erfolgte unter Einsatz von 1 nmol rhGH.
1) Phenylthiohydantoin
c) Analyse der Aminosäure-Zusammensetzung
Etwa 20 ug des in Ausführungsbeispiel 10 erhaltenen hGH wurden zur Bestimmung der Aminosäure-Zusammensetzung mittels Aminosäure-Analyzer (L-8500A, Hitachi) eingesetzt. Die Aminosäure-Zusammensetzung des in Ausführungsbeispiel 10 erhaltenen hGH stimmte mit der aus der cDNA-Sequenz von hGH Vorhergesagten überein. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 angeführt. Tabelle 14 Analyse der Aminosäure-Zusammensetzung
Saure Hydrolyse (6 N HCl, 1% Phenol, 110ºC, Mittelwerte der nach 24 und 48 h Hydrolyse erhaltenen Werte)
1) Unter der Annahme einer Hydrolysendauer von 0 h extrapolierter Wert
2) Nicht bestimmt
d) Analyse der C-terminalen Aminosäure
Etwa 15 nmol des in Ausführungsbeispiel 10 erhaltenen hGH wurden zur Bestimmung der C-terminalen Aminosäure mittels Aminosäure-Analyzer (L-8500A, Hitachi) eingesetzt. Die C-terminale Aminosäure des in Ausführungsbeispiel 10 erhaltenen hGH stimmte mit der aus der cDNA-Sequenz von hGH Vorhergesagten überein. Die Ergebnisse sind in Tabelle 15 angeführt. Tabelle 15 Analyse der C-terminalen Aminosäure
Dampfphasen-Hydrazinolyse (100ºC, 3,5 h)

Ausführungsbeispiel 12

(Bestimmung der Aktivität von rhGH)

Es wurde ein Assay des gereinigten und in Ausführungsbeispiel 10 erhaltenen hGH unter Verwendung von Nb 2-Zellen abhängigen Zellen gemäß dem in Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 51, 1058 (1980), beschriebenen Verfahren durchgeführt, der zeigte, dass das gereinigte und in Ausführungsbeispiel 10 erhaltene hGH eine nahezu gleiche Aktivität der Zellwachstumsförderung wie ein Standard-Produkt (Chemicon International, USA) aufwies.

Ausführungsbeispiel 13

(Entfernung des N-terminalen Met)

Die in Bezugsbeispiel 9 erhaltene Met-hGH-Lösung wurde durch eine Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris-HCl und 8 M Harnstoff ersetzt und unter Verwendung eines Ultrafiltration-Systems (Diaflo-Membran YM 10, 43 mm; Amicon) zu einer Lösung von 10 mg/ml Met-hGH aufkonzentriert. Zu 1 ml der erhaltenen Lösung wurde 1 ml einer Lösung (pH 7,0) mit 4 M Natriumacetat, 20 mM Essigsäure, 0,4 M Glyoxalsäure, 20 mM Nickelchlo rid und 6 M Harnstoff zugesetzt, das Gemisch gerührt und bei Raumtemperatur 60 min lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (10 mm ID · 30 cm L; Pharmacia), äquilibriert mit einer Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris- HCl und 4 M Harnstoff, geschickt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-hGH zu gewinnen. Der eluierten Lösung wurde das gleiche Volumen einer Lösung mit 4 M Essigsäure, 4 M Natriumacetat und 80 mM o-Phenylendiamin zugesetzt, das Gemisch gerührt und bei 37ºC 15 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (10 mm ID · 40 cm L; Pharmacia), äquilibriert mit einer Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris-HCl, geschickt, um die hGH-Fraktion zu gewinnen. Die erhaltene Fraktion wurde über eine DEAE-5PW-Säule (2,15 cm ø · 15 cm; Tosoh) nach dem HPLC-Verfahren (Gilson HPLC-System; Gilson) geschickt. Die Säule wurde unter Einsatz eines pH-Gradienten aus 70-85% Lösung B (A = 50 mM Tris-HCl und 2,5 M Harnstoff (pH 8,0); B = 50 mM MES [2-(N-Morpholino)ethansulfonat] und 2,5 M Harnstoff (pH 4,0)) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 7,5 ml/min innerhalb von 70 min eluiert, um die hGH-Fraktion zu gewinnen.

Ausführungsbeispiel 14

(Entfernung des N-terminalen Met)

Die in Bezugsbeispiel 9 erhaltene Met-hGH-Lösung wurde durch eine Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris-HCl und 8 M Harnstoff ersetzt und unter Verwendung eines Ultrafiltration-Systems (Diaflo-Membran YM 10, 43 mm; Amicon) zu einer Lösung von 10 mg/ml Met-hGH aufkonzentriert. Zu 1 ml der erhaltenen Lösung wurde 1 ml einer Lösung (pH 7,0) mit 4 M Natriumacetat, 20 mM Essigsäure, 0,4 M Glyoxalsäure, 20 mM Kobaltchlorid und 6 M Harnstoff zugesetzt, das Gemisch gerührt und bei Raumtemperatur 60 min lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (10 mm ID · 30 cm L; Pharmacia), äquilibriert mit einer Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris- HCl und 4 M Harnstoff, geschickt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-hGH zu gewinnen. Der eluierten Lösung wurde das gleiche Volumen einer Lösung mit 4 M Essigsäure, 4 M Natriumacetat und 80 mM o-Phenylendiamin zugesetzt, das Gemisch gerührt und bei 37ºC 15 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (10 mm ID · 40 cm L; Pharmacia), äquilibriert mit einer Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris-HCl, geschickt, um die hGH-Fraktion zu gewinnen. Die erhaltene Fraktion wurde über eine DEAE-5PW-Säule (2,15 cm ø · 15 cm; Tosoh) nach dem HPLC-Verfahren (Gilson HPLC-System; Gilson) geschickt. Die Säule wurde unter Einsatz eines pH-Gradienten aus 70-85% Lösung B (A = 50 mM Tris-HCl und 2,5 M Harnstoff (pH 8,0); B = 50 mM MES [2-(N-Morpholino)ethansulfonat] und 2,5 M Harnstoff (pH 4,0)) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 7,5 ml/min innerhalb von 70 min eluiert, um die hGH-Fraktion zu gewinnen.

Ausführungsbeispiel 15

(Entfernung des N-terminalen Met)

Die in Bezugsbeispiel 9 erhaltene Met-hGH-Lösung wurde durch eine Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris-HC4 und 8 M Harnstoff ersetzt und unter Verwendung eines Ultrafiltration-Systems (Diaflo-Membran YM 10, 43 mm; Amicon) zu einer Lösung von 10 mg/ml Met-hGH aufkonzentriert. Zu 1 ml der erhaltenen Lösung wurde 1 ml einer Lösung (pH 7,0) mit 4 M Natriumacetat, 20 mM Essigsäure, 0,4 M Glyoxalsäure, 20 mM Zinksulfat und 6 M Harnstoff zugesetzt, das Gemisch gerührt und bei Raumtemperatur 60 min lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (10 mm ID · 30 cm L; Pharmacia), äquilibriert mit einer Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris- HCl und 4 M Harnstoff, geschickt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-hGH zu gewinnen. Der eluierten Lösung wurde das gleiche Volumen einer Lösung mit 4 M Essigsäure, 4 M Natriumacetat und 80 mM o-Phenylendiamin zugesetzt, das Gemisch gerührt und bei 37ºC 15 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (10 mm ID · 40 cm L; Pharmacia), äquilibriert mit einer Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris-HCl, geschickt, um die hGH-Fraktion zu gewinnen. Die erhaltene Fraktion wurde über eine DEAE-SPW-Säule (2,15 cm ø · 15 cm; Tosoh) nach dem HPLC-Verfahren (Gilson HPLC-System; Gilson) geschickt. Die Säule wurde unter Einsatz eines pH-Gradienten aus 70-85% Lösung B (A = 50 mM Tris-HCl und 2,5 M Harnstoff (pH 8,0); B = 50 mM MES [2-(N-Morpholino)ethansulfonat] und 2,5 M Harnstoff (pH 4,0)) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 7,5 ml/min innerhalb von 70 min eluiert, um die hGH-Fraktion zu gewinnen.

Ausführungsbeispiel 16

(Entfernung des N-terminalen Met)

Die in Bezugsbeispiel 9 erhaltene Met-hGH-Lösung wurde durch eine Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris-HCl und 8 M Harnstoff ersetzt und unter Verwendung eines Ultrafiltration-Systems (Diaflo-Membran YM 10, 43 mm; Amicon) zu einer Lösung von 10 mg/ml Met-hGH aufkonzentriert. Zu 1 ml der erhaltenen Lösung wurde 1 ml einer Lösung (pH 7,0) mit 4 M Natriumacetat, 20 mM Essigsäure, 0,4 M Glyoxalsäure, 20 mM Kupferacetat und 6 M Harnstoff zugesetzt, das Gemisch gerührt und bei Raumtemperatur 60 min lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (10 mm ID · 30 cm L; Pharmacia), äquilibriert mit einer Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris- HCl und 4 M Harnstoff, geschickt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-hGH zu gewinnen. Der eluierten Lösung wurde das gleiche Volumen einer Lösung mit 4 M Essigsäure, 4 M Natriumacetat und 80 mM o-Phenylendiamin zugesetzt, das Gemisch gerührt und bei 37ºC 15 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (10 mm ID · 40 cm L; Pharmacia), äquilibriert mit einer Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris-HCl, geschickt, um die hGH-Fraktion zu gewinnen. Die erhaltene Fraktion wurde über eine DEAE-5PW-Säule (2,15 cm ø · 15 cm; Tosoh) nach dem HPLC-Verfahren (Gilson HPLC-System; Gilson) geschickt. Die Säule wurde unter Einsatz eines pH-Gradienten aus 70-85% Lösung B (A = 50 mM Tris-HCl und 2,5 M Harnstoff (pH 8,0); B = 50 mM MES [2-(N-Morpholino)ethansulfonat] und 2,5 M Harnstoff (pH 4,0)) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 7,5 ml/min innerhalb von 70 min eluiert, um die hGH-Fraktion zu gewinnen.

Ausführungsbeispiel 17

(Entfernung des N-terminalen Met)

Die in Bezugsbeispiel 9 erhaltene Met-hGH-Lösung wurde durch eine Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris-HCl und 8 M Harnstoff ersetzt und unter Verwendung eines Ultrafiltration-Systems (Diaflo-Membran YM 10, 43 mm; Amicon) zu einer Lösung von 10 mg/ml Met-hGH aufkonzentriert. Zu 1 ml der erhaltenen Lösung wurde 1 ml einer Lösung (pH 7,0) mit 4 M Natriumacetat, 20 mM Essigsäure, 0,4 M Glyoxalsäure, 20 mM Kupfersulfat und 6 M Harnstoff zugesetzt und das Gemisch gerührt und bei Raumtemperatur 60 min lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (10 mm ID · 30 cm L; Pharmacia), äquilibriert mit einer Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris-HCl und 4 M Harnstoff, geschickt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met- hGH zu gewinnen. Der eluierten Lösung wurde das gleiche Volumen einer Lösung mit 4 M Essigsäure, 4 M Natriumacetat und 80 mM Tolylen-3,4-diamin zugesetzt, das Gemisch gerührt und bei 37ºC 15 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (10 mm ID · 40 cm L; Pharniacia), äquilibriert mit einer Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris-HCl, geschickt, um die hGH-Fraktion zu gewinnen. Die erhaltene Fraktion wurde über eine DEAE-5PW-Säule (2,15 cm ø · 15 cm; Tosoh) nach dem HPLC-Verfahren (Gilson HPLC-System; Gilson) geschickt. Die Säule wurde unter Einsatz eines pH-Gradienten aus 70-85% Lösung B (A = 50 mM Tris-HCl und 2,5 M Harnstoff (pH 8,0); B = 50 mM MES [2-(N-Morpholino)ethansulfonat] und 2,5 M Harnstoff (pH 4,0)) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 7,5 ml/min innerhalb von 70 min eluiert, um die hGH-Fraktion zu gewinnen.

