DE69700224T2

DE69700224T2 - Biosensor und Verfahren zur Überwachung der Wasserqualität

Info

Publication number: DE69700224T2
Application number: DE69700224T
Authority: DE
Inventors: Jean-Marie Ory
Original assignee: ARNATRONIC PLUS Sarl
Current assignee: ARNATRONIC PLUS Sarl
Priority date: 1996-06-03
Filing date: 1997-06-02
Publication date: 1999-09-23
Anticipated expiration: 2017-06-03
Also published as: FR2749389A1; ATE180330T1; EP0811842A1; DE69700224D1; EP0811842B1; FR2749389B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Biosensor zur Überwachung der Wasserqualität sowie ein Verfahren, bei dem ein derartiger Sensor eingesetzt wird, das für den Nachweis von Spuren von Verunreinigungen wie landwirtschaftlichen Pestiziden, industriellen Rückständen, Schwermetallen, Nitraten, etc., insbesondere für die kontinuierliche Überwachung des Verschmutzungsgrads von zirkulierendem bzw. fließendem Wasser, wie z. B. Wasser eines Flusses, bestimmt ist.
Es gibt bereits Verfahren und Vorrichtungen, die für die Überwachung der Wasserqualität vorgesehen sind. Es ist beispielsweise bekannt, die Qualität von städtischem Wasser zu überwachen und gegebenenfalls enthaltene Verunreinigungen nachzuweisen, indem das Verhalten von Tieren, wie z. B. Fischen oder Bakterien, beobachtet wird, die in diesem Wasser gehalten werden. Veränderungen im Verhalten sind aufschlußreich für Veränderungen des wäßrigen Mediums und insbesondere für die Gegenwart von verschmutzenden Bestandteilen im Wasser.
Andere Verfahren beruhen auf dem Nachweis der photosynthetischen Aktivität von Wasserpflanzen oder Algen oder allgemein von chlorophyllhaltigen Pflanzen. Es ist bekannt, daß die Photosynthese der physikalisch-chemische Prozeß ist, bei dem Pflanzen die Lichtenergie des Sonnenlichts für die Umwandlung von Wasser und Kohlendioxid in Kohlenwasserstoffe und Sauerstoff verwenden. Die photosynthetische Aktivität einer Pflanze oder einer chlorophyllhaltigen Substanz kann demnach durch eine Messung der pro Zeiteinheit erzeugten Sauerstoffmenge ermittelt werden, die über den Gesamtstoffwechsel der Pflanze Auskunft gibt. Es sind demnach auch bereits Verfahren und Vorrichtungen für den Nachweis von Wasserverschmutzungen bekannt, die auf diesem Prinzip beruhen und bei denen insbesondere bestimmte Arten von Algen verwendet werden, die in dem zu überwachenden Wasser gehalten werden, wobei die Messung des von diesen Algen erzeugten Sauerstoffs für ihre metabolische Aktivität charakteristisch ist, die durch in dem Wasser vorhandene Verunreinigungen beeinflußt wird.
Es ist außerdem bekannt, daß Pflanzen Fluoreszenzlicht im roten und nahen infraroten Bereich des Lichtspektrums (d. h. bei einer Wellenlänge von 650 bis 800 nm) ausstrahlen, wenn sie beleuchtet werden. Die Intensität dieser Fluoreszenz ist proportional zu der von der Pflanze aufgenommenen und infolge einer Blockierung des Elektronentransfers im Bereich der Membran der Thylakoiden nicht bei der Photosynthese für die Assimilation verbrauchten Lichtmenge. Die Fluoreszenzintensität, die üblicherweise gering ist, wenn die Pflanze gesund ist und demnach das aufgenommene Licht maximal für die Photosynthese ausnützt, kann kräftig zunehmen, wenn ein von außen einwirkender Faktor (Chemikalie, schnelle Änderung der Temperatur oder der Beleuchtung, etc.) den Stoffwechsel der Pflanze hemmt. Die Messung der Fluoreszenz, die von den Pflanzen oder Algen, die in einem wäßrigen Medium gehalten werden, abgestrahlt wird, ist demnach ebenfalls für die Qualität des Mediums, in dem die Pflanze gehalten wird, charakteristisch und ist demnach aufschlußreich für Verunreinigungen dieses Mediums.
Die bekannten Vorrichtungen, bei denen diese Vorgänge angewendet werden und entweder der Sauerstoff oder die Fluoreszenz gemessen wird, sind zur Zeit im wesentlichen Labor- oder Testapparaturen, bei denen es erforderlich ist, Proben des überwachten Wassers zu entnehmen (siehe beispielsweise in der Druckschrift DE-A-4334 327). Sie können nicht für die Durchführung kontinuierlicher Messungen verwendet werden und sind demnach für eine kontinuierliche Überwachung der Qualität von fließendem Wasser und den Nachweis von Verunreinigungen ungeeignet. Die Vorrichtung, die in der Druckschrift DE-A-26 26 915 beschrieben wird, ermöglicht keine In-situ-Überwachung von zirkulierendem oder fließendem Wasser. Es besteht insbesondere bei starken, jedoch vorübergehenden und nur kurz andauernden Verunreinigungen die Gefahr, daß sie nicht nachgewiesen werden können.