[go: up one dir, main page]

DE69635193T3 - System for measuring the electrical potential through a membrane - Google Patents

System for measuring the electrical potential through a membrane Download PDF

Info

Publication number
DE69635193T3
DE69635193T3 DE69635193T DE69635193T DE69635193T3 DE 69635193 T3 DE69635193 T3 DE 69635193T3 DE 69635193 T DE69635193 T DE 69635193T DE 69635193 T DE69635193 T DE 69635193T DE 69635193 T3 DE69635193 T3 DE 69635193T3
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
membrane
reagent
fluorescent
group
fluorescence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69635193T
Other languages
German (de)
Other versions
DE69635193D1 (en
DE69635193T2 (en
Inventor
Roger Y. La Jolla Tsien
Jesus E. La Jolla Gonzalez
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California
University of California Berkeley
University of California San Diego UCSD
Original Assignee
University of California
University of California Berkeley
University of California San Diego UCSD
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23914150&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE69635193(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by University of California, University of California Berkeley, University of California San Diego UCSD filed Critical University of California
Publication of DE69635193D1 publication Critical patent/DE69635193D1/en
Application granted granted Critical
Publication of DE69635193T2 publication Critical patent/DE69635193T2/en
Publication of DE69635193T3 publication Critical patent/DE69635193T3/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
    • C07D209/08—Indoles; Hydrogenated indoles with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms, directly attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/28—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D239/46—Two or more oxygen, sulphur or nitrogen atoms
    • C07D239/60—Three or more oxygen or sulfur atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/28—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D239/46—Two or more oxygen, sulphur or nitrogen atoms
    • C07D239/60—Three or more oxygen or sulfur atoms
    • C07D239/62—Barbituric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/28—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D239/46—Two or more oxygen, sulphur or nitrogen atoms
    • C07D239/60—Three or more oxygen or sulfur atoms
    • C07D239/66—Thiobarbituric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/04—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring
    • C07D311/06—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 2
    • C07D311/08—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 2 not hydrogenated in the hetero ring
    • C07D311/16—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 2 not hydrogenated in the hetero ring substituted in position 7
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F5/00—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic Table
    • C07F5/003—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic Table without C-Metal linkages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F5/00—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic Table
    • C07F5/02—Boron compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F5/00—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic Table
    • C07F5/02—Boron compounds
    • C07F5/027—Organoboranes and organoborohydrides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/09—Esters of phosphoric acids
    • C07F9/10—Phosphatides, e.g. lecithin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/553—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07F9/572—Five-membered rings
    • C07F9/5728—Five-membered rings condensed with carbocyclic rings or carbocyclic ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
    • C09B23/02—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5041—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects involving analysis of members of signalling pathways
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5058—Neurological cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5061—Muscle cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5076—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving cell organelles, e.g. Golgi complex, endoplasmic reticulum
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/805—Optical property

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)
  • Measuring Instrument Details And Bridges, And Automatic Balancing Devices (AREA)
  • Traffic Control Systems (AREA)
  • Photometry And Measurement Of Optical Pulse Characteristics (AREA)
  • Measurement Of Current Or Voltage (AREA)
  • Image Input (AREA)
  • Pyridine Compounds (AREA)
  • Pyrane Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Compounds Containing Sulfur Atoms (AREA)
  • Quinoline Compounds (AREA)

Abstract

Methods and compositions are provided for determining the potential of a membrane. In one aspect, the method comprises: (a) introducing a first reagent comprising a hydrophobic fluorescent ion capable of redistributing from a first face of the membrane to a second face of the membrane in response to changes in the potential of the membrane, as described by the Nernst equation, (b) introducing a second reagent which labels the first face or the second face of the membrane, which second reagent comprises a chromophore capable of undergoing energy transfer by either (i) donating excited state energy to the fluorescent ion, or (ii) accepting excited state energy from the fluorescent ion, (c) exposing the membrane to radiation; (d) measuring energy transfer between the fluorescent ion and the second reagent, and (e) relating the energy transfer to the membrane potential. Energy transfer is typically measured by fluorescence resonance energy transfer. In some embodiments the first and second reagents are bound together by a suitable linker. In one aspect the method is used to identify compounds which modulate membrane potentials in biological membranes.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen den Nachweis und die Messung von Transmembran-Potentialen. Insbesondere betrifft die Erfindung Zusammensetzungen und optische Verfahren zur Bestimmung von Transmembran-Potentialen biologischer Zellen.The present invention generally relates to the detection and measurement of transmembrane potentials. In particular, the invention relates to compositions and optical methods for the determination of transmembrane potentials of biological cells.

Fluoreszenznachweis und Abbilden von zellulärer elektrischer Aktivität ist eine sehr wichtige Technik mit Potential (A. Grinvald, R. D. Frostig, E. Lieke, R. Hildesheim, 1988, Optical imaging of neuronal activity, Physiol. Rev. 68, 1285–1366; B. M. Salzberg, 1983, Optical recording of electrical activity in neurons using molcular grobes, in: Current Methods in Cellular Neurobiology, J. L. Barker, Hrsg., Wiley, New York, 139–187; L. B. Cohen, S. Lesher, 1985, Optical monitoring of membrane potential: methods of multisite optical measurement, in: Optical Methods in Cell Physiology, P. de Weer, B. M. Salzberg, Hrsg., Wiley, New York, 71–99).Fluorescence detection and imaging of cellular electrical activity is a very important technique with potential (Grinvald, RD Frostig, E. Lieke, R. Hildesheim, 1988, Optical Imaging of Neuronal Activity, Physiol Rev. 68, 1285-1366, BM Salzberg , 1983, Optical recording of electrical activity in neurons using molecular coarse, in: Current Methods in Cellular Neurobiology, JL Barker, ed., Wiley, New York, 139-187; LB Cohen, S. Lesher, 1985, Optical monitoring of membrane potential: methods of multisite optical measurement, in: Optical Methods in Cell Physiology, P. de Weer, BM Salzberg, Ed., Wiley, New York, 71-99).

Die Mechanismen für das optische Abtasten eines Membranpotentials wurden traditionell in zwei Klassen eingeteilt:

  • 1.) empfindliche, aber langsame Umverteilung von permeablen Ionen vom extrazellulären Medium in die Zelle, und
  • 2.) schnelle, aber geringfügige Störungen von relativ impermeablen Farbstoffen, die auf einer Fläche der Plasmamembran gebunden sind; vgl. L. M. Loew, ”How to choose a potentiometric membrane probe”, in: Spectroscopic Membrane Probes, L. M. Loew, Hrsg., 139–151 (1988) (CRC Press, Boca Raton); L. M. Loew, ”Potentiometric membrane dyes”, in: Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity, W. T. Mason, Hrsg., 150–160 (1993) (Academic Press, San Diego).
The mechanisms for optically sensing a membrane potential have traditionally been divided into two classes:
  • 1.) sensitive but slow redistribution of permeable ions from the extracellular medium into the cell, and
  • 2.) rapid but slight disruption of relatively impermeable dyes bound on a surface of the plasma membrane; see. LM Loew, "How to choose a potentiometric membrane probe", in: Spectroscopic Membrane Probes, LM Loew, Eds., 139-151 (1988) (CRC Press, Boca Raton); LM Loew, "Potentiometric membrane dyes", in: Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity, WT Mason, Eds., 150-160 (1993) (Academic Press, San Diego).

Die permeablen Ionen sind empfindlich, da das Verhältnis ihrer Konzentrationen zwischen der Innen- und Außenseite der Zelle sich bis zur Nernstschen Grenze von 10fach für eine Veränderung des Transmembran-Potentials von 60 mV ändern kann. Ihre Antworten darauf sind jedoch langsam, da zur Einstellung neuer Gleichgewichte Ionen durch unbewegte Schichten in jeder wäßrigen Phase und dem Inneren der Plasmamembran, das eine niedrige Dielektrizitätskonstante aufweist, diffundieren müssen. Darüber hinaus verteilen sich solche Farbstoffe ungerichtet in alle verfügbaren hydrophoben Bindungsstellen. Daher ist eine Selektivität zwischen Zelltypen schwierig. Auch jegliche Zugaben von hydrophoben Proteinen oder Reagenzien zur externen Lösung oder Veränderungen beim Aussetzen gegenüber hydrophoben Oberflächen können Artefakte verursachen. Diese Indikatoren können auch keine Verschiebung von Fluoreszenz-Wellenlängen oder ratiometrischen Ergebnissen liefern. Solche Doppel-Wellenlängen-Darstellungen sind zur Vermeidung von Artefakten geeignet, die auf Veränderungen in der Farbstoffkonzentration, der Weglänge, der Zellzahl, der Quellenintensität und der Nachweiseffizienz zurückzuführen sind.The permeable ions are sensitive because the ratio of their concentrations between the inside and outside of the cell can change up to 10 times the Nernstian limit for a change in transmembrane potential of 60 mV. However, their answers to this are slow because, to adjust new equilibria, ions must diffuse through immobile layers in each aqueous phase and the interior of the plasma membrane, which has a low dielectric constant. In addition, such dyes are randomly distributed in all available hydrophobic binding sites. Therefore, selectivity between cell types is difficult. Also, any additions of hydrophobic proteins or external solution reagents or alterations upon exposure to hydrophobic surfaces can cause artifacts. These indicators also fail to provide a shift in fluorescence wavelengths or ratiometric results. Such dual-wavelength plots are useful for avoiding artifacts due to changes in dye concentration, path length, cell count, source intensity, and detection efficiency.

Im Gegensatz dazu können die impermeablen Farbstoffe sehr schnell antworten, da sie nur eine geringe oder keine örtliche Verschiebung erfordern. Die impermeablen Farbstoffe sind jedoch unempfindlich, da sie das elektrische Feld mit nur einem Teil einer Einheitsladung abfühlen, die sich nicht über die gesamte Länge des Moleküls bewegt, wobei die Länge wiederum nur einen kleinen Teil der Transmembran-Distanz darstellt. Darüber hinaus stammt ein signifikanter Anteil des gesamten Farbstoffsignals von Molekülen, die sich auf irrelevanten Membranen oder Zellen befinden, was zur Verwässerung des Signals von den wenigen richtig plazierten Molekülen führt.

  • Rink et al. in Biochem. Biophys. Acta, Bd. 595 (1980), Seiten 15–30, die Verwendung von Bis-(1,3-diethylthiobarbiturat)-trimethin-oxonol als Fluoreszenzsonde zur Messung von Membranpotentialen.
In contrast, the impermeable dyes can respond very quickly because they require little or no local displacement. However, the impermeable dyes are insensitive because they sense the electric field with only a portion of a unit charge that does not move the full length of the molecule, again representing only a small portion of the transmembrane distance. Moreover, a significant portion of the total dye signal originates from molecules located on irrelevant membranes or cells, resulting in dilution of the signal from the few properly placed molecules.
  • Rink et al. in Biochem. Biophys. Acta, Bd. 595 (1980), pages 15-30, the use of bis (1,3-diethylthiobarbiturate) trimethine oxonol as a fluorescence probe for the measurement of membrane potentials.

Die US-PS 4,560,665 beschreibt ein Verfahren zur Messung von Membranfusionen zwischen Liposomen, die aus Phospholipid hergestellt sind, wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch die Kombination von Ionophoren, fluoreszierenden Farbstoffen, die gegenüber dem Membranpotential (im Inneren negativ) empfindlich sind, und Porinen, die die membranbildenden Proteine sind. Mit diesem Verfahren kann das Ausmaß der Liposomfusion einfach und genau bestimmt werden.The U.S. Patent 4,560,665 describes a method of measuring membrane fusion between liposomes made from phospholipid, which method is characterized by the combination of ionophores, fluorescent dyes that are (negatively sensitive to) the membrane potential, and porins, which are the membrane-forming proteins , With this method, the extent of liposome fusion can be determined easily and accurately.

Die US-PS 4,861,727 beschreibt einen Sauerstoff-Sensor zur Bestimmung des Partialdrucks von Sauerstoff. Der Sauerstoff-Sensor umfaßt Sauerstoff-quenchbare lumineszierende Lanthanidkomplexe, vorzugsweise Terbiumkomplexe von Schiffschen Basen oder β-Diketon-Liganden.The U.S. Patent 4,861,727 describes an oxygen sensor for determining the partial pressure of oxygen. The oxygen sensor comprises oxygen-quenchable luminescent lanthanide complexes, preferably terbium complexes of Schiff bases or β-diketone ligands.

Gutiérrez-Merino et al. beschreiben in Biochemistry, Bd. 34 (1995), Seiten 4846–4855, eine Studie zur Verteilung der beiden fluoreszierenden Phospholipid-Analoga über die Acetylcholin-Rezeptor (AChR)-reichen Membranen von Torpedo marmorata durch eine Kombination von nicht-strahlendem Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer unter Verwendung von Lipidsonden und Quenching ihrer Fluoreszenz mit Co2+ und 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure. Das Membranpotential wurde unter anderem unter Verwendung von exofacialer Rho-PE mit Co2+-Quenching der Fluoreszenz gemessen.Gutierrez-Merino et al. describe in Biochemistry, Vol. 34 (1995), pages 4846-4855, a study on the distribution of the two fluorescent phospholipid analogues over the acetylcholine receptor (AChR) -rich membranes of Torpedo marmorata by a combination of non-fluorescent fluorescence Resonance energy transfer using lipid probes and quenching their fluorescence with Co 2+ and 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid. Membrane potential was measured inter alia using exophacial Rho-PE with Co 2+ quenching of fluorescence.

Die EP-A-0 552 107 beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung des pH-Wertes oder von pCO2 mittels Lumineszenz-Lebensdauer und Energietransfer, wobei ein Energietransfer-Donor-Akzeptor-Paar einer zu analysierenden Probe ausgesetzt wird, wobei der Donor des Donor-Akzeptor-Paares photolumineszent ist und der Akzeptor des Donor-Akzeptor-Paares gegenüber dem pH-Wert oder dem pCO2 der Probe empfindlich ist. Eines oder beide Donor-Akzeptor-Paare können an einen Träger gebunden sein. Darüber hinaus kann der Donor und der Akzeptor mittels eines Spacers verbunden sein und sie liegen in einem bekannten Verhältnis vor.The EP-A-0 552 107 describes a method for determining the pH or pCO 2 by luminescence lifetime and energy transfer wherein an energy transfer donor-acceptor pair is exposed to a sample to be analyzed, wherein the donor of the donor-acceptor pair is photoluminescent and the acceptor of the donor-acceptor pair is sensitive to the pH or pCO 2 of the sample. One or both donor-acceptor pairs may be attached to a support. In addition, the donor and the acceptor may be linked by means of a spacer and they are in a known ratio.

Die WO 95/08637 betrifft einen nicht kompetitiven Immunoassay zum Nachweis des Vorliegens eines unbekannten Analyten in Lösung. Der Immunoassay umfaßt a) einen Ionenkanalrezeptor, der in einem Lipidfilm, der in Kontakt mit einer Ionen-enthaltenden Lösung auf jeder Seite davon steht, immobilisiert ist; b) einen mit dem Rezeptor konjugierten Liganden, der eine besondere Affinität für den Analyten in Lösung aufweist und der beim Binden an den Analyten in Lösung eine Hemmung des Ionenflusses durch den Kanal verursacht; und c) eine Einrichtung zum Nachweis der Hemmung des Ionenflusses durch den Kanal als Antwort auf das Binden des konjugierten Liganden an den Analyten.The WO 95/08637 relates to a non-competitive immunoassay for detecting the presence of an unknown analyte in solution. The immunoassay comprises a) an ion channel receptor immobilized in a lipid film in contact with an ion-containing solution on each side thereof; b) a receptor-conjugated ligand which has a particular affinity for the analyte in solution and which, when bound to the analyte in solution, causes inhibition of ion flow through the channel; and c) means for detecting inhibition of ion flow through the channel in response to binding of the conjugated ligand to the analyte.

Die EP-A-0 397 641 betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung eines oder mehrerer chemischer Parameter eines Probemediums wie z. B. die Wasserstoffionen-Konzentration oder die Ba2+-, Mg2+-, Ca2+-, usw. -Konzentration. Im Verfahren wird ein fluoreszierendes Mittel und ein nahe daran angrenzendes chromogenes Mittel eingesetzt.The EP-A-0 397 641 relates to a method for the quantitative determination of one or more chemical parameters of a sample medium such. For example, the hydrogen ion concentration or the Ba 2+ , Mg 2+ , Ca 2+ , etc. concentration. The method employs a fluorescent agent and a chromogenic agent adjacent thereto.

Die EP-A-0 429 907 betrifft einen Sensor mit einem Aufbau für ein Nachweisverfahren für Moleküle, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert sind, und zwar zum Nachweis dieser gelösten Substanzen durch Energietransfer mittels einer Fluoreszenztechnik.The EP-A-0 429 907 relates to a sensor with a structure for a detection method for molecules which are labeled with a fluorescent dye, for the detection of these solutes by energy transfer by means of a fluorescence technique.

Im Hinblick auf die vorstehend erwähnten Nachteile sind Verfahren und Zusammensetzungen erforderlich, die für kleine Veränderungen des Transmembran-Potentials empfindlich sind und sowohl auf schnelle, vorzugsweise im ms-Zeitmaßstab, als auch anhaltende Membranpotential-Veränderungen antworten können. Es besteht auch ein Bedarf für Verfahren und Zusammensetzungen, die gegenüber den Wirkungen von Veränderungen der externen Lösungszusammensetzungen weniger empfindlich sind, Membranen von speziellen Zelltypen besser selektiv kontrollieren und ein Fluoreszenz-Verhältnissignal bereitstellen können. Diese und vergleichbare Erfordernisse werden erfindungsgemäß erfüllt.In view of the above-mentioned disadvantages, methods and compositions are required which are sensitive to small changes in transmembrane potential and can respond to both rapid, preferably ms-time scale, and sustained membrane potential changes. There is also a need for methods and compositions that are less sensitive to the effects of changes in the external solution compositions, that are more selective in selectively controlling membranes of particular cell types and can provide a fluorescence ratio signal. These and comparable requirements are met according to the invention.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNGSUMMARY OF THE INVENTION

Es werden Verfahren und Zusammensetzungen zur Bestimmung von elektrischen Transmembran-Potentialen (Membranpotentialen), insbesondere der äußersten (Plasma-)Membran von lebenden Zellen bereitgestellt. In einem Aspekt umfaßt das Verfahren:

  • (a) Einführen eines ersten Reagenz, umfassend ein hydrophobes fluoreszierendes Ion, das sich von einer ersten Membranfläche zu einer zweiten Membranfläche als Antwort auf Veränderungen des Membranpotentials umverteilen kann, entsprechend der Nernst-Gleichung;
  • (b) Einführen eines zweiten Reagenz, das eine Fläche, üblicherweise die extrazelluläre Membranfläche markiert, wobei das zweite Reagenz einen Chromophor umfaßt, der einem Energietransfer unterliegen kann, entweder durch (i) Abgeben von Energie des angeregten Zustands an das fluoreszierende Ion oder (ii) Aufnehmen von Energie des angeregten Zustands vom fluoreszierenden Ion;
  • (c) Aussetzen der Membran gegenüber Anregungslicht einer geeigneten Wellenlänge, typischerweise in der ultravioletten oder sichtbaren Region;
  • (d) Messen des Energietransfers zwischen dem fluoreszierenden Ion und dem zweiten Reagenz; und
  • (e) In-Beziehung-Setzen des Energietransfers zum Membranpotential.
Methods and compositions for determining electrical transmembrane potentials (membrane potentials), in particular the outermost (plasma) membrane of living cells, are provided. In one aspect, the method comprises:
  • (a) introducing a first reagent comprising a hydrophobic fluorescent ion that can redistribute from a first membrane surface to a second membrane surface in response to changes in membrane potential according to the Nernst equation;
  • (b) introducing a second reagent which labels a surface, usually the extracellular membrane surface, the second reagent comprising a chromophore capable of undergoing energy transfer, either by (i) delivering excited state energy to the fluorescent ion or (ii ) Receiving energy of the excited state from the fluorescent ion;
  • (c) exposing the membrane to excitation light of a suitable wavelength, typically in the ultraviolet or visible region;
  • (d) measuring the energy transfer between the fluorescent ion and the second reagent; and
  • (e) relating the energy transfer to the membrane potential.

Erfindungsgemäß können die ersten und zweiten Reagenzien nur dann durch einen Linker miteinander verbunden sein, wenn das zweite Reagenz ein grün fluoreszierendes Protein, ein fluoreszierend markiertes Protein oder ein Coumarin umfasst. In allen anderen Ausführungsformen können die ersten und zweiten Reagenzien nicht durch eine Linkergruppe miteinander verbunden sein.According to the invention, the first and second reagents can be linked to each other only by a linker if the second reagent comprises a green fluorescent protein, a fluorescently labeled protein or a coumarin. In all other embodiments, the first and second reagents may not be linked together by a linker group.

Das zweite Reagenz ist vorzugsweise ein Fluorophor. In jedem Fall kann die Wechselwirkung des angeregten Zustands über einen Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET) ablaufen, der bevorzugt ist, oder über einige weitere Mechanismen wie Elektronentransfer, Austausch-Wechselwirkung (Dexter), paramagnetisches Quenching oder beschleunigtes Intersystem Crossing. Das Verfahren ist besonders geeignet zum Nachweis von Veränderungen des Membranpotentials der Plasmamembran in biologischen Zellen.The second reagent is preferably a fluorophore. In either case, the excited state interaction can proceed via fluorescence resonance energy transfer (FRET), which is preferred. or some other mechanisms such as electron transfer, exchange interaction (Dexter), paramagnetic quenching, or accelerated intersystem crossing. The method is particularly suitable for detecting changes in the membrane potential of the plasma membrane in biological cells.

Vorzugsweise ist das hydrophobe Ion ein Anion, das die extrazelluläre Oberfläche der Plasmamembran markiert. Nach Zugabe des hydrophoben fluoreszierenden Anions zur Membran, Zelle oder Gewebepräparation bewegt sich das Anion in die Plasmamembran, wo es sich zwischen den extrazellulären und intrazellulären Oberflächen gemäß einem Nernstschen Gleichgewicht verteilt. Veränderungen des Membranpotentials lassen das fluoreszierende Anion durch die Membran wandern, so daß es an eine positiv geladene Oberfläche (die intrazelluläre oder extrazelluläre Oberfläche) bindet, je nach dem, welche der beiden Oberflächen positiv geladen ist. Da die Effizienz des Energietransfers zwischen den beiden Reagenzien eine Funktion des Abstands zwischen ihnen ist und da dieser Abstand sich verändert, wenn das fluoreszierende Anion sich durch die Membran hin und zurück umverteilt, stellt die Messung des Energietransfers ein empfindliches Maß für Veränderungen des Transmembran-Potentials dar. Wenn sich beispielsweise das Membranpotential (intrazellulär im Verhältnis zu extrazellulär) von negativ zu positiv ändert, wird das fluoreszierende hydrophobe Anion von der extrazellulären Oberfläche zur intrazellulären Oberfläche der Plasmamembran gezogen. Wenn sich das zweite Reagenz auf der extrazellulären Oberfläche befindet, führt dies zu einer Vergrößerung des Abstands zwischen dem Anion und dem zweiten Reagenz und einem damit verbundenen Rückgang in der Effizienz des FRET und zu einem Quenching zwischen den beiden Spezies. Folglich führen Fluoreszenzmessungen bei geeigneten Anregungs- und Emissionswellenlängen zu einem Fluoreszenzmeßergebnis, das gegenüber den Veränderungen des Transmembran-Potentials empfindlich ist. Typischerweise ist die Zeitkonstante für die Umverteilung des fluoreszierenden Anions schnell und liegt im ms-Bereich. Das läßt eine bequeme Messung sowohl eines schnellen zellulären elektrischen Phänomens zu, wie eines Aktionspotentials oder einer Ligand-induzierten Kanalöffnung sowie von langsameren und länger andauernden Veränderungen, die durch Veränderung der Aktivität von Ionenpumpen oder -austauschern induziert werden.Preferably, the hydrophobic ion is an anion that labels the extracellular surface of the plasma membrane. Upon addition of the hydrophobic fluorescent anion to the membrane, cell or tissue preparation, the anion moves into the plasma membrane where it distributes between the extracellular and intracellular surfaces according to a Nernstian equilibrium. Changes in membrane potential cause the fluorescent anion to migrate through the membrane to bind to a positively charged surface (the intracellular or extracellular surface), depending on which of the two surfaces is positively charged. Since the efficiency of energy transfer between the two reagents is a function of the distance between them and as this distance changes as the fluorescent anion redistributes back and forth across the membrane, the measurement of energy transfer provides a sensitive measure of changes in transmembrane potential For example, as the membrane potential (intracellular versus extracellular) changes from negative to positive, the fluorescent hydrophobic anion is drawn from the extracellular surface to the intracellular surface of the plasma membrane. When the second reagent is on the extracellular surface, this leads to an increase in the distance between the anion and the second reagent and a concomitant decrease in the efficiency of the FRET and quenching between the two species. Consequently, fluorescence measurements at appropriate excitation and emission wavelengths will result in a fluorescence reading that is sensitive to changes in transmembrane potential. Typically, the time constant for the redistribution of the fluorescent anion is fast and in the ms range. This allows convenient measurement of both a rapid cellular electrical phenomenon, such as an action potential or ligand-induced channel opening, and slower and longer lasting changes induced by altering the activity of ion pumps or exchangers.

Herkömmliche elektrophysiologische Techniken nehmen das Potential an der Spitze einer Elektrode ab und sind folglich auf Messungen einer einzelnen Zelle beschränkt. Im Gegensatz dazu sind die hier beschriebenen optischen Indikatoren besonders vorteilhaft zur gleichzeitigen Kontrolle des Membranpotentials vieler Neuronen oder Muskelzellen. Optische Indikatoren erfordern anders als herkömmliche Mikroelektroden keine physikalische Punktion der Membran; in vielen Zellen oder Organellen führt eine solche Punktion zu starken Zerstörungen oder ist mechanisch schwierig durchzuführen. Optische Indikatoren sind somit für Zellen geeignet, die zu klein oder zu empfindlich sind, um von Elektroden durchbohrt zu werden.Conventional electrophysiological techniques reduce the potential at the tip of an electrode and are thus limited to measurements of a single cell. In contrast, the optical indicators described herein are particularly advantageous for simultaneously controlling the membrane potential of many neurons or muscle cells. Optical indicators, unlike conventional microelectrodes, require no physical puncture of the membrane; In many cells or organelles, such a puncture leads to severe destruction or is mechanically difficult to perform. Optical indicators are thus suitable for cells that are too small or too sensitive to be pierced by electrodes.

In einem anderen Aspekt der Erfindung lassen die Spannungsabfühlverfahren einen Nachweis der Wirkung von Testproben, wie potentiellen therapeutischen Arzneimittel-Molekülen, auf die Aktivierung/Deaktivierung von Ionen-Transporteinrichtungen (Kanälen, Pumpen oder Austauschern) zu, die in der Membran eingebettet sind.In another aspect of the invention, the voltage sensing techniques allow evidence of the effect of test samples, such as potential therapeutic drug molecules, on the activation / deactivation of ion transport devices (channels, pumps or exchangers) embedded in the membrane.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen umfassen zwei Reagenzien. Das erste Reagenz umfaßt ein hydrophobes fluoreszierendes Ion (vorzugsweise ein Anion), das sich von einer Membranoberfläche zur anderen als Antwort auf Veränderungen des Transmembran-Potentials umverteilen kann. Dieses Anion wird als mobiles oder hydrophobes Anion bezeichnet. Beispiele dafür sind Polymethinoxonole, Tetraarylborate, die mit Fluorophoren konjugiert sind, und fluoreszierende Komplexe von Seltenerd- und Übergangsmetallen. Das zweite Reagenz umfaßt einen Chromophor, vorzugsweise ein Fluorophor, der einem Energietransfer unterliegen kann, entweder durch (i) Abgeben von Energie des angeregten Zustands an das fluoreszierende Anion oder (ii) Aufnehmen von Energie des angeregten Zustands vom fluoreszierenden Anion. Das zweite Reagenz bindet selektiv an eine Oberfläche der Membran und im Gegensatz zum ersten Reagenz findet keine Umverteilung als Antwort auf Veränderungen des Membranpotentials statt. Es wird daher als das asymmetrisch gebundene oder nicht-mobile Reagenz bezeichnet. Beispiele für zweite Reagenzien sind fluoreszierende Lektine, fluoreszierende Lipide, fluoreszierende Kohlenhydrate, fluoreszierend-markierte Antikörper gegen Oberflächenmembranbestandteile und amphiphile fluoreszierende Farbstoffe. In der erfindungsgemäßen Ausführungsform, in der eine Linkergruppe vorliegen kann, ist die Linkergruppe ausreichend lang, so daß das erste Reagenz auf der dem zweiten Reagenz gegenüberliegenden Oberfläche der Membran verbleiben und somit den FRET verringern kann.The compositions of the invention comprise two reagents. The first reagent comprises a hydrophobic fluorescent ion (preferably an anion) that can redistribute from one membrane surface to another in response to changes in transmembrane potential. This anion is called a mobile or hydrophobic anion. Examples include polymethine oxonols, tetraaryl borates conjugated to fluorophores, and fluorescent complexes of rare earth and transition metals. The second reagent comprises a chromophore, preferably a fluorophore, which may undergo energy transfer, either by (i) donating excited state energy to the fluorescent anion or (ii) receiving excited state energy from the fluorescent anion. The second reagent selectively binds to a surface of the membrane and, unlike the first reagent, does not undergo redistribution in response to changes in membrane potential. It is therefore referred to as the asymmetrically bound or non-mobile reagent. Examples of second reagents are fluorescent lectins, fluorescent lipids, fluorescent carbohydrates, fluorescently-labeled antibodies to surface membrane constituents, and amphiphilic fluorescent dyes. In the embodiment of the present invention in which a linker group may be present, the linker group is sufficiently long that the first reagent may remain on the surface of the membrane opposite the second reagent and thus reduce the FRET.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGENBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Die Erfindung wird näher durch die begleitenden Zeichnungen erläutert, wobei:The invention will be explained in more detail by the accompanying drawings, wherein:

1A und 1B ein Schema des spannungsempfindlichen FRET-Mechanismus veranschaulichen; 1A and 1B illustrate a scheme of the voltage sensitive FRET mechanism;

2 normalisierte Anregungs- und Emissionsspektren von (A) Fluorescein-markiertem Weizenkeim-Agglutinin (FL-WGA) in Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS), (B) (1,3-Dihexyl-2-thiobarbiturat)-trimethinoxonol [DiSBA-C6-(3)] in Octanol und (C) TR-WGA in HBSS zeigt; 2 normalized excitation and emission spectra of (A) fluorescein-labeled wheatgerm agglutinin (FL-WGA) in Hanks balanced salt solution (HBSS), (B) (1,3-dihexyl-2-thiobarbiturate) trimethine oxonol [DiSBA-C 6 - (3)] in octanol and (C) TR-WGA in HBSS;

3 Verschiebungsströme von 2,3 μM DiSBA-C6-(3) in L-M(TK–)-Zellen bei 20°C zeigt; 3 Shift currents of 2.3 μM DiSBA-C 6 - (3) into LM (TK - ) cells at 20 ° C;

4 die Spannungsabhängigkeit von DiSBA-C6-(3) zeigt, das während der Verschiebungs- und Flankenströme bei stufenweisen Spannungsveränderungen, ausgehend von einem –30 mV Haltepotential bewegt wurde; 4 shows the voltage dependence of DiSBA-C 6 - (3), which was moved during the displacement and edge currents with stepwise voltage changes, starting from a -30 mV holding potential;

5 die Spannungsabhängigkeit von DiSBA-C6-(3) Verschiebungsstrom-Zeitkonstanten in L-M(TK–)-Zellen für die gleichen Daten wie in 4 zeigt; 5 the voltage dependence of DiSBA-C 6 - (3) shift current time constants in LM (TK - ) cells for the same data as in 4 shows;

6 die gleichzeitigen Fluoreszenzveränderungen des FL-WGA/DiSBA-C4-(3)-Paares als Antwort auf vier Depolarisationen von –70 mV auf 40, 80, 120 und 160 mV in einer L-M(TK–)-Zelle bei 20°C zeigt, wobei die Einzelwellenlängen-Fluoreszenzemissionspuren von DiSBA-C4-(3) und FL-WGA in A bzw. B und das FL-WGA/DiSBA-C4(3)-Verhältnis in (C) zeigt; 6 shows the simultaneous fluorescence changes of the FL-WGA / DiSBA-C 4 - (3) pair in response to four depolarizations of -70 mV to 40, 80, 120 and 160 mV in an LM (TK - ) cell at 20 ° C wherein the single-wavelength fluorescence emission traces of DiSBA-C show 4 - (3) and FL-WGA in A and B respectively and the FL-WGA / DiSBA-C 4 (3) ratio in (C);

7 den zeitlichen Verlauf der Fluoreszenzänderung des FL-WGA/DiSBA-C10-(3)-Paares als Antwort auf eine 100 mV Depolarisation, ausgehend von 70 mV zeigt; 7 shows the time course of the fluorescence change of the FL-WGA / DiSBA-C 10 (3) pair in response to a 100 mV depolarization, starting from 70 mV;

8 eine Einzel-Sweep-Spur der Fluoreszenzverhältnisänderungen des FL-WGA/DiSBA-C4-(3)-Paares in schlagenden neonatalen Herzmyozyten zeigt, wobei die obere Spur (A) den FL-WGA-Kanal, (B) den langwelligeren Oxonolkanal und (C) das FL-WGA/Oxonol-Verhältnis zeigt, bei dem Bewegungsartefakte signifikant verringert sind; 8th shows a single-sweep trace of the fluorescence ratio changes of the FL-WGA / DiSBA-C 4 - (3) pair in beating neonatal cardiac myocytes, with the upper lane (A) the FL-WGA channel, (B) the longer-wavelength oxonol channel and (C) shows the FL-WGA / oxonol ratio at which motion artifacts are significantly reduced;

9 die Fluoreszenzänderungen des FL-WGA/DiSBA-C6-(3)-Paares in einer spannungsabgegriffenen (voltage clamped) Astrozytomzellen zeigt, wobei die obere Spur (A) die DiSBA-C6-(3)-Emission, (B) das FL-WGA-Fluoreszenzsignal und (C) das FL-WGA/Oxonol-Verhältnis zeigt; 9 shows the fluorescence changes of the FL-WGA / DiSBA-C 6 - (3) pair in a voltage-clamped astrocytoma cell, the upper trace (A) showing the DiSBA-C 6 - (3) emission, (B) the FL-WGA fluorescence signal and (C) the FL-WGA / oxonol ratio;

10 die Synthese eines fluoreszierenden Tetraarylborats zeigt; 10 shows the synthesis of a fluorescent tetraarylborate;

11 eine Synthese eines asymmetrischen Oxonols und dessen Bindung an ein zweites Reagenz; 11 a synthesis of an asymmetric oxonol and its binding to a second reagent;

12 mögliche Bindungspunkte (X) von Oxonolen an ein zweites Reagenz zeigt; 12 showing potential binding points (X) of oxonols to a second reagent;

13 eine Synthese von DiSBA-C6-(3) zeigt; 13 shows a synthesis of DiSBA-C 6 - (3);

14 die Synthese eines bifunktionellen Linkers zeigt; 14 shows the synthesis of a bifunctional linker;

15 und 16 die Synthese eines asymmetrischen Oxonols mit einem Linker zeigen, der zur Bindung an ein zweites Reagenz geeignet ist; 15 and 16 show the synthesis of an asymmetric oxonol with a linker suitable for binding to a second reagent;

17 einen FRET zwischen Cou-PE, einem Konjugat eines 6-Chlor-7-hydroxycumarins mit Dimyristoylphosphatidylethanolamin als FRET-Donor, und einem Bis-(1,3-dihexyl-2-thiobarbiturat)-trimethinoxonol in einer Astrozytomzelle zeigt; 17 shows a FRET between Cou-PE, a conjugate of 6-chloro-7-hydroxycoumarin with dimyristoylphosphatidylethanolamine as FRET donor, and a bis (1,3-dihexyl-2-thiobarbiturate) trimethine oxonol in an astrocytoma cell;

18 einen FRET zwischen DMPE-Glycin-Cumarin (Cou-PE) als FRET-Donor und einem Bis-(1,3-dihexyl-2-thiobarbiturat)-trimethinoxonol in L-Zellen zeigt; 18 shows a FRET between DMPE-glycine coumarin (Cou-PE) as a FRET donor and a bis (1,3-dihexyl-2-thiobarbiturate) trimethine oxonol in L cells;

19 einen FRET zwischen DMPE-Glycin-Cumarin (Cou-PE) als FRET-Donor und einem Bis-(1,3-dihexyl-2-thiobarbiturat)-trimethinoxonol in Herzmyozyten zeigt, und zwar gemessen durch Ratio-Output; 19 shows a FRET between DMPE-glycine coumarin (Cou-PE) as a FRET donor and a bis (1,3-dihexyl-2-thiobarbiturate) trimethine oxonol in cardiac myocytes, as measured by ratio output;

20 repräsentative fluoreszierende Phosphatidylethanolamin-Konjugate zeigt, die als FRET-Donoren gegenüber den Oxonolen wirken. Die Strukturen der linken Seite zeigen repräsentative Fluorophore und X bezeichnet die Bindungsstelle des Phosphatidylethanolamins (PE). Die Struktur (PE-R) auf der rechten Seite zeigt ein Phosphatidylethanolamin, wobei R ein Fluorophor bezeichnet, das an die Aminogruppe des Ethanolamins gebunden ist; 20 show representative phosphatidylethanolamine fluorescent conjugates which act as FRET donors to the oxonols. The structures of the left side show representative fluorophores and X denotes the binding site of the phosphatidylethanolamine (PE). The structure (PE-R) on the right shows a phosphatidylethanolamine, wherein R denotes a fluorophore bonded to the amino group of the ethanolamine;

21 das (A) Emissionsspektrum von Cou-PE, (B) das Anregungsspektrum von DiSBA-C6-(5) und (C) das Emissionsspektrum von DiSBA-C6-(5) zeigt; 21 the (A) emission spectrum of Cou-PE, (B) the excitation spectrum of DiSBA-C 6 - (5) and (C) the emission spectrum of DiSBA-C 6 - (5);

22 die Geschwindigkeit der DiSBA-C6-(5)-Translokation als Antwort auf eine 100 mV Depolarisationsstufe zeigt, und zwar unter Verwendung des FRET eines asymmetrisch markierten Cou-PE; und 22 shows the rate of DiSBA C 6 (5) translocation in response to a 100 mV depolarization step using the FRET of an asymmetrically labeled Cou-PE; and

23 die Spektren von [TB(Salen)2]–1 (oben) und [Eu(Salen)2]–1 (unten) zeigt, wobei beide als Piperidiniumsalze, gelöst in Acetonitril, vorliegen. 23 shows the spectra of [TB (salen) 2 ] -1 (top) and [Eu (salen) 2 ] -1 (bottom), both being present as piperidinium salts dissolved in acetonitrile.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMDESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENT

Die folgenden Definitionen sollen die Bedeutung und den Bereich der verschiedenen Begriffe veranschaulichen und definieren, die zur Beschreibung der Erfindung verwendet werden.The following definitions are intended to illustrate and define the meaning and scope of the various terms used to describe the invention.

