[go: up one dir, main page]

DE69636870T2 - KVLQT1 - EIN GEN DES LONG-QT-SYNDROMS, WELCHES FÜR KVLQT1 KODIERT UND WELCHES SICH MIT Mink ZUSAMMENSETZT, UM Iks-KALIUMKANÄLE DES HERZENS ZU BILDEN - Google Patents

KVLQT1 - EIN GEN DES LONG-QT-SYNDROMS, WELCHES FÜR KVLQT1 KODIERT UND WELCHES SICH MIT Mink ZUSAMMENSETZT, UM Iks-KALIUMKANÄLE DES HERZENS ZU BILDEN Download PDF

Info

Publication number
DE69636870T2
DE69636870T2 DE69636870T DE69636870T DE69636870T2 DE 69636870 T2 DE69636870 T2 DE 69636870T2 DE 69636870 T DE69636870 T DE 69636870T DE 69636870 T DE69636870 T DE 69636870T DE 69636870 T2 DE69636870 T2 DE 69636870T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
kvlqt1
human
mink
gene
current
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69636870T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69636870D1 (de
Inventor
T. Mark Salt Lake City KEATING
C. Michael Park City SANGUINETTI
E. Mark Hopkinton CURRAN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Utah Research Foundation Inc
Original Assignee
University of Utah Research Foundation Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26691739&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE69636870(T2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by University of Utah Research Foundation Inc filed Critical University of Utah Research Foundation Inc
Publication of DE69636870D1 publication Critical patent/DE69636870D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE69636870T2 publication Critical patent/DE69636870T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Description