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, diese Schwierigkeiten zu überwinden und eine Vorrichtung und ein Verfahren für den einfachen Nachweis von Verschmutzungen bereitzustellen, mit der/dem eine kontinuierliche Überwachung des Wassers und der Nachweis einer länger andauernden oder vorübergehenden Verschmutzung, insbesondere in fließendem Wasser, wie z. B. in Flußwasser oder Versorgungskreisen, ermöglicht wird. Die Erfindung zielt insbesondere auf die In-situ-Überwachung der Qualität von fließendem Wasser und die automatische und über einen längeren Zeitraum durchgeführte Aufzeichnung von Veränderungen des Verschmutzungsgrads des fließenden Wassers und die Anzeige von plötzlichen Veränderungen des Verschmutzungsgrads ab.
Im Hinblick auf diese Aufgabe ist ein Biosensor zur Überwachung der Qualität von fließendem Wasser und zum Nachweis einer Verschmutzung dieses Wassers Gegenstand der Erfindung, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er umfaßt:
- eine Durchflußvorrichtung, in der das Wasser zirkulieren oder fließen kann und in deren Wandung ein Fenster vorgesehen ist, in der angeordnet sind:
- eine durchsichtige Trägerwand,
- eine poröse Membran, die im wesentlichen parallel zur Trägerwand angeordnet ist, die in unmittelbarem Kontakt mit dem Innenraum der Durchflußvorrichtung steht und durch die das Wasser hindurchtreten kann,
- ein chlorophyllhaltiges Biosubstrat, das zwischen der Trägerwand und der porösen Membran angeordnet ist,
- eine Meßeinrichtung zur Messung der metabolischen Aktivität des auf der Trägerwand angeordneten Biosubstrats, und
- eine Hauptlichtquelle, die so angeordnet ist, daß das Biosubstrat durch die Trägerwand hindurch beleuchtet wird.
Der erfindungsgemäße Biosensor ist einfach konstruiert und kann leicht in situ bei der Durchführung des kontinuierlichen und in Echtzeit durchgeführten Nachweises der Verschmutzung von Wasser, das durch die Durchflußvorrichtung geleitet wird, verwendet werden. Insbesondere und beispielhaft kann im Falle der Überwachung von städtischem Wasser, das unter Druck in Versorgungsleitungen fließt, der Biosensor leicht mit Hilfe eines Absperrventil in diesen Leitungen installiert werden. Beispielsweise kann bei der Überwachung von Flußwasser die Zirkulation oder das Fließen des Wassers in dem Biosensor durch eine Peristaltikpumpe, die das Flußwasser ansaugt, und einen stromaufwärts des Biosensors gelegenen Vorbehandlungskreislauf, der insbesondere die Filterung des Wassers, einem gleichmäßigen Durchsatz, die Entgasung, die Temperatursteuerung, etc., gewährleistet, und eine Leitung zum Ablassen des Wassers nach dessen Durchtritt durch den Biosensor gewährleistet werden.
Es wird darauf hingewiesen, daß aufgrund der Verwendung einer Lichtquelle, die das Biosubstrat durch die Trägerwand beleuchtet und die demnach auf der gleichen Seite dieser Trägerwand angeordnet ist wie die Meßeinrichtung, alle Bestandteile, die eine Verbindung mit einer Stromquelle oder einer Schaltung zur Verarbeitung der Signale, die von dieser Meßeinrichtung geliefert werden, in ein und demselben Gehäuse angeordnet werden können. Dieses Gehäuse kann außerdem die Elektronik zur Verarbeitung der Meßsignale enthalten, wodurch Probleme aufgrund von Störsignalen verhindert werden können, die die Signale dann stören würden, wenn sie über ein Kabel zu einem von dem Biosensor entfernt angeordneten signalverarbeitenden elektronischen Gerät übertragen würden.
Zur Vereinfachung der Wartung und Handhabung des Biosensors und insbesondere für den einfachen Austausch des Biosubstrats weist die Durchflußvorrichtung vorzugsweise eine dem Fenster gegenüber angeordnete Öffnung auf, die durch eine dicht schließende und leicht abnehmbare Abdeckung verschlossen ist, die einen leichten Zutritt zu der porösen Membran und zu dem Biosubstrat ermöglicht.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zum Nachweis der Verschmutzung von fließendem bzw. zirkulierendem Wasser, das dadurch gekennzeichnet ist, daß in einem Fenster, das in der Wandung einer Durchflußvorrichtung, durch die das Wasser hindurchfließt, vorgesehen ist, ein chlorophyllhaltiges Biosubstrat angeordnet wird, das zwischen einer porösen Membran, die sich in unmittelbarer Verbindung mit dem Innenraum der Durchflußvorrichtung befindet, und einer durchsichtigen Trägerwand gehalten wird, daß auf der dem Innenraum der Durchflußleitung gegenüberliegenden Seite eine Meßeinrichtung zur Messung der metabolischen Aktivität des Biosubstrats angeordnet wird, daß das Biosubstrat durch die Trägerwand hindurch beleuchtet wird und daß die metabolische Aktivität des Biosubstrats kontinuierlich gemessen wird, wobei die Änderungen der von der Meßeinrichtung gelieferten Signale für den Verschmutzungszustand des Wassers charakteristisch sind.