Der Begriff ”Hydrocarbyl” bezieht sich auf einen organischen Rest, der Kohlenstoffketten umfaßt, an die Wasserstoffatome und andere Elemente gebunden sind. Der Begriff beinhaltet Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl- und Arylgruppen, Gruppen, die aus einem Gemisch von gesättigten und ungesättigten Bindungen bestehen, carbocyclische Ringe sowie Kombinationen solcher Gruppen. Der Begriff kann sich auf geradkettige, verzweigtkettige, cyclische Strukturen oder Kombinationen davon beziehen.The term "hydrocarbyl" refers to an organic radical comprising carbon chains to which hydrogen atoms and other elements are attached. The term includes alkyl, alkenyl, alkynyl and aryl groups, groups consisting of a mixture of saturated and unsaturated bonds, carbocyclic rings and combinations of such groups. The term may refer to straight-chain, branched-chain, cyclic structures or combinations thereof.

Der Begriff ”Alkyl” bezieht sich auf einen verzweigt- oder geradkettigen acyclischen, einwertigen gesättigten Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen.The term "alkyl" refers to a branched or straight chain acyclic monovalent saturated hydrocarbon radical of 1 to 20 carbon atoms.

Der Begriff ”Alkenyl” bezieht sich auf einen ungesättigten Kohlenwasserstoffrest, der mindestens eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung enthält, und beinhaltet geradkettige, verzweigtkettige und cyclische Reste.The term "alkenyl" refers to an unsaturated hydrocarbon radical containing at least one carbon-carbon double bond and includes straight-chain, branched-chain and cyclic radicals.

Der Begriff ”Alkinyl” bezieht sich auf einen ungesättigten Kohlenwasserstoffrest, der mindestens eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindung enthält und beinhaltet geradkettige, verzweigtkettige und cyclische Reste.The term "alkynyl" refers to an unsaturated hydrocarbon radical containing at least one carbon-carbon triple bond and includes straight-chain, branched-chain and cyclic radicals.

Der Begriff ”Nieder”, der hier in Verbindung mit organischen Resten bzw. Verbindungen verwendet wird, definiert Reste bzw. Verbindungen mit bis zu und einschließlich 6, vorzugsweise bis zu und einschließlich 4 Kohlenstoffatomen. Solche Reste können geradkettig oder verzweigtkettig sein.The term "lower" used herein in connection with organic radicals or compounds defines radicals or compounds of up to and including 6, preferably up to and including 4 carbon atoms. Such radicals may be straight-chain or branched-chain.

Der Begriff ”Heteroalkyl” bezieht sich auf einen verzweigt- oder geradkettigen acyclischen, einwertigen gesättigten Rest mit 2 bis 40 Atomen in der Kette, wobei mindestens eines der Atome in der Kette ein Heteroatom wie z. B. Sauerstoff oder Schwefel ist.The term "heteroalkyl" refers to a branched or straight chain acyclic, monovalent saturated radical having from 2 to 40 atoms in the chain, wherein at least one of the atoms in the chain is a heteroatom, such as e.g. As oxygen or sulfur.

Der Begriff ”Niederalkyl” bezieht sich auf einen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Beispiele für Niederalkylreste sind Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, Isobutyl-, sec-Butyl-, n-Butyl-, t-Butyl-, n-Hexyl- und 3-Methylpentylgruppen.The term "lower alkyl" refers to an alkyl radical of 1 to 6 carbon atoms. Examples of lower alkyl radicals are methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, isobutyl, sec-butyl, n-butyl, t-butyl, n-hexyl and 3-methylpentyl groups.

Der Begriff ”Cycloalkyl” bezieht sich auf einen einwertigen gesättigten carbocyclischen Rest mit 3 bis 12 Kohlenstoffatomen im Carbocyclus.The term "cycloalkyl" refers to a monovalent saturated carbocyclic radical having from 3 to 12 carbon atoms in the carbocycle.

Der Begriff ”Heterocycloalkyl” bezieht sich auf einen einwertigen gesättigten cyclischen Rest mit 1 bis 12 Atomen im Ring, wobei der Ring mindestens ein Heteroatom (wie Sauerstoff oder Schwefel) enthält.The term "heterocycloalkyl" refers to a monovalent saturated cyclic radical having from 1 to 12 atoms in the ring, which ring contains at least one heteroatom (such as oxygen or sulfur).

Der Begriff ”Alkylen” bezieht sich auf einen vollständig gesättigten, cyclischen oder acyclischen, zweiwertigen, verzweigt- oder geradkettigen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 40 Kohlenstoffatomen. Beispiele für Alkylenreste sind Methylen-, Ethylen-, n-Propylen-, 1-Ethylethylen- und n-Heptylengruppen.The term "alkylene" refers to a fully saturated, cyclic or acyclic, divalent, branched or straight-chain hydrocarbon radical having from 1 to 40 carbon atoms. Examples of alkylene radicals are methylene, ethylene, n-propylene, 1-ethylethylene and n-heptylene groups.

Der Begriff ”Heteroalkylen” bezieht sich auf einen Alkylenrest, bei dem mindestens eines der Atome in der Kette ein Heteroatom ist.The term "heteroalkylene" refers to an alkylene radical in which at least one of the atoms in the chain is a heteroatom.

Der Begriff ”Heterocyclo-diyl” bezieht sich auf einen zweiwertigen Rest, der einen heterocyclischen Ring enthält. Die freien Valenzen können beide am heterocyclischen Ring vorliegen oder eine oder beide können sich auf den Alkylensubstituenten befinden, die am Ring gebunden sind.The term "heterocyclyldyl" refers to a bivalent radical containing a heterocyclic ring. The free valencies may both be present on the heterocyclic ring or one or both may be on the alkylene substituents attached to the ring.

Der Begriff ”Niederalkylen” bezieht sich auf einen vollständig gesättigten, acyclischen, zweiwertigen, verzweigt- oder geradkettigen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Beispiele für Niederalkylenreste sind Methylen-, Ethylen-, n-Propylen-, Isopropylen-, n-Butylen-, Isobutylen-(oder 2-Methylpropylen)-, Isoamylen-(oder 3,3-Dimethylpropylen)-, Pentylen- und n-Hexylengruppen. The term "lower alkylene" refers to a fully saturated, acyclic, bivalent, branched or straight-chain hydrocarbon radical having from 1 to 6 carbon atoms. Examples of lower alkylene radicals are methylene, ethylene, n-propylene, isopropylene, n-butylene, isobutylene (or 2-methylpropylene), isoamylene (or 3,3-dimethylpropylene), pentylene and n- hexylene.

Der Begriff ”Cycloalkyl-niederalkyl” bezieht sich auf eine Cycloalkylgruppe, die an einen Niederalkylrest gebunden ist. Beispiele für Cycloalkyl-niederalkylgruppen sind Cyclopropylmethyl-, Cyclopentylmethyl-, Cyclopentylethyl- und Cyclopentylpropylgruppen.The term "cycloalkyl-lower alkyl" refers to a cycloalkyl group attached to a lower alkyl group. Examples of cycloalkyl-lower alkyl groups are cyclopropylmethyl, cyclopentylmethyl, cyclopentylethyl and cyclopentylpropyl groups.

Der Begriff ”substituiertes Phenyl” bezieht sich auf eine Phenylgruppe, die unabhängig mit Hydrocarbyl-, Alkyl-, Niederalkyl-, Cycloalkyl- oder Cycloalkyl-niederalkylgruppen mono-, di-, tri- oder tetrasubstituiert ist.The term "substituted phenyl" refers to a phenyl group which is mono-, di-, tri- or tetrasubstituted independently with hydrocarbyl, alkyl, lower alkyl, cycloalkyl or cycloalkyl lower alkyl groups.

Der Begriff ”Aryl” bezieht sich auf einen aromatischen einwertigen carbocyclischen Rest, der aus einem einzigen Ring (z. B. Phenyl) oder aus mehreren anellierten Ringen (z. B. Naphthyl, Anthracenyl) besteht, der gegebenenfalls unabhängig mit Hydrocarbyl-, Alkyl-, Niederalkyl-, Cycloalkyl- oder Cycloalkyl-niederalkylgruppen mono-, di- oder trisubstituiert sein kann.The term "aryl" refers to an aromatic monovalent carbocyclic radical consisting of a single ring (e.g., phenyl) or multiple fused rings (e.g., naphthyl, anthracenyl) optionally independently with hydrocarbyl, alkyl , Lower alkyl, cycloalkyl or cycloalkyl lower alkyl groups may be mono-, di- or trisubstituted.

Der Begriff ”Arylen” bezieht sich auf einen aromatischen zweiwertigen carbocyclischen Rest. Die freien Valenzpositionen können jegliche Positionen auf dem/den Ring(en) sein. Im Fall eines zweiwertigen Phenylrestes können sie sich in ortho-, meta- oder para-Stellung zueinander befinden.The term "arylene" refers to an aromatic divalent carbocyclic radical. The free valence positions may be any positions on the ring (s). In the case of a divalent phenyl radical they may be ortho, meta or para to each other.

Der Begriff ”Aralkyl” bezieht sich auf eine Arylgruppe, die an einen Niederalkylrest gebunden ist. Beispiele für Aralkylgruppen sind Benzyl-, 2-Phenylethyl- und 2-(2-Naphthylethyl)-gruppen.The term "aralkyl" refers to an aryl group attached to a lower alkyl radical. Examples of aralkyl groups are benzyl, 2-phenylethyl and 2- (2-naphthylethyl) groups.

Der Begriff ”Aralkenyl” bezieht sich auf eine Arylgruppe, die mit einem vollständig konjugierten Alkenylrest verbunden ist. Beispiele für Aralkenylgruppen sind Styrenyl-(cis und trans), 1-Phenylbutadienyl- und 1-Naphthylbutadienylgruppen (einschließlich aller möglichen Kombinationen der Z- und E-Isomeren an den Doppelbindungen).The term "aralkenyl" refers to an aryl group linked to a fully conjugated alkenyl radical. Examples of aralkenyl groups are styrenyl (cis and trans), 1-phenylbutadienyl and 1-naphthylbutadienyl groups (including all possible combinations of the Z and E isomers on the double bonds).

Der Begriff ”Halogen” bezieht sich auf Fluor-, Brom-, Chlor- und Iodreste.The term "halogen" refers to fluoro, bromo, chloro and iodo radicals.

Der Begriff ”Niederalkylthio” bezieht sich auf die Gruppen R-S-, wobei der Rest R eine Niederalkylgruppe ist.The term "lower alkylthio" refers to the groups R-S-, where R is a lower alkyl group.

Der Begriff ”Abgangsgruppe” bezieht sich auf eine Gruppe, die in einer chemischen Reaktion durch ein Nucleophil, z. B. Halogenid, Alkylsulfonate (z. B. Methansulfonat), Arylsulfonate, Phosphate, Sulfonsäure, Sulfonsäuresalze, Imidazolide, N-Hydroxysuccinimide und dergleichen ersetzt werden kann.The term "leaving group" refers to a group that undergoes a chemical reaction by a nucleophile, e.g. Halide, alkylsulfonates (e.g., methanesulfonate), arylsulfonates, phosphates, sulfonic acid, sulfonic acid salts, imidazolides, N-hydroxysuccinimides, and the like.

Der Begriff ”Linker” bezieht sich auf jegliche chemisch und biologisch verträgliche kovalente Atomgruppierung, die zur Verbindung der erfindungsgemäß verwendeten ersten und zweiten Reagenzien dienen kann. Im allgemeinen haben bevorzugte Linker von Ende zu Ende 20 bis 40 Bindungen, vorzugsweise 25 bis 30 Bindungen, und sie können verzweigt- oder geradkettig sein oder Ringe enthalten. Die Bindungen können Kohlenstoff-Kohlenstoff-, Kohlenstoff-Heteroatom- oder Heteroatom-Heteroatom-Bindungen sein. Die Verbindung kann hydrophob oder hydrophil gestaltet sein. Die verbindende Gruppe kann Einfach- und/oder Doppelbindungen, 0 bis 10 Heteroatome (wobei Sauerstoff und Schwefel bevorzugt sind) und gesättigte oder aromatische Ringe enthalten. Die verbindende Gruppe kann Gruppierungen wie Ester, Ether, Sulfid, Disulfid und dergleichen enthalten.The term "linker" refers to any chemically and biologically acceptable covalent atomic grouping that can serve to link the first and second reagents used in the invention. In general, preferred end-to-end linkers have 20 to 40 bonds, preferably 25 to 30 bonds, and may be branched or straight-chain or contain rings. The bonds can be carbon-carbon, carbon-heteroatom or heteroatom-heteroatom bonds. The compound may be hydrophobic or hydrophilic. The linking group may contain single and / or double bonds, 0 to 10 heteroatoms (with oxygen and sulfur being preferred) and saturated or aromatic rings. The linking group may include moieties such as esters, ethers, sulfides, disulfides, and the like.

Der Begriff ”amphiphil” betrifft ein Molekül mit sowohl einem hydrophilen als auch einem hydrophoben Anteil.The term "amphiphilic" refers to a molecule having both a hydrophilic and a hydrophobic portion.

Es werden Verfahren und Zusammensetzungen zum Nachweis von Änderungen des Membranpotentials in biologischen Systemen bereitgestellt. Ein Aspekt des Nachweisverfahrens umfaßt:

  • (a) Einführen eines ersten Reagenz, umfassend ein hydrophobes fluoreszierendes Anion, das sich von einer ersten Membranfläche zu einer zweiten Membranfläche als Antwort auf Veränderungen des Membranpotentials umverteilen kann;
  • (b) Einführen eines zweiten Reagenz, das die erste oder zweite Membranfläche markiert, wobei das zweite Reagenz ein Fluorophor umfaßt, das einem Energietransfer unterliegen kann, entweder durch (i) Abgeben von Energie des angeregten Zustands an das fluoreszierende Anion oder (ii) Aufnehmen von Energie des angeregten Zustands vom fluoreszierenden Anion;
  • (c) Aussetzen der Membran gegenüber Anregungslicht einer geeigneten Wellenlänge;
  • (d) Messen des Energietransfers zwischen dem fluoreszierenden Anion und dem zweiten Reagenz; und
  • (e) In-Beziehung-Setzen des Energietransfers zu der Änderung des Membranpotentials.
Methods and compositions for detecting changes in membrane potential in biological systems are provided. One aspect of the detection method comprises:
  • (a) introducing a first reagent comprising a hydrophobic fluorescent anion that can redistribute from a first membrane surface to a second membrane surface in response to changes in membrane potential;
  • (b) introducing a second reagent which marks the first or second membrane surface, the second reagent comprising a fluorophore which can undergo energy transfer, either by (i) dispensing excited state energy to the fluorescent anion; or (ii) picking up excited state energy from the fluorescent anion;
  • (c) exposing the membrane to excitation light of a suitable wavelength;
  • (d) measuring the energy transfer between the fluorescent anion and the second reagent; and
  • (e) relating the energy transfer to the change in membrane potential.

Erfindungsgemäß können die ersten und zweiten Reagenzien nur dann durch einen Linker miteinander verbunden sein, wenn das zweite Reagenz ein grün fluoreszierendes Protein, ein fluoreszierend markiertes Protein oder ein Coumarin umfasst. In allen anderen Ausführungsformen können die ersten und zweiten Reagenzien nicht durch eine Linkergruppe miteinander verbunden sein.According to the invention, the first and second reagents can be linked to each other only by a linker if the second reagent comprises a green fluorescent protein, a fluorescently labeled protein or a coumarin. In all other embodiments, the first and second reagents may not be linked together by a linker group.

Der bevorzugte Energietransfer-Modus ist der Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET). Das Verfahren ist besonders geeignet zum Nachweis von Änderungen des Membranpotentials der Plasmamembran in biologischen Zellen.The preferred energy transfer mode is Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The method is particularly suitable for detecting changes in the membrane potential of the plasma membrane in biological cells.

Die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Zusammensetzungen umfassen zwei Reagenzien. Das erste Reagenz umfaßt ein hydrophobes fluoreszierendes Anion, das sich schnell von einer Oberfläche der Plasmamembran zur anderen als Antwort auf Änderungen des Transmembranpotentials umverteilt. Diese Spezies wird als das mobile oder das hydrophobe Anion bezeichnet. Das zweite Reagenz umfaßt ein Fluorophor, das einem Energietransfer unterliegen kann, entweder durch (i) Abgeben von Energie des angeregten Zustands an das fluoreszierende Anion oder (ii) Aufnehmen von Energie des angeregten Zustands vom fluoreszierenden Anion, typischerweise durch FRET.The compositions used in the methods of the invention comprise two reagents. The first reagent comprises a hydrophobic fluorescent anion which redistributes rapidly from one surface of the plasma membrane to the other in response to changes in transmembrane potential. This species is referred to as the mobile or hydrophobic anion. The second reagent comprises a fluorophore that can undergo energy transfer, either by (i) delivering excited state energy to the fluorescent anion, or (ii) receiving excited state energy from the fluorescent anion, typically by FRET.

Die ersten und zweiten Reagenzien sind zueinander spektroskopisch komplementär, was bedeutet, daß ihre spektralen Eigenschaften derart sind, daß zwischen ihnen ein Transfer von Energie des angeregten Zustands stattfinden kann. Jedes der Reagenzien kann als Donor oder Akzeptor wirken, wobei dann das andere Reagenz entsprechend komplementär ist, d. h. der Akzeptor bzw. Donor. Sowohl FRET als auch das Quenching sind sehr empfindlich gegenüber dem Abstand zwischen den beiden Spezies. Beispielsweise verändert sich das bei FRET beobachtete Quenching des Nichtstrahlungs-Förster-Typs invers mit der sechsten Potenz des Abstands zwischen der Donor- und der Akzeptor-Spezies. Wenn sich das Membranpotential ändert und das hydrophobe fluoreszierende Anion sich entweder vom zweiten Reagenz entfernt oder sich annähert, wird daher der FRET zwischen den beiden Reagenzien entweder signifikant verringert oder verstärkt. Andere Mechanismen wie Elektronentransfer, Dexter-Austauschwechselwirkung, paramagnetisches Quenching und beschleunigtes Intersystem-Crossing weisen sogar eine noch kürzere Reichweite auf und erfordern, daß die beiden Reagenzien aneinanderstoßen oder sich mindestens auf 1 nm annähern.The first and second reagents are spectroscopically complementary to each other, which means that their spectral properties are such that there can be an energy transfer of the excited state between them. Each of the reagents may act as a donor or acceptor, in which case the other reagent is correspondingly complementary, i. H. the acceptor or donor. Both FRET and quenching are very sensitive to the distance between the two species. For example, FRET quenching of the nonradiator Förster type varies inversely with the sixth power of the distance between the donor and acceptor species. Thus, as the membrane potential changes and the hydrophobic fluorescent anion either moves away from or approaches the second reagent, the FRET is either significantly reduced or enhanced between the two reagents. Other mechanisms, such as electron transfer, Dexter exchange interaction, paramagnetic quenching and accelerated intersystem crossing, have an even shorter range and require the two reagents to collide or approach at least 1 nm.

Bisher beschriebene spannungsempfindliche Fluoreszenzindikatoren, die durch Potential-getriebene Umverteilung des Fluorophors durch die Membran wirken, hatten Antwortzeiten von größer als 100 ms, häufig Minuten. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt stark fluoreszierende anionische Farbstoffe bereit, die sehr viel schneller durch die Membran translocieren, und zwar mit exponentiellen Zeitkonstanten von typischerweise weniger als 10 ms, häufig weniger als 5 ms, sehr häufig von etwa 1 bis 3 ms und insbesondere weniger als 1 ms (z. B. 0,1 bis 1 ms). Diese Translokationsgeschwindigkeiten sind von der Gegenwart des zweiten Reagenz auf der extrazellulären Oberfläche der Membran unabhängig. Antwortzeiten von kleiner 1 ms sind zur genauen Messung von einfachen Aktionspotentialen in einzelnen Neuronen notwendig und werden mit einigen der hier beschriebenen Farbstoffe (z. B. Hexyl-substituiertem Pentamethinoxonol, DiSBA-C6-(5)) erhalten. Andere hier beschriebene Farbstoffe weisen Antwortzeiten im Bereich von 2 bis 5 ms auf, die schnell genug sind, um Spannungsänderungen in Herz- und glatten Muskelzellen, viele synaptische Potentiale in einzelnen Neuronen und die durchschnittliche Signalaktivität in Neuron-Populationen (z. B. Aufzeichnung der elektrischen Antworten verschiedener Regionen des Zentralnervensystems auf sensorische Reize) zu kontrollieren. Die erfindungsgemäßen Indikatoren können auch langsameren Spannungsänderungen über einen Zeitbereich von Sekunden bis Minuten folgen.Previously described voltage-sensitive fluorescent indicators, which act by potential-driven redistribution of the fluorophore through the membrane, had response times greater than 100 ms, often minutes. One aspect of the present invention provides highly fluorescent anionic dyes that translocate through the membrane much faster, with exponential time constants typically less than 10 ms, often less than 5 ms, very often from about 1 to 3 ms, and especially less than 1 ms (eg 0.1 to 1 ms). These translocation rates are independent of the presence of the second reagent on the extracellular surface of the membrane. Response times of less than 1 ms are necessary for the accurate measurement of simple action potentials in individual neurons and are obtained with some of the dyes described here (eg hexyl-substituted pentamethine oxonol, DiSBA-C 6 - (5)). Other dyes described herein have response times in the range of 2 to 5 ms which are fast enough to detect voltage changes in cardiac and smooth muscle cells, many synaptic potentials in individual neurons, and average signal activity in neuron populations (e.g. electrical responses of various regions of the central nervous system to sensory stimuli). The indicators of the invention may also follow slower voltage changes over a time range of seconds to minutes.

I. Erstes Reagenz – Hydrophobe fluoreszierende AnionenI. First Reagent - Hydrophobic Fluorescent Anions

In den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren umfaßt das erste Reagenz ein hydrophobes Ion (Fluoreszenz-Donor, -Akzeptor oder -Quencher), das als Spannungssensor dient und sich innerhalb der Membran als Antwort auf Änderungen des Transmembranpotentials von einer Membran-Oberfläche zur anderen bewegt. Die Verteilung von hydrophoben Ionen zwischen den beiden wäßrigen Membran-Grenzflächen (der extrazellulären und intrazellulären Grenzfläche) wird durch das Membranpotential festgelegt. Kationen werden sich an der negativ geladenen Membran-Grenzfläche ansammeln und entsprechend werden sich Anionen zur positiv geladenen Grenzfläche bewegen. Die erfindungsgemäße inhärente Empfindlichkeit basiert auf den großen Konzentrationsänderungen des mobilen Ions an der Grenzfläche bei physiologisch relevanten Änderungen des Membranpotentials. Potentiell erzeugt eine Änderung von 60 mV eine 10fache Änderung im Verhältnis der Anion-Konzentrationen an den jeweiligen Grenzflächen. Die erfindungsgemäßen Verfahren koppeln diese Änderung der Grenzflächen-Konzentration mit einem effizienten Fluoreszenzsignal, und stellen damit ein empfindliches Verfahren zum Nachweis von Änderungen des Transmembranpotentials bereit. Die Geschwindigkeit der Fluoreszenzänderung hängt von der Membran-Translokationsgeschwindigkeit des hydrophoben Ions ab.In the compositions and methods of the present invention, the first reagent comprises a hydrophobic ion (fluorescent donor, acceptor or quencher) which acts as a stress sensor and moves within the membrane from one membrane surface to the other in response to changes in transmembrane potential. The distribution of hydrophobic ions between the two aqueous membrane interfaces (the extracellular and intracellular interface) is determined by the membrane potential. Cations will accumulate at the negatively charged membrane interface and become corresponding Anions move to the positively charged interface. The intrinsic sensitivity of the invention is based on the large concentration changes of the mobile ion at the interface with physiologically relevant changes in membrane potential. Potentially, a change of 60 mV produces a 10-fold change in the ratio of anion concentrations at the respective interfaces. The methods of the invention couple this change in interfacial concentration with an efficient fluorescence signal, thus providing a sensitive method for detecting changes in transmembrane potential. The rate of fluorescence change depends on the membrane translocation rate of the hydrophobic ion.

Vorzugsweise sind die durch die Plasmamembran translocierenden fluoreszierenden Ionen hydrophob, um fest an die Plasmamembran zu binden und schnell als Antwort auf Änderungen des Transmembranpotentials durch die Plasmamembran zu translocieren. Vorzugsweise wird das Ion einfach geladen sein, wobei die Ladung über einen signifikanten Teil des Farbstoffions, vorzugsweise über das gesamte Farbstoffion delokalisiert sein wird. Die Ladungsdelokalisierung verringert die Bornsche Ladungsenergie (umgekehrt proportional zum Anionenradius), die erforderlich ist, um ein geladenes Molekül von einer hydrophilen in eine hydrophobe Umgebung zu bewegen und sie erleichtert eine schnelle Translokation von Ionen (R. Benz, 1988, ”Structural requirement for the rapid movement of charged molecules across membranes”, Biophys. J. 54, 25–33). Die Erhöhung der Hydrophobie beschränkt die Freisetzung des gebundenen Farbstoffs von der Plasmamembran auf ein Mindestmaß und führt zu einer tieferen Einlagerung des Ions in die Membran, was die elektrostatische Aktivierungsenergie für die Translokation verringert. Polare Gruppen auf dem Ion sollten bei einem Minimum gehalten und so stark wie möglich abgeschirmt werden, um eine Solvatation im Kopfgruppenbereich der Doppelschicht zu vermeiden. Die Hydrophobie kann jedoch nicht unbeschränkt erhöht werden, da eine gewisse Löslichkeit im wäßrigen Medium erforderlich ist, um ein zelluläres Beladen zuzulassen. Falls notwendig, können die Farbstoffe mit Hilfe von amphiphilen Solubilisierungsreagenzien wie beta-Cyclodextrin, Pluronics wie Pluronic F-127 oder Polyethylenglykolen wie PEG 400 beladen werden, die die Solubilisierung der hydrophoben Ionen in wäßriger Lösung unterstützen.Preferably, the fluorescent ions translocating through the plasma membrane are hydrophobic to firmly bind to the plasma membrane and to rapidly translocate through the plasma membrane in response to changes in transmembrane potential. Preferably, the ion will be simply charged with the charge being delocalized over a significant portion of the dye ion, preferably over the entire dye ion. Charge delocalization reduces the Born's charge energy (inversely proportional to the anion radius) required to move a charged molecule from a hydrophilic to a hydrophobic environment and facilitates rapid translocation of ions (R. Benz, 1988, "Structural Requirement for the rapid movement of charged molecules across membranes ", Biophys J. 54, 25-33). Increasing the hydrophobicity minimizes the release of the bound dye from the plasma membrane and results in a deeper incorporation of the ion into the membrane which reduces the electrostatic activation energy for translocation. Polar groups on the ion should be kept to a minimum and shielded as much as possible to avoid solvation in the headgroup region of the bilayer. However, the hydrophobicity can not be increased indefinitely because some solubility in the aqueous medium is required to allow for cellular loading. If necessary, the dyes may be loaded by amphiphilic solubilization reagents such as beta-cyclodextrin, Pluronics such as Pluronic F-127, or polyethylene glycols such as PEG 400, which aid solubilization of the hydrophobic ions in aqueous solution.

Der Begriff ”hydrophob” bezieht sich, wenn er im Zusammenhang mit dem hydrophoben Ion verwendet wird, auf eine Spezies, deren Verteilungskoeffizient zwischen einer physiologischen Salzlösung (z. B. HBSS) und Octanol vorzugsweise mindestens etwa 50 und mehr bevorzugt mindestens etwa 1000 beträgt. Der Adsorptionskoeffizient der Spezies an eine Phospholipid-Doppelschicht (wie z. B. eine von menschlichen roten Blutzellen stammende Membran) beträgt mindestens etwa 100 nm, vorzugsweise mindestens etwa 300 nm (wobei die Membran 3 nm dick ist). Verfahren zur Bestimmung von Verteilungs- und Adsorptionskoeffizienten sind bekannt.The term "hydrophobic", when used in the context of the hydrophobic ion, refers to a species whose partition coefficient between a physiological salt solution (eg, HBSS) and octanol is preferably at least about 50, and more preferably at least about 1,000. The adsorption coefficient of the species to a phospholipid bilayer (such as a membrane derived from human red blood cells) is at least about 100 nm, preferably at least about 300 nm (the membrane being 3 nm thick). Methods for determining distribution and adsorption coefficients are known.

Es ist im allgemeinen bevorzugt, daß der hydrophobe Farbstoff eine anionische Spezies ist. Estergruppen biologischer Membranen erzeugen ein beträchtliches Dipolpotential innerhalb des Kohlenwasserstoffkerns der Membran. Dieses Potential unterstützt die Translokation von Anionen durch die hydrophobe Schicht, hält jedoch Kationen zurück. Was die Membran-Translokation angeht, haben Anionen somit einen enormen inhärenten Geschwindigkeitsvorteil gegenüber Kationen. Beispielsweise ist für die isostrukturellen Ionen Tetraphenylphosphonium-Kation und Tetraphenylphosphat-Anion bekannt, daß das Anion eine viel höhere Permeabilität als das Kation aufweist (R. F. Flewelling und W. L. Hubbell, 1986, ”The membrane dipole potential in a total mebrane potential model”, Biophys. J. 49, 541–552).It is generally preferred that the hydrophobic dye is an anionic species. Ester groups of biological membranes produce considerable dipole potential within the hydrocarbon core of the membrane. This potential promotes the translocation of anions through the hydrophobic layer but retains cations. As far as membrane translocation is concerned, anions have an enormous inherent rate advantage over cations. For example, for the isostructural ions, tetraphenylphosphonium cation and tetraphenyl phosphate anion are known to have a much higher permeability than the cation (RF Flewelling and WL Hubbell, 1986, "The membrane dipole potential in a totally molecular potential model", Biophys. J. 49, 541-552).

Vorzugsweise sollten die Anionen stark fluoreszieren, wenn sie an der Membran adsorbiert sind, wohingegen sie frei in wäßriger Lösung nur eine minimale Fluoreszenz zeigen sollten. Vorzugsweise sollte die Intensität der anionischen Fluorophore mindestens viermal und vorzugsweise mindestens achtmal höher sein, wenn sie an der Membran adsorbiert sind. Die Fluoreszenz der hier beschriebenen Thiobarbituratoxonole ist in der Membran etwa 20 mal stärker als in Wasser. Wenn der Farbstoff sehr stark an die Membran gebunden ist, wäre prinzipiell kein großes Fluoreszenzverhältnis des an die Membran gebundenen Farbstoffs im Vergleich zu frei in wäßriger Lösung vorliegendem Farbstoff erforderlich; da jedoch in Wirklichkeit das Membranvolumen im Verhältnis zum Volumen der wäßrigen Lösung sehr gering ist und eine gewisse Wasserlöslichkeit zum Beladen des Farbstoffs in Zellen und Gewebe notwendig ist, ist es erwünscht, daß das erste Reagenz eine mindestens etwa viermal stärkere Fluoreszenz in einer Membran als in wäßriger Lösung aufweist.Preferably, the anions should fluoresce strongly when adsorbed to the membrane, whereas free in aqueous solution should show only minimal fluorescence. Preferably, the intensity of the anionic fluorophores should be at least four times and preferably at least eight times higher when adsorbed to the membrane. The fluorescence of the thiobarbiturate oxonols described herein is about 20 times stronger in the membrane than in water. In principle, if the dye is very strongly bound to the membrane, there would be no need for a large fluorescence ratio of the dye bound to the membrane as compared to free dye in aqueous solution; however, since in reality the membrane volume is very small relative to the volume of the aqueous solution and some water solubility is required to load the dye into cells and tissues, it is desirable that the first reagent exhibit at least about four times more fluorescence in a membrane than in the membrane aqueous solution.

Die Anionen sollten auch nicht als Ionophore wirken, insbesondere nicht als Protonophore, da ein solches Verhalten anhaltende Leckströme verursachen kann. Daher liegt der pKa der Protonierung des Anions typischerweise deutlich unter 7, vorzugsweise unter 5 und insbesondere unter 3. Anregungs- und Emissionswellenlängen im roten bis infraroten Bereich sind bevorzugt, um Gewebestreuung und Häm-Absorption zu vermeiden. Eine photodynamische Beschädigung sollte möglichst niedrig gehalten werden, und zwar vorzugsweise am besten dadurch, daß die Bildung von Triplett-Zuständen und die daraus resultierende Bildung von Singulett-Sauerstoff auf ein Mindestmaß reduziert wird.Also, the anions should not act as ionophores, especially as protonophores, as such behavior can cause sustained leakage currents. Therefore, the pKa of protonation of the anion is typically well below 7, preferably below 5 and especially below 3. Excitation and emission wavelengths in the red to infrared range are preferred to avoid tissue scattering and heme absorption. Photodynamic damage should be kept as low as possible preferably, best by minimizing the formation of triplet states and the resulting formation of singlet oxygen.

Die fluoreszierenden hydrophoben Ionen beinhalten Polymethinoxonole, Tetraarylborate, die mit Fluorophoren konjugiert sind, und fluoreszierende Komplexe von Seltenerd- und Übergangsmetallen.The fluorescent hydrophobic ions include polymethine oxonols, tetraaryl borates conjugated to fluorophores, and fluorescent complexes of rare earth and transition metals.

A. PolymethinoxonoleA. polymethine oxonols

Der Begriff ”Polymethinoxonol” bezieht sich auf Moleküle, die zwei potentiell saure Gruppen umfassen, die mittels einer Polymethinkette verbunden sind, und eine zwischen den beiden sauren Gruppen delokalisierte einzelne negative Ladung besitzen. Die bevorzugten sauren Gruppen sind Barbiturate oder Thiobarbiturate. Sie können symmetrisch oder asymmetrisch sein, d. h. jedes der zwei (Thio-)Barbiturate kann gleich oder verschieden sein. Die symmetrischen (Thio-)Barbituratoxonole werden durch die herkömmlichen Kürzel DiBA-Cn-(x) und DiSBA-Cn-(x) bezeichnet, wobei sich DiBA auf die Gegenwart von zwei Barbituraten, DiSBA auf die Gegenwart von zwei Thiobarbituraten bezieht, Cn Alkylsubstituenten mit n Kohlenstoffatomen an den Stickstoffatomen der (Thio-)Barbiturate darstellt und x die Anzahl von Kohlenstoffatomen in der Polymethinkette ist, die die (Thio-)Barbiturate verbindet. Es wurde überraschend entdeckt, daß Oxonole mit langkettigen Alkylsubstituenten (z. B. mit Cn größer als Hexyl, insbesondere Decyl in den Pentamethinoxonolen) überraschend schnell durch die Plasmamembranen translocieren.The term "polymethine oxonol" refers to molecules comprising two potentially acidic groups linked by a polymethine chain and having a single negative charge delocalized between the two acidic groups. The preferred acidic groups are barbiturates or thiobarbiturates. They may be symmetric or asymmetric, ie each of the two (thio) barbiturates may be the same or different. The symmetrical (thio) barbiturate oxonols are designated by the conventional abbreviations DiBA-C n - (x) and DiSBA-C n - (x), where DiBA refers to the presence of two barbiturates, DiSBA to the presence of two thiobarbiturates, C n represents alkyl substituents with n carbon atoms on the nitrogen atoms of the (thio) barbiturates, and x is the number of carbon atoms in the polymethine chain linking the (thio) barbiturates. It has surprisingly been discovered that oxonols with long-chain alkyl substituents (eg with C n greater than hexyl, in particular decyl in the pentamethine oxonols) translocate surprisingly rapidly through the plasma membranes.

Eine außerordentlich nützliche Eigenschaft dieser Oxonole ist, daß ihr Fluoreszenzemissions-Maximum bei 560 nm bei Bindung an Membranen 20mal intensiver ist als in wäßriger Lösung [T. J. Rink, C. Montecucco, T. R. Hesketh und R. Y. Tsien, 1980, Lymphocyte membrane potential assessed with fluorescent grobes, Biochim. Biophys. Acta 595, 15–30]. Darüber hinaus ist die negative Ladung über dem Chromophor delokalisiert, wobei die vier äquivalenten Sauerstoffatome den Hauptteil der Ladung tragen. Die hohe Elektronenaffinität der Thiobarbituratreste verhindert eine Protonierung (pKa < 1) und verhindert ein photooxidatives Bleichen. Die vier N-Alkylgruppen und die Thiocarbonylgruppe verleihen dem Molekül ein notwendiges Maß an Hydrophobie, das für eine feste Bindung an die Membran und eine schnelle Translokation erforderlich ist.An extremely useful feature of these oxonols is that their maximum fluorescence emission at 560 nm when bound to membranes is 20 times more intense than in aqueous solution [T. J. Rink, C. Montecucco, T.R. Hesketh and R.Y. Tsien, 1980, Lymphocyte membrane potential with fluorescent coarse, Biochim. Biophys. Acta 595, 15-30]. In addition, the negative charge is delocalized over the chromophore, with the four equivalent oxygen atoms carrying the bulk of the charge. The high electron affinity of the thiobarbiturate moieties prevents protonation (pKa <1) and prevents photooxidative bleaching. The four N-alkyl groups and the thiocarbonyl group provide the molecule with a necessary level of hydrophobicity required for tight binding to the membrane and rapid translocation.

Erfindungsgemäß verwendete Oxonolverbindungen haben die allgemeine Formel I

Figure 00170001
in der der Rest R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom, einer Hydrocarbyl- und einer Heteroalkylgruppe, der Rest X unabhängig ein Sauerstoff- oder Schwefelatom ist und n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist, und Salze davon.Oxonol compounds used according to the invention have the general formula I.
Figure 00170001
wherein R is independently selected from the group consisting of a hydrogen atom, a hydrocarbyl group and a heteroalkyl group, X is independently an oxygen or sulfur atom, and n is an integer of 1 to 3, and salts thereof.