  • Diese Anmeldung wurde mit Unterstützung der Regierung unter den Erteilungsnummern R01 HL48074 erstellt, und finanziert von den National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, und unter Erteilungsnummer M01 RR00064 vom Public Health Service der USA.
  • Allgemeiner Stand der Technik
  • Die vorliegende Erfindung betrifft inter alia den Bereich der Gene und Genprodukte, die mit dem Long-QT-Syndrom (LQT) assoziiert sind, und Verfahren zur Diagnose und Vorbeugung von LQT. LQT wird durch Analyse der DNS-Sequenz des KVLQT1-Gens eines zu testenden Individuums und Vergleichen der entsprechenden DNS-Sequenz mit der bekannten DNS-Sequenz eines normalen KVLQT1-Gens diagnostiziert. Alternativ kann das KVLQT1-Gen eines zu testenden Individuums auf Mutationen gescreent werden, die LQT verursachen. Die Vorhersage von LQT wird praktische Ärzte in die Lage versetzen, dieser Störung unter Verwendung existierender Heilverfahren vorzubeugen. Diese Erfindung richtet sich ferner auf die Entdeckung, dass die KVLQT1- und minK-Proteine coassemblieren, um einen kardialen IKs-Kaliumkanal zu bilden. Dieses Wissen kann verwendet werden, um diese beiden Proteine in einer Zelle zu coexprimieren und eine solche transformierte Zelle kann zum Auffinden von Wirkstoffen verwendet werden, die für die Behandlung oder Vorbeugung von LQT verwendbar sein werden.
  • Die Veröffentlichungen und andere Materialien, die hier verwendet werden, um den allgemeinen Stand der Technik zu erläutern, oder zusätzliche Details hinsichtlich der Praxis bereitzustellen, werden als Bezugsdokumente beigefügt, und sind in der beigefügten Liste der Verweise jeweils in übersichtlichen Gruppen zusammengefasst.
  • Kardiale Arrhythmien sind eine verbreitete Ursache für Morbidität und Mortalität, die für ungefähr 11 % aller natürlichen Todesfälle verantwortlich sind (Kannel, 1987; Willich et al., 1987). Im Allgemeinen ist die präsymptomatische Diagnose und Behandlung von Individuen mit lebensbedrohlichen ventrikulären Tachyarrhythmien schlecht, und in einigen Fällen erhöht medizinisches Management sogar das Arrhythmie- und Todesrisiko (New Engl. J. Med. 327, 227 (1992)). Diese Faktoren machen ein frühes Erkennen von Individuen mit Anfälligkeit für kardiale Arrhythmien und die Arrhythmievorbeugung zu einer hohen Priorität.
  • Sowohl genetische als auch erworbene Faktoren tragen zum Risiko der Entwicklung kardialer Arrhythmien bei. Das Long-QT-Syndrom (LQT) ist eine erbliche kardiale Arrhythmie, die abrupten Bewusstseinsverlust, Synkope, Anfälle und plötzlichen Tod aufgrund ventrikulärer Tachyarrhythmien, spezifisch Torsade-de pointes und ventrikulärer Fibrillation verursacht (Ward, 1964; Romano, 1965; Schwartz et al., 1975; Moss et al., 1991). Diese Störung tritt üblicherweise bei jungen, ansonsten gesunden Individuen auf (Ward, 1964; Romano, 1965; Schwartz, 1975). Die meisten Träger des LQT-Gens zeigen eine Verlängerung des QT-Intervalls auf Elektrokardiogrammen, ein Zeichen für eine abnorme kardiale Repolarisation (Vincent et al., 1992). Die klinischen Merkmale von LQT resultieren aus episodischen kardialen Arrhythmien, spezifisch repolarisationsbezogenen ventrikulären Tachyarrhythmien, wie Torsade-de-pointes, so bezeichnet aufgrund der charakteristischen wellenförmigen Form des Elektrokardiogramms bei dieser Arrhythmie, und ventrikulärer Fibrillation (Schwartz et al., 1975; Moss und McDonald, 1970). Torsade-de-pointes kann zu einer ventrikulären Fibrillation degenerieren, einer besonders tödlichen Arrhythmie. Auch wenn LQT keine sehr verbreitete Diagnose ist, sind ventrikuläre Arrhythmien sehr verbreitet; über 300.000 Bürger der Vereinigten Staaten erleiden jedes Jahr einen plötzlich Tod (Kannel, et al., 1987; Willich et al., 1987) und in vielen Fällen kann der zugrunde liegende Mechanismus aberrierende, kardiale Repolarisation sein. LQT stellt daher eine einmalige Möglichkeit bereit, die lebensbedrohlichen kardialen Arrhythmien auf molekularer Ebene zu untersuchen.
  • Es wurden sowohl erbliche als auch erworbene Formen von LQT definiert. Erworbene LQT und sekundäre Arrhythmien können aus kardialer Ischämie, Bradykardie und Stoffwechselanomalien, wie etwa niedriger Kalium- oder Kalziumkonzentration im Serum resultieren (Zipes, 1987). LQT kann auch aus der Behandlung mit bestimmten Medikamenten, einschließlich Antibiotika, Antihistaminen, Allgemeinanästhetika und, am häufigsten, antiarrhythmischen Medikamenten resultieren (Zipes, 1987). Erbliche Formen von LQT können aus Mutationen in mindestens drei verschiedenen Genen resultieren. In vorherigen Untersuchungen wurden LQT-Loci auf Chromosom 11p15.5 (LQT1) (Keating et al., 1991a; Keating et al., 1991b), 7g35-36 (LQT2) und 3p21-24 (LQT3) (Jiang et al., 1994) kartiert. Unter diesen ist LQT1 die häufigste Ursache des erblichen LQTs (Li et al. (1996), Pediatrics, Band 98, Nr.3, S. 534–535). Unsere Daten zeigen auf, dass Mutationen in diesem Gen für über 50 % des erblichen LQTs verantwortlich sind (Q. Wang, unveröffentlichte Ergebnisse). Unlängst wurde ein vierter LQT-Locus (LQT4) auf 4g25-27 kartiert (Schott et al., 1995). Die vorliegende Arbeit zeigt auf, dass minK, ein Gen, das auf Chromosom 21 liegt, ebenfalls an LQT beteiligt ist.
  • Es wurde über autosomal-dominante und autosomal-rezessive Formen dieser Störung berichtet. Autosomal- rezessives LQT (auch bekannt als Jervell-Lange-Nielson-Syndrom) wurde mit kongenitaler neuraler Schwerhörigkeit assoziiert; diese Form des LQTs ist selten (Jervell und Lange-Nielson, 1957). Das autosomal-dominante LQT (Romano-Ward-Syndrom) ist verbreiteter und wird nicht mit anderen phänotypischen Anomalien assoziiert. Eine Störung, die dem erblichen LQT sehr ähnlich ist, kann auch, üblicherweise als Ergebnis einer pharmakologischen Therapie, erworben sein (Schwartz et al., 1975; Zipes, 1987).
  • Die Daten haben Implikationen für den Mechanismus von Arrhythmien beim LQT. Zwei Hypothesen für das LQT wurden zuvor vorgeschlagen (Schwartz et al., 1994). Eine legt nahe, dass eine Prädominanz der linken autonomen Innervation eine abnorme kardiale Repolarisation und Arrhythmien verursacht. Diese Hypothese wird gestützt durch den Befund, dass Arrhythmien bei Hunden durch das Entfernen des rechten Sternganglions induziert werden können. Außerdem legt anektotische Evidenz nahe, dass einige LQT-Patienten tatsächlich mit β-Adrenolytika und durch Ektomie des linken Sternganglions behandelt wurden (Schwartz et al., 1994). Die zweite Hypothese für mit LQT zusammenhängende Arrhythmien legt nahe, dass Mutationen in kardialspezifischen Ionenkanalgenen, oder Genen, die kardiale Ionenkanäle modulieren, verzögerte myozelluläre Repolarisation verursachen. Verzögerte myozelluläre Repolarisation könnte die Reaktivierung von L-Typ-Kalziumkanälen fördern, die in sekundären Depolarisationen resultieren (January und Riddle, 1989). Diese sekundären Depolarisationen sind der wahrscheinliche zelluläre Mechanismus von Torsade-depointes-Arrhythmien (Surawicz, 1989). Diese Hypothese wird durch die Beobachtung gestützt, dass das pharmakologische Blockieren von Kaliumkanälen eine QT-Verlängerung und mit Repolarisation zusammenhängende Arrhythmien beim Menschen und in Tiermodellen induzieren können (Antzelevitch und Sicouri, 1994). Die Entdeckung, dass eine Form des LQTs aus Mutationen in einem kardialen Kaliumkanalgen resultiert, stützt die myozelluläre Hypothese.
  • Im Jahr 1991 wurde die vollständige Kopplung zwischen autosomal-dominantem LQT und einem Polymorphismus bei HRAS berichtet (Keating et al., 1991a; Keating et al., 1991b). Diese Entdeckung lokalisierte LQT1 auf Chromosom 11p15.5 und machte bei einigen Familien die präsymptomatische Diagnose möglich. Zuvor war angenommen worden, das autosomal-dominantes LQT genetisch homogen wäre, und die ersten sieben Familien, die untersucht wurden, wurden mit 11p15.5 gekoppelt (Keating et al., 1991b). Im Jahr 1993 wurde herausgefunden, dass es eine Locus-Heterogenität für LQT gab (Benhorin et al., 1993; Curran et al., 1993; Towbin et al., 1994). Anschließend wurden zwei zusätzliche LQT-Loci identifiziert, LQT2 auf Chromosom 7q35-36 (neun Familien) und LQT3 auf 3p21-24 (drei Familien) (Jiang et al., 1994). Mehrere Familien konnten nicht mit den bekannten Loci gekoppelt werden, was auf eine zusätzliche Locus-Heterogenität für LQT hinwies. Dieser Grad an Heterogenität legt nahe, dass unterschiedliche LQT-Gene Proteine kodieren, die interagieren, um kardiale Repolarisation und Arrhythmie-Risiko zu modulieren.
  • Auch wenn über die Physiologie von LQT wenig bekannt ist, so ist die Störung assoziiert mit der Verlängerung des QT-Intervalls auf Elektrokardiogrammen, einem Zeichen für abnorme kardiale Repolarisation. Diese Assoziation legt nahe, dass Gene, die Ionenkanäle kodieren, oder deren Modulatorsubstanzen, berechtigte Kandidaten für LQT sind. HRAS, das auf Chromosom 11p15.5 lokalisiert wurde, wurde als Kandidat für LQT1, basierend auf direkten DNS-Sequenzanalysen (unveröffentlichte Beobachtungen) und durch Kopplungsanalysen, ausgeschlossen (Roy et al., 1994). Ein neuroendokrines Kalziumkanalgen (CACNL1A2; Chin et al., 1991; Seino et al., 1992) und ein Gen, das ein GTP-Bindeprotein kodiert, das Kaliumkanäle moduliert (GNRI2; Weinstein et al., 1988; Magovcevic et al., 1992), wurden, basierend auf ihrer chromosomalen Lage, Kandidaten für LQT3. Durch anschließende Kopplungsanalysen wurden diese Gene jedoch ausgeschlossen (Wang und Keating, unveröffentlichte Daten). Ein Skelettmuskel-Chloridkanal (CLCN1; Koch et al., 1992) und ein kardialer Muskarin-Acetylcholin-Rezeptor (CHRM2; Bonner et al., 1987) wurden Kandidaten für LQT2, basierend auf ihrer chromosomalen Lage 7g35-36, aber durch anschließende Kopplungsanalysen wurden diese Gene ausgeschlossen (Wang et al., hinterlegt).
  • Theoretisch könnten Mutationen in einem Natriumkanalgen LQT verursachen. Spannungsgesteuerte Natriumkanäle vermitteln schnelle Depolarisation in ventrikulären Myozyten und leiten auch einen niedrigen Strom während der Plateauphase des Aktionspotentials (Attwell et al., 1979). Geringe Anomalien der Natriumkanalfunktion (z. B. verzögerte Natriumkanalinaktivierung oder veränderte Spannungsabhängigkeit der Kanalinaktivierung) könnte die kardiale Repolarisation verzögern, was zu QT-Verlängerung und Arrhythmien führen könnte. Im Jahr 1992 klonierten und charakterisierten Gellens und Kollegen ein kardiales Natriumkanalgen SCN5A (Gellens et al., 1992). Die Struktur dieses Gens ähnelte anderen, zuvor charakterisierten Natriumkanälen, die ein großes Protein mit 2016 Aminosäuren kodierten. Diese Kanalproteine enthalten vier homologe Domänen (DI-DIV), von denen jede sechs putative membranspannende Segmente enthält (S1–S6). SCN5A wurde unlängst auf Chromosom 3p21 kartiert, was es zu einem ausgezeichneten Kandidatengen für LQT3 macht (George et al., 1995), und es erwies sich dann, dass dieses Gen mit LQT3 assoziiert ist (Wang et al., 1995a).
  • Im Jahr 1994 identifizierten Warmke und Ganetzky eine neuartige menschliche cDNS, das Human Ether-A-Go-Go Related Gen (HERG, Warmke und Ganetzky, 1994). HERG wurde auf dem menschlichen Chromosom 7 durch PCR-Analyse eines Somazellhybridpanels lokalisiert (Warmke und Ganetzky, 1994), was es zu einem Kandidaten für LQT2 machte. Die Funktion des Proteins, das von HERG kodiert wird, ist nicht bekannt, aber es hat eine vorhergesagte Aminosäuresequenzhomologie zu Kaliumkanälen. HERG wurde aus einer Hippocampus-cDNS-Bibliothek durch Homologie zum Drosophila Ether-A-Go-Go-Gen (eag) isoliert, das einen Kalzium-modulierten Kaliumkanal kodiert (Bruggeman et al., 1993). HERG ist nicht das menschliche Homolog zu eag, indes es nur 50 Aminosäuresequenzhomologie teilt. Es wurde gezeigt, dass HERG mit LQT2 assoziiert ist (Curran et al., 1995).
  • Es wurde ein neuartiges Kaliumkanalgen entdeckt, das KVLQT1 genannt wurde (Wang et al. (1996) Nature Genetics, Band 12, Nr. 1, S. 17–23). Hier wird der Beweis präsentiert, der aufzeigt, dass KVLQT1 LQT1 ist. Sechzehn Familien mit Mutationen in KVLQT1 wurden identifiziert und charakterisiert, und es wurde gezeigt, dass es in allen sechzehn Familien eine vollständige Kopplung zwischen LQT1 und KVLQT1 gab. KVLQT1 wurde auf Chromosom 11p15.5 kartiert, was es zu einem Kandidatengen für LQT1 machte. KVLQT1 kodiert ein Protein mit strukturellen Charakteristika von Kaliumkanälen und die Expression des Gens, wie mittels Northern-Blot-Analyse gemessen, bewies, dass KVLQT1 am stärksten im Herzen exprimiert wird. Eine intragene Deletion und zehn verschiedene Missense-Mutationen, die LQT verursachen, wurden in KVLQT1 identifiziert. Diese Daten definieren KVLQT1 als ein neuartiges kardiales Kaliumkanalgen und zeigen, dass Mutationen in diesem Gen Anfälligkeit für ventrikuläre Tachyarrhythmien und plötzlichen Tod verursachen.
  • Mutationen in SCN5A, HERG und KVLQT1 als potentielle Ursache von LQT werden ebenfalls diskutiert in Roden et al. (1996), American Heart Association, Inc., Band 94, Nr. 8, S. 1996–2012; und Priori et al. (1996), Schweiz. Med. Wochenschr., Band 126, Nr. 41, S. 1727–1731.
  • Priori et al. (1996), Archives des maladies du coeur et des vaisseaux, Band 89, Nr. 9, S. 1185–1187, berichten über die Entwicklung eines zellulären Modells, in dem ventrikuläre Myozyten Anthopleurin und Dofetilid ausgesetzt wurden, um LQT3 bzw. LQT2 nachzuahmen.
  • Es war bekannt, dass eine Komponente des IKs-Kanals minK ist, ein 130-Aminosäureprotein mit einer einzigen putativen Transmembrandomäne (Takumi et al., 1988; Goldstein und Miller, 1991; Hausdorff et al., 1991; Takumi et al., 1991; Busch et al., 1992; Wang und Goldstein, 1995; Wang et al., 1996).
  • Ein menschlicher minK-Kanal wurde in Xenopus Oozyten exprimiert und charakterisiert (Ruknudin et al. (1993), Society for Neuroscience Abstracts, Band 19, Nr. 292.9). Ein Polymorphismus in dem minK-Gen wurde von Lai et al. (1994), Gene, Band 151, S. 339–340, berichtet.
  • Aufgrund der Größe und Struktur von minK war es unwahrscheinlich, dass minK allein funktionelle Kanäle bildete (Attali et al., 1993; Lesage et al., 1993). Es wird der Beweis präsentiert, dass KVLQT1 und minK coassemblieren, um den kardialen IKs-Kaliumkanal zu bilden. Eine IKs-Dysfunktion ist eine Ursache für kardiale Arrhythmie.
  • Kurzdarstellung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung beweist die molekulare Basis des Long-QT-Syndroms. Spezifischer hat die vorliegende Erfindung ermittelt, dass molekulare Varianten des KVLQT1-Gens die Pathogenese von LQT verursachen oder daran beteiligt sind. Genotyp-Analysen zeigen, dass KVLQT1 bei sechzehn nicht miteinander verwandten Familien vollständig mit LQT1 gekoppelt ist. Die Analyse des KVLQT1-Gens wird eine frühe Diagnose von LQT bei Probanden bereitstellen. Das Diagnoseverfahren umfasst das Analysieren der DNS-Sequenz des KVLQT1-Gens eines zu testenden Individuums und Vergleichen derselben mit der DNS-Sequenz des nativen, nichtvarianten Gens. Das KVLQT1-Gen eines zu testenden Individuums wird auf Mutationen gescreent, die LQT verursachen. Die Fähigkeit, LQT vorherzusagen, wird Ärzte in die Lage versetzen, der Krankheit mit medizinischer Therapie, wie etwa Betablockern vorzubeugen.
  • Es wird ferner bewiesen, dass sich KVLQT1 und minK coassemblieren, um einen kardialen IKs-Kaliumkanal zu bilden. Eine IKs-Dysfunktion ist eine Ursache für kardiale Arrhythmie. Das Wissen, dass diese beiden Proteine coassemblieren, um den IKs-Kanal zu bilden, ist nützlich für die Entwicklung eines Assays, um auf Wirkstoffe zu screenen, die bei der Behandlung oder Vorbeugung von LQT1 verwendbar sind. Durch Coexprimieren beider Gene in einer Zelle, wie etwa einem Oozyten, ist es möglich, auf Wirkstoffe zu screenen, die eine Wirkung auf den IKs-Kanal haben, sowohl in dessen Wildtyp-Formen als auch in dessen mutierten Formen. Dieses Wissen ist auch für die Analyse des minK-Gens für eine frühe Diagnose von Probanden mit LQT verwendbar. Die Diagnoseverfahren werden ausgeführt, wie oben für KVLQT1 angegeben.
  • Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung eine Zelle bereit, umfassend eine DNS, die kodiert für
    • (a) menschliches minK und menschliches KVLQT1;
    • (b) menschliches minK und mutiertes menschliches KVLQT1;
    • (c) mutiertes menschliches minK und menschliches KVLQT1; oder
    • (d) mutiertes menschliches minK und mutiertes menschliches KVLQT1;
    wobei jede DNS exprimiert wird, und wobei jene Zelle im Hinblick auf diese DNS heterolog ist,
    und eine Zelle, umfassend eine RNS, die komplementär ist zu einer DNS, die kodiert für
    • (a) menschliches minK und menschliches KVLQT1;
    • (b) menschliches minK und mutiertes menschliches KVLQT1;
    • (c) mutiertes menschliches minK und menschliches KVLQT1; oder
    • (d) mutiertes menschliches minK und mutiertes menschliches KVLQT1;
    wobei jene RNS translatiert wird, und wobei jene Zelle im Hinblick auf jene RNS heterolog ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Auffinden von Wirkstoffen bereit, die zur Behandlung oder Vorbeugung von Long-QT-Syndrom verwendbar sind, wobei das Verfahren umfasst:
    • (a) das Einbringen einer Zelle, die DNS umfasst, die für menschliches minK und menschliches KVLQT1 kodiert, wobei jene DNS exprimiert wird, und wobei jene Zelle im Hinblick auf diese DNS heterolog ist, oder eine Zelle, die RNS umfasst, die komplementär ist zu DNS, die für menschliches minK und menschliches KVLQT1 kodiert, wobei jene RNS translatiert wird, und wobei jene Zelle im Hinblick auf jene RNS heterolog ist, in einer Badelösung zur Strommessung;
    • b) das Messen des induzierten K+-Stroms in der Zelle aus Schritt (a);
    • (c) das Einbringen einer Zelle, die DNS umfasst, die kodiert für menschliches minK und mutiertes menschliches KVLQT1; mutiertes menschliches minK und menschliches KVLQT1; oder mutiertes menschliches minK und mutiertes menschliches KVLQT1; wobei jede DNS exprimiert wird, und wobei jene Zelle im Hinblick auf diese DNS heterolog ist, oder eine Zelle, umfassend eine RNS, die komplementär ist zu einer DNS, die kodiert für menschliches minK und mutiertes menschliches KVLQT1; mutiertes menschliches minK und menschliches KVLQT1; oder mutiertes menschliches minK und mutiertes menschliches KVLQT1; wobei jene RNS translatiert wird, und wobei jene Zelle im Hinblick auf jene RNS heterolog ist, in eine Badelösung zur Strommessung;
    • d) das Messen des induzierten K+-Stroms in der Zelle aus Schritt (c);
    • (e) die Zugabe eines Wirkstoffs zu der Badelösung aus Schritt (d);
    • (f) das Messen des induzierten K+-Stroms in der Zelle aus Schritt (e);
    • (g) die Bestimmung, ob der Wirkstoff einen Strom induzierte, der dem in einer mit menschlichen minK und menschlichen KVLQT1 kotransfizierten Zelle beobachteten induzierten K+-Strom ähnlicher oder weniger ähnlich ist, im Vergleich mit dem in einer mit (i) menschlichem minK und mutiertem menschlichem KVLQT1, (ii) mutiertem menschlichem minK und menschlichem KVLQT1, oder (iii) mutiertem menschlichem minK und mutiertem menschlichem KVLQT1, kotransfizierten Zelle beobachteten Strom in Abwesenheit eines Wirkstoffs, wobei Wirkstoffe, die einen Strom auslösen, der dem in einer mit menschlichem minK und menschlichem KVLQT1 kotransfizierten Zelle beobachteten Strom ähnlicher ist, zur Behandlung oder Vorbeugung von Long-QT-Syndrom verwendet werden können.
  • Bevorzugt stammen die in diesem Verfahren verwendeten Zellen aus Säugetieren, wie etwa CHO-Zellen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein nichtmenschliches transgenes Tier bereit, wobei jenes Tier
    • (a) menschliches minK und menschliches KVLQT1;
    • (b) menschliches minK und mutiertes menschliches KVLQT1;
    • (c) mutiertes menschliches minK und menschliches KVLQT1; oder
    • (d) mutiertes menschliches minK und mutiertes menschliches KVLQT1 umfasst.
  • Die Erfindung richtet sich ferner auf ein Verfahren zum Auffinden von Wirkstoffen, die zur Behandlung oder Vorbeugung von Long-QT-Syndrom verwendbar sind, wobei das Verfahren umfasst:
    • (a) das Messen des induzierten K+-Stroms in einem nichtmenschlichen transgenen Tier, wobei jenes Tier menschliches minK und menschliches KVLQT1 umfasst;
    • (b) das Messen des induzierten K+-Stroms in einem nichtmenschlichen transgenen Tier, wobei jenes Tier umfasst menschliches minK und menschliches KVLQT1; menschliches minK und mutiertes menschliches KVLQT1; mutiertes menschliches minK und menschliches KVLQT1; oder mutiertes menschliches minK und mutiertes menschliches KVLQT1.
    • (c) die Verabreichung eines Wirkstoffs an das transgene Tier aus Schritt (b);
    • (d) das Messen des induzierten K+-Stroms in dem mit dem Wirkstoff behandelten Tier aus Schritt (c);
    • (e) die Bestimmung, ob der Wirkstoff einen Strom induzierte, der dem in einem transgenen Tier beobachteten induzierten K+-Strom, umfassend menschliches minK und menschliches KVLQT1, ähnlicher oder weniger ähnlich ist, im Vergleich mit dem in dem transgenen Tier beobachteten Strom, umfassend (i) menschliches minK und mutiertes menschliches KVLQT1, (ii) mutiertes menschliches minK und menschliches KVLQT1, oder (iii) mutiertes menschliches minK und mutiertes menschlichem KVLQT1, in Abwesenheit eines Wirkstoffs, wobei Wirkstoffe, die einen Strom auslösen, der dem in einem menschliches minK und menschliches KVLQT1 umfassenden transgenen Tier beobachteten Strom ähnlicher ist, zur Behandlung oder Vorbeugung von Long-QT-Syndrom verwendet werden können.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1. Stammbaumstruktur für einen Abschnitt von LQT Familienstamm 1532. Betroffene Individuen werden als gefüllte Kreise (Frauen) oder Quadrate (Männer), nicht betroffene Individuen als leere Symbole gezeigt, und Individuen mit unbestimmten Phänotypen sind getüpfelt. Die Genotypen für Chromosom-11-Marker sind unter jedem Symbol angezeigt und werden als Haplotypen gezeigt. Die Marker sind (von oben nach unten) geordnet nach: Tel-HRAS-D11S922-TH-D11S1318-D11S454-D11S860-D11SS12-Cen. Die Genauigkeit der Haplotypen wurde durch die Verwendung von Genotypen aus dem zusätzlichen Chromosom-11p15.5-Marker gewährleistet (Q. Wang, unveröffentlichte Ergebnisse). Vermutete Genotypen werden in Klammern gezeigt. Krankheitschromosome werden als Kästchen angezeigt und Rekombinationsereignisse werden durch horizontale Volllinien angezeigt. Die Rekombinationsereignisse, die Krankheitschromosomen betreffen, treten in folgenden Individuen auf: IV-22, IV-25, V-6, V-17, V-24, V-34, VI-13, VI-14 und VI-16. Rekombinationsereignisse, die in Nichtkrankheitschromosomen auftreten, werden nicht angezeigt. KVLQT1 ist ein SSCP-Konformer innerhalb von KVLQT1, der durch die Primer 5 und 6 identifiziert ist; dieser Konformer wurde nur in K1532 identifiziert und repräsentiert eine Erkankheit-assoziierte Mutation (Allel 2 ist das mutierte Allel). Haplotypenanalysen zeigen an, dass KVLQT1 zwischen den flankierenden Markern D11S922 und D11S454 liegt.
  • 2. Physische Karte der LQT1-Region. Das Ideogramm von Chromosom 11 zeigt die ungefähre Lage von LQT1 an (11p15.5). Die Lage der polymorphen Marker und einige Cosmide werden durch senkrechte Linien auf der Karte angezeigt. Verbesserte genetische Kartierung ordnet LQT1 zwischen TH und D11S454 ein. Der Abstand zwischen TH und D115454 wurde durch Puls-Feld-Gel-Analysen auf < 700 kb geschätzt. Eine physische Karte eines minimalen Sets überlappender YAC- und P1-Klone wird gezeigt. Die Lagen der KVLQT1-cDNS und der gefangenen (trapped) Exons werden angegeben. Strichlinien in YACs zeigen Chimärismus an.
  • 3A und 3B. Nukleotid und abgeleitete Aminosäuresequenzen von KVLQT1 (ohne die Region, die die ersten 34 Aminosäuren kodiert). (A) Die zusammengesetzte Sequenz von KVLQT1 wird gezeigt. Die Nukleotidsequenz ist SEQ-ID-Nr.: 15. Die Aminosäuresequenz ist SEQ-ID-Nr.: 16 Sechs putative Transmembransegmente (S1 bis S6) und eine putative Porenregion (Pore) sind angegeben. Eine potentielle Glycosylierungsstelle (N160) ist kursiv gedruckt. Zwei Consensus-Polyadenylierungssignale sind in der 3'-untranslatierten Region fettgedruckt angegeben. Zusammengesetzte cDNS-Sequenzen für KVLQT1 wurden durch Endsequenzierung der überlappenden cDNS-Klone und durch Primerwalking erhalten. KVLQT1-Sequenzen erhielten die GenBank-Accession-Number U40990.
  • (B) Alignment der S1–S6-Region von KVLQT1 mit dem Drosophila-Shaker-Kaliumkanal, DMSHAKE1 (SHA) (Pongs et al., 1988). Identität (I) und Ähnlichkeit (:) werden angegeben. Die 3 separaten Fragmente von KVLQT1 sind der Reihe nach: SEQ-ID-Nr.: 17, SEQ-ID-Nr.: 18 und SEQ-ID-Nr.: 19. Die 3 separaten Fragmente von DMSHAKE1 sind der Reihe nach: SEQ-ID-Nr.: 20, SEQ-ID-Nr.: 21 und SEQ-ID-Nr.: 22.
  • 4. Gewebeexpressionsmuster von KVLQT1. Northern-Analysen stellten eine 3,2 kb KVLQT1-mRNA in menschlicher Niere, Lunge, Plazenta und Herz dar, mit höchsten Leveln im Herzen.
  • 5A bis 5D. KVLQT1-Missense-Mutationen cosegregieren mit LQT in den Familienstämmen K1532 (5A), K2605 (5B), K1723 (5C) und K1807 (5D). Die Ergebnisse der SSCP-Analysen mit Primerpaar 5 bis 6 (K1532), Primerpaar 9 bis 10 (K1723, K1807) und Primerpaar 11 bis 12 (K2605) werden unter jedem Stammbaum gezeigt. Aberrierende SSCP-Konformers (durch * angezeigt) cosegregierten mit LQT in jedem Familienstamm. Für K1532 werden nur acht der 217 Individuen gezeigt; die Ergebnisse der SSCP-Analysen bei zusätzlichen Mitgliedern von K1532 werden in 1 gezeigt (KVLQT1-Allel 2). Weil die aberrierenden SSCP-Konformer, die in K161 und K162 mit LQT cosegregieren, mit dem aberrierenden Konformer, der in K1807 definiert ist, identisch waren, werden die Ergebnisse für diese Stämme nicht gezeigt.
  • Die Ergebnisse der DNS-Sequenzanalysen der normalen (linken) und aberrierenden Konformer (rechts) werden unter jedem Stammbaum gezeigt.
  • 6A bis 6G. Intragene Deletionen und Missense-Mutationen in KVLQT1, die mit LQT assoziiert sind, in den Familienstämmen K13216 (6A), K1777 (6B), K20925 (6C), K2557 (6D), K13119 (6E), K20926 (6F) und K15019 (6G). Die Ergebnisse der SSCP-Analysen mit Primerpaar 1 bis 2 (K13216, K2557, K13119, K15019), Primerpaar 7 bis 8 (K1777, K20926) und Primerpaar 9 bis 10 (K20925) werden unter jedem Stammbaum gezeigt. Weil die aberrierenden SSCP-Konformer, die in K2050, K163 und K164 mit LQT cosegregieren, mit den aberrierenden Konformern, die in K1723 und K1807 definiert sind, identisch waren, werden die Ergebnisse für diese Familienstämme nicht gezeigt. Die Ergebnisse der DNS-Sequenzanalysen der normalen (linken) und aberrierenden (rechten) Konformer werden unter jedem Stammbau gezeigt. Die gezeigten Sequenzen sind auf dem Antisense-Strang.
  • 7. Schematische Repräsentation der vorhergesagten Topologie des KVLQT1-Proteins und Lage der KVLQT1-Mutationen.
  • 8A und 8B. Struktur von menschlichen KVLQT1 und Xenopus-KVLQT1 und Gewebeexpressionsmuster menschlicher KVLQT1. A) Vergleich menschlicher KVLQT1 und einer teilweisen Xenopus-KVLQT1-Aminosäuresequenz. Senkrechte Linien zeigen identische Reste an. Die Xenopus-Aminosäuresequenz ist SEQ-ID-Nr.: 23 und die menschliche Aminosäuresequenz ist SEQ-ID-Nr.: 24. B) Northern-Analysen zeigen die Expression von KVLQT1 im menschlichen Herzen, Plazenta, Lunge, Niere und Bauchspeicheldrüse an.
  • 9A bis 9E. KVLQT1- und hminK-Coexpression in CHO-Zellen induziert einen Strom, der mit dem kardialen IKs fast identisch ist. A) KVLQT1-Ströme, die während 1 Sek. depolarisierender Impulse an Membranpotentialen von –50 bis +40 mV aufgenommen wurden, die von einem Haltepotential von –80 mV angewendet werden. Schwanzströme wurden bei –70 mV gemessen. B) Normalisierte isochronale Aktivierungskurven für Zellen, die mit KVLQT1 (n = 6; 1 Sek. Impulse) oder KVLQT1 und hminK (n = 7; 7,5 Sek. Impulse) transfiziert wurden. C-E) Ströme, die während 7,5 Sek. Impulsen zu –40, –20, –10, 0, +20 und +40 mV in Zellen aufgezeichnet wurden, die mit hminK (C), KVLQT1 (D) oder KVLQT1 und hminK (E) transfiziert wurden. Schwanzströme wurden bei –70 mV in D, und bei –50 mV in C und E gemessen. Die Amplitude des stationären Zustands-KVLQT1-Stroms bei +40 mV betrug 0,37 ± 0,14 nA (n = 6). In Zellen, die mit KVLQT1 und hminK cotransfiziert wurden, betrug der zeitabhängige Strom während eines 7,5-s Impulses an +40 mV 1,62 + 0,39 nA (n = 7).
  • 10A bis 10C. Expression von KVLQT1 in Xenopus-Oozyten. A) Ströme, die in einem mit 12,5 ng KVLQT1-cRNA injizierten Oozyten aufgezeichnet wurden. Die Impulse wurden in 10-mV-Steigerungen von –70 bis +40 mV angewendet. B) Isochronale (Is) Aktivierungskurve für KVLQT1-Strom. V1/2 betrug –14, 0 ± 0, 2 mV und der Slope-Faktor betrug 11,2 ± 0,2 mV (n = 9). C) Die Beziehung von Erev versus log[K+]e wurde mit einer linearen Funktion angepasst und hatte einen Slope von 49,9 ± 0,4 mV (n = 6–7 Oozyten je Punkt). Tail-Ströme wurden mit mehreren Voltzahlen nach 1,6 Sek Vorimpulsen an +10 mV gemessen.
  • 11A bis 11E. Die Coexpression von KVLQT1 und hminK legt die Gegenwart eines KVLQT1-Homologs in Xenopus Oozyten nahe. Die Ströme wurden bei –40, –20, 0, +20 und +40 mV in Oozyten aufgenommen, die entweder mit 5,8 ng KVLQT1 (11A), 1 ng hminK (11B) injiziert wurden oder mit beiden cRNAs (11C) coinjiziert wurden, aufgenommen. 11D zeigt Strom- Spannung-Verhältnisse, die unter Verwendung von 2-Sek.-Impulsen für KVLQT1, und 7,5 Sek.-Impulsen für hminK oder KVLQT1 und hminK (n = 20 Zellen für jede Bedingung) gemessen wurden. Für Oozyten, die mit 60 pg oder 1 ng hminK-cRNA injiziert wurden, betrug der IsK bei +40 mV 2,11 ± 0,12 μA und 2,20 ± 0,18 μA. 11E zeigt normalisierte isochronale Aktivierungskurven für Oozyten, die mit hminK (V1/2 = 2, 4 ± 0, 3 mV injiziert wurden; Slope = 11,4 ± 0,3 mV; n = 16) oder mit KVLQT1- und hminK-cRNA (V1/2 = 6,2 ± 0,3 mV; Slope = 12,3 ± 0,2 mV; n = 20) coinjiziert wurden
  • 12A bis 12D. Die Nukleotidsequenz für KVLQT1-cDNS und deren Translationsprodukt werden gezeigt.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung richtet sich auf den Nachweis, dass LQT in dem KVLQT1-Gen kartiert, und dass molekulare Varianten dieses Gens die Pathogenese von LQT verursachen oder daran beteiligt sind. Sie ist auch auf den Nachweis gerichtet, dass KVLQT1 und minK coassemblieren, um kardiale IKs-Kaliumkanäle zu bilden. Hier werden Mutationen im KVLQT1-Gen und ihre Verwendung bei der Diagnose von LQT beschrieben. Ebenfalls beschrieben werden Verfahren zum Screenen von Menschen auf die Gegenwart von KVLQT1-Genvarianten, die LQT verursachen. Da LQT nun früher (d. h. bevor Symptome auftauchen) und definitiver ermittelt werden kann, werden bessere Behandlungsmöglichkeiten für solche Individuen verfügbar sein, die als Träger von LQT identifiziert wurden. Die vorliegende Erfindung richtet sich auch auf Verfahren zum Auffinden von Wirkstoffen, die zur Behandlung oder Vorbeugung von LQT1 verwendbar sind.
  • Ferner werden hier Verfahren zum Screenen des KVLQT1-Gens beschrieben, um Mutationen zu identifizieren. Solche Verfahren können ferner den Schritt des Amplifizierens eines Abschnitts des KVLQT1-Gens umfassen, und können ferner einen Schritt zum Bereitstellen eines Polynukleotidsets beinhalten, die Primer für die Amplifikation des Abschnitts des KVLQT1-Gens sind. Das Verfahren ist zum Identifizieren von Mutationen für die Verwendung entweder bei der Diagnose von LQT oder der Prognose von LQT verwendbar.
  • Das Long-QT-Syndrom ist eine erbliche Störung, die plötzlichen Tod aufgrund kardialer Arrhythmien, spezifisch Torsade-de-pointes und ventrikuläre Fibrillation verursacht. LQT wurde zuvor auf drei Loci kartiert: LQT1 auf Chromosom 11p15.5, LQT2 auf 7g35-36 und LQT3 auf 3p21-24. Es ist eine Entdeckung der vorliegenden Erfindung, dass es eine genetische Kopplung zwischen LQT1 und Polymorphismen innerhalb von KVLQT1, einem kardialen Kaliumkanalgen, gibt.