Ausführungsbeispiel 18

(Entfernung des N-terminalen Met)

Die in Bezugsbeispiel 9 erhaltene Met-hGH-Lösung wurde durch eine Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris-HCl und 8 M Harnstoff ersetzt und unter Verwendung eines Ultrafiltration-Systems (Diaflo-Membran YM 10, 43 mm; Amicon) zu einer Lösung von 10 mg/ml Met-hGH aufkonzentriert. Zu 1 ml der erhaltenen Lösung wurde 1 ml einer Lösung (pH 7,0) mit 4 M Natriumacetat, 20 mM Essigsäure, 0,4 M Glyoxalsäure, 20 mM Kupfersul fat und 6 M Harnstoff zugesetzt und das Gemisch gerührt und bei Raumtemperatur 60 min lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (10 mm ID · 30 cm L; Pharmacia), äquilibriert mit einer Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris-HCl und 4 M Harnstoff, geschickt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met- hGH zu gewinnen. Der eluierten Lösung wurde das gleiche Volumen einer Lösung mit 4 M Essigsäure, 4 M Natriumacetat und 80 mM 4-Chlor-o-phenylendiamin zugesetzt, das Gemisch gerührt und bei 37ºC 15 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (10 mm ID · 40 cm L; Pharmacia), äquilibriert mit einer Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris-HCl, geschickt, um die hGH-Fraktion zu gewinnen. Die erhaltene Fraktion wurde über eine DEAE-5PW-Säule (2,15 cm ø · 15 cm; Tosoh) nach dem HPLC-Verfahren (Gilson HPLC-System; Gilson) geschickt. Die Säule wurde unter Einsatz eines pH-Gradienten aus 70-85% Lösung B (A = 50 mM Tris-HCl und 2,5 M Harnstoff (pH 8,0); B = 50 mM MES [2-(N-Morpholino)ethansulfonat] und 2,5 M Harnstoff (pH 4,0)) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 7,5 ml/min innerhalb von 70 min eluiert, um die hGH-Fraktion zu gewinnen.

Ausführungsbeispiel 19

(Entfernung des N-terminalen Met)

Die in Bezugsbeispiel 9 erhaltene Met-hGH-Lösung wurde durch eine Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris-HCl und 8 M Harnstoff ersetzt und unter Verwendung eines Ultrafiltration-Systems (Diaflo-Membran YM 10, 43 mm; Amicon) zu einer Lösung von 10 mg/ml Met-hGH aufkonzentriert. Zu 1 ml der erhaltenen Lösung wurde 1 ml einer Lösung (pH 7,0) mit 4 M Natriumacetat, 20 mM Essigsäure, 0,4 M Glyoxalsäure, 20 mM Kupfersulfat und 6 M Harnstoff zugesetzt und das Gemisch gerührt und bei Raumtemperatur 60 min lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (10 mm ID · 30 cm L; Pharmacia), äquilibriert mit einer Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris-HCl und 4 M Harnstoff, geschickt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met- hGH zu gewinnen. Der eluierten Lösung wurde das gleiche Volumen einer Lösung mit 4 M Essigsäure, 4 M Natriumacetat und 80 mM 3,4-Diaminobenzoesäure zugesetzt, das Gemisch gerührt und bei 37ºC 15 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (10 mm ID · 40 cm L; Pharmacia), äquilibriert mit einer Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris-HCl, geschickt, um die hGH-Fraktion zu gewinnen. Die erhaltene Fraktion wurde über eine DEAE-5PW-Säule (2,15 cm ø · 15 cm; Tosoh) nach dem HPLC-Verfahren (Gilson HPLC-System; Gilson) geschickt. Die Säule wurde unter Einsatz eines pH-Gradienten aus 70-85% Lösung B (A = 50 mM Tris-HCl und 2,5 M Harnstoff (pH 8,0); B = 50 mM MES [2-(N-Morpholino)ethansulfonat] und 2,5 M Harnstoff (pH 4,0)) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 7,5 ml/min innerhalb von 70 min eluiert, um die hGH-Fraktion zu gewinnen.

Ausführungsbeispiel 20

(Entfernung des N-terminalen Met)

Die in Bezugsbeispiel 9 erhaltene Met-hGH-Lösung wurde durch eine Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris-HCl und 8 M Harnstoff ersetzt und unter Verwendung eines Ultrafiltration-Systems (Diaflo-Membran YM 10, 43 mm; Amicon) zu einer Lösung von 10 mg/ml Met-hGH aufkonzentriert. Zu 1 ml der erhaltenen Lösung wurde 1 ml einer Lösung (pH 7,0) mit 4 M Natriumacetat, 20 mM Essigsäure, 0,4 M Glyoxalsäure, 20 mM Kupfersulfat und 6 M Harnstoff zugesetzt und das Gemisch gerührt und bei Raumtemperatur 60 min lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (10 mm ID · 30 cm L; Pharmacia), äquilibriert mit einer Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris-HCl und 4 M Harnstoff, geschickt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met- hGH zu gewinnen. Der eluierten Lösung wurde das gleiche Volumen einer Lösung mit 4 M Essigsäure, 4 M Natriumacetat und 80 mM Cysteamin zugesetzt, das Gemisch gerührt und bei 37ºC 15 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (10 mm ID · 40 cm L; Pharmacia), äquilibriert mit einer Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris-HCl, geschickt, um die hGH-Fraktion zu gewinnen. Die erhaltene Fraktion wurde über eine DEAE-5PW-Säule (2,15 cm ø · 15 cm; Tosoh) nach dem HPLC-Verfahren (Gilson HPLC-System; Gilson) geschickt. Die Säule wurde unter Einsatz eines pH-Gradienten aus 70-85% Lösung B (A = 50 mM Tris-HCl und 2,5 M Harnstoff (pH 8,0); B = 50 mM MES [2-(N-Morpholino)ethansulfonat] und 2,5 M Harnstoff (pH 4,0)) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 7,5 ml/min innerhalb von 70 min eluiert, um die hGH-Fraktion zu gewinnen.

Ausführungsbeispiel 21

(Entfernung des N-terminalen Met)

Die in Bezugsbeispiel 9 erhaltene Met-hGH-Lösung wurde durch eine Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris-HCl und 3 M Harnstoff ersetzt und unter Verwendung eines Ultrafiltration-Systems (Diaflo-Membran YM 10, 43 mm; Amicon) zu einer Lösung von 5 mg/ml Met-hGH aufkonzentriert. Zu 2 ml der erhaltenen Lösung wurden 2 ml einer Lösung mit 4 M Natriumacetat, 0,8 mM Essigsäure, 0,4 M Glyoxalsäure, 10 mM Kupfersulfat und 2,5 M Harnstoff zugesetzt und das Gemisch gerührt und bei Raumtemperatur 60 min lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (10 mm ID · 30 cm L; Pharmacia), äquilibriert mit einer Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris- HCl und 2,5 M Harnstoff, geschickt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-hGH zu gewinnen. Der eluierten Lösung wurde das gleiche Volumen einer Lösung mit 4 M Essigsäure, 4 M Natriumacetat und 80 mM o-Phenylendiamin zugesetzt, das Gemisch gerührt und bei 4ºC 3d lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (10 mm ID · 40 cm L; Pharmacia), äquilibriert mit einer Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris-HCl und 2,5 M Harnstoff, geschickt, um die hGH-Fraktion zu gewinnen. Die erhaltene Fraktion wurde über eine DEAE-5PW-Säule (2,15 cm ø · 15 cm; Tosoh) nach dem HPLC-Verfahren (Gilson HPLC-System; Gilson) geschickt. Die Säule wurde unter Einsatz eines pH-Gradienten aus 70-85% Lösung B (A = 50 mM Tris-HCl und 2,5 M Harnstoff (pH 8,0); B = 50 mM MES [2-(N-Morpholino)ethansulfonat] und 2,5 M Harnstoff (pH 4,0)) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 7,5 ml/min innerhalb von 70 min eluiert, um die hGH-Fraktion zu gewinnen.

Ausführungsbeispiel 22

(Entfernung des N-terminalen Met)

Die in Bezugsbeispiel 9 erhaltene Met-hGH-Lösung wurde durch eine Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris-HCl und 3 M Harnstoff ersetzt und unter Verwendung eines Ultrafiltration-Systems (Diaflo-Membran YM 10, 43 mm; Amicon) zu einer Lösung von 5 mg/ml Met-hGH aufkonzentriert. Zu 2 ml der erhaltenen Lösung wurden 2 ml einer Lösung mit 1 M Imidazol, 0,5 M Glyoxalsäure, 20 mM Kupfersulfat und 2,5 M Harnstoff zugesetzt und das Gemisch gerührt und bei Raumtemperatur 60 min lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (10 mm ID · 30 cm L; Pharmacia), äquilibriert mit einer Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris-HCl und 2,5 M Harnstoff, geschickt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-hGH zu gewinnen. Der eluierten Lösung wurde das gleiche Volumen einer Lösung mit 4 M Essigsäure, 4 M Natriumacetat und 80 mM o-Phenylendiamin zugesetzt, das Gemisch gerührt und bei 4ºC 3d lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (10 mm ID x 40 cm L; Pharmacia), äquilibriert mit einer Lösung (pH 8,0) von 20 mM Tris-HCl und 2,5 M Harnstoff, geschickt, um die hGH-Fraktion zu gewinnen. Die erhaltene Fraktion wurde über eine DEAE-5PW-Säule (2,15 cm ø · 15 cm; Tosoh) nach dem HPLC-Verfahren (Gilson HPLC-System; Gilson) geschickt. Die Säule wurde unter Einsatz eines pH- Gradienten aus 70-85% Lösung B (A = 50 mM Tris-HCl und 2,5 M Harnstoff (pH 8,0); B = 50 mM MES [2-(N-Morpholino)ethansulfonat] und 2,5 M Harnstoff (pH 4,0)) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 7,5 ml/min innerhalb von 70 min eluiert, um die hGH-Fraktion zu gewinnen.