Die Oxonol-Anionen werden üblicherweise als Salze beladen, wobei das Kation typischerweise H+, ein Alkalimetall-, substituiertes Ammonium- oder Pyridiniumion ist.The oxonol anions are usually loaded as salts, the cation typically being H + , an alkali metal, substituted ammonium or pyridinium ion.

Vorzugsweise ist der Rest X ein Schwefelatom, d. h. das hydrophobe Anion ist ein Bis-(1,3-dialkyl-2-thiobarbiturat)-polymethinoxonol oder ein Derivat davon.Preferably, the radical X is a sulfur atom, i. H. the hydrophobic anion is a bis (1,3-dialkyl-2-thiobarbiturate) polymethine oxonol or a derivative thereof.

Wenn der Rest R eine Hydrocarbylgruppe ist, kann sie unabhängig ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Alkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Cycloalkyl- und Cycloalkyl-niederalkylgruppen. Typischerweise haben diese Gruppen 4 bis etwa 40 Kohlenstoffatome, mehr bevorzugt etwa 5 bis etwa 20 Kohlenstoffatome. Arylgruppen können mit Hydrocarbyl-, Alkyl-, Niederalkyl-, Heteroalkyl- und Halogengruppen substituiert sein. Oxonole, in denen die Reste R an einem speziellen (Thio-)Barbituratrest verschieden voneinander sind, sind insbesondere in diese Erfindung einbezogen und können aus unsymmetrischen Harnstoffderivaten hergestellt werden.When R is a hydrocarbyl group, it may be independently selected from the group consisting of alkyl, aryl, aralkyl, cycloalkyl and cycloalkyl lower alkyl groups. Typically, these groups have from 4 to about 40 carbon atoms, more preferably from about 5 to about 20 carbon atoms. Aryl groups may be substituted with hydrocarbyl, alkyl, lower alkyl, heteroalkyl and halo groups. Oxonols in which the R radicals on a specific (thio) barbiturate radical are different from each other are particularly included in this invention and can be prepared from unsymmetrical urea derivatives.

In einigen Ausführungsformen ist der Rest R eine Hydrocarbylgruppe der allgemeinen Formel -(CH2)p(CH=CH-CH2)q(CH2)rCH3 in der p eine ganze Zahl von 1 bis etwa 20 ist, vorzugsweise etwa 1 bis 2, q eine ganze Zahl von 1 bis etwa 6 ist, vorzugsweise 1 bis 2, die Stereochemie der Doppelbindung(en) cis oder trans sein kann, wobei cis bevorzugt ist, r eine ganze Zahl von 1 bis etwa 20 ist, vorzugsweise etwa 1 bis 3, und p + 3q + r + 1 40 ist, vorzugsweise etwa 4 bis 20, insbesondere etwa 6 bis 10. In some embodiments, the radical R is a hydrocarbyl group of the general formula - (CH 2 ) p (CH = CH-CH 2 ) q (CH 2 ) r CH 3 wherein p is an integer from 1 to about 20, preferably from about 1 to 2, q is an integer from 1 to about 6, preferably 1 to 2, the stereochemistry of the double bond (s) may be cis or trans, where cis preferably, r is an integer from 1 to about 20, preferably about 1 to 3, and p + 3q + r + 1 is 40, preferably about 4 to 20, especially about 6 to 10.

In einer anderen Ausführungsform der Polymethinoxonole ist der Rest R eine Heteroalkylgruppe der allgemeinen Formel -(CH2)xAy(CH2)zCH3 in der der Rest A ein Sauerstoff- oder Schwefelatom ist, x unabhängig eine ganze Zahl von 1 bis etwa 20, vorzugsweise etwa 10 bis 15 ist, y unabhängig den Wert 0 oder 1 hat, z unabhängig eine ganze Zahl von 1 bis etwa 20, vorzugsweise etwa 10 bis 15 ist, und x + y + z den Wert 40 hat, vorzugsweise eine ganze Zahl von etwa 5 bis 25 und insbesondere etwa 5 bis 10 ist.In another embodiment of the polymethine oxonols, the radical R is a heteroalkyl group of the general formula - (CH 2 ) x A y (CH 2 ) z CH 3 in which the radical A is an oxygen or sulfur atom, x is independently an integer from 1 to about 20, preferably about 10 to 15, y is independently 0 or 1, z is independently an integer from 1 to about 20, is preferably about 10 to 15, and x + y + z is 40, preferably an integer of about 5 to 25, and more preferably about 5 to 10.

In anderen Ausführungsformen ist der Rest R eine Phenylgruppe, die unabhängig mit bis zu 4 Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydrocarbyl-, Heteroalkyl-, Halogengruppen und Wasserstoffatomen substituiert ist.In other embodiments, the radical R is a phenyl group independently substituted with up to 4 substituents selected from the group consisting of hydrocarbyl, heteroalkyl, halo groups and hydrogen atoms.

In anderen Ausführungsformen beinhaltet einer der vier Reste R einen Linker zu dem zweiten Reagenz, wie nachstehend in Abschnitt III beschrieben.In other embodiments, one of the four R groups includes a linker to the second reagent, as described in Section III, below.

Die negative Ladung eines Oxonols ist über den gesamten Chromophor verteilt. Bis-(thiobarbiturat)-trimethinoxonole absorbieren bei 542 nm (Extinktionskoeffizient = 200.000 M–1cm–1), emittieren bei 560 nm und haben in Octanol eine Quantenausbeute von 0,4. Ein Oxonol mit R = n-Hexyl, DiSBA-C6-(3), translociert mit einer Zeitkonstante (τ) < 3 ms in spannungsabgegriffenen Säugerzellen. Die entsprechende Decylverbindung, DiSBA-C10-(3) translociert mit einer Zeitkonstante von < 2 ms. Die Anforderungen an das Molekül für eine schnelle Translokation werden durch die symmetrischen Oxonole gut erfüllt. Bis-(thiobarbiturat)-pentamethinoxonole absorbieren bei ~630 nm und emittieren bei ~660 nm. Die negative Ladung ist in solchen rot verschobenen Oxonolen weiter delokalisiert. Wie erwartet sind die Translokationsgeschwindigkeiten der Pentamethinoxonole höher als die der Trimethinoxonole. DiSBA-C4-(5) durchquert die Membran mit τ < 3 ms, also sechsmal schneller als das entsprechende Trimethinoxonol. DiSBA-C6-(5) translociert mit τ ~ 0,4 ms bei 20°C.The negative charge of an oxonol is distributed throughout the chromophore. Bis (thiobarbiturate) trimethine oxonols absorb at 542 nm (extinction coefficient = 200,000 M -1 cm -1 ), emit at 560 nm and have a quantum yield of 0.4 in octanol. An oxonol with R = n-hexyl, DiSBA-C 6 - (3), translocated with a time constant (τ) <3 ms in stress-relieved mammalian cells. The corresponding decyl compound, DiSBA-C 10 - (3), is translocated with a time constant of <2 ms. The demands on the molecule for rapid translocation are well met by the symmetric oxonols. Bis (thiobarbiturate) pentamethine oxonols absorb at ~ 630 nm and emit at ~ 660 nm. The negative charge is further delocalized in such red-shifted oxonols. As expected, the translocation rates of the pentamethine oxonols are higher than those of the trimethine oxonols. DiSBA-C 4 - (5) traverses the membrane with τ <3 ms, six times faster than the corresponding trimethyneoxonol. DiSBA-C 6 - (5) translocates with τ ~ 0.4 ms at 20 ° C.

B. Tetraarylborat-Fluorophor-KonjugateFor example, tetraarylborate-fluorophore conjugates

Eine weitere geeignete Klasse von fluoreszierenden hydrophoben Anionen sind Tetraarylborate der allgemeinen Formel II [(Ar1)3B-Ar2-Y-FLU]– Formel II in der der Rest Ar1 eine Arylgruppe, der Rest Ar2 eine bifunktionelle Arylengruppe, der Rest B ein Boratom, der Rest Y ein Sauerstoff- oder Schwefelatom und FLU ein neutrales Fluorophor ist.Another suitable class of fluorescent hydrophobic anions are tetraarylborates of the general formula II [(Ar 1 ) 3 B-Ar 2 -Y-FLU] - Formula II in which the radical Ar 1 is an aryl group, the radical Ar 2 is a bifunctional arylene group, the radical B is a boron atom, the radical Y is an oxygen or sulfur atom and FLU is a neutral fluorophore.

Häufig ist der Rest Ar1 mit einer oder zwei Elektronen-ziehenden Gruppen substituiert, wie z. B. CF3. In bestimmten Ausführungsformen sind die Reste Ar1 und Ar2 gegebenenfalls substituierte Phenylgruppen, wie es nachstehend für die Struktur der allgemeinen Formel III gezeigt ist.

Figure 00200001
in der jeder Rest R' unabhängig ein Wasserstoffatom, eine Hydrocarbyl-, Halogen-, CF3-Gruppe oder eine Linkergruppe, n eine ganze Zahl von 0 bis 5, jeder Rest X unabhängig ein Wasserstoffatom, Halogen oder CF3, m eine ganze Zahl von 0 bis 4, der Rest Y ein Sauerstoff- oder Schwefelatom und FLU ein neutrales Fluorophor ist.Frequently, the radical Ar 1 is substituted with one or two electron-withdrawing groups, such as. B. CF 3 . In certain embodiments, the radicals Ar 1 and Ar 2 are optionally substituted phenyl groups, as shown below for the structure of general formula III.
Figure 00200001
wherein each R 'is independently a hydrogen atom, a hydrocarbyl, halogen, CF 3 or a linker group, n is an integer from 0 to 5, each X is independently hydrogen, halogen or CF 3 , m is an integer from 0 to 4, the radical Y is an oxygen or sulfur atom and FLU is a neutral fluorophore.

Wenn der Rest R' eine Hydrocarbylgruppe ist, enthält sie typischerweise 1 bis etwa 40, vorzugsweise 3 bis etwa 20 und insbesondere etwa 5 bis 15 Kohlenstoffatome. Vorzugsweise ist der Rest R' eine niedere Alkylgruppe, insbesondere (für eine einfachere Synthese) sind alle Reste R' Wasserstoffatome. Sofern der Rest R' keine Hydrocarbylgruppe ist, ist er häufig die Gruppe CF3, und n hat den Wert 1. In bestimmten Ausführungsformen ist X = F und m = 4. Der Rest X ist typischerweise Elektronen-ziehend, um einen photoinduzierten Elektronentransfer vom Tetraarylborat zum Fluorophor zu verhindern, der die Fluoreszenz des Fluorophors löscht. Insbesondere ist der Rest X ein Fluoratom.When the radical R 'is a hydrocarbyl group, it typically contains from 1 to about 40, preferably from 3 to about 20 and most preferably from about 5 to 15 carbon atoms. Preferably, the radical R 'is a lower alkyl group, in particular (for a simpler synthesis), all the radicals R' are hydrogen atoms. When R 'is not a hydrocarbyl group, it is often the group CF 3 , and n is 1. In certain embodiments, X = F and m = 4. The moiety X is typically electron-withdrawing to promote photoinduced electron transfer from Tetraarylborate to prevent the fluorophore, which quenches the fluorescence of the fluorophore. In particular, the radical X is a fluorine atom.

1. Synthese von Tetraarylborat-Fluorophor-Konjugaten1. Synthesis of Tetraarylborate-Fluorophore Conjugates

Es wurde eine allgemeine Synthese von fluoreszierenden Tetraarylborat-Anionen entwickelt, die in 10 beispielhaft für ein fluoreszierendes Biman-Tetraarylborat-Konjugat (bezeichnet als Borman, Verbindung IV in 10) gezeigt ist.A general synthesis of fluorescent tetraarylborate anions has been developed which is described in US Pat 10 exemplified by a fluorescent biman-tetraaryl borate conjugate (referred to as Borman, Compound IV in U.S.P. 10 ) is shown.

Allgemein wird ein Triarylboran mit einem geschützten Phenoxy- oder Thiophenoxyorganometall-Reagenz umgesetzt, wie z. B. einem Organolithiumderivat. Die Schutzgruppe wird dann entfernt und das ungeschützte Phenol (oder Thiophenol) wird mit einem Fluorophor umgesetzt, das eine Abgangsgruppe trägt. Die nukleophile Substitution der Abgangsgruppe gefolgt von der herkömmlichen Reinigung des Rohprodukts liefert das an das Fluorophor gebundene Tetraarylborat-Anion. Die Substituenten R' und X werden durch geeignete Wahl der Edukte Triarylboran und Phenoxy-(oder Thiophenoxy-)organometallverbindung variiert. Geeignete Edukte sind von Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI) und anderen bekannten Herstellern erhältlich. In dieser Spezies wird folglich ein Fluorophor an einen funktionalisierten Boratkern gebunden. Dieses allgemeine Syntheseverfahren erlaubt die Bindung von jeglichem Fluorophor an das Boratanion.Generally, a triarylborane is reacted with a protected phenoxy or thiophenoxyorganometall reagent, such as e.g. B. an organolithium derivative. The protecting group is then removed and the unprotected phenol (or thiophenol) reacted with a fluorophore bearing a leaving group. Nucleophilic substitution of the leaving group followed by conventional purification of the crude product yields the tetraaryl borate anion attached to the fluorophore. The substituents R 'and X are varied by suitable choice of the educts triarylborane and phenoxy (or thiophenoxy) organometallic compound. Suitable starting materials are available from Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI) and other known manufacturers. Thus, in this species, a fluorophore is bound to a functionalized borate nucleus. This general method of synthesis allows binding of any fluorophore to the borate anion.

2. Neutrale Fluorophore2. Neutral fluorophores

Da polare Chromophore die Membran-Translokationsgeschwindigkeit erniedrigen, ist es bevorzugt, daß das an das Tetraarylborat gebundene Fluorophor neutral ist. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann ein neutrales Fluorophor als fluoreszierendes Molekül definiert werden, das keine geladenen funktionellen Gruppen enthält. Beispielhafte fluoreszierende Moleküle, die Abgangsgruppen tragen und zur Konjugation geeignet sind, sind von Molecular Probes (Portland, OR), Eastman Kodak (Huntington, TN), Pierce Chemical Co. (Rockville, MD) und anderen bekannten Herstellern erhältlich. Alternativ können Abgangsgruppen mit bekannten Verfahren in fluoreszierende Moleküle eingeführt werden.Since polar chromophores decrease the membrane translocation rate, it is preferred that the fluorophore bound to the tetraarylborate be neutral. For the purposes of the present invention, a neutral fluorophore can be defined as a fluorescent molecule that does not contain charged functional groups. Exemplary fluorescent molecules bearing leaving groups and suitable for conjugation are available from Molecular Probes (Portland, OR), Eastman Kodak (Huntington, TN), Pierce Chemical Co. (Rockville, MD), and other known manufacturers. Alternatively, leaving groups can be introduced into fluorescent molecules by known methods.

Besonders geeignete Klassen neutraler Fluorophore, die an die Tetraarylborate zur erfindungsgemäßen Verwendung gebunden werden können, beinhalten Bimane, Bodipys und Cumarine, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Particularly suitable classes of neutral fluorophores that can be attached to the tetraaryl borates for use in the present invention include, but are not limited to, bimans, bodypies and coumarins.

Bodipys (d. h. Difluorboradiazaindacene) haben die allgemeine Formel IV

Figure 00220001
in der jeder Rest R1, der gleich oder verschieden sein kann, unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom, einer Niederalkyl-, Aryl-, heteroaromatischen Gruppe, Aralkenylgruppen und einem Alkylen-Verknüpfungspunkt, jeder Rest R2, der gleich oder verschieden sein kann, unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom, einer Niederalkyl-, Phenylgruppe und einem Alkylen-Verknüpfungspunkt.Bodipys (ie difluoroboradiazaindacenes) have the general formula IV
Figure 00220001
wherein each R 1 , which may be the same or different, is independently selected from the group consisting of a hydrogen atom, a lower alkyl, aryl, heteroaromatic, aralkenyl and an alkylene linking point, each R 2 being the same or may be independently selected from the group consisting of a hydrogen atom, a lower alkyl, phenyl group and an alkylene linking point.

Für die Zwecke dieser Beschreibung bezieht sich der Begriff ”Alkylen-Verknüpfungspunkt” auf die Gruppe -(CH2)t- oder -(CH2)t-C(O)-, worin t eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist und eine Valenzbindung an das Fluorophor und die andere Valenzbindung an das Tetraarylborat gebunden ist. Vorzugsweise hat t den Wert 1, d. h. der Alkylen-Verknüpfungspunkt ist eine Methylengruppe. Dem Fachmann ist klar, daß alle Fluorophore einen Verknüpfungspunkt besitzen, an dem sie mit dem Tetraarylborat verbunden sein können. Im allgemeinen trägt das zur Bindung des Fluorophors an das Tetraarylborat verwendete Vorläufer-Molekül eine Abgangsgruppe am Verknüpfungspunkt. Die Umsetzung dieses Vorläufer-Moleküls mit einem geeigneten Nukleophil am Tetraarylborat (z. B. einem Amin, einer Hydroxygruppe oder einem Thiol) ergibt ein Fluorophor-Tetraarylborat-Konjugat, das am Verknüpfungspunkt verbunden ist. Der Begriff ”Verknüpfungspunkt” bezieht sich im weiteren Sinn auf eine chemische Gruppierung, die zur Umsetzung mit entweder einem Fluorophor oder einem bifunktionellen Linker zur Bildung der fluoreszierenden Konjugate und/oder den hier beschriebenen verbundenen ersten und zweiten Reagenzien geeignet ist.For the purposes of this specification, the term "alkylene linking point" refers to the group - (CH 2 ) t - or - (CH 2 ) t -C (O) -, wherein t is an integer from 1 to 10 and one Valence bond to the fluorophore and the other valence bond is bound to the tetraarylborate. Preferably t has the value 1, ie the alkylene linking point is a methylene group. It will be understood by those skilled in the art that all fluorophores have a point of attachment where they can be linked to the tetraaryl borate. In general, the precursor molecule used to attach the fluorophore to the tetraaryl borate has a leaving group at the point of attachment. Reaction of this precursor molecule with a suitable nucleophile on the tetraaryl borate (eg, an amine, a hydroxy group, or a thiol) yields a fluorophore-tetraaryl borate conjugate linked at the point of attachment. The term "point of attachment" broadly refers to a chemical moiety suitable for reaction with either a fluorophore or a bifunctional linker to form the fluorescent conjugates and / or the associated first and second reagents described herein.

Häufig tragen diese Verknüpfungspunkte Abgangsgruppen wie z. B. Alkyltosylate, aktivierte Ester (Anhydride, n-Hydroxysuccinimidylester und dergleichen), die mit einem Nukleophil an der zu verbindenden Spezies reagieren. Dem Fachmann ist klar, daß die relative Anordnung der Abgangsgruppe und des Nukleophils an den Molekülen, die miteinander verbunden werden, umgekehrt werden kann.Often, these tie points carry leaving groups such. , Alkyl tosylates, activated esters (anhydrides, n-hydroxysuccinimidyl esters and the like) which react with a nucleophile on the species to be joined. It will be understood by those skilled in the art that the relative location of the leaving group and the nucleophile on the molecules that are joined together can be reversed.

Cumarine und verwandte Fluorophore können durch die allgemeinen Formeln V und VI

Figure 00230001
dargestellt werden, worin jeder Rest R3, der gleich oder verschieden sein kann, unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom, Halogen, niederem Alkyl, CN, CF3, COOR5, CON(R5)2, OR5 und einem Verknüpfungspunkt, der Rest R4 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus OR5 und N(R5)2, der Rest Z ein Sauerstoff-, Schwefelatom oder NR5 ist und jeder Rest R5, der gleich oder verschieden sein kann, unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom, einer niederen Alkylgruppe und einem Alkylen-Verknüpfungspunkt.Coumarins and related fluorophores can be represented by the general formulas V and VI
Figure 00230001
wherein each R 3 is the same or different may be independently selected from the group consisting of a hydrogen atom, halogen, lower alkyl, CN, CF 3 , COOR 5 , CON (R 5 ) 2 , OR 5 and a linking point, the radical R 4 is selected from the group consisting from OR 5 and N (R 5 ) 2 , the radical Z is an oxygen, sulfur or NR 5 and each R 5 , which may be the same or different, is independently selected from the group consisting of a hydrogen atom, a lower alkyl group and an alkylene linking point.

Bimane können durch die allgemeine Formel VII

Figure 00230002
dargestellt werden, in der jeder Rest R5, der gleich oder verschieden sein kann, unabhängig ein Wasserstoffatom, eine niedere Alkylgruppe oder ein Alkylen-Verknüpfungspunkt ist.Bimans can be replaced by the general formula VII
Figure 00230002
in which each R 5 , which may be the same or different, is independently a hydrogen atom, a lower alkyl group or an alkylene linking point.

Fluoreszierende Tetraarylborate mit daran gebundenen Cumarinen und Bimanen wurden hergestellt. Diese fluoreszierenden Borste translocieren mit τ < 3 ms in spannungsabgegriffenen Fibroblasten. Die Synthese eines beispielhaften fluoreszierenden Tetraarylborats ist in Beispiel V beschrieben.Fluorescent tetraaryl borates with coumarins and bimanes attached were prepared. These fluorescent bristles translocate with τ <3 ms in voltage-tapped fibroblasts. The synthesis of an exemplary fluorescent tetraaryl borate is described in Example V.

C. Fluorophor-Komplexe mit ÜbergangsmetallenC. Fluorophore complexes with transition metals

Lanthanid-Ionen wie beispielsweise Tb3+ und Eu3+ lumineszieren in den grünen und roten Bereichen des sichtbaren Spektrums mit einer Lebensdauer im Bereich von Millisekunden. Die Emission ist zusammengesetzt aus verschiedenen scharfen Banden, die für den atomaren Ursprung der angeregten Zustände charakteristisch sind. Direkte Anregung der Ionen kann durch Verwendung von tiefem UV-Licht erreicht werden. Eine Anregung der Lanthanid-Ionen bei größeren Wellenlängen ist möglich, wenn die Ionen durch absorbierende Liganden chelatisiert werden, die Anregungsenergie auf die Ionen übertragen können, die dann mit ihrer charakteristischen Emission lumineszieren können, so wie wenn sie direkt angeregt worden wären. Lanthanid-Komplexe von Tb3+ und Eu3+ mit absorbierenden Liganden, die vier negative Ladungen liefern und somit eine Nettoladung von –1 erzeugen, können als mobile Ionen für den spannungsempfindlichen FRET-Mechanismus wirken. Die Lebensdauer von Tb3+ und Eu3+ ist noch ausreichend schnell, um Spannungsänderungen im Millisekundenbereich zu messen.Lanthanide ions such as Tb 3+ and Eu 3+ luminesce in the green and red regions of the visible spectrum with a lifetime in the range of milliseconds. The emission is composed of several sharp bands that are characteristic of the atomic origin of the excited states. Direct excitation of the ions can be achieved by using deep UV light. Excitation of the lanthanide ions at longer wavelengths is possible when the ions are chelated by absorbing ligands that can transmit excitation energy to the ions, which can then luminesce with their characteristic emission, as if they had been directly excited. Lanthanide complexes of Tb 3+ and Eu 3+ with absorbing ligands that yield four negative charges, thus generating a net charge of -1, can act as mobile ions for the voltage-sensitive FRET mechanism. The lifetime of Tb 3+ and Eu 3+ is still fast enough to measure millisecond voltage changes.

Die Erfindung stellt auch solche Komplexe bereit, die als fluoreszierendes hydrophobes Anion (als FRET-Donoren) im ersten Reagenz wirken können. Unter Verwendung des Liganden Bis-(salicylaldehyd)-ethylendiamin (Salen)2– wurden [Tb(Salen)2]–1 und [Eu(Salen)2]–1 hergestellt. Diese Komplexe zeigen eine maximale Absorption bei 350 nm mit einer signifikanten Absorption bis 380 nm und eine Lumineszenz mit der charakteristischen Atomemission (10). Die Verwendung von Lanthanid-Komplexen als Donoren bietet einige einzigartige Vorteile. Streuung, zelluläre Autofluoreszenz und Emission von direkt angeregten Akzeptoren besitzt eine Lebensdauer im Nanosekundenbereich oder kürzer und kann durch ”Time gating” der Emissionsaufnahme unterdrückt werden (vgl. beispielsweise G. Marriott, M. Heidecker, E. P. Diamandis, Y. Yan-Marriott, 1994, Time-resolved delayed luminescence image microscopy using an europium ion chelate complex, Biophys. J. 67, 957–965). Der Ausschluß der schnellen Emission verringert den Hintergrund und führt zu hervorragenden Signal-Rausch-Verhältnissen. Ein weiterer Hauptvorteil der Verwendung von Lanthanidchelaten als Donoren ist der, daß der FRET-Bereich durch Lateraldiffusion in die Membran während der Lebensdauer des angeregten Zustands verstärkt wird (D. D. Thomas, W. F. Carlsen, L. Stryer, 1978, Fluorescence energy transfer in the rapid diffusion limit, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5746–5750). Diese Eigenschaft verringert den Bedarf für hohe Akzeptorkonzentrationen zur Gewährleistung eines wirksamen FRETs stark. Zusätzlich zur Verringerung der Störung und Belastung des zellulären Systems aufgrund hoher Farbstoffkonzentrationen führt der Diffusions-verstärkte FRET zu einer größeren Spannungsempfindlichkeit im Vergleich zu einem statischen Fall. Lanthanidchelate können auch als asymmetrisch markierte Donoren für mobile Akzeptoren wie die Tri- und Pentamethinoxonole verwendet werden, und zwar mit den gleichen vorstehend diskutierten Vorteilen.The invention also provides such complexes which can act as a fluorescent hydrophobic anion (as FRET donors) in the first reagent. Using the ligand bis (salicylaldehyde) ethylenediamine (salen) 2- , [Tb (salen) 2 ] -1 and [Eu (salen) 2 ] -1 were prepared. These complexes show a maximum absorption at 350 nm with a significant absorption up to 380 nm and a luminescence with the characteristic atomic emission ( 10 ). The use of lanthanide complexes as donors offers some unique benefits. Scattering, cellular autofluorescence and emission of directly excited acceptors has nanosecond or shorter lifetime and can be suppressed by time gating the emission uptake (see, for example, G. Marriott, M. Heidecker, EP Diamandis, Y. Yan-Marriott, 1994 Time-resolved delayed luminescence image microscopy using europium ion chelate complex, Biophys J. 67, 957-965). The exclusion of the fast emission reduces the background and leads to excellent signal-to-noise ratios. Another major advantage of using lanthanide chelates as donors is that the FRET region is enhanced by lateral diffusion into the membrane during the excited state lifetime (DD Thomas, WF Carlsen, L. Stryer, 1978, Fluorescence energy transfer in the rapid diffusion Sci. USA 75, 5746-5750), Proc. Natl. Acad. Sci. This feature greatly reduces the need for high acceptor concentrations to ensure effective FRET. In addition to reducing the disruption and stress on the cellular system due to high dye concentrations, the diffusion enhanced FRET results in greater voltage sensitivity compared to a static case. Lanthanide chelates can also be used as asymmetrically labeled donors for mobile acceptors, such as the tri- and pentamethine oxonols, with the same advantages discussed above.

Beispiele für Lanthanid-Komplexe, die als hydrophobe fluoreszierende Anionen verwendet werden können, sind Verbindungen der allgemeinen Formeln XI und XII

Figure 00250001
in der Ln = Tb, Eu oder Sm ist, der Rest R unabhängig ein Wasserstoffatom, eine C1-8-Alkyl-, C1-8-Cycloalkyl- oder C1-4-Perfluoralkylgruppe ist, die Reste X und Y unabhängig ein Wasserstoffatom, F, Cl, Br, I, NO2, CF3, C1-4-Alkyl, CN, Ph, O-(Niederalkyl) oder OPh sind, oder die Reste X und Y zusammengenommen die Gruppe -CH=CH- sind, und der Rest Z die 1,2-Ethandiyl-, 1,3-Propandiyl-, 2,3-Butandiyl-, 1,2-Cyclohexandiyl-, 1,2-Cyclopentandiyl-, 1,2-Cycloheptandiyl-, 1,2-Phenylendiyl-, 3-Oxa-1,5-pentandiyl-, 3-Aza-3-(niederalkyl)-1,5-pentandiyl-, Pyridin-2,6-bis-(methylen)- oder Tetrahydrofuran-2,5-bis-(methylen)-gruppe ist.
Figure 00260001
in der Ln = Tb, Eu oder Sm ist, der Rest R unabhängig ein Wasserstoffatom, eine C1-8-Alkyl-, C1-8-Cycloalkyl- oder C1-4-Perfluoralkylgruppe ist, die Reste X' und Y' unabhängig ein Wasserstoffatom, F, Cl, Br, I, NO2, CF3, C1-4-Alkyl, CN, Ph, O-(Niederalkyl) oder OPh sind, oder die Reste X' und Y' zusammengenommen die Gruppe -CH=CH- sind, und der Rest Z' unabhängig eine Valenzbindung, CR2, die Pyridin-2,6-diyl- oder Tetrahydrofuran-2,5-diylgruppe ist.Examples of lanthanide complexes that can be used as hydrophobic fluorescent anions are compounds of general formulas XI and XII
Figure 00250001
in which Ln = Tb, Eu or Sm, the radical R is independently a hydrogen atom, a C 1-8 alkyl, C 1-8 cycloalkyl or C 1-4 perfluoroalkyl group, the radicals X and Y are independently one Are hydrogen, F, Cl, Br, I, NO 2 , CF 3 , C 1-4 -alkyl, CN, Ph, O- (lower alkyl) or OPh, or the radicals X and Y taken together are the group -CH = CH- and Z is 1,2-ethanediyl, 1,3-propanediyl, 2,3-butanediyl, 1,2-cyclohexanediyl, 1,2-cyclopentanediyl, 1,2-cycloheptanediyl, 1 , 2-phenylenediyl, 3-oxa-1,5-pentanediyl, 3-aza-3- (lower alkyl) -1,5-pentanediyl, pyridine-2,6-bis (methylene) - or tetrahydrofuran-2 , 5-bis (methylene) group.
Figure 00260001
in which Ln = Tb, Eu or Sm, the radical R is independently a hydrogen atom, a C 1-8 -alkyl, C 1-8 -cycloalkyl or C 1-4 perfluoroalkyl group, the radicals X 'and Y' are independently a hydrogen atom, F, Cl, Br, I, NO 2 , CF 3 , C 1-4 alkyl, CN, Ph, O- (lower alkyl) or OPh, or the radicals X 'and Y' taken together are the group CH = CH-, and the radical Z 'is independently a valence bond, CR 2 , which is pyridine-2,6-diyl or tetrahydrofuran-2,5-diyl group.

II. Stationäre, asymmetrisch gebundene zweite ReagenzienII. Stationary, asymmetrically bound second reagents

Das zweite Reagenz ist ein fluoreszierender Donor, Akzeptor oder Quencher, der komplementär zum ersten Reagenz, dem hydrophoben Anion, ist und entweder an die extrazelluläre oder intrazelluläre Fläche der Plasmamembran bindet. Folglich macht die Gegenwart des zweiten Reagenz auf der einen oder anderen Membranfläche die Membran unsymmetrisch. Wie vorstehend beschrieben erzeugt die Bestrahlung mit Licht einer geeigneten Wellenlänge eine Fluoreszenzantwort, die sich als Folge der Hin- und Herbewegung des hydrophoben Ions in der Plasmamembran ändert. Dem Fachmann ist klar, daß es zahllose Molekülspezies gibt, die als Fluoreszenz-aktives unsymmetrisch machendes Mittel wirken können. Eine primäre Eigenschaft dieser Komponente ist, daß sie sich auf einer Fläche der Plasmamembran anordnen kann und in einer komplementären Weise (d. h. als Fluoreszenz-Donor, -Akzeptor oder -Quencher) auf das hydrophobe Ion einwirken kann, das sich in der Membran hin- und herbewegt, wenn sich das Transmembranpotential ändert.The second reagent is a fluorescent donor, acceptor or quencher that is complementary to the first reagent, the hydrophobic anion, and binds either to the extracellular or intracellular surface of the plasma membrane. Thus, the presence of the second reagent on one or the other membrane surface renders the membrane unsymmetrical. As described above, the irradiation with light generates a suitable wavelength, a fluorescence response that changes as a result of the reciprocal motion of the hydrophobic ion in the plasma membrane. It will be apparent to those skilled in the art that there are numerous molecular species that can act as a fluorescence-active unsymmetrical agent. A primary property of this component is that it can anneal to a surface of the plasma membrane and act in a complementary fashion (ie, as a fluorescent donor, acceptor, or quencher) on the hydrophobic ion that travels in the membrane moved when the transmembrane potential changes.

Beispiele für zweite Reagenzien sind fluoreszierende Lektine, fluoreszierende Lipide, fluoreszierende Kohlenhydrate mit hydrophoben Substituenten, fluoreszierende Peptide, fluoreszierend markierte Antikörper gegen Membran-Oberflächenbestandteile oder Xanthene, Cyanine und Cumarine mit hydrophoben und hydrophilen Substituenten, und zwar, um die Bindung an Membranen zu fördern und um eine Permeation durch Membranen zu verhindern.Examples of second reagents are fluorescent lectins, fluorescent lipids, fluorescent carbohydrates having hydrophobic substituents, fluorescent peptides, fluorescently labeled antibodies to membrane surface constituents or xanthenes, cyanines and coumarins with hydrophobic and hydrophilic substituents to promote binding to membranes, and to prevent permeation through membranes.

A. Fluoreszierende LektineA. Fluorescent lectins

Eine Klasse der zweiten Reagenzien sind Lektine, die eine fluoreszierende Markierung tragen. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann ein Lektin als Zucker-bindendes Protein definiert werden, das an Glycoproteine und Glycolipide auf der extrazellulären Fläche der Plasmamembran bindet; vgl. J. Roth, ”The Lectins: Molecular Probes in Cell Biology and Membrane Research”, Exp. Patholo. (Supp. 3) (Gustav Fischer Verlag, Jena, 1978). Zu den Lektinen gehören Concavalin A, verschiedene Agglutinine (Erbsen-Agglutinin, Erdnuß-Agglutinin, Weizenkeim-Agglutinin und dergleichen), Rizin, A-Kette und dergleichen. Verschiedene Lektine sind von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, erhältlich.One class of second reagents are lectins that carry a fluorescent label. For the purposes of the present invention, a lectin can be defined as a sugar-binding protein that binds to glycoproteins and glycolipids on the extracellular surface of the plasma membrane; see. J. Roth, "The Lectins: Molecular Probes in Cell Biology and Membrane Research", Exp. Patholo. (Supp. 3) (Gustav Fischer Verlag, Jena, 1978). The lectins include concavalin A, various agglutinins (pea agglutinin, peanut agglutinin, wheat germ agglutinin and the like), ricin, A chain and the like. Various lectins are available from Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.

Geeignete Fluoreszenz-Marker zur Verwendung in fluoreszierenden Lektinen sind, ohne darauf beschränkt zu sein, die folgenden: Xanthene (einschließlich Fluoresceine, Rhodamine und Rhodole), Bodipys, Cyanine und lumineszierende Übergangsmetall-Komplexe. Es ist klar, daß die nachstehend beschriebenen Fluoreszenz-Marker nicht nur mit Lektinen sondern auch mit den hier beschriebenen anderen zweiten Reagenzien verwendet werden können. Die bisher besten Ergebnisse mit Lektinen wurden mit Fluorescein-markiertem Weizenkeim-Agglutinin (FL-WGA) erhalten.Suitable fluorescent labels for use in fluorescent lectins include, but are not limited to, the following: xanthenes (including fluoresceins, rhodamines, and rhodoles), bodypis, cyanines, and luminescent transition metal complexes. It will be appreciated that the fluorescence labels described below can be used not only with lectins but also with the other second reagents described herein. The best results with lectins to date have been obtained with fluorescein-labeled wheat germ agglutinin (FL-WGA).

1. Xanthene1. Xanthene

Eine bevorzugte Klasse von Fluoreszenz-Markern umfaßt Xanthen-Chromophore der allgemeinen Formel VIII oder IX

Figure 00280001
worin der Rest R6 unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom, Halogen, einer niederen Alkylgruppe, SO3H und einem Alkylen-Verknüpfungspunkt, der Rest R7 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom, einer niederen Alkylgruppe, einem Alkylen-Verknüpfungspunkt und dem Rest R8, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
Figure 00280002
worin jeder der Reste a und a' unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom und einem Alkylen-Verknüpfungspunkt, der Rest G ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom, OH, OR9, NR9R9 und einem Alkylen-Verknüpfungspunkt, der Rest T ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Sauerstoff-, Schwefelatom, C(CH3)2 und NR9, und der Rest M ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Sauerstoffatom und NR9R9, wobei jeder Rest R9, der gleich oder verschieden sein kann, unabhängig ein Wasserstoffatom oder eine Hydrocarbylgruppe ist.A preferred class of fluorescent labels includes xanthene chromophores of general formula VIII or IX
Figure 00280001
wherein the group R 6 is independently selected from the group consisting of a hydrogen atom, halogen, a lower alkyl group, SO 3 H and an alkylene linking point, the group R 7 is selected from the group consisting of a hydrogen atom, a lower alkyl group, a Alkylene linking point and the radical R 8 , which is selected from the group consisting of
Figure 00280002
wherein each of the radicals a and a 'is independently selected from the group consisting of a hydrogen atom and an alkylene linking point, the radical G is selected from the group consisting of a hydrogen atom, OH, OR 9 , NR 9 R 9 and an alkylene Linkage point, the radical T is selected from the group consisting of an oxygen, sulfur atom, C (CH 3 ) 2 and NR 9 , and the radical M is selected from the group consisting of an oxygen atom and NR 9 R 9 , wherein each radical R 9 , which may be the same or different, is independently a hydrogen atom or a hydrocarbyl group.