  • Die vorliegende Erfindung beweist, dass minK auf Chromosom 21 ebenfalls an LQT beteiligt ist. Das minK-Protein und KVLQT1 coassemblieren, um einen K+-Kanal zu bilden. Hier werden somit Verfahren zum Screenen des minK-Gens beschrieben, um Mutationen zu identifizieren. Solche Verfahren können ferner den Schritt des Amplifizierens eines Abschnitts des minK-Gens umfassen, und können ferner einen Schritt zum Bereitstellen eines Polynukleotidsets beinhalten, die Primer für die Amplifikation des Abschnitts des minK-Gens sind. Das Verfahren ist zum Identifizieren von Mutationen für die Verwendung entweder bei der Diagnose von LQT oder der Prognose von LQT verwendbar.
  • Schließlich richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Auffinden von Wirkstoffkandidaten, um Wirkstoffe zu identifizieren, die für die Behandlung oder Vorbeugung von LQT verwendbar sind. Das Wirkstoff-Screening wird durch Coexpression mutierter KVLQT1- und/oder minK-Gene in Zellen, wie etwa Oozyten, Zellen aus Säugetieren oder transgenen Tieren, und Analysieren der Wirkung eines Wirkstoffkandidaten auf den IKs-Kanal ausgeführt. Die Wirkung wird mit der IKs-Kanal-Aktivität der Wildtyp-KVLQT1- und -minK-Gene verglichen.
  • Der Beweis, dass das KVLQT1-Gen am Verursachen von LQT beteiligt ist, wird durch das Finden von Sequenzen in DNS erhalten, die aus betroffenen Familienstammmitgliedern extrahiert wurde, die abnorme KVLQT1-Genprodukte oder abnorme Level der Genprodukte erzeugen. Solche LQT-Anfälligkeitsallele werden mit der Erkrankung in großen Familienstämmen cosegregieren. Sie werden ebenfalls in sehr viel größerer Häufigkeit bei Nicht-Familienstammes-Individuen mit LQT vorhanden sein als bei Individuen aus der allgemeinen Bevölkerung. Der Schlüssel ist, Mutationen zu finden, die gefährlich genug sind, um die offensichtliche Disruption der normalen Funktion des Genprodukts zu verursachen. Diese Mutationen können eine Reihe von Formen annehmen. Die schwerwiegendsten Formen wären Rasterverschiebungsmutationen oder große Deletionen, die verursachen würden, dass das Gen für ein abnormes Protein kodiert oder eines, das die Proteinexpression signifikant verändern würde. Weniger schwerwiegende disruptive Mutationen würden kleine In-Frame-Deletionen und nichtkonservative Basenpaarsubstitutionen beinhalten, die eine signifikante Wirkung auf das produzierte Protein haben würden, wie etwa Änderungen zu oder von einem Cysteinrest, von einer basischen zu einer azidischen Aminosäure und umgekehrt, von einer hydrophoben zu einer hydrophilen Aminosäure oder umgekehrt, oder andere Mutationen, die die sekundäre oder tertiäre Proteinstruktur beeinträchtigen würden. Von stillen Mutationen oder solchen, die in konservativen Aminosäuresubstitutionen resultieren, würde im Allgemeinen keine Disruption der Proteinfunktion erwartet.
  • Gemäß dem hier beschriebenen Diagnose- und Prognoseverfahren wird die Veränderung Wildtyp-KVLQT1- Gens ermittelt. Außerdem kann das Verfahren durch Ermitteln des Wildtyp-KVLQT1-Gens und Bestätigen des Fehlens einer Ursache von LQT als Ergebnis dieses Locus durchgeführt werden. „Veränderung eines Wildtyp-Gens" schließt alle Formen von Mutationen ein, einschließlich Deletionen, Insertionen und Punktmutationen in den kodierenden und nicht kodierenden Regionen. Bei den Deletionen kann es sich um das gesamte Gen oder nur einen Abschnitt des Gens handeln. Punktmutationen können in Stoppcodonen, Rasterverschiebungsmutationen oder Aminosäurensubstitutionen resultieren. Somatische Mutationen sind jene, die nur in bestimmten Geweben auftreten und nicht in der Keimbahn vererbt werden. Keimbahnmutationen können in allen Körpergeweben gefunden werden und sind erblich. Punktmutationsereignisse können in Regulationsregionen, wie etwa in dem Promoter des Gens auftreten, was zu Verlust oder Verringerung von Expression der mRNS führt zu. Punktmutationen können auch richtiges RNS-Processing aufheben, was zu Verlust von Expression des KVLQT1-Genprodukts, oder zu einer Abnahme an mRNS-Stabilität oder Translationseffizienz führt.
  • Die Gegenwart von LQT kann durch Testen jeden Gewebes eines Menschen auf Mutationen des KVLQT1-Gens oder des minK-Gens festgestellt werden. Zur Bezugserleichterung wird sich die folgende Beschreibung auf das KVLQT1-Gen richten. Die Beschreibung ist jedoch in gleicher Weise für das minK-Gen zum Testen auf Mutationen anwendbar. Zum Beispiel wäre eine Person, die eine KVLQT1-Keimbahnmutation geerbt hat, anfällig dafür, LQT zu entwickeln. Dies kann durch das Testen von DNS aus jedem Körpergewebe dieser Person nachgewiesen werden. Am einfachsten kann Blut abgenommen und DNS aus den Blutzellen extrahiert werden. Außerdem kann eine pränatale Diagnose durchgeführt werden, indem fötale Zellen, Plazentazellen oder amniotische Zellen auf Mutationen des KVLQT1-Gens getestet werden. Die Veränderung eines Wildtyp-KVLQT1-Allels, zum Beispiel entweder durch Punktmutation oder Deletion über jedes der hier diskutierten Mittel ermittelt werden.
  • Es gibt mehrere Verfahren, die verwendet werden können, um eine DNS-Sequenzvariation zu ermitteln. Direkte DNS-Sequenzierung, entweder manuelle Sequenzierung oder automatisierte Fluoreszenz-Sequenzierung, kann Sequenzvariation ermitteln. Ein anderer Ansatz ist der Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-Assay (SSCP) (Orita et al., 1989). Dieses Verfahren ermittelt nicht alle Sequenzänderungen, speziell, wenn die Größe des DNS-Fragments mehr als 200 bp beträgt, kann aber optimiert werden, um die meisten DNS-Sequenzvariationen zu ermitteln. Die reduzierte Nachweissensitivität ist ein Nachteil, aber der höhere Durchsatz, der mit SSCP möglich ist, macht ihn zu einer attraktiven, entwicklungsfähigen Alternative zur direkten Sequenzierung zum Mutationsnachweis auf Forschungsbasis. Die Fragmente, die auf SSCP-Gelen eine „geshiftete" Mobilität aufweisen, werden dann sequenziert, um die genaue Natur der DNS-Sequenzvariation zu ermitteln. Andere Ansätze, die auf dem Nachweis von Fehlpaarungen zwischen den zwei komplementären DNS-Strängen basieren, beinhalten Clamped Denaturing Gel Electrophoresis (CDGE) (Sheffield et al., 1991), Heteroduplex-Analyse (HA) (White et al., 1992) und chemische Spaltung von Fehlpaarungen (CMC) (Grompe et al., 1989). Keines der oben beschriebenen Verfahren wird große Deletionen, Duplikationen oder Insertionen ermitteln, noch werden sie eine Regulationsmutation ermitteln, die die Transkription oder Translation des Protein beeinträchtigt. Andere Verfahren, die diese Klasse von Mutationen ermitteln könnten, wie etwa ein Protein-Trunkierungs-Assay oder der asymmetrische Assay, ermitteln nur spezifische Arten von Mutationen und würden Missense-Mutationen nicht ermitteln. Einen Überblick über derzeit verfügbare Verfahren zum Nachweis von DNS-Sequenzvariation ist in einem aktuellen Überblick von Grompe (1993) zu finden. Sobald eine Mutation bekannt ist, kann ein Allel-spezifischer Nachweis-Ansatz, wie etwa Allel-spezifische Oligonukleotidhybridisierung (ASO) genutzt werden, um schnell eine große Anzahl von anderen Proben auf diese gleiche Mutation zu screenen.
  • Eine schnelle vorläufige Analyse, um Polymorphismen in DNS-Sequenzen zu ermitteln, kann ausgeführt werden, indem eine Reihe von Southern-Blots von DNS angesehen wird, die mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen, bevorzugt mit einer großen Anzahl von Restriktionsenzymen, geschnitten wurde. Jeder Blot enthält eine Reihe normaler Individuen und eine Reihe von LQT-Fällen. Southern-Blots, die hybridisierende Fragmente (die sich in der Länge von Kontroll-DNS unterscheiden, wenn sie mit Sequenzen nahe oder einschließlich des KVLQT1-Locus sondiert werden) darstellen, zeigen eine mögliche Mutation an. Wenn Restriktionsenzyme verwendet werden, die sehr große Restriktionsfragmente produzieren, dann wird Puls-Feld-Gel-Elektrophorese (PFGE) benutzt.
  • Der Nachweis von Punktmutationen kann durch molekulares Klonieren des KVLQT1-Allels und Sequenzieren des Allels unter Verwendung von Techniken erreicht werden, die dem Fachmann bekannt sind.
  • Es gibt sechs gut bekannte Verfahren für einen vollständigeren, aber immer noch indirekten Test zur Bestätigung der Gegenwart eines Anfälligkeitsallels: 1) Einzelstrang-Konformations-Analyse (SSCP) (Orita et al., 1989); 2) denaturierende Gradientengel-Elektrophorese (DGGE) (Wartell et al., 1990; Sheffield et al., 1989); 3) RNase-Schutz-Assays (Finkelstein et al., 1990; Kinszler et al., 1991); 4) Allel-spezifische Oligonukleotide (ASOs) (Conner et al., 1983); 5) die Verwendung von Proteinen, die Nukleotid-Fehlpaarungen erkennen, wie etwa das E.-coli-mutS-Protein (Modrich, 1991); und 6) Allel-spezifische PCR (Rano und Kidd, 1989). Für die Allel-spezifische PCR werden Primer verwendet, die an ihren 3'-Enden zu einer bestimmten KVLQT1-Mutation hybridisieren. Wenn die bestimmte Mutation nicht vorhanden ist, wird kein Amplifikationsprodukt beobachtet. Das System der amplifizierungsresistentn Mutationen (ARMS) kann ebenfalls verwendet werden, wie in der europäischen Patentanmeldungs-Veröffentlichungsnr. 0332435 und in Newton et al., 1989, offenbart. Insertionen und Deletionen von Genen können ebenfalls durch Klonierung, Sequenzierung und Amplifikation ermittelt werden. Außerdem können Restriktionsfragmentlängenpolymorphismussonden (RFLP) für das Gen oder umgebende Markergene verwendet werden, um die Veränderung eines Allels oder einer Insertion in einem polymorphen Fragment zu markieren. Ein solches Verfahren ist insbesondere geeignet zum Screenen von Verwandten eines betroffenen Individuums auf die Gegenwart der Mutation, die in diesem Individuum gefunden wurde. Andere Techniken zum Nachweis von Insertionen und Deletionen, die dem Fachmann bekannt sind, können verwendet werden.
  • Bei den ersten drei Verfahren (SSCP, DGGE und RNase-Schutz-Assay) erscheint ein neues elektrophoretisches Band. SSCP ermittelt ein Band, das unterschiedlich migriert, weil die Sequenzänderung eine Differenz in der einzelsträngigen intramolekularen Basenpaarung verursacht. RNase-Schutz beinhaltet die Spaltung des mutierten Polynukleotids in zwei oder mehrere kleinere Fragmente. DGGE ermittelt unter Verwendung eines denaturierenden Gradientengels Differenzen in den Migrationsraten der mutierten Sequenzen im Vergleich zu Wildtyp-Sequenzen. In einem Allel-spezifischen Oligonukleotid-Assay wird ein Oligonukleotid designed, das eine spezifische Sequenz ermittelt, und der Assay wird durch Nachweis der Gegenwart oder Abwesenheit eines Hybridisierungssignals ausgeführt. In dem mutS-Assay bindet das Protein nur an Sequenzen, die eine Nukleotid-Fehlpaarung in einem Heteroduplex zwischen mutierten und Wildtyp-Sequenzen enthalten.
  • Fehlpaarungen gemäß der vorliegenden Erfindung sind hybridisierte Nukleinsäureduplexe, in denen die beiden Stränge nicht 100 % komplementär sind. Das Fehlen einer totalen Homologie kann auf Deletionen, Insertionen, Inversionen oder Substitutionen zurückzuführen sein. Der Fehlpaarungs-Nachweis kann verwendet werden, um Punktmutationen in dem Gen oder in dessen mRNS-Produkt zu ermitteln. Wenn diese Techniken auch weniger empfindlich sind als die Sequenzierung, so sind sie an einer großen Anzahl von Proben einfacher auszuführen. Ein Beispiel für eine Fehlpaarungs-Spaltungstechnik ist das RNase-Schutz-Verfahren. In der Praxis der vorliegenden Erfindung beinhaltet das Verfahren die Verwendung einer markierten Riboprobe, die zu der menschlichen genkodierenden Wildtyp-KVLQT1-Sequenz komplementär ist. Die Riboprobe und entweder mRNS oder DNS, die aus der Person isoliert wurde, werden zusammen annealt (hybridisiert) und anschließend mit dem Enzym RNase A verdaut, das in der Lage ist, einige Fehlpaarungen in einer Duplex-RNS-Struktur zu ermitteln. Wenn eine Fehlpaarung durch RNase A ermittelt wird, spaltet sie an der Stelle der Fehlpaarung. Wenn somit die annealte RNS-Präparation auf einer elektrophoretischen Gelmatrix separiert wird, wenn eine Fehlpaarung ermittelt und durch RNase A gespalten wurde, wird ein RNS-Produkt zu sehen sein, das kleiner ist als die Volllängen-Duplex-RNS für die Riboprobe und die mRNS oder DNS. Die Riboprobe muss keine Volllänge der mRNS oder des Gens sein, sondern kann ein Segment eines der beiden sein. Wenn die Riboprobe nur ein Segment der mRNS oder des Gens umfasst, wird es wünschenswert sein, eine Anzahl dieser Sonden zu nutzen, um die gesamte mRNS-Sequenz auf Fehlpaarungen zu screenen.
  • Auf ähnliche Weise können DNS-Sonden verwendet werden, um Fehlpaarungen durch enzymatische oder chemische Spaltung zu ermitteln. Vgl. z. B. Cotton et al., 1988; Shenk et al., 1975; Novack et al., 1986. Alternativ können Fehlpaarungen durch Verschiebungen in der elektrophoretischen Mobilität von fehlgepaarten Duplexen im Verhältnis zu korrekt gepaarten Duplexen ermittelt werden. Vgl. z. B. Cariello, 1988. Die zelluläre mRNS oder DNS, die eine Mutation enthalten könnte, kann, entweder mit Riboproben oder DNS-Sonden, unter Verwendung von PCR (vgl. unten) vor der Hybridisierung, amplifiziert werden. Änderungen in der DNS des KVLQT1-Gens können ebenfalls unter Verwendung von Southern-Hybridisierung ermittelt werden speziell dann, wenn die Änderungen umfangreiche Rearrangements sind, wie etwa Deletionen und Insertionen.
  • DNS-Sequenzen des KVLQT1-Gens, die unter Verwendung von PCR amplifiziert wurden, können ebenfalls unter Verwendung Allel-spezifischer Sonden gescreent werden. Diese Sonden sind Nukleinsäureoligomere, von denen jedes eine Region der Gensequenz enthält, die eine bekannte Mutation beherbergt. Zum Beispiel kann ein Oligomer, entsprechend einem Abschnitt der Gensequenz, etwa 30 Nukleotide lang sein. Unter Verwendung einer Gruppe solcher Allel-spezifischen Sonden können PCR-Amplifikationsprodukt gescreent werden, um die Gegenwart einer zuvor identifizierten Mutation in dem Gen zu identifizieren. Die Hybridisierung Allelspezifischer Sonden mit amplifizierten KVLQT1-Sequenzen kann zum Beispiel auf einem Nylonfilter ausgeführt werden. Die Hybridisierung zu einer bestimmten Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen zeigt die Gegenwart der gleichen Mutation im Gewebe an, wie in der Allel-spezifischen Sonde.
  • Der definitivste Test auf Mutationen in einem Kandidatenlocus ist der direkte Vergleich genomischer KVLQT1-Sequenzen von Patienten mit denen einer Kontrollpopulation. Alternativ ließe sich Messenger-RNS nach der Amplifikation, z. B. durch PCR sequenzieren, und dadurch die Notwendigkeit der Bestimmung der Exonstruktur des Kandidatengens beseitigen.
  • Mutationen von Patienten, die außerhalb der kodierenden Region von KVLQT1 liegen, können durch Überprüfung der nicht kodierenden Regionen, wie etwa Introns und Regulatorsequenzen nahe der oder innerhalb der Gene ermittelt werden. Eine frühes Anzeichen dafür, dass Mutationen in nichtkodierenden Regionen wichtig sind, kann aus Northern-Blot-Versuchen kommen, die Messenger-RNS-Moleküle abnormer Größe oder Abundanz bei Patienten, verglichen mit Kontrollindividuen, aufdecken.
  • Die Veränderung von KVLQT1-mRNS-Expression kann durch jede Technik ermittelt werden, die dem Fachmann bekannt ist. Diese beinhaltet Northern-Blot-Analyse, PCR-Amplifikation und RNase-Schutz. Verringerte mRNS-Expression zeigt eine Veränderung des Wildtyp-Gens an. Die Veränderung von Wildtyp-Genen kann ebenfalls durch Screenen auf Veränderung von Wildtyp-KVLQT1-Protein ermittelt werden. Zum Beispiel können monoklonale Antikörper verwendet werden, die immunoreaktiv mit KVLQT1 sind, um ein Gewebe zu screenen. Das Fehlen des verwandten (cognate) Antigens würde eine Mutation anzeigen. Antikörper, die für Produkte von mutierten Allelen spezifisch sind, könnten ebenfalls verwendet werden, um mutierte Genprodukte zu ermitteln. Solche immunologischen Assays können in allen passenden Formaten gemacht werden, die dem Fachmann bekannt sind. Diese beinhalten Western-Blots, immunohistochemische Assays und ELISA-Assays. Alle Mittel zum Nachweis eines veränderten KVLQT1-Proteins können verwendet werden, um eine Veränderung des Wildtyp-KVLQT1-Gens zu ermitteln. Funktionelle Assays, wie etwa Proteinbindungsbestimmungen, können verwendet werden. Außerdem können Assays verwendet werden, die die biochemische KVLQT1-Funktion ermitteln. Das Finden eines mutierten KVLQT1-Genprodukts zeigt Veränderungen eines Wildtyp-KVLQT1-Gens an.
  • Ein mutiertes KVLQT1-Gen oder Genprodukt kann auch in anderen menschlichen Körperproben, wie etwa Serum, Stuhl, Urin und Sputum, ermittelt werden. Die gleichen Techniken, die oben für den Nachweis von mutierten Genen oder Genprodukten in Geweben diskutiert wurden, können auf andere Körperproben angewendet werden. Durch Screenen solcher Körperproben kann eine einfache frühe Diagnose für LQT erreicht werden.
  • Die hier beschriebenen Primerpaare sind zur die Bestimmung der Nukleotidsequenz eines bestimmten KVLQT1- oder minK-Allels unter Verwendung von PCR verwendbar. Die einzelsträngigen DNS-Primerpaare für KVLQT1 können zu Sequenzen innerhalb des KVLQT1-Gens auf Chromosom 11 oder darum herum annealt werden, um die amplifizierende DNS-Synthese des Gens selbst vorzubereiten. Die einzelsträngigen DNS-Primerpaare für minK können zu Sequenzen innerhalb oder des minK-Gens oder darum herum auf Chromosom 21 annealed werden, um die amplifizierende DNS-Synthese des Gens selbst vorzubereiten. Ein vollständiges Set dieser Primer ermöglicht die Synthese aller Nukleotide der genkodierenden Sequenzen, d. h. der Exons. Das Primerset ermöglicht bevorzugt die Synthese sowohl von Intron- als auch Exonsequenzen. Allel-spezifische Primer können ebenfalls verwendet werden. Solche Primer annealen nur zu bestimmten mutierten KVLQT1-Allelen und werden somit nur ein Produkt in Gegenwart des mutierten Allels als Template amplifizieren.
  • Um das anschließende Klonieren amplifizierter Sequenzen zu erleichtern, können Primer Restriktionsenzymstellensequenzen an ihre 5'-Enden angehängt haben. Somit sind alle Nukleotide der Primer von der KVLQT1-Sequenz oder Sequenzen benachbart zu KVLQT1 abgeleitet, abgesehen von den wenigen Nukleotiden, die notwendig sind, um eine Restriktionsenzymstelle zu bilden. Solche Enzyme und Stellen sind dem Fachmann gut bekannt. Die Primer selbst können unter Verwendung von Techniken synthetisiert werden, die dem Fachmann gut bekannt sind. Im Allgemeinen können die Primer unter Verwendung von Oligonukleotid-synthetisierenden Maschinen hergestellt werden, die im Handel erhältlich ist. Wenn die Sequenz von KVLQT1 vorgegeben ist, dann ist das Design bestimmter Primer dem Fachmann gut bekannt.
  • Die hier beschriebenen Nukleinsäuresonden sind für eine Anzahl von Zwecken verwendbar. Sie können bei Southern-Hybridisierung zu genomischer DNS und in den RNase-Schutz-Verfahren zum Nachweis von Punktmutationen verwendet werden, die bereits oben diskutiert wurden. Die Sonden können verwendet werden, um PCR-Amplifikationsprodukte zu ermitteln. Sie können auch verwendet werden, um Fehlpaarungen mit dem KVLQT1-Gen oder mRNS unter Verwendung anderer Techniken zu ermitteln.
  • Es wurde entdeckt, dass Individuen mit dem Wildtyp-KVLQT1-Gen kein LQT haben. Mutationen, die die Funktion des KVLQT1-Genprodukts stören, sind jedoch an der Pathogenese von LQT beteiligt. Somit verursacht die Gegenwart eines veränderten (oder eines mutierten) KVLQT1-Gens, das ein Protein produziert, das einen Funktionsverlust oder eine veränderte Funktion aufweist, direkt LQT, das das Risiko für kardiale Arrhythmien erhöht. Um eine KVLQT1-Genmutation zu ermitteln, wurde eine biologische Probe präpariert und auf eine Differenz zwischen der Sequenz des Allels, das analysiert wird und der Sequenz des Wildtyp-Allels analysiert. Mutierte KVLQT1-Allele können anfänglich von jeder der oben beschriebenen Techniken identifiziert werden. Die mutierten Allele werden dann sequenziert, um die spezifische Mutation des bestimmten mutierten Allels zu identifizieren. Alternativ können mutierte Allele anfänglich identifiziert werden, indem, unter Verwendung herkömmlicher Techniken, mutierte (veränderte) Proteine identifiziert werden. Die mutierten Allele werden dann sequenziert, um die spezifische Mutation für jedes Allel zu identifizieren. Die Mutationen, speziell jene, die zu einer veränderten Funktion des Proteins führen, werden dann für die Diagnose- und Prognoseverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet.
  • Es wurde ebenfalls entdeckt, dass das KVLQT1-Protein mit dem minK-Protein coassembliert. Somit sind Mutationen in minK, die die Funktion des minK-Genprodukts stören, an der Pathogenese von LQT beteiligt. Somit verursacht die Gegenwart eines veränderten (oder eines mutierten) minK-Gens, das ein Protein produziert, das einen Funktionsverlust oder eine veränderte Funktion aufweist, direkt LQT, das das Risiko für kardiale Arrhythmien erhöht. Um eine minK-Genmutation zu ermitteln, wurde eine biologische Probe präpariert und auf eine Differenz zwischen der Sequenz des Allels, das analysiert wird, und der Sequenz des Wildtyp-Allels analysiert. Mutierte minK-Allele können anfänglich durch jede der oben beschriebenen Techniken identifiziert werden. Die mutierten Allele werden dann sequenziert, um die spezifische Mutation des bestimmten mutierten (veränderten) Proteins, unter Verwendung herkömmlicher Techniken, zu identifizieren. Die mutierten Allele werden dann sequenziert, um die spezifische Mutation für jedes Allel zu identifizieren. Die Mutationen, speziell jene, die zu einer veränderten Funktion des Proteins führen, werden dann für die Diagnose- und Prognoseverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet.
  • Definitionen
  • Die vorliegende Erfindung benutzt die folgenden Definitionen:
    „Sonden". Polynukleotidpolymorphismen, die mit KVLQT1-Allelen assoziiert sind, die für LQT prädisponieren, werden durch Hybridisierung mit einer Polynukleotidesonde ermittelt, die ein stabiles Hybrid mit der der Targetsequenz bildet, unter stringenten bis moderat stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen. Wenn erwartet wird, dass die Sonden perfekt komplementär mit der Targetsequenz sein werden, dann werden stringente Bedingungen verwendet. Die Hybridisierungsstringenz kann verkleinert werden, wenn eine gewisse Fehlpaarung erwartet wird, zum Beispiel, wenn Varianten erwartet werden, mit dem Ergebnis, dass die Sonde nicht vollständig komplementär sein wird. Es werden Bedingungen gewählt, die nichtspezifische/adventive Bindungen ausschließen, das heißt, die das Rauschen minimieren. Da solche Indikationen neutrale DNS-Polymorphismen sowie Mutationen identifizieren, benötigen diese Indikationen weitere Analysen, um den Nachweis eines KVLQT1-Anfälligkeitsallels zu beweisen.
  • Sonden für KVLQT1-Allele können aus den Sequenzen der KVLQT1-Region oder deren cDNS abgeleitet werden. Die Sonden können jede passende Länge haben, die die gesamte KVLQT1-Region oder einen Abschnitt davon umspannen, und die spezifische Hybridisierung der Region erlauben. Wenn die Targetsequenz eine Sequenz enthält, die mit der der Sonde identisch ist, können die Sonden kurz sein, z. B. im Bereich von etwa 8 bis 30 Basenpaaren, da das Hybrid unter gleichmäßig stringente Bedingungen relativ stabil sein wird. Wenn ein gewisser Grad von Fehlpaarungen bei der Sonde erwartet wird, d. h., wenn befürchtet wird, dass die Sonde zu einer varianten Region hybridisieren wird, kann eine längere Sonde benutzt werden, die zu der Targetsequenz mit der erforderlichen Spezifität hybridisiert.
  • Die Sonden werden ein isoliertes Polynukleotid beinhalten, das an ein Marker- oder Reportermolekül gebunden ist, und verwendet werden kann, um andere Polynukleotidsequenzen durch Standardverfahren zu isolieren, die Sequenzähnlichkeit aufweisen. Für Techniken zum Präparieren und Markieren von Sonden, vgl. z. B. Sambrook et al., 1989 oder Ausubel et al., 1992. Andere ähnliche Polynukleotide können unter Verwendung homologer Polynukleotide selektiert werden. Alternativ können Polynukleotide, die diese oder ähnliche Polypeptide kodieren, unter Verwendung der Redundanz im genetischen Code synthetisiert oder selektiert werden. Verschiedene Codonsubstitutionen können eingeführt werden, z. B. durch stumme Änderungen (wodurch verschiedene Restriktionsstellen produziert werden) oder um die Expression für ein bestimmtes System zu optimieren. Mutationen können eingeführt werden, um die Eigenschaften des Polypeptids zu modifizieren, vielleicht, um Polypeptidabbau oder Umsatzrate zu ändern.
  • Sonden, die synthetische Oligonukleotide oder andere Polynukleotide der vorliegenden Erfindung umfassen, können von natürlich auftretenden oder rekombinanten einzel- oder doppelsträngigen Polynukleotiden abgeleitet, oder chemisch synthetisiert werden. Sonden können ebenfalls durch Nick-Translation, Klenow-Fill-in-Reaktion oder anderen Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, markiert werden.
  • Abschnitte der Polynukleotidsequenz, die mindestens etwa acht Nukleotide, üblicherweise mindestens etwa 15 Nukleotide, und weniger als etwa 6 kb, üblicherweise weniger als etwa 1,0 kb aufweisen, einer Polynukleotidsequenz, die KVLQT1 kodiert, sind als Sonden bevorzugt. Die Sonden können ebenfalls verwendet werden, um zu bestimmen, ob mRNS, die KVLQT1 kodiert, in einer Zelle oder einem Gewebe vorhanden ist.
  • „Regulatorsequenzen" bezieht sich auf jene Sequenzen, normalerweise innerhalb von 100 kb der kodierenden Region eines Locus, aber sie können weiter entfernt von der kodierenden Region sein, die die Expression des Gens (einschließlich Transkription des Gens, und Translation, Splicing, Stabilität oder ähnliche der Messenger-RNS) beeinträchtigen.
  • „Substantielle Homologie oder Ähnlichkeit". Eine Nukleinsäure oder ein Fragment davon ist „substantiell homolog" („oder substantiell ähnlich") zu einem anderen, wenn es, bei optimalem Alignment (mit geeigneten Nukleotidinsertionen oder -deletionen) mit der anderen Nukleinsäure (oder deren komplementärem Strang), eine Nukleotidsequenzidentität in mindestens etwa 60 % der Nukleotidbasen, üblicherweise mindestens etwa 70 %, noch üblicher mindestens etwa 80 %, bevorzugt mindestens etwa 90 %, und stärker bevorzugt mindestens etwa 95 bis 98 % der Nukleotidbasen gibt.
  • Alternativ existiert substantielle Homologie oder (Ähnlichkeit), wenn eine Nukleinsäure oder ein Fragment davon mit einer anderen Nukleinsäure (oder einem komplementären Strang davon) unter selektiven Hybridisierungsbedingungen zu einem Strang oder dessen Komplement hybridisieren. Selektivität der Hybridisierung existiert, wenn die Hybridisierung, die substantiell selektiver ist als das totale Fehlen von Spezifizät, stattfindet. Typischerweise wird eine selektive Hybridisierung stattfinden, wenn es mindestens etwa 55 % Homologie über einen Stretch von mindestens etwa 14 Nukleotiden, bevorzugt mindestens etwa 65 %, stärker bevorzugt mindestens etwa 75 %, und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 90 % gibt. Vgl. Kanehisa, 1984. Die Länge des Homologievergleichs, wie beschrieben, kann über längere Stretches erfolgen, und wird in bestimmten Ausführungsformen häufig über einen Stretch von mindestens etwa neun Nukleotiden, üblicherweise über mindestens etwa 20 Nukleotiden, noch üblicher über mindestens etwa 24 Nukleotiden, typischerweise über mindestens etwa 28 Nukleotiden, stärker typisch über mindestens etwa 32 Nukleotiden, und bevorzugt über mindestens etwa 36 oder mehr Nukleotiden erfolgen.
  • Nukleinsäurehybridisierung wird durch Bedingungen beeinflusst, wie etwa Salzkonzentration, Temperatur oder organisches Lösemittel, zusätzlich zur Basenzusammensetzung, Länge der komplementären Stränge und der Anzahl der Nukleotidbasen-Fehlpaarungen zwischen den hybridisierenden Nukleinsäuren, wie der Fachmann sogleich zu schätzen wissen wird. Stringente Temperaturbedingungen werden im Allgemeinen Temperaturen über 30 °C, typischerweise über 37 °C und bevorzugt über 45 °C beinhalten. Stringente Salzbedingungen werden gewöhnlich weniger als 1.000 mM, typischerweise weniger als 500 mM, und bevorzugt weniger als 200 mM sein. Die Kombination der Parameter ist jedoch wichtiger als das Messen jedes einzelnen Parameters. Vgl. z. B. Wetmur & Davidson, 1968.
  • Sondensequenzen können ebenfalls spezifisch zu Duplex-DNS unter bestimmten Bedingungen hybridisieren, um Triplex oder andere DNS-Komplexe höherer Ordnung zu bilden. Die Herstellung solcher Sonden und passende Hybridisierungsbedingungen sind dem Fachmann gut bekannt.
  • Herstellung rekombinanter oder chemisch synthetisierter Nukleinsäuren; Vektoren, Transformation, Wirtszellen
  • Grosse Mengen der hier beschriebenen Polynukleotide können durch Replikation in einer passenden Wirtszelle produziert werden. Natürliche oder synthetische Polynukleotidfragmente, die für ein gewünschtes Fragment kodieren, werden in rekombinante Polynukleotidkonstrukte, üblicherweise DNS-Konstrukte eingebaut werden, die zur Einführung in und zur Replikation in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Zelle in der Lage sind. Üblicherweise werden die Polynukleotidkonstrukte für die Replikation in einem unizellulären Wirt, wie etwa Hefe oder Bakterien, passend sein, sie können aber auch zur Integration (mit und ohne Integration innerhalb des Genoms) in kultivierte Säugetier- oder Pflanzenzelllinien oder andere eukaryontische Zelllinien bestimmt sein. Die Reinigung der Nukleinsäuren, die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung produziert werden, werden z. B. in Sambrook et al., 1989 oder Ausubel et al., 1992, beschrieben.
  • Die hier beschriebenen Polynukleotide können auch durch chemische Synthese produziert werden, z. B. durch das Phosphoramiditverfahren, beschrieben von Beaucage & Carruthers, 1981 oder dem Triesterverfahren gemäß Matteucci und Caruthers, 1981, und kann auf im Handel erhältlichen, automatisierten Oligonukleotidsynthesizern ausgeführt werden. Ein doppelsträngiges Fragment kann aus dem einzelsträngigen Produkt chemischer Synthese entweder durch Synthetisierung des komplementären Strangs und gemeinsames Annealen des Strangs unter geeigneten Bedingungen oder durch Zugabe des komplementären Strangs unter Verwendung von DNS-Polymerase mit einer geeigneten Primersequenz erhalten werden.
  • Polynukleotidkonstrukte, die zur Einführung in einen prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt hergestellt wurden, können ein vom Wirt erkanntes Replikationssystem umfassen, einschließlich des gesuchten Polynukleotidfragments, das das gewünschte Polypeptid kodiert, und werden bevorzugt ebenfalls Transkription und translationale Initiation-Regulationssequenzen enthalten, die operabel mit dem Polypeptid kodierenden Segment verknüpft sind. Expressionsvektoren können zum Beispiel einen Replikationsstartpunkt oder eine autonom replizierende Sequenz (ARS) und Expressionskontrollsequenzen, einen Promoter, einen Enhancer und notwendige Processing-Informationsstellen, wie etwa Ribosomen-Bindungsstellen, RNS-Spleiß-Stellen, Polyadenylierungsstellen, transkriptionale Terminationssequenzen und mRNS-Stabilisierungssequenzen beinhalten. Solche Vektoren können durch Standard-Rekombinationstechniken hergestellt werden, die dem Fachmann gut bekannt sind, und zum Beispiel in Sambrook et al., 1989 oder Ausubel et al., 1992, beschrieben werden.