Die Messung der metabolischen Aktivität des Biosubstrats kann entweder durch Messung der bei der Photosynthese des Biosubstrats gebildeten Sauerstoffmenge oder durch Messung der Fluoreszenz des Chlorophylls erfolgen.
Im ersten Fall besteht die Meßeinrichtung vorzugsweise aus einer Vorrichtung vom Typ der Clark-Elektrode, mit der die Menge gelösten Sauerstoffs gemessen wird, der durch die Trägerwand hindurchtritt, die demnach aus einem Material besteht, das für Sauerstoff durchlässig und für Wasser undurchlässig ist, wie z. B. einer PTFE-Folie. Die Beleuchtung erfolgt mit Unterbrechungen mit einer Periode von z. B. 1 min (20 s Beleuchtung, 40 s Dunkelheit). Unter diesen Bedingungen wird kontinuierlich die Ableitung des Signals der Sauerstoffkonzentration aufgezeichnet, das von der Meßeinrichtung geliefert wird und das die photosynthetische Aktivität des Biosubstrats wiedergibt und demnach den Nachweis von verunreinigenden Stoffen im Wasser ermöglicht.
Im zweiten Fall besteht die Meßeinrichtung aus einem Lichtdetektor, z. B. einer Photodiode, der im roten oder nahen infraroten Spektralbereich des Lichts (vorzugsweise bei einer Wellenlänge über 650 nm) die Fluoreszenz mißt, die von dem Biosubstrat als Antwort auf die modulierte Beleuchtung mit Licht mit einer Wellenlänge von beispielsweise 470 nm ausgesendet wird, das von einer zusätzlichen Lichtquelle erzeugt wird. Die Modulation des beleuchtenden Lichts führt zu einer modulierten Fluoreszenz des chlorophyllhaltigen Substrats, die durch die Photodiode gemessen wird. Durch die synchrone Demodulierung des verstärkten Signals der Photodiode kann das kräftige Rauschen des Signals, das durch die Photodiode erzeugt wird, entfernt werden, so daß nur die Bestandteile des Signals, die wie das Licht der zusätzlichen Lichtquelle moduliert sind, zurückbehalten werden. Die Hauptbeleuchtung kann so gesteuert werden, daß die natürlichen Tag- Nacht-Beleuchtungsbedingungen simuliert werden, was es ermöglicht, die chlorophyllhaltige Substanz gemäß den beiden metabolischen Zuständen des Calvin-Zyklus reagieren zu lassen. Die Hauptlichtquelle kann ferner im gepulsten Modus verwendet werden, um vorübergehende Zustände zu erzeugen, die unter der Bezeichnung Kautski-Kurve bekannt sind (hierbei handelt es sich um die Fluoreszenz-Antwort einer Pflanze auf plötzliche Veränderungen der Beleuchtung), woraus dann die charakteristischen Parameter der erhaltenen Kurve ermittelt werden, um daraus den metabolischen Zustand des Biosubstrats herzuleiten.
Weitere Merkmale und Vorteile ergeben sich aus der Beschreibung, in der beispielhaft zwei erfindungsgemäße Ausführungsformen dargestellt werden, wobei die erste Ausführungsform auf der Messung der Fluoreszenz des Chlorophylls und die zweite Ausführungsform auf der Messung der durch die Photosynthese gebildeten Sauerstoffmenge basiert.
Es wird auf die beigefügten Figuren Bezug genommen, von denen:
- Fig. 1 eine Schnittansicht eines Biosensors gemäß der ersten Ausführungsform darstellt;
- Fig. 2 einen Biosensor darstellt, der für die zweite Ausführungsform bestimmt ist.
Der in Fig. 1 dargestellte Biosensor umfaßt ein Gehäuse 1, das eine Durchflußvorrichtung darstellt, in der das zu analysierende Wasser entsprechend den Pfeilen F fließt, und ein Fluorimeter 2, das an dem Gehäuse 1 des Biosensors mit Hilfe von Klemmschrauben befestigt ist, die nur durch ihre Achsen 29 wiedergegeben sind (es reichen z. B. drei Schrauben, die radial um 120º versetzt angeordnet sind, um das Fluorimeter an dem Gehäuse 1 zu arretieren, wobei die beiden Bauteile dennoch sehr leicht voneinander getrennt werden können). Das Gehäuse 1 wird vorzugsweise aus einem undurchsichtigen, vorzugsweise schwarzen synthetischen Material hergestellt, z. B. aus PVC oder Delrin. Das Gehäuse 1 umfaßt eine Innenkammer 3, die z. B. einen polygonalen Querschnitt hat, in die eine Wasserzuleitung 4 und eine Wasserableitung 5 münden.
Das Gehäuse 1 besteht vorzugsweise aus einem Grundkörper 6, in dessen Wandung ein Fenster 7 ausgebildet ist, das in die Kammer 3 mündet, und einer abnehmbaren Abdeckung 8, in die die Zuleitung 4 und die Ableitung 5 eingelassen sind. Die Abdeckung 8 wird auf dem Grundkörper 6 durch ein an sich bekanntes, schnell entfernbares Befestigungssystem, z. B. durch eine Abdeckung in Form eines Schraubdeckelglases (Einmachglas), befestigt. Die Dichtigkeit zwischen dem Grundkörper und der Abdeckung wird beispielsweise durch einen Runddichtring 9 gewährleistet.