Ausführungsbeispiel 23

10 mg des in Bezugsbeispiel 4 erhaltenen Met-BTC wurden in 4 ml Lösung mit 3 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurde eine Lösung (pH 5,0) aus 0,5 ml 50 mM Kupfersulfat, 0,25 g Glyoxalsäure und 0,5 ml Pyridin zugesetzt und bei 25ºC 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit einer Pufferlösung von 2,5 M Harnstoff und 50 mM Phosphat (pH 6,0), geschickt und die Säule mit der gleichen Pufferlösung mit einer Durchflussge schwindigkeit von 6 ml/min ausgewaschen, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-BTC zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde das gleiche Volumen einer Lösung mit 4 M Essigsäure - 4 M Natriumacetat und anschließend o-Phenylendiamin in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 15 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit 50 mM Phosphat-Pufferlösung (pH 6,0), geschickt und die Säule mit der gleichen Pufferlösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/min ausgewaschen, um die Fraktion von BTC ohne Methionin am N-Terminus zu gewinnen. Die abgenommene Fraktion wurde auf pH 6,0 eingestellt und auf eine SP-5PW-Säule (7,5 mm ID · 75 mm L; Tosoh), äquilibriert mit einer Pufferlösung mit 200 mM NaCl und 100 mM Phosphat (pH 5,0), geladen, gefolgt von Elution mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0-100% Lösung B (B = 100 mM Phosphat-Pufferlösung + 200 mM NaCl, pH 9,0) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,8 mf/min über 30 min, um die BTC-Fraktion zu gewinnen. Die abgenommene Fraktion wurde über eine ODP-50-Säule (10 mm ID · 250 mm L; Showa Denko), äquilibriert mit 0,1% TFA, geschickt, gefolgt von Elution mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 20-60% Lösung B (B = 80% Acetonitril / 0,1% TFA) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 2 ml/min innerhalb von 40 min, um die BTC-Fraktion zu gewinnen. Die abgenommene Fraktion wurde gefriergetrocknet, um etwa 760 ug BTC zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 24

(Bestimmung der Eigenschaften von BTC)

a) Analyse mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Der in Ausführungsbeispiel 23 erhaltenen BTC-Lösung wurde Probenpuffer [Laemmli, Nature 227, 680 (1970)] mit 100 mM DTT zugesetzt und das Gemisch 1 min lang auf 95ºC erhitzt, gefolgt von Elektrophorese mit Multi-Gel 15/25 (Dalichi Pure Chemicals). Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie-Brilliantblau gefärbt, und es wurde nur eine einzige Bande des gereinigten Proteins bei etwa 16 kd erhalten. Aus den Ergebnissen zeigte sich, dass das erhaltene BTC unter den reduzierenden Bedingungen des DTT ein stabiles Dinier bildet. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt. In Fig. 6 stellen die Spuren 1-2 Molekulargewichtsmarker bzw. BTC dar.
b) Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz
Die N-terminale Aminosäuresequenz des in Ausführungsbeispiel 23 erhaltenen BTC wurde mittels eines Gasphasen-Proteinsequenzers (Applied Biosystems, Modell 477A) bestimmt. Die N-terminale Aminosäuresequenz des in Ausführungsbeispiel 23 erhaltenen BTC stimmte mit der aus der cDNA-Sequenz von BTC Vorhergesagten überein. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 angeführt. Tabelle 16 Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz
Die Analyse erfolgte unter Einsatz von 1 nmol BTC.
1) Phenylthiohydantoin
c) Analyse der Aminosäure-Zusammensetzung
Etwa 20 ug des in Ausführungsbeispiel 23 erhaltenen BTC wurden zur Bestimmung der Aminosäure-Zusammensetzung mittels Aminosäure-Analyzer (Beckman 6300E-System) eingesetzt. Die Aminosäure-Zusammensetzung des in Ausführungsbeispiel 23 erhaltenen BTC stimmte mit der aus der cDNA-Sequenz von BTC Vorhergesagten überein. Die Ergebnisse sind in Tabelle 17 angeführt. Tabelle 17 Analyse der Aminosäure-Zusammensetzung
Saure Hydrolyse (6 N HCl, 1% Phenol, 110ºC, Mittelwerte der nach 24 und 48 h Hydrolyse erhaltenen Werte)
1) Unter der Annahme einer Hydrolysendauer von 0 h extrapolierter Wert
2) Nicht bestimmt
d) Analyse der C-terminalen Aminosäure
Etwa 15 nmol des in Ausführungsbeispiel 6 erhaltenen BTC wurden zur Bestimmung der C-terminalen Aminosäure mittels Aminosäure-Analyzer (Beckman 6300E-System) eingesetzt. Die C-terminale Aminosäure des in Ausführungsbeispiel 23 erhaltenen BTC stimmte mit der aus der cDNA-Sequenz von BTC Vorhergesagten überein. Die Ergebnisse sind in Tabelle 18 angeführt. Tabelle 18 Analyse der C-terminalen Aminosäure
Dampfphasen-Hydrazinolyse (100ºC, 3,5 h)

Ausführungsbeispiel 25

(Bestimmung der BTC-Aktivität)

Es wurde ein Assay des gereinigten und in Ausführungsbeispiel 23 erhaltenen BTC unter Verwendung des Klons 4 von BALB/c 3T3 A31-714 [International Journal of Cancer 12, 463 (1973)] gemäß dem in Molecular Cell Biology 8, 588 (1988), beschriebenen Verfahren durchgeführt, der zeigte, dass das gereinigte und in Ausführungsbeispiel 23 erhaltene BTC eine nahezu gleiche Aktivität der Zellwachstumsförderung wie ein Standard- Produkt aufwies (gereinigtes BTCI, wie in Ausführungsbeispiel 13 der JP-A-87894/1994 beschrieben).

Ausführungsbeispiel 26

40 mg des in Bezugsbeispiel 4 erhaltenen Met-BTC mit Methionin an seinem N-Terminus wurden in 4 ml Lösung mit 3 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurde eine Lösung aus 0,5 ml 50 mM Kupfersulfat, 0,25 g Glyoxalsäure und 0,5 ml Pyridin zugesetzt und bei 25ºC 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G- 25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit einer Pufferlösung von 2,5 M Harnstoff und 50 mM Phosphat (pH 6,0), geschickt und die Säule mit der gleichen Pufferlösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/min ausgewaschen, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-8TC zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde das gleiche Volumen einer Lösung mit 4 M Essigsäure - 4 M Natriumacetat und anschließend Tolylen-3,4-diamin in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 15 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 23 gereinigt, um gereinigtes BTC zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 27

40 mg des in Bezugsbeispiel 4 erhaltenen Met-BTC mit Methionin an seinem N-Terminus wurden in 4 ml Lösung von 3 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurde eine Lösung aus 0,5 ml 50 mM Kupfersulfat, 0,25 g Glyoxalsäure und 0,5 ml Pyridin zugesetzt und bei 230C 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G- 25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit einer Pufferlösung von 2,5 M Harnstoff und 50 mM Phosphat (pH 6,0), geschickt und die Säule mit der gleichen Pufferlösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/min ausgewaschen, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-BTC zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde das gleiche Volumen einer Lösung mit 4 M Essigsäure - 4 M Natriumacetat und anschließend 2,3-Diaminophenol in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 15 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 23 gereinigt, um gereinigtes BTC zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 28

40 mg des in Bezugsbeispiel 4 erhaltenen Met-BTC mit Methionin an seinem N-Terminus wurden in 4 ml Lösung von 3 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurde eine Lösung aus 0,5 ml 50 mM Kupfersulfat, 0,25 g Glyoxalsäure und 0,5 ml Pyridin zugesetzt und bei 23% 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G- 25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit einer Pufferlösung von 2,5 M Harnstoff und 50 mM Phosphat (pH 6,0), geschickt und die Säule mit der gleichen Pufferlösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/min ausgewaschen, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-BTC zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde das gleiche Volumen einer Lösung mit 4 M Essigsäure - 4 M Natriumacetat und anschließend 3,4-Diaminobenzoesäure in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 15 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 23 gereinigt, um gereinigtes BTC zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 29

40 mg des in Bezugsbeispiel 4 erhaltenen Met-BTC mit Methionin an seinem N-Terminus wurden in 4 ml Lösung von 3 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurde eine Lösung aus 0,5 ml 50 mM Kupfersulfat, 0,25 g Glyoxalsäure und 0,5 ml Pyridin zugesetzt und bei 25ºC 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G- 25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit einer Pufferlösung von 2,5 M Harnstoff und 50 mM Phosphat (pH 6,0), geschickt und die Säule mit der gleichen Pufferlösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/min ausgewaschen, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-BTC zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde das gleiche Volumen einer Lösung mit 4 M Essigsäure - 4 M Natriumacetat und anschließend 4-Chlor-o-phenylendiamin in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 15 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 23 gereinigt, um gereinigtes BTC zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 30

40 mg des in Bezugsbeispiel 4 erhaltenen Met-BTC mit Methionin an seinem N-Terminus wurden in 4 ml Lösung von 3 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurde eine Lösung aus 0,5 ml 50 mM Kupfersulfat, 0,25 g Glyoxalsäure und 0,5 ml Pyridin zugesetzt und bei 25ºC 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G- 25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit einer Pufferlösung von 2,5 M Harnstoff und 50 mM Phosphat (pH 6,0), geschickt und die Säule mit der gleichen Pufferlösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/min ausgewaschen, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-BTC zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde Cysteamin in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt und das Gemisch auf einen pH von 8,5 eingestellt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 15 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe VVeise wie in Ausführungsbeispiel 23 gereinigt, um gereinigtes BTC zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 31

20 mg des in Bezugsbeispiel 4 erhaltenen Met-BTC mit Methionin an seinem N-Terminus wurden in 2 ml Lösung von 3 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurden 2 ml einer Lösung mit 4 M Natriumacetat, 20 mM Essigsäure, 0,4 M Glyoxalsäure, 20 mM Nickelsulfat und 6 M Harnstoff zugesetzt und bei 25ºC 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit einer Pufferlösung von 2,5 M Harnstoff und 50 mM Phosphat (pH 6,0), geschickt und die Säule mit der gleichen Pufferlösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/min ausgewaschen, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-BTC zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde das gleiche Volumen einer Lösung von 4 M Essigsäure - 4 M Natriumacetat und anschließend o-Phenylendiamin in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 15 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 23 gereinigt, um gereinigtes BTC zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 32

20 mg des in Bezugsbeispiel 4 erhaltenen Met-BTC mit Methionin an seinem N-Terminus wurden in 2 ml Lösung von 3 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurden 2 mf einer Lösung mit 4 M Natriumacetat, 20 mM Essigsäure, 0,4 M Glyoxalsäure, 20 mM Kobaltchlorid und 6 M Harnstoff zugesetzt und bei 25ºC 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit einer Pufferlösung von 2,5 M Harnstoff und 50 mM Phosphat (pH 6,0), geschickt und die Säule mit der gleichen Pufferlösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/min ausgewaschen, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-BTC zu gewinnen.
Dieser Fraktion wurde das gleiche Volumen einer Lösung von 4 M Essigsäure - 4 M Natriumacetat und anschließend o-Phenylendiamin in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 15 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 23 gereinigt, um gereinigtes BTC zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 33