  • Ein geeigneter Promoter und andere notwendige Vektorsequenzen werden selektiert werden, so dass sie in dem Wirt funktionell sind, und können, wenn geeignet, jene beinhalten, die auf natürliche Weise mit dem KVLQT1- oder minK-Gen assoziiert sind. Beispiele für verarbeitbare Kombinationen von Zelllinien und Expressionsvektoren werden in Sambrook et al., 1989 oder Ausubel et al., 1992; vgl. auch z. B. Metzger et al., 1988, beschrieben. Viele verwendbare Vektoren sind dem Fachmann bekannt und können von Lieferanten, wie etwa Stratagene, New England Biolabs, Promega Biotech und anderen erhalten werden. Promoter, wie etwa trp, lac und Phagenpromoter, tRNA-Promoter und Glycolyseenzympromoter können in prokaryontischen Wirten verwendet werden. Verwendbare Hefepromoter beinhalten Promoterregionen für Metallothionein, 3-Phosphoglyceratkinase oder andere Glycolyseenzyme, wie etwa Enolase oder Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Enzyme, die für die Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind, und andere. Vektoren und Promoter, die für die Verwendung in der Hefeexpression passend sind, sind ferner in Hitzeman et al., EP 73,675A beschrieben. Geeignete nicht-native Säugetierpromoter können die frühen und späten Promoter von SV40 (Fiers et al., 1978) oder Promoter beinhalten, die von murinen Molony-Leukämie-Virus, Mäusetumorvirus, Vogel-Sarcoma-Viren, Adenovirus II, bovinen Papilloma- Virus oder Polyomavirus abgeleitet sind. Außerdem kann das Konstrukt mit einem amplifizierbaren Gen (z. B. DHFR) verbunden werden, so dass mehrfache Kopien des Gens erstellt werden können. Für geeignete Enhancer und andere Expressionskontrollsequenzen vgl. auch Enhancers und Eukaryotic Gene Expression, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1983).
  • Während solche Expressionsvektoren autonom replizieren können, können sie auch replizieren, indem sie in das Genom der Wirtszelle durch Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, inseriert werden.
  • Expressions- und Klonierungsvektoren werden wahrscheinlich einen selektierbaren Marker enthalten, ein Gen, das ein Protein kodiert, das für das Überleben oder Wachstum einer Wirtszelle notwendig ist, die mit dem Vektor transformiert ist. Die Gegenwart dieses Gens gewährleistet das Wachstum nur jener Wirtszellen, die die Inserts exprimieren. Typische Selektionsgene kodieren Proteine, die a) Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen toxischen Substanzen verleihen, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat usw., b) auxotrophische Defizienzen komplementieren, oder c) kritische Nährstoffe liefern, die aus komplexen Medien nicht verfügbar sind, z. B. die genkodierende D-Alaninracemase für Bacilli. Die Wahl des richtigen selektierbaren Markers wird von der Wirtszelle abhängen, und geeignete Marker für verschiedene Wirte sind dem Fachmann gut bekannt.
  • Die Vektoren, die die interessierenden Nukleinsäuren enthalten, können in vitro transkribiert werden, und die resultierende RNS wird in die Wirtszelle durch gut bekannte Verfahren, z. B. durch Injektion (vgl. Kubo et al., 1988) eingeführt, oder die Vektoren können direkt in die Wirtszellen durch Verfahren eingeführt werden, die dem Fachmann gut bekannt sind, die abhängig von der Art des zellulären Wirts variieren, einschließlich Elektroporation; Transfektion, die Calciumchlorid nutzt, Rubidiumchloridcalciumphosphat, DEAE-Dextran oder andere Substanzen; Mikroprojektil-Bombardement; Lipofektion; Infektion (wobei der Vektor ein infektiöses Mittel, wie etwa einem retroviralen Genom ist); und andere Verfahren. Vgl. allgemein Sambrook et al., 1989, und Ausubel et al., 1992. Auf die Einführung der Polynukleotide in die Wirtszelle durch jedes dem Fachmann bekannte Verfahren, einschließlich, inter alia, jene, die oben beschrieben wurden, wird hier unter „Transformation" Bezug genommen. Die Zellen, in die die oben beschriebenen Nukleinsäuren eingeführt wurden, sollen ebenfalls die Nachkommenschaft solcher Zellen beinhalten.
  • Große Mengen der Nukleinsäuren und Polypeptiden können durch Exprimieren der KVLQT1- oder minK-Nukleinsäure oder Abschnitten davon in Vektoren oder anderen Expressionsvehikeln in kompatible prokaryontische oder eukaryontische Wirtszellen hergestellt werden. Die am häufigsten verwendeten prokaryontischen Wirte sind Stämme von Escherichia coli, auch wenn andere Prokaryoten, wie etwa Bacillus subtilis oder Pseudomonas, ebenfalls verwendet werden können.
  • Säugetierwirtszellen oder andere eukaryontische Wirtszellen, wie etwa jene von Hefe, fädigen Pilzen, Pflanzen, Insekten oder amphibischen oder aviären Spezies, können ebenfalls für die Herstellung der Proteine der vorliegenden Erfindung verwendbar sein. Die Propagierung von Zellen aus Säugetieren in Kultur ist an sich gut bekannt. Vgl. Jakoby und Pastan (Hrsg.), 1979. Beispiele für gewöhnlich verwendete Säugetierwirtszelllinien sind VERO- und HeLa-Zellen, Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO) und WI38, BHK- und COS-Zelllinien, auch wenn es der Fachmann in der Praxis zu schätzen wissen wird, dass andere Zelllinien geeignet sein können, z. B. um höhere Expression, gewünschte Glycosylierungsmuster oder andere Merkmale bereitzustellen.
  • Klone werden durch die Verwendung von Markern selektiert, abhängig vom Modus der Vektorkonstruktion. Der Marker kann auf dem gleichen oder einem anderen DNS-Molekül, bevorzugt dem gleichen DNS-Molekül sein. In prokaryontischen Wirten kann der Transformant z. B. durch Resistenz gegenüber Ampicillin, Tetracyclin oder anderen Antibiotika selektiert werden. Die Herstellung eines bestimmten Produkts auf der Basis der Temperatursensitivät kann ebenfalls als geeigneter Marker dienen.
  • Prokaryontische oder eukaryontische Zellen, die mit den Polynukleotiden der vorliegenden Erfindung transformiert sind, werden nicht nur für die Produktion der Nukleinsäuren und Polypeptide der vorliegenden Erfindung verwendbar sein, sondern zum Beispiel auch bei der Untersuchung der Charakteristika des KVLQT1- oder minK-Polypeptids.
  • Die Sonden und Primer, die auf der hier offenbarten KVLQT1-Gensequenz basieren, werden verwendet, um homologe KVLQT1-Gensequenzen und Proteine in anderen Spezies zu identifizieren. Diese Gensequenzen und Proteine werden in den hier beschriebenen diagnostischen/prognostischen, therapeutischen Verfahren und Verfahren Wirkstoff-Screening für die Spezies verwendet, aus denen sie isoliert wurden.
  • Verwendungsverfahren: Wirkstoff-Screening
  • Die Erfindung ist insbesondere zum Screenen von Verbindungen unter Verwendung von KVLQT1- und minK-Proteinen in transformierten Zellen, transfizierten Oozyten oder transgenen Tieren verwendbar. Da Mutationen entweder im KVLQT1- oder minK-Protein das Funktionieren des kardialen IKs-Kaliumkanals verändern kann, werden Kandidatenwirkstoffe auf Wirkungen auf den Kanal unter Verwendung von Zellen gescreent, die entweder ein normales KVLQT1- oder minK-Protein bzw. ein mutiertes minK- oder KVLQT1-Protein oder ein mutiertes KVLQT1- und ein mutiertes minK-Protein enthalten. Der Wirkstoff wird den Zellen in Kultur zugefügt oder einem transgenen Tier verabreicht, und die Wirkung auf den induzierten Strom des IKs-Kaliumkanals wird mit dem induzierten Strom einer Zelle oder eines Tieres verglichen, das das Wildtyp-KVLQT1 und -minK enthält. Wirkstoffkandidaten, die den induzierten Strom auf ein normaleres Level verändern, sind für die Behandlung oder Vorbeugung von LQT verwendbar.
  • Verwendungsverfahren: Nukleinsäurediagnose und Diagnosekits
  • Um die Gegenwart von einem KVLQT1- oder minK-Allel zu ermitteln, das ein Individuum für LQT prädisponiert, wird eine biologische Probe, wie etwa eine Blutprobe präpariert und auf die Gegenwart oder Abwesenheit von Anfälligkeitsallelen von KVLQT1 oder minK analysiert. Um die Gegenwart von LQT zu ermitteln oder als Prognoseindikator wird eine biologische Probe präpariert und auf die Gegenwart oder Abwesenheit von mutierten KVLQT1- oder minK-Allelen analysiert. Die Ergebnisse dieser Tests und die Auslegungsinformationen werden dem Erbringer der Gesundheitsleistungen zur Mitteilung an das geteste Individuum zurückgegeben. Solche Diagnosen können durch Diagnoselabore ausgeführt werden oder es werden alternativ Diagnosekits gefertigt und an Erbringer von Gesundheitsleistungen oder an private Individuen zur Selbstdiagnose verkauft.
  • Anfänglich beinhaltet das Screeningverfahren die Amplifikation der relevanten KVLQT1- oder minK-Sequenzen. In einem anderen Aspekt beinhaltet das Screeningverfahren eine nicht-PCR-basierte Strategie.
  • Solche Screeningverfahren beinhalten Zwei-Schritt-Marker-Amplifikationmethoden, die dem Fachmann gut bekannt sind. Sowohl PCR-basierte als auch nicht-PCR-basierte Screeningstrategien können Targetsequenzen mit einem hohen Anfälligkeitslevel ermitteln.
  • Das populärste Verfahren, das heute verwendet wird, ist die Targetamplifikation. Hier wird die Targetnukleinsäuresequenz mit Polymerasen amplifiziert. Ein besonders bevorzugtes Verfahren unter Verwendung von Polymerase-angetriebener Amplifikation ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Die Polymerasekettenreaktion und andere Polymerase-angetriebene Amplifikationsassays können durch die Verwendung von Polymerase-angetriebenen Amplifikationszyklen einen mehr als millionenfachen Anstieg der Kopienzahl erreichen. Sobald sie amplifiziert ist, kann die resultierende Nukleinsäure sequenziert oder als Substrat für DNS-Sonden verwendet werden.
  • Wenn die Sonden verwendet werden, um die Gegenwart der Targetsequenzen zu ermitteln, kann die biologische Probe, die zu analysieren ist, wie etwa Blut oder Serum, wenn gewünscht, behandelt werden, um die Nukleinsäuren zu extrahieren. Die Nukleinsäure der Probe kann auf verschiedene Arten präpariert werden, um den Nachweis der Targetsequenz zu erleichtern, z. B. Denaturierung, Restriktionsverdauung, Elektrophorese oder Dot-Blotting. Die targetierte Region der Analytnukleinsäure muss üblicherweise mindestens teilweise einzelsträngig sein, um Hybride mit der targetierenden Sequenz der Sonde zu bilden. Wenn die Sequenz auf natürliche Weise einzelsträngig ist, wird eine Denaturierung nicht erforderlich sein. Wenn jedoch die Sequenz doppelsträngig ist, wird die Sequenz wahrscheinlich denaturiert werden müssen. Die Denaturierung kann mit verschiedenen Techniken durchgeführt werden, die dem Fachmann bekannt sind.
  • Die Analytnukleinsäure und die Sonde werden unter Bedingungen inkubiert, die stabile Hybridbildung der Targetsequenz in der Sonde mit der putativen targetierten Sequenz in dem Analyten fördern.
  • Die Region der Sonden, die verwendet wird, um an den Analyten zu binden, können vollständig komplementär zur targetierten Region des menschlichen Chromosoms 11 für KVLQT1 gemacht werden. Daher sind Bedingungen hoher Stringenz wünschenswert, um falsch-positiven Ergebnissen vorzubeugen. Jedoch werden Bedingungen hoher Stringenz nur verwendet, wenn die Sonden komplementär zu Regionen des Chromosoms sind, die in dem Genom einzigartig sind. Die Stringenz der Hybridisierung wird durch eine Anzahl von Faktoren während der Hybridisierung und während der Waschprozedur bestimmt, einschließlich Temperatur, Ionenstärke, Basenzusammensetzung, Sondenlänge und Formamidkonzentration. Diese Faktoren werden zum Beispiel in Maniatis et al., 1982 und Sambrook et al., 1989, umrissen. Unter gewissen Umständen kann die Bildung von Hybriden höherer Ordnung, wie etwa Triplexen, Quadruplexen usw. gewünscht werden, um die Mittel zum Nachweis von Targetsequenzen bereitzustellen.
  • Der Nachweis, wenn vorhanden, des resultierenden Hybrids wird üblicherweise durch die Verwendung markierter Sonden erreicht. Alternativ kann die Sonde unmarkiert sein, kann aber durch spezifische Bindung mit einem Liganden ermittelbar sein, der entweder direkt oder indirekt markiert ist. Geeignete Marker und Verfahren zum Markieren von Sonden und Liganden sind dem Fachmann bekannt, und beinhalten zum Beispiel radioaktive Marker, die durch bekannte Verfahren eingebaut werden können (z. B. Nick-Translation, Random Priming oder Kinasierung), Biotin, fluoreszierende Gruppen, chemilumineszierende Gruppen (z. B. Dioxetane, besonders getriggerte Dioxetane), Enzyme, Antikörper und ähnliche. Variationen dieses Grundschemas sind dem Fachmann bekannt und beinhalten jene Variationen, die die Separation der Hybride erleichtern, die aus Fremdstoffen ermittelt werden und/oder die das Signal aus der markierten Hälfte amplifizieren. Eine Anzahl dieser Variationen werden z. B. in Matthews & Kricka, 1988; Landegren et al., 1988; der US-Patentschrift 4,868,105; und in der EPO-Veröffentlichung mit der Nr. 225,807 untersucht.
  • Wie oben vermerkt, werden auch nicht-PCR-basierte Screeningassays in Erwägung gezogen. Diese Prozedur hybridisiert eine Nukleinsäuresonde (oder ein Analog, wie etwa eine Methylphosphonathauptkette, die den normalen Phosphodiester ersetzt), auf das Niedriglevel-DNS-Target. Diese Sonde kann ein Enzym aufweisen, das mit der Sonde kovalent verknüpft ist, so dass die kovalente Verknüpfung die Spezifität der Hybridisierung nicht stört. Dieser Enzym-Sonden-Konjugat-Targetnukleinsäurekomplex kann dann von dem freien Sondenenzymkonjugat weg isoliert werden und es wird ein Substrat zum Enzymnachweis zugefügt. Die enzymatische Aktivität wird als eine Änderung bei der Farbentwicklung oder der Lumineszenzausgabe beobachtet, die in einem 103 bis 106 Anstieg an Anfälligkeit resultiert. Für ein Beispiel bezüglich der Herstellung der Oligodesoxynukleotid alkalischen Phosphatasekonjugate und deren Verwendung als Hybridisierungssonden vgl. Jablonski et al., 1986.
  • Methoden für die Zwei-Schritt-Marker-Amplifikation sind dem Fachmann bekannt. Diese Assays arbeiten nach dem Prinzip, dass ein kleiner Ligand (wie etwa Digoxigenin, Biotin oder ähnliche) an eine Nukleinsäuresonde angehängt werden, die in der Lage ist, spezifisch an KVLQT1 zu binden. Allel-spezifische Sonden werden ebenfalls innerhalb des Umfangs dieses Beispiels in Erwägung gezogen und exemplarische Allel-spezifische Sonden beinhalten Sonden, die die prädisponierenden Mutationen dieser Patentanmeldung einschließen.
  • In einem Beispiel wird der kleine Ligand, der an die Nukleinsäuresonde angehängt ist, von einem Antikörper-Enzymkonjugat spezifisch erkannt. In einer Ausführungsform dieses Beispiels, wird Digoxigenin an die Nukleinsäuresonde angehängt. Die Hybridisierung wird durch einen alkalischen Phosphatasekonjugatantikörper ermittelt, der über einem chemilumineszierenden Substrat gedreht wird. Für Verfahren zum Markieren von Nukleinsäuresonden gemäß dieser Ausführungsform vgl. Martin et al., 1990. In einem zweiten Beispiel wird der kleine Ligand von einem zweiten Ligand-Enzym-Konjugat erkannt, das in der Lage ist, spezifisch an dem ersten Liganden zu komplexieren. Eine gut bekannte Ausführungsform dieses Beispiels ist der Biotin-Avidin-Interaktionstyp. Für Verfahren zum Markieren von Nukleinsäuresonden und deren Verwendung in Biotin-Avidin-basierten Assays vgl. Rigby et al., 1977 und Nguyen et al., 1992.
  • Es wird ebenfalls in Erwägung gezogen, dass die Nukleinsäuresondenassays dieser Erfindung einen Cocktail von Nuklensäuresonden nutzen werden, die in der Lage sind, KVQT1 oder minK zu ermitteln. Somit werden in einem Beispiel zum Nachweis der Gegenwart von KVLQT1 in einer Zellprobe mehr als eine Sonde benutzt, die zu dem Gen komplementär ist, und insbesondere die Anzahl der verschiedenen Sonden alternativ zwei, drei oder fünf verschiedene Nukleinsäuresondensequenzen beträgt. In einem anderen Beispiel zum Nachweis der Gegenwart von Mutationen in der KVLQT1-Gensequenz eines Patienten wird mehr als eine Sonde benutzt, die komplementär zu diesen Genen ist, wobei der Cocktail Sonden beinhaltet, die in der Lage sind, an die Allel-spezifischen Mutationen zu binden, die in Populationen von Patienten mit Veränderungen in KVLQT1 identifiziert wurden. In dieser Ausführungsform kann jede Anzahl von Sonden verwendet werden und sie wird bevorzugt Sonden beinhalten, die den wichtigsten Genmutationen entsprechen, die als jene identifiziert wurden, die ein Individuum für LQT prädisponieren.
  • Verwendungsverfahren: Peptiddiagnose und Diagnosekits
  • Die Gegenwart von LQT kann ebenfalls auf der Basis der Veränderung von Wildtyp-KVLQT1- oder -minK-Polypeptid ermittelt werden. Solche Veränderungen können durch Sequenzanalyse gemäß herkömmlicher Techniken bestimmt werden. Stärker bevorzugt werden (polyklonale oder monoklonale) Antikörper verwendet, um Differenzen in, oder die Abwesenheit von KVLQT1- oder minK-Peptiden zu ermitteln. Techniken zum Züchten und Reinigen von Antikörpern sind dem Fachmann gut bekannt und jede solcher Techniken kann gewählt werden, um die Präparationen, die in dieser Erfindung beansprucht werden, zu erreichen. Antikörper werden KVLQT1- oder minK-Protein aus einer Lösung immunpräzipitieren sowie mit diesen Proteinen auf Western- oder Immunoblots aus Polyacrylamidgelen reagieren. Antikörper können KVLQT1- oder minK-Proteine auch in Paraffin oder gefrorenen Gewebesektionen unter Verwendung immunzytochemischer Techniken ermitteln.
  • Bevorzugt sind ebenfalls Verfahren zum Nachweis von KVLQT1 oder minK oder deren Mutationen einschließlich enzymgekoppelte Immunadsorptionsassays (ELISA), Radio-Immunoassays (RIA), immunoradiometrische Assays (IRMA) und immunenzymatische Assays (IEMA), einschließlich Sandwichassays, unter Verwendung monoklonaler und/oder polyklonaler Antikörper. Exemplarische Sandwichassays werden von David et al., in den US-Patentschriften mit den Nummern 4,376,110 und 4,486,530 beschrieben.
  • Verwendungsverfahren: Gentherapie
  • Es wird auch ein Verfahren zum Liefern einer Wildtyp-KVLQT1- oder minK-Funktion an eine Zelle bereitgestellt, die ein mutiertes KVLQT1- bzw. minK-Allel trägt. Das Liefern einer solchen Funktion sollte das normale Funktionieren der Empfängerzellen ermöglichen. Das Wildtyp-Gen oder ein Teil des Gens kann in einem Vektor in die Zelle eingeführt werden, so dass das Gen extrachromosomal bleibt. In einer solchen Situation wird das Gen durch die Zelle von einer extrachromosomalen Lage aus exprimiert werden. Stärker bevorzugt ist die Situation, in der das Wildtyp-Gen oder ein Teil davon in die mutierte Zelle auf eine solche Weise eingeführt wird, dass es mit dem endogenen mutierten Gen rekombiniert, das in der Zelle vorhanden ist. Eine solche Rekombination erfordert ein doppeltes Rekombinationsereignis, dass in der Korrektur der Genmutation resultiert. Vektoren für die Einführung von Genen sowohl zur Rekombination als auch zur extrachromosomalen Erhaltung sind dem Fachmann bekannt, und es kann jeder passende Vektor verwendet werden. Verfahren zum Einführen von DNS in Zellen, wie etwa Elektroporation, Calciumphosphatcopräzipitation und virale Transduktion sind dem Fachmann bekannt, und die Wahl des Verfahrens liegt im Ermessen des Praktikers.
  • Wie oben allgemein diskutiert, kann das KVLQT1- oder minK-Gene oder Fragment, wo zutreffend, in Gentherapieverfahren benutzt werden, um die Menge der Expressionsprodukte eines solchen Gens in Zellen zu erhöhen. Es kann ebenfalls nützlich sein, das Expressionslevel eines gegebenen LQT-Gens sogar in jenen Herzzellen zu erhöhen, in denen das mutierte Gen auf einem „normalen" Level exprimiert wird, das Genprodukt jedoch nicht völlig funktionell ist.
  • Die Gentherapie würde gemäß allgemein anerkannter Verfahren ausgeführt, zum Beispiel wie von Friedman, 1991, beschrieben. Zellen eines Patienten würden zuerst mit den oben beschriebenen Diagnoseverfahren analysiert, um die Produktion von KVLQT1- oder minK-Polypeptid in den Zellen festzustellen. Ein Virus oder Plasmidvektor (vgl. unten für weitere Details), der eine Kopie des KVLQT1- oder minK-Gens enthält, das an Expressionskontrollelemente gekoppelt ist, und in der Lage ist, innerhalb der Zellen zu replizieren, wird präpariert. Passende Vektoren sind bekannt, wie in der US-Patentschrift Nr. 5,252,479 und der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 93/07282 offenbart. Der Vektor wird dann in den Patienten injiziert. Wenn das transfizierte Gen nicht permanent in das Genom jeder der targetierten Zellen eingebaut wird, muss die Behandlung möglicherweise regelmäßig wiederholt werden.
  • Gentransfersysteme, die dem Fachmann bekannt sind, können in der Praxis von Gentherapieverfahren der vorliegenden Erfindung verwendbar sein. Diese beinhalten virale und nichtvirale Transferverfahren. Eine Anzahl von Viren wurden als Gentransfervektoren verwendet, einschließlich Papovaviren (z. B. SV40, Madzak et al., 1992), Adenovirus (Berkner, 1992; Berkner et al., 1988; Gorziglia und Kapikian, 1992; Quantin et al., 1992; Rosenfeld et al., 1992; Wilkinson et al., 1992; Stratford-Perricaudet et al., 1990), Vakziniavirus (Moss, 1992), adenoassoziiertes Virus (Muzyczka, 1992; Ohi et al., 1990), Herpesviren einschließlich HSV und EBV (Margolskee, 1992; Johnson et al., 1992; Fink et al., 1992; Breakfield und Geller, 1987; Freese et al., 1990) und Retroviren aviären (Brandyopadhyay und Temin, 1984; Petropoulos et al., 1992), murinen (Miller, 1992; Miller et al., 1985; Sorge et al., 1984; Mann und Baltimore, 1985; Miller et al., 1988), und menschlichen Ursprungs (Shimada et al., 1991; Helseth et al., 1990; Page et al., 1990; Buchschacher und Panganiban, 1992). Die meisten menschlichen Gentherapieprotokolle basierten auf deaktivierten murinen Retroviren.
  • Nichtvirale Gentransferverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, beinhalten chemische Techniken, wie etwa Calciumphosphatcopräzipitation (Graham und van der Eb, 1973; Pellicer et al., 1980); mechanische Techniken, zum Beispiel Mikroinjektion (Anderson et al., 1980; Gordon et al. 1980; Brinster et al., 1981; Constantini und Lacy, 1981); membranfusionsvermittelter Transfer über Liposome (Felgner et al., 1987; Wang und Huang, 1989; Kaneda et al., 1989; Stewart et al., 1992; Nabel et al., 1990; Lim et al., 1992); und direkte DNS-Aufnahme und rezeptorvermittelter DNS-Transfer (Wolff et al., 1990; Wu et al., 1991; Zenke etal., 1990; Wu et al., 1989; Wolff et al., 1991; Wagner et al., 1990; Wagner et al., 1991; Cotten et al., 1990; Curiel et al., 1991a; Curiel et al., 1991b).
  • In einem Ansatz, der biologische und physikalische Gentransferverfahren kombiniert, wird die Plasmid-DNS jeder Größe mit einem Polylysin-konjugierten Antikörper kombiniert, der spezifisch zu dem Adenovirushexonprotein ist, und der resultierende Komplex wird an einen Adenovirusvektor gebunden. Der trimolekulare Komplex wird dann verwendet, um Zellen zu infizieren. Der Adenovirusvektor erlaubt die effiziente Bindung, Internalisierung und den Abbau des Endosoms bevor die gekoppelte DNS beschädigt wird.
  • Liposom/DNS-Komplexe haben gezeigt, dass sie in der Lage sind, direkten in vivo Gentransfer zu vermitteln. Während in Standard-Liposom-Präparationen der Gentransferprozess nicht spezifisch ist, wurde über lokalisierte in vivo Aufnahme und Expression in Tumordepots berichtet, zum Beispiel, nach direkter In-situ-Verabreichung (Nabel, 1992).
  • Gentransfertechniken, die DNS direkt auf das Herzgewebe targetieren sind bevorzugt. Rezeptorvermittelter Gentransfer wird zum Beispiel durch die Konjugation von DNS (üblicherweise in Form von kovalent geschlossenem supergeknäultem Plasmid) an einen Proteinliganden mittels Polylysin erreicht. Die Liganden werden auf der Basis der Gegenwart des entsprechenden Ligandenrezeptors auf der Zelloberfläche der Targetzelle/Gewebtyps gewählt. Diese Liganden-DNS-Konjugate können, wenn gewünscht, direkt in das Blut injiziert werden, und sind auf das Targetgewebe gerichtet, in dem die Rezeptorbindung und die Internalisierung des DNS-Proteinkomplexes stattfindet. Um das Problem der intrazellulären Zerstörung von DNS zu überwinden, kann die Coinfektion mit Adenovirus eingeschlossen werden, um die Endosomfunktion zu unterbrechen.
  • Die Therapie ist wie folgt: Patienten, die ein KVLQT1- oder minK-Anfälligkeitsallel tragen, werden mit einem Genabgabevehikel behandelt, so dass einige oder alle ihrer Herzvorläuferzellen mindestens eine zusätzliche Kopie eines funktionellen normalen KVLQT1- oder minK-Allels aufnehmen. In diesem Schritt haben die behandelten Individuen in dem Masse ein reduziertes LQT-Risiko, in dem der Wirkung des anfälligen Allels durch die Gegenwart des normalen Allels entgegengewirkt wurde.
  • Verwendungsverfahren: transformierte Wirte
  • Tiere zum Testen therapeutischer Stoffe können nach der Mutagenese des gesamten Tiers oder nach der Behandlung von Keimbahnzellen oder Zygoten selektiert werden. Solche Behandlungen beinhalten die Insertion mutierter KVLQT1- und/oder minK-Allele, üblicherweise aus einer zweiten Tierspezies, sowie die Insertion zerstörter homologer Gene. Alternativ kann das endogene KVLQT1- oder minK-Gen der Tiere durch Insertion oder Deletion, Mutation oder andere gentechnische Veränderungen, unter Verwendung herkömmlicher Techniken zerstört werden (Capecchi, 1989; Valancius und Smithies, 1991; Hasty et al., 1991; Shinkai et al., 1992; Mombaerts et al., 1992; Philpott et al., 1992; Snouwaert et al., 1992; Donehower et al., 1992). Nachdem den Tieren Testsubstanzen verabreicht wurden, muss die Gegenwart von LQT bewertet werden. Wenn die Testsubstanz dem Auftreten von LQT vorbeugt oder es unterdrückt, dann ist die Testsubstanz ein Kandidat für einen therapeutischen Stoff für die Behandlung von LQT. Diese Tiermodelle stellen ein äußerst wichtiges Testvehikel für potentielle therapeutische Produkte bereit.
  • Zwei Strategien wurden hier genutzt, um LQT-Gene zu identifizieren, ein Kandidatengenansatz und Positionsklonierung. Positionsinformationen sind jetzt für drei LQT-Loci verfügbar, wobei LQT1 auf dem Chromosom 11p15.5 kartiert wurde (Keating et al., 1991a; Keating et al., 1991b), LQT2 auf 7g35-36 und LQT3 auf 3p21-24 (Jiang et al., 1994). Die vorliegende Erfindung hat auch minK auf Chromosom 21 als ein LQT-Gen identifiziert. Der Kandidatengenansatz hängt von wahrscheinlichen mechanistischen Hypothesen ab, die auf Physiologie basieren. Auch wenn über die Physiologie von LQT wenig bekannt ist, so ist die Störung mit der Verlängerung des QT-Intervalls auf Elektrokardiogrammen assoziiert, einem Zeichen für abnorme kardiale Repolarisation. Diese Assoziation legt nahe, dass Gene, die Ionenkanäle kodieren, oder deren Modulatorsubstanzen, berechtigte Kandidaten für LQT sind. Diese Hypothese wird nun durch die Entdeckung gestützt, dass Chromosom-7-gekoppeltes LQT aus Mutationen in HERG resultiert, einem putativen kardialen Kaliumkanalgen. Ein neuroendokrines Kalziumkanalgen (CACNL1A2; Chin et al., 1991; Seino et al., 1992) und ein Gen, das ein GTP-Bindeprotein kodiert, das Kaliumkanäle moduliert (GNAI2; Weinstein et al., 1988; Magovcevic et al., 1992) wurden, basierend auf ihrer chromosomalen Lage, Kandidaten für LQT3. Durch anschließende Kopplungsanalysen wurden diese Gene jedoch ausgeschlossen (Wang und Keating, unveröffentlichte Daten). Es wurde nun gezeigt, dass LQT3 mit SCN5A assoziiert ist (Wang et al., 1995a). Trotz beträchtlicher Anstrengung war jedoch ein Kandidatengenansatz für mit Chromosom 11 gekoppeltes LQT nicht erfolgreich. Zwei Kaliumkanalgene (KCNA4 und KCNC1) wurden auf dem kurzen Arm des Chromosoms 11 (Wymore et al., 1994) kartiert, aber beide wurden als Kandidaten für LQT1 durch Kopplungsanalysen ausgeschlossen (Russell et al., 1995; die vorliegende Untersuchung). Alle anderen zuvor charakterisierten kardialen Kalium-, Chlorid-, Natrium- und Calciumkanalgene wurden auf ähnliche Weise auf der Basis ihren chromosomalen Lagen ausgeschlossen. Die vorliegende Untersuchung hat Positionsklonierung und Mutationsanalysen verwendet, um LQT1 zu identifizieren.
  • Die vorliegende Erfindung hat genotypische Analysen verwendet, um zu zeigen, dass bei 16 nicht miteinander verwandten Familien KVLQT1 eng an LQT1 gekoppelt ist (Details werden in den Beispielen bereitgestellt). KVLQT1 ist ein putatives kardiales Kaliumkanalgen und verursacht die an das Chromosom 11 gekoppelte Form von LQT. Genetische Analysen legten nahe, dass KVLQT1 einen spannungskontrollierten Kaliumkanal mit funktioneller Bedeutung in der kardialen Repolarisierung kodiert, und es wird nun gezeigt, dass KVLQT1 mit minK coassembliert, um einen kardialen IKs-Kaliumkanal zu bilden. Wenn das korrekt ist, dann ist der Mechanismus von mit Chromosom 11 gekoppeltem LQT möglicherweise am reduzierten repolarisierenden KVLQT1-Strom beteiligt. Da angenommen wird, dass Kaliumkanäle mit sechs Transmembrandomänen aus Homo- oder Heterotetrameren gebildet werden (MacKinnon, 1991; MacKinnon et al., 1993; Covarrubias et al., 1991), ist es möglich, dass LQT-assozierte Mutationen von KVLQT1 durch einen dominant-negativen Mechanismus wirken. Die Art und die Lage der hier beschriebenen KVLQT1-Mutationen sind mit dieser Hypothese konsistent. Die resultierende Unterdrückung der Kaliumkanalfunktion würde ihrerseits wahrscheinlich zu abnormaler kardialer Repolarisation und einem erhöhten Risiko für ventrikuläre Tachyarrhythmien führen. Die in HERG identifizierten Mutationen und die Biophysik der Kaliumkanal-Alphauntereinheiten legen nahe, dass mit Chromosom 7 gekoppeltes LQT aus dominant-negativen Mutationen resultiert und dass daraus eine Reduktion an funktionellen Kanälen resultiert. In mit Chromosom 3 gekoppeltem LQT resultieren dagegen die LQT-assoziierten Deletionen, die in SCN5A identifiziert wurden, wahrscheinlich in funktionellen kardialen Natriumkanälen mit veränderten Eigenschaften, wie etwa verzögerte Inaktivierung oder veränderte Spaltungsabhängigkeit der Kanalinaktivierung. Verzögerte Natriumkanalinaktivierung würde den einwärts gerichteten Natriumstrom erhöhen und dadurch die Membran depolarisieren. Diese Wirkung ist ähnlich dem veränderten Membranpotential, das von HERG-Mutationen erwartet wird, wobei der auswärtsgerichtete Kaliumstrom verringert ist. Es ist unwahrscheinlich, dass mehr schädliche Mutationen von SCNSA LQT verursachen würden. Man würde zum Beispiel erwarten, dass eine Reduktion der gesamten Anzahl der kardialen Natriumkanäle die Dauer des Aktionspotentials reduzieren würde, ein phänotypgegensatz zu dem von LQT.
  • Präsymptomatische Diagnose von LQT hing von der Identifikation der QT-Verlängerung auf Elektrokardiogrammen ab. Leider werden Elektrokardiogramme nur selten bei jungen, gesunden Individuen durchgeführt. Außerdem haben viele LQT-Genträger relativ normale QT-Intervalle und das erste Zeichen der Krankheit kann eine tödliche kardiale Arrhythmie sein (Vincent et al., 1992). Jetzt, da ein drittes LQT-Gen (KVLQT1) identifiziert wurde und minK ebenfalls mit LQT assoziiert wurde, kann ein Gentest für diese Störung in Erwägung gezogen werden. Dies wird fortgesetzte Mutationsanalysen und die Identifikation zusätzlicher LQT-Gene erfordern. Mit ausführlicheren phänotypischen Analysen könnten phänotypische Differenzen zwischen den verschiedenen Formen von LQT entdeckt werden. Diese Differenzen können für die Diagnose und Behandlung verwendbar sein.
  • Die Identifikation der Assoziation zwischen den SCN5A-, HERG- und KVLQT1-Genmutationen und LQT erlaubt das frühe präsymptomatische Screenen von Individuen, um jene mit dem Risiko, LQT zu entwickeln, zu identifizieren. Um solche Individuen zu identifizieren, werden die SCNSA-, HERG- und/oder KVQT1-Allele entweder direkt oder nach dem Klonieren der Allele auf Mutationen gescreent. Mutationen in minK können auf ähnliche Weise entdeckt werden. Die Allele werden auf die Gegenwart von Nukleinsäuresequenzdifferenzen zum normalen Allel getestet, unter Verwendung jeder passenden Technik, einschließlich, aber nicht beschränkt auf eine der folgenden Verfahren: Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH), direkte DNS-Sequenzierung, PFGE-Analyse, Southern-Blot-Analyse, Einzelstrang-Konformations-Analyse (SSCP), Kopplungsanalyse, RNase-Schutz-Assay, (ASO) Allel-spezifische Oligonukleotid-Dot-Blot-Analyse und PCR-SSCP-Analyse. Zum Beispiel entweder (1) die Nukleotidsequenz beider klonierter Allele und des normalen KVLQT1-Gens oder ein geeignetes Fragment (kodierende Sequenz oder genomische Sequenz) bestimmt und dann verglichen, oder (2) die RNS-Transkripte des KVLQT1-Gens oder des Genfragments werden zu einzelsträngiger ganzer genomischer DNS von einem zu testenden Individuum hybridisiert, und das resultierende Heteroduplex wird mit Ribonuklease A (RNase A) behandelt und auf einem denaturierenden Gel laufen gelassen, um die Lage aller Fehlpaarungen zu ermitteln. Zwei dieser Verfahren können gemäß den folgenden Prozeduren durchgeführt werden.