In dem Fenster 7 ist ein mikroporöses Filter 10 angeordnet, das wasserdurchlässig ist, z. B. ein Filter aus Cellulosenitrat, auf dem als Dünnschicht auf der der Kammer 3 gegenüberliegenden Seite ein chlorophyllhaltiges Biosubstrat 11 angeordnet ist, das im übrigen mit einer Trägerwand in Kontakt steht, die aus einer chemisch inerten, durchsichtigen Folie 12 oder einem Glasplättchen besteht, die/das dicht schließend zwischen dem Gehäuse 1 und dem Fluorimeter 2, z. B. durch Aufkleben auf das Gehäuse 1, gehalten wird.
Eine aus einem steifen Gitter gebildete Scheibe 13 aus einem Inertmaterial ist mit Hilfe eines elastischen Rings 14 fest in das Fenster 7 eingesetzt, wodurch ein Druck auf das mikroporöse Filter 10 ausgeübt wird, durch den das Biosubstrat zwischen dem Filter und dem durchsichtigen Film 12 unbeweglich festgehalten wird.
Das Biosubstrat besteht vorzugsweise aus einer Schicht mikroskopischer Algen, es kann aber auch aus Diatomeen, Cyanobakterien, Flechten, Thylakoiden, die aus einer beliebigen Pflanze gewonnen werden, oder jeder sonstigen Form eines chlorophyllhaltigen Systems einschließlich höherer Pflanzen oder Teilen höherer Pflanzen bestehen. Ein Gel, wie z. B. Alginat in Form einer Dünnschicht oder in Form von Mikrokügelchen, kann ebenfalls für die Fixierung des Biosubstrats verwendet werden.
Die Kammer 3 dient dazu, kräftige Turbulenzen des Wassers zu erzeugen, wodurch eine gute Diffusion der im Wasser enthaltenen Verunreinigungen durch das Filter 10 und somit aufgrund einer schnellen Erneuerung des Wassers, das sich im Kontakt mit dem Biosubstrat befindet, ein effizienter Nachweis gewährleistet wird. Die abnehmbare Abdeckung 8 ermöglicht den regelmäßigen, leichten und schnellen Austausch des Biosubstrats bei der Durchführung von Wartungsarbeiten.
Das Fluorimeter besteht aus einem Gehäuse 21, z. B. einem metallischen, aus Aluminium oder Duraluminium bestehenden Gehäuse, das eine zentrale Öffnung 22 aufweist, die zu der dem Biosubstrat 11 gegenüberliegenden Folie 12 hin angeordnet ist. Es umfaßt eine Hauptlichtquelle, die z. B. aus mehreren leuchtstarken Leuchtdioden 23 gebildet ist, die auf der Seite der Öffnung 22 in das Gehäuse eingesteckt sind (z. B. vier Dioden, die um die Öffnung 22 verteilt sind) und die so angeordnet sind, daß der abgegebene Lichtstrahl auf das Biosubstrat 11 gelenkt wird. Bei diesen Dioden 23 handelt es sich vorzugsweise um gelborangefarbe Dioden, die Licht mit einer Wellenlänge von etwa 590 nm liefern, und mit denen es möglich ist, je nachdem, ob sie aus- oder eingeschaltet sind, die Beleuchtungsbedingungen des Tages oder der Nacht zu simulieren, wodurch das Biosubstrat unter Bedingungen gehalten werden kann, die den beiden metabolischen Zuständen des Calvin-Zyklus entsprechen. Die von diesen Dioden gelieferte Lichtintensität kann z. B. 6 Candela oder mehr betragen.
Eine oder mehrere weitere Dioden, die speziell dafür vorgesehen sind, die Fluoreszenz des Biosubstrats hervorzurufen, z. B. blaue Dioden 24 geringer Intensität, die Licht mit einer Wellenlänge von 470 nm aussenden, sind ebenfalls und in ähnlicher Weise wie die Dioden 23 in dem Gehäuse angeordnet (z. B. vier blaue Dioden, die zwischen den orangefarbenen Dioden 23 verteilt sind).
Eine Photodiode 25 für den Nachweis der Fluoreszenz des Biosubstrats, vor der ein optisches Filter 26 angeordnet ist, das Licht mit einer Wellenlänge unter etwa 650 nm nicht durchläßt, ist axial in der Öffnung 22 angeordnet und mit einer elektronischen Schaltung für die Vorverstärkung 27 verbunden, die ebenfalls in das Metallgehäuse 21 eingebaut ist, wodurch eine hohe Unempfindlichkeit dieser Schaltung gegen Störsignale gewährleistet wird. Eine weitere elektronische Schaltung, die ebenfalls in dem Gehäuse 32 angeordnet sein kann, dient der Stromversorgung der Leuchtdioden und steuert insbesondere die Hell- und Dunkelphasen bei der Beleuchtung mit den gelb-orangen Dioden sowie die Modulation der blauen Dioden, was, wie im folgenden gezeigt wird, für die Verbesserung der Verarbeitung des von der Photodiode 25 gelieferten Signals nützlich ist. Da das Fluoreszenzsignal, das von der Photodiode 25 geliefert wird, sehr schwach ist, ist die Schaltung für die Versorgung der Dioden 23 und 24 vorzugsweise vollständig von der Schaltung der Photodiode 25 getrennt und gekapselt, um Störungen letzterer Schaltung zu vermeiden.