2. Cyanine2. Cyanine

Eine weitere bevorzugte Klasse von Fluoreszenz-Markern sind Cyanin-Farbstoffe der allgemeinen Formel X

Figure 00290001
in der der Rest R15 unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom, Halogen, einer niederen Alkylgruppe, SO3H, PO3H2, OPO3H2, COOH und einem Alkylen-Verknüpfungspunkt, der Rest R16 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom, einer niederen Alkylgruppe, (CH2)jCOOH, (CH2)jSO3H und einem Alkylen-Verknüpfungspunkt, wobei j eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist, der Rest T' ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Sauerstoff-, Schwefelatom, C(CH3)2, -CH=CH- und NR17, wobei der Rest R17 ein Wasserstoffatom oder eine Hydrocarbylgruppe ist und n eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist.Another preferred class of fluorescence markers are cyanine dyes of general formula X.
Figure 00290001
in which the radical R 15 is independently selected from the group consisting of a hydrogen atom, halogen, a lower alkyl group, SO 3 H, PO 3 H 2 , OPO 3 H 2 , COOH and an alkylene linking point, the radical R 16 is selected from the group consisting of a hydrogen atom, a lower alkyl group, (CH 2 ) j COOH, (CH 2 ) j SO 3 H and an alkylene linking point, where j is an integer from 1 to 10, the radical T 'is selected from the group consisting of an oxygen, sulfur, C (CH 3 ) 2 , -CH = CH- and NR 17 , wherein R 17 is a hydrogen atom or a hydrocarbyl group and n is an integer from 1 to 6.

B. Fluoreszierende LipideB. Fluorescent lipids

Fluoreszierend markierte amphipathische Lipide, insbesondere Phospholipide, wurden auch erfolgreich verwendet. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann ein amphipathisches Lipid als Molekül definiert werden, das sowohl hydrophobe als auch hydrophile Gruppen besitzt, die an die Zellmembran binden, aber sie nicht einfach durchdringen. Fluoreszierend markierte Phospholipide sind als zweites Reagenz besonders wertvoll.Fluorescently labeled amphipathic lipids, especially phospholipids, have also been used successfully. For the purposes of the present invention, an amphipathic lipid can be defined as a molecule having both hydrophobic and hydrophilic groups that bind to the cell membrane but do not easily penetrate it. Fluorescently labeled phospholipids are particularly valuable as a second reagent.

Wie hier definiert, beinhalten ”Phospholipide” Phosphatidsäure (PA) und Phosphatidylglycerine (PG), Phosphatidylcholine (PC), Phosphatidylethanolamine (PE), Phosphatidylinositole (PI), Phosphatidylserine (PS) und Phosphatidylcholin, -serin, -inositol, -ethanolamin-Lipid-Derivate wie Phosphatidylcholin aus Hühnerei (EPC), Dilauroylphosphatidylethanolamin, Dimyristoylphosphatidylethanolamin, Dipalmitoylphosphatidylethanolamin, Distearoylphosphatidylethanolamin, Dioleoylphosphatidylethanolamin, Distearoylphosphatidylserin, Dilinoleoylphosphatidylinositol und Gemische davon. Die Lipide können ungesättigt sein und natürlich vorkommen oder synthetisch sein. Die einzelnen Phosphatidsäure-Komponenten können symmetrisch oder unsymmetrisch sein, d. h. beide Acylreste sind gleich oder verschieden.As defined herein, "phospholipids" include phosphatidic acid (PA) and phosphatidylglycerols (PG), phosphatidylcholines (PC), phosphatidylethanolamines (PE), phosphatidylinositols (PI), phosphatidylserines (PS), and phosphatidylcholine, serine, inositol, -ethanolamine-lipid Derivatives such as chicken egg phosphatidylcholine (EPC), dilauroylphosphatidylethanolamine, dimyristoylphosphatidylethanolamine, dipalmitoylphosphatidylethanolamine, distearoylphosphatidylethanolamine, dioleoylphosphatidylethanolamine, distearoylphosphatidylserine, dilinoleoylphosphatidylinositol, and mixtures thereof. The lipids may be unsaturated and naturally occurring or synthetic. The individual phosphatidic acid components may be symmetric or unsymmetrical, i. H. both acyl radicals are the same or different.

Verschiedene bevorzugte Ausführungsformen beinhalten 6-Chlor-7-hydroxycumarin-markiertes Phosphatidylethanolamin (Cou-PE), Fluorescein-markiertes Phosphatidylethanolamin (FL-PE), N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-phosphatidylethanolamin (NBD-PE) und 5,5'-Disulfoindodicarbocyanin-markiertes Phosphatidylethanolamin (Cy5-PE). Die fluoreszierende Gruppe wird zweckmäßig aus den vorstehend zur Herstellung von fluoreszierenden Lektinen als zweckmäßig beschriebenen Gruppen ausgewählt. Bevorzugte fluoreszierende Phospholipide beinhalten Cou-PE, FL-PE, NBD-PE oder Cy5-PE. Die Verwendung von Cou-PE als Donor mit DiSBA-C6-(3) als Akzeptor ergab eine Verhältnisänderung von 80% für eine Änderung des Plasmamembranpotentials von 100 mV und ergibt typischerweise Verhältnissignale, die doppelt so groß sind wie die von FL-WGA mit dem gleichen Oxonol.Various preferred embodiments include 6-chloro-7-hydroxycoumarin-labeled phosphatidylethanolamine (Cou-PE), fluorescein-labeled phosphatidylethanolamine (FL-PE), N- (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl ) phosphatidylethanolamine (NBD-PE) and 5,5'-disulfoindodicarbocyanine-labeled phosphatidylethanolamine (Cy5-PE). The fluorescent group is suitably selected from the groups described above for the preparation of fluorescent lectins. Preferred fluorescent phospholipids include Cou-PE, FL-PE, NBD-PE or Cy5-PE. The use of Cou-PE as donor with DiSBA-C 6 - (3) as acceptor gave a ratio change of 80% for a change in plasma membrane potential of 100 mV and typically gives ratio signals twice as large as that of FL-WGA the same oxonol.

C. Fluoreszierend markierte AntikörperC. Fluorescently labeled antibodies

Antikörper, die gegen Oberflächen-Antigene wie Glycolipide oder Membranproteine gerichtet sind, können auch fluoreszierend markiert und als zweite Reagenzien verwendet werden. Beispielsweise färben FITC-markierte Antikörper gegen das Glycolipid GD3 die äußere Oberfläche der Melanozellinie M21 und ergeben Verhältnisänderungen von bis zu 10%/100 mV unter Verwendung von DiSBA-C6-(3) als mobiles fluoreszierendes Anion. Eine Spezifität für bestimmte Zelltypen ist wahrscheinlich mit Antikörpern einfacher zu erreichen als mit Lektinen, da Antikörper gegen nahezu jeglichen Oberflächen-Marker erzeugt werden können. Auch mikroinjizierte Antikörper könnten Stellen auf der Cytoplasmafläche der Plasmamembran markieren, an denen Kohlenhydrat-Bindungsstellen für Lektine abwesend sind.Antibodies directed against surface antigens such as glycolipids or membrane proteins can also be fluorescently labeled and used as second reagents. For example, FITC-labeled antibodies to the glycolipid GD3 stain the outer surface of melanoma cell line M21 and give ratio changes of up to 10% / 100mV using DiSBA-C 6 - (3) as a mobile fluorescent anion. Specificity for certain cell types is likely to be easier to achieve with antibodies than with lectins, as antibodies to almost any surface marker can be generated. Also, microinjected antibodies could label sites on the cytoplasmic surface of the plasma membrane where carbohydrate binding sites for lectins are absent.

D. CytochromeD. cytochromes

Es wurde auch entdeckt, daß als zweites Reagenz verwendetes Cytochrom C als Quencher wirkt, der an die äußere Plasmamembran-Oberfläche bindet. Demgemäß umfassen andere geeignete Klassen von zweiten Reagenzien Cytochrom C oder Apocytochrom C, und zwar mit oder ohne fluoreszierende Gruppe, wie es vorstehend im Zusammenhang mit anderen zweiten Reagenzien beschrieben wurde.It has also been discovered that cytochrome C used as the second reagent acts as a quencher that binds to the outer surface of the plasma membrane. Accordingly, other suitable classes of second reagents cytochrome C or apocytochrome C, with or without a fluorescent group, as described above in connection with other second reagents.

E. Fluoreszierende KohlenhydrateE. Fluorescent Carbohydrates

Eine weitere bevorzugte Klasse von Ausführungsformen des zweiten Reagenz beinhaltet fluoreszierend markierte amphipathische Kohlenhydrate, z. B. Cyclodextrine, die selektiv und stark an die extrazelluläre Plasmamembran-Oberfläche binden. Typischerweise sind die Kohlenhydrate mit einem hydrophoben Schwanz funktionalisiert, um die Interkalation in die Membran und eine feste Bindung an die Membran zu erleichtern. Der cyclische Zucker verleiht eine gute Wasserlöslichkeit für das zelluläre Beladen und verhindert eine Membran-Translokation. Ein weiterer Vorteil ist, daß die Cyclodextrine das Beladen des Oxonols erleichtern.Another preferred class of embodiments of the second reagent includes fluorescently labeled amphipathic carbohydrates, e.g. As cyclodextrins that bind selectively and strongly to the extracellular plasma membrane surface. Typically, the carbohydrates are functionalized with a hydrophobic tail to facilitate intercalation into the membrane and tight binding to the membrane. The cyclic sugar confers good water solubility for cellular loading and prevents membrane translocation. Another advantage is that the cyclodextrins facilitate the loading of the oxonol.

F. Fluoreszierende Peptide und ProteineF. Fluorescent peptides and proteins

Eine weitere bevorzugte Klasse von Ausführungsformen des zweiten Reagenz beinhaltet fluoreszierend markierte amphipathische Peptide. Solche Peptide enthalten typischerweise mehrere basische Reste wie Lysine und Arginine, um elektrostatisch an negativ geladene Phospholipidgruppen zu binden, sowie mehrere hydrophobe Reste zur Verankerung des Peptids an der Membran. Gegebenenfalls können langkettige Alkylsubstituenten wie N-Myristoyl-, N-Palmitoyl-, S-Palmitoyl- oder C-terminale Prenylgruppen hydrophobe Eigenschaften bereitstellen. Die fluoreszierende Markierung wird typischerweise mittels Lysin-ε-Aminogruppen oder Cystein-Sulfhydrylgruppen verbunden.Another preferred class of embodiments of the second reagent includes fluorescently labeled amphipathic peptides. Such peptides typically contain several basic residues such as lysines and arginines to electrostatically bind to negatively charged phospholipid groups, as well as several hydrophobic residues to anchor the peptide to the membrane. Optionally, long-chain alkyl substituents such as N-myristoyl, N-palmitoyl, S-palmitoyl or C-terminal prenyl groups can provide hydrophobic properties. The fluorescent label is typically linked by means of lysine ε-amino groups or cysteine sulfhydryl groups.

Eine weitere bevorzugte Klasse von Ausführungsformen des zweiten Reagenz beinhaltet natürliche fluoreszierende Proteine wie das grün fluoreszierende Protein (GFP) von Aequorea victoria (A. B. Cubitt et al., 1995, Understanding, improving, and using green fluorescent Proteins, Trends Biochem. Sci. 20, 448–455; M. Chalfie und D. C. Prasher, US-PS 5,491,084 ). Solche Proteine würden an native Plasmamembran-Proteine durch Expression von Tandem-DNA-Konstrukten fusionieren, in denen die das GFP und das native Protein kodierenden DNA-Sequenzen hintereinander verknüpft sind. Alternativ könnte das GFP an ein Motiv fusioniert sein, das eine Bindung von Glycosylphosphatidylinositol-Ankern und eine Zielsteuerung des Proteins an die Plasmamembran verursacht.Another preferred class of embodiments of the second reagent include natural fluorescent proteins such as the green fluorescent protein (GFP) of Aequorea victoria (AB Cubitt et al., 1995, Understanding, Improving, and Using Green Fluorescent Proteins, Trends Biochem., Sci. 448-455, M. Chalfie and DC Prasher, U.S. Patent 5,491,084 ). Such proteins would fuse to native plasma membrane proteins by expression of tandem DNA constructs in which the DNA sequences encoding the GFP and native protein are sequentially linked. Alternatively, the GFP could be fused to a motif that causes binding of glycosylphosphatidylinositol anchors and targeting of the protein to the plasma membrane.

Aufgrund der vorstehenden Diskussion ist dem Fachmann klar, daß eine Vielzahl von bekannten Donor/Akzeptor-Paaren als erste und zweite Reagenzien verwendet werden können. Besonders bevorzugte Kombinationen sind, ohne darauf beschränkt zu sein, die folgenden, in denen das erstgenannte Fluorophor der Donor und das als zweites genannte Fluorophor der Akzeptor ist: Fluorescein/Bis-thiobarbiturat-trimethinoxonol, GFP/Bis-thiobarbiturat-trimethinoxonol, GFP/Bis-thiobarbiturat-pentamethinoxonol, Cumarin/Bis-thiobarbiturat-trimethinoxonol, Cumarin/Bis-thiobarbiturat-pentamethinoxonol, Bis-thiobarbiturat-trimethinoxonol/Texas-Rot, Bis-thiobarbiturat-trimethinoxonol/Resorufin, Bis-thiobarbiturat-trimethinoxonol/Cy5, Bis-thiobarbiturat-trimethinoxonol/Bis-thiobarbiturat-pentamethinoxonol, Texas-Rot/Bis-thiobarbiturat-pentamethinoxonol, NBD/Bis-thiobarbiturat-trimethinoxonol, NBD/Bis-thiobarbiturat-pentamethinoxonol.It will be apparent to those skilled in the art from the foregoing discussion that a variety of known donor / acceptor pairs can be used as first and second reagents. Particularly preferred combinations include, but are not limited to, the following, in which the former fluorophore is the donor and the second is the acceptor: fluorescein / bis-thiobarbiturate-trimethyoxonole, GFP / bis-thiobarbiturate-trimethyoxonol, GFP / Bis -thiobarbiturate-pentamethineoxonol, coumarin / bis-thiobarbiturate-trimethyoxonol, coumarin / bis-thiobarbiturate-pentamethineoxonol, bis-thiobarbiturate-trimethyoxonol / Texas Red, bis-thiobarbiturate-trimethyoxonol / resorufin, bis-thiobarbiturate-trimethyoxonol / Cy5, bis-thiobarbiturate -trimethineoxonol / bis-thiobarbiturate-pentamethineoxonol, Texas Red / bis-thiobarbiturate-pentamethineoxonol, NBD / bis-thiobarbiturate-trimethyoxonol, NBD / bis-thiobarbiturate-pentamethineoxonol.

III. Linker-Gruppen zwischen dem ersten und zweiten ReagenzIII. Linker groups between the first and second reagents

In einigen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren wird eine Linker-Gruppe zwischen den ersten und zweiten Fluorophoren eingesetzt. Die Linker-Gruppe gewährleistet einen bestimmten minimalen Abstand zwischen den ersten und zweiten Fluorophoren und stellt einen wirksamen Energietransfer zwischen dem Donor und dem Akzeptor (oder Fluorophor und Quencher) sicher, wenn sie sich auf der gleichen Membranseite befinden, selbst bei niedrigen Konzentrationen. Der gute Energietransfer läßt es zu, die Donor-Emission weiter von der Akzeptor-Absorption zu trennen und somit das spektrale Übersprechen zu verringern, was zur Verringerung der spannungsempfindlichen Verhältnisänderung von theoretischen Werten beiträgt. Ein weiterer Hauptvorteil eines Linkers ist der, daß er das System in ein unimolekulares System umwandelt. Dadurch wird die Fluoreszenzmessung stark vereinfacht, eine 1:1-Stöchiometrie von Donor und Akzeptor (oder Fluorophor und Quencher) gewährleistet und der Bedarf einer Optimierung der relativen Beladeniveaus von Donor und Akzeptor für eine optimale spannungsempfindliche Fluoreszenzänderung wird ausgeschlossen (mit dem zusätzlichen Vorteil einer minimalen zellulären Störung und Toxizität). Die Linker-Gruppe ist ausreichend lang, um sich durch die gesamte Membran zu erstrecken.In some embodiments of the compositions and methods of the invention, a linker group is employed between the first and second fluorophores. The linker group ensures a certain minimum distance between the first and second fluorophores and ensures efficient energy transfer between the donor and the acceptor (or fluorophore and quencher) when they are on the same membrane side, even at low concentrations. The good energy transfer allows the donor emission to be further separated from the acceptor absorption and thus to reduce the spectral crosstalk, which contributes to the reduction of the voltage-sensitive ratio change of theoretical values. Another major advantage of a linker is that it transforms the system into a unimolecular system. This greatly simplifies fluorescence measurement, assures a 1: 1 stoichiometry of donor and acceptor (or fluorophore and quencher), and eliminates the need to optimize the relative loading levels of donor and acceptor for optimal voltage-sensitive fluorescence change (with the added benefit of minimal fluorescence change) cellular disorder and toxicity). The linker group is sufficiently long to extend throughout the membrane.

Das hydrophobe fluoreszierende Anion und das zweite Reagenz werden mittels eines bifunktionellen Linkers aneinander gebunden. ”Linker-Gruppe” soll den ”chemischen Arm” zwischen dem ersten und zweiten Reagenz bezeichnen. Dem Fachmann ist klar, daß jeder der Reaktanten die notwendigen reaktiven Gruppen enthalten muß, um die erforderliche chemische Struktur zu erhalten.The hydrophobic fluorescent anion and the second reagent are bound together by means of a bifunctional linker. "Linker group" is meant to be the "chemical arm" between the first and second Denote reagent. It will be understood by those skilled in the art that each of the reactants must contain the necessary reactive groups to obtain the required chemical structure.

Beispiele für Kombinationen solcher Gruppen sind Aminogruppen mit Carboxylgruppen zur Bildung von Amidbindungen, Carboxylgruppen mit Hydroxygruppen zur Bildung von Esterbindungen, Aminogruppen mit Alkylhalogeniden zur Bildung von Alkylaminobindungen, Thiole mit Thiolen zur Bildung von Disulfiden oder Thiole mit Maleinimiden oder Alkylhalogeniden zur Bildung von Thioethern. Es ist offensichtlich, daß Hydroxyl-, Carboxyl-, Aminogruppen und andere funktionelle Gruppen, falls abwesend, durch bekannte Verfahren eingeführt werden können. Es ist gleichermaßen bekannt, daß eine Vielzahl von verbindenden Gruppen verwendet werden kann. Die Struktur der Verbindung sollte eine stabile kovalente Bindung sein, die zur Bindung der beiden Spezies aneinander gebildet wird. Die Abschnitte des Linkers, die sich am dichtesten am zweiten Reagenz befinden, können hydrophil sein, wohingegen die Abschnitte des Linkers, die sich am dichtesten am mobilen fluoreszierenden Anion befinden, hydrophob sein sollten, um die Insertion in die Membran zuzulassen und um ein Verzögern der spannungsabhängigen Translokation des Anions zu vermelden. Die kovalenten Bindungen sollten im Verhältnis zu den Lösungsbedingungen, bei denen die Zellen beladen werden, stabil sein. Im allgemeinen bevorzugte verbindende Gruppen umfassen 20 bis 40 Bindungen von einem Ende zum anderen und 0 bis 10 Heteroatome (NH, O, S) und können verzweigt- oder geradkettig sein. Ohne die vorstehenden Ausführungen zu beschränken, sollte dem Fachmann klar sein, daß nur Kombinationen von chemisch verträglichen Atomen die verbindende Gruppe umfassen können. So sind beispielsweise Amid-, Ester-, Thioether-, Thioester-, Keto-, Hydroxyl-, Carboxyl- und Ethergruppen in Kombinationen mit Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen geeignete Beispiele für chemisch verträgliche verbindende Gruppen. Weitere chemisch kompatible Linker sind in den US-PSen 5,470,997 (Spalte 2 und Spalten 4–7) und 5,470,843 (Spalten 11–13) beschrieben.Examples of combinations of such groups are amino groups having carboxyl groups to form amide bonds, carboxyl groups having hydroxy groups to form ester bonds, amino groups with alkyl halides to form alkylamine bonds, thiols with thiols to form disulfides, or thiols with maleimides or alkyl halides to form thioethers. It is apparent that hydroxyl, carboxyl, amino and other functional groups, if absent, can be introduced by known methods. It is equally known that a variety of linking groups can be used. The structure of the compound should be a stable covalent bond formed to bind the two species together. The portions of the linker which are closest to the second reagent may be hydrophilic, whereas the portions of the linker closest to the mobile fluorescent anion should be hydrophobic to permit insertion into the membrane and retard to report voltage-dependent translocation of the anion. The covalent bonds should be stable relative to the solution conditions at which the cells are loaded. Generally preferred linking groups include from 20 to 40 end-to-end linkages and from 0 to 10 heteroatoms (NH, O, S) and may be branched or straight chain. Without limiting the foregoing, it should be understood by those skilled in the art that only combinations of chemically acceptable atoms may include the linking group. For example, amide, ester, thioether, thioester, keto, hydroxyl, carboxyl and ether groups in combinations with carbon-carbon bonds are suitable examples of chemically compatible linking groups. Other chemically compatible linkers are in the U.S. Patents 5,470,997 (Column 2 and columns 4-7) and 5,470,843 (Columns 11-13).

Asymmetrische 1,3-substituierte Thioharnstoffe wurden zur Verwendung bei der Synthese von Oxonolen mit N-substituierten Linkern hergestellt, wobei die Linker endständige reaktive Gruppen enthalten, die an ein geeignetes zweites Reagenz (Fluorophore/Quencher) binden können. In einem Beispiel ist einer der Oxonolsubstituenten eine Pentylkette (C5) mit einer endständigen Bromid- oder Tosylatgruppe. Aus diesen Thioharnstoffen und Diethylmalonat in Ethanolat/Ethanol wurden Thiobarbiturate hergestellt. Gemischte Pentamethinoxonole, die aus einem Äquivalent des Barbiturats mit funktionalisierten Linkern und 1,3-Dibutylthiobarbiturat hergestellt wurden, sind charakterisiert worden. Ein Synthesebeispiel ist in 11 abgebildet. Es ist klar, daß Oxonole mit Alkylketten, die von C5-Alkylketten verschieden sind, einfach durch ein solches Verfahren hergestellt werden können. Diese Oxonole liegen innerhalb des Bereichs dieser Erfindung.Asymmetric 1,3-substituted thioureas have been prepared for use in the synthesis of oxonols with N-substituted linkers, where the linkers contain terminal reactive groups that can bind to a suitable second reagent (fluorophore / quencher). In one example, one of the oxonol substituents is a pentyl chain (C 5 ) having a terminal bromide or tosylate group. Thiobarbiturates were prepared from these thioureas and diethyl malonate in ethanolate / ethanol. Mixed pentamethine oxonols prepared from one equivalent of the barbiturate with functionalized linkers and 1,3-dibutylthiobarbiturate have been characterized. A synthesis example is in 11 displayed. It will be understood that oxonols having alkyl chains other than C 5 alkyl chains can be readily prepared by such a method. These oxonols are within the scope of this invention.

Eine bevorzugte Klasse von geeigneten Linkern beinhaltet bifunktionalisierte Polyalkylenglykol-Oligomere (Polyethylenglykol, Polypropylenglykol, Polybutylenglykol, usw.) mit einer Länge, die geeignet ist, sich über die Plasmamembran zu erstrecken (25 bis 30 Kohlenstoff-Äquivalente), beispielsweise 8 bis 10 PEG-Einheiten. Das Sauerstoffatom (oder das Schwefelatom in den entsprechenden Thio-Analoga davon) stellt die Hydrophobie ein und damit die Translokationsgeschwindigkeit und das Beladen. Verbindungen, die durch solche Linker-Gruppen verbunden sind, haben die allgemeine Formel X-(CH2)m-Zq-(CH2)m'-Z'q'-(CH2)m''-Z''q''-Y in der der Rest X ein hydrophobes fluoreszierendes Anion, der Rest Y ein fluoreszierendes zweites Reagenz, das ein grün fluoreszierendes Protein, ein fluoreszierend markiertes Protein oder ein Coumarin umfasst, ist, die Reste Z, Z' und Z'' unabhängig ein Sauerstoff-, Schwefelatom, SS, CO, COO sind, m, m' und m'' ganze Zahlen von 0 bis etwa 32 sind, q, q' und q'' unabhängig den Wert 0 oder 1 haben und m + q + m' + q' + m'' + q'' etwa 20 bis 40 ist (vorzugsweise zwischen 25 und 35).A preferred class of suitable linkers include bifunctionalized polyalkylene glycol oligomers (polyethylene glycol, polypropylene glycol, polybutylene glycol, etc.) having a length capable of extending across the plasma membrane (25 to 30 carbon equivalents), for example, 8 to 10 PEGs. Units. The oxygen atom (or the sulfur atom in the corresponding thio analogues thereof) adjusts the hydrophobicity and thus the translocation rate and loading. Compounds linked by such linker groups have the general formula X- (CH 2 ) m -Z q - (CH 2 ) m ' - Z' q ' - (CH 2 ) m'' - Z''q'' - Y in which the radical X is a hydrophobic fluorescent anion, the radical Y is a fluorescent second reagent comprising a green fluorescent protein, a fluorescently labeled protein or a coumarin, the radicals Z, Z 'and Z''are independently an oxygen, Sulfur atom, SS, CO, COO, m, m 'and m''are integers from 0 to about 32, q, q' and q '' independently have the value 0 or 1 and m + q + m '+ q '+ m''+q''is about 20 to 40 (preferably between 25 and 35).

Vorzugsweise ist der Rest Z ein Schwefelatom, d. h. die Linker sind Polyalkylenthioether; m = 5, Z = S, q = 1, m' = 12, Z' = S, q' = 1, m'' = 11, Z'' = CO und q'' = 1.Preferably, the radical Z is a sulfur atom, i. H. the linkers are polyalkylene thioethers; m = 5, Z = S, q = 1, m '= 12, Z' = S, q '= 1, m' '= 11, Z' '= CO and q' '= 1.

Eine weitere Klasse von geeigneten Linkern beinhaltet funktionalisierte Alkylketten mit endständigen Thiolgruppen, die eine zentrale Disulfidbindung bilden. Das Disulfid wirkt als hydrophober Drehpunkt im Zentrum der Membran. Diese Verbindungen haben die allgemeine Formel X-(CH2)nSS(CH2)n'-Y in der der Rest X ein hydrophobes fluoreszierendes Anion, der Rest Y ein fluoreszierendes zweites Reagenz, das ein grün fluoreszierendes Protein, ein fluoreszierend markiertes Protein oder ein Coumarin umfasst, ist, n und n' ganze Zahlen von 0 bis etwa 32 sind, wobei n + n' weniger als oder gleich 33 ist.Another class of suitable linkers includes functionalized thiol-terminated alkyl chains that form a central disulfide bond. The disulfide acts as a hydrophobic fulcrum in the center of the membrane. These compounds have the general formula X- (CH 2 ) n SS (CH 2 ) n ' -Y wherein X is a hydrophobic fluorescent anion, Y is a fluorescent second reagent comprising a green fluorescent protein, a fluorescently labeled protein, or a coumarin, n and n 'are integers from 0 to about 32, where n + n 'is less than or equal to 33.

Dem Fachmann ist klar, daß die Linker-Gruppen mit geeigneten substituierten oder funktionalisierten ersten und zweiten Fluorophoren mit herkömmlicher Kopplungschemie umgesetzt werden können. Darüber hinaus ist klar, daß die Linker-Gruppe an vielen verschiedenen Positionen mit einem Fluorophor verbunden werden kann. Wichtige Positionen (X) zur Verbindung des Linkers in beispielhaften Oxonol-Klassen sind in 12 veranschaulicht. It will be understood by those skilled in the art that the linker groups can be reacted with suitable substituted or functionalized first and second fluorophores with conventional coupling chemistry. In addition, it is clear that the linker group can be attached to a fluorophore at many different positions. Important positions (X) for linking the linker in exemplary oxonol classes are in 12 illustrated.

IV. MeßverfahrenIV. Measuring method

In einer Klasse von erfindungsgemäßen Ausführungsformen wird die Fluoreszenz des hydrophoben Ions auf einer Fläche der Membran durch einen Mechanismus gequencht, der von FRET verschieden ist. FRET hat die Vorteile, daß er über große Entfernungen wirksam ist, was die erforderlichen Akzeptor-Konzentrationen auf ein Mindestmaß beschränkt, und daß er ein ratiometrisches Ausgangssignal bei zwei Emissionswellenlängen liefert. Wenn ein FRET auch über sehr große Entfernungen, die größer als die Membrandicke sind, wirksam ist, besteht die Möglichkeit, daß er nicht zwischen Akzeptoren auf gleichen und Akzeptoren auf gegenüberliegenden Seiten der Membran unterscheiden kann. Die anderen Quenching-Mechanismen besitzen eine wesentlich kürzere Reichweite und sollten keinesfalls über die Membrandicke wirksam sein.In one class of embodiments of the invention, the fluorescence of the hydrophobic ion is quenched on one face of the membrane by a mechanism other than FRET. FRET has the advantages of being effective over long distances, minimizing the required acceptor concentrations, and providing a ratiometric output at two emission wavelengths. If a FRET is effective over very large distances greater than the membrane thickness, there is a possibility that it can not distinguish between acceptors on the same and acceptors on opposite sides of the membrane. The other quenching mechanisms have a much shorter range and should by no means be effective across the membrane thickness.

Das/der zweite Fluorophor/Quencher kann sich auf jeder der intrazellulären oder extrazellulären Fläche befinden, solange es/er für die eine oder die andere Fläche spezifisch ist. In den hier beschriebenen speziellen Beispielen wurde aus Gründen der Zweckmäßigkeit die extrazelluläre Oberfläche als Ziel verwendet.The second fluorophore / quencher may be on any of the intracellular or extracellular surfaces as long as it is specific to one face or the other. In the specific examples described herein, for the sake of convenience, the extracellular surface has been targeted.

FRET oder das Fluoreszenz-Quenching wird am besten durch Ins-Verhältnis-Setzen der Emission nachgewiesen, das zwischen den zwei Populationen des mobilen Fluorophors, d. h. dem an die extrazelluläre und dem an die intrazelluläre Fläche der Membran gebundenen Fluorophor unterscheiden kann. Insbesondere stellt ein FRET, bei dem ein fluoreszierender Akzeptor eingesetzt wird, eine Änderung des Emissionsverhältnisses bereit, das für konfokale Lasermikroskopie und interne Korrekturen für Veränderungen bei der Beladung des Donors, der Zelldicke und -position (einschließlich Bewegungsartefakten) und der Annregungsintensität gut geeignet ist. Emissionsverhältnisse ändern sich gewöhnlich stärker als jedes der Emissionswellenlängen-Signale allein, da die Donor- und Akzeptoremissionen sich in entgegengesetzte Richtungen verändern sollten, die sich gegenseitig verstärken, wenn sie ins Verhältnis zueinander gesetzt werden. Wenn ein Ins-Verhältnis-Setzen der Emission nicht erwünscht oder möglich ist, kann jede der Wellenlängen immer noch allein verwendet werden oder es kann die Veränderung der Lebensdauer des angeregten Zustands des Donors kontrolliert werden.FRET or fluorescence quenching is best detected by ratioing the emission between two populations of the mobile fluorophore, i. H. can distinguish between the bound to the extracellular and to the intracellular surface of the membrane fluorophore. In particular, a FRET employing a fluorescent acceptor provides a change in emission ratio well suited for confocal laser microscopy and internal corrections for changes in donor loading, cell thickness and position (including motion artifacts), and intensity of the annealing. Emission ratios usually change more than each of the emission wavelength signals alone, because the donor and acceptor emissions should change in opposite directions, which mutually reinforce each other when they are placed in relation to each other. If an in-ratio emission setting is not desired or possible, each of the wavelengths may still be used alone or the change in excited state lifetime of the donor may be controlled.

Emissionsverhältnisse werden entweder durch Veränderung des Durchlaßbereichs eines Wellenlängen-selektiven Filters vor einem einzelnen Detektor oder vorzugsweise durch Aufspalten des emittierten Lichts mit einem dichroitischen Spiegel und gleichzeitigem Messen von zwei Wellenlängenbereichen mit zwei Detektoren gemessen, denen jeweils zusätzliche Wellenlängen-selektive Filter vorausgehen können. Im ersten Verfahren können die Wellenlängen-selektiven Filter zwei oder mehrere Interferenzfilter mit verschiedenen Durchlaßbereichen sein, die abwechselnd vor dem Detektor angeordnet werden, oder sie können ein kontinuierlich abstimmbarer Monochromator sein, der wiederholt über einen Wellenlängenbereich abgetastet wird. Der Vorteil des ersten Verfahrens besteht darin, daß nur ein Detektor verwendet wird, was Detektoren einspart und das Problem der genauen Anpassung zweier Detektoren vermeidet. Die Vorteile des zweiten Verfahrens, nämlich der Verwendung eines dichroitischen Spiegels und zwei getrennten Detektoren bestehen darin, daß die beiden Emissionen wirklich gleichzeitig anstatt nacheinander gemessen werden können und daß die von der Probe emittierten Photonen besser ausgenutzt werden.Emission ratios are measured either by changing the passband of a wavelength-selective filter in front of a single detector or preferably by splitting the emitted light with a dichroic mirror and simultaneously measuring two wavelength ranges with two detectors, each preceded by additional wavelength-selective filters. In the first method, the wavelength-selective filters may be two or more interference filters having different passbands alternately arranged in front of the detector, or may be a continuously tunable monochromator repeatedly scanned over a wavelength range. The advantage of the first method is that only one detector is used, saving detectors and avoiding the problem of exact matching of two detectors. The advantages of the second method, namely the use of a dichroic mirror and two separate detectors, are that the two emissions can actually be measured simultaneously rather than sequentially and that the photons emitted by the sample are better utilized.

Eine molekulare Spezifität für bestimmte Zelltypen in einer gemischten Population kann durch Verwendung zellspezifischer Antikörper oder Lektine als Träger der extrazellulären fluoreszierenden Markierung oder durch Verwendung eines grün fluoreszierenden Proteins eingeführt werden, das spezifisch in einem gegebenen Zelltyp als die intra- oder extrazelluläre Markierung exprimiert wird. Spezifisch markierte Zellen verringern auch die Hintergrundfärbung und gewährleisten starke Fluoreszenzänderungen in komplexen Geweben.Molecular specificity for particular cell types in a mixed population can be introduced by using cell-specific antibodies or lectins as carriers of the extracellular fluorescent label or by using a green fluorescent protein that is specifically expressed in a given cell type as the intra- or extracellular label. Specifically labeled cells also reduce background staining and ensure strong fluorescence changes in complex tissues.

Eine hohe Empfindlichkeit wird erreicht, wenn der Spannungssensor (d. h. das hydrophobe Anion des ersten Reagenz) mindestens eine volle Einheitsladung nahezu über den ganzen Weg durch die Membran translociert. Sogar ohne spezifische Ionen-Kanäle oder -Transporter kann eine solche Translokation ziemlich schnell sein, wenn das Ion negativ geladen, delokalisiert und hydrophob ist. Beispielsweise erzeugt das Lipid-lösliche, nicht fluoreszierende Anion des Dipicrylamins (2,2',4,4',6,6'-Hexanitrodiphenylamin) Verschiebungsströme in anregbarem Gewebe mit Submillisekunden-Kinetiken, deren Geschwindigkeit mit Natrium-Kanal-Torströmen vergleichbar ist [R. Benz und F. Conti, 1981, Structure of the squid axon membrane as derived from charge-pulse relaxation studies in the presence of absorbed lipophilic ions, J. Membrane Biol. 59, 91–104; R. Benz und W. Nonner, 1981, Structure of the axolemma of frog myelinated nerve: relaxation experiments with a lipophilic probe ion, J. Membrane Biol. 59, 127–134; J. M. Fernández, R. E. Taylor und F. Bezanilla, 1983, Induced capacitance in the squid giant axon, J. Gen. Physiol. 82, 331–346]. Das Abfühlen der Spannung sollte jedoch keine weitere Diffusion des Ions durch die unbewegten wäßrigen Schichten erfordern, da dies die Antwort verlangsamt und einen anhaltenden Leckstrom verursacht.High sensitivity is achieved when the voltage sensor (ie, the hydrophobic anion of the first reagent) translocates at least one full unit charge almost all the way through the membrane. Even without specific ion channels or transporters, such translocation can be quite fast if the ion is negatively charged, delocalized, and hydrophobic. For example, the lipid-soluble, non-fluorescent anion of dipicrylamine (2,2 ', 4,4', 6,6'-hexanitrodiphenylamine) produces shift currents in excitable tissue with submillisecond kinetics comparable in speed to sodium channel gate currents [ R. Benz and F. Conti, 1981, Structure of the squid axon membrane as derived from charge-pulse relaxation studies in the presence of absorbed lipophilicions, J. Membrane Biol. 59, 91-104; R. Benz and W. Nonner, 1981, Structure of the axolema of frog myelinated nerve: relaxation experiments with a lipophilic probe ion, J. Membrane Biol. 59, 127-134; JM Fernández, RE Taylor and F. Bezanilla, 1983, Induced Capacitance in the Squid Giant axon, J.Gen. Physiol. 82, 331-346]. However, sensing the voltage should not require further diffusion of the ion through the still aqueous layers as this slows the response and causes a sustained leakage current.

Um ein optisches Signal der Translokation des fluoreszierenden hydrophoben Ions (d. h. des ersten Reagenz) von einer Seite der Plasmamembran zur anderen Seite zu erzeugen, wird FRET oder Fluoreszenz-Quenching zwischen dem translocierenden Ion und einem Fluorophor oder Quencher (d. h. dem zweiten Reagenz) verwendet, das an nur einer Fläche der Plasmamembran fixiert ist. Am zweckmäßigsten wird die extrazelluläre Fläche verwendet.To generate an optical signal of the translocation of the fluorescent hydrophobic ion (ie, the first reagent) from one side of the plasma membrane to the other, FRET or fluorescence quenching is used between the translocating ion and a fluorophore or quencher (ie, the second reagent). which is fixed to only one surface of the plasma membrane. Most conveniently, the extracellular surface is used.