  • Die Allele des KVLQT1- oder minK-Gens in einem zu testenden Individuum werden unter Verwendung herkömmlicher Techniken kloniert. Zum Beispiel wird eine Blutprobe von einem Individuum erhalten. Die aus den Zellen in dieser Probe isolierte genomische DNS wird auf eine durchschnittliche Fragmentgröße von ungefähr 20 kb teilweise verdaut. Fragmente im Bereich zwischen 18 bis 21 kb werden isoliert. Die resultierenden Fragmente werden in einen geeigneten Vektor ligiert. Die Sequenzen der Klone werden dann bestimmt und mit dem normalen KVLQT1- oder minK-Gen verglichen.
  • Alternativ werden Polymerase-Kettenreaktionen (PCRs) mit den Primerpaaren der 5'-Region oder den Exons des KVLQT1-Gens ausgeführt. PCRs können auch mit Primerpaaren ausgeführt werden, die auf jeder Sequenz des normalen KVQT1-Gens basieren. Zum Beispiel können Primerpaare für eines der Introns hergestellt und verwendet werden. Schließlich kann PCR auch auf der mRNS durchgeführt werden. Die amplifizierten Produkte werden dann durch Einzelstrang-Konformations-Polymorphismen (SSCP) unter Verwendung herkömmlicher Techniken analysiert, um alle Differenzen zu identifizieren und diese werden dann sequenziert und mit der normalen Gensequenz verglichen.
  • Individuen können schnell auf verbreitete KVLQT1- oder minK-Genvarianten durch Amplifizieren der DNS des Individuums unter Verwendung passender Primerpaare und Analysieren des amplifizierten Produkts, z. B. durch Dot-Blot-Hybridisierung unter Verwendung Allel-spezifischer Oligonukleotidsonden gescreent werden.
  • Das zweite Verfahren benutzt RNase A, um beim Nachweis von Differenzen zwischen dem normalen KVLQT1- oder minK-Gen und defektiven Genen mitzuhelfen. Dieser Vergleich wird in Schritten ausgeführt, unter Verwendung kleiner (500 bp) Restriktionsfragmente des KVLQT1- oder minK-Gens als Sonde. Zuerst wird das KVLQT1- oder minK-Gen mit einem Restriktionsenzyme(n) verdaut, dass die Gensequenz in Fragmente von ungefähr 500 bp schneidet. Diese Fragmente werden auf einem Elektrophoresegel separiert, aus dem Gel gereinigt und einzeln in beide Orientierungen in einen SP6-Vektor (z. B. pSP64 oder pSP65) kloniert. Die SP6-basierten Plasmide, die Inserts der KVLQT1- oder minK-Genfragmente enthalten, werden in vitro in das SP6-Transkriptionssystem transkribiert, das dem Fachmann gut bekannt ist, in Gegenwart von [α-32P]GTP, das radioaktiv markierte RNS-Transkripte beider Gene generiert.
  • Diese RNS-Transkripte werden einzeln verwendet, um unter Verwendung herkömmlicher Techniken Heteroduplexe mit der Allel-DNS zu bilden. Fehlpaarungen, die in dem RNS:DNS-Heteroduplex auftreten, die auf Sequenzdifferenzen zwischen dem KVLQT1- oder minK-Fragment und dem KVLQT1- oder minK-Allelsubklon des Individuums zurückzuführen sind, resultieren bei RNase-A-Behandlung in Spaltung im RNS-Strang. Solche Fehlpaarungen können das Ergebnis von Punktmutationen oder kleinen Deletionen in dem Allel des Individuums sein. Die Spaltung des RNS-Strangs erbringt zwei oder mehrere kleine RNS-Fragmente, die auf dem denaturierenden Gel schneller laufen als die RNS-Sonde selbst.
  • Alle Differenzen, die gefunden werden, werden ein Individuum, das eine molekulare Variante des KVLQT1- oder minK-Gens aufweist und die daraus folgenden Gegenwart des Long-QT-Syndroms identifizieren. Diese Varianten können eine Anzahl von Formen annehmen. Die schwerwiegendsten Formen wären Rasterverschiebungsmutationen oder große Deletionen, die Ursache dafür wären, dass das Gen für ein abnormes Protein kodiert oder eines, das die Proteinexpression signifikant verändern würde. Weniger schwerwiegende disruptive Mutationen würden kleine In-Frame-Deletionen und nichtkonservative Basenpaarsubstitutionen beinhalten, die eine signifikante Wirkung auf das produzierte Protein haben würden, wie etwa Änderungen zu oder von einem Cysteinrest, von einer basischen zu einer azidischen Aminosäure und umgekehrt, von einer hydrophoben zu einer hydrophilen Aminosäure oder umgekehrt, oder andere Mutationen, die die sekundäre oder tertiäre Proteinstruktur beeinträchtigen würden. Von stillen Mutationen oder solchen, die in konservativen Aminosäuresubstitutionen resultieren, würde im Allgemeinen keine Disruption der Proteinfunktion erwartet.
  • Genetische Tests werden Ärzte in die Lage versetzen, Individuen mit einem Risiko für LQT bei oder sogar vor der Geburt zu identifizieren. Präsymptomatische Diagnose von LQT wird eine Vorbeugung dieser Störungen ermöglichen. Bestehende medizinische Therapien, einschließlich Betarezeptorenblocker, können dem Auftreten von Problemen, die mit dieser Krankheit assoziiert sind, vorbeugen und sie verzögern. Schließlich ändert diese Erfindung unser Verständnis der Ursache und die Behandlung einer verbreiteten Herzerkrankung wie kardiale Arrhythmien, die für 11 aller natürlichen Todesfälle verantwortlich sind. Die bestehende Diagnose konzentrierte sich auf das Messen des QT-Intervalls aus Elektrokardiogrammen. Dieses Verfahren ist kein völlig exakter Indikator für die Gegenwart des Long-QT-Syndroms. Die vorliegende Erfindung ist ein exakterer Indikator für die Gegenwart der Erkrankung. Genetische Tests und verbessertes mechanistisches Verständnis von LQT stellt die Möglichkeit der Vorbeugung lebensbedrohlicher Arrhythmien durch rationale Therapien bereit. Es ist zum Beispiel möglich, dass kaliumkanalöffnende Mittel das Risiko von Arrhythmien bei Patienten mit KVLQT1-, minK- oder HERG-Mutationen reduzieren werden; Natriumkanal blockierende Mittel dagegen könnten eine wirksamere Behandlung für Patienten mit Mutationen sein, die die Funktion von SCN5A verändern. Schließlich können diese Untersuchungen Einblick in die Mechanismen bereitstellen, die verbreiteten Arrhythmien zugrunde liegen, da diese Arrhythmien häufig mit abnormer kardialer Repolarisation assoziiert werden und aus einer Kombination von erblichen und erworbenen Faktoren resultieren können.
  • Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen ausführlicher erläutert, die zur Illustration angeboten werden, und die die Erfindung auf keinerlei Weise beschränken sollen. Es werden Standardtechniken, die dem Fachmann gut bekannt sind, oder Techniken, die nachfolgend spezifisch beschrieben werden, genutzt.
  • BEISPIEL 1
  • Verfahren zur phänotypischen Bewertung
  • Für diese Untersuchungen wurden sechs große LQT-Familienstämme (K1532, K1723, K2605, K1807, K161 und K162) sowie einige kleine Familienstämme und sporadische Fälle untersucht. LQT-Patienten wurden von medizinischen Kliniken aus ganz Nordamerika und Europa identifiziert. Zwei Faktoren wurden zur Phänotypisierung berücksichtigt: 1) Historische Daten (die Gegenwart von Synkope, die Anzahl synkopaler Episoden, die Gegenwart von Anfällen, das Alter beim Auftreten der Symptome und das Auftreten von plötzlichem Tod); und 2) das QT-Intervall auf Elektrokardiogrammen, korrigiert um die Herzfrequenz (QTc) (Bazzett, 1920). Um eine falsche Einordnung von Individuen zu vermeiden, wurde der gleiche konservative Ansatz für die phänotypische Zuordnung verwendet, der in vorherigen Untersuchungen erfolgreich war (Keating et al., 1991a; Keating et al., 1991b; Jiang et al., 1994). Von jedem Individuum oder deren Vormunden wurde, gemäß den lokalen institutionellen Prüfungsausschussrichtlinen, eine informierte Einwilligung erhalten. Die phänotypischen Daten wurden ohne Kenntnis des Genotyps interpretiert. Symptomatische Individuen mit einem korrigierten QT-Intervall (QTc) von 0,45 Sekunden oder länger und asymptomatische Individuen mit einem QTc von 0,47 Sekunden oder länger wurden als betroffen eingeordnet. Asymptomatische Individuen mit einem QTc von 0,41 Sekunden oder weniger wurden als nicht betroffen eingeordnet. Asymptomatische Individuen mit einem QTc zwischen 0,41 und 0,47 Sekunden und symptomatische Individuen mit QTc von 0,44 Sekunden oder weniger wurden als ungewiss eingeordnet.
  • BEISPIEL 2
  • Genotypen und Kopplungsanalyse
  • Genomische DNS wurde aus peripheren Blutlymphozyten oder Zelllinien präpariert, die von mit Epstein-Barr-Virus transformierten Lymphozyten unter Verwendung von Standardprozeduren abgeleitet wurden (Anderson und Gusella, 1984). Für genotypische Analysen wurden vier kleine Tandemwiederholungspolymorphismen (STR) verwendet, die zuvor auf Chromosom 11p15.5 kartiert wurden: Du11S922, TH, D11S1318 und D11S860 (Gyapay et al., 1994). Die Genotypisierung von RFLP-Markern (HRASI, D11S454 und D11S12) wurde ausgeführt, wie zuvor beschrieben (Keating et al., 1991 a).
  • Die paarweise Kopplungsanalyse wurde unter Verwendung von MLINK in LINKAGE v5.1 (Lathrop et al., 1985) ausgeführt. Angenommene Werte von 0,90 für Penetranz und 0,001 für LQT-Genhäufigkeit wurden verwendet. Die Genfrequenz wurde als bei Männern und Frauen gleich angenommen. Männliche und weibliche Rekombinationsfrequenzen wurden als gleich berücksichtigt. STR-Allel-Frequenzen waren 1/n, wobei n = Anzahl der beobachteten Allele war. Auch wenn der maximale LOD-Score für D11S454 bei einem Rekombinationswert von 0 identifiziert wurde, so platziert die Gegenwart eines nicht obligatorischen Rekombinanten (Individuum VI-14, 1) dieses LQT-Gen telomerisch von D11S454.
  • BEISPIEL 3
  • Physikalische Kartierung
  • Primer wurden auf der Basis von Sequenzen von TH-INS-IGFII- und D11S454-Loci designed und verwendet, um Klone von CEPH-YAC-Bibliotheken unter Verwendung der PCR-basierten Technik zu identifizieren und zu isolieren (Green und Olson, 1990; Kwiatowski et al., 1990). Terminale YAC-Sequenzen wurden durch inverse PCR, wie in (Ochman et al., 1988) beschrieben, bestimmt und als STSs verwendet.
  • P1-Klone wurden unter Verwendung von Sonden eines einmalig im Genom vorkommenden Gens auf zuvor identifizierten Cosmiden cosQW22 (diese Untersuchung) isoliert, cCI11-469 (D11S679), cCI11-385 (D11S551), cCI11-565 (D11S601), cCI11-237 (D11S454) (Tanigami et al., 1992; Tokino et al., 1991; Sternberg, 1990). Neu isolierte P1s wurden auf Chromosom 11p15 durch FISH oder Southern-Analysen kartiert. End-spezifische Riboproben wurden aus neuen isolierten P1s generiert und verwendet, um zusätzliche benachbarte Klone zu identifizieren (Riboprobe Gemini Core System Kit; Promega). DNS für P1 und Cosmidklone wurde unter Verwendung alkalischer Lysisplasmidisolierung präpariert und durch Gleichgewichtszentrifugation in CsCl-Ethidiumbromidgradienten gereinigt, wie beschrieben (Sambrook et al., 1989). P1-Insertendsequenzen wurden durch zyklische Sequenzierung bestimmt, wie beschrieben (Wang und Keating, 1994). STSs wurden, basierend auf diesen Insertendsequenzen, generiert. Überlappung zwischen P1s und Cosmiden wurden berechnet, indem die gemeinsamen Restriktionsfragmente summiert wurden.
  • BEISPIEL 4
  • Isolierung und Charakterisierung von KVLQT1-Klonen
  • Eine adulte menschliche kardiale cDNS-Bibliothek (Stratagene) wurde plattiert, und 1 × 106 Platten wurden unter Verwendung von gefangenem Exon 4181A als Sonde gescreened. Sequenzen von gefangenem Exon 4181 A wurden verwendet, um Oligonukleotidsonden für das cDNS-Bibliothek-Screening zu designen. Das GENETRAPPERTM cDNA Positive Selection System wurde verwendet, um 1 × 1011 Klone aus einer menschlichen Herz-cDNS-Bibliothek (Life Technologies, Inc.) zu screenen. Die Sequenzen der Capture- und Reparatur-Oligonukleotide waren 5'-CAGATCCTGAGGATGCT-3' (SEQ-ID-Nr.: 1) und 5'-GTACCTGGCTGAGAAGG-3' (SEQ-ID-Nr.: 2).
  • Zusammengesetzte cDNS-Sequenzen für KVLQT1 wurden durch Endsequenzierung der überlappenden cDNS-Klone und durch Primerwalking erhalten. Sequenzierung wurde entweder automatisch, unter Verwendung von Pharmacia A.L.F. automatisierten Sequencers, oder manuell, unter Verwendung eines Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit (United States Biochemical, Inc.) ausgeführt. Datenbankanalysen und Sequenzanalysen wurden unter Verwendung des GCG-Software Package, IG-Software Package und des BLAST-Network-Service vom National Center for Biotechnology Information durchgeführt.
  • Die partiale genomische Struktur (von Transmembrandomäne S2 bis S6) von KVLQT1 wurde durch zyklische Sequenzierung von P1 18B12 bestimmt, wie beschrieben (Wang und Keating, 1994). Die Primer wurden basierend auf der KVLQT1-cDNS-Sequenz designed und zur zyklischen Sequenzierung verwendet.
  • BEISPIEL 5
  • Mutationsanalyse
  • SSCP wurde wie zuvor beschrieben (Wang et al., 1995a; Wang et al., 1995b) durchgeführt. Normale und aberrierende SSCP-Produkte wurden isoliert, direkt sequenziert, wie beschrieben (Wang und Keating, 1994), oder in pBluescript (SK+; Stratagene) unter Verwendung des T-Vektor-Verfahrens subkloniert (Marchuk et al., 1990). Wenn letzteres Verfahren verwendet wurde, wurden mehrere Klone mittels Didesoxy-Kettenterminationsverfahren unter Verwendung von SequenaseTM Version 2.0 (United States Biochemicals, Inc.) sequenziert.
  • BEISPIEL 6
  • Northern-Analysen
  • Ein mehrfacher Gewebe-Northern-Filter (Human MTN blot 1, Clontech) wurde mit einer 32P-markierten KVLQT1-cDNS-Sonde, wie zuvor beschrieben (Curran et al., 1995) sondiert.
  • BEISPIEL 7
  • Verfeinerte genetische und physikalische Lokalisierung von LQT1
  • Die exakte Lage von LQT1 wurde durch genotypische Analysen in Familienstamm 1532 (K1532), einer großen Familie nordeuropäischer Abstammung aus Utah, bestimmt (1). Dieser Familienstamm wurde in der anfänglichen Untersuchung verwendet, wobei das erste LQT-Gen, LQT1, mit Chromosom 11p15.5 gekoppelt wurde (Keating et al., 1991a; Keating et al., 1991b). Zusätzliche Familienmitglieder wurden für eine Gesamtprobegröße von 217 Individuen identifiziert und phänotypisiert. Die phänotypische Bestimmung wurde wie zuvor beschrieben ausgeführt (Keating et al., 1991a; Keating et al., 1991b; Jiang et al., 1994). Vorläufige genotypische Analysen unter Verwendung von Markern auf HRAS, TH, D11S454 und D11S12 beinhalteten alle sicheren Mitglieder von K1532. Diese Versuche identifizierten informative Zweige dieser Familie. Zusätzliche genotypische Analysen wurden unter Verwendung dreier hoch polymorpher Marker von Chromosom 11p15.5:D11S922, D11S1318 und D11S860 (Gyapay et al., 1994) ausgeführt.
  • Genotypen und paarweise LOD-Scores für jeden Marker werden in 1 und Tabelle 1 gezeigt. Von diesen Markern waren TH und D11S1318 vollständig gekoppelt. Die Rekombination wurde mit allen anderen getesteten Markern, einschließlich HRAS, identifiziert, aber in jedem Fall wurde ein statistisch signifikanter positiver LOD-Score (+3 oder größer) identifiziert. Diese Daten zeigen an, dass LQT1 vollständig zu TH und D11S1318 in diesem Familienstamm gekoppelt ist, und dass dieses Erkrankungsgen centromerisch von HRAS liegt.
  • Um die Lokalisierung von LQT1 zu verfeinern, wurden Haplotypanalysen von K1532 ausgeführt (vgl. 1). Neun chromosomentragende informative Rekombinationsereignisse wurden identifiziert. Telomerische Rekombinationsereignisse wurden in dem nicht betroffenen Individuum IV-22 (zwischen D11S922 und TH), dem betroffenen Individuum IV-25 (zwischen D11S922 und TH), dem nicht betroffenen Individuum V-6 (zwischen HRAS und D11S922) und dem betroffenen Individuum V-24 (zwischen HRAS und D11S922) beobachtet. Centromerische Rekombinationsereignisse wurden in dem nicht betroffenen Individuum V-17 (zwischen D11S860 und D11S454), dem betroffenen Individuum V-24 (zwischen D11S860 und D11S454), dem nicht betroffenen Individuum V-34 (zwischen D11S860 und D11S454), dem nicht betroffenen Individuum VI-13 (zwischen D11S860 und D11S454), dem nicht betroffenen Individuum VI-14 (zwischen D11S454 und D11S1318) und dem betroffenen Individuum VI-16 (zwischen D11S860 und D11S454) identifiziert. Diese Daten zeigen an, dass LQT1 zwischen D11S922 und D11S454 liegt. In Übereinstimmung mit jüngsten Untersuchungen, die LQT1 centromerisch von TH platzieren (Russell et al., 1995), platzieren diese Daten LQT1 in dem Intervall zwischen TH und D11S454.
  • Die Größe der Region, die LQT1 enthält, wurde unter Verwendung von Puls-Feld-Gel-Analysen mit genomischen Sonden von Chromosom 11P15.5 geschätzt. Sonden von TH, D11S551 und D11S454 hybridisierten zu einem 700 kb MluI-Restriktionsfragment (2). Diese Daten legen nahe, dass die Region, die LQT1 enthält, kleiner als 700 kb ist. Physikalische Repräsentation dieser Region wurde durch das Screenen von künstlichem Hefechromosom (YAC) und P1-Bibliotheken mit Sonden aus der Region erreicht (Tanigami et al., 1992; Tokino et al., 1991). Die Reihenfolge dieser Klone wurde unter Verwendung von Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierungsanalysen (FISH) bestätigt als: Telomer-TH-D11S551-D11S679-D11S601-D11S454-Centromer. Die Klone, die in anfänglichen Versuchen identifiziert wurden, wurden dann für die Identifikation benachbarter, überlappender Klone verwendet. Der Mindestklonsatz aus dem LQT1-Intervall wird in 2 gezeigt.
  • Figure 00640001
  • BEISPIEL 8
  • Identifikation und Charakterisierung von KVLQT1
  • Exonamplifikation mit Klonen von der physikalischen Karte wurde ausgeführt, um Kandidatengene für LQT1 zu identifizieren. Exon-Trapping wurde unter Verwendung von pSPL3B (Burn et al., 1995) auf genomischen P1-Klonen ausgeführt, wie zuvor beschrieben (Buckler et al., 1991; Church et al., 1994). Ein Minimum von 128 gefangenen Exons von jedem P1-Klon wurden anfänglich durch Größeneinstufung der PCR-Produkte charakterisiert. Aus diesen wurden 400 Klone durch Didesoxysequenzierung unter Verwendung eines A.L.F. automatisierten Sequencers (Pharmacia) weiter analysiert. DNS-Sequenz- und Datenbankanalysen deckten acht mögliche Exons mit vorhergesagter Aminosäuresequenzähnlichkeit zu Ionenkanälen auf. Die größte Ähnlichkeit wurde für ein gefangenen Exon (4181A) mit 238 Basenpaaren erhalten, mit 53 Ähnlichkeit zu Kaliumkanalproteinen von verschiedenen Spezies, einschließlich Ähnlichkeit zu einem Abschnitt einer putativen Porenregion. PCR-Analysen wurden verwendet, um 4181 A auf dem kurzen Arm von Chromosom 11 zu kartieren und auf zwei P1s der physikalischen Karte (118A10, 18B12). Diese Daten legten nahe, dass 4181A Teil eines Kaliumkanalgens auf Chromosom 11p15.5 ist.
  • Zwei verschiedene cDNS-Bibliothek-Screeningverfahren wurden verwendet, um zu bestimmen, ob gefangenes Exon 4181A Teil eines Gens war. Traditionelle Plaquefilterhybridisierung mit einer adulten menschlichen kardialen cDNS-Bibliothek führte zur Identifikation eines einzigen positiven Klons. Eine Variation der cDNS-Selektion wurde verwendet, um eine zweite kardiale cDNS-Bibliothek (das GENETRAPPERTM cDNS Positive Selection System, Life Technologies, Inc.) zu screenen, und zwölf unabhängige Klone wurden rückgewonnen. DNS-Sequenzanalysen deckten ein vollständiges Alignment mit Sequenzen auf, die von 4181A und den anderen oben beschriebenen gefangenen Exons abgeleitet wurden. Die zusammengesetzte Sequenz dieser cDNS-Klone wird in 3A gezeigt. Der längste offene Leserahmen umspannt 1654 Basenpaare. Zwei Consensus-Polyadenylierungssignale wurde stromaufwärts des Poly(A)-Tails in der 3'-untranslatierten Region identifiziert. Die Identität des Initiationscodons ist noch nicht sicher.
  • Diese cDNS sagte ein Protein mit strukturellen Charakteristiken von Kaliumkanälen vorher. Hydropathie-Analysen legten eine Topologie von sechs größeren hydrophoben Regionen nahe, die membrandurchdringende α-Helices repräsentieren könnten. Diese Regionen teilen Sequenzähnlichkeit mit den Kaliumkanal-Transmembrandomänen S1 bis S6. Ein Vergleich der vorhergesagten Aminosäuresequenz, die von dem identifizierten Gen und dem Shaker-(SHA)-Kaliumkanal abgeleitet ist (Pongs et al., 1988), wird in 3B gezeigt. In der Region, die S1 bis S6 enthält, betrug die Aminosäuresequenzidentität 30 % und die Ähnlichkeit betrug 59 %. Die Sequenz, die 3' von S1 bis S6 lokalisiert ist, hatte keine signifikante Ähnlichkeit mit irgendeinem bekannten Protein. Weil dieses Gen eine starke Ähnlichkeit mit spannungskontrollierten Kaliumkanalgenen hatte und ein guter Kandidat für LQT1 wurde, wurde es KVLQT1 genannt.
  • Northern-Blot-Analysen wurden verwendet, um die Gewebeverteilung von KVLQT1-mRNS zu bestimmen. KVLQT1-cDNS-Sonden ermittelten ein 3,2 kb-Transkript im menschlichen Herzen, Niere, Lunge und Plazenta, aber nicht in SkelettmuskeL, Leber oder Gehirn (4). Das Herz zeigte die höchsten Level an KVLQT1-mRNS.
  • BEISPIEL 9
  • Charakterisierung der vollständigen KVLQT1-cDNS
  • Die oben beschriebenen Untersuchungen resultierten in dem Klonieren und Charakterisieren einer unvollständigen cDNS für KVLQT1. Die Sequenz dieser unvollständigen cDNS sagte ein Protein mit sechs hydrophoben membrandurchdringenden α-Helices (S1 bis S6) und eine typische K+-Kanal-Porensignatursequenz vorher (Heginbotham et al., 1994). Dieser cDNS schien jedoch die aminoterminale Domäne zu fehlen und sie exprimierte nicht funktionell. Um die vollständige Sequenz von KVLQT1 zu definieren, wurden mehrere cDNS-Bibliotheken gescreened und es wurde ein neuer Klon isoliert. Das Screening wurde ausgeführt durch radioaktives markieren einer partiellen KVLQT1-cDNS mit 32P und dem Screenen mehrerer cDNS-Bibliotheken, die von Clontech erhalten wurden. Ein 1,2-kb-Klon wurde aus einer Bauchspeicheldrüsen-Bibliothek isoliert und in pBluescript II subkloniert und sequenziert. Dieser Klon beinhaltete eine putative translationale Startstelle und eine ATG-Sequenz in-frame mit dem originalen KVLQT1-Klonen. Diese neuen Sequenzdaten wurden mit den früheren Sequenzdaten kombiniert, um die cDNS-Sequenz zu erbringen, die das vollständige Protein kodiert. Diese cDNS-Sequenz sowie 5'- und 3'-untranslatierte Regionen werden in 12A bis 12D gezeigt. Die neue cDNS-Sequenz sagt ein Protein mit 581 Aminosäuren mit einer vollständigen S1-Domäne und einer N-terminalen Region mit 27 Aminosäuren voraus. Dies wird in 8A gezeigt. Um zu gewährleisten, dass diese neue Sequenz Teil des mit Chromosom 11p15.5-gekoppelten KVLQT1-Gens war, wurde ein XhoI-Restriktionsfragment mit 135 Basenpaaren aus dieser Region in Hybridisierungsversuchen mit DNS von einem Somazellhybridpanel verwendet. Das neue 5'-Ende wurde auf dem kurzen Arm von Chromosom 11 kartiert. Northern-Analyse unter Verwendung der neuen KVLQT1-Sequenz zeigte eine Hybridisierung mit einer einzigen Messenger-RNS von 3,2 kb in der menschlichen Bauchspeicheldrüse, Herz, Niere, Lunge und Plazenta an, aber nicht in Gehirn, Leber oder Skelettmuskel (8B). Die Northern-Analysen wurden unter Verwendung eines mehrfachen Gewebe-Northern-Filters (Human MTN blot 1, Clontech) ausgeführt, wie von Curran et al., 1995, beschrieben.
  • BEISPIEL 10
  • Charakterisierung der KVLQT1-Funktion
  • Um die Funktion von KVLQT1 zu definieren, wurden Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO) mit der vollständigen cDNS, die oben in Beispiel 9 beschrieben wurde, transfiziert. Die KVLQT1-cDNS wurde in pCEP4 (InVitrogen) subkloniert. Die CHO-Zellen wurden in Ham's F-12-Medium kultiviert und vorübergehend unter Verwendung von Lipofectamin (Gibco BRL) transfiziert. Die Zellen wurden 18 Stunden lang in 35-mm-Schalen transfiziert, die 6 μl Lipofectamin, 0,5 μg grün fluoreszierendes Protein (pGreen Lantern-1, Gibco BRL) und 1,5 μg KVLQT1 in pCEP4 enthielten. Die fluoreszierenden Zellen wurden dem Voltage-clamp Verfahren unter Verwendung eines Axopatch 200 Patch-clamp-Amplifiers (Axon Instruments) 48 bis 78 Stunden nach der Transfektion unterzogen. Die Badelösung enthielt, in mM: 142 NaCl, 2 KCl, 1, 2 MgCl2, 1, 8 CaCl2, 11,1 Glucose, 5,5 HEPES-Puffer (pH-Wert 7,4, 22 bis 25 °C). Die Pipettenlösung enthielt, in mM: 110 Kaliumglutamat, 20 KCl, 1,0 MgCl2, 5 EGTA, 5 K2ATP, 10 HEPES (pH-Wert 7,3). Datenerfassung und Analysen erfolgten unter Verwendung von pCLAMP6 (Axon Instruments). Die Spannungsabhängigkeit der Stromaktivierung wurde bestimmt, indem das Verhältnis zwischen Tail-Strömen (bestimmt durch Extrapolation der deaktivierenden Phase des Stroms zum Ende des Testimpulses) und dem Testpotential mit einer Boltzmann-Funktion angepasst wurde. Die Tail-Ströme wurden im Verhältnis zum größten Wert für jeden Oozyten normalisiert.
  • Ein spannungsabhängiger, auswärtsgerichteter K+-Strom wurde nach der Membrandepolarisation auf Potentiale über –60 mV beobachtet (9A). Dieser Strom erreichte innerhalb 1 Sekunde bei +40 mV einen stationären Zustand. Der Aktivierung des Stroms ging eine kurze Verzögerung voraus, und die Repolarisierung auf –70 mV ruft Tail-Ströme mit einem anfänglichen Amplitudenanstieg (Hook) vor der Deaktivierung hervor. Ähnliche Amplitudenanstiege von Tail-Strömen wurden zuvor für HERG K+-Kanäle beobachtet, und wurden der Nachbildung der Kanäle aus der Inaktivierung mit einer Geschwindigkeit zugeschrieben, die schneller ist als die Deaktivierung (Sanguinetti et al., 1995; Smith et al., 1996; Spector et al., 1996). Die Aktivierungskurve für den KVLQT1-Strom war halb-maximal (V1/2) –11,6 ± 0,6 mV und hatte einen Slopefaktor von 12,6 ± 0,5 mV (n = 6; 9B).
  • Die biophysikalischen Eigenschaften von KVLQT1 waren anders als andere bekannte kardiale K+-Ströme. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass KVLQT1 mit einer anderen Untereinheit coassembliert, um einen bekanten kardialen Kanal zu bilden. Der langsam aktivierende verzögerte gleichrichtende (slowly activating delayed rectifier) K+-Strom, IKs moduliert die Repolarisierung des kardialen Aktionspotentials. Trotz intensiver Untersuchungen ist die molekulare Struktur des IKs-Kanals nicht verstanden. Physiologische Daten legen nahe, dass eine Komponente des IKs-Kanals minK ist (Goldstein und Miller, 1991; Hausdorff et al., 1991; Takumi et al., 1991; Busch et al., 1992; Wang und Goldstein, 1995; Wang et al., 1996), ein Protein mit 130 Aminosäuren mit einer einzelnen putativen Transmembrandomäne (Takumi et al., 1988). Die Größe und Struktur dieses Proteins ließen jedoch Zweifel aufkommen, dass minK allein funktionelle Kanäle bildete (Attali et al., 1993; Lesage et al., 1993).
  • Um diese Hypothese zu testen, wurden CHO-Zellen mit KVLQT1 und menschlichen minK (hminK) cDNSs cotransfiziert. Eine hminK-cDNS wurde in pCEP4 (InVitrogen) subkloniert und die Transfektion wurde wie oben für KVLQT1 allein beschrieben, ausgeführt. Für die Cotransfektion von KVLQT1 und hminK, wurden 0,75 μg jeder cDNS verwendet. Wie zuvor berichtet (Lesage et al., 1993), beinhaltete die Transfektion von CHO-Zellen mit hminK allein keinen nachweisbaren Strom (n = 10, 9C). Die Cotransfektion von hminK mit KVLQT1 induziert einen langsam aktivierenden verzögerten gleichrichtenden Strom (slowly activating delayedrectifier current), der viel größer war als der Strom, der in Zellen, die mit KVLQT1 allein (9D und 9E) transfiziert wurden. Der langsame Aktivierung von Strom in cotransfizierten CHO-Zellen ging eine Verzögerung voraus, die mehrere hundert Msek. dauerte, die anzeigte, dass kein signifikanter homomerer KVLQT1-Kanalstrom vorhanden war. Der Strom saturierte während langer depolarisierender Impulse nicht, und erforderte eine drei-exponentielle Funktion, um die anfängliche Verzögerung und zwei Phasen der Stromaktivierung am besten zu beschreiben. Während eines 30 Sek. langen depolarisierenden Impulses mit +40 mV, wurde Strom mit Zeitkonstanten von 0,68 ± 0,18, 1,48 ± 0,16 und 8,0 ± 0,6 Sek. (n = 4) aktiviert. Die isochronale (7,5 Sek.) Aktivierungskurve für Strom hatte einen V1/2 von 7,5 ± 0,9 mV und einen Slopefaktor von 16, 5 ± 0, 8 mV (n = 7; 9B). Beim Vergleich sind V1/2 und Slope der Aktivierungskurve für menschliche kardiale IKs 9,4 mV und 11, 8 mV (Li et al., 1996). Wie KVLQT1 und hminK in CHO-Zellen coexprimiert, ist die Aktivierung kardialer IKs äußerst langsam und wurde am besten durch eine dreiexponentielle Funktion beschrieben (Baiser et al., 1990; Sanguinetti und Jurkiewicz, 1990). Chinidin (50 μM) blockierte Tail-Ströme in cotransfizierten CHO-Zellen mit 30 ± 8 % (n = 5), ähnlich deren Wirkung (40–50 % Block) auf IKs in isolierten Myozyten (Baiser et al, 1991). Somit induzierte die KVLQT1- und hminK- Coexpression in CHO-Zellen einen Strom mit biophysikalischen Eigenschaften, der mit kardialem IKs fast identisch war.
  • Um die Eigenschaften von hminK und KVLQT1 weiter zu charakterisieren, wurden diese Kanäle separat und gemeinsam in Xenopus-Oozyten exprimiert. Xenopuslaevis-Oozyten wurden mit cRNA isoliert und injiziert, wie von Sanguinetti et al., 1995 beschrieben. Die KVLQT1-cDNS wurde in pSP64 (Promega) subkloniert. Die HminK-cDNS war ein Geschenk von R. Swanson. Annähernd äquimolare Konzentrationen von KVLQT1-cRNA (5,8 ng je Oozyt) und hminK-cRNA (1 ng je Oozyt) wurden für die Coinjektionsversuche verwendet. Die Badelösung enthielt, in mM: 98 NaCl, 2 KCl, 2 MgCl2, 0,1 CaCl2 und 5 HEPES (pH-Wert 7,6, 22 bis 25 °C). Für Umkehrpotentialversuche wurde die Osmolarität durch äquimolare Substitution des externen NaCl für KCl aufrechterhalten. Die Ströme wurden unter Verwendung von Standard-Zwei-Mikroelektroden-Voltage-clamp-Techniken 3 Tage nach der Injektion von Oozyten mit cRNA aufgezeichnet (Sanguinetti et al., 1995). Die Ströme wurden bei 0,5 Hz gefiltert und bei 2 kHz digitalisiert. Die Daten werden als Mittelwerte (mean ± s.e.m) präsentiert.
  • Die mit KVLQT1-komplementärer RNS injizierten Oozyten exprimierten einen schnell aktivierenden auswärtsgerichteten K+-Strom mit einer Spannungsabhängigkeit der Aktivierung, nahezu identisch mit CHO-Zellen, die mit KVLQT1-cDNS transfiziert wurden (10A und 10B). Die K+-Selektivität der KVLQT1-Kanäle wurde durch die Messung des Umkehrpotentials (Erev) der Tail-Ströme in verschiedenen Konzentrationen von extrazellulärem K ([K+]e) bestimmt. Der Slope des Verhältnisses zwischen Erev und log [K+]e betrug 49,9 ± 0,4 mV (n = 7; 10C), signifikant niedriger als von der Nernst-Gleichung (58 mV) für einen vollkommen selektiven K+-Kanal vorhergesagt. Coinjektion von Oozyten mit KVLQT1- und hminK-cRNA induzierte einen Strom ähnlich IKs (11C). Der Slope des Verhältnisses zwischen Erev und log[K+]e für coinjizierte Oozyten betrug 49,9 ± 4 mV (n = 6), ähnlich wie KVLQT1 allein und kardialer Meerschweinchen-IKs (49 mV) (Matsuura et al., 1987). Die isochronale (7,5 Sek.) Aktivierungskurve für coinjizierte Oozyten hatte eine V1/2 von 6,2 mV und einen Slope von 12,3 mV (11E), ähnlich dem kardialen IKs.
  • BEISPIEL 11
  • Identifikation eines KVLQT1-Gens in Xenopus
  • Dagegen war hminK bei CHO-Zellen in der Lage, funktionelle Expression in Xenopus-Oozyten zu erleiden (11B). Der induzierte Strom (IsK) war geringer als der Strom, der in den coinjizierten Oozyten induziert wurde, aber die Kinetik und die Spannungsabhängigkeit der Aktivierung waren ähnlich (11A bis E). Zwei Beobachtungen haben zu der Hypothese geführt, dass IsK in Xenopus-Oozyten aus Kanälen resultiert, die durch Coassemblierung von minK mit einer noch nicht identifizierten, konstitutiv exprimierten Untereinheit, gebildet wurden. Erstens, die Größe von IsK saturiert nach Injektion von sehr geringen Mengen von minK-cRNA (11D), was nahe legt, dass eine endogene Komponente von beschränkter Menge für die funktionelle Expression erforderlich ist ((Wang und Goldstein, 1995; Cui et al., 1994). Zweitens induziert die heterologe Expression von minK in Zellen von Säugetieren keinen nachweisbaren Strom (Lesage et al., 1993) (9C), was nahe legt, dass minK nicht ausreichend ist, um funktionelle Kanäle zu bilden. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass diese noch nicht identifizierte Untereinheit ein Homolog von KVLQT1 sein könnte. Um diese Hypothese zu testen, wurde eine Xenopus-Oozyten-cDNS-Bibliothek (Clontech) mit einem KVLQT1-cDNS-Klon gescreent, der die S3- bis S5-Domänen umspannt. Ein 1,6-kb-Teilklon (XKVLQT1, 8A) wurde isoliert. XKVLQT1 ist auf Aminosäurelevel zu 88 identisch mit der entsprechenden Region von KVLQT1 (8A). Diese Daten legen nahe, dass IsK aus der Coassemblierung des XKVLQT1- und des minK-Proteins resultieren.