Die Vorverstärkungsschaltung ist im übrigen mit einer nicht abgebildeten elektronischen Verarbeitungsvorrichtung verbunden, die z. B. aus einem Signalprozessor DSP56001 besteht, der mit Analog-Digital-Wandlern und über eine Verbindungsleitung mit einem Rechner verbunden ist, was es ermöglicht, das Fluoreszenzsignal durch synchrone Demodulation des verstärkten Signals der Photodiode zu erhalten.
Anstelle der Leuchtdioden 23, 24 unterschiedlicher Farben können auch Diodenlaser oder als Hauptlichtquelle eine Halogenlichtquelle verwendet werden. Ebenso könnte die Photodiode 25 in einer kostspieligeren Ausführungsform vorteilhaft durch einen im roten Bereich empfindlichen Photomultiplier ersetzt sein. Die Anordnung der Leuchtdioden könnte ebenfalls modifiziert sein, z. B. so, daß die Strahlung so gut wie möglich im rechten Winkel auf die Trägerwand 12 gelenkt wird, um so störende Reflexionen zu vermeiden und so gut wie möglich das durch Reflexion verlorene Licht zu verringern. Es könnte ebenso eine Photozelle mit kleineren Abmessungen verwendet werden, weiterhin könnte die Photozelle von der Trägerwand entfernt werden und das Fluoreszenzlicht mit Hilfe eines Lichtleiters oder eines optischen Faserbündels zu der Photozelle geleitet werden.
Beim Einsatz des Biosensors wird das zu analysierende Wasser in die Kammer 3 geleitet, entweder durch direkte Verbindung der Zuleitung 4 mit einer unter Druck stehenden Leitung, z. B. bei der Analyse von städtischem Wasser, oder mit Hilfe einer Pumpe und einem Filtrationskreislauf bei fließendem Wasser, z. B. bei der Analyse von Flußwasser. Mittel für die Steuerung der Temperatur sind vorteilhaft stromaufwärts der Kammer 3 angeordnet. Hierfür können insbesondere Peltier-Elemente verwendet werden, die beispielsweise in die Zuleitung des Biosensors eingebaut sind. Es wird ebenfalls darauf geachtet, daß die durch den Biosensor hin durchtretende Wassermenge so groß ist, daß die schnelle Erneuerung des Wassers, das das Biosubstrat umfließt, und eine ausreichende Umwälzung gewährleistet sind, damit eine gute Diffusion der Spuren von Verunreinigungen durch das poröse Filter sichergestellt ist. Im übrigen wird darauf hingewiesen, daß der in der Figur dargestellte Aufbau des Biosensors, d. h. mit dem Fenster 7, das zum Boden der Kammer 3 hin vorgesehen ist, es ermöglicht, daß keine Luftblasen mit dem Biosubstrat in Kontakt kommen (dies ist insbesondere bei der zweiten Variante wichtig, die auf der Messung des gelösten Sauerstoffs basiert, die im folgenden beschrieben wird).
Die Beleuchtung des Biosubstrats erfolgt mit gelb-orangen Dioden 23, deren Licht die Photosynthese hervorruft. Es wird hierzu darauf hingewiesen, daß es aufgrund der Lichtundurchlässigkeit des Materials des Gehäuses des Biosensors möglich ist, den störenden Einfluß einer zufälligen von außen stammenden Beleuchtung vollständig zu vermeiden. Die Dioden können ferner im gepulsten Modus mit einer Periode von etwa 15 s verwendet werden, um die bereits erwähnten Kautski-Kurven zu erzeugen. Diese Kurven sind durch eine plötzliche Zunahme der Fluoreszenz einer Pflanze charakterisiert, wie z. B. von Algen der Sorte/Gattung Senedesmus, als Antwort auf den Übergang von einem ausreichend lang beibehaltenen Dunkelzustand zu einer ausreichend intensiven Bestrahlung. In Gegenwart von reinem Wasser nimmt diese Fluoreszenz schnell innerhalb einiger Sekunden ab; im Gegensatz dazu bleibt diese Fluoreszenz in Gegenwart eines verunreinigenden Stoffs wie Atrazin dauerhaft auf einem hohen Niveau. Die gepulste Beleuchtung ermöglicht es demnach, Verunreinigungen in Abhängigkeit von ihrer Wirkung auf das Biosubstrat durch eine Analyse der charakteristischen Merkmale der Kautski-Kurven, die durch die Verarbeitung der von der Photodiode stammenden Signale erzeugt werden, nachzuweisen und zu charakterisieren.