20 mg des in Bezugsbeispiel 4 erhaltenen Met-BTC mit Methionin an seinem N-Terminus wurden in 2 ml Lösung von 3 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurden 2 ml einer Lösung mit 4 M Natriumacetat, 20 mM Essigsäure, 0,4 M Glyoxalsäure, 20 mM Zinksulfat und 6 M Harnstoff zugesetzt und bei 25ºC 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit einer Pufferlösung von 2,5 M Harnstoff und 50 mM Phosphat (pH 6,0), geschickt und die Säule mit der gleichen Pufferlösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/min ausgewaschen, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-BTC zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde das gleiche Volumen einer Lösung von 4 M Essigsäure - 4 M Natriumacetat und anschließend o-Phenylendiamin in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 15 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 23 gereinigt, um gereinigtes BTC zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 34

40 mg des in Bezugsbeispiel 4 erhaltenen Met-BTC mit Methionin an seinem N-Terminus wurden in 4 ml Lösung von 3 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurde eine Lösung aus 0,5 ml 50 mM Kupferacetat, 0,25 g Glyoxalsäure und 0,5 ml Pyridin zugesetzt und bei 25ºC 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G- 25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit einer Pufferlösung von 2,5 M Harnstoff und 50 mM Phosphat (pH 6,0), geschickt und die Säule mit der gleichen Pufferlösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/min ausgewaschen, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-BTC zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde das gleiche Volumen einer Lösung von 4 M Essigsäure - 4 M Natriumacetat und anschließend o-Phenylendiamin in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 15 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 23 gereinigt, um gereinigtes BTC zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 35

20 mg des in Bezugsbeispiel 4 erhaltenen Met-BTC mit Methionin an seinem N-Terminus wurden in 2 ml Lösung von 3 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurden 2 ml einer Lösung mit 4 M Natriumacetat, 0,8 mM Essigsäure, 0,4 M Glyoxalsäure, 10 mM Kupfersulfat und 3 M Harnstoff zugesetzt und bei 25ºC 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit einer Pufferlösung von 2,5 M Harnstoff und 50 mM Phosphat (pH 6,0), geschickt und die Säule mit der gleichen Pufferlösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/min ausgewaschen, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-BTC zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde das gleiche Volumen einer Lösung von 4 M Essigsäure - 4 M Natriumacetat und anschließend o-Phenylendiamin in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 15 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 23 gereinigt, um gereinigtes BTC zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 36

20 mg des in Bezugsbeispiel 4 erhaltenen Met-BTC mit Methionin an seinem N-Terminus wurden in 2 ml Lösung von 3 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurden 2 ml einer Lösung mit 1 M Imidazol, 0,5 M Glyoxalsäure, 20 mM Kupfersulfat und 3 M Harnstoff zugesetzt und bei 25ºC 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit einer Pufferlösung von 2,5 M Harnstoff und 50 mM Phosphat (pH 6,0), geschickt und die Säule mit der gleichen Pufferlösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/min ausgewaschen, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-BTC zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde das gleiche Volumen einer Lösung von 4 M Essigsäure - 4 M Natriumacetat und anschließend o-Phenylendiamin in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 15 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 23 gereinigt, um gereinigtes BTC zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 37

40 mg des in Bezugsbeispiel 3 erhaltenen Met-NT-3 mit Methionin an seinem N-Terminus wurden in 4 ml Lösung von 3 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurde eine Lösung aus 0,5 ml 50 mM Kupfersulfat, 0,25 g Glyoxalsäure und 0,5 ml Pyridin zugesetzt und bei 25ºC 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G- 25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit einer Pufferlösung von 2,5 M Harnstoff und 50 mM Phosphat (pH 6,0), geschickt und die Säule mit der gleichen Pufferlösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/min ausgewaschen, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-NT-3 zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde das gleiche Volumen einer Lösung von 4 M Essigsäure - 4 M Natriumacetat und anschließend o-Phenylendiamin in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 15 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit SO mM Phosphat-Pufferlösung (pH 6,0), geschickt und die Säule mit der gleichen Pufferlösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/min ausgewaschen, um die Fraktion von NT-3 ohne Methionin am N-Terminus zu gewinnen. Die abgenommene Fraktion wurde auf pH 6,0 eingestellt und auf eine SP-5PW- Säule (21,5 mm ID · 150 mm L; Tosoh), äquilibriert mit einer Pufferlösung mit 200 mM NaCl und 100 mlvt Phosphat (pH 5,0), geladen, gefolgt von Elution mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0-100% Lösung B (B = 100 mM Phosphat-Pufferlösung + 200 mM NaCl, pH 9,0) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,8 ml/min über 30 min, um die NT-3-Fraktion zu gewinnen. Die abgenommene Fraktion wurde über eine ODP-50-Säule (10 mm ID · 250 mm L; Showa Denko), äquilibriert mit 0,1% TFA, geschickt, gefolgt von Elution mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 20-60% Lösung B (B = 80% Acetonitonitril / 0,1% TFA) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 2 ml/min innerhalb von 40 min, um die NT-3-Fraktion zu gewinnen. Die abgenommene Fraktion wurde gefriergetrocknet, um etwa 600 ug NT-3 zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 38

(Bestimmung der Eigenschaften von NT-3)

a) Analyse mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Der in Ausführungsbeispiel 37 erhaltenen NT-3-Lösung wurde Probenpuffer [Laemmli, Nature 227, 680 (1970)] mit 100 mM DTT zugesetzt und das Gemisch 1 min lang auf 100ºC erhitzt, gefolgt von Elektrophorese mit Multi-Gel 15/25 (Dalichi Kagaku Pure Chemicals). Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie-Brilliantblau gefärbt, und es wurde nur eine einzige Bande des gereinigten Proteins erhalten. Die Ergebnisse sind in Fig. 7 dargestellt. In Fig. 7 stellen die Spuren 1-2 Molekulargewichtsmarker bzw. NT-3 dar.
b) Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz
Die N-terminale Aminosäuresequenz des in Ausführungsbeispiel 37 erhaltenen NT-3 wurde mittels eines Gasphasen-Proteinsequenzers (Applied Biosystems, Modell 477A) bestimmt. Die N-terminale Aminosäuresequenz des in Ausführungsbeispiel 37 erhaltenen NT-3 stimmte mit der aus der cDNA-Sequenz von NT-3 Vorhergesagten überein. Die Ergebnisse sind in Tabelle 19 angeführt. Tabelle 19 Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz
Die Analyse erfolgte unter Einsatz von 1 nmol NT-3.
1) Phenylthiohydantoin
c) Analyse der Aminosäure-Zusammensetzung
Etwa 20 ug des in Ausführungsbeispiel 37 erhaltenen NT-3 wurden zur Bestimmung der Aminosäure-Zusammensetzung mittels Aminosäure-Analyzer (Beckman 6300E-System) eingesetzt. Die Aminosäure-Zusammensetzung des in Ausführungsbeispiel 37 erhaltenen NT-3 stimmte mit der aus der cDNA-Sequenz von NT-3 Vorhergesagten überein. Die Ergebnisse sind in Tabelle 20 angeführt. Tabelle 20 Analyse der Aminosäure-Zusammensetzung
Saure Hydrolyse (6 N HCl, 1% Phenol, 110ºC, Mittelwerte der nach 24 und 48 h Hydrolyse erhaltenen Werte)
1) Unter der Annahme einer Hydrolysendauer von 0 h extrapolierter Wert
2) Nicht bestimmt
d) Analyse der C-terminalen Aminosäure
Etwa 15 nmol des in Ausführungsbeispiel 37 erhaltenen NT-3 wurden zur Bestimmung der C-terminalen Aminosäure mittels Aminosäure-Analyzer (Beckman 6300E-System) eingesetzt. Die C-terminale Aminosäure des in Ausführungsbeispiel 37 erhaltenen NT-3 stimmte mit der aus der cDNA-Sequenz von NT-3 Vorhergesagten überein. Die Ergebnisse sind in Tabelle 21 angeführt. Tabelle 6 Analyse der C-terminalen Aminosäure
Dampfphasen-Hydrazinolyse (100ºC, 3,5 h)

Ausführungsbeispiel 39

(Bestimmung der NT-3-Aktivität)

Es wurde ein Assay des gereinigten und in Ausführungsbeispiel 37 erhaltenen NT-3 unter Einsatz von DRG durchgeführt, der zeigte, dass das gereinigte und in Ausführungsbeispiel 37 erhaltene NT-3 eine nahezu gleiche Aktivität wie aus CHO-Zellen erhaltenes NT-3 aufwies.

Ausführungsbeispiel 40

40 mg des in Bezugsbeispiel 3 erhaltenen Met-NT-3 mit Methionin an seinem N-Terminus wurden in 4 ml Lösung von 3 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurde eine Lösung aus 0,5 ml 50 mM Kupfersulfat, 0,25 g Glyoxalsäure und 0,5 ml Pyridin zugesetzt und bei 25ºC 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G- 25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit einer Pufferlösung von 2,5 M Harnstoff und 50 mM Phosphat (pH 6,0), geschickt und die Säule mit der gleichen Pufferlösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/min ausgewaschen, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-NT-3 zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde das gleiche Volumen einer Lösung von 4 M Essigsäure - 4 M Natriumacetat und anschließend Tolylen- 3,4-diamin in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 15 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 37 gereinigt, um gereinigtes NT-3 zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 41

40 mg des in Bezugsbeispiel 3 erhaltenen Met-NT-3 mit Methionin an seinem N-Terminus wurden in 4 ml Lösung von 3 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurde eine Lösung aus 0,5 ml 50 mM Kupfersulfat, 0,25 g Glyoxalsäure und 0,5 ml Pyridin zugesetzt und bei 25ºC 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G- 25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit einer Pufferlösung von 2,5 M Harnstoff und 50 mM Phosphat (pH 6,0), geschickt und die Säule mit der gleichen Pufferlösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/min ausgewaschen, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-NT-3 zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde das gleiche Volumen einer Lösung von 4 M Essigsäure - 4 M Natriumacetat und anschließend 2,3-Diaminophenol in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 15 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 37 gereinigt, um gereinigtes NT-3 zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 42

40 mg des in Bezugsbeispiel 3 erhaltenen Met-NT-3 mit Methionin an seinem N-Terminus wurden in 4 ml Lösung von 3 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurde eine Lösung aus 0,5 ml 50 mM Kupfersulfat, 0,25 g Glyoxalsäure und 0,5 ml Pyridin zugesetzt und bei 25ºC 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G- 25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit einer Pufferlösung von 2,5 M Harnstoff und 50 mM Phosphat (pH 6,0), geschickt und die Säule mit der gleichen Pufferlösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/min ausgewaschen, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-NT-3 zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde das gleiche Volumen einer Lösung von 4 M Essigsäure - 4 M Natriumacetat und anschließend 3,4- Diaminobenzoesäure in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 15 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 37 gereinigt, um gereinigtes NT-3 zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 43

40 mg des in Bezugsbeispiel 3 erhaltenen Met-NT-3 mit Methionin an seinem N-Terminus wurden in 4 ml Lösung von 3 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurde eine Lösung aus 0,5 ml 50 mM Kupfersulfat, 0,25 g Glyoxalsäure und 0,5 ml Pyridin zugesetzt und bei 25ºC 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G- 25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit einer Pufferlösung von 2,5 M Harnstoff und 50 mM Phosphat (pH 6,0), geschickt und die Säule mit der gleichen Pufferlösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/min ausgewaschen, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-NT-3 zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde das gleiche Volumen einer Lösung von 4 M Essigsäure - 4 M Natriumacetat und anschließend 4-Chlor- o-phenylendiamin in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 15 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 37 gereinigt, um gereinigtes NT-3 zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 44