  • Es wurde gefolgert, dass KVLQT1 und minK coassemblieren, um den kardialen IKs-Kanal zu bilden. Zwei verzögerte gleichrichtende K+-Ströme, IKr und IKs. modulieren die Aktionspotentialdauer in kardialen Myozyten (Li et al., 1996; Sanguinetti und Jurkiewicz, 1990). Vorherige Untersuchungen haben eine Dysfunktion der IKr-Kanäle beim Long-QT-Syndrom impliziert (Sanguinetti et al., 1995; Curran et al., 1995; Sanguinetti et al., 1996). Die Beobachtung, dass KVLQT1-Mutationen auch diese Störung verursachen kann (Wang et al., 1996) und die Entdeckung, dass KVLQT1 einen Teil des IKs-Kanals bildet, zeigen an, dass die Dysfunktion beider kardialer verzögerter gleichrichtender K+-Kanäle zum Risiko von plötzlichem Tod aufgrund kardialer Arrhythmie beitragen.
  • BEISPIEL 12
  • Cosegregation von KVLQT1-Missense
  • Mutationen mit LQT in sechs großen Familien
  • Um die Hypothese, dass KVLQT1 LQT1 ist, zu testen, wurden Einzelstrang-Konformationspolymorphismusanalysen (SSCP) verwendet, um betroffene Mitglieder von K1532, der größten LQT-Familie, die Koppelung zu Chromosom 11 zeigte, auf funktionelle Mutationen zu screenen. SSCP wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Wang et al., 1995a; Wang et al., 1995b). Normale und aberrierende SSCP-Produkte wurden isoliert und direkt sequenziert, wie beschrieben (Wang und Keating, 1994), oder in pBluescript (SK+) (Stratagene) unter Verwendung des T-Vektor-Verfahrens subkloniert (Marchuk et al., 1990). Wenn letzteres Verfahren verwendet wurde, wurden mehrere Klone durch das Didesoxy- Kettenterminationsverfahren unter Verwendung von SequenaseTM Version 2.0 (United States Biochemicals, Inc.) sequenziert. Die Analysen wurden auf die Region zwischen S2 und S6 konzentriert, da diese Regionen wichtig für die KVLQT1-Funktion sein könnten. Wir haben Oligonukleotidprimer basierend auf cDNS-Sequenzen designed und verwendeten diese Primer für Cycle-Sequenzierungsreaktionen mit KVLQT1-enthaltendem P1, 18812 (Wang und Keating, 1994). Diese Versuche definierten intronische Sequenzen, die Exons flankieren, die S2 bis S6 kodieren. Zusätzliche Primer wurden dann aus diesen intronischen Sequenzen generiert und für SSCP-Analysen verwendet (Tabelle 2).
  • SSCP-Analysen identifizierten einen anomalen Konformer in den 70 betroffenen Mitgliedern von K1532 (5). Dieser aberrierende Konformer wurde bei den 147 nicht betroffenen Mitgliedern dieses Familienstamms oder in genomischer DNS von mehr als 200 nicht verwandten Kontrollindividuen nicht beobachtet (Q. Wang, unveröffentlichte Ergebnisse). Der Zweipunkt-LOD-Score für die Kopplung zwischen dieser Anomalie und LQT betrug 14,19 bei einem Rekombinationswert von 0 (Tabelle 1). Keine Rekombination wurde zwischen KVLQT1 und LQT1 beobachtet, was anzeigt, dass diese Loci vollständig gekoppelt sind. DNS-Sequenzanalysen der normalen und aberrierenden SSCP-Konformers deckten eine einzelne Basensubstitution, eine G- bis A-Transition, am ersten Nukleotid des Codons Val-125 auf (5 und Tabelle 3). Diese Mutation resultiert in einer Valin- bis Methionin-Substitution in der vorhergesagten intrazellulären Domäne zwischen S4 und S5.
  • Um die Hypothese, dass Mutationen in KVLQT1 LQT verursachen, weiter zu testen, wurden DNS-Proben von betroffenen Mitgliedern von fünf zusätzlichen großen LQT-Familienstämmen untersucht. Kopplungsanalysen mit polymorphen Markern aus dieser Region hatten gezeigt, dass der Erkrankungsphänotyp in diesen Familien an Chromosom 11 gekoppelt war (Q. Wang, unveröffentlichte Ergebnisse). Aberrierende SSCP-Konformer wurden in betroffenen Mitgliedern von K1723, K2605, K1807 (5), K161 und K162 identifiziert (Q. Wang, unveröffentlichte Ergebnisse). Die SSCP-Anomalien, die in K161 und K162 identifiziert wurden, waren mit denen identisch, die in K1807 beobachtet wurden (Q. Wang, unveröffentlichte Ergebnisse). Der aberrierende Konformer wurde bei nicht betroffenen Mitgliedern diese Familienstämme oder in DNS-Proben von mehr als 200 nicht verwandten Kontrollindividuen nicht gesehen (5; Q. Wang, unveröffentlichte Ergebnisse). Die normalen und aberrierenden Konformer, die in jeder Familie identifiziert wurden, wurden sequenziert. Die Nukleotidänderung, kodierende Wirkung und Lokalisierung jeder Mutation wird in Tabelle 3 zusammengefasst.
  • Tabelle 2. PCR-Primer, die verwendet wurden, um KVLQT1-Mutationen zu definieren.
    Figure 00750001
  • Figure 00760001
  • BEISPIEL 13
  • Eine intragene KVLQT1-Deletion und neun Missense-Mutationen
  • Assoziiert mit LQT in kleinen Familien und sporadischen Fällen
  • Um zusätzliche LQT-assoziierte Mutationen in KVLQT1 zu identifizieren, wurden weitere SSCP-Analysen für kleine Familienstämme und sporadische Fälle ausgeführt. SSCP deckte einen aberrierende Konformer in Familienstamm 13216 auf (6). Analysen von mehr als 200 nicht verwandten Kontrollindividuen zeigten diese Anomalie nicht (Q. Wang, unveröffentlichte Ergebnisse). Dieser aberrierende Konformer wurde kloniert und sequenziert, und deckte eine Dreibasendeletion auf, die die Codone 38 und 39 einschloss. Diese Mutation resultiert in einer Phenylalanin- bis Tryptophansubstitution und Deletion eines Glycins in der putativen S2-Domäne (Tabelle 3).
  • Aberrierende SSCP-Konformer wurden in betroffenen Mitgliedern von neun zusätzlichen Familienstämmen identifiziert: K1777, K20925, K13119, K20926, K15019 (6), K2050, K163 und K164 (Q. Wang, unveröffentlichte Ergebnisse). Ein aberrierender SSCP-Konformer, der in K2050 identifiziert wurde, war mit dem in K1723 identisch, und aberrierende Konformer, die in K163 und K164 identifiziert wurden, waren mit dem identisch, der in K1807 beobachtet wurde. Keiner der aberrierenden Konformer wurde in DNS-Proben von mehr als 200 Kontrollindividuen identifiziert (Q. Wang, unveröffentlichte Ergebnisse). In jedem Fall wurden die normalen und aberrierenden Konformer sequenziert. Diese Daten werden in 6 gezeigt und in Tabelle 3 zusammengefasst. Insgesamt wurden KVLQT1-Mutationen, die mit LQT assoziiert sind in 16 Familien oder sporadischen Fällen (7) identifiziert, was eine starke molekulargenetische Evidenz bereitstellt, dass Mutationen in KVLQT1 die mit Chromosom 11 gekoppelte Form von LQT verursachen.
  • BEISPIEL 14
  • Generierung polyklonaler Antikörper gegen KVLQT1
  • Segmente der KVLQT1-kodierenden Sequenz werden als Fusionsprotein in E. coli exprimiert. Das überexprimierte Protein wird durch Gelelution gereinigt und verwendet, um Kaninchen und Mäusen unter Verwendung einer Prozedur zu immunisieren, ähnlich derjenigen, die von Harlow und Lane, 1988, beschrieben wurde. Diese Prozedur hat gezeigt, dass sie Abs gegen verschiedene andere Proteine generieren kann (vgl. zum Beispiel Kraemer et al., 1993).
  • Kurz zusammengefasst wird ein Stretch der KVLQT1-kodierenden Sequenz als Fusionsprotein in Plasmid PET5A (Novagen, Inc., Madison, WI) kloniert. Nach Induktion mit IPTG wird die Überexpression eines Fusionsproteins mit dem erwarteten Molekulargewicht durch SDS/PAGE verifiziert. Das Fusionsprotein wird aus dem Gel durch Elektroelution gereinigt. Die Identifikation des Proteins als das KVLQT1-Fusionsprodukt wird durch Proteinsequenzierung am N-Terminus verifiziert. Danach wurde das gereinigte Protein als Immunogen in Kaninchen verwendet. Kaninchen werden mit 100 μg des Proteins in Complete Freund's Adjuvans immunisiert und zwei Mal in 3-Wochen-Intervallen, zuerst mit 100 μg Immunogen in Incomplete Freund's Adjuvans, gefolgt von 100 μg Immunogen in PBS geboosted. Antikörper enthaltendes Serum wird zwei Wochen danach gesammelt.
  • Diese Prozedur wird wiederholt, um Antikörper gegen die mutierten Formen des KVLQT1-Gens zu generieren. Diese Antikörper werden in Verbindung mit Antikörpern gegen Wildtyp-KVLQT1 verwendet, um die Gegenwart und das relative Level an mutierten Formen in verschiedenen Geweben und biologischen Fluids zu ermitteln.
  • BEISPIEL 15
  • Generierung von monoklonalen Antikörpern, die für KVLQT1 spezifisch sind
  • Monoklonale Antikörper werden gemäß dem folgenden Protokoll generiert. Mäuse wurden mit Immunogen immunisiert, das intakte (Wildtyp- oder mutierte) KVLQT1- oder KVLQT1-Peptide umfasst, die an Keyhole Limpet Hemocyanin unter Verwendung von Glutaraldehyd oder EDC konjugiert wurden, wie gut bekannt ist.
  • Das Immunogen wird mit einem Adjuvans gemischt. Jede Maus erhält vier Injektionen von 10 bis 100 μg Immunogen und nach der vierten Injektion werden Blutproben von den Mäusen entnommen, um zu bestimmen, ob das Serum Antikörper gegen das Immunogen enthält. Der Serumtiter wird durch ELISA oder RIA bestimmt. Mäuse mit Seren, die die Gegenwart von Antikörper gegen Immunogen anzeigen, werden für die Hybridomproduktion selektiert.
  • Die Milzen werden aus den immunen Mäusen entfernt und eine Einzelzellsuspension wird präpariert (vgl. Harlow und Lane, 1988). Zellfusionen werden im Wesentlichen wie von Kohler und Milstein, 1975, beschrieben, ausgeführt. Kurz zusammengefasst, P3.65.3 Myelomzellen (American Type Culture Collection, Rockville, MD) werden mit immunen Milzzellen unter Verwendung von Polyethylenglycol fusioniert, wie von Harlow und Lane, 1988, beschrieben. Die Zellen wurden mit einer Dichte von 2 × 105 Zellen/Vertiefung in Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen plattiert. Individuelle Vertiefungen werden auf Wachstum untersucht und die Überstände von Vertiefungen mit Wachstum werden auf die Gegenwart von KVLQT1-spezifische Antikörper getestet durch ELISA oder RIA unter Verwendung von Wildtyp- oder mutierten KVLQT1-Targetprotein. Zellen in positiven Vertiefungen werden expandiert und subkloniert, um Monoklonalität herzustellen und zu bestätigen.
  • Klone mit den gewünschten Spezifizäten werden expandiert und als Aszite in Mäusen oder in einem Hohlfasersystem gewachsen, um ausreichende Mengen von Antikörper für die Charakterisierung und Assay-Entwicklung zu produzieren.
  • BEISPIEL 16
  • Sandwich-Assay für KVLQT1
  • Monoklonaler Antikörper ist an eine solide Oberfläche, wie etwa eine Platte, ein Röhrchen, eine Perle oder einen Partikel gebunden. Bevorzugt ist der Antikörper an die Oberfläche einer Vertiefung einer ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen gebunden. 100 μl Probe (z. B. Serum, Urin, Gewebecytosol), die das (Wildtyp- oder mutierte)KVLQT1-Peptid/Protein enthält, wird dem Festphasen-Antikörper zugefügt. Die Probe wird für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird das Probenfluid dekantiert, und die Festphase wird mit Puffer gewaschen, um das ungebundene Material zu entfernen. 100 μl eines zweiten monoklonalen Antikörpers (gegen eine unterschiedliche Determinante auf dem KVLQT1-Peptid/Protein) wird der Festphase zugefügt. Dieser Antikörper ist mit einem Detektormolekül (z. B. 125-I, Enzym, Fluorophor oder einem Chromophor) markiert und die Festphase mit dem zweiten Antikörper wird für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Der zweite Antikörper wird dekantiert und die Festphase wird mit Puffer gewaschen, um das ungebundene Material zu entfernen.
  • Die Menge des gebundenen Markers, die proportional zu der Menge an KVLQT1-Peptid/Protein ist, das in der Probe vorhanden ist, wird quantifiziert. Separate Assays wurden unter Verwendung monoklonaler Antikörper ausgeführt, die spezifisch für Wildtyp-KVLQT1 sind sowie monoklonale Antikörper, die für jede der Mutationen spezifisch sind, die in KVLQT1 identifiziert wurden.
  • BEISPIEL 17
  • Assay, um Wirkstoffe zu screenen, die den KVLQT1- und minK-K+-Kanal beeinflussen
  • Mit dem Wissen, dass KVLQT1 und minK coassemblieren, um einen kardialen IKs-Kaliumkanal zu bilden, ist es nun möglich, einen Assay zum Screenen auf Wirkstoffe, die eine Wirkung auf diesen Kanal haben werden, zu erdenken. Die beiden Gene, KVLQT1 und minK, werden in Oozyten oder Zellen von Säugetieren cotransfiziert und wie oben beschrieben coexprimiert. Die Cotransfektion wird unter Verwendung jeder Kombination von Wildtyp oder spezifisch mutiertem KVLQT1 und minK ausgeführt. Wenn eines der Gene, das für die Cotransfektion verwendet wurde, eine Mutation enthält, die LQT verursacht, ist, verglichen mit der Cotransfektion mit nur den Wildtyp-Genen, eine Änderung in dem induzierten Strom zu sehen. Ein Wirkstoffkandidat wird der Badelösung der transfizierten Zellen zugefügt, um die Wirkungen des Wirkstoffkandidaten auf den induzierten Strom zu testen. Ein Wirkstoffkandidat, der den induzierten Strom so verändert, dass er näher an dem Strom ist, der mit Zellen zu sehen ist, die mit Wildtyp-KVLQT1 und -minK cotransfiziert sind, ist für die Behandlung von LQT verwendbar.
  • Auch wenn die Erfindung in dieser Patentanmeldung durch Bezugnahme auf die Details der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung offenbart wurde, sollte man verstehen, dass die Offenbarung eher im Sinne einer Illustration als einer Beschränkung gedacht ist, da innerhalb des Geists der Erfindung und dem Umfang der anhängenden Ansprüche in Erwägung gezogen wird, dass Modifikationen dem Fachmann schnell in den Sinn kommen.
  • LISTE DER VERWEISE
    • Anderson, et al. (1980). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5399–5403.
    • Anderson, M.A. und Gusella, J.K. (1984). Use of cyclosporin A in establishing Epstein-Barr virustransformed human lymphoblastoid cell lines. In Vitro 20, 856–858.
    • Antzelevitch, C. und Sicouri, S. (1994). Clinical relevance of cardiac arrhythmias generated by after depolarizations: Role of M cells in the generation of U waves, triggered activity und torsade de pointes. J. Am. Col. Card. 23, 259–277.
    • Attali, B., et al. (1993). Nature 365, 850–852.
    • Attwell, D. et al. (1979). Steady-state TTX-sensitive („window") current in cardiac Purkinje fibres. Pflugers Arch. 379, 137–142.
    • Ausubel, F.M., et al. (1992). Current Protocols in Molecular Biology, (J. Wiley und Sons, N.Y.)
    • Balser, J.R. et al. (1991). Circ. Res. 69, 519–529.
    • Balser, J. R. et al. (1990). J. Gen. Physiol. 96, 835–863.
    • Bazett, H. C. (1920). An analysis of the timerelationships of electrocardiograms. Heart 7, 353–370.
    • Beaucage & Carruthers (1981). Tetra. Letts. 22, 1859–1862.
    • Benhorin, J. et al. (1993). Evidence of genetic heterogeneity in the long QT syndrome, Science 260, 1960–1962.
    • Berkner, et al. (1988). BioTechniques 6, 616-629.
    • Berkner (1992). Curr. Top. Microbiol. Immunol.158, 39–61.
    • Bonner, T. I. et al. (1987). Identification of a family of muscarinic acetylcholine receptor genes. Science 237, 527–532.
    • Brandyopadhyay und Temin (1984). Mol. Cell. Biol. 4, 749–754.
    • Breakfield und Geller (1987). Mol. Neurobiol.1, 337–371.
    • Brinster, et al. (1981). Cell 27, 223–231.
    • Bruggeman, A. et al. (1993). Ether-a-go-go encodes a voltage-gated channel permeable to K+ und Ca2+ und modulated by cAMP. Nature 365, 445–448.
    • Buchschacher und Panganiban (1992). J. Virol. 66, 2731–2739.
    • Buckler, A.J., et al. (1991). Exon amplification: a strategy to isolate mammalian genes based on RNA splicing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4005–4009.
    • Burn, T.C. et al. (1995). Increased exon trapping efficiencies through modifications to the pSPL3 splicing vector. Gene 161, 183–187.
    • Busch, A.E. et al. (1992). Science 255, 1705–1707.
    • Capecchi, M.R. (1989). Science 244, 1288.
    • Cariello (1988). Human Genetics 42, 726.
    • Chin, H., et al. (1991). A brain L-type calcium channel al subunit gene (CCHLIA2) maps to mouse chromosome 14 und human chromosome 3. Genomics 11, 914–919.
    • Church, D.M., et al. (1994). Isolation of genes from complex sources of mammalian genomic DNA using exon amplification. Nature Genet. 6, 98–104.
    • Conner, B.J., et al. (1983). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 278–282.
    • Constantini und Lacy (1981). Nature 294, 92–94.
    • Cotten, M. et al. (1990). Transferrin-polycationmediated introduction of DNA into human leukemic cells: stimulation by agents that affect the survival of transfected DNA or modulate transferrin receptor levels. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4033–4037.
    • Cotton, R.G. et al. (1988). Reactivity of cytosine und thymine in single-base-pair mismatches with hydroxylamine und osmium tetroxide und its application to the study of mutations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4397–4401.
    • Covarrubias, M. et al. (1991). Shaker, shal, shab, und shaw express independent K+ current systems. Neuron 7, 763–773.
    • Cui, J. et al. (1994). J. Gen. Physiol. 104, 87–105.
    • Curiel, et al. (1991a). Hum. Gene Ther. 3, 147–154.
    • Curiel, et al. (1991b). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8850–8854.
    • Curran, M. E. et al. (1993). Locus heterogeneity of autosomal dominant long QT syndrome. J. Clin. Invest. 92, 799–803.
    • Curran, M.E. et al. (1995). A Molecular Basis for Cardiac Arrhythmia: HERG Mutations Cause Long QT Syndrome. Cell 80, 795–803.
    • Donehower, L.A., et al. (1992). Nature 356, 215.
    • Enhancers und Eukaryotic Gene Expression, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1983).
    • Felgner, et al. (1987). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413–7417.
    • Fiers, et al. (1978). Nature 273, 113.
    • Fink, et al. (1992). Hum. Gene Ther.3, 11–19.
    • Finkelstein, J., et al. (1990). Genomics 7, 167–172.
    • Freese, et al. (1990). Biochem. Pharmacol. 40, 2189–2199.
    • Friedman, T. (1991). In Therapy for Genetic Diseases, T. Friedman, ed., Oxford University Press, S. 105–121.
    • Gellens, M. et al. (1992). Primary structure und functional expression of the human cardiac tetrodotoxin-insensitive voltage-dependent sodium channel. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 554–558.
    • George, A.L. et al. (1995). Assignment of the human heart tetrodotoxin-resistant voltage-gated Na+ channel α-subunit gene (SCN5A) to band 3p21. Cytogenet. Cell. Genet. 68, 67–70.
    • Goldstein, S.A.N. und Miller, C. (1991). Neuron 7, 403–408.
    • Gordon, et al. (1980). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 7380–7384.
    • Gorziglia und Kapikian (1992). J. Virol. 66, 4407–4412.
    • Graham und van der Eb (1973). Virology 52, 456–467.
    • Green, E.D. und Olson, M.V. (1990). Systematic screening of yeast artificial-chromosome libraries by use of the polymerase chain reaction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1213–1217.
    • Grompe, M., (1993). Nature Genetics 5, 111–117. Grompe, M., et al., (1989). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5855–5892.
    • Gyapay, G. et al. (1994). The 1993–94 Genethon human genetic linkage map. Nat. Genet. 7, 246–339.
    • Harlow & Lane (1988). Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).
    • Hasty, P., K., et al. (1991). Nature 350, 243.
    • Hausdorff, S.F. et al. (1991). Biochem. 30, 3341–3346.
    • Heginbotham, L. et al. (1994). Biophys. J.66, 1061–1067.
    • Helseth, et al. (1990). J. Virol. 64, 2416–2420.
    • Jablonski, E., et al. (1986). Nucl. Acids Res. 14, 6115–6128.
    • Jakoby, W.B. und Pastan, I.H. (eds.) (1979). Cell Culture. Methods in Enzymology, volume 58 (Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jovanovich (New York)).
    • January, C. T. und Riddle, J. M. (1989). Early after depolarizations: Mechanism of induction und block. Circ. Res. 64, 977–990.
    • Jervell, A. und Lange-Nielson, F. (1957). Congenital deaf mutism, functional heart disease with prolongation of the QT interval, und sudden death. Am. Heart J. 54, 59–78.
    • Jiang, C. et al. (1994). Two long QT syndrome loci map to chromosomes 3 und 7 with evidence for further heterogeneity. Nat. Genet. 8, 141–147.
    • Johnson, et al. (1992). J. Virol. 66, 2952–2965.
    • Kaneda, et al. (1989). J. Biol. Chem. 264, 12126–12129.
    • Kanehisa (1984). Nucl. Acids Res. 12, 203–213.
    • Kannel, W. B. et al. (1987). Sudden death risk in overt coronary heart diseases: The Framingham study. Am. Heart J. 113, 799–804.
    • Keating, M. T. et al. (1991a). Linkage of a cardiac arrhythmia, the long QT syndrome, und the Harvey ras-1 gene. Science 252, 704–706.
    • Keating, M. T. et al. (1991b). Consistent linkage of the long QT syndrome to the Harvey ras-1 locus on chromosome 11. Am. J. Hum. Genet. 49, 1335–1339.
    • Kinszler, K.W., et al. (1991). Science 251, 1366–1370.
    • Koch, M. C. et al. (1992). The skeletal muscle chloride channel in dominant und recessive human myotonia. Science 257, 797–800.
    • Kohler, G. und Milstein, C. (1975). Nature 256, 495–497.
    • Kraemer, F.B. et al. (1993). J. Lipid Res. 34, 663–672.
    • Kubo, T., et al. (1988). FEBS Letts. 241, 119.
    • Kwiatowski, T.J. et al. (1990). Rapid identification of yeast artificial chromosome clones by matrix pooling und crude lysate PCR. Nucl. Acids Res. 17, 7191–7192.
    • Landegren, et al. (1988). Science 242, 229.
    • Lathrop, G. M. et al. (1985). Multilocus linkage analysis in humans: detection of linkage und estimation of recombination. Am. J. Hum. Genet. 37, 482–498.
    • Lesage, F., et al. (1993). Receptors und Channels 1, 143–152.
    • Li, G.-R. et al. (1996). Circ. Res. 78, 689–696.
    • Lim, et al. (1992). Circulation 83, 2007–2011.
    • MacKinnon, R. (1991). Determination of the subunit stoichiometry of a voltage-activated potassium channel. Nature 350, 232–235.
    • MacKinnon, R. et al. (1993). Functional stoichiometry of shaker potassium channel inactivation. Science 262, 757–759.
    • Madzak, et al. (1992). J. Gen. Virol. 73, 1533–1536.
    • Magovcevic, I. et al. (1992). Regional localization of the human G protein ai2 (GNAI2) gene: Assignment to 3021 und a related sequence (GNAI2L) to 12p12-p13. Genomics 12, 125–129.
    • Maniatis, T. et al. (1982). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).
    • Mann und Baltimore (1985). J. Virol. 54, 401–407.
    • Marchuk, D. et al. (1990). Construction of T-vectors, a rapid und general system for direct cloning of unmodified PCR products. Nucl. Acids Res. 19, 1154.
    • Margolskee (1992). Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 67–90.
    • Martin, R., et al. (1990). BioTechniques 9, 762–768.
    • Matsuura, H. et al. (1987). Pflugers Arch. 410, 596–603.
    • Matteucci, M.D. und Caruthers, M.H. (1981). J. Am. Chem. Soc. 103, 3185.
    • Matthews & Kricka (1988). Anal. Biochem. 169,1.
    • Metzger, et al. (1988). Nature 334, 31–36.
    • Miller (1992). Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 1–24.
    • Miller, et al. (1985). Mol. Cell. Biol. 5, 431–437.
    • Miller, et al. (1988). J. Virol. 62, 4337–4345.
    • Modrich, P. (1991). Ann. Rev. Genet. 25, 229–253.
    • Mambaerts, P., et al. (1992). Cell 68, 869.
    • Moss, A.J. und McDonald, J. (1970). Unilateral cervicothoracic sympathetic ganglionectomy for the treatment of long QT interval syndrome. N. Engl. J. Med. 285, 903–904.
    • Moss, A.J. et al. (1991). The long QT syndrome: prospective longitudinal study of 328 families. Circulation 84, 1136–1144.
    • Moss (1992). Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 25–38.
    • Muzyczka (1992). Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 97–123.
    • Nabel, et al. (1990). Science 249, 1285–1288.
    • Nabel (1992). Hum. Gene Ther. 3, 399–410.
    • „The Cardiac Arrhythmia Suppression Trial II Investigators. Effect of the antiarrhythmic agent moricizine on survival after myocardial infarction." (1992). N. Engl. J. Med. 327, 227.
    • Newton, C.R. et al. (1989). Nucl. Acids Res.17, 2503–2516.
    • Nguyen, Q., et al. (1992). BioTechniques 13, 116–123.
    • Novack, et al. (1986). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 586.
    • Ochman, H. et al. (1988). Genetic application of an inverse polymerase chain reaction. Genetics 120, 621–623.
    • Ohi, et al. (1990). Gene 89, 279–282.
    • Orita, M. et al. (1989). Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single strand conformation polymorphisms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2766–2770.
    • Page, et al. (1990). J. Virol. 64, 5370–5276.
    • Pellicer, et al. (1980). Science 209, 1414–1422.
    • Petropoulos, et al. (1992). J. Virol. 66, 3391–3397.
    • Philpott, K.L., et al. (1992). Science 256, 1448.
    • Pongs, O., et al. (1988). Shaker encodes a family of putative potassium channel proteins in the nervous system of Drosophila. EMBO J. 7, 1087–1095.
    • Quantin, et al. (1992). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 2581–2584.
    • Rano & Kidd (1989). Nucl. Acids Res. 17, 8392.
    • Rigby, P.W.J., et al. (1977). J. Mol. Biol. 113, 237–251.
    • Romano, C. (1965). Congenital cardiac arrhythmia. Lancet 1, 658–659.
    • Rosenfeld, et al. (1992). Cell 68, 143–155.
    • Roy, N. et al. (1994). Exclusion of HRAS from long QT locus. Nat. Genet. 8, 113–114.
    • Russell, M.W., et al. (1995). Localization of Romano-Ward long QT syndrome gene, LQT1, to the interval between tyrosine hydroxylase (TH) und DIIS1349. Am. J. Hum. Genet. 57, 503–507.
    • Sambrook, J., et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).
    • Sanguinetti, M.C. et al. (1996). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 2208–2212.
    • Sanguinetti, M.C. et al. (1995). Cell 81, 299–307.
    • Sanguinetti, M.C. und Jurkiewicz, N.K. (1990). J. Gen. Physiol. 96, 195–215.
    • Schott, J., et al. (1995). Mapping of a gene for long QT syndrome to chromosome 4g25-27. Am. J. Hum. Genet. 57, 1114–1122.
    • Schwartz, P. J. et al. (1975). The long QT syndrome. Am. Heart J. 109, 378–390.
    • Schwartz, P. J. et al. (1994). The long QT syndrome. In Cardiac Electrophysiology: from cell to bedside. D. P. Zipes und J. Jalife eds. (W.B. Sanders Company) S. 788–811.
    • Seino, S. et al. (1992). Assignment of the gene encoding the α1 subunit of the neuroendocrine/braintype calcium channel(CACNL1A2) to human chromosome 3, band p14.3. Genomics 13, 1375–1377.
    • Sheffield, V.C., et al. (1989). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 232–236.
    • Sheffield, V.C., et al., (1991). Am. J. Hum. Genet. 49, 699–706.
    • Shenk, T.E. et al. (1975). Biochemical method for mapping mutational alterations in DNA with S1 nuclease; the location of deletions und temperature-sensitive mutations in simian virus 40. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 989–993.
    • Shimada, et al. (1991). J. Clin. Invest. 88, 1043–1047.
    • Shinkai, Y., et al. (1992). Cell 68, 855.
    • Smith, P.L. et al. (1996). Nature 379, 833–836.
    • Snouwaert, J.N., et al. (1992). Science 257, 1083.
    • Sorge, et al. (1984). Mol. Cell. Biol. 4, 1730–1737.
    • Spector, P.S. et al. (1996). J. Gen. Physiol. 107, 611–619.
    • Sternberg, N. (1990). Bacteriophage P1 cloning system for the isolation, amplification, und recovery of DNA fragments as large as 100 kilobase pairs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 103–107.
    • Stewart, et al. (1992). Hum. Gene Ther. 3, 267–275.
    • Stratford-Perricaudet, et al. (1990). Hum. Gene Ther. 1, 241–256.
    • Surawicz, B. (1989). Electrophysiologic substrate of torsade de pointes: Dispersion of repolarization or early after depolarizations? J. Am. Coll. Cardiol. 14, 172–184.
    • Takumi, T. et al. (1988). Science 242, 1042–1045.
    • Takumi, T., et al. (1991). J. Biol. Chem. 266, 22192-22198.
    • Tanigami, A., et al. (1992). Mapping of 262 DNA markers into 24 intervals on human chromosome 11. Am. J. Hum. Genet. 50, 56–64.
    • Tokino, T., et al. (1991). Isolation und mapping of 62 new RFLP markers on human chromosome 11. Am. J. Hum. Genet. 48, 258–268.
    • Towbin, J. A. et al. (1994). Evidence of genetic heterogeneity in Romano-Ward long QT syndrome (LQTs): Analysis of 23 families. Circulation 90, 2635–2644.
    • Valancius, V. & Smithies, O. (1991). Mol. Cell Biol. 11, 1402.
    • Vincent, G. M. et al. (1992). The spectrum of symptoms und QT intervals in carriers of the gene for the long QT syndrome. N. Engl. J. Med. 327, 846–852.
    • Wagner, et al. (1991). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4255–4259.
    • Wagner, et al. (1990). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410–3414.
    • Wang und Huang (1989). Biochemistry 28, 9508–9514.
    • Wang, K.-W. und Goldstein, S.A.N. (1995). Neuron 14, 1303–1309.
    • Wang, K., Tai, K. und Goldstein, S.A.N. (1996). Neuron 16, 571–577.
    • Wang, Q. und Keating, M. T. (1994). Isolation of P1 insert ends by direct sequencing. BioTechniques 17, 282–284.
    • Wang, Q. et al. (1995a). SCN5A Mutations Associated with an Inherited Cardiac Arrhythmia, Long QT Syndrome. Cell 80, 805–811.
    • Wang, Q., et al. (1995b). Cardiac sodium channel mutations in patients with long QT syndrome, an inherited cardiac arrhythmia. Hum. Mol. Genet. 4, 1603–1607.
    • Wang, Q., et al. (1996). Nature Genetics 12, 17–23.
    • Ward, O. C. (1964). A new familial cardiac syndrome in children. J. Ir. Med. Assoc. 54, 103–106.
    • Warmke, J. E. und Ganetzky, B. (1994). A family of potassium channel genes related to eag in Drosophila und mammals. Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 3438–3442.
    • Wartell, R.M., et al. (1990). Nucl. Acids Res. 18, 2699–2705.
    • Weinstein, L.S. et al. (1988). Cloning und characterization of the human gene for the α-subunit of Gi2, a GTP-binding signal transduction protein. FEBS Letters 232, 333–340.
    • Wetmur & Davidson (1968). J. Mol. Biol. 31, 349–370.
    • White, M.B., et al. (1992). Genomics 12, 301–306.
    • Wilkinson, et al. (1992). Nucleic Acids Res. 20, 2233–2239.
    • Willich, S. N. et al. (1987). Circadian variation in the incidence of sudden cardiac death in the Framingham heart study population. Am. J. Cardiol. 60, 801–806.
    • Wolff, et al. (1990). Science 247, 1465–1468.
    • Wolff, et al. (1991). BioTechniques 11, 474–485.
    • Wu, et al. (1989). J. Biol. Chem. 264, 16985–16987.
    • Wu, et al. (1991). J. Biol. Chem. 266, 14338–14342.
    • Wymore, R.S., et al. (1994). Genomic organization, nucleotide sequence, biophysical properties, und localization of the voltage-gated K+ channel gene KCN4A/KV1.4 to mouse chromosome 2/human 11p14 und mapping of KCNC1/KV3.1 to mouse 7/human 11p14.3-p15.2 und KCNA1/Kv1.1 to human 12p13. Genomics 20, 191202.
    • Zenke, et al. (1990). Proc. Natl. Acad. Sci. USA87, 3655–3659.
    • Zipes, D.P. (1987). Proarrhythmic effects of antiarrhythmic drugs. Am. J. Cardiol. 59, 26E–31E.
    • European Patent Application Publication Nr. 0332435.
    • EPO Publication Nr. 225,807.
    • Hitzeman et al., EP 73,675A .
  • Patente und Patentanmeldungen:
    • PCT published application WO 93/07282.
    • U.S. Patent 4,376,110.
    • U.S. Patent 4,486,530.
    • U.S. Patent 4,868,105.
    • U.S. Patent 5,252,479.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00970001
  • Figure 00980001
  • Figure 00990001
  • Figure 01000001
  • Figure 01010001
  • Figure 01020001
  • Figure 01030001
  • Figure 01040001
  • Figure 01050001
  • Figure 01060001
  • Figure 01070001
  • Figure 01080001
  • Figure 01090001
  • Figure 01100001
  • Figure 01110001
  • Figure 01120001
  • Figure 01130001
  • Figure 01140001
  • Figure 01150001
  • Figure 01160001
  • Figure 01170001
  • Figure 01180001
  • Figure 01190001
  • Figure 01200001
  • Figure 01210001