Die eigentliche Messung der Fluoreszenz erfolgt mit Hilfe der Photodiode, die die von dem Biosubstrat stammende Fluoreszenz strahlung aufnimmt. Die Modulation der von den blauen Dioden 24 gelieferte Strahlung (Modulation mit einer Frequenz in der Größenordnung von kHz) ermöglicht eine deutliche Verbesserung des Nachweises, denn das Fluoreszenzsignal ist sehr schwach und verschwindet im Rauschen aller Signale, die von der Photodiode geliefert werden. Indem aus dem vorverstärkten Signal der Photodiode durch synchrone Demodulierung die Signale herausgefiltert werden, die der Modulationsfrequenz der blauen Dioden entsprechen, erhält man ausschließlich die Signale, die mit gleicher Frequenz wie die Lichtquelle moduliert sind. Im übrigen nimmt die Photodiode, da das optische Filter 26 für die Strahlung der Leuchtdioden praktisch vollständig undurchlässig ist, nur die Bestandteile der Strahlung auf, die der modulierten Fluoreszenz entsprechen, deren Wellenlänge größer als 650 nm ist, unter Ausschluß der von den Lichtquellen stammenden störenden Strahlung. Es wird zu diesem Thema darauf hingewiesen, daß die Verwendung einer Strahlung mit einer Wellenlänge von etwa 470 nm besonders interessant ist, da bei dieser Wellenlänge die Fluoreszenzausbeute des Biosubstrats maximal ist. Es wird ferner darauf hingewiesen, daß die wesentliche Aufgabe des optischen Filters 26 darin besteht, zu verhindern, daß die modulierte Strahlung der blauen Dioden 24 auf die Photodiode trifft, so daß das nach der synchronen Demodulierung erhaltene Signal ausschließlich der Fluoreszenz des Chlorophylls entspricht. Das Filter dient außerdem dazu, zu verhindern, daß zu viel von der Hauptbeleuchtungsquelle stammendes Licht auf die Photodiode trifft, in dem das schwache Fluoreszenzsignal verschwinden könnte. Für die weitere Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit könnte außerdem das von den Leuchtdioden stammende Licht mit einem Filter, das Licht mit einer Wellenlänge oberhalb von 650 nm nicht durchläßt, gefiltert werden, oder man könnte Lichtquellen verwenden, die polarisiertes Licht aussenden, um die Reflexion von Licht, das nicht zum Fluoreszenzlicht gehört, zu verhindern.
Nach der synchronen Demodulierung kann das erhaltene Signal, das kontinuierlich für die Fluoreszenz des Chlorophylls des Bio substrats charakteristisch ist, zahlreichen weiteren nachfolgenden Verarbeitungsschritten, die bis zur Anzeige eines Datendiagramms führen, unterzogen werden, in dem die kleinen Änderungen der Fluoreszenz und die hierzu gehörenden Meßwerte deutlich erkennbar sind.
Mit dem zuvor beschriebenen Verfahren und dem zuvor beschriebenen Biosensor ist es z. B. möglich, zuverlässig Spuren von Atrazin oder Diuron, die in dem Wasser in einer Konzentration unter 1 um/l enthalten sind, nachzuweisen.
Die Zeichnung der Fig. 2 stellt eine zweite Ausführungsform des Biosensors dar, die auf der Messung des durch die Photosynthese des Biosubstrats erzeugten Sauerstoffs basiert. Der Biosensor umfaßt ein Gehäuse 30, das an einer Durchflußvorrichtung 31 befestigt ist. Das Gehäuse 30 enthält einen Meßfühler 32 für die Messung von gelöstem Sauerstoff, der in ähnlicher Weise aus einer modifizierten Clark-Elektrode besteht. Dieser Meßfühler umfaßt eine undurchsichtige Hülle 33 mit insgesamt zylindrischer Form, z. B. aus PVC oder Delrin, in derem Inneren koaxial ein ebenfalls zylindrischer Elektrodenhalter 34, z. B. aus durchsichtigem PVC, angeordnet ist, in den eine oder mehrere Leuchtdioden 40 eingesetzt sind. Eine ringförmige Kammer 35, die zwischen dem Elektrodenhalter und der Hülle vorhanden ist, ist mit einem Elektrolyt wie KCl gefüllt. Die Hülle 33 ist an ihrem Ende durch eine lichtdurchlässige und ausschließlich für Sauerstoff durchlässige Wand geschlossen, wie z. B. eine Membran aus PTFE 36. Der Elektrodenhalter 34 erstreckt sich bis in die Nähe dieser Membran und trägt auf seiner Stirnwand eine Kathode 37, z. B. eine Goldkathode, die aus einem Gitter oder einer Spirale oder auch einem sehr dünnen Goldplättchen gebildet ist, damit die Kathode lichtdurchlässig ist. Eine Silberanode 38 ist auf der Seitenwand des Elektrodenhalters angeordnet.
Eine poröse Membran 39, auf die ein chlorophyllhaltiges Biosubstrat 41 in Form einer dünnen Schicht aufgebracht ist, ist so auf der Hülle 33 befestigt, daß das Biosubstrat 41 dicht an die PTFE-Folie 36 angedrückt wird. Die Abmessungen des Meßfühlers sind so festgelegt, daß die poröse Membran 39 im wesentlichen bündig mit der inneren Oberfläche der Wandung der Durchflußvorrichtung in einem Fenster 42, das hierfür in dieser Wandung ausgespart ist, abschließt.