40 mg des in Bezugsbeispiel 3 erhaltenen Met-NT-3 mit Methionin an seinem N-Terminus wurden in 4 ml Lösung von 3 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurde eine Lösung aus 0,5 ml 50 mM Kupfersulfat, 0,25 g Glyoxalsäure und 0,5 ml Pyridin zugesetzt und bei 25ºC 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G- 25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit einer Pufferlösung von 2,5 M Harnstoff und 50 mM Phosphat (pH 6,0), geschickt und die Säule mit der gleichen Pufferlösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/min ausgewaschen, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-NT-3 zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde Cysteamin in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt und das Gemisch auf einen pH von 8,5 eingestellt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 15 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 37 gereinigt, um gereinigtes NT-3 zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 45

20 mg des in Bezugsbeispiel 3 erhaltenen Met-NT-3 mit Methionin an seinem N-Terminus wurden in 2 ml Lösung von 3 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurden 2 ml einer Lösung mit 4 M Natriumacetat, 20 mM Essigsäure, 0,4 M Glyoxalsäure, 20 mM Nickelsulfat und 6 M Harnstoff zugesetzt und bei 25ºC 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit einer Pufferlösung von 2,5 M Harnstoff und 50 mM Phosphat (pH 6,0), geschickt und die Säule mit der gleichen Pufferlösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/min ausgewaschen, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-NT-3 zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde das gleiche Volumen einer Lösung von 4 M Essigsäure - 4 M Natriumacetat und anschließend o-Phenylendiamin in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 15 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 37 gereinigt, um gereinigtes NT-3 zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 46

20 mg des in Bezugsbeispiel 3 erhaltenen Met-NT-3 mit Methionin an seinem N-Terminus wurden in 2 mf Lösung von 3 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurden 2 ml einer Lösung mit 4 M Natriumacetat, 20 mM Essigsäure, 0,4 M Glyoxalsäure, 20 mM Kobaltchlorid und 6 M Harnstoff zugesetzt und bei 25ºC 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit einer Pufferlösung von 2,5 M Harnstoff und 50 mM Phosphat (pH 6,0), geschickt und die Säule mit der gleichen Pufferlösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/min ausgewaschen, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-NT-3 zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde das gleiche Volumen einer Lösung von 4 M Essigsäure - 4 M Natriumacetat und anschließend o-Phenylendiamin in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 15 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 37 gereinigt, um gereinigtes NT-3 zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 47

20 mg des in Bezugsbeispiel 3 erhaltenen Met-NT-3 mit Methionin an seinem N-Terminus wurden in 2 ml Lösung von 3 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurden 2 ml einer Lösung mit 4 M Natriumacetat, 20 mM Essigsäure, 0,4 M Glyoxalsäure, 20 mM Zinksul fat und 6 M Harnstoff zugesetzt und bei 25ºC 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit einer Pufferlösung von 2,5 M Harnstoff und 50 mM Phosphat (pH 6,0), geschickt und die Säule mit der gleichen Pufferlösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/min ausgewaschen, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-NT-3 zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde das gleiche Volumen einer Lösung von 4 M Essigsäure - 4 M Natriumacetat und anschließend o-Phenylendiamin in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 15 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 37 gereinigt, um gereinigtes NT-3 zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 48

40 mg des in Bezugsbeispiel 3 erhaltenen Met-NT-3 mit Methionin an seinem N-Terminus wurden in 4 ml Lösung von 3 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurde eine Lösung aus 0,5 ml 50 mM Kupferacetat, 0,25 g Glyoxalsäure und 0,5 ml Pyridin zugesetzt und bei 25ºC 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G- 25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit einer Pufferlösung von 2,5 M Harnstoff und 50 mM Phosphat (pH 6,0), geschickt und die Säule mit der gleichen Pufferlösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/min ausgewaschen, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-NT-3 zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde das gleiche Volumen einer Lösung von 4 M Essigsäure - 4 M Natriumacetat und anschließend o-Phenylendiamin in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 15 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 37 gereinigt, um gereinigtes NT-3 zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 49

20 mg des in Bezugsbeispiel 3 erhaltenen Met-NT-3 mit Methionin an seinem N-Terminus wurden in 2 ml Lösung von 3 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurden 2 ml einer Lösung mit 4 M Natriumacetat, 0,8 mM Essigsäure, 0,4 M Glyoxalsäure, 10 mM Kupfersulfat und 3 M Harnstoff zugesetzt und bei 25ºC 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit einer Pufferlösung von 2,5 M Harnstoff und 50 mM Phosphat (pH 6,0), geschickt und die Säule mit der gleichen Pufferlösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/min ausgewaschen, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-NT-3 zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde das gleiche Volumen einer Lösung von 4 M Essigsäure - 4 M Natriumacetat und anschließend o-Phenylendiamin in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 15 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 37 gereinigt, um gereinigtes NT-3 zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 50

20 mg des in Bezugsbeispiel 3 erhaltenen Met-NT-3 mit Methionin an seinem N-Terminus wurden in 2 ml Lösung von 3 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurden 2 ml einer Lösung mit 1 M Imidazol, 0,5 M Glyoxalsäure, 20 mM Kupfersulfat und 3 M Harnstoff zugesetzt und bei 25ºC 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde über eine Sephadex G-25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit einer Pufferlösung von 2,5 M Harnstoff und 50 mM Phosphat (pH 6,0), geschickt und die Säule mit der gleichen Pufferlösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/min ausgewaschen, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-NT-3 zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde das gleiche Volumen einer Lösung von 4 M Essigsäure - 4 M Natriumacetat und anschließend o-Phenylendiamin in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 15 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 37 gereinigt, um gereinigtes NT-3 zu erhalten.
Die Aktivierung von denaturiertem Met-NT-3 und die Reinigung von aktiviertem Met- NT-3 können beispielsweise nach folgendem Verfahren durchgeführt werden: Die in Bezugsbeispiel 3(5) erhaltene Pellet-Lösung wird zentrifugiert (10.000 U/min) und der erhaltene Überstand wurde mit 100 mM Phosphat-Pufferlösung (pH 8,5) mit 1,8 M Hernstoff, 0,2 M Arg, 0,2 mM GSSG und 1,0 mM GSH auf etwa das 20fache Volumen verdünnt. Das Gemisch wird bei 4ºC 4 Wochen lang stehen gelassen, um die Neufaltung (Aktivierung) von denaturiertem Met-NT-3 fortzusetzen.
Nach der Neufaltung wird die Lösung auf pH 6,0 eingestellt und auf eine SP-Sepharose- Säule (22 mm ID · 120 mm L), äquilibriert mit 100 mM Phosphat-Pufferlösung (pH 6,0), gefolgt von Elution mit 100 mM Phosphat-Pufferiösung + 400 mM NaCl (pH 6,0), um die Met-NT-3-Fraktion zu gewinnen. Die abgenommene Fraktion wird über eine ODP- 50-Säule (21,5 mm ID · 300 mm L; Showa Denko), äquilibriert mit 0,1% TFA, geschickt, gefolgt von Elution mit 0-80% Lösung B (B = Acetonitril / 0,1% TFA) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 5 ml/min innerhalb von 60 min, um die Met-NT-3-Fraktion zu gewinnen. Die abgenommene Fraktion wurde gefriergetrocknet, um Met-NT-3- Pulver zu erhalten.
Anstelle des obigen Arg können auch Citrullin, Ala, Val, Asp, etc. zur Neufaltung eingesetzt werden.

Ausführungsbeispiel 51

20 mg des in Bezugsbeispiel 5 erhaltenen Human-Interleukin-2 mit Methionin an seinem N-Terminus (Met-IL-2) wurden in 27 ml 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) gelöst. Dem Gemisch wurden 3,375 ml einer Lösung von 1,55 g Glyoxalsäure, 0,1 M Nickelchlorid, 4 M Natriumacetat, 20 mM Essigsäure und 6 M Harnstoff zugesetzt und bei Raumtemperatur 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 300 ml/h über eine Sephadex G-25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0), geschickt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-IL-2 zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde o-Phenylendiamin in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 21 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 8 behandelt, um gefriergetrocknetes IL-2-Pulver zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 52

20 mg des in Bezugsbeispiel 5 erhaltenen Human-Interleukin-2 mit Methionin an seinem N-Terminus (Met-IL-2) wurden in 27 ml 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) gelöst. Dem Gemisch wurden 3,375 ml einer Lösung von 1,55 g Glyoxalsäure, 0,1 M Kobaltchlorid, 4 M Natriumacetat, 20 mM Essigsäure und 6 M Harnstoff zugesetzt und bei Raumtemperatur 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 300 ml/h über eine Sephadex G-25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0), geschickt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-IL-2 zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde o-Phenylendiamin in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 21 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 8 behandelt, um gefriergetrocknetes IL-2-Pulver zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 53

20 mg des in Bezugsbeispiel 5 erhaltenen Human-Interleukin-2 mit Methionin an seinem N-Terminus (Met-IL-2) wurden in 27 ml 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) gelöst. Dem Gemisch wurden 3,375 ml einer Lösung von 1,55 g Glyoxalsäure, 0,1 M Zinksulfat, 4 M Natriumacetat, 20 mM Essigsäure und 6 M Harnstoff zugesetzt und bei Raumtemperatur 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 300 ml/h über eine Sephadex G-25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0), geschickt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-IL-2 zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde o-Phenylendiamin in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 21 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 8 behandelt, um gefriergetrocknetes IL-2-Pulver zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 54

20 mg des in Bezugsbeispiel 5 erhaltenen Human-Interleukin-2 mit Methionin an seinem N-Terminus (Met-IL-2) wurden in 27 ml 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) gelöst. Dem Gemisch wurden 3,375 ml einer Lösung von 1,55 g Glyoxalsäure, 0,1 M Kupferacetat, 4 M Natriumacetat, 20 mM Essigsäure und 6 M Harnstoff zugesetzt und bei Raumtemperatur 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 300 ml/h über eine Sephadex G-25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0), geschickt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-IL-2 zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde o-Phenylendiamin in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 21 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 8 behandelt, um gefriergetrocknetes IL-2-Pulver zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 55

20 mg des in Bezugsbeispiel 5 erhaltenen Human-Interleukin-2 mit Methionin an seinem N-Terminus (Met-IL-2) wurden in 27 ml 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) gelöst. Dem Gemisch wurden 3,375 ml einer Lösung von 1,55 g Glyoxalsäure, 0,1 M Kupfersulfat und 3,375 ml Pyridin zugesetzt und bei Raumtemperatur 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 300 ml/h über eine Sephadex G-25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0), geschickt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-IL-2 zu gewinnen. Diese Fraktion wurde auf pH 8,5 eingestellt und ihr Cysteamin in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 21 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 8 behandelt, um gefriergetrocknetes IL-2-Pulver zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 56