Als nicht beschränkendes Beispiel ist in 1 schematisch der Fall gezeigt, bei dem translocierende Ionen anionische fluoreszierende Akzeptoren sind, die bei Wellenlängen absorbieren, die mit dem Emissionsspektrum der extrazellulär fixierten Donor-Fluorophore überlappen. Bei einem bestehenden negativen Membranpotential (A) weisen die permeablen Oxonole an der extrazellulären Oberfläche der Plasmamembran eine hohe Konzentration auf und der Energietransfer vom extrazellulär gebundenen FL-WGA (Fluoreszein-Weizenkeim-Agglutinin) ist begünstigt. FRET wird durch den geraden Pfeil von Lektin zu Oxonol symbolisiert. Bei einem positiven Membranpotential (B) befinden sich die Anionen vorwiegend auf der intrazellulären Oberfläche der Membran und ein Energietransfer wird stark verringert, und zwar aufgrund ihres erhöhten mittleren Abstands von den Donoren auf der extrazellulären Oberfläche.As a non-limiting example, in 1 schematically shown the case in which translocating ions are anionic fluorescent acceptors that absorb at wavelengths that overlap with the emission spectrum of extracellularly fixed donor fluorophores. At an existing negative membrane potential (A), the permeable oxonols at the extracellular surface of the plasma membrane have a high concentration and the energy transfer from the extracellularly bound FL-WGA (fluorescein wheat germ agglutinin) is favored. FRET is symbolized by the straight arrow from lectin to oxonol. At positive membrane potential (B), the anions are predominantly on the intracellular surface of the membrane and energy transfer is greatly reduced due to their increased mean distance from the donors on the extracellular surface.

Die Geschwindigkeit der spannungsempfindlichen Fluoreszenzantwort hängt von der Translokationsgeschwindigkeit des Fluorophors von einer Seite zur anderen Seite ab. Die Geschwindigkeit der Antwort ist für DiSBA-C6-(3) in 5 gezeigt und folgt den allgemeinen Gleichungen (1) und (2). Wie diese Gleichung zeigt, werden fluoreszierende Ionen, die in einem Millisekunden-Zeitbereich als Antwort auf biologisch signifikante Veränderungen des Transmembranpotentials über die Membran springen, benötigt, um schnellen Polarisations-/Depolarisationskinetiken folgen zu können. Langsamer springende Ionen wären nicht geeignet, um beispielsweise schnellen elektrischen Signalen in neuronalem Gewebe zu folgen (eine Hauptanwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren). Die Entwicklung und Entdeckung solcher Moleküle mit der zusätzlichen Einschränkung, daß sie fluoreszierend sein müssen, ist keine triviale Aufgabe.The speed of the voltage-sensitive fluorescent response depends on the translocation rate of the fluorophore from one side to the other. The speed of the answer is for DiSBA-C 6 - (3) in 5 and follows general equations (1) and (2). As this equation shows, fluorescent ions that jump across the membrane in a millisecond time range in response to biologically significant changes in transmembrane potential are needed to follow rapid polarization / depolarization kinetics. Slow jumping ions would not be suitable for following, for example, fast electrical signals in neuronal tissue (a major application of the compositions and methods of the invention). The development and discovery of such molecules with the additional restriction that they must be fluorescent is not a trivial task.

Die mobilen hydrophoben Anionen können vielmehr Donoren als Akzeptoren sein. Jede der Alternativen hat bestimmte Vorteile. Ein Beispiel, bei dem das hydrophobe Ion der FRET-Donor ist, ist die DiSBA-C6-(3)/Texas-Rot-WGA-Kombination. Ein Hauptvorteil dieser Anordnung ist, daß sie die Konzentration des hydrophoben Farbstoff-Moleküls in der Membran auf ein Mindestmaß beschränkt; dies verringert die Toxizität und die zellulären Störungen, die sich aus dem Verschiebungsstrom und jeglichen photodynamischen Effekten ergeben. Ein weiterer Vorteil ist die im allgemeinen höhere Quantenausbeute von Fluorophoren, die in Membranen gebunden sind, im Verhältnis zu denen auf Proteinen oder in Wasser; dadurch wird bei einer gegebenen Entfernung ein besserer FRET erzeugt.The mobile hydrophobic anions may be donors rather than acceptors. Each of the alternatives has certain advantages. An example in which the hydrophobic ion is the FRET donor is the DiSBA C 6 (3) / Texas Red WGA combination. A major advantage of this arrangement is that it minimizes the concentration of the hydrophobic dye molecule in the membrane; this reduces the toxicity and cellular disturbances that result from the displacement current and any photodynamic effects. Another advantage is the generally higher quantum yield of fluorophores bound in membranes relative to those on proteins or in water; this will produce a better FRET at a given distance.

Es wurde hier gezeigt, daß Bis-(1,3-dialkyl-2-thiobarbiturat)-trimethinoxonole, wobei Alkyl die n-Hexyl- und n-Decylgruppe bedeutet (DiSBA-C6(3) bzw. DiSBA-C10-(3)) als Donoren für Texas-Rot-markiertes Weizenkeim-Agglutinin (TR-WGA) und als Akzeptoren von Fluorescein-markiertem Lektin (FL-WGA) wirken. In spannungsabgegriffenen Fibroblasten wurde die Translokation dieser Oxonole als Verschiebungsstrom mit einer Zeitkonstante von etwa 2 ms für 100 mV Depolarisation bei 20°C gemessen, was mit der Geschwindigkeit der Fluoreszenz-Änderungen übereinstimmt. Änderungen des Fluoreszenz-Verhältnisses zwischen 4 bis 34% wurden für eine 100 mV Depolarisation in Fibroblasten, Astrozytomzellen, schlagenden Herzmyozyten und B104-Neuroblastomzellen beobachtet. Die starken Fluoreszenz-Änderungen gestatteten eine Hochgeschwindigkeitskonfokal-Bilderzeugung.It has been shown here that bis (1,3-dialkyl-2-thiobarbiturate) trimethine oxonols, where alkyl is the n-hexyl and n-decyl group (DiSBA-C 6 (3) or DiSBA-C 10 - ( 3)) act as donors for Texas red-labeled wheat germ agglutinin (TR-WGA) and as acceptors of fluorescein-labeled lectin (FL-WGA). In voltage-removed fibroblasts, the translocation of these oxonols was measured as a displacement current with a time constant of about 2 ms for 100 mV depolarization at 20 ° C, which agrees with the rate of fluorescence changes. Changes in fluorescence ratio between 4 to 34% were observed for 100 mV depolarization in fibroblasts, astrocytoma cells, beating cardiac myocytes, and B104 neuroblastoma cells. The strong fluorescence changes allowed high speed confocal imaging.

In den Beispielen wurden einzelne Zellen verwendet, so daß die optischen Signale mit den Spannungsänderungen verglichen werden konnten, die von herkömmlichen Mikroelektroden-Techniken wie patch clamping, die nur auf einzelne Zellen anwendbar sind, genau bekannt sind. Es sollte jedoch klar sein, daß die Farbstoffe für viele Anwendungen eingesetzt werden können, in denen Mikroelektroden nicht einsetzbar sind. Der Vergleich mit Mikroelektroden wird lediglich für eine genaue Kalibrierung und den Beweis benötigt, daß der Mechanismus der Fluoreszenz-Signalerzeugung dem hier beschriebenen entspricht. Die hier beschriebenen Zwei-Reagenz-Zusammensetzungen und -Verfahren können entweder die verschiedenen elektrischen Potentiale vieler benachbarter Zellen oder benachbarter Teile einer einzelnen Zelle auflösen oder ein gemitteltes Signal für alle Membran-Positionen ergeben, und zwar abhängig davon, ob das optische Signal räumlich dargestellt oder zusammengefaßt wird.In the examples, individual cells were used so that the optical signals could be compared with the voltage changes well known from conventional microelectrode techniques, such as patch clamping, which are applicable only to single cells. It should be understood, however, that the dyes can be used in many applications where microelectrodes are not applicable. Comparison with microelectrodes is needed only for accurate calibration and proof that the mechanism of fluorescence signal generation corresponds to that described herein. The two-reagent compositions and methods described herein can either resolve the various electrical potentials of many adjacent cells or adjacent portions of a single cell or an average one Signal for all membrane positions, depending on whether the optical signal is spatially displayed or summarized.

Die hier beschriebenen Verfahren sind auf viele Membranen anwendbar. Insbesondere können Membranpotentiale von Membranen biologischer Zellen nachgewiesen und kontrolliert werden. Das Verfahren ist am besten für Plasmamembranen geeignet, insbesondere die äußerste Plasmamembran von Säugerzellen. Nicht beschränkende Beispiele für Membranen sind subzelluläre Organellen, Membranen des endoplasmatischen Reticulums, sekretorische Granula, Mitochondrien, Mikrosomen und sekretorische Vesikel. Verwendbare Zelltypen sind unter anderem Neuronen, Herzzellen, Lymphozyten (T- und B-Lymphozyten), Nervenzellen, Muskelzellen und dergleichen.The methods described here are applicable to many membranes. In particular, membrane potentials of membranes of biological cells can be detected and controlled. The method is best suited for plasma membranes, in particular the outermost plasma membrane of mammalian cells. Non-limiting examples of membranes are subcellular organelles, membranes of the endoplasmic reticulum, secretory granules, mitochondria, microsomes and secretory vesicles. Useful cell types include neurons, cardiac cells, lymphocytes (T and B lymphocytes), nerve cells, muscle cells, and the like.

V. Arzneistoff-ScreeningV. Drug Screening

Die Erfindung stellt auch Verfahren zum Screenen von Testproben wie potentiellen therapeutischen Arzneistoffen, die Membranpotentiale in biologischen Zellen beeinflussen, bereit. Diese Verfahren beinhalten das vorstehend beschriebene Messen von Membranpotentialen in Gegenwart und Abwesenheit (Kontrollmessung) der Testprobe. Kontrollmessungen werden gewöhnlich mit einer Probe ausgeführt, die alle Komponenten der Testprobe enthält, jedoch nicht den vermuteten Arzneistoff. Der Nachweis einer Änderung des Membranpotentials in Gegenwart des Testmittels im Verhältnis zur Kontrolle zeigt, daß das Testmittel wirksam ist. Membranpotentiale können auch in Gegenwart oder Abwesenheit eines pharmakologischen Mittels bekannter Aktivität (d. h. einem Standardmittel) oder vermuteter Aktivität (d. h. einem Testmittel) bestimmt werden. Ein mit den hier beschriebenen Verfahren nachgewiesener Unterschied in den Membranpotentialen erlaubt den Vergleich der Wirkung des Testmittels mit der des Standardmittels. Es ist klar, daß viele Kombinationen und Permutationen von Arneistoff-Screening-Protokollen bekannt sind. Diese bekannten Protokolle können unter Verwendung des hier beschriebenen Verfahrens der Membranpotential-Messung einfach angepaßt werden, um Verbindungen zu identifizieren, die Membranpotentiale beeinflussen. Die Verwendung der hier beschriebenen Technik zur Bestimmung von Membranpotentialen in Kombination mit all diesen Verfahren ist von dieser Erfindung umfaßt. In einer speziellen Anwendung stellt die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung bereit, die die Aktivität eines Ionenkanals, einer Ionenpumpe oder eines Ionenaustauschers in der Membran moduliert, umfassend:

  • (a) Beladen der Zellen mit den ersten und zweiten Reagenzien, die zusammen das Membranpotential wie vorstehend beschrieben messen;
  • (b) Bestimmen des Membranpotentials wie vorstehend beschrieben;
  • (c) Aussetzen der Zellen gegenüber der Testprobe;
  • (d) erneutes Bestimmen des Membranpotentials und Vergleichen mit dem Ergebnis von (b) zur Bestimmung der Wirkung der Testprobe;
  • (e) gegebenenfalls Aussetzen der Membran gegenüber einem Reiz, der einen Ionenkanal, eine Ionenpumpe oder einen Ionenaustauscher moduliert, und erneutes Bestimmen des Membranpotentials und Vergleichen mit dem Ergebnis von (d) zur Bestimmung der Wirkung der Testprobe auf die Antwort auf den Reiz.
The invention also provides methods for screening test samples such as potential therapeutic drugs that affect membrane potentials in biological cells. These methods involve the measurement of membrane potentials in the presence and absence (control measurement) of the test sample described above. Control measurements are usually performed on a sample containing all components of the test sample, but not the suspected drug. Detection of a change in membrane potential in the presence of the test agent relative to the control indicates that the test agent is effective. Membrane potentials may also be determined in the presence or absence of a pharmacological agent of known activity (ie, a standard agent) or suspected activity (ie, a test agent). A difference in membrane potentials as demonstrated by the methods described herein allows comparison of the effect of the test agent with that of the standard agent. It is clear that many combinations and permutations of arsenite screening protocols are known. These known protocols can be readily adapted using the method of membrane potential measurement described herein to identify compounds that affect membrane potentials. The use of the technique described herein for determining membrane potentials in combination with all of these methods is encompassed by this invention. In a specific application, the invention provides a method of identifying a compound that modulates the activity of an ion channel, ion pump or ion exchanger in the membrane, comprising:
  • (a) loading the cells with the first and second reagents which together measure the membrane potential as described above;
  • (b) determining the membrane potential as described above;
  • (c) exposing the cells to the test sample;
  • (d) re-determining the membrane potential and comparing with the result of (b) to determine the effect of the test sample;
  • (e) optionally exposing the membrane to a stimulus modulating an ion channel, an ion pump or an ion exchanger and re-determining the membrane potential and comparing with the result of (d) to determine the effect of the test sample on the response to the stimulus.

In einer weiteren Anwendung stellt die Erfindung ein Verfahren zum Screenen von Testproben bereit, und zwar zur Identifizierung einer Verbindung, die die Aktivität eines Ionenkanals, einer Ionenpumpe oder eines Ionenaustauschers in einer Membran moduliert, umfassend:

  • (a) Beladen eines ersten und eines zweiten Satzes von Zellen mit ersten und zweiten Reagenzien, die zusammen das Membranpotential messen;
  • (b) gegebenenfalls Aussetzen von sowohl dem ersten als auch dem zweiten Satz von Zellen gegenüber einem Reiz, der einen Ionenkanal, eine Ionenpumpe oder einen Ionenaustauscher moduliert;
  • (c) Aussetzen des ersten Satzes von Zellen gegenüber der Testprobe;
  • (d) Messen des Membranpotentials des ersten und zweiten Satzes von Zellen; und
  • (e) In-Beziehung-Setzen der Membranpotential-Differenzen zwischen den ersten und zweiten Sätzen von Zellen zur Fähigkeit einer Verbindung in der Testprobe, die Aktivität eines Ionenkanals, einer Ionenpumpe oder eines Ionenaustauschers in einer Membran zu modulieren.
In another application, the invention provides a method of screening test samples to identify a compound that modulates the activity of an ion channel, ion pump, or ion exchanger in a membrane, comprising:
  • (a) loading a first and a second set of cells with first and second reagents which together measure the membrane potential;
  • (b) optionally exposing both the first and second sets of cells to a stimulus that modulates an ion channel, an ion pump, or an ion exchanger;
  • (c) exposing the first set of cells to the test sample;
  • (d) measuring the membrane potential of the first and second set of cells; and
  • (e) relating the membrane potential differences between the first and second sets of cells to the ability of a compound in the test sample to modulate the activity of an ion channel, ion pump or ion exchanger in a membrane.

Interessierende Ionenkanäle beinhalten unter anderem Natrium-, Calcium-, Kalium-, nicht spezifische Kation- und Chlorid-Ionenkanäle, wobei jeder davon konstitutiv offen, spannungsgesteuert, Ligand-gesteuert oder durch intrazelluläre Signalwege gesteuert sein kann.Interesting ion channels include, but are not limited to, sodium, calcium, potassium, non-specific cation and chloride ion channels, each of which can be constitutively open, voltage-gated, ligand-gated, or controlled by intracellular signaling pathways.

Biologische Zellen, die gescreent werden können, sind unter anderem Primärkulturen von Säugerzellen, von Säugergewebe dissoziierte Zellen, und zwar entweder unmittelbar oder nach Primärkultur. Zelltypen sind unter anderem weiße Blutzellen (z. B. Leukozyten), Hepatozyten, Pankreas-beta-Zellen, Neuronen, glatte Muskelzellen, Darmepithelzellen, Herzmyozyten, Gliazellen und dergleichen. Die Erfindung beinhaltet auch die Verwendung rekombinanter Zellen, in die die Ionentransporter, Ionenkanäle, -pumpen und -austauscher eingesetzt und mittels Gentechnik exprimiert wurden. Viele cDNA-Sequenzen für solche Transporter wurden geklont (vgl. US-PS 5,380,836 für einen geklonten Natriumkanal) und Verfahren für deren Expression in interessierenden Zellinien sind bekannt (vgl. US-PS 5,436,128 ). Beispiele für gezüchtete Zellinien, die von Menschen oder anderen Säugern abgeleitet sind, beinhalten LM(TK–)-Zellen, HEK293 (Nierenzellen von menschlichen Embryonen), 3T3-Fibroblasten, COS-Zellen, CHO-Zellen, RAT1- und HLHepG2-Zellen.Biological cells that can be screened include primary cultures of mammalian cells, cells dissociated from mammalian tissue, either directly or after primary culture. Cell types include white blood cells (eg leukocytes), hepatocytes, pancreatic beta cells, neurons, smooth Muscle cells, intestinal epithelial cells, cardiac myocytes, glial cells and the like. The invention also includes the use of recombinant cells into which the ion transporters, ion channels, pumps and exchangers have been inserted and expressed by genetic engineering. Many cDNA sequences for such transporters have been cloned (cf. U.S. Patent 5,380,836 for a cloned sodium channel) and methods for their expression in cell lines of interest are known (cf. U.S. Patent 5,436,128 ). Examples of cultured cell lines derived from humans or other mammals include LM (TK - ) cells, HEK293 (human embryonic kidney cells), 3T3 fibroblasts, COS cells, CHO cells, RAT1 and HLHepG2 cells.

Die hier beschriebenen Screening-Verfahren können auf Zellen angewandt werden, die in feste Oberflächen wachsen oder auf solchen Oberflächen abgelagert sind. Eine gebräuchliche Technik ist die Verwendung einer Mikrotiterplattenvertiefung, wobei die Fluoreszenz-Messungen mit käuflichen Fluoreszenzplatten-Lesegeräten durchgeführt werden. Die Erfindung beinhaltet High Throughput Screening (HTS) sowohl in automatischen als auch halbautomatischen Systemen. Ein solches Verfahren besteht darin, daß Zellen in Costar Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (flach mit einem durchsichtigen Boden) verwendet werden und daß das Fluoreszenzsignal mit einem CytoFluor Multiwell Plattenlesegerät (Perseptive Biosystems, Inc., MA) unter Verwendung von zwei Emissionswellenlängen zur Aufnahme von Fluoreszenz-Emissionsverhältnissen gemessen wird.The screening methods described herein can be applied to cells that grow in solid surfaces or are deposited on such surfaces. One common technique is the use of a microtiter plate well, wherein the fluorescence measurements are made with commercially available fluorescent plate readers. The invention includes high throughput screening (HTS) in both automatic and semi-automatic systems. One such method is to use cells in Costar 96 well microtiter plates (flat with a transparent bottom) and fluorescence signal with a CytoFluor Multiwell plate reader (Perseptive Biosystems, Inc., MA) using two emission wavelengths to capture fluorescence Mission ratios is measured.

Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung und sind nicht beschränkend aufzufassen.The following examples illustrate the invention and are not intended to be limiting.

BEISPIELEEXAMPLES

BEISPIEL I – SYNTHESE VON OXONOL-FARBSTOFFENExample I - Synthesis of Oxone Colourants

Alle Ausgangsmaterialien und -reagenzien wiesen die höchste erhältliche Reinheit auf (Aldrich, Milwaukee, WI) und wurden ohne weitere Reinigung verwendet, falls nichts anderes angegeben ist. Lösungsmittel waren HPLC-rein (Fisher) und wurden über aktiviertem Molekularsieb 3 Å getrocknet. Die NMR-Spektren wurden mit einem Varian Gemini 200 MHz Spektrometer (Palo Alto, CA) aufgenommen. Die Spektren wurden auf den Lösungsmittel-Peak von CHCl3 bei 7,24 ppm bezogen. Fluoreszenzspektren wurden mit einem Spex Fluorolog-2 (Edison, NJ) aufgenommen und wurden gegen Veränderungen der Lampen- und Detektor-Wellenlänge unter Verwendung der vom Hersteller gelieferten Korrekturdaten korrigiert.All starting materials and reagents had the highest available purity (Aldrich, Milwaukee, WI) and were used without further purification unless otherwise specified. Solvents were HPLC grade (Fisher) and were dried over activated molecular sieve 3Å. The NMR spectra were recorded on a Varian Gemini 200 MHz spectrometer (Palo Alto, CA). The spectra were based on the solvent peak of CHCl 3 at 7.24 ppm. Fluorescence spectra were recorded with a Spex Fluorolog-2 (Edison, NJ) and corrected for changes in lamp and detector wavelengths using the correction data provided by the manufacturer.

Bis-(1,3-dibutyl-2-thiobarbiturat)-trimethinoxonol DiSBA-C4-(3): DiSBA-C4-(3) wurde auf der Basis des für das Ethylderivat angegebenen Verfahrens hergestellt [ GB-PS 1,231,884 ]. 1,3-Dibutyl-thiobarbiturat (500 mg, 2 mmol) wurde in 700 μl Pyridin gelöst und mit einem Gemisch von 181 μl (1,1 mmol) Malonaldehyd-bis-(dimethylacetal) und 100 μl einer 1 M HCl versetzt, worauf sich die Lösung sofort rot färbte. Nach 3 Stunden wurde die Hälfte des Reaktionsgemisches entfernt und 2 Äquivalente des geschützten Malonaldehyds wurden stündlich insgesamt 4 Stunden lang dem verbliebenen Gemisch zugesetzt. Danach wurden die ausgefallenen purpur-schwarzen Kristalle des DiSBA-C4-(3)-Pyridiniumsalzes abfiltriert. Nach dem Waschen der Kristalle mit Wasser und Trocknen unter vermindertem Druck (0,7 mbar (0,5 Torr)) wurden 67,2 mg reines Produkt erhalten.
1H-NMR (CDCl3): 8,91 (2H, d, J = 5,1 Hz, py), 8,76 (1H, t, J = 13,7 Hz, mittleres Methin), 8,52 (1H, t, J = 8,0 Hz, py), 8,16 (2H, d, J = 13,9 Hz, Methin), 8,00 (2H, dd, J1~J2 = 6,9 Hz, py), 4,47 (8H, cm, NCH 2CH2CH2CH3), 1,69 (8H, cm, NCH2CH 2CH2CH3), 1,39 (8H, cm, NCH2CH2CH 2CH3), 0,95 (12H, t, J = 6,4 Hz, Methyl).Bis (1,3-dibutyl-2-thiobarbiturate) trimethine oxonol DiSBA-C 4 - (3): DiSBA-C 4 - (3) was prepared on the basis of the procedure given for the ethyl derivative [ GB-PS 1,231,884 ]. 1,3-Dibutyl-thiobarbiturate (500 mg, 2 mmol) was dissolved in 700 μl of pyridine and treated with a mixture of 181 μl (1.1 mmol) of malonaldehyde bis (dimethylacetal) and 100 μl of 1 M HCl, whereupon The solution immediately turned red. After 3 hours, half of the reaction mixture was removed and 2 equivalents of the protected malonaldehyde was added to the remaining mixture for a total of 4 hours each hour. Thereafter, the precipitated purple-black crystals of DiSBA-C 4 - (3) -pyridinium salt were filtered off. After washing the crystals with water and drying under reduced pressure (0.7 mbar (0.5 Torr)), 67.2 mg of pure product were obtained.
1 H-NMR (CDCl3): 8.91 (2H, d, J = 5.1 Hz, py), 8.76 (1H, t, J = 13.7 Hz, central methine), 8.52 ( 1H, t, J = 8.0 Hz, py), 8.16 (2H, d, J = 13.9 Hz, methine), 8.00 (2H, dd, J 1 ~J 2 = 6.9 Hz , py), 4.47 (8H, cm, NC H 2 CH 2 CH 2 CH 3 ), 1.69 (8H, cm, NCH 2 C H 2 CH 2 CH 3 ), 1.39 (8H, cm, NCH 2 CH 2 C H 2 CH 3 ), 0.95 (12H, t, J = 6.4 Hz, methyl).

Zur Herstellung von 1,3-Dibutyl-thiobarbiturat wurden 1,22 g Natrium (53 mmol) langsam unter Argon in 20 ml trockenem Ethanol gelöst. Die Ethanolatlösung wurde mit 8,5 g (8 ml, 53 mmol) Diethylmalonat und dann mit 5 g (26,5 mmol) Dibutylthioharnstoff versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Tage unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde das Gemisch filtriert und das Filtrat unter Zugabe von Wasser geklärt. Dann wurde bis zu einem pH-Wert von 1–2 konzentrierte HCl zugegeben, worauf das saure Filtrat 3× mit einem Hexangemisch extrahiert wurde. Nach dem Konzentrieren des Extrakts wurde ein Niederschlag von 5,5 g Rohprodukt erhalten. Der Feststoff wurde aus Methanol unter Zugabe von kleinen Mengen Wasser umkristallisiert, wobei 4,23 g der reinen Barbitursäure erhalten wurden. (Ausbeute: 65%).
1H-NMR (CDCl3): 4,33 (4H, cm, NCH 2CH2CH2CH3), 3,71 (2H, s, Ring-CH2), 1,63 (4H, cm, NCH2CH 2CH2CH3), 1,35 (4H, cm, NCH2CH2CH 2CH3), 0,94 (6H, t, J = 6,2 Hz, Methyl).To prepare 1,3-dibutylthiobarbiturate, 1.22 g of sodium (53 mmol) was slowly dissolved under argon in 20 ml of dry ethanol. The ethanolate solution was treated with 8.5 g (8 ml, 53 mmol) of diethylmalonate and then with 5 g (26.5 mmol) of dibutylthiourea. The reaction mixture was heated at reflux for 3 days. After cooling, the mixture was filtered and the filtrate clarified with the addition of water. Concentrated HCl was then added to pH 1-2 and the acidic filtrate was extracted 3x with a hexane mixture. After concentration of the extract, a precipitate of 5.5 g of crude product was obtained. The solid was recrystallized from methanol with addition of small amounts of water to give 4.23 g of the pure barbituric acid. (Yield: 65%).
1 H-NMR (CDCl3): 4.33 (4H, cm, NC H 2 CH 2 CH 2 CH 3), 3.71 (2H, s, ring CH 2), 1.63 (4H, cm, NCH 2 C H 2 CH 2 CH 3 ), 1.35 (4H, cm, NCH 2 CH 2 C H 2 CH 3 ), 0.94 (6H, t, J = 6.2 Hz, methyl).

Bis-(1,3-dihexyl-2-thiobarbiturat)-pentamethinoxonol (DiSBA-C6-(5)): 1,3-Dihexyl-2-thiobarbitursäure (200 mg, 0,64 mmol) und Glutakondialdehyddianilmonohydrochlorid (Chemical Abstract Name: N-[5-(Phenylamino)-2,4-pentadienyliden]-phenylamin, Monohydrochlorid) (91 mg, 0,32 mmol) wurden in 1 ml Pyridin gemischt, worauf sich die Lösung innerhalb von 10 Sekunden blau färbte. Das Reaktionsgemisch wurde 1,5 Stunden gerührt und anschließend das Lösungsmittel unter Hochvakuum entfernt. Der Rückstand wurde in CHCl3 gelöst und einer Kieselgel-Chromatographie mit CHCl3/MeOH (93:7) als Eluent unterworfen, wobei reines blaues Oxonol (72 mg) gewonnen wurde.
1H-NMR (CDCl3/CD3OD): 7,60-7,80 (4H, cm, Methin-CH2), 7,35 (1H, t, J = 11,3 Hz, mittleres Methin), 4,31 (8H, cm, NCH2R), 1,57 (8H, cm, NCH2CH2R), 1,20 (24H, breites m, bulk CH2), 0,74 (12H, breites t, Methyl).Bis (1,3-dihexyl-2-thiobarbiturate) pentamethine oxonol (DiSBA-C 6 - (5)): 1,3-dihexyl-2-thiobarbituric acid (200 mg, 0.64 mmol) and glutacondialdehyde dianil monohydrochloride (Chemical Abstract Name N- [5- (phenylamino) -2,4-pentadienylidene] -phenylamine, monohydrochloride) (91 mg, 0.32 mmol) were mixed in 1 ml of pyridine and the solution turned blue within 10 seconds. The reaction mixture was stirred for 1.5 hours and then the solvent was removed under high vacuum. The residue was in CHCl 3 and subjected to silica gel chromatography with CHCl 3 / MeOH (93: 7) as eluent to give pure blue oxonol (72 mg).
1 H-NMR (CDCl 3 / CD 3 OD): 7.60-7.80 (4H, cm, methine-CH 2 ), 7.35 (1H, t, J = 11.3 Hz, medium methine), 4.31 (8H, cm, NCH 2 R), 1.57 (8H, cm, NCH 2 CH 2 R), 1.20 (24H, broad m, bulk CH 2 ), 0.74 (12H, broad t , Methyl).

Weitere Oxonole wurden mit dem gleichen Verfahren unter Verwendung des geeigneten Thioharnstoffs hergestellt, der aus dem erforderlichen primären Amin und Kohlenstoffdisulfid synthetisiert wurde [N. Bortnick, L. S. Luskin, M. D. Hurwitz und A. W. Rytina, 1956, t-Carbinamines, RR'R''CNH2, III.. The preparation of isocyanates, isothiocyanates and related compounds, J. Am. Chem. Soc. 78, 4358–4361]. Eine beispielhafte Synthese von DiSBA-C6-(3) ist in 13 abgebildet.Additional oxonols were prepared by the same procedure using the appropriate thiourea synthesized from the requisite primary amine and carbon disulfide [N. Bortnick, LS Luskin, MD Hurwitz and AW Rytina, 1956, t-carbinamines, RR'R''CNH 2 , III. The preparation of isocyanates, isothiocyanates and related compounds, J. Am. Chem. Soc. 78, 4358-4361]. An exemplary synthesis of DiSBA-C 6 - (3) is in 13 displayed.

BEISPIEL II – SYNTHESE VON FLUORESZIERENDEN PHOSPHOLIPIDENEXAMPLE II - SYNTHESIS OF FLUORESCENT PHOSPHOLIPIDES

Cou-PE: 3-Amidoglycin-6-chlor-7-butyryloxycumarin wurde nach der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/407,554, eingereicht am 20. März 1995, wie nachstehend angegeben hergestellt. Zur Synthese von 2,4-Dihydroxy-5-chlor-benzaldehyd wurden 21,7 g (0,15 Mol) 4-Chlorresorcin in 150 ml trockenem Diethylether gelöst und unter Rühren mit 27 g feingepulvertem Zink(II)-cyanid und 0,5 g Kaliumchlorid versetzt. Die Suspension wurde im Eisbad gekühlt und anschließend wurde unter heftigem Rühren ein starker Chlorwasserstoff-Gasstrom in die Lösung eingeleitet. Nach etwa 30 Minuten waren die Reaktanten gelöst. Die Zugabe von Chlorwasserstoff wurde solange fortgesetzt, bis die Absorption in der Etherlösung endete (etwa 1 Stunde). Während dieser Zeit bildete sich ein Niederschlag. Die Suspension wurde 1 weitere Stunde im Eisbad gerührt, worauf man den Feststoff absetzen ließ. Die Etherlösung wurde vom Feststoff abdekantiert, der dann mit 100 g Eis behandelt und in einem Wasserbad auf 100°C erhitzt wurde. Nach dem Abkühlen kristallisierte das Produkt in glänzenden Plättchen aus, die abfiltriert und über Kaliumhydroxid getrocknet wurden. Die Ausbeute betrug 15,9 g (0,092 Mol, 61%).
1H-NMR (CDCl3): δ 6,23 ppm (s, 1H, Phenol), δ 6,62 ppm (s, 1H, Phenyl), δ 7,52 ppm (s, 1H, Phenyl), δ 9,69 ppm (s, 1H, Formyl), δ 11,25 ppm (s, 1H, Phenol).Cou-PE: 3-amidoglycine-6-chloro-7-butyryloxycoumarin was prepared according to U.S. Patent Application Serial No. 08 / 407,554, filed March 20, 1995, as noted below. For the synthesis of 2,4-dihydroxy-5-chloro-benzaldehyde, 21.7 g (0.15 mol) of 4-chlororesorcinol were dissolved in 150 ml of dry diethyl ether and stirred with 27 g of finely powdered zinc (II) cyanide and O, 5 g of potassium chloride are added. The suspension was cooled in an ice bath and then a strong hydrogen chloride gas stream was introduced into the solution with vigorous stirring. After about 30 minutes, the reactants were dissolved. The addition of hydrogen chloride was continued until the absorption in the ether solution ended (about 1 hour). During this time a precipitate formed. The suspension was stirred for an additional 1 hour in an ice bath, whereupon the solid was allowed to settle. The ether solution was decanted from the solid, which was then treated with 100 g of ice and heated to 100 ° C in a water bath. After cooling, the product crystallized in shiny platelets, which were filtered off and dried over potassium hydroxide. The yield was 15.9 g (0.092 mol, 61%).
1 H-NMR (CDCl3): δ 6.23 ppm (s, 1H, phenol), δ 6.62ppm (s, 1H, phenyl), δ 7.52ppm (s, 1H, phenyl), δ 9 , 69 ppm (s, 1H, formyl), δ 11.25 ppm (s, 1H, phenol).

Zur Herstellung von 3-Carboxy-6-chlor-7-hydroxycumarin wurden 5,76 g (0,033 Mol) 2,4-Dihydroxy-5-chlorbenzaldehyd und 7,2 g (0,069 Mol) Malonsäure in 5 ml warmem Pyridin gelöst und unter Rühren mit 75 μl Anilin versetzt, worauf man das Reaktionsgemisch 3 Tage bei Raumtemperatur stehenließ. Der gebildete gelbe Feststoff wurde in kleinere Stücke gebrochen und mit 50 ml Ethanol versetzt. Die cremige Suspension wurde durch eine Glasfritte filtriert und der Feststoff wurde 3× mit 1 N Chlorwasserstoffsäure und dann mit Wasser gewaschen. Anschließend wurde der Feststoff mit 100 ml Ethylacetat, 150 ml Ethanol und 10 ml halbkonzentrierter Chlorwasserstoffsäure gerührt. Das Lösungsmittel-Volumen wurde unter vermindertem Druck verringert, der Niederschlag abfiltriert, mit Diethylether gewaschen und über Phosphorpentoxid getrocknet, wobei 4,97 g (0,021 Mol, 63%) Produkt in Form eines weißen Pulvers erhalten wurden.
1H-NMR (dDMSO): δ 6,95 ppm (s, 1H), δ 8,02 ppm (s, 1H), δ 8,67 ppm (s, 1H).For the preparation of 3-carboxy-6-chloro-7-hydroxycoumarin 5.76 g (0.033 mol) of 2,4-dihydroxy-5-chlorobenzaldehyde and 7.2 g (0.069 mol) of malonic acid were dissolved in 5 ml of warm pyridine and under Stirring with 75 ul aniline was added, whereupon the reaction mixture was allowed to stand for 3 days at room temperature. The resulting yellow solid was broken into smaller pieces and 50 ml of ethanol added. The creamy suspension was filtered through a glass frit and the solid was washed 3x with 1N hydrochloric acid and then with water. Subsequently, the solid was stirred with 100 ml of ethyl acetate, 150 ml of ethanol and 10 ml of half-concentrated hydrochloric acid. The solvent volume was reduced under reduced pressure, the precipitate filtered off, washed with diethyl ether and dried over phosphorus pentoxide to give 4.97 g (0.021 mol, 63%) of product as a white powder.
1 H-NMR (dDMSO): δ 6.95 ppm (s, 1H), δ 8.02 ppm (s, 1H), δ 8.67 ppm (s, 1H).

Zur Herstellung von 7-Butyryloxy-3-carboxy-6-chlorcumarin wurden 3,1 g (12,9 mmol) 3-Carboxy-6-chlor-7-hydroxycumarin in 100 ml Dioxan gelöst und 2 Stunden bei Raumtemperatur mit 5 ml Buttersäureanhydrid, 8 ml Pyridin und 20 mg Dimethylaminopyridin behandelt. Die Reaktionslösung wurde unter Rühren in 300 ml Heptan gegossen, worauf sich ein weißer Niederschlag bildete, der durch Filtration abgetrennt und in 150 ml Ethylacetat gelöst wurde. Ungelöstes Material wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat 2× mit 50 ml 1 N Chlorwasserstoffsäure/Salzlösung (1:1) und anschließend mit Salzlösung extrahiert. Die Lösung wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Verdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck ergab 2,63 g (8,47 mmol, 66%) Produkt.
1H-NMR (CDCl3): δ 1,08 ppm (t, 3H, J = 7,4 Hz, Buttersäure-Methyl), δ 1,85 ppm (m, 2H, J1~J2 = 7,4 Hz, Buttersäure-Methylen), δ 2,68 ppm (t, 2H, J = 7,4 Hz, Buttersäure-Methylen), δ 7,37 ppm (s, 1H, Cumarin), δ 7,84 ppm (s, 1H, Cumarin), δ 8,86 ppm (s, 1H, Cumarin).For the preparation of 7-butyryloxy-3-carboxy-6-chlorocoumarin, 3.1 g (12.9 mmol) of 3-carboxy-6-chloro-7-hydroxycoumarin were dissolved in 100 ml of dioxane and 2 hours at room temperature with 5 ml of butyric anhydride , Treated with 8 ml of pyridine and 20 mg of dimethylaminopyridine. The reaction solution was poured into 300 ml of heptane with stirring, whereupon a white precipitate formed, which was separated by filtration and dissolved in 150 ml of ethyl acetate. Undissolved material was removed by filtration, and the filtrate was extracted twice with 50 ml of 1N hydrochloric acid / saline (1: 1) followed by brine. The solution was dried over anhydrous sodium sulfate. Evaporation of the solvent under reduced pressure gave 2.63 g (8.47 mmol, 66%) of product.
1 H-NMR (CDCl 3 ): δ 1.08 ppm (t, 3H, J = 7.4 Hz, butyric acid-methyl), δ 1.85 ppm (m, 2H, J 1 ~ J 2 = 7.4 Hz, butyric acid methylene), δ 2.68 ppm (t, 2H, J = 7.4 Hz, butyric acid methylene), δ 7.37 ppm (s, 1H, coumarin), δ 7.84 ppm (s, 1H, coumarin), δ 8.86 ppm (s, 1H, coumarin).