Bei der Verwendung dieses Biosensors umspült das in der Durchflußvorrichtung 31 zirkulierende Wasser das Biosubstrat 41, und tritt dabei durch die poröse Membran 39 hindurch. Die photosynthetische Aktivität des Biosubstrats, die durch die von den Dioden 40 stammende Beleuchtung ausgelöst wird, führt zur Bildung von Sauerstoff, der durch die PTFE-Folie 36 hindurchtritt und dann in dem Elektrolyt 35 enthalten ist. Die Konzentration des so erzeugten Sauerstoffs wird durch die Messung der Stärke des Stroms ermittelt, der zwischen der Anode 38 und der Kathode 37 fließt, zwischen denen eine Polarisationsspannung von etwa 0,7 V angelegt ist. Die dem zeitabhängigen Signal entsprechende Kurve stellt demnach in etwa das Integral der erzeugten Sauerstoffmenge dar. Um die zeitlichen Änderungen der Menge des durch die Photosynthese erzeugten Sauerstoffs ermitteln zu können, wird die Diode zyklisch versorgt, so daß das erhaltene Signal, obwohl zunehmend, die Beleuchtungszyklen wiedergibt. Durch Ableitung erhält man dann ein Signal, das für die pro Zeiteinheit erzeugte Sauerstoffmenge und demnach für die photosynthetische Aktivität des Biosubstrats charakteristisch ist. Zur Begrenzung des Einflusses von Temperaturschwankungen wird einerseits die Temperatur des Wassers so gut wie möglich stromabwärts des Biosensors kontrolliert, wie dies bei der ersten Ausführungsform angegeben wurde, und andererseits kann in den Meßfühler ein Temperaturfühler, z. B. in den Elektrodenhalter eingebaut sein, und der gemessene Wert kann bei der Verarbeitung des für die erzeugte Sauerstoffmenge charakteristischen Signals berücksichtigt werden.
Mit dieser Vorrichtung war es möglich, Spuren verschiedener Verunreinigungen, wie z. B. Atrazin in einer Konzentration von 0,4 mg/l, Dichromationen bei 1 ppm, Cyanid bei 1 ppm, Chlor bei 3,6 mg/l, oder auch Phosphate oder Nitrate effizient nachzuweisen, wobei die Effizienz des Nachweises jedoch von der Art des verwendeten Biosubstrats abhängt. Die gegenwärtig erreichbare Empfindlichkeitsschwelle beträgt etwa 50 ug/l.
Unabhängig von den angewandten Meßverfahren ist es besonders wichtig, daß das Wasser gut durchwirbelt wird, um eine homogene Temperatur und die Diffusion der verunreinigenden Stoffe in das Biosubstrat zu gewährleisten. Hierfür wird vorteilhaft eine Pumpe verwendet, z. B. eine Turbopumpe, mit der außerdem die Geschwindigkeit des Wassers in der Kammer 3 erhöht werden kann, wodurch das Wasser in einem schleifenförmigen Kreislauf umgewälzt werden kann, in dem es durch ein Puffervorratsbehälter und einem der Temperaturregulierung dienenden Block hindurchtritt.
Bei einer Laboranwendung kann der Kreislauf geschlossen sein und ein bekanntes Volumen, z. B. einen Liter, aufweisen, bei der der verunreinigende Stoff in einer vorbestimmten Menge in diesen Kreislauf eingebracht wird.
Bei einer Anwendung mit kontinuierlicher Überwachung besteht eine Schwierigkeit darin, die Temperatur des Wassers konstant zu halten, ohne große Energiemengen zu verbrauchen. Hierfür können mehrere Verfahren angewandt werden:
- Allmähliches Vermischen unter Verwendung einer Peristaltikpumpe, um kontinuierlich eine kleine Menge in den schleifenförmigen Kreislauf einzubringen, beispielsweise einige Kubikzentimeter zu testendes Wasser pro Minute, während die gleiche Menge Wasser entfernt wird;
- oder die Entnahme von Proben, indem langsam ein dem Volumen des geschlossenen Kreislaufs entsprechendes Volumen des zu testenden Wassers entnommen wird und dieses Wasser, während die Messung der vorhergehenden Probe erfolgt, vorgewärmt wird; anschließend ersetzt ein Elektroventilmechanismus dieses vorge wärmte Wasser in dem Hauptkreislauf, während die vorherige Probe schnell entfernt wird. Idealerweise dauert die Probennahme genauso lang wie die Messung; auf diese Weise gehen keine Informationen verloren. Ein Wärmetauscher kann zur Aufheizung oder zur Abkühlung des entnommenen Wassers mit dem entfernten Wasser dienen.
Bei einer Arbeitsweise unter Probenentnahme können mehrere Wasserkreisläufe oder mehrere vollständige Biosensoren, die zeitversetzten Augenblicken entsprechen, gleichzeitig verwendet werden mit dem Ziel, die Antwortzeiten zu verringern.
Wenn eine genaue Messung kleiner Unterschiede gewünscht wird, ist die Messung unter Durchführung von Vergleichsmessungen bevorzugt. Dies macht ein oder mehrere Wasser-Referenzproben erforderlich, die zu vorgegebenen Zeitpunkten in den Biosensor eingespritzt werden, um den Biosensor zu kalibrieren oder seinen Nullpunkt neu festzulegen. Dieses Verfahren macht wie bei den Verfahren unter Probenentnahme eine Vorerwärmung erforderlich.
Um den Einfluß von unkontrolliert vorhandenen Gasen, die in dem Wasser gelöst sind, zu verhindern, wird vorzugsweise stromaufwärts der Vorrichtung eine kräftige Durchwirbelung oder Durchströmung mit Luft bei einer kontrollierten Wassertemperatur durchgeführt, wodurch die Menge der gelösten Gase vereinheitlicht wird.