Claims (7)

  1. Eine Zelle, umfassend eine DNS, die kodiert für (a) menschliches minK und menschliches KVLQT1; (b) menschliches minK und mutiertes menschliches KVLQT1; (c) mutiertes menschliches minK und menschliches KVLQT1; oder (d) mutiertes menschliches minK und mutiertes menschliches KVLQT1, wobei jene DNS exprimiert wird, und wobei jene Zelle im Hinblick auf diese DNS heterolog ist.
  2. Eine Zelle, umfassend eine RNS, die komplementär ist zu einer DNS, die kodiert für (a) menschliches minK und menschliches KVLQT1; (b) menschliches minK und mutiertes menschliches KVLQT1; (c) mutiertes menschliches minK und menschliches KVLQT1; oder (d) mutiertes menschliches minK und mutiertes menschliches KVLQT1, wobei jene RNS translatiert wird, und wobei jene Zelle im Hinblick auf jene RNS heterolog ist.
  3. Ein Verfahren zum Auffinden von Wirkstoffen, die zur Behandlung oder Vorbeugung von Long-QT-Syndrom verwendbar sind, wobei das Verfahren umfasst: (a) das Einbringen der Zelle nach Anspruch 1(a) oder Anspruch 2(a) in eine Badelösung zur Strommessung; (b) das Messen des induzierten K+-Stroms in der Zelle aus Schritt (a); (c) das Einbringen der Zelle nach Anspruch 1(b), 1(c), 1(d), 2(b), 2(c) oder 2(d) in eine Badelösung zur Strommessung; (d) das Messen des induzierten K+-Stroms in der Zelle aus Schritt (c); (e) die Zugabe eines Wirkstoffs zu der Badelösung aus Schritt (d); (f) die Messung des induzierten K+-Stroms in der Zelle aus Schritt (e); (g) die Bestimmung, ob der Wirkstoff einen Strom induzierte, der dem in einer mit menschlichem minK und menschlichem KVLQT1 kotransfizierten Zelle beobachteten induzierten K+-Strom ähnlicher oder weniger ähnlich ist, im Vergleich mit dem in einer mit (i) menschlichem minK und mutiertem menschlichem KVLQT1; (ii) mutiertem menschlichem minK und menschlichem KVLQT1; oder (iii) mutiertem menschlichem minK und mutiertem menschlichem KVLQT1 kotransfizierten Zelle beobachteten Strom in Abwesenheit eines Wirkstoffs, wobei Wirkstoffe, die einen Strom auslösen, der dem in einer mit menschlichem minK und menschlichem KVLQT1 kotransfizierten Zelle beobachteten Strom ähnlicher ist, zur Behandlung oder Vorbeugung von Long-QT-Syndrom verwendet werden können.
  4. Das Verfahren nach Anspruch 3, wobei jene Zellen aus Säugetieren stammen.
  5. Das Verfahren nach Anspruch 4, wobei jene Zellen CHO-Zellen sind.
  6. Ein nichtmenschliches transgenes Tier, wobei jenes Tier (a) menschliches minK und menschliches KVLQT1; (b) menschliches minK und mutiertes menschliches KVLQT1; (c) mutiertes menschliches minK und menschliches KVLQT1; oder (d) mutiertes menschliches minK und mutiertes menschliches KVLQT1 umfasst.
  7. Ein Verfahren zum Auffinden von Wirkstoffen, die zur Behandlung oder Vorbeugung von Long-QT-Syndrom verwendbar sind, wobei das Verfahren umfasst: (a) das Messen des induzierten K+-Stroms in dem transgenen Tier nach Anspruch 6(a); (b) das Messen des induzierten K+-Stroms in dem transgenen Tier nach Anspruch 6(a), 6(b), 6(c) oder 6(d); (c) die Verabreichung eines Wirkstoffs an das transgene Tier aus Schritt (b); (d) die Messung des induzierten K+-Stroms in dem mit dem Wirkstoff behandelten Tier aus Schritt (c); (e) die Bestimmung, ob der Wirkstoff einen Strom induzierte, der dem in einem menschliches minK und menschliches KVLQT1 umfassenden transgenen Tier beobachteten induzierten K+-Strom ähnlicher oder weniger ähnlich ist, im Vergleich mit dem in einem (i) menschliches minK und mutiertes menschliches KVLQT1; (ii) mutiertes menschliches minK und menschliches KVLQT1; oder (iii) mutiertes menschliches minK und mutiertes menschliches KVLQT1 umfassenden transgenen Tier beobachteten Strom in Abwesenheit eines Wirkstoffs, wobei Wirkstoffe, die einen Strom auslösen, der dem in einem menschliches minK und menschliches KVLQT1 umfassenden transgenen Tier beobachteten Strom ähnlicher ist, zur Behandlung oder Vorbeugung von Long-QT-Syndrom verwendet werden können.
DE69636870T 1995-12-22 1996-12-20 KVLQT1 - EIN GEN DES LONG-QT-SYNDROMS, WELCHES FÜR KVLQT1 KODIERT UND WELCHES SICH MIT Mink ZUSAMMENSETZT, UM Iks-KALIUMKANÄLE DES HERZENS ZU BILDEN Expired - Lifetime DE69636870T2 (de)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US1901495P 1995-12-22 1995-12-22
US19014P 1995-12-22
US73938396A 1996-10-29 1996-10-29
US739383 1996-10-29
PCT/US1996/019756 WO1997023598A2 (en) 1995-12-22 1996-12-20 A long qt syndrome gene which encodes kvlqt1 and its association with mink