20 mg des in Bezugsbeispiel 5 erhaltenen Human-Interleukin-2 mit Methionin an seinem N-Terminus (Met-IL-2) wurden in 27 ml 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) gelöst. Dem Gemisch wurden 3,375 ml einer Lösung von 1,55 g Glyoxalsäure, 0,1 M Kupfersulfat und 3,375 ml Pyridin zugesetzt und bei Raumtemperatur 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 300 ml/h über eine Sephadex G-25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0), geschickt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-IL-2 zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde Tolylen-3,4-diamin in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 21 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 8 behandelt, um gefriergetrocknetes IL-2-Pulver zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 57

20 mg des in Bezugsbeispiel 5 erhaltenen Human-Interleukin-2 mit Methionin an seinem N-Terminus (Met-IL-2) wurden in 27 ml 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) gelöst. Dem Gemisch wurden 3,375 ml einer Lösung von 1,55 g Glyoxalsäure, 0,1 M Kupfersulfat und 3,375 ml Pyridin zugesetzt und bei Raumtemperatur 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 300 ml/h über eine Sephadex G-25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0), geschickt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-IL-2 zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde 4-Chlor-o-phenylendiamin in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 21 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 8 behandelt, um gefriergetrocknetes IL-2-Pulver zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 58

20 mg des in Bezugsbeispiel 5 erhaltenen Human-Interleukin-2 mit Methionin an seinem N-Terminus (Met-IL-2) wurden in 27 ml 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) gelöst. Dem Gemisch wurden 3,375 ml einer Lösung von 1,55 g Glyoxalsäure, 0,1 M Kupfersulfat und 3,375 ml Pyridin zugesetzt und bei Raumtemperatur 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 300 ml/h über eine Sephadex G-25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0), geschickt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-lL-2 zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde 3,4-Diaminobenzoesäure in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 21 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 8 behandelt, um gefriergetrocknetes IL-2-Pulver zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 59

20 mg des in Bezugsbeispiel 5 erhaltenen Human-Interleukin-2 mit Methionin an seinem N-Terminus (Met-IL-2) wurden in 27 ml 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) gelöst. Dem Gemisch wurden 3,375 ml einer Lösung von 1,55 g Glyoxalsäure, 0,1 M Kupfersulfat und 3,375 ml Pyridin zugesetzt und bei Raumtemperatur 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 300 ml/h über eine Sephadex G-25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0), geschickt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-IL-2 zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde 2,3-Diaminophenol in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 21 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 8 behandelt, um gefriergetrocknetes IL-2-Pulver zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 60

20 mg des in Bezugsbeispiel 5 erhaltenen Human-Interleukin-2 mit Methionin an seinem N-Terminus (Met-IL-2) wurden in 27 ml 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) gelöst. Dem Gemisch wurde das gleiche Volumen einer Lösung von 0,5 M Glyoxalsäure, 20 mM Zinksulfat, 40 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) und 6 M Harnstoff zugesetzt und bei Raumtemperatur 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 300 ml/h über eine Sephadex G- 25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0), geschickt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-IL-2 zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde o-Phenylendiamin in einer Endkonzentration von 20 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 21 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 8 behandelt, um gefriergetrocknetes IL-2- Pulver zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 61

20 mg des in Bezugsbeispiel 5 erhaltenen Human-Interleukin-2 mit Methionin an seinem N-Terminus (Met-IL-2) wurden in 27 ml 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) gelöst. Dem Gemisch wurde das gleiche Volumen einer Lösung von 0,5 M Gly oxalsäure, 20 mM Kupferacetat, 40 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) und 6 M Harnstoff zugesetzt und bei Raumtemperatur 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 300 ml/h über eine Sephadex G- 25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0), geschickt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-IL-2 zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde o-Phenylendiamin in einer Endkonzentration von 20 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 21 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 8 behandelt, um gefriergetrocknetes IL-2-Pulver zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 62

20 mg des in Bezugsbeispiel 5 erhaltenen Human-Interleukin-2 mit Methionin an seinem N-Terminus (Met-IL-2) wurden in 27 ml 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) gelöst. Dem Gemisch wurde das gleiche Volumen einer Lösung von 0,5 M Glyoxalsäure, 20 mM Nickelchlorid, 40 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) und 6 M Harnstoff zugesetzt und bei Raumtemperatur 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 300 ml/h über eine Sephadex G- 25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0), geschickt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-IL-2 zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde o-Phenylendiamin in einer Endkonzentration von 20 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 21 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 8 behandelt, um gefriergetrocknetes IL-2-Pulver zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 63

20 mg des in Bezugsbeispiel 5 erhaltenen Human-Interleukin-2 mit Methionin an seinem N-Terminus (Met-IL-2) wurden in 27 ml 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) gelöst. Dem Gemisch wurde das gleiche Volumen einer Lösung von 0,5 M Glyoxalsäure, 20 mM Kobaltchlorid, 40 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) und 6 M Harnstoff zugesetzt und bei Raumtemperatur 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 300 ml/h über eine Sephadex G- 25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0), geschickt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-IL-2 zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde o-Phenylendiamin in einer Endkonzentration von 20 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 21 h fang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 8 behandelt, um gefriergetrocknetes IL-2-Pulver zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 64

20 mg des in Bezugsbeispiel 5 erhaltenen Human-Interleukin-2 mit Methionin an seinem N-Terminus (Met-IL-2) wurden in 27 ml 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) gelöst, gefolgt von Dialyse gegen 2 l einer Lösung von 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) mit 3 M Harnstoff. Der dialysierten Lösung wurde das gleiche Volumen einer Lösung von 1 M Imidazol, 0,5 M Glyoxalsäure, 20 mM Kupfersulfat und 2,5 M Harnstoff zugesetzt und bei Raumtemperatur 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 300 ml/h über eine Sephadex G-25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0), geschickt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-IL-2 zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde o-Phenylendiamin in einer Endkonzentration von 20 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 21 h lang ab laufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 8 behandelt, um gefriergetrocknetes IL-2-Pulver zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 65

20 mg des in Bezugsbeispiel 5 erhaltenen Human-Interleukin-2 mit Methionin an seinem N-Terminus (Met-IL-2) wurden in 27 ml 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) gelöst, gefolgt von Dialyse gegen 2 l einer Lösung von 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) mit 3 M Harnstoff. Der dialysierten Lösung wurde das gleiche Volumen einer Lösung von 4 M Natriumacetat, 0,4 M Glyoxalsäure, 10 mM Kupfersulfat, 0,8 M Essigsäure und 2,5 M Harnstoff zugesetzt und bei Raumtemperatur 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 300 ml/h über eine Sephadex G- 25-Säule (25 mm ID · 600 mm L), äquilibriert mit 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0), geschickt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-IL-2 zu gewinnen. Dieser Fraktion wurde o-Phenylendiamin in einer Endkonzentration von 20 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktion bei 37ºC 21 h lang ablaufen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 8 behandelt, um gefriergetrocknetes IL-2-Pulver zu erhalten.

Bezugsbeispiel 10

Escherichia coli MM294 (DE3)/pE-C35PTH (IFO 15213; beschrieben in EP-A-499.990 und)P-A-304976/1993) wurde in 1 l eines flüssigen Mediums (pH 7,0) mit 1% Bacto- TRYPTON, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% Natriumchlorid und 50 ug/ml Ampicillin eingeimpft und anschließend auf einer Umlaufschüttelmaschine bei 30ºC kultiviert. 1 l der erhaltenen Kulturlösung wurde danach in 19 l eines flüssigen Mediums mit 1% Bacto-TRYP- TON, 0,5% Hefeextrakt und 0,5% Natriumchlorid übergeführt, wonach sie unter Belüftung und Agitation bei 30ºC 8 h lang kultiviert wurde. Die resultierenden 17 l Kulturlösung wurden danach in einen 500 l Standfermenter übergeführt, der 343 l M-9-Medium (0,0005% Vitamin B&sub1;, 1,5% Glucose, 1,5% Casaminosäure) enthielt, wonach sie unter Belüftung und Agitation bei 37ºC 7 h lang kultiviert wurde, um etwa 350 l Kulturlösung zu erhalten. Die erhaltene Kulturlösung wurde zentrifugiert, um etwa 4 kg Zellen (Nassgewicht) zu erhalten, die bei -80ºC eingefroren wurden.

Bezugsbeispiel 11

Zu 10 g der in Bezugsbeispiel 10 erhaltenen Zellen (Nassgewicht) wurden 40 ml 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) mit 7 M Guanidin-hydrochlorid zugesetzt und die Zellen in der Lösung gelöst, gefolgt von Zentrifugation (10.000 U/min, 60 min), um etwa 40 ml Zellextrakt zu erhalten. Der Zellextrakt wurde mit etwa 2 l einer 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) verdünnt, gefolgt von Zentrifugation (4.200 U/min, 20 min), um etwa 2 l des resultierenden Überstands zu erhalten. Der Überstand wurde auf eine SP-Toyopearl 650M-Säule (5 cm ø · 30 cm) geladen, gefolgt von Adsorption und Waschen. Die Säule wurde mit 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) mit 1 M NaCl eluiert. Die eluierte Lösung wurde auf eine ODS-120T-Säule (21,5 cm · 30 cm; Tosoh) nach dem HPLC-Verfahren geladen, gefolgt von Elution mit einem linearen Konzentrationsgradienten aus (1) 0,1% TFA und (2) 80% Acetonitril mit 0,1% TFA, um etwa 30 ml einer Fraktion von Met-[Cys³&sup5;]-PTH(1-84) zu erhalten. Die Fraktion wurde gegen 0,1 M Essigsäure-Lösung (5 l) mit 6 M Harnstoff dialysiert. Der resultierenden Lösung wurden etwa 4 mg DMAP-CN (1-Cyano-4-dimethylaminopyridinium-tetrafluorborat) zugesetzt und die Lösung bei Raumtemperatur 15 min lang stehen gelassen, um Met-[Cys(CN)³&sup5;]-PTH(1-84) zu erhalten. Die erhaltene Reaktionslösung wurde auf eine SP-Toyopearl 650M-Säule (1,0 cm ø · 30 cm) geladen und die Säule mit 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) mit 100 mM NaCl ausgewaschen, um den Reaktanden zu entfernen, gefolgt von Elution mit 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) mit 1 M NaCl. Die eluierte Lösung wurde gegen 5 l einer Lösung von 6 M Harnstoff dialysiert. Die resultierende Lösung (etwa 8 ml) wurde eisgekühlt, wonach etwa 400 pl 1 N NaOH zugesetzt und das Gemisch bei 0ºC 10 min lang stehen gelassen wurde. Die resultierende Reaktionslösung wurde Gelfiltration mit Toyopearl HW-50F (2 cm ø · 50 cm), äquilibriert mit 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0), unterzogen, um die Met-PTH(1-34)-Fraktion zu gewinnen. Die Fraktion wurde nach dem HPLC-Verfahren auf eine ODS-120T-Säule (21,5 cm ø · 30 cm; Tosoh) geladen, gefolgt von Elution mit einem linearen Konzentrationsgradienten aus (1) 0,1% TFA und (2) 80% Acetonitril mit 0,1% TFA, um etwa 50 ml einer Fraktion von Met-PTH(1- 34) zu erhalten. Die Fraktion wurde gefriergetrocknet, um etwa 5 mg Met-PTH(1-34) zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 66