Claims

1. Biosensor zur Überwachung der Qualität von fließendem Wasser und zum Nachweis einer Verschmutzung dieses Wassers, dadurch gekennzeichnet, daß er umfaßt:

- eine Durchflußvorrichtung (1, 31), durch die das Wasser fließen kann und in deren Wandung ein Fenster (7, 42) vorgesehen ist, in der angeordnet sind:

- eine durchsichtige Trägerwand (12, 36),

- eine poröse Membran (10, 39), die im wesentlichen parallel zur Trägerwand angeordnet ist, die in unmittelbarem Kontakt mit dem Innenraum der Durchflußvorrichtung steht und durch die das Wasser hindurchtreten kann,

- ein chlorophyllhaltiges Biosubstrat (11, 41), das zwischen der Trägerwand und der porösen Membran angeordnet ist,

- eine Meßeinrichtung (2; 32) zur Messung der metabolischen Aktivität des auf der Trägerwand angeordneten Biosubstrats, und

- eine Hauptlichtquelle (23, 40), die so angeordnet ist, daß das Biosubstrat durch die Trägerwand hindurch beleuchtet wird.

2. Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Durchflußvorrichtung (1) dem Fenster (7) gegenüber eine Öffnung aufweist, die durch eine dicht schließende und leicht abnehmbare Abdeckung verschlossen ist.

3. Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Fenster in der Wandung einer Kammer (3) ausgebildet ist, in die eine Wasserzuleitung (4) und eine Wasserableitung (5) münden.

4. Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßeinrichtung eine Einrichtung zur Messung der Fluoreszenz des Chlorophylls des Biosubstrats ist.

5. Biosensor nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßeinrichtung umfaßt:

ein Gehäuse (21), das mit einer Öffnung (22) versehen ist, die dem Fenster (7) gegenüber angeordnet ist,

einen Lichtdetektor (25), der in dieser Öffnung angeordnet ist und mit einem optischen Filter (26) versehen ist, zur Messung der Fluoreszenz des Biosubstrats,

eine zusätzliche Lichtquelle (24) zur Erzeugung einer modulierten Beleuchtung des Biosubstrats und

eine Verarbeitungseinrichtung zur Durchführung einer synchronen Demodulation des von dem Detektor gelieferten Signals.

6. Biosensor nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Hauptlichtquelle aus Leuchtdioden (23) besteht, die in dem Gehäuse (21) angeordnet sind und Licht mit einer Wellenlänge von etwa 550 nm aussenden, daß die zusätzliche Lichtquelle aus Dioden gebildet ist, die Licht mit einer Wellenlänge von etwa 470 nm aussenden, wobei die Dioden so angeordnet sind, daß die Strahlung auf das Biosubstrat (11) gerichtet ist, und daß das optische Filter (26) ein Filter ist, das für Licht mit einer Wellenlänge oberhalb etwa 650 nm durchlässig ist.

7. Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerwand (36) aus einem Material besteht, das durchlässig für Sauerstoff, aber undurchlässig für Wasser ist, und daß die Meßeinrichtung eine Einrichtung (32) zur Messung der vom Biosubstrat durch Photosynthese gebildeten und durch die Trägerwand hindurchtretenden Sauerstoffmenge ist, wobei die Meßeinrichtung (32) eine Hülle (33) umfaßt, die einen Elektrodenhalter (34) umgibt und von dem Elektrodenhalter durch einen ringförmigen Zwischenraum beabstandet ist, der mit einem Elektrolyt gefüllt ist, wobei der Elektrodenträger seitlich angeordnet eine Anode (38) und auf der Stirnfläche, die in Nähe der Trägerwand (36) gelegen ist, eine für Lichtstrah lung durchlässige Kathode (37) aufweist, wobei die Lichtquelle (40) in dem Elektrodenträger angeordnet ist.

8. Verfahren zum Nachweis der Verschmutzung von fließendem Wasser, dadurch gekennzeichnet, daß in einem Fenster (7, 42), das in der Wandung einer Durchflußvorrichtung (1, 31), durch die das Wasser hindurchfließt, vorgesehen ist, ein chlorophyllhaltiges Biosubstrat (11, 41) angeordnet wird, das zwischen einer porösen Membran (10, 39), die sich in unmittelbarer Verbindung mit dem Innenraum der Durchflußvorrichtung befindet, und einer durchsichtigen Trägerwand (12, 36) gehalten wird, daß auf der dem Innenraum der Durchflußleitung gegenüberliegenden Seite eine Meßeinrichtung (2, 32) zur Messung der metabolischen Aktivität des Biosubstrats angeordnet wird, daß das Biosubstrat durch die Trägerwand hindurch beleuchtet wird und daß die metabolische Aktivität des Biosubstrats kontinuierlich gemessen wird, wobei die Änderungen der von der Meßeinrichtung gelieferten Signale für den Verschmutzungszustand des Wassers charakteristisch sind.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Biosubstrat einerseits mit einer Strahlung mit einer Wellenlänge von etwa 550 nm unter Bedingungen, die eine natürliche Beleuchtung nachbilden, und andererseits mit einer zeitabhängig modulierten Strahlung mit einer Wellenlänge von etwa 470 nm beleuchtet wird, um eine modulierte Fluoreszenz des Biosubstrats zu erzeugen, daß diese Fluoreszenz mit einem Lichtdetektor (25) nachgewiesen wird, der mit einem Filter ausgestattet ist, das für Licht mit einer Wellenlänge unter etwa 650 nm nicht durchlässig ist, und daß eine synchrone Demodulation des von dem Detektor (25) gelieferten Signals durchgeführt wird, um das Ausmaß der Fluoreszenz des Biosubstrats zu bestimmen, das für die metabolische Aktivität des Biosubstrats charakteristisch ist.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerwand aus einem Material erzeugt wird, das für Sauerstoff durchlässig und für Wasser undurchlässig ist, und daß die zeitliche Änderung der durch die Photosynthese des Biosubstrats gebildeten und durch die Trägerwand hindurchtretenden Sauerstoffmenge gemessen wird.