Zur Herstellung von 7-Butyryloxy-3-benzyloxycarbonylmethylaminocarbonyl-6-chlorcumarin wurden 2,5 g (8,06 mmol) 7-Butyryloxy-3-carboxy-6-chlorcumarin, 2,36 g Hydroxybenzotriazolhydrat (16 mmol) und 1,67 g (8,1 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid in 30 ml Dioxan gelöst. Eine Toluollösung von O-Benzylglycin [hergestellt durch Extraktion von 3,4 g (10 mmol) Benzylglycintosylsalz mit Ethylacetat/Toluol/gesättigte wäßrige Hydrogencarbonatlösung/Wasser (1:1:1:1, 250 ml), Trocknen der organischen Phase mit wasserfreiem Natriumsulfat und Verminderung des Lösungsvolumens auf 5 ml] wurde tropfenweise der Cumarinlösung zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gehalten, worauf der gebildete Niederschlag abfiltriert und gründlich mit Ethylacetat und Aceton gewaschen wurde. Die vereinigten Lösungsmittelfraktionen wurden am Rotationsverdampfer auf 50 ml konzentriert, worauf 1 Volumenteil Toluol zugesetzt und das Volumen weiter auf 30 ml verringert wurde. Das ausgefallene Produkt wurde abfiltriert und in 200 ml Chloroform/Ethanol abs. (1:1) gelöst. Die Lösung wurde am Rotationsverdampfer auf 50 ml konzentriert und das Produkt abfiltriert und unter vermindertem Druck getrocknet, wobei 1,29 g der Titelverbindung erhalten wurden. Eine weitere Verringerung des Lösungsmittelvolumens ergab eine zweite Ausbeute von 0,64 g. Gesamtausbeute: 1,93 g (4,22 mmol, 52%).
1H-NMR (CDCl3): δ 1,08 ppm (t, 3H, J = 7,4 Hz, Buttersäure-Methyl), δ 1,84 ppm (m, 2H, J1~J2 = 7,4 Hz, Buttersäure-Methylen), δ 2,66 ppm (t, 2H, J = 7,4 Hz, Buttersäure-Methylen), δ 4,29 ppm (d, 2H, J = 5,5 Hz, Glycinmethylen), δ 5,24 ppm (s, 2H, Benzyl), δ 7,36 ppm (s, 1H, Cumarin), δ 7,38 ppm (s, 5H, Phenyl), δ 7,77 ppm (s, 1H, Cumarin), δ 8,83 ppm (s, 1H, Cumarin), δ 9,15 ppm (t, 1H, J = 5,5 Hz, Amid).To prepare 7-butyryloxy-3-benzyloxycarbonylmethylaminocarbonyl-6-chlorocoumarin, 2.5 g (8.06 mmol) of 7-butyryloxy-3-carboxy-6-chlorocoumarin, 2.36 g of hydroxybenzotriazole hydrate (16 mmol) and 1.67 Dissolved g (8.1 mmol) dicyclohexylcarbodiimide in 30 ml of dioxane. A toluene solution of O-benzylglycine [prepared by extraction of 3.4 g (10 mmol) of benzylglycine tosyl salt with ethyl acetate / toluene / saturated aqueous solution of hydrogencarbonate / water (1: 1: 1: 1, 250 ml), drying the organic phase with anhydrous sodium sulfate and reducing the solution volume to 5 ml] was added dropwise to the coumarin solution. The reaction mixture was kept at room temperature for 20 hours, after which the formed precipitate was filtered off and washed thoroughly with ethyl acetate and acetone. The combined solvent fractions were concentrated on a rotary evaporator to 50 ml, whereupon 1 volume of toluene was added and the Volume was further reduced to 30 ml. The precipitated product was filtered off and abs in 200 ml of chloroform / ethanol. (1: 1) solved. The solution was concentrated to 50 ml on a rotary evaporator, and the product was filtered off and dried under reduced pressure to give 1.29 g of the title compound. Further reduction in solvent volume gave a second crop of 0.64 g. Total yield: 1.93 g (4.22 mmol, 52%).
1 H-NMR (CDCl 3 ): δ 1.08 ppm (t, 3H, J = 7.4 Hz, butyric acid-methyl), δ 1.84 ppm (m, 2H, J 1 ~ J 2 = 7.4 Hz, butyric acid methylene), δ 2.66 ppm (t, 2H, J = 7.4 Hz, butyric acid methylene), δ 4.29 ppm (d, 2H, J = 5.5 Hz, glycine methylene), δ 5.24 ppm (s, 2H, benzyl), δ 7.36 ppm (s, 1H, coumarin), δ 7.38 ppm (s, 5H, phenyl), δ 7.77 ppm (s, 1H, coumarin) , δ 8.83 ppm (s, 1H, coumarin), δ 9.15 ppm (t, 1H, J = 5.5 Hz, amide).

Zur Herstellung von 7-Butyryloxy-3-carboxymethylaminocarbonyl-6-chlorcumarin wurden 920 mg (2 mmol) 7-Butyryloxy-3-benzyloxycarbonylmethylaminocarbonyl-6-chlorcumarin in 50 ml Dioxan gelöst und mit 100 mg Palladium auf Aktivkohle (10%) und 100 μl Essigsäure versetzt, worauf die Suspension bei Normaldruck unter Wasserstoffatmosphäre heftig gerührt wurde. Nachdem die Aufnahme von Wasserstoff beendet war, wurde die Suspension filtriert. Das Kohlenstoff-enthaltende Produkt wurde fünfmal mit 25 ml siedendem Dioxan extrahiert. Man ließ die vereinigten Dioxanlösungen abkühlen, worauf das Produkt als weißes Pulver ausfiel. Nach dem Einengen der Lösung auf 20 ml konnte weiteres Produkt gewonnen werden. Die verbleibende Dioxanlösung wurde zum Sieden erhitzt und solange mit Heptan versetzt, bis eine Trübung eintrat. Die getrockneten Pulver wogen 245 mg, 389 mg und 58 mg. Insgesamt wurden 692 mg (1,88 mmol, 94%) weißes Produkt erhalten.
1H-NMR (dDMSO): δ 1,02 ppm (t, 3H, J = 7,4 Hz, Buttersäure-Methyl), δ 1,73 ppm (m, 2H, J1~J2 = 7,3 Hz, Buttersäure-Methylen), δ 2,70 ppm (t, 2H, J = 7,2 Hz, Buttersäure-Methylen), δ 4,07 ppm (d, 2H, J = 5,6 Hz, Glycin-Methylen), δ 7,67 ppm (s, 1H, Cumarin), δ 8,35 ppm (s, 1H, Cumarin), δ 8,90 ppm (s, 1H, Cumarin), δ 9,00 ppm (t, 1H, J = 5,6 Hz, Amid).To prepare 7-butyryloxy-3-carboxymethylaminocarbonyl-6-chlorocoumarin, 920 mg (2 mmol) of 7-butyryloxy-3-benzyloxycarbonylmethylaminocarbonyl-6-chlorocoumarin were dissolved in 50 ml of dioxane and treated with 100 mg of palladium on activated carbon (10%) and 100 added to acetic acid, whereupon the suspension was stirred vigorously under atmospheric pressure under a hydrogen atmosphere. After the uptake of hydrogen was complete, the suspension was filtered. The carbon-containing product was extracted five times with 25 ml of boiling dioxane. The combined dioxane solutions were allowed to cool and the product precipitated as a white powder. After concentration of the solution to 20 ml further product could be obtained. The remaining dioxane solution was heated to boiling and treated with heptane until turbidity occurred. The dried powders weighed 245 mg, 389 mg and 58 mg. In total, 692 mg (1.88 mmol, 94%) of white product were obtained.
1 H-NMR (dDMSO): δ 1.02 ppm (t, 3H, J = 7.4 Hz, butyric acid-methyl), δ 1.73 ppm (m, 2H, J 1 ~ J 2 = 7.3 Hz , Butyric acid methylene), δ 2.70 ppm (t, 2H, J = 7.2 Hz, butyric acid methylene), δ 4.07 ppm (d, 2H, J = 5.6 Hz, glycine-methylene), δ 7.67 ppm (s, 1H, coumarin), δ 8.35 ppm (s, 1H, coumarin), δ 8.90 ppm (s, 1H, coumarin), δ 9.00 ppm (t, 1H, J = 5.6 Hz, amide).

6-Chlor-7-(n-butyryloxy)-cumarin-3-carboxamidoessigsäure (26,2 mg, 100 mmol) wurde in 2 ml 1:1 CHCl3/Dioxan gelöst und unter Argon bei 4°C mit Isobutylchlorformiat (14,3 ml, 110 mmol) versetzt und 30 Minuten gerührt. Getrennt davon wurde Dimyristoylphosphatidylethanolamin (DMPE) (20 mg, 31,5 mmol) in 1 ml CHCl3 gelöst und mit 1 Tropfen trockenem Methanol und 6 ml (34,5 mmol) Diisopropylethylamin (DIEA) versetzt. Die Lösung des gemischten Anhydrids wurde dann in die Phospholipidlösung pipettiert. Nach 2 Stunden wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, der Rückstand in 3 ml MeOH gelöst und mit 3 ml 0,25 M NaHCO3 gemischt. Die Lösung färbte sich nahezu sofort gelb und wurde 15 Minuten gerührt. Die Lösung wurde dann 3–5× mit CHCl3 extrahiert, worauf sich eine Emulsion bildete. Die Extrakte wurden vereinigt und konzentriert. Der Rückstand wurde in 1 ml 1:1 MeOH/H2O gelöst und auf einer C18-RP-Säule (1,7 × 7 cm) gereinigt. Bei Elution mit dem gleichen Lösungsmittel passierte eine fluoreszierende Bande die Säule, gefolgt von einer langsameren Bande. Die Lösungsmittelpolarität wurde auf 9:1 MeOH/H2O erniedrigt, worauf die gelbe Hauptbande von der Säule eluiert wurde. Nach dem Konzentrieren und Trocknen wurden 2,5 mg (2,74 mmol) des reinen Produkts gesammelt.
1H-NMR (CD3OD): d 8,72 (s, 1H, Cumarin), 7,81 (s, 1H, Cumarin), 6,84 (s, 1H, Cumarin), 5,25 (cm, 2H), 4,43 (dd, J1 = 12,1 Hz, J2 = 3,2 Hz), 4,22 (d, J = 6,6 Hz, 1H), 4,13 (s, ~4H), 3,7-4,1 (cm, ~11H), 3,47 (cm, ~3H), 3,2-3,3 (~q), 2,31 (cm, ~7H), 1,57 (breites s, ~8H, CH2, benachbart zur Carbonylgruppe), 1,2-1,5 (cm, ~63H, bulk CH2), 0,92 (nicht aufgelöstes t, ~12H, CH3). Elektrospray-MS (neg. Ion) [MeOH/H2O: 95/5] (Peak, rel. Int.) 456,8 (M–2, 20), 524,5 (50), 704,9 (6), 734,7 (100), 913,9 (M–1, 95), dekonvolutierte M = 915,3 amu, berechnet: M = 915,5 amu. UV-Vis (MeOH/HBSS, 2/1) λmax = 414 nm, Fluoreszenz (MeOH/HBSS, 2/1) λemax = 450 nm, Quantenausbeute = 1,0.6-Chloro-7- (n-butyryloxy) -coumarin-3-carboxamidoacetic acid (26.2 mg, 100 mmol) was dissolved in 2 mL of 1: 1 CHCl 3 / dioxane and extracted with isobutyl chloroformate (4) at 4 ° C under argon. 3 ml, 110 mmol) and stirred for 30 minutes. Separately, dimyristoylphosphatidylethanolamine (DMPE) (20 mg, 31.5 mmol) was dissolved in 1 mL of CHCl 3 and treated with 1 drop of dry methanol and 6 mL (34.5 mmol) of diisopropylethylamine (DIEA). The mixed anhydride solution was then pipetted into the phospholipid solution. After 2 hours the solvent was removed under reduced pressure, the residue dissolved in 3 ml of MeOH and mixed with 3 ml of 0.25 M NaHCO 3 . The solution turned yellow almost immediately and was stirred for 15 minutes. The solution was then extracted 3-5x with CHCl 3 whereupon an emulsion formed. The extracts were combined and concentrated. The residue was dissolved in 1 ml of 1: 1 MeOH / H 2 O and purified on a C 18 RP column (1.7 x 7 cm). When eluted with the same solvent, a fluorescent band passed the column, followed by a slower band. The solvent polarity was lowered to 9: 1 MeOH / H 2 O and the yellow major band was eluted from the column. After concentrating and drying, 2.5 mg (2.74 mmol) of the pure product was collected.
1 H-NMR (CD 3 OD): d 8.72 (s, 1H, coumarin), 7.81 (s, 1H, coumarin), 6.84 (s, 1H, coumarin), 5.25 (cm, 2H), 4.43 (dd, J 1 = 12.1 Hz, J 2 = 3.2 Hz), 4.22 (d, J = 6.6 Hz, 1H), 4.13 (s, ~ 4H ), 3.7-4.1 (cm, ~ 11H), 3.47 (cm, ~ 3H), 3.2-3.3 (~ q), 2.31 (cm, ~ 7H), 1, 57 (broad s, ~ 8H, CH 2 , adjacent to the carbonyl group), 1.2-1.5 (cm, ~ 63H, bulk CH 2 ), 0.92 (unresolved t, ~ 12H, CH 3 ). Electrospray MS (Neg. Ion) [MeOH / H 2 O: 95/5] (Peak, Rel. Int.) 456.8 (M -2 , 20), 524.5 (50), 704.9 (6 ), 734.7 (100), 913.9 (M -1 , 95), deconvoluted M = 915.3 amu, calculated: M = 915.5 amu. UV-Vis (MeOH / HBSS, 2/1) λ max = 414 nm, fluorescence (MeOH / HBSS, 2/1) λ emax = 450 nm, quantum yield = 1.0.

Cy5-PE: DMPE (1,0 mg, 1,6 mmol) wurde in 650 ml (12:1) CHCl3/MeOH gelöst und mit DIEA (1 ml, 5,7 mmol) versetzt. Getrennt davon wurde Cy5-OSu (Amersham, Arlington Heights, IL), der N-Hydroxysuccinimidester von N-Ethyl-N'-(5-carboxypentyl)-5,5'-disulfoindodicarbocyanin (0,8 mg, 1 mmol) in 150 ml (2:1) CHCl3/MeOH gelöst und der Phospholipidlösung zugesetzt. Nach 3 Stunden wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in MeOH gelöst und auf eine C18-RP-Säule (1 × 10 cm), die mit 1:1 MeOH/H2O equilibriert war, aufgegeben. Bei Elution mit dem gleichen Lösungsmittel wurde der hydrolysierte Ester entfernt. Die Polarität wurde auf 9:1 MeOH/H2O verringert und das reine blaue Produkt wurde von der Säule eluiert, wobei 400 mg (310 μmol, 31%) erhalten wurden.Cy5-PE: DMPE (1.0 mg, 1.6 mmol) was dissolved in 650 mL (12: 1) CHCl 3 / MeOH and treated with DIEA (1 mL, 5.7 mmol). Separately, Cy5-OSu (Amersham, Arlington Heights, IL), the N-hydroxysuccinimide ester of N-ethyl-N '- (5-carboxypentyl) -5,5'-disulfoindodicarbocyanine (0.8 mg, 1 mmol) in 150 ml (2: 1) CHCl 3 / MeOH and added to the phospholipid solution. After 3 hours, the solvent was removed under reduced pressure. The residue was dissolved in MeOH and applied to a C18 RP column (1 x 10 cm) with 1: 1 equilibrated MeOH / H 2 O, abandoned. Elution with the same solvent removed the hydrolyzed ester. The polarity was reduced to 9: 1 MeOH / H 2 O and the pure blue product was eluted from the column to give 400 mg (310 μmol, 31%).

BEISPIEL III – SYNTHESE EINES LINKERS FÜR DONOREN UND AKZEPTORENEXAMPLE III - SYNTHESIS OF A LINKER FOR DONORS AND ACCEPTORS

Dieses Beispiel bezieht sich auf die 14–16. 12-p-Methoxybenzylthio-1-dodecanol (1): Na (800 mg, 34,8 mmol) wurde in 30 ml trockenem Methanol gelöst und die Lösung wurde unter Argon mit p-Methoxybenzylmercaptan (2,75 ml, 3,04 g, 19,7 mmol) versetzt. Nach wenigen Minuten wurde dem Reaktionsgemisch 12-Bromdodecanol (2,5 g, 9,43 mmol) tropfenweise zugesetzt. Innerhalb 5 Minuten bildete sich ein Niederschlag. Nach wenigstens 3 Stunden wurde das Reaktionsgemisch filtriert und dreimal mit kaltem Methanol gewaschen, wobei nach dem Trocknen 2,874 g (8,49 mmol, 90%) reines Produkt erhalten wurden.
1H-NMR (CDCl3): d 7,23 (d, J = 8,8 Hz, 2H, AA' des aromatischen AA' BB' Systems), 6,85 (d, J = 8,8 Hz, 2H, BB' des aromatischen AA' BB' Systems), 3,80 (s, 3H, Methoxy), 3,66 (s, 2H, Benzyl), 3,64 (dt, J1 = 6,6 Hz, J2 = 5,5 Hz, 2H, RCH2OH), 2,40 (t, J = 7,3 Hz, 2H, RSCH2R), 1,50-1,65 (cm, 4H, CH2 an Heteroatomen), 1,2-1,4 (cm, 16H, bulk Methylengruppen).This example refers to the 14 - 16 , 12-p-methoxybenzylthio-1-dodecanol (1): Na (800 mg, 34.8 mmol) was dissolved in 30 mL of dry methanol and the solution was purified under argon with p-methoxybenzylmercaptan (2.75 mL, 3.04 g , 19.7 mmol). After a few minutes, the reaction mixture 12-bromododecanol (2.5 g, 9.43 mmol) was added dropwise. Within 5 minutes, a precipitate formed. After at least 3 hours, the reaction mixture was filtered and washed three times with cold methanol to give, after drying, 2.874 g (8.49 mmol, 90%) of pure product.
1 H-NMR (CDCl3): d 7.23 (d, J = 8.8 Hz, 2H, AA 'of the aromatic AA' BB 'system), 6.85 (d, J = 8.8 Hz, 2H , BB 'of the aromatic AA' BB 'system), 3.80 (s, 3H, methoxy), 3.66 (s, 2H, benzyl), 3.64 (dt, J 1 = 6.6 Hz, J 2 = 5.5 Hz, 2H, RCH 2 OH), 2.40 (t, J = 7.3 Hz, 2H, RSCH 2 R), 1.50-1.65 (cm, 4H, CH 2 on heteroatoms) , 1.2-1.4 (cm, 16H, bulk methylene groups).

12-p-Methoxybenzylthio-1-bromdodecan (2): (1) (500 mg, 1,48 mmol) wurde mit Kohlenstofftetrabromid (611 mg, 1,85 mmol) in 2,5 ml CH2Cl2 gemischt und in einem Eisbad gekühlt, bis sich ein Niederschlag bildete. Nach dem Entfernen des Eisbads wurde das Reaktionsgemisch mit Triphenylphosphin (348 mg, 2,22 mmol) versetzt, worauf sich die Lösung sofort gelblich färbte. Laut DC (EtOAc/Hexan, 1:1) war das Ausgangsmaterial nach 30 Minuten verbraucht. Das Lösungsmittel wurde entfernt und der feste Rückstand mit 50 ml Hexan versetzt. Nach Rühren über Nacht wurde die Lösung filtriert und nach Konzentrierung wurde ein Feststoff erhalten, der mit etwa 10–15 ml Hexan gemischt und erneut filtriert wurde. Nach dem Trocknen ergab das konzentrierte Filtrat 537 mg (1,34 mmol, 91%) reines Produkt.
1H-NMR (CDCl3): d 7,23 (d, J = 8,6 Hz, 2H, AA' des aromatischen AA' BB' Systems), 6,85 (d, J = 8,7 Hz, 2H, BB' des aromatischen AA' BB' Systems), 3,80 (s, 3H, Methoxy), 3,67 (s, 2H, Benzyl), 3,41 (t, J = 6,9 Hz, 2H, RCH2Br), 2,40 (t, J = 7,3 Hz, 2H, RSCH2R), 1,86 (cm, 2H, CH2 an Br), 1,15-1,45 (cm, 18H, bulk Methylengruppen).12-p-methoxybenzylthio-1-bromododecane (2): (1) (500 mg, 1.48 mmol) was mixed with carbon tetrabromide (611 mg, 1.85 mmol) in 2.5 mL of CH 2 Cl 2 and concentrated in a Cooled ice bath until a precipitate formed. After removal of the ice bath, triphenylphosphine (348 mg, 2.22 mmol) was added to the reaction mixture, whereupon the solution immediately turned yellowish. According to TLC (EtOAc / hexane, 1: 1) the starting material was consumed after 30 minutes. The solvent was removed and the solid residue was added with 50 ml of hexane. After stirring overnight, the solution was filtered and, upon concentration, a solid was obtained which was mixed with about 10-15 ml of hexane and refiltered. After drying, the concentrated filtrate gave 537 mg (1.34 mmol, 91%) of pure product.
1 H-NMR (CDCl3): d 7.23 (d, J = 8.6 Hz, 2H, AA 'of the aromatic AA' BB 'system), 6.85 (d, J = 8.7 Hz, 2H , BB 'of the aromatic AA' BB 'system), 3.80 (s, 3H, methoxy), 3.67 (s, 2H, benzyl), 3.41 (t, J = 6.9 Hz, 2H, RCH 2 Br), 2.40 (t, J = 7.3 Hz, 2H, RSCH 2 R), 1.86 (cm, 2H, CH 2 to Br), 1.15 to 1.45 (cm, 18H, bulk methylene groups).

12-(12-p-Methoxybenzylthio-1-dodecylthio)-dodecansäure (3): Eine Lösung von Natrium (116 mg, 5 mmol) in trockenem MeOH wurde mit 12-Mercapto-1-dodecansäure (340 mg, 1,46 mmol) – hergestellt gemäß JACS 115, 3458–3474, 1993 – versetzt. Nach fünfminütigem Rühren unter schwachem Erwärmen wurde (2) (497 mg, 1,24 mmol) dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde sehr viskos und es wurden weitere 1,75 ml MeOH zugesetzt, worauf man das Reaktionsgemisch über Nacht stehenließ. Die Umsetzung wurde mit 10%iger Essigsäure abgebrochen. Das pastenartige Reaktionsgemisch wurde in einen 500 ml Scheidetrichter überführt und in gleichen Volumina von EtOAc/Hexan (1:1) und der Essigsäurelösung gelöst. Die organische Schicht wurde abgetrennt und die wäßrige Schicht anschließend zwei weitere Male extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden konzentriert, wobei 740,3 mg (1,34 mmol) Rohprodukt erhalten wurden. Die überschüssige Essigsäure wurde als Toluolazeotrop entfernt. Der Feststoff wurde aus Isopropylether kristallisiert, wobei 483 mg (71%) erhalten wurden. DC und NMR zeigten eine Verunreinigung, die wahrscheinlich ein Disulfid-Nebenprodukt ist. Das Material wurde durch Flash-Chromatographie (CHCl3/MeOH/AA (99:0,5:0,5)) weiter gereinigt, wobei 334 mg (0,604 mmol, 49%) reines Produkt erhalten wurden.
1H-NMR (CDCl3): d 9,45 (breites s, 1H, COOH), 7,23 (d, J = 8,8 Hz, 2H, AA' des aromatischen AA' BB'-Systems), 6,85 (d, J = 8,7 Hz, 2H, BB' des aromatischen AA' BB'-Systems), 3,80 (s, 3H, Methoxy), 3,66 (s, 2H, Benzyl), 2,50 (t, J = 7,3 Hz, 4H, RCH2SCH2R), 2,40 (t, J = 7,3 Hz, 2H, RSCH2R), 2,35 (t, J = 7,5 Hz, 2H, RCH2COOH), 1,5-1,7 (cm, 8H, CH2 an Heteroatomen), 1,15-1,45 (cm, 30H, bulk Methylengruppen).
13C-NMR (CDCl3): d 179,5 (COOH), 129,9 (aromatisch, 2C), 113,9 (aromatisch, 2C), 55,2 (MeOR), 35,6 (CH2), 33,7 (CH2), 32,2 (CH2), 31,3 (CH2), 29,7 (CH2), 29,4 (CH2), 29,2 (CH2), 28,9 (CH2), 24,6 (CH2).12- (12-p-methoxybenzylthio-1-dodecylthio) -dodecanoic acid (3): A solution of sodium (116 mg, 5 mmol) in dry MeOH was treated with 12-mercapto-1-dodecanoic acid (340 mg, 1.46 mmol ) - prepared according to JACS 115, 3458-3474, 1993 - added. After stirring for five minutes with gentle warming, (2) (497 mg, 1.24 mmol) was added to the reaction mixture. The reaction mixture became very viscous and an additional 1.75 ml of MeOH was added followed by allowing the reaction mixture to stand overnight. The reaction was stopped with 10% acetic acid. The paste-like reaction mixture was transferred to a 500 ml separatory funnel and dissolved in equal volumes of EtOAc / hexane (1: 1) and the acetic acid solution. The organic layer was separated and the aqueous layer was then extracted two more times. The combined extracts were concentrated to give 740.3 mg (1.34 mmol) of crude product. The excess acetic acid was removed as a toluene zeolite. The solid was crystallized from isopropyl ether to give 483 mg (71%). TLC and NMR showed an impurity likely to be a disulfide by-product. The material was further purified by flash chromatography (CHCl 3 / MeOH / AA (99: 0.5: 0.5)) to give 334 mg (0.604 mmol, 49%) of pure product.
1 H-NMR (CDCl3): d 9.45 (broad s, 1H, COOH), 7.23 (d, J = 8.8 Hz, 2H, AA 'of the aromatic AA' BB 'system), 6 , 85 (d, J = 8.7 Hz, 2H, BB 'of the aromatic AA' BB 'system), 3.80 (s, 3H, methoxy), 3.66 (s, 2H, benzyl), 2, 50 (t, J = 7.3 Hz, 4H, RCH 2 SCH 2 R), 2.40 (t, J = 7.3 Hz, 2H, RSCH 2 R), 2.35 (t, J = 7, 5 Hz, 2H, RCH 2 COOH), 1.5-1.7 (cm, 8H, CH 2 on heteroatoms), 1.15-1.45 (cm, 30H, bulk methylene groups).
13 C-NMR (CDCl 3 ): d 179.5 (COOH), 129.9 (aromatic, 2C), 113.9 (aromatic, 2C), 55.2 (MeOR), 35.6 (CH 2 ), 33.7 (CH 2 ), 32.2 (CH 2 ), 31.3 (CH 2 ), 29.7 (CH 2 ), 29.4 (CH 2 ), 29.2 (CH 2 ), 28, 9 (CH 2 ), 24.6 (CH 2 ).

1-Butyl-3-(12-(12-pentylthio-1-dodecylthio)-dodecansäure)-thiobarbiturat (13): (3) (73,8 mg, 133,5 μmol) wurde bei 70°C 2,5 Stunden in 2 ml trockenem TFA/Anisol (14:1) entschützt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand in 10 ml trockenem EtOH gelöst. Natriumborhydrid (330 mg) wurde zugesetzt und das Gemisch über Nacht gerührt. Die Lösung wurde dann mit konzentrierter HCl angesäuert, bis die Gasentwicklung endete. Die Lösung wurde dann viermal mit Ether extrahiert und die vereinigten Extrakte wurden konzentriert, wobei ein weißer Feststoff zurückblieb. Der Feststoff wurde anschließend gelöst und zweimal mit entgastem MeOH konzentriert. Nach dem Trocknen unter Hochvakuum wurden 69,5 mg Feststoff erhalten. Eine Abschätzung per DC ergab, daß dieser Feststoff aus gleichen Teilen entschütztem Produkt und Di-p-methoxyphenylmethan (104 μmol, 78%) bestand. Der entschützte Linker wurde unter Erhitzen in 0,5 ml trockenem DMF gelöst und die Lösung wurde mit NaH (~550 μmol) versetzt, wobei eine geringe Gasentwicklung auftrat. (8) (38,5 mg, ~100 μmol) wurden dann dem Reaktionsgemisch in 100 μl DMF zugesetzt, und man ließ das Reaktionsgemisch über Nacht bei 60°C stehen. Ein DC in EtOAc/MeOH/AA (90:8:2) zeigte, daß sich eine neue, weniger polare Barbitursäure gebildet hatte. Das Lösungsmittel wurde entfernt und der Rückstand in EtOAc/Hexan (1:1) gelöst und mit Wasser gewaschen. Das Material wurde dann mittels Chromatographie (EtOAc/MeOH/AA (90:8:2) gereinigt. Ein NMR des Produkts zeigte Signale der Barbitursäure und des Linkers. Elektrospray-MS (neg. Ion) [MeOH/H2O: 95/5] (Peak, rel. Int.) 516,4 (95), 699,4 (M–1, 100), 715,1 (M–1 + 16, 40), 1024,0 (M–1 + 32, 25), berechnet: M–1 = 700,1 amu. Die Etherlinker wurden anscheinend teilweise zu Sulfoxiden oxidiert.1-Butyl-3- (12- (12-pentylthio-1-dodecylthio) -dodecanoic acid) -thiobarbiturate (13): (3) (73.8 mg, 133.5 μmol) was heated at 70 ° C for 2.5 hours deprotected in 2 ml of dry TFA / anisole (14: 1). The solvent was removed under reduced pressure and the residue was dissolved in 10 ml of dry EtOH. Sodium borohydride (330 mg) was added and the mixture was stirred overnight. The solution was then acidified with concentrated HCl until gas evolution ceased. The solution was then extracted four times with ether and the combined extracts were concentrated leaving a white solid. The solid was then dissolved and concentrated twice with degassed MeOH. After drying under high vacuum, 69.5 mg of solid were obtained. A DC estimate indicated that this solid consisted of equal parts of deprotected product and di-p-methoxyphenylmethane (104 μmol, 78%). The deprotected linker was dissolved with heating in 0.5 ml of dry DMF and the solution was treated with NaH (~ 550 μmol) with little evolution of gas. (8) (38.5 mg, ~ 100 μmol) were then added to the reaction mixture in 100 μl of DMF and the reaction was allowed to stand overnight at 60 ° C. A TLC in EtOAc / MeOH / AA (90: 8: 2) showed that a new, less polar barbituric acid had formed. The solvent was removed and the residue was dissolved in EtOAc / hexane (1: 1) and washed with water. The material was then purified by chromatography (EtOAc / MeOH / AA (90: 8: 2). NMR of the product showed signals of the barbituric acid and the linker.) Electrospray MS (Neg. Ion) [MeOH / H 2 O: 95 / 5] (peak, rel. Int.) 516.4 (95), 699.4 (M -1 , 100), 715.1 (M -1 + 16, 40), 1024.0 (M -1 + 32 , 25), calculated: M -1 = 700.1 amu The ether linkers were apparently partially oxidized to sulfoxides.

1-(1,3-Dibutylthiobarbiturat)-3-(1-butyl-3-(12-(12-pentylthio-1-dodecylthio)-dodecansäure)-thiobarbiturat)-trimethinoxonol (14): (3) (73,8 mg, 133,5 mmol) wurde bei 70°C 2,5 Stunden lang in 2 ml trockenem TFA/Anisol (14:1) entschützt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand in 20 ml trockenem EtOH gelöst. Natriumborhydrid (330 mg) wurde zugegeben und das Gemisch über Nacht gerührt. Die Lösung wurde dann mit konzentrierter HCl angesäuert, bis die Gasentwicklung endete. Die Lösung wurde dann viermal mit Ether extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden konzentriert, wobei ein weißer Feststoff erhalten wurde. Der Feststoff wurde dann gelöst und zweimal mit entgastem MeOH konzentriert. Nach dem Trocknen unter Hochvakuum wurden 71,1 mg Feststoff erhalten. Per DC wurde abgeschätzt, daß dieser Feststoff zu gleichen Teilen aus dem entschützten Produkt und Di-p-methoxyphenylmethan (106 μmol, 79%) bestand. Der entschützte Linker wurde unter Erhitzen in 1 ml trockenem DMF gelöst und mit NaH (~350 μmol) versetzt, worauf eine schwache Gasentwicklung auftrat. (12) (35,5 μmol) wurde dann dem Reaktionsgemisch in 200 μl DMF zugesetzt. Die Umsetzung schien nach etwa 1 Stunde nicht mehr weiterzulaufen, so daß 4 mg N. H. (60%) dem Reaktionsgemisch zugesetzt wurden. Die Lösung wurde nun orange anstelle von rot und es bildete sich ein zweites unpolares Oxonol. Man ließ die Umsetzung bei 60°C weitere 18 Stunden laufen. Die Hälfte des Reaktionsgemisches wurde wie nachstehend beschrieben aufgearbeitet. Das Reaktionsgemisch wurde zusammen mit ~12 ml Toluol in einen 30 ml Scheidetrichter überführt, worauf 4 ml einer 10%igen Essigsäurelösung und 3 ml Wasser zugesetzt wurden. Der größte Teil des Oxonols löste sich in der organischen Phase, die dreimal mit Essigsäurelösung/Wasser (1:1) gewaschen wurde. Die organische Phase wurde dann konzentriert und mittels Flash-Chromatographie (2,5 × 18 cm) gereinigt. Die Säule wurde gefüllt und es wurde zunächst mit CHCl3/MeOH/AA (93:5:2) eluiert. Nach Entfernung eines unpolaren Oxonols wurde die Polarität des Lösungsmittels auf CHCl3/MeOH/AA (90:8:2) erhöht, wodurch das Oxonolprodukt von der Säule gewaschen wurde. Nach Konzentrieren der Fraktionen und Trocknen wurden 7,2 mg (7,25 μmol, 20%) reines Produkt erhalten.
1H-NMR (CDCl3/MeOH): d 8,54 (t, J = 13,8 Hz, 1H, mittleres Methin), 7,97 (d, J = 14,2 Hz, 2H, Methine), 4,39 (cm, 8H, NCH2R), 2,46 (t, J = 7,3 Hz, 8H, RCH2SCH2R), 2,2 (t, 2H, RCH2COOH), 1,5-1,8 (bulk Methylengruppen), 1,2-1,4 (bulk Methylengruppen), 0,92 (t, J = 7,2 Hz, 9H, Methylgruppen). Elektrospray-MS (neg. Ion) [MeOH/H2O: 95/5] (Peak, rel. Int.) 683 (50), 977,8 (30), 992,1 (M–1, 100), 1008,1 (M–1 + 16, 40), 1024,0 (M–1 + 32, 10), berechnet: M–1 = 992,5 amu. Die +16- und +32-Peaks lassen eine Oxidation der Thioether zu Sulfoxidgruppen vermuten. (14) wurde auch analog der Synthese von (11) erfolgreich aus (13) unter Verwendung von (10) erhalten. 1- (1,3-dibutylthiobarbiturate) -3- (1-butyl-3- (12- (12-pentylthio-1-dodecylthio) -dodecanoic acid) -thiobarbiturate) -trimethyoxonol (14): (3) (73.8 mg, 133.5 mmol) was deprotected at 70 ° C for 2.5 hours in 2 ml of dry TFA / anisole (14: 1). The solvent was removed under reduced pressure and the residue was dissolved in 20 ml of dry EtOH. Sodium borohydride (330 mg) was added and the mixture was stirred overnight. The solution was then acidified with concentrated HCl until gas evolution ceased. The solution was then extracted four times with ether. The combined extracts were concentrated to give a white solid. The solid was then dissolved and concentrated twice with degassed MeOH. After drying under high vacuum, 71.1 mg of solid were obtained. It was estimated by DC that this solid consisted in equal parts of the deprotected product and di-p-methoxyphenylmethane (106 μmol, 79%). The deprotected linker was dissolved in 1 ml of dry DMF with heating and treated with NaH (~350 μmol), whereupon a slight evolution of gas occurred. (12) (35.5 μmol) was then added to the reaction mixture in 200 μl of DMF. The reaction did not appear to proceed after about 1 hour, so that 4 mg of NH (60%) was added to the reaction mixture. The solution turned orange instead of red and a second nonpolar oxonol formed. The reaction was allowed to proceed at 60 ° C for an additional 18 hours. Half of the reaction mixture was worked up as described below. The reaction mixture was transferred to a 30 ml separatory funnel along with ~12 ml of toluene, whereupon 4 ml of a 10% acetic acid solution and 3 ml of water were added. Most of the oxonol dissolved in the organic phase, which was washed three times with acetic acid solution / water (1: 1). The organic phase was then concentrated and purified by flash chromatography (2.5 x 18 cm). The column was filled and eluted first with CHCl 3 / MeOH / AA (93: 5: 2). After removal of a nonpolar oxonol, the polarity of the solvent was increased to CHCl 3 / MeOH / AA (90: 8: 2), washing the oxonol product off the column. Concentration of the fractions and drying gave 7.2 mg (7.25 μmol, 20%) of pure product.
1 H-NMR (CDCl3 / MeOH): d 8.54 (t, J = 13.8 Hz, 1H, central methine), 7.97 (d, J 14.2 = Hz, 2H, methines), 4 , 39 (cm, 8H, NCH 2 R), 2.46 (t, J = 7.3 Hz, 8H, RCH 2 SCH 2 R), 2.2 (t, 2H, RCH 2 COOH), 1.5 -1.8 (bulk methylene groups), 1.2-1.4 (bulk methylene groups), 0.92 (t, J = 7.2 Hz, 9H, methyl groups). Electrospray MS (Neg. Ion) [MeOH / H 2 O: 95/5] (Peak, Rel. Int.) 683 (50), 977.8 (30), 992.1 (M -1 , 100), 1008.1 (M -1 + 16, 40), 1024.0 (M -1 + 32, 10), calculated: M -1 = 992.5 amu. The + 16 and + 32 peaks suggest oxidation of the thioether to sulfoxide groups. (14) was also obtained analogously to the synthesis of (11) successfully from (13) using (10).

1-(1,3-Dibutylthiobarbiturat)-3-(1-butyl-3-(12-(12-pentylthio-1-dodecylthio)-N-hydroxysuccinimiddodecanoat)-thiobarbiturat)-trimethinoxonol (15): 22,5 μmol (14) wurden mit Disuccinimidylcarbonat (57 mg, 225 μmol) in 0,5 ml CH2Cl2 in Gegenwart von DIEA (39 μl, 225 mmol) umgesetzt. Ein DC (EtOAc/MeOH) (9:1) zeigte nach 1,5 Stunden, daß sich drei neue unpolare Banden gebildet hatten. Das Lösungsmittel wurde entfernt und die zwei unpolaren Oxonolbanden mittels Flash-Chromatographie (EtOAc/MeOH) (95:5)) gereinigt. Elektrospray-MS (neg. Ion) [MeOH/H2O: 95/5] (Peak, rel. Int.) 1089,3 (M–1, 20), 1105,1 (M–1 + 16, 100), 1121,0 (M–1 + 32, 60), berechnet: M–1 = 1089,5 amu.1- (1,3-dibutylthiobarbiturate) -3- (1-butyl-3- (12- (12-pentylthio-1-dodecylthio) -N-hydroxysuccinimidodecanoate) -thiobarbiturate) -trimethyoxonol (15): 22.5 μmol ( 14) were reacted with disuccinimidyl carbonate (57 mg, 225 μmol) in 0.5 ml CH 2 Cl 2 in the presence of DIEA (39 μl, 225 mmol). A TLC (EtOAc / MeOH) (9: 1) showed after 1.5 hours that three new nonpolar bands had formed. The solvent was removed and the two non-polar oxonol bands were purified by flash chromatography (EtOAc / MeOH) (95: 5)). Electrospray MS (Neg. Ion) [MeOH / H 2 O: 95/5] (Peak, Rel. Int.) 1089.3 (M -1 , 20), 1105.1 (M -1 + 16, 100) , 1121.0 (M -1 + 32, 60), calculated: M -1 = 1089.5 amu.