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69636870D1 DE69636870D1 (de) 2007-03-15
DE69636870T2 true DE69636870T2 (de) 2007-11-08

Family

ID=26691739

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69636870T Expired - Lifetime DE69636870T2 (de) 1995-12-22 1996-12-20 KVLQT1 - EIN GEN DES LONG-QT-SYNDROMS, WELCHES FÜR KVLQT1 KODIERT UND WELCHES SICH MIT Mink ZUSAMMENSETZT, UM Iks-KALIUMKANÄLE DES HERZENS ZU BILDEN
DE69637895T Expired - Lifetime DE69637895D1 (de) 1995-12-22 1996-12-20 Ein gen des "langen qt syndroms" (long qt syndrom), welches kvlqt1 kodiert und seine wechselwirkung mit mink

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69637895T Expired - Lifetime DE69637895D1 (de) 1995-12-22 1996-12-20 Ein gen des "langen qt syndroms" (long qt syndrom), welches kvlqt1 kodiert und seine wechselwirkung mit mink

Country Status (11)

Country Link
EP (3) EP2085478A1 (de)
JP (2) JP2001519646A (de)
AT (2) ATE427993T1 (de)
AU (2) AU714041B2 (de)
CA (1) CA2240737C (de)
DE (2) DE69636870T2 (de)
DK (1) DK0876491T3 (de)
ES (1) ES2325820T3 (de)
NZ (2) NZ330744A (de)
PT (1) PT876491E (de)
WO (2) WO1997023598A2 (de)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6277978B1 (en) 1995-12-22 2001-08-21 University Of Utah Research Foundation KVLQT1—a long QT syndrome gene
US6274332B1 (en) * 1995-12-22 2001-08-14 Univ. Of Utah Research Foundation Mutations in the KCNE1 gene encoding human minK which cause arrhythmia susceptibility thereby establishing KCNE1 as an LQT gene
JP4520634B2 (ja) * 1997-10-24 2010-08-11 ユニバーシティ・オブ・ユタ・リサーチ・ファウンデーション 良性の家族性新生児痙攣（ｂｆｎｃ）および他の癲癇において突然変異されたｋｃｎｑ２およびｋｃｎｑ３−カリウムチャンネル遺伝子
GB9726339D0 (en) * 1997-12-13 1998-02-11 Zeneca Ltd Human-derived tissue-specific potassium channel
AU747846B2 (en) * 1998-02-25 2002-05-23 Icagen, Inc. Human potassium channel genes
US6071720A (en) 1998-04-29 2000-06-06 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Delayed rectifier potassium channel subunit
US6794161B1 (en) 1999-01-26 2004-09-21 Neurosearch A/S Potassium channels and genes encoding these potassium channels
DE60031241T2 (de) * 1999-01-26 2007-02-08 Neurosearch A/S Kaliumkanäle und für diese kaliumkanäle kodierende gene
WO2001024681A2 (en) 1999-08-09 2001-04-12 University Of Utah Research Foundation Alterations in the long qt syndrome genes kvlqt1 and scn5a and methods for detecting same
US6458542B1 (en) 1999-10-08 2002-10-01 Vanderbilt University Method of screening for susceptibility to drug-induced cardiac arrhythmia
EP1176197A1 (de) * 2000-06-16 2002-01-30 Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie vzw. Transgenes Tiermodel für Herzarrythmien
CA2421584C (en) * 2000-09-06 2013-12-31 Johns Hopkins University Gene therapy for cardiac arrythmias
US8013133B2 (en) * 2003-04-25 2011-09-06 Medtronic, Inc. Genetic modification of targeted regions of the cardiac conduction system
US10917454B1 (en) 2019-08-01 2021-02-09 Rohde & Schwarz Gmbh & Co. Kg System and method for ATC voice quality assurance

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4486530A (en) 1980-08-04 1984-12-04 Hybritech Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
CA1188246A (en) 1981-08-31 1985-06-04 Jerry L. Gregory Immobilized microbe recycle apparatus
US4868105A (en) 1985-12-11 1989-09-19 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assay
IE61148B1 (en) 1988-03-10 1994-10-05 Ici Plc Method of detecting nucleotide sequences
IL103059A0 (en) 1991-09-30 1993-02-21 Boehringer Ingelheim Int Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
US5599673A (en) * 1995-03-09 1997-02-04 University Of Utah Research Foundation Long QT syndrome genes

Also Published As

Publication number Publication date
AU1742897A (en) 1997-07-17
PT876491E (pt) 2009-07-14
AU1951297A (en) 1997-07-17
DE69637895D1 (de) 2009-05-20
NZ330743A (en) 1999-07-29
JP2001519646A (ja) 2001-10-23
EP0870041A4 (de) 2002-01-23
WO1997023598A3 (en) 1997-09-12
EP2085478A1 (de) 2009-08-05
EP0870041A2 (de) 1998-10-14
WO1997023632A1 (en) 1997-07-03
ATE427993T1 (de) 2009-04-15
CA2240737C (en) 2009-09-29
EP0876491B1 (de) 2009-04-08
AU714041B2 (en) 1999-12-16
CA2240737A1 (en) 1997-07-03
NZ330744A (en) 1999-02-25
EP0870041B1 (de) 2007-01-24
EP0876491A4 (de) 2001-12-19
WO1997023598A2 (en) 1997-07-03
JP3449419B2 (ja) 2003-09-22
DK0876491T3 (da) 2009-07-06
EP0876491A1 (de) 1998-11-11
ATE352629T1 (de) 2007-02-15
AU714527B2 (en) 2000-01-06
JP2001501445A (ja) 2001-02-06
DE69636870D1 (de) 2007-03-15
ES2325820T3 (es) 2009-09-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69837565T2 (de) Mutationen des menschlichen mink gens, die mit arrhytmie verbunden sind
DE69636870T2 (de) KVLQT1 - EIN GEN DES LONG-QT-SYNDROMS, WELCHES FÜR KVLQT1 KODIERT UND WELCHES SICH MIT Mink ZUSAMMENSETZT, UM Iks-KALIUMKANÄLE DES HERZENS ZU BILDEN
DE69635751T2 (de) &#34;long qt&#34; gene und methode zur diagnose oder prävention des &#34;long qt&#34; syndroms
WO1997023598A9 (en) A long qt syndrome gene which encodes kvlqt1 and its association with mink
DE69936781T2 (de) Kvlqt1 - im zusammenhang mit &#39;long qt syndrom&#39;
KR100508845B1 (ko) KVLQT1을 코딩하는 장기 QT증후군 유전자 및 KVLQT1과 minK의 결합체
CA2240739A1 (en) A long qt syndrome gene which encodes kvlqt1 and its association with mink
KR19990076620A (ko) Kvlqt1을 코딩하는 장기 qt 증후군 유전자 및kvlqt1과 mink의 결합체

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8328 Change in the person/name/address of the agent

Representative=s name: DF-MP, 80333 MUENCHEN