5 mg des in Bezugsbeispiel 11 erhaltenen Met-PTH(1-34) mit Methionin an seinem N- Terminus wurden in 1 ml destilliertem Wasser gelöst. Dem Gemisch wurde eine Lösung von 46,4 mg Glyoxalsäure, 2,5 mg Kupfersulfat und 94,8 mg Pyridin zugesetzt und das Gemisch bei Raumtemperatur 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert und der erhaltene Überstand nach dem HPLC-Verfahren auf eine ODP-50- Säule (1 cm ø · 25 cm; Showa Denko) geladen, gefolgt von Elution mit einem linearen Konzentrationsgradienten aus (1) 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) mit 10% Acetonitril und (2) 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) mit 60% Acetonitril, um etwa 5,4 ml einer Fraktion des Diketonderivats von Met-PTH(1-34) zu erhalten. Die Fraktion wurde gefriergetrocknet und 4 ml destilliertes Wasser zugesetzt. Dem Gemisch wurden 4 ml einer Lösung von 80 mM o-Phenylendiamin, 4 M Essigsäure und 4 M Ammoniumacetat zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach das Gemisch bei 37ºC 17 h lang stehen gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde nach dem HPLC-Verfahren auf eine ODP-50-Säule (1 cm ø · 25 cm; Showa Denko) geladen, gefolgt von Elution mit einem linearen Konzentrationsgradienten aus (1) 0,1% TFA und (2) 80% Acetonitril mit 0,1% TFA, um die Fraktion von PTH(1-34) zu erhalten. Die Fraktion wurde mit 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) auf das Fünffache verdünnt und die verdünnte Lösung auf eine SP-5PW-Säule (7,5 mm ø · 75 mm; Tosoh), äquilibriert mit 20 mM Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) mit 2 M Harnstoff, geladen, gefolgt von Elution mit einem linearen Konzentra tionsgradienten aus 0-50% Lösung B (B = 20 mM MES, 2 M Harnstoff und 0,5 M NaCl) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,8 ml/min innerhalb von 30 min, um die PTH(1-34)-Fraktion zu gewinnen, die gegen 1 l destilliertes Wasser dialysiert wurde. Die dialysierte Lösung wurde gefriergetrocknet, um gefriergetrocknetes PTH(1-34)-Pulver zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 67

(Bestimmung der Eigenschaften von PTH(1-34))

a) Analyse mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Das in Ausführungsbeispiel 66 erhaltene PTH(1-34)-Pulver wurde in Probenpuffer [NOVEX JAPAN] suspendiert und das Gemisch mittels Peptid-PAGE mini (TEFCO) Elektrophorese unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie-Brilliantblau gefärbt, und es wurde nur eine einzige Bande des gereinigten Proteins erhalten. Die Ergebnisse sind in Fig. 8 dargestellt. In Fig. 8 stellen die Spuren 1-2 Molekulargewichtsmarker bzw. PTH(1-34) dar.
b) Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz
Die N-terminale Aminosäuresequenz des in Ausführungsbeispiel 66 erhaltenen PTH(1- 34) wurde mittels eines Gasphasen-Proteinsequenzers (Applied Biosystems, Modell 477A) bestimmt. Die N-terminale Aminosäuresequenz des in Ausführungsbeispiel 66 erhaltenen PTH(1-34) stimmte mit der aus der cDNA-Sequenz von PTH(1-34) Vorhergesagten überein. Die Ergebnisse sind in Tabelle 22 angeführt. Tabelle 22 Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz
Die Analyse erfolgte unter Einsatz von 400 umol PTH(1-34).
1) Phenylthiohydantoin
c) Analyse der Aminosäure-Zusammensetzung
In Ausführungsbeispiel 66 erhaltenes PTH(1-34) wurde zur Bestimmung der Aminosäure-Zusammensetzung mittels Aminosäure-Analyzer (Hitachi L-8500A Aminosäure-Analyzer) eingesetzt. Die Aminosäure-Zusammensetzung des in Ausführungsbeispiel 66 erhaltenen PTH(1-34) stimmte mit der aus der cDNA-Sequenz von PTH(1-34) Vorhergesagten überein. Die Ergebnisse sind in Tabelle 23 angeführt. Tabelle 23 Analyse der Aminosäure-Zusammensetzung
Saure Hydrolyse (6 N HCl, 1% Thioglykolsäure, 110ºC, 24 h Hydrolyse)
1) Nicht bestimmt
d) Analyse der C-terminalen Aminosäure
Das in Ausführungsbeispiel 66 erhaltenen PTH(1-34) wurden zur Bestimmung der C-terminalen Aminosäure mittels Aminosäure-Analyzer (Hitachi L-8500A Aminosäure-Analyzer) eingesetzt. Die C-terminale Aminosäure des in Ausführungsbeispiel 66 erhaltenen PTH(1-34) stimmte mit der aus der cDNA-Sequenz von PTH(1-34) Vorhergesagten überein. Die Ergebnisse sind in Tabelle 24 angeführt. Tabelle 24 Analyse der C-terminalen Aminosäure
Dampfphasen-Hydrazinolyse (100ºC, 6 h)
e) Bestimmung der PTH(1-34)-Aktivität
Es wurde ein Assay des in Ausführungsbeispiel 66 erhaltenen PTH(1-34) unter Einsatz von MC3T3-E1-Zellen (osteoblasten-ähnlicher Stamm) nach dem von Shizue Nakagawa et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 200, 1735 (1994), beschriebenen Verfahren durchgeführt, der zeigte, dass das in Ausführungsbeispiel 66 erhaltene PTH(1-34) eine nahezu gleiche Aktivität wie ein Standard-Produkt aufwies.

Ausführungsbeispiel 68

5 mg des in Bezugsbeispiel 11 erhaltenen Met-PTH(1-34) mit Methionin an seinem N- Terminus wurden in 1 ml eine Lösung von 4 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurde 1 ml einer Lösung von 4 M Ammoniumacetat, 20 mM Essigsäure, 0,4 M Glyoxalsäure, 20 mM Nickelchlorid und 4 M Harnstoff zugesetzt und das Gemisch bei Raumtemperatur 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert und der erhaltene Überstand nach dem HPLC-Verfahren unter Verwendung einer ODP-50-Säule wie in Ausführungsbeispiel 66 beschrieben gereinigt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-PTH(1-34) zu erhalten. Die Fraktion wurde gefriergetrocknet, wonach 4 ml destilliertes Wasser zugesetzt wurden. Dem Gemisch wurden 4 ml einer Lösung von 80 mM o-Phenylendiamin, 4 M Essigsäure und 4 M Ammoniumacetat zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktionslösung stehen gelassen und auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 66 behandelt wurde, um gefriergetrocknetes PTH(1-34)-Pulver zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 69

5 mg des in Bezugsbeispiel 11 erhaltenen Met-PTH(1-34) mit Methionin an seinem N- Terminus wurden in 1 ml eine Lösung von 4 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurde 1 ml einer Lösung von 4 M Ammoniumacetat, 20 mM Essigsäure, 0,4 M Glyoxalsäure, 20 mM Kobaltchlorid und 4 M Harnstoff zugesetzt und das Gemisch bei Raumtemperatur 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert und der erhaltene Überstand nach dem HPLC-Verfahren unter Verwendung einer ODP-50-Säule wie in Ausführungsbeispiel 66 beschrieben gereinigt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-PTH(1-34) zu erhalten. Die Fraktion wurde gefriergetrocknet, wonach 4 ml destilliertes Wasser zugesetzt wurden. Dem Gemisch wurden 4 ml einer Lösung von 80 mM o-Phenylendiamin, 4 M Essigsäure und 4 M Ammoniumacetat zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktionslösung stehen gelassen und auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 66 behandelt wurde, um gefriergetrocknetes PTH(1-34)-Pulver zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 70

5 mg des in Bezugsbeispiel 11 erhaltenen Met-PTH(1-34) mit Methionin an seinem N- Terminus wurden in 1 ml eine Lösung von 4 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurde 1 ml einer Lösung von 4 M Ammoniumacetat, 20 mM Essigsäure, 0,4 M Glyoxalsäure, 20 mM Zinksulfat und 4 Vt Harnstoff zugesetzt und das Gemisch bei Raumtemperatur 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert und der erhaltene Überstand nach dem HPLC-Verfahren unter Verwendung einer ODP-50-Säule wie in Ausführungsbeispiel 66 beschrieben gereinigt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-PTH(1-34) zu erhalten. Die Fraktion wurde gefriergetrocknet, wonach 4 ml destilliertes Wasser zugesetzt wurden. Dem Gemisch wurden 4 ml einer Lösung von 80 mM o-Phenylendiamin, 4 M Essigsäure und 4 M Ammoniumacetat zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktionslösung stehen gelassen und auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 66 behandelt wurde, um gefriergetrocknetes PTH(1-34)-Pulver zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 71

S mg des in Bezugsbeispiel 11 erhaltenen Met-PTH(1-34) mit Methionin an seinem N- Terminus wurden in 1 ml eine Lösung von 4 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurde 1 ml einer Lösung von 4 M Ammoniumacetat, 20 mM Essigsäure, 0,4 M Glyoxalsäure, 20 mM Kupferacetat und 4 M Harnstoff zugesetzt und das Gemisch bei Raumtemperatur 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert und der erhaltene Überstand nach dem HPLC-Verfahren unter Verwendung einer ODP-50-Säule wie in Ausführungsbeispiel 66 beschrieben gereinigt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-PTH(1-34) zu erhalten. Die Fraktion wurde gefriergetrocknet, wonach 4 ml destilliertes Wasser zugesetzt wurden. Dem Gemisch wurden 4 ml einer Lösung von 80 mM o-Phenylendiamin, 4 M Essigsäure und 4 M Ammoniumacetat zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktionslösung stehen gelassen und auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 66 behandelt wurde, um gefriergetrocknetes PTH(1-34)-Pulver zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 72

5 mg des in Bezugsbeispiel 11 erhaltenen Met-PTH(1-34) mit Methionin an seinem N- Terminus wurden in 1 ml eine Lösung von 4 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurde 1 ml einer Lösung von 4 M Ammoniumacetat, 20 mM Essigsäure, 0,4 M Glyoxalsäure, 20 mM Kupfersulfat und 4 M Harnstoff zugesetzt und das Gemisch bei Raumtemperatur 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert und der erhaltene Überstand nach dem HPLC-Verfahren unter Verwendung einer ODP-50-Säule wie in Ausführungsbeispiel 66 beschrieben gereinigt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-PTH(1-34) zu erhalten. Die Fraktion wurde gefriergetrocknet, wonach 4 ml einer Lösung mit 50 mM Tris-HCl (pH 8,5) zugesetzt wurden. Dem Gemisch wurde Cysteamin in einer Endkonzentration von 40 mM zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktionslösung stehen gelassen und auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 66 behandelt wurde, um gefriergetrocknetes PTH(1-34)-Pulver zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 73