BEISPIEL IV – MESSUNG DES MEMBRANPOTENTIALS MIT OXONOL-FARBSTOFFEN ALS FRET-AKZEPTOREN UND FLUORESZIERENDEN LEKTINEN ALS FRET-DONORENEXAMPLE IV - MEASUREMENT OF THE MEMBRANE POTENTIAL WITH OXONOL DYES AS FRET ACCEPTORS AND FLUORESCENT LEKTINS AS FRET DONORS

FL-WGA wurde von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten. TR-WGA wurde aus WGA und Texas-Rot (Molecular Probes, Eugene, OR) in einem 100 mM Bicin-Puffer bei pH 8,5 hergestellt. Eine 73 μM Lösung von WGA wurde mit einem 6fachen Überschuß Texas-Rot 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt. Das Protein-Konjugat wurde auf einer G25 Sephadex-Säule gereinigt.FL-WGA was obtained from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). TR-WGA was prepared from WGA and Texas Red (Molecular Probes, Eugene, OR) in a 100 mM bicine buffer at pH 8.5. A 73 μM solution of WGA was reacted with a 6-fold excess of Texas Red for 1 hour at room temperature. The protein conjugate was purified on a G25 Sephadex column.

Alle Zellen wurden gezüchtet und behandelt wie L-M(TK–), falls nichts anderes angegeben ist. L-M(TK–)-Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (Gibco, Grand Island, NY) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin (PS) (Gemini, Calabasas, CA) gezüchtet. B104-Zellen wurden 5 Tage vor der Verwendung mit 1 μM Retinsäure differenziert. Die Zellen wurden mindestens 1 Tag vor der Verwendung auf Deckgläsern ausplattiert. Die aneinander haftenden Zellen wurden gewaschen und in 2,5–3,0 ml HBSS mit 1 g/l Glukose und 20 mM HEPES bei pH 7,4 aufbewahrt. Eine frisch hergestellte 75 μM wäßrige Lösung des geeigneten Oxonols wurde vor einem Experiment aus einer DMSO-Vorratslösung hergestellt. Die Zellen wurden durch Mischen von 100 μl der Oxonollösung mit 750 μl des Bades und anschließender Zugabe der verdünnten Lösung zu den Zellen gefärbt. Der Farbstoff wurde 30–40 Minuten bei einer Badkonzentration von 2,3 μM belassen. 1,5 mM β-Cyclodextrin in der Badlösung war für ein Beladen der Zellen mit DiSBA-C6-(3) nötig. Die Butyl- und Ethylderivate waren ausreichend wasserlöslich, um Zellen ohne β-Cyclodextrin-Komplexierung zu beladen. DiSBA-C10-(3) wurde in einer Lösung mit einem pH-Wert von 7,4, die 290 mM Sucrose und 10 mM HEPES, 364 mOsm enthielt, 10 Minuten bei einer Badkonzentration von 10 μM beladen. Das Markieren mit DiSBA-C10-(3) wurde durch Ersetzen des Bades durch HBSS-Lösung abgebrochen. Die Zellen wurden 15 Minuten mit 15 μg/ml FL-WGA gefärbt. Für die B104-Zellen war eine Badkonzentration von 125 μg/ml erforderlich, um eine ausreichende Färbung mit dem Lektin zu erreichen. Die überschüssigen Farbstoffe wurden mit wiederholtem Waschen mit HBSS entfernt. Wenn die überschüssigen Ethyl- oder Butyloxonolderivate im Bad belassen wurden, wurden langsame Ströme und Fluoreszenzänderungen aufgrund einer Umverteilung der Farbstoffe in die Zelle während Depolarisationen mit einer Dauer von mehr als 1 Sekunde beobachtet. Die Herzmyozyten [S. A. Henderson, M. Spencer, A. Sen, C. Kumar, M. A. Q. Siddiqui und K. R. Chien, 1989, Structure organization and expression of the rat cardiac myosin light chain-2 gene, J. Biol. chem. 264, 18142–18146] wurden uns von Prof. Kenneth Chien, UCSD; überlassen. Die Jurkat-Lymphozytensuspensionen wurden in RPMI-Medien mit 5% hitzeinaktiviertem FVBS und 1% PS gezüchtet. 15–20 ml Aliquots der zellulären Suspension wurden dreimal vor und nach der Farbstoffbehandlung durch vierminütige Zentrifugation bei 100 g und nachfolgenden Zugaben von frischem HBSS gewaschen.All cells were grown and treated as LM (TK - ) unless otherwise stated. LM (TK - ) cells were grown in Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco, Grand Island, NY) with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin-streptomycin (PS) (Gemini, Calabasas, CA). B104 cells were differentiated 5 days prior to use with 1 μM retinoic acid. The cells were plated on coverslips at least 1 day before use. The adherent cells were washed and stored in 2.5-3.0 ml of HBSS with 1 g / L glucose and 20 mM HEPES at pH 7.4. A freshly prepared 75 μM aqueous solution of the appropriate oxonol was prepared prior to an experiment from a stock DMSO solution. The cells were stained by mixing 100 μl of the oxonol solution with 750 μl of the bath and then adding the diluted solution to the cells. The dye was left at a bath concentration of 2.3 μM for 30-40 minutes. 1.5 mM β-cyclodextrin in the bath solution was required for loading the cells with DiSBA-C 6 - (3). The butyl and ethyl derivatives were sufficiently water-soluble to load cells without β-cyclodextrin complexation. DiSBA-C 10 - (3) was loaded in a pH 7.4 solution containing 290 mM sucrose and 10 mM HEPES, 364 mOsm for 10 minutes at a bath concentration of 10 μM. Marking with DiSBA-C 10 - (3) was quenched by replacing the bath with HBSS solution. The cells were stained for 15 minutes with 15 μg / ml FL-WGA. For the B104 cells, a bath concentration of 125 μg / ml was required to achieve sufficient staining with the lectin. The excess dyes were removed with repeated washing with HBSS. When the excess ethyl or butyloxonol derivatives were left in the bath, slow currents and fluorescence changes due to redistribution of the dyes into the cell were observed during depolarizations lasting more than 1 second. The cardiac myocytes [SA Henderson, M. Spencer, A. Sen, C. Kumar, MAQ Siddiqui and KR Chien, 1989, Structure organization and expression of the rat cardiac myosin light chain-2 gene, J. Biol. Chem. 264, 18142-18146] were submitted to us by Prof. Kenneth Chien, UCSD; left. The Jurkat lymphocyte suspensions were grown in RPMI media with 5% heat-inactivated FVBS and 1% PS. 15-20 ml aliquots of the cellular suspension were washed three times before and after the dyeing treatment by centrifuging for four minutes at 100 g and subsequent additions of fresh HBSS.

Die fluoreszierend markierten Zellen wurden mit Licht einer 75 Watt Xenon-Lampe, das durch 450–490 nm Anregungs-Interferenzfilter geschickt wurde, angeregt. Das Licht wurde mittels eines 505 nm dichroitischen Spiegels auf die Probe reflektiert. Das emittierte Licht wurde mit einer 63 X Zeiss-Linse (1,25 oder 1,4 numerische Apertur) gesammelt, durch einen 505 nm Langwellen-Durchlaßfilter geschickt und auf einen G-1B 550 nm dichroitischen Spiegel (Omega, Brattleboro, VT) gerichtet. Das von diesem zweiten dichroitischen Spiegel reflektierte Licht wurde durch einen 515 DF35-Durchlaßbereichfilter geschickt und stellte das FL-WGA-Signal dar. Das übertragene Licht wurde durch einen 560 oder 570 LP-Filter geschickt und umfaßte das Oxonol-Signal. Für Experimente, bei denen Oxonol als Donor für TR-WGA verwendet wurde, wurde der 550 nm dichroitische Spiegel zur Anregung und ein 580 nm dichroitischer Spiegel zur Aufspaltung der Emission verwendet. Die langwellige Texas-Rot-Fluoreszenz wurde durch einen 605 nm DF55-Durchlaßbereichfilter geschickt. Die spannungsabhängigen Fluoreszenzänderungen in einzelnen Zellen wurden unter Verwendung eines Nikon Mikroskops, das mit einem Photoscan II-Photometer verbunden war, gemessen, wobei das Photometer mit zwei R928-PMTs für Doppelemissionsaufnahmen ausgestattet war. Auf alle optischen Daten wurde eine 7-Punkt Savitsky-Golay-Glättungsroutine angewandt [A. Savitsky und M. J. E. Golay, 1964, Smoothing and differentiation of data by simplified least squares procedure, Anal. Chem. 36, 1627–1639], falls nichts anderes angegeben ist. Die 1–2 kHz Einzelwellenlängendaten wurden mit einem Axobasic-Programm aufgenommen, und zwar unter Verwendung der TTL-Pulszählroutine LEVOKE. Konfokalbilder wurden unter Verwendung eines selbstgebauten Hochgeschwindigkeits-Konfokalmikroskops aufgenommen [R. Y. Tsien und B. J. Bacskai, 1994, Video-rate confocal microscopy, in: Handbook of Biological Confocal Microscopy, J. B. Pawley, Hrsg., Plenum Press, New York]. Die Zelle wurde bei einem Haltepotential von –70 mV Spannungs-abgegriffen. Nach einer Verzögerung von 200 ms wurde die Zelle einem zweiten 200 ms depolarisierenden Rechteck-Spannungsimpuls auf 50 mV ausgesetzt. Pseudofarbenbilder, die das Verhältnis der FL-WGA/Oxonol-Emissionen zeigten, wurden alle 67 ms aufgenommen und zeigten bei Depolarisation der Zelle auf +50 mV eine Veränderung im Verhältnis, und zwar lokalisiert an der Plasmamembran.The fluorescently labeled cells were excited with light from a 75 watt xenon lamp passed through 450-490 nm excitation interference filters. The light was reflected onto the sample by means of a 505 nm dichroic mirror. The emitted light was collected with a 63X Zeiss lens (1.25 or 1.4 numerical aperture), passed through a 505 nm long-wave pass filter, and directed to a G-1B 550 nm dichroic mirror (Omega, Brattleboro, VT) , The light reflected from this second dichroic mirror was passed through a 515 DF35 pass-band filter and presented the FL-WGA signal. The transmitted light was passed through a 560 or 570 LP filter and included the oxonol signal. For experiments using oxonol as a donor for TR-WGA, the 550 nm dichroic mirror was used for excitation and a 580 nm dichroic mirror was used to split the emission. The long wavelength Texas Red fluorescence was passed through a 605 nm DF55 passband filter. Voltage-dependent fluorescence changes in single cells were measured using a Nikon microscope connected to a Photoscan II photometer, with the photometer equipped with two R928 PMTs for dual emission imaging. A 7-point Savitsky-Golay smoothing routine was applied to all optical data [A. Savitsky and M.J.E. Golay, 1964, Smoothing and differentiation of data by simplified least squares procedure, Anal. Chem. 36, 1627-1639], unless otherwise indicated. The 1-2 kHz single-wavelength data was recorded using an Axobasic program using the TTL pulse count routine LEVOKE. Confocal images were taken using a self-built high-speed confocal microscope [R. Y. Tsien and B.J. Bacskai, 1994, Video Rate Confocal Microscopy, in: Handbook of Biological Confocal Microscopy, J.B. Pawley, eds., Plenum Press, New York]. The cell was voltage tapped at a holding potential of -70 mV. After a delay of 200 ms, the cell was exposed to a second 200 ms depolarizing square-wave voltage pulse at 50 mV. Pseudo-color images showing the ratio of FL-WGA / oxonol emissions were recorded every 67 ms and showed a change in depolarization of the cell to +50 mV localized at the plasma membrane.

Patch-clamp-Aufnahmen wurden unter Verwendung eines mit einer CV-4-Headstage ausgestatteten Axopatch 1-D-Verstärkers von Acon Instruments (Foster City, CA) durchgeführt. Die Daten wurden unter Verwendung der PCLAMP-Software digitalisiert und gespeichert. Die verwendete pH 7,4 Intrazellulärlösung enthielt 125 mM Kaliumglukonat, 1 mM CaCl2·2H2O, 2 mM MgCl2·6H2O, 11 mM EGTA und 10 mM HEPES. Für die B104-Zellen wurden 4 mM ATP und 0,5 mM GTP zugesetzt.Patch clamp recordings were made using a CV-4 headstage equipped Axopatch 1-D amplifier from Acon Instruments (Foster City, CA). The data was digitized and stored using the PCLAMP software. The pH 7.4 containing 125 mM potassium gluconate Intrazellulärlösung used, 1 mM CaCl 2 .2H 2 O, 2 mM MgCl 2 .6H 2 O, 11 mM EGTA and 10 mM HEPES. For the B104 cells, 4 mM ATP and 0.5 mM GTP were added.

Die Quantenausbeute von DiSBA-C6-(3) wurde im Verhältnis zu Rhodamin B in Ethanol (F = 0,97) bestimmt [G. Weber und F. W. K. Teale, 1957, Determination of the absolute quantum yield of fluorescent solutions, Faraday Soc. Trans. 53, 646–655]. R0 wurde gemäß Standardverfahren berechnet [P. Wu und L. Brand, 1994, Resonance energy transfer: methods and applications, Anal. Biochem. 218, 1–13]. Die Spektren von FL-WGA in HBSS und DiSBA-C6-(3) in Octanol wurden zur Bestimmung des Überlappungsintegrals verwendet. Werte von 1,4 und 0,67 wurden für den Brechungsindex bzw. den Orientierungsfaktor verwendet.The quantum yield of DiSBA-C 6 - (3) was determined in relation to rhodamine B in ethanol ( F = 0.97) [G. Weber and FWK Teale, 1957, Determination of the absolute Quantum Yield of Fluorescent Solutions, Faraday Soc. Trans. 53, 646-655]. R 0 was calculated according to standard methods [P. Wu and L. Brand, 1994, Resonance energy transfer: methods and applications, Anal. Biochem. 218, 1-13]. The spectra of FL-WGA in HBSS and DiSBA-C 6 - (3) in octanol were used to determine the overlap integral. Values of 1.4 and 0.67 were used for refractive index and orientation factor, respectively.

Symmetrische Bis-(thiobarbiturat)-oxonole wurden als wahrscheinliche Kandidaten für schnelle translocierende fluoreszierende Ionen auf der Basis der vorstehenden Anordnungskriterien ausgewählt. Das starke Absorptionsmaximum (~200 000 M–1cm–1) bei 540 nm und die gute Quantenausbeute (0,40) in Membranen macht sie geeignet zur Verwendung als Fluoreszenz-Donoren oder -Akzeptoren in Zellen. Die Fluoreszenz-Anregungs- und Emissionsspektren von DiSBA-C6-(3) sind in 2 zusammen mit denen für FL-WGA und TR-WGA gezeigt. Die Anregungsspektren sind die kürzeren eines jeden Paares. Als Lösungsmittel für Oxonol wurde Octanol ausgewählt, um die Membranumgebung nachzuahmen.Symmetrical bis (thiobarbiturate) oxonols have been selected as likely candidates for fast translocating fluorescent ions based on the above ordering criteria. The strong absorption maximum (~ 200,000 M -1 cm -1 ) at 540 nm and the good quantum yield (0.40) in membranes make them suitable for use as fluorescence donors or acceptors in cells. The fluorescence excitation and emission spectra of DiSBA-C 6 - (3) are in 2 shown together with those for FL-WGA and TR-WGA. The excitation spectra are the shorter of each pair. As a solvent for oxonol, octanol was selected to mimic the membrane environment.

Die Translokationsgeschwindigkeiten wurden in L-M(TK–)-Zellen studiert, und zwar unter Verwendung der Gesamtzell-Spannungsabgreifaufnahme (whole cell voltage clamping). Die L-M(TK–)-Zellen wurden ausgewählt, da sie sehr geringe Hintergrundströme aufweisen und sehr einfach im Patch-clamp-Verfahren verendet werden können. Diese Zellen haben ein Ruhepotential von –5 mV und keine offensichtlichen spannungsaktivierten Ströme. Translocation rates were studied in LM (TK - ) cells using whole cell voltage clamping. The LM (TK - ) cells were chosen because they have very low background currents and can be easily used in the patch-clamp process. These cells have a resting potential of -5 mV and no obvious voltage-activated currents.

Verschiebungsströme von DiSBA-C6-(3) bei 20°C sind in 3 abgebildet. Auf die Zelle wurden 12,5 ms lange Spannungsstufen bei Inkrementen von 15 mV, ausgehend von einem Haltepotential von –70 mV angewandt. Die größeren und schnelleren Übergänge aufgrund eines einfachen Membran-Kapazitätsübergangs konnten auf ein Mindestmaß beschränkt werden, und zwar unter Verwendung der Kapazitäts- und Reihenwiderstands-Kompensationsfähigkeit des Axopatch-Verstärkers, so daß die Verschiebungsströme eindeutig beobachtet werden konnten. Die Ströme entstehen aufgrund einer Umverteilung des Membran-gebundenen Oxonols als Antwort auf 8 Depolarisationen. Die Zeitkonstante für den Verschiebungsstrom beträgt 2 ms für eine Depolarisation von 120 mV. Äquivalente Ladungsmengen bewegen sich am Anfang und am Ende der Spannungsstufe, jedoch in entgegengesetzte Richtung, was mit der Umverteilung von gespeicherten Ionen von einem Energieminimum zum anderen über die Plasmamembran konsistent ist. Darüber hinaus kann die durch die Oxonolbewegung induzierte Kapazität dq/dV zu ~5 pF für eine 100 mV Depolarisation berechnet werden. Dieser Wert entspricht etwa einem Drittel der Membrankapazität ohne den Farbstoff. Interessanterweise sind Natriumkanal-Torladungen auch für etwa 33% der Gesamtkapazität von Squid Axons für kleine Depolarisationen verantwortlich [A. Hodgkin, 1975, The optimum density of sodium channels in an unmyelinated nerve, Philos. Trans. R. Soc. Lond. [Biol.] 270, 297–300]. In Abwesenheit des Oxonols wurden vernachlässigbare Ströme beobachtet. DiSBA-C10-(3) ergab Verschiebungsströme mit etwa der gleichen Geschwindigkeit, wohingegen Analoga mit R=Butyl und Ethyl viel langsamere Ströme ergaben. Die Butylverbindung hatte eine Zeitkonstante von ~18 ms und die Ströme der Ethylverbindung waren sehr klein, langsam und schwer zu beobachten.Displacement currents of DiSBA-C 6 - (3) at 20 ° C are in 3 displayed. 12.5 ms voltage steps were applied to the cell at increments of 15 mV, starting from a holding potential of -70 mV. The larger and faster transitions due to a simple membrane capacitance transition could be minimized using the capacitance and series resistance compensation capability of the Axopatch amplifier so that the displacement currents could be clearly observed. The currents are due to redistribution of the membrane-bound oxonol in response to 8 depolarizations. The time constant for the displacement current is 2 ms for a depolarization of 120 mV. Equivalent charge levels move at the beginning and end of the voltage step, but in opposite directions, consistent with the redistribution of stored ions from one energy minimum to the other across the plasma membrane. In addition, the induced by the oxonol movement capacity dq / dV can be calculated to ~ 5 pF for a 100 mV depolarization. This value corresponds to about one third of the membrane capacity without the dye. Interestingly, sodium channel gate charges are also responsible for about 33% of the total capacity of squid axons for small depolarizations [A. Hodgkin, 1975, The optimum density of sodium channels in an unmyelinated nerve, Philos. Trans. R. Soc. Lond. [Biol.] 270, 297-300]. In the absence of oxonol, negligible currents were observed. DiSBA-C 10 - (3) gave shift currents at about the same rate whereas analogs with R = butyl and ethyl gave much slower flows. The butyl compound had a time constant of ~ 18 ms and the ethyl compound streams were very small, slow and difficult to observe.

4 und 5 zeigen die Spannungsabhängigkeit und die Zeitkonstanten für die Ladungstranslokation in einer mit etwa viermal soviel Oxonol beladenen Zelle wie im Experiment von 3. In 4 stellen die Kreise die Daten der Einschaltantwort und die Quadrate die der Flankenströme dar. Die Rohdaten wurden an eine einfach exponentielle Kurve angepaßt und die bewegte Ladung, die der Fläche entspricht, wurde als das Produkt der Stromamplitude und der Zeitkonstante berechnet. Die experimentellen Daten stimmen vernünftig mit bestehenden Modellen des Transports hydrophober Ionen zwischen zwei Energieminima in der Nähe der wäßrigen Grenzflächen der Lipid-Doppelschicht überein [B. Ketterer, B. Neumcke und P. Länger, 1971, Transport mechanism of hydrophobic ions through lipid bilayer membranes, J. Membrane Biol. 5, 225–245; O. S. Andersen und M. Fuchs, 1975, Potential energy barriers to ion transport within lipid bilayer, Biophys. J. 15, 795–830; R. Benz, P. Läuger und K. Janko, 1976, Transport kinetics of hydrophobic ions in lipid bilayer membranes, Biochim. Biophys. Acta 455, 701–720]. Diese Modelle sagen voraus, daß die Gleichgewichtsladungsverteilung q(V) und die Translokationszeitkonstante (V) vom extern angewandten Membranpotential V auf folgende Weise abhängen sollen:

Figure 00540001
Vh, das Membranpotential, bei dem sich die gleiche Ionenanzahl in jeder Senke der potentiellen Energie befindet, sollte aufgrund der Membranasymmetrie von 0 verschieden sein. β ist der Anteil des extern angewandten Potentials, das effektiv am translocierenden Ion anliegt; q ist die Ladung auf jedem Ion, k und T sind die Boltzmann-Konstante und die absolute Temperatur. qmax bzw. τmax ist die Gesamtladung in jeder Energiesenke bzw. die Zeitkonstante für die Translokation, und zwar beide bei V = Vh. Die glatte Kurve in 4 stellt die Anpassung an Gleichung 1 mit qmax = 4770 ± 140 fC, β = 0,42 ± 0,02 und Vh = –3,8 ± 1,5 mV dar. Gleichermaßen stellt die glatte Kurve in 5 die Anpassung an Gleichung 2 mit τmax = 2,9 ms bei Vh = –5 mV und β = 0,42 dar. 4 and 5 show the voltage dependence and the time constants for the charge translocation in a cell loaded with about four times as much oxonol as in the experiment of 3 , In 4 The circles represent the turn-on response data and the squares the edge currents. The raw data was fitted to a single exponential curve and the moving charge corresponding to the area was calculated as the product of current amplitude and time constant. The experimental data are reasonably consistent with existing models of transport of hydrophobic ions between two energy minima near the aqueous interfaces of the lipid bilayer [B. Ketterer, B. Neumcke and P. Länger, 1971, Transport mechanism of hydrophobic ions through lipid bilayer membranes, J. Membrane Biol. 5, 225-245; OS Andersen and M. Fuchs, 1975, Potential energy barriers to ion transport within lipid bilayer, Biophys. J. 15, 795-830; R. Benz, P. Läuger and K. Janko, 1976, Transport kinetics of hydrophobic ions in lipid bilayer membranes, Biochim. Biophys. Acta 455, 701-720]. These models predict that the equilibrium charge distribution q (V) and the translocation time constant (V) should depend on the externally applied membrane potential V in the following way:
Figure 00540001
V h , the membrane potential with the same number of ions in each potential energy sink should be different from 0 due to membrane asymmetry. β is the proportion of externally applied potential that is effectively present at the translocating ion; q is the charge on each ion, k and T are the Boltzmann constant and the absolute temperature. q max or τ max is the total charge in each energy sink or the time constant for the translocation, both at V = V h . The smooth curve in 4 represents the fit to equation 1 with q max = 4770 ± 140 fC, β = 0.42 ± 0.02 and V h = -3.8 ± 1.5 mV. Similarly, the smooth curve in FIG 5 the adaptation to equation 2 with τ max = 2.9 ms at V h = -5 mV and β = 0.42 represents.

Diese Ergebnisse zeigen, daß das Oxonol einen signifikanten Teil des elektrischen Feldes über die Membran abfühlt, daß es in ~3 ms oder weniger translociert und daß die größte Empfindlichkeit und Linearität der Translokation als Funktion des Membranpotential im physiologisch relevanten Bereich liegt.These results indicate that oxonol senses a significant portion of the electrical field across the membrane, translocates in ~ 3 ms or less, and that the greatest sensitivity and linearity of translocation as a function of membrane potential is in the physiologically relevant range.

Um Ladungsverschiebungen in optische Signale umzuwandeln, werden die Oxonol-Fluoreszenzen an den intrazellulären und extrazellulären Membran-Bindungsstellen unterschiedlich gemacht. Fluoreszenz-Asymmetrie wird durch Einführung der fluoreszierend markierten Lektine, die an die extrazelluläre Membranoberfläche gebunden sind, erzeugt. Die Anregung von FL-WGA führt zu einem Energietransfer auf die in der extrazellulären Membran-Bindungsstelle, wie in 1 gezeigt, befindlichen Oxonole. Der Extinktionskoeffizient und die Fluoreszenz-Quantenausbeute von FL-WGA wurden zu 222 000 M–1cm–1 (~3 Fluorescein/Protein) bzw. 0,23 bestimmt. In mit FL-WGA markierten Jurkat-Zellsuspensionen wurden bis zu 30% der Lektin-Fluoreszenzintensität bei Titration von DiSBA-C4-(3) gequencht. Im besten Fall, wobei das gesamte Quenching auf Energietransfer zurückzuführen ist, beträgt der mittlere Abstand des Lektins zum Membran-gebundenen Oxonol immer noch mehr als 50 Å, dem berechneten Förster-Abstand R0 für das FL-WGA-Oxonolpaar. Die spektrale Überlappung zwischen der FL-WGA-Emission und der DiSBA-C6-(3)-Anregung ist in 2 dargestellt. Da der FRET umgekehrt proportional zur sechsten Potenz des Abstands zwischen den beiden Fluorophoren abfällt, ist der Energietransfer zu Oxonolen in der intrazellulären Membranstelle, die weitere 40 Å entfernt ist, möglicherweise vernachlässigbar. In order to convert charge shifts to optical signals, the oxonol fluorescences at the intracellular and extracellular membrane binding sites are made different. Fluorescence asymmetry is created by introduction of the fluorescently labeled lectins bound to the extracellular membrane surface. The excitation of FL-WGA leads to an energy transfer to those in the extracellular membrane binding site, as in 1 shown, located oxonols. The extinction coefficient and fluorescence quantum yield of FL-WGA were determined to be 222,000 M -1 cm -1 (~ 3 fluorescein / protein) and 0.23, respectively. In FL-WGA labeled Jurkat cell suspensions, up to 30% of the lectin fluorescence intensity was quenched by titration of DiSBA-C 4 - (3). In the best case, with all quenching due to energy transfer, the mean distance of the lectin to the membrane-bound oxonol is still more than 50 Å, the calculated Förster distance R 0 for the FL-WGA oxonol pair. The spectral overlap between the FL-WGA emission and the DiSBA-C 6 - (3) excitation is in 2 shown. Since the FRET falls inversely proportional to the sixth power of the distance between the two fluorophores, the energy transfer to oxonols in the intracellular membrane site, which is further 40 Å away, may be negligible.

Bei Depolarisation verteilen sich die Oxonolmoleküle so um, daß mehr an die intrazelluläre und weniger an die extrazelluläre Stelle gebunden sind. Diese Änderung zeigt sich durch einen Abfall im Energietransfer, was zu einer Erhöhung der Fluoreszenz von FL-WGA und einer begleitenden Verringerung der Oxonol-Emission führt. Die Fluoreszenzsignale in einer spannungsabgegriffenen L-M(TK–)-Zelle, die mit dem DiSBA-C4-(3)/FL-WGA-Paar markiert ist und mit 4 sich erhöhenden Spannungsstufen depolarisiert wird, ist in 6 gezeigt. Die Daten stellen einen Mittelwert aus 99 Durchläufen dar. Die FL-WGA-Emission erhöht sich um 7–8%, die Oxonol-Fluoreszenz verringert sich um 10% und das FL-WGA/Oxonol-Emissionsverhältnis verändert sich um 19% bei einer 120 mV Depolarisation. Die gleichzeitigen Änderungen der Donor- und Akzeptor-Emissionen ist konsistent mit dem in 1 skizzierten FRET-Mechanismus. Die Verringerung der Oxonol-Emission bei Depolarisation ist das Gegenteil von dem, was bei der wenig spannungsempfindlichen Aufnahme von Oxonolen in Zellen beobachtet wurde [Rink et al., 1980, supra]. Die Fluoreszenzänderungen haben Zeitkonstanten von ~18 ms bei 20°C, was mit den DiSBA-C4-(3)-Verschiebungsströmen übereinstimmt. In Abwesenheit von FL-WGA werden keine großen Fluoreszenzänderungen beobachtet. Die Translokationsgeschwindigkeit von DiSBA-C4-(3) erhöht sich bei steigender Temperatur. Die Zeitkonstante fällt auf 7–8 ms bei 29°C ab, was eine Aktivierungsenergie von ~17 kcal/mol entspricht. Eine Temperaturerhöhung erhöht jedoch auch die Aufnahme des Lektins und verringert die Fluoreszenzänderung. Die Oxonole mit R=Ethyl und Butyl erreichen auch interne zelluläre Membranen, obwohl eine aktive Membranaufnahme möglicherweise nicht notwendig ist. Eine zusätzliche Abschwächung der spannungsabhängigen FRET-Signale ergibt sich aus der spektralen Überlappung von Fluorescein und Oxonol, so daß ein Teil des Lichts im Fluorescein-Emissionskanal vom Oxonol stammt und umgekehrt.When depolarized, the oxonol molecules redistribute to bind more to the intracellular and less to the extracellular site. This change is reflected by a decrease in energy transfer, which leads to an increase in fluorescence of FL-WGA and an accompanying reduction in oxonol emission. The fluorescence signals in a voltage-clamped LM (TK - ) cell labeled with the DiSBA-C 4 - (3) / FL-WGA pair and depolarized with 4 increasing voltage steps is in 6 shown. The data represent an average of 99 runs. FL-WGA emission increases by 7-8%, oxonol fluorescence decreases by 10% and FL-WGA / oxonol emission ratio changes by 19% at 120 mV depolarization. The simultaneous changes in donor and acceptor emissions are consistent with those in 1 sketched FRET mechanism. The reduction in oxonol emission upon depolarization is the opposite of what has been observed in the low voltage susceptible uptake of oxonols in cells [Rink et al., 1980, supra]. The fluorescence changes have time constants of ~ 18 ms at 20 ° C, consistent with the DiSBA C 4 (3) shift currents. In the absence of FL-WGA, no large fluorescence changes are observed. The translocation rate of DiSBA-C 4 - (3) increases with increasing temperature. The time constant decreases to 7-8 ms at 29 ° C, which corresponds to an activation energy of ~ 17 kcal / mol. However, a temperature increase also increases the uptake of the lectin and reduces the fluorescence change. The oxonols with R = ethyl and butyl also reach internal cellular membranes, although active membrane uptake may not be necessary. An additional attenuation of the voltage-dependent FRET signals results from the spectral overlap of fluorescein and oxonol, so that part of the light in the fluorescein emission channel originates from the oxonol and vice versa.

Die Verlängerung der Alkylketten der Oxonole verbessert die Antwortzeiten signifikant. Das DiSBA-C6-(3)/FL-WGA-Paar hat eine Zeitkonstante von ~3 ms bei 20°C, während das DiSBA-C10-(3)/FL-WGA-Paar mit einer Zeitkonstante von 2 ms antwortet, wie es in 7 gezeigt ist. Die ausgezogene Kurve ist eine Anpassung an eine einfache Exponentialfunktion mit einer 2 ms Zeitkonstante. Die Daten stellen den Durchschnittswert von 3 L-M(TK–)-Zellen bei 20°C, aufgenommen bei 2 kHz, dar. Aufgrund der Glättung ist die abgebildete Antwort etwas langsamer als der wahre Wert. Die Fluoreszenz-Zeitkonstanten stimmen mit denen der Verschiebungsströme überein, beispielsweise in 3. Die vorteilhafte Wirkung einer Hydrophobie-Erhöhung des Oxonols in Form längerer Alkylketten erreicht ein Plateau. Die Substitution von Hexyl für Butyl am Oxonolkern führt zu einem großen 6fachen Anstieg der Translokationsgeschwindigkeit. Das Einführen von doppelt so vielen Methylengruppen beim Schritt von der Hexyl- zur Decylverbindung führt jedoch zu einem weniger als 2fachen Anstieg. Diese schneller translocierenden Oxonole sind im wesentlichen in Wasser unlöslich und müssen mit geänderten Verfahren in Zellen beladen werden. DiSBA-C6-(3) kann einfach in normalem Medium, das zusätzlich mit 1,5 mM β-Cyclodextrin zur Komplexierung der Alkylketten versetzt ist, beladen werden. Nicht-fluoreszierende DiSBA-C6-(3)-Aggregate in Hanks augewogener Salzlösung (HBSS) werden nach Zugabe von β-Cyclodextrin fluoreszierend. DiSBA-C10-(3) erfordert ein Beladen in einem Medium mit niedrigerer Ionenstärke mit einer durch Saccharose aufrecht erhaltenen Osmolarität. Die Markierung ist nahezu ausschließlich auf die Plasmamembran beschränkt, und zwar vermutlich aufgrund einer Hydrophobie, die nun groß genug ist, um die Desorption von der ersten Membran, auf die der Farbstoff stößt, zu verhindern.The extension of the alkyl chains of the oxonols significantly improves the response times. The DiSBA-C 6 - (3) / FL-WGA pair has a time constant of ~ 3 ms at 20 ° C, while the DiSBA-C 10 - (3) / FL-WGA pair responds with a 2 ms time constant as it is in 7 is shown. The solid curve is an adaptation to a simple exponential function with a 2 ms time constant. The data represent the average of 3 LM (TK -) cells at 20 ° C, recorded at 2 kHz, is a result of smoothing the response shown is slightly slower than the true value.. The fluorescence time constants agree with those of the displacement currents, for example in 3 , The beneficial effect of increasing the hydrophobicity of the oxonol in the form of longer alkyl chains achieves a plateau. The substitution of hexyl for butyl at the oxonol core leads to a large 6-fold increase in the translocation rate. However, the introduction of twice as many methylene groups in the step from the hexyl to the decyl compound leads to a less than 2-fold increase. These faster translocating oxonols are substantially insoluble in water and have to be loaded into cells with altered procedures. DiSBA-C 6 - (3) can be readily loaded in normal medium supplemented with 1.5 mM β-cyclodextrin to complex the alkyl chains. Non-fluorescent DiSBA-C 6 - (3) aggregates in Hanks balanced salt solution (HBSS) become fluorescent upon addition of β-cyclodextrin. DiSBA-C 10 - (3) requires loading in a lower ionic strength medium with osmolarity maintained by sucrose. The label is almost exclusively confined to the plasma membrane, presumably because of a hydrophobicity that is now large enough to prevent desorption from the first membrane that the dye encounters.

BEISPIEL V – MESSUNG VON MEMBRANPOTENTIALEN MIT OXONOL-FARBSTOFFEN ALS FRET-AKZEPTOREN UND FLUORESZIERENDEN LIPIDEN ALS FRET-DONATOREN EXAMPLE V - MEASUREMENT OF MEMBRANE POTENTIALS USING OXONOL DYES AS FRET ACCEPTORS AND FLUORESCENT LIPIDES AS FRET DONATORS

A. TrimethinoxonoleA. trimethine oxonols

Ein 6-Chlor-7-hydroxycumarin, das mittels eines Glycin-Linkers mit Dimyristoylphosphatidylethanolamin (DMPE) gebunden ist, Cou-PE, wurde hergestellt und es wurde entdeckt, daß diese Verbindung als hervorragender spannungsempfindlicher FRET-Donor für Bis-(1,3-dialkyl-2-thiobarbiturat)-trimethinoxonole wirkt. Dieses neue FRET-Paar ergab eine Verhältnisänderung von 80% für eine 100 mV Depolarisation in einer Astrozytomzelle, was das größte in einer Zelle beobachtete spannungsempfindliche optische Signal darstellt, vgl. 17. Die Spannungsempfindlichkeit dieses FRET-Paares ist demzufolge zwei- bis dreimal besser als die von FL-WGA/Trimethinoxonol in einer Vielzahl von Zelltypen. In L-Zellen werden Verhältniswerte zwischen 25–50% gefunden, die mit den in beiden Kanälen gefundenen prozentualen Änderungen übereinstimmen, vgl. 18. In neonatalen Herzmyozyten wurden Fluoreszenz-Verhältnisänderungen von 5–30% für spontan erzeugte Aktionspotentiale beobachtet. Die größten Signale sind nahezu viermal größer als die, die mit FL-WGA/Trimethinoxonol möglich sind. Ein Beispiel einer solchen großen Änderung von einem einzelnen Herzzellen-Cluster ist in 19 gezeigt. Die Vorteile eines Verhältnissignals sind in dieser Figur offensichtlich. Die einzelnen Wellenlängen, in der Figur oben, zeigen eine abfallende Grundlinie, die auf ein Ausbleichen des Fluorophors zurückzuführen ist. Die in der Figur unten gezeigten Verhältnisdaten kompensieren den Intensitätsverlust in beiden Kanälen und führen zu einer flachen Grundlinie. Darüber hinaus führen Bewegungsartefakte zu einer Verbreiterung der einzelnen Wellenlängenantworten. Die Verhältnisdaten verringern diese Artefakte und führen zu einem schärferen Signal, das die tatsächlichen Spannungsänderungen besser darstellt. Die größere Empfindlichkeit für dieses neue FRET-Paar ist am wahrscheinlichsten auf eine Kombination von Faktoren zurückzuführen. Wenn der Donor näher an die Membranoberfläche gebracht wird und der Förster-Transferabstand R0 verringert wird, könnte dies zu einer verstärkten FRET-Unterscheidung zwischen den mobilen Ionen auf gleichen und gegenüberliegenden Seiten der Membran führen. Auch die erhöhte spektrale Trennung erleichtert das Aufnehmen der Donor- und Akzeptoremission und verringert einen Signalverlust aufgrund von Übersprechen.A 6-chloro-7-hydroxycoumarin linked to dimyristoylphosphatidylethanolamine (DMPE) by a glycine linker, Cou-PE, was prepared and it was discovered that this compound was an excellent FRET stress-sensitive donor for bis (1.3 -dialkyl-2-thiobarbiturate) trimethine oxonole acts. This new FRET pair gave a ratio change of 80% for a 100 mV depolarization in an astrocytoma cell, representing the largest voltage-sensitive optical signal observed in a cell, cf. 17 , The voltage sensitivity of this FRET pair is thus two to three times better than that of FL-WGA / trimethine oxonol in a variety of cell types. Ratio values between 25-50% are found in L cells, which agree with the percentage changes found in both channels, cf. 18 , In neonatal cardiac myocytes, fluorescence ratio changes of 5-30% were observed for spontaneously generated action potentials. The largest signals are nearly four times larger than those possible with FL-WGA / trimethine oxonol. An example of such a large change from a single heart cell cluster is in 19 shown. The advantages of a ratio signal are evident in this figure. The individual wavelengths, in the figure above, show a declining baseline due to fading of the fluorophore. The ratio data shown in the figure below compensates for the intensity loss in both channels and results in a flat baseline. In addition, motion artifacts lead to a broadening of the individual wavelength responses. The ratio data reduces these artifacts and results in a sharper signal that better represents the actual voltage changes. The greater sensitivity for this new FRET pair is most likely due to a combination of factors. If the donor is brought closer to the membrane surface and the Förster transfer distance R 0 is reduced, this could lead to an increased FRET distinction between the mobile ions on the same and opposite sides of the membrane. The increased spectral separation also facilitates the uptake of donor and acceptor emission and reduces signal loss due to crosstalk.