5 mg des in Bezugsbeispiel 11 erhaltenen Met-PTH(1-34) mit Methionin an seinem N- Terminus wurden in 1 ml eine Lösung von 4 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurde 1 ml einer Lösung von 4 M Ammoniumacetat, 20 mM Essigsäure, 0,4 M Glyoxalsäure, 20 mM Kupfersulfat und 4 M Harnstoff zugesetzt und das Gemisch bei Raumtemperatur 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert und der erhaltene Uberstand nach dem HPLC-Verfahren unter Verwendung einer ODP-50-Säule wie in Ausführungsbeispiel 66 beschrieben gereinigt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-PTH(1-34) zu erhalten. Die Fraktion wurde gefriergetrocknet, wonach 4 ml destilliertes Wasser zugesetzt wurden. Dem Gemisch wurden 4 ml einer Lösung von 80 mM Tolylen-3,4-diamin, 4 M Essigsäure und 4 M Ammoniumacetat zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktionslösung stehen ge lassen und auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 66 behandelt wurde, um gefriergetrocknetes PTH(1-34)-Pulver zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 74

5 mg des in Bezugsbeispiel 11 erhaltenen Met-PTH(1-34) mit Methionin an seinem N- Terminus wurden in 1 ml eine Lösung von 4 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurde 1 ml einer Lösung von 4 M Ammoniumacetat, 20 mM Essigsäure, 0,4 M Glyoxalsäure, 20 mM Kupfersulfat und 4 M Harnstoff zugesetzt und das Gemisch bei Raumtemperatur 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert und der erhaltene Überstand nach dem HPLC-Verfahren unter Verwendung einer ODP-50-Säule wie in Ausführungsbeispiel 66 beschrieben gereinigt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-PTH(1-34) zu erhalten. Die Fraktion wurde gefriergetrocknet, wonach 4 ml destilliertes Wasser zugesetzt wurden. Dem Gemisch wurden 4 ml einer Lösung von 80 mM 4-Chlor-o-phenylendiamin, 4 M Essigsäure und 4 M Ammoniumacetat zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktionslösung stehen gelassen und auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 66 behandelt wurde, um gefriergetrocknetes PTH(1-34)-Pulver zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 75

5 mg des in Bezugsbeispiel 11 erhaltenen Met-PTH(1-34) mit Methionin an seinem N- Terminus wurden in 1 ml eine Lösung von 4 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurde 1 ml einer Lösung von 4 M Ammoniumacetat, 20 mM Essigsäure, 0,4 M Glyoxalsäure, 20 mM Kupfersulfat und 4 M Harnstoff zugesetzt und das Gemisch bei Raumtemperatur 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert und der erhaltene Überstand nach dem HPLC-Verfahren unter Verwendung einer ODP-50-Säule wie in Ausführungsbeispiel 66 beschrieben gereinigt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-PTH(1-34) zu erhalten. Die Fraktion wurde gefriergetrocknet, wonach 4 ml destilliertes Wasser zugesetzt wurden. Dem Gemisch wurden 4 ml einer Lösung von 80 mM 3,4-Diaminobenzoesäure, 4 M Essigsäure und 4 M Ammoniumacetat zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktionslösung stehen gelassen und auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 66 behandelt wurde, um gefriergetrocknetes PTH(1-34)-Pulver zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 76

5 mg des in Bezugsbeispiel 11 erhaltenen Met-PTH(1-34) mit Methionin an seinem N- Terminus wurden in 1 ml eine Lösung von 4 M Harnstoff gelöst. Dem Gemisch wurde 1 ml einer Lösung von 4 M Ammoniumacetat, 20 mM Essigsäure, 0,4 M Glyoxalsäure, 20 mM Kupfersulfat und 4 M Harnstoff zugesetzt und das Gemisch bei Raumtemperatur 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert und der erhaltene Überstand nach dem HPLC-Verfahren unter Verwendung einer ODP-50-Säule wie in Ausführungsbeispiel 66 beschrieben gereinigt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-PTH(1-34) zu erhalten. Die Fraktion wurde gefriergetrocknet, wonach 4 ml destilliertes Wasser zugesetzt wurden. Dem Gemisch wurden 4 ml einer Lösung von 80 mM 2,3-Diaminophenol, 4 M Essigsäure und 4 M Ammoniumacetat zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktionslösung stehen gelassen und auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 66 behandelt wurde, um gefriergetrocknetes PTH(1-34)-Pulver zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 77

5 mg des in Bezugsbeispiel 11 erhaltenen Met-PTH(1-34) mit Methionin an seinem N- Terminus wurden in 1 ml eine Lösung von 3 M Harnstoff und 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) gelöst. Dem Gemisch wurde 1 ml einer Lösung von 1 M Imidazol, 0,5 M Glyoxalsäure, 20 mM Kupfersulfat und 2,5 M Harnstoff zugesetzt und das Gemisch bei Raumtemperatur 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert und der erhaltene Überstand nach dem HPLC-Verfahren unter Verwendung einer ODP-50-Säule wie in Ausführungsbeispiel 66 beschrieben gereinigt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-PTH(1-34) zu erhalten. Die Fraktion wurde gefriergetrocknet, wonach 4 ml destilliertes Wasser zugesetzt wurden. Dem Gemisch wurden 4 ml einer Lösung von 80 mM o-Phenylendiamin, 4 M Essigsäure und 4 M Ammoniumacetat zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktionslösung stehen gelassen und auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 66 behandelt wurde, um gefriergetrocknetes PTH(1-34)-Pulver zu erhalten.

Ausführungsbeispiel 78

5 mg des in Bezugsbeispiel 11 erhaltenen Met-PTH(1-34) mit Methionin an seinem N- Terminus wurden in 1 ml eine Lösung von 3 M Harnstoff und 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) gelöst. Dem Gemisch wurde 1 ml einer Lösung von 4 M Ammoniumacetat, 0,8 M Essigsäure, 0,4 M Glyoxalsäure, 10 mM Kupfersulfat und 2,5 M Harnstoff zugesetzt und das Gemisch bei Raumtemperatur 1 h lang stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert und der erhaltene Überstand nach dem HPLC-Verfahren unter Verwendung einer ODP-50-Säule wie in Ausführungsbeispiel 66 beschrieben gereinigt, um die Fraktion des Diketonderivats von Met-PTH(1-34) zu erhalten. Die Fraktion wurde gefriergetrocknet, wonach 4 ml destilliertes Wasser zugesetzt wurden. Dem Gemisch wurden 4 ml einer Lösung von 80 mM o-Phenylendiamin, 4 M Essigsäure und 4 M Ammoniumacetat zugesetzt, gefolgt von Evakuierung und Abschluss unter Stickstoffgas, wonach die Reaktionslösung stehen gelassen und auf dieselbe Weise wie in Ausführungsbeispiel 66 behandelt wurde, um gefriergetrocknetes PTH(1-34)-Pulver zu erhalten.

SEQUENZAUFLISTUNG:

(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:

(i) ANMELDER:
(A) NAME: Takeda Chemical Industries Limited (B) STRASSE: 1-1, Doshomachi 4-Chome (C) STADT: Chuo-Ku (D) BUNDESSTAAT: Osaka (E) LAND: Japan (F) POSTLEITZAHL: 541
(i) TITEL DER ERFINDUNG: Verfahren zur Entfernung von N-terminalem Methionin
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 8
(iv) CPOMPUTERLESBARE FORM:
(A) ART DES MEDIUMS: Diskette (B) COMPUTER: IBM-PC kompatibel (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS / MS-DOS (D) SOFTWARE: PatentIn Release 1.0, Version 1.30 (EPO)

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 1:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 35 Basen paare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGANZAHL: einfach (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: andere Nukleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "synthetische DNA"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 1:

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 2:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGANZAHL: einfach (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: andere Nukleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "synthetische DNA"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 2:

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 3:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 15 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGANZAHL: einfach (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: andere Nukleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "synthetische DNA"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 3:

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 4:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 10 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGANZAHL: einfach (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: andere Nukleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "synthetische DNA"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 4:

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 5:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 12 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGANZAHL: einfach (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: andere Nukleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "synthetische DNA"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 5:

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 6:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 22 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGANZAHL: einfach (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: andere Nukleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "synthetische DNA"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 6:

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 7:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 28 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGANZAHL: einfach (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: andere Nukleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "synthetische DNA"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 7:

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 8:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGANZAHL: einfach (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: andere Nukleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "synthetische DNA"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 8:

Claims

1. Verfahren zum Entfernen eines N-terminalen Methioninrests, wobei der Methioninrest oxidiert sein kann, welches das Umsetzen eines Peptids oder eines Salzes davon mit dem Methioninrest an seinem N-Terminus mit einem α-Diketonderivat und das anschließende Hydrolysieren des erhaltenen Produktes umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Peptid ein durch Gen-Rekombinations- Technik erzeugtes Peptid ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin das durch Gen-Rekombinations-Technik erzeugte Peptid aus der aus Wachstumshormon, Neurotrophin-3, Betacellulin, Parathyroidhormon und Interleukin-2 bestehenden Gruppe ausgewählt ist, die jeweils einen solchen, gegebenenfalls oxidierten, Methioninrest an ihrem N-Terminus aufweisen.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das α-Diketonderivat in Gegenwart eines Übergangsmetallions umgesetzt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das α-Diketonderivat in Gegenwart einer Base umgesetzt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das α-Diketonderivat in Gegenwart eines Übergangsmetallions und einer Base umgesetzt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das α-Diketonderivat Glyoxalsäure oder ein Salz davon ist.

8. Verfahren nach Anspruch 4, worin das Übergangsmetallion ein Kupferion ist.

9. Verfahren nach Anspruch 5, worin die Base ein Pyridin ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin die Hydrolyse unter Verwendung einer Base durchgeführt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin die Base ein Aminderivat ist.

12. Verfahren nach Anspruch 10, worin die Base (1) ein Diaminderivat oder (2) ein Thio- oder Selenosemicarbazid-Derivat ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, worin das Diaminderivat o-Phenylendiamin ist.

14. Verfahren zur Herstellung eines Peptids ohne Methioninrest an seinem N-Terminus, ausgewählt aus der aus menschlichem Wachstumshormon, Neurotrophin-3, menschlichem Betacellulin, Parathyroidhormon, menschlichem Interleukin-2 und Salzen davon bestehenden Gruppe, welches das Umsetzen des Peptids oder eines Salzes davon mit einem Methionin an seinem N-Terminus, produziert durch Gen-Rekombinations-Technik, mit einer Glyoxylsäure oder einem Salz davon in Gegenwart von Kupfer(II)-sulfat und Pyridin, und das anschließende Umsetzen mit einem o-Phenylendiamin umfaßt.

15. Verbindung der Formel:

CH&sub3;-S(O)m-(CH&sub2;)&sub2;-CO-CO-X

worin m eine ganze Zahl von 0-2 ist und X eine Peptidkette ist, die aus nicht weniger als 2 Aminosäureresten besteht, oder ein Salz davon.

16. Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder eines Salzes davon, welches das Hydrolysieren der Verbindung nach Anspruch 15 umfaßt.

17. Verfahren nach Anspruch 16, worin die Verbindung nach Anspruch 15 durch Umsetzen von

CH&sub3;-S(O)m-(CH&sub2;)&sub2;-CH(NH&sub2;)-CO-X

mit einem α-Diketonderivat hergestellt wird.