B. PentamethinoxonoleB. pentamethine oxonols

Bis-(1,3-dialkyl-2-thiobarbiturat)-pentamethinoxonole wurden durch Kondensieren von 1,3-substituierten Thiobarbitursäuren mit Glutacondialdehyddianil-monohydrochlorid, auch als N-[5-(Phenylamino)-2,4-pentadienyliden]-phenylamin-monohydrochlorid, hergestellt. Die Pentamethinoxonole absorbieren bei 638 nm (e = 225 000 M–1cm–1) und fluoreszieren maximal bei 663 nm in Ethanol. Die Absorption und Emission ist im Vergleich zu den Trimethinoxonolen um 100 nm zu größeren Wellenlängen verschoben. Diese Verschiebung ist mit anderen Polymethin-Farbstoffen konsistent, wie z. B. Cyaninen, bei denen die Einführung von zwei zusätzlichen Methingruppen zu Wellenlängenverschiebungen von 100 nm in den roten Bereich führt.Bis (1,3-dialkyl-2-thiobarbiturate) pentamethine oxonols have been prepared by condensing 1,3-substituted thiobarbituric acids with glutacondialdehyde dianil monohydrochloride, also as N- [5- (phenylamino) -2,4-pentadienylidene] -phenylamine. monohydrochloride. The pentamethine oxonols absorb at 638 nm (e = 225,000 M -1 cm -1 ) and fluoresce maximally at 663 nm in ethanol. The absorption and emission is shifted by 100 nm compared to the Trimethinoxonolen to longer wavelengths. This shift is consistent with other polymethine dyes such. For example, cyanines in which the introduction of two additional methine groups leads to wavelength shifts of 100 nm in the red region.

Die Pentamethine können in kultivierte Zellen auf die gleiche Weise wie das Trimethinoxonol beladen werden. Die Butylverbindung, DiSBA-C4-(5), kann in Hanks ausgewogener Salzlösung beladen werden, während die Hexylverbindung, DiSBA-C6-(5), die Zugabe von β-Cyclodextrin erfordert, um die Hexyl-Seitenketten zu maskieren und das hydrophobe Oxonol zu solubilisieren.The pentamethines can be loaded into cultured cells in the same manner as the trimethine oxonol. The butyl compound, DiSBA-C 4 - (5), can be loaded in Hanks balanced salt solution while the hexyl compound, DiSBA-C 6 - (5), requires the addition of β-cyclodextrin to sequester the hexyl side chains and the to solubilize hydrophobic oxonol.

Ein spannungsempfindlicher FRET von verschiedenen Plasmamembran-gebundenen fluoreszierenden Donoren zu den Pentamethinoxonolen wurde in einzelnen Zellen gezeigt. Es wurde gezeigt, daß FL-WGA einem FRET mit dem Pentamethin unterliegt und Verhältnisänderungen ergibt, die mit den für Trimethinoxonol beobachteten vergleichbar sind. In Astrozytomzellen wurden Verhältnisänderungen von 15–30% für eine 100 mV Depolarisationsstufe ausgehend von –70 mV aufgenommen. Offensichtlich wird die Verringerung des FRET aufgrund des kleineren Überlappungsintegrals J beim Verschieben der Oxonolabsorption um 100 nm in den langwelligeren Bereich durch eine erhöhte Selektivität des FRET für die extrazelluläre Fläche der Membran im Verhältnis zur intrazellulären und/oder einer verringerten spektralen Überlappung kompensiert.A voltage-sensitive FRET of different plasma membrane-bound fluorescent donors to the pentamethine oxonols was shown in single cells. It has been shown that FL-WGA undergoes FRET with the pentamethine and gives ratio changes comparable to those observed for trimethineoxonol. In astrocytoma cells, ratio changes of 15-30% were recorded for a 100 mV depolarization step starting at -70 mV. Obviously, the reduction in FRET due to the smaller overlap integral J when shifting oxonol absorption by 100 nm into the longer wavelength region is compensated for by an increased selectivity of FRET for the extracellular surface of the membrane relative to intracellular and / or reduced spectral overlap.

Es wurde auch entdeckt, daß fluoreszierende Phosphatidylethanolamin-Konjugate als FRET-Donoren für Pentamethinoxonol wirken. Die Strukturen der getesteten PE-Konjugate sind in 20 gezeigt. Das NBD-PE/Pentamethinoxonol-Paar ergab Verhältnisänderungen von 1–10%/100 mV. Cou-PE/Pentamethinoxonol ergab Verhältnisänderungen von 15–30% in spannungsabgegriffenen Astrozytomzellen für eine Depolarisation von 100 mV. Dieses Paar ist bemerkenswert, da die Cou-PE-Emissions- und DiSBA-C6-(5)-Absorptionsmaxima durch 213 nm getrennt sind und es kaum eine sichtbare Überlappung gibt, vgl. 21. Die große Extinktion des Pentamethins bei großen Wellenlängen läßt einen FRET zwischen dem Cumarin und dem Pentamethinoxonol zu. Der R0-Wert für dieses Paar wurde zu 37 Å unter Verwendung eines Quantenausbeute-Wertes von 1,0 für Cou-PE berechnet.It has also been discovered that fluorescent phosphatidylethanolamine conjugates act as FRET donors for pentamethine oxonol. The structures of the tested PE conjugates are in 20 shown. The NBD-PE / pentamethineoxonole pair gave ratio changes of 1-10% / 100mV. Cou-PE / pentamethine oxonol gave ratio changes of 15-30% in voltage-removed astrocytoma cells for a depolarization of 100 mV. This pair is noteworthy because the Cou-PE emission and DiSBA C 6 (5) absorption maxima are separated by 213 nm and there is little visible overlap, cf. 21 , The large extinction of pentamethine at long wavelengths leaves a FRET between coumarin and Pentamethine oxonol too. The R 0 value for this pair was calculated to be 37 Å using a quantum yield value of 1.0 for Cou-PE.

Die Membran-Translokationsgeschwindigkeiten für die Pentamethine sind etwa 5–8mal höher als die der Trimethin-Analoga. DiSBA-C4-(5) Verschiebungsströme in spannungsabgegriffenen Astrozytomzellen zeigten, daß Butylpentamethinoxonol mit einer Zeitkonstante von ~2 ms als Antwort auf Spannungsstufen von +20–120 mV über die Plasmamembran springt. Das Trimethin-Analogon translociert mit ~18 ms unter identischen Bedingungen. Die Verschiebungsströme von DiSBA-C6-(5) fallen sehr schnell ab und sind schwer von der Zellkapazität zu trennen. Als Ergebnis des großen spannungsabhängigen Signals des Cou-PE/DiSBA-C6-(5)-Paares war es möglich, die Geschwindigkeit der Spannungsantwort von DiSBA-C6-(5) optisch zu messen. Die Zeitkonstante für die DiSBA-C6-(5)-Translokation wurde optisch zu 0,383 ± 0,032 ms als Antwort auf eine 100 mV Depolarisationsstufe bestimmt, und zwar unter Verwendung von FRET von asymmetrisch markiertem Cou-PE. Die Verhältnisdaten und die exponentielle Antwort sind in 22 gezeigt. Die erhöhten Translokationsgeschwindigkeiten stammen von der größeren Ladungsdelokalisation und einer etwas höheren Hydrophobie des Pentamethinoxonols. Die schnelle Spannungsantwort von DiSBA-C6-(5) ist die schnellste, die für ein permeables, hoch-fluoreszierendes Molekül bekannt ist. Die Antwort im Submillisekundenbereich ist schnell genug, um Aktionspotentiale einzelner Neuronen genau aufzuzeichnen.The membrane translocation rates for the pentamethines are about 5-8 times higher than that of the trimethine analogs. DiSBA-C 4 - (5) shift currents in voltage-removed astrocytoma cells showed that butylpentamethine oxonol jumps across the plasma membrane with a time constant of ~ 2 ms in response to voltage levels of + 20-120 mV. The trimethine analog translocates at ~ 18 ms under identical conditions. The shift currents of DiSBA-C 6 - (5) are very fast and difficult to separate from cell capacity. As a result of the large voltage-dependent signal of the Cou-PE / DiSBA-C 6 - (5) pair, it was possible to optically measure the rate of voltage response of DiSBA-C 6 - (5). The time constant for the DiSBA C6 (5) translocation was determined optically at 0.383 ± 0.032 ms in response to a 100 mV depolarization step using FRET from asymmetrically labeled Cou-PE. The ratio data and the exponential answer are in 22 shown. The increased translocation rates are due to the larger charge delocalization and a slightly higher hydrophobicity of pentamethine oxonol. The rapid voltage response of DiSBA-C 6 - (5) is the fastest known for a permeable, highly fluorescent molecule. The sub-millisecond response is fast enough to accurately record the action potentials of individual neurons.

BEISPIEL VI – MESSUNG VON MEMBRANPOTENTIALEN MIT OXONOL-FARBSTOFFEN ALS FRET-DONORENEXAMPLE VI - MEASUREMENT OF MEMBRANE POTENTIALS WITH OXONOL DYES THAN FRET DONORS

Die Richtung des Energietransfers kann durch Verwendung von TR-WGA anstelle von FL-WGA umgekehrt werden. DiSBA-C6-(3) wirkt als FRET-Donor für TR-WGA in L-M(TK–)-Zellen mit der gleichen Antwortzeit wie FL-WGA/DiSBA-C6-(3). Die spektrale Überlappung dieses FRET-Paares ist in 2 gezeigt. Die Signaländerung ist jedoch nur halb so groß wie die für FL-WGA/DiSBA-C6-(3).The direction of energy transfer can be reversed by using TR-WGA instead of FL-WGA. DiSBA-C 6 - (3) acts as a FRET donor for TR-WGA in LM (TK - ) cells with the same response time as FL-WGA / DiSBA-C 6 - (3). The spectral overlap of this FRET pair is in 2 shown. However, the signal change is only half that of FL-WGA / DiSBA-C 6 - (3).

DiSBA-C6-(3) wurde erfolgreich als FRET-Donor für Cy5-markiertes PE in B104-Neuroblastomzellen verwendet. Die Verhältnisänderungen von 5–15%/100 mV sind die größten, die für das mobile Ion als Donor beobachtet wurden.DiSBA-C 6 - (3) was successfully used as a FRET donor for Cy5-labeled PE in B104 neuroblastoma cells. The ratio changes of 5-15% / 100 mV are the largest observed for the mobile ion as a donor.

BEISPIEL VII – MESSUNG DES MEMBRANPOTENTIALS IN VERSCHIEDENEN ZELLTYPENEXAMPLE VII - MEASUREMENT OF THE MEMBRANE POTENTIAL IN VARIOUS CELL TYPES

Das FL-WGA/DiSBA-C6-(3)-System wurde in einer Vielzahl von Zellinien getestet. In neonatalen Herzmyozyten konnten die beiden Fluorophore beladen werden, ohne das spontane Schlagen zu beeinflussen. Daher verhinderte die hinzugefügte Kapazität der Oxonol-Verschiebungsströme nicht die Bildung von Aktionspotentialen. Die periodischen 90 mV Aktionspotentiale [L. Conforti, N. Tohse und N. Sperelakis, 1991, Influence of sympathetic innervation on the membrane electrical properties of neonatal rat cardiomyocytes in culture, J. Devel. Physiol. 15, 237–246] konnten in einem einzigen Durchlauf beobachtet werden, vgl. 8C. Die Verhältnisänderung ohne Abzug von jeglicher Hintergrundfluoreszenz betrug 4–8%. In den Einzelwellenlängendaten wurden Bewegungsartefakte beobachtet. Die 8A und B zeigen große langsame Änderungen des nachgewiesenen Lichts, die in beiden Kanälen beobachtet wurden. Diese Effekte konnten jedoch im wesentlichen bei den Verhältnisdaten ausgeschlossen werden. Die Daten wurden bei 100 Hz aufgenommen und es wurden 10 μM Isoproterenol der Badlösung zugesetzt. Die spannungsabhängigen Fluoreszenzänderungen sind schneller als die Artefakte auf mechanischer Basis, was auch erwartet werden konnte [B. C. Hill und K. R. Courtney, 1982, Voltage-sensitive dyes discerning contraction and electrical signals in myocardium, Biophys. J. 40, 255–257]. Einige Zellen, die mit 2,3 μM Oxonol beladen wurden, hörten nach etwa 7 Sekunden kontinuierlichem Aussetzen gegenüber Xenon-Bogenlampenbelichtung auf, zu schlagen. Bei einer Beladung von 0,6 μM wurde die Phototoxizität, aber leider auch das Signal verringert. In differenzierten B104-Neuroblastomzellen wurde ein Anstieg des Verhältnisses von 8% aufgenommen, und zwar ohne jeglichen Hintergrundabzug für eine 120 mV Depolarisation. Die nach innen gerichteten Natriumströme verschlechterten sich nicht aufgrund phototoxischer Effekte während Experimenten mit Anregungszeiten von insgesamt 10–20 Sekunden. FL-WGA/DiSBA-C6-(3)-markierte 1321N-Astrozytomzellen zeigten Oxonol und FL-WGA-Fluoreszenz nahezu ausschließlich auf der Plasmamembran.The FL-WGA / DiSBA-C 6 - (3) system has been tested in a variety of cell lines. In neonatal cardiac myocytes, the two fluorophores could be loaded without affecting spontaneous hitting. Therefore, the added capacity of the oxonol shift currents did not prevent the formation of action potentials. The periodic 90 mV action potentials [L. Conforti, N. Tohse and N. Sperelakis, 1991, Influence of sympathetic innervation on the membrane electrical properties of neonatal rat cardiomyocytes in culture, J. Devel. Physiol. 15, 237-246] could be observed in a single run, cf. 8C , The ratio change without deduction of any background fluorescence was 4-8%. Motion artifacts were observed in the single-wavelength data. The 8A and B show large slow changes in the detected light observed in both channels. However, these effects could essentially be excluded in the ratio data. The data was taken at 100 Hz and 10 μM isoproterenol was added to the bath solution. The voltage-dependent fluorescence changes are faster than the mechanical-based artifacts, which could also be expected [BC Hill and KR Courtney, 1982, Voltage-sensitive discerning contraction and electrical signals in myocardium, Biophys. J. 40, 255-257]. Some cells loaded with 2.3 μM oxonol ceased beating after about 7 seconds of continuous exposure to xenon arc lamp exposure. At a loading of 0.6 μM the phototoxicity but unfortunately also the signal was reduced. In differentiated B104 neuroblastoma cells, an 8% increase in the ratio was recorded, with no background subtraction for a 120 mV depolarization. The inward sodium currents did not degrade due to phototoxic effects during experiments with excitation times of 10-20 seconds in total. FL-WGA / DiSBA-C 6 (3) -labeled 1321N astrocytoma cells exhibited oxonol and FL-WGA fluorescence almost exclusively on the plasma membrane.

Verhältnisänderungen von 22–34% für 100 mV wurden in Photometrie-Experimenten beobachtet, vgl. 9. Nach einer 50 ms Verzögerung wurde das Membranpotential 100 ms lang für 100 mV, ausgehend von –70 mV depolarisiert. Die Spuren stellen den Mittelwert von 4 bei 300 Hz aufgenommenen Durchläufen dar, und zwar ohne Glättung. Die Zeitkonstante für die Fluoreszenzänderungen beträgt weniger als 3,3 ms, was mit den Verschiebungsströmen, wie den in 3 gezeigten, übereinstimmt. Ein kleines Hintergrundsignal wurde vom Ausgangssignal abgezogen, und zwar < 5% für den Oxonol-Kanal und < 15% für den Fluorescein-Kanal. Die Fluoreszenzintensitäten in den Fluorescein- und Oxonol-Kanälen erhöhten sich um ~17% bzw. verringerten sich um ~16% für eine 100 mV Depolarisation. In diesen Zellen, anders als bei L-M(TK–), verringerte sich das Übersprechen zwischen den Emissionskanälen und im Fluorescein-Signal traten größere Änderungen auf. Diese Signaländerungen sind die größten Membranpotential-abhängigen Verhältnisänderungen im Millisekundenbereich, die in einzelnen Zellen beobachtet wurden. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, daß 4-ANEPPS eine 9%/100 mV Anregungs-Verhältnisänderung ergibt [V. Montane, D. L. Farkas und L. M. Loew, 1989, Dual-wavelength ratiometric fluorescence measurements of membrane potential, Biochemistry 28, 4536–4539]. Darüber hinaus sind FL-WGA/DiSBA-C6-(3)-Fluoreszenzänderungen in jedem Emissionskanal vergleichbar mit den größten berichteten Änderungen, beispielsweise der 21%/100 mV Änderung in einer Neuroblastomzelle unter Verwendung von RH-421 [A. Grinvald, A. Fine, I. C. Farber und R. Hildesheim, 1983, Fluorescence monitoring of electrical responses from small neurons and their processes, Biophys. J. 42, 195–198]. Die großen Signale von FL-WGA/DiSBA-C6-(3) ermöglichten die Aufnahme von Verhältnisbildern von Membranpotentialänderungen in spannungsabgegriffenen L-M(TK–)- und Astrozytomzellen unter Verwendung eines Hochgeschwindigkeits-Konfokalmikroskops.Ratio changes of 22-34% for 100 mV were observed in photometry experiments, cf. 9 , After a 50 ms delay, the membrane potential was depolarized for 100 ms for 100 mV, starting from -70 mV. The tracks represent the average of 4 passes recorded at 300 Hz, with no smoothing. The time constant for the fluorescence changes is less than 3.3 ms, which is consistent with the shift currents such as those in 3 shown, matches. A small background signal was subtracted from the output signal, <5% for the oxonol channel and <15% for the fluorescein Channel. The fluorescence intensities in the fluorescein and oxonol channels increased by ~ 17% and decreased by ~ 16% for a 100 mV depolarization, respectively. In these cells, unlike LM (TK - ), crosstalk between the emission channels decreased, and larger changes occurred in the fluorescein signal. These signal changes are the largest membrane potential-dependent ratio changes in the millisecond range observed in single cells. Previous studies have shown that 4-ANEPPS gives a 9% / 100mV excitation ratio change [V. Montane, DL Farkas and LM Loew, 1989, Dual-wavelength ratiometric fluorescence measurements of membrane potential, Biochemistry 28, 4536-4539]. In addition, FL-WGA / DiSBA-C 6 (3) fluorescence changes in each emission channel are comparable to the largest reported changes, for example the 21% / 100 mV change in a neuroblastoma cell using RH-421 [A. Grinvald, A. Fine, IC Farber and R. Hildesheim, 1983, Fluorescence monitoring of small neurons and their processes, Biophys. J. 42, 195-198]. The large signals from FL-WGA / DiSBA-C 6 - (3) enabled the reception of ratio images of membrane potential changes in voltage LM (TK -) - and astrocytoma cells using a high speed confocal microscope.

Die Astrozytomzellen ergaben eine Erhöhung des Verhältnisses um 10–20%, die an der Plasmamembran für eine 120 mV Depolarisation lokalisiert wurde.The astrocytoma cells increased the ratio by 10-20%, which was localized at the plasma membrane for a 120 mV depolarization.

BEISPIEL VIII – SYNTHESE VON FLUORESZIERENDEN TETRAARYLBORATENEXAMPLE VIII - SYNTHESIS OF FLUORESCENT TETRAARYL BORATES

Unter Bezugnahme auf 10 wurden 0,788 g (580 μl, 2,2 mmol) Verbindung I in einem in der Flamme getrockneten 25 ml-Zweihalskolben unter Argon in 6 ml trockenem Hexan gelöst. Nach dem Abkühlen des Kolbens auf –70°C wurden mittels einer Spritze 1,46 ml einer 1,5 M N-Butyllithiumlösung (2,2 mmol) zugegeben. In einem anderen Kolben wurden 0,60 trockenes Boran II in einem sauerstofffreien Gemisch von 6 ml Hexan und 1,5 ml frisch destilliertem THF gelöst. Die Boranlösung wurde dann mittels einer Spritze dem Lithium-Reagenz zugesetzt, worauf sofort ein Niederschlag entstand. Nach etwa 30 Minuten wurde das Kältebad entfernt und man ließ das Reaktionsgemisch langsam erwärmen. Nach 3 Stunden wurde das Lösungsmittel abdekantiert und der Feststoff mit weiterem Hexan gewaschen. Der Feststoff wurde in Acetonitril und Wasser gelöst und dann in einen Scheidetrichter überführt. Die wäßrige Phase wurde erneut mit Hexan gewaschen und anschließend mit Ethylacetat extrahiert. Die Hälfte des Extrakts wurde konzentriert, wobei 124,9 mg (170,5 μmol) des gewünschten Produkts erhalten wurden. Dieses Produkt wurde dann mit 97 mg Tetrabutylammoniumfluorid in Acetonitril 15 Minuten bei Raumtemperatur gemischt. Nach der Aufarbeitung wurden 129,1 mg der Verbindung III als Tetrabutylammoniumsalz erhalten (93%).
1H-NMR (d6-Aceton): 7,61 (breites d, 2H, CF3-Phenylgruppe), 7,43 (cm, ~3H, CF3-Phenylgruppe), 6,90-7,26 (cm, ~7H, CF3-Phenylgruppe), 3,43 (cm, 8H, NCH 2CH2CH2CH3), 1,81 (cm, ~8H, NCH2CH 2CH2CH3), 1,42 (cm, ~8H, NCH2CH2CH 2CH3), 0,93 (t, J = 7,1 Hz, NCH2CH2CH 3).With reference to 10 0.788 g (580 μl, 2.2 mmol) of Compound I were dissolved in 6 ml of dry hexane in a flame-dried 25 ml two-necked flask under argon. After cooling the flask to -70 ° C, 1.46 ml of a 1.5 M N-butyllithium solution (2.2 mmol) was added via syringe. In another flask, 0.60 dry borane II was dissolved in an oxygen-free mixture of 6 ml hexane and 1.5 ml freshly distilled THF. The borane solution was then added by syringe to the lithium reagent, whereupon a precipitate formed immediately. After about 30 minutes, the cold bath was removed and the reaction mixture was allowed to warm slowly. After 3 hours the solvent was decanted off and the solid washed with more hexane. The solid was dissolved in acetonitrile and water and then transferred to a separatory funnel. The aqueous phase was washed again with hexane and then extracted with ethyl acetate. Half of the extract was concentrated to give 124.9 mg (170.5 μmol) of the desired product. This product was then mixed with 97 mg of tetrabutylammonium fluoride in acetonitrile for 15 minutes at room temperature. After working up, 129.1 mg of compound III were obtained as the tetrabutylammonium salt (93%).
1 H-NMR (d 6 -acetone): 7.61 (broad d, 2H, CF 3 -phenyl group), 7.43 (cm, -3H, CF 3 -phenyl group), 6.90-7.26 (cm , ~ 7H, CF 3 -phenyl group), 3.43 (cm, 8H, NC H 2 CH 2 CH 2 CH 3 ), 1.81 (cm, ~ 8H, NCH 2 C H 2 CH 2 CH 3 ), 1 , 42 (cm, ~ 8H, NCH 2 CH 2 C H 2 CH 3 ), 0.93 (t, J = 7.1 Hz, NCH 2 CH 2 C H 3 ).

Unter Bezugnahme auf 10 wurden zur Synthese von Verbindung IV in einem 5 ml-Rundkolben 14 mg (17,2 μmol) Verbindung III, 7 mg (25,8 μmol) Brommethylbiman, 27,3 mg (172 μmol) Kaliumcarbonat und 5 mg (18,9 μmol) 18-Krone-6 in 0,6 ml trockenem Acetonitril gemischt. Das Gemisch wurde 1,5 Stunden bei 70°C erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde das Reaktionsgemisch in Ethylacetat gelöst und 3× mit Wasser gewaschen. Der organische Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (Toluol/Aceton (2:1)) gereinigt. Die Hauptbande wurde gesammelt, wobei 12,1 mg (70%) reines Produkt IV als Tetrabutylammoniumsalz erhalten wurde.
1H-NMR (d6-Aceton): 7,58 (breites d, 2H, CF3-Phenylgruppe), 7,4-7,5 (cm, 2H, CF3-Phenylgruppe), 7,0-7,3 (cm, ~10H, CF3-Phenylgruppe), 5,29 (d, J = 1,6 Hz, 2H, CH2), 3,46 (cm, 8H, NCH 2CH2CH2CH3), 2,56 (d, J = 0,7 Hz, 3H, Biman-Methyl), 1,84 (cm, ~8H, NCH2CH 2CH2CH3), 1,79 (d, J = 0,8 Hz, 3H, Biman-Methyl), 1,76 (s, 3H, Biman-Methyl), 1,44 (cm, ~8H, NCH2CH2CH 2CH3), 0,98 (t, J = 7,2 Hz, NCH2CH2CH2CH 3), f = 0,73 in Dioxan auf der Basis von Chininsulfat in 0,1 N H2SO4 f = 0,55.With reference to 10 For the synthesis of compound IV in a 5 ml round bottomed flask, 14 mg (17.2 μmol) Compound III, 7 mg (25.8 μmol) bromomethylbimane, 27.3 mg (172 μmol) potassium carbonate and 5 mg (18.9 μmol ) 18-crown-6 in 0.6 ml of dry acetonitrile. The mixture was heated at 70 ° C for 1.5 hours. After cooling, the reaction mixture was dissolved in ethyl acetate and washed with water three times. The organic residue was purified by flash chromatography (toluene / acetone (2: 1)). The major band was collected to give 12.1 mg (70%) of pure product IV as the tetrabutylammonium salt.
1 H-NMR (d 6 -acetone): 7.58 (broad d, 2H, CF 3 -phenyl group), 7.4-7.5 (cm, 2H, CF 3 -phenyl group), 7.0-7, 3 (cm, ~ 10H, CF 3 -phenyl group), 5.29 (d, J = 1.6Hz, 2H, CH 2 ), 3.46 (cm, 8H, NC H 2 CH 2 CH 2 CH 3 ) , 2.56 (d, J = 0.7 Hz, 3H, Biman-methyl), 1.84 (cm, ~ 8H, NCH 2 C H 2 CH 2 CH 3 ), 1.79 (d, J = 0 , 8Hz, 3H, biman-methyl), 1.76 (s, 3H, biman-methyl), 1.44 (cm, ~ 8H, NCH 2 CH 2 C H 2 CH 3 ), 0.98 (t, J = 7.2 Hz, NCH 2 CH 2 CH 2 C H 3 ), f = 0.73 in dioxane based on quinine sulfate in 0.1 NH 2 SO 4 f = 0.55.

BEISPIEL IX – SYNTHESE VON ASYMMETRISCHEN OXONOLEN MIT EINER LINKER-GRUPPEEXAMPLE IX - SYNTHESIS OF ASYMMETRIC OXONOLS WITH A LINKER GROUP

  • (A) Dieses Beispiel veranschaulicht die Synthese von asymmetrischen Oxonolen, die eine eingebaute Linker-Gruppe enthalten. Unter Bezugnahme auf 11 wurden zur Synthese von Verbindung V 4,35 g (21,7 mmol) 1,12-Diaminododecan in 40 ml trockenem CH2Cl2 gelöst. Mittels einer Spritze wurden 2,62 ml (2,17 mmol) Butylisothiocyanat dem Reaktionskolben zugesetzt. Nach 30 Minuten trat ein weißer Niederschlag auf. 1 Stunde nach der Zugabe wurde das Reaktionsgemisch filtriert und das Filtrat eingedampft, wobei ein weißer Feststoff zurückblieb. Der Feststoff wurde in 45 ml trockenem CH2Cl2 gelöst und mit 2,44 ml N,N-Diisopropylethylamin (DIEA) und 3,9 g (17,9 mmol) Di-t-butyl-dicarbonat gemischt. Nach 1 Stunde Umsetzung wurde das Gemisch in einen Scheidetrichter überführt und mit 5%iger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Ein ausgefallener Feststoff wurde abfiltriert (< 100 mg). Die organische Lösung wurde dann mit Wasser und einer gesättigten Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde dann mit Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filtrat wurde eingedampft und der erhaltene weiße Feststoff wurde aus Isopropylether umkristallisiert, wobei 4,30 g (10,3 mmol) reine Verbindung V erhalten wurden (Gesamtausbeute: 48%). 1H-NMR (CDCl3): 5,73 (breites s, 2H, Thioamid), 4,50 (breites s, 1H, Carbamat), 3,40 (breites s, 4H, NCH 2), 3,10 (g, J = 7,2 Hz, ~3H, CH 2 am Carbamat), 1,44 (s, 9H, t-Butyl), 1,2-1,7 (cm, bulk CH 2), 0,94 (t, J = 7,2 Hz, N-Butylmethyl).(A) This example illustrates the synthesis of asymmetric oxonols containing a built-in linker group. With reference to 11 For the synthesis of compound V, 4.35 g (21.7 mmol) of 1,12-diaminododecane were dissolved in 40 ml of dry CH 2 Cl 2 . By means of a syringe, 2.62 ml (2.17 mmol) of butyl isothiocyanate was added to the reaction flask. After 30 minutes, a white precipitate appeared. One hour after the addition, the reaction mixture was filtered and the filtrate evaporated to leave a white solid. The solid was dissolved in 45 mL of dry CH 2 Cl 2 and mixed with 2.44 mL of N, N-diisopropylethylamine (DIEA) and 3.9 g (17.9 mmol) of di-t-butyl dicarbonate. After 1 hour of reaction, the mixture was transferred to a separatory funnel and charged with 5% Washed sodium bicarbonate solution. A precipitated solid was filtered off (<100 mg). The organic solution was then washed with water and a saturated saline solution. The organic phase was then dried with magnesium sulfate and filtered. The filtrate was evaporated and the resulting white solid was recrystallised from isopropyl ether to give 4.30 g (10.3 mmol) of pure Compound V (total yield: 48%). 1 H-NMR (CDCl 3 ): 5.73 (broad s, 2H, thioamide), 4.50 (broad s, 1H, carbamate), 3.40 (broad s, 4H, NC H 2 ), 3.10 (g, J = 7.2 Hz, ~ 3 H, C H 2 next to carbamate), 1.44 (s, 9H, t-butyl), 1.2-1.7 (cm, bulk C H 2), 0 , 94 (t, J = 7.2 Hz, N-butylmethyl).

Zur Herstellung von Verbindung VI wurden 441 mg (19,2 mmol) Natrium unter Argon in 5 ml trockenem Ethanol gelöst. Nachdem sich nahezu das gesamte Natrium aufgelöst hatte, wurden 2,92 ml (3,1 g, 19,2 mmol) Diethylmalonat zugegeben, wobei ein schwacher Niederschlag auftrat. 4,0 g (9,6 mmol) Verbindung V wurden zugegeben und das Gemisch wurde 70 Stunden unter Argon bei 100°C unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde das Reaktionsgemisch filtriert und mit Ethanol gewaschen. Nach der Zugabe von Wasser zum Filtrat trat ein weißer Niederschlag auf. Der Feststoff (799 mg, vorwiegend nicht umgesetztes Ausgangsmaterial) wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde dann auf etwa pH 2 angesäuert und anschließend mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde dann mit MgSO4 getrocknet und filtriert. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels wurden 1,6 g (3,3 mmol) eines gelben Öls erhalten (34%).
1H-NMR (CDCl3): 4,22 (cm, 4H, NCH 2 am Barbiturat), 3,63 (s, 2H, Ring-CH 2), 2,99 (cm, 2H, CH 2 am Carbamat), 1,53 (cm, 4H, NCH2CH 2), 1,34 (s, 9H, t-Butyl), 1,1-1,3 (cm, bulk CH 2), 0,85 (t, J = 7,4 Hz, n-Butylmethyl).To prepare Compound VI, 441 mg (19.2 mmol) of sodium was dissolved under argon in 5 ml of dry ethanol. After almost all of the sodium had dissolved, 2.92 ml (3.1 g, 19.2 mmol) of diethyl malonate was added, with a slight precipitate. 4.0 g (9.6 mmol) of compound V were added and the mixture was refluxed for 70 hours under argon at 100 ° C. After cooling, the reaction mixture was filtered and washed with ethanol. Upon addition of water to the filtrate, a white precipitate appeared. The solid (799 mg, predominantly unreacted starting material) was filtered off. The filtrate was then acidified to about pH 2 and then extracted with ethyl acetate. The organic layer was then dried with MgSO 4 and filtered. After removal of the solvent, 1.6 g (3.3 mmol) of a yellow oil were obtained (34%).
1 H-NMR (CDCl 3 ): 4.22 (cm, 4H, NC H 2 on barbiturate), 3.63 (s, 2H, Ring-C H 2 ), 2.99 (cm, 2H, C H 2 carbamate), 1.53 (cm, 4H, NCH 2 C H 2 ), 1.34 (s, 9H, t -butyl), 1.1-1.3 (cm, bulk C H 2 ), 0, 85 (t, J = 7.4 Hz, n-butylmethyl).

Zur Herstellung der Verbindung VII wurde 1 ml Trifluoressigsäure (TFA) unter Rühren zu 200 mg (0,41 mmol) Verbindung VI, gelöst in 3 ml CH2Cl2, zugegeben. Nach 1,25 Stunden wurde das gesamte Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. 1 Äquivalent von jeweils N-[5-(Phenylamino)-2,4-pentadienyliden]-anilin-monohydrochlorid und 1,3-Di-n-butylthiobarbiturat wurden zugegeben, alle drei Komponenten in 1 ml Pyridin gelöst und über Nacht stehengelassen. Das Produkt wurde mittels Flash-Chromatographie von den anderen Pentamethinxonolen abgetrennt. Die unpolaren Produkte wurden mit CHCl3/CH3OH (9:1) eluiert. Das reine, den Linker enthaltende Produkt wurde mit CHCl3/CH3OH (1:1) eluiert. Das Produkt war sehr fest am Kieselgel gebunden und nur 10 mg Produkt konnten gewonnen werden.
1H-NMR (CDCl3)/CD3OD: 7,5-7,8 (cm, 4H, Vinylmethine), 7,35 (t, J = ~14 Hz, 1H, mittleres Methin), 4,34 (breites t, ~10H, NCH 2 am Barbiturat), 2,72 (cm, ~3H, CH 2 am Amin), 1,4-1,7 (breites cm, ~12H, NCH2CH 2), 1,0-1,4 (cm, ~40H, bulk CH 2), 0,81 (p, J = 7,3 Hz, 9H, n-Butylmethyl).

  • (B) Dieses spezielle Beispiel bezieht sich auf die 15 und 16.
To prepare compound VII, 1 ml of trifluoroacetic acid (TFA) was added with stirring to 200 mg (0.41 mmol) of compound VI dissolved in 3 ml of CH 2 Cl 2 . After 1.25 hours, all the solvent was removed under reduced pressure. 1 equivalent of each of N- [5- (phenylamino) -2,4-pentadienylidene] -aniline monohydrochloride and 1,3-di-n-butylthiobarbiturate was added, all three components were dissolved in 1 ml of pyridine and allowed to stand overnight. The product was separated from the other pentamethine xonols by flash chromatography. The nonpolar products were eluted with CHCl 3 / CH 3 OH (9: 1). The pure product containing the linker was eluted with CHCl 3 / CH 3 OH (1: 1). The product was very firmly bound to the silica gel and only 10 mg product could be recovered.
1 H-NMR (CDCl 3) / CD3 OD: 7.5-7.8 (cm, 4H, Vinylmethine), 7.35 (t, J = ~ 14 Hz, 1H, central methine), 4.34 ( broad t, ~ 10H, NC H 2 on barbiturate), 2.72 (cm, ~ 3H, C H 2 on the amine), 1.4-1.7 (broad cm, ~ 12H, NCH 2 C H 2 ), 1.0-1.4 (cm, ~ 40H, bulk C H 2 ), 0.81 (p, J = 7.3 Hz, 9H, n-butylmethyl).
  • (B) This specific example refers to the 15 and 16 ,

N-Butyl-N-5-pentanolthioharnstoff (6): 5-Amino-1-pentanol (1,416 ml, 13 mmol) wurde in 7 ml CH2Cl2 gelöst und unter Argon mittels einer Spritze mit Butylisothiocyanat (1,570 ml, 13 mmol) versetzt. Nach 2,5 Stunden wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, wobei ein Öl zurückblieb. Unter Hochvakuum wurde das Öl 2× mit flüssigem Stickstoff gefriergetrocknet und über Nacht unter vermindertem Druck belassen. Am nächsten Morgen wurden 2,615 g reines festes Produkt gesammelt (12 mmol, 92%).
1H-NMR (CDCl3): d 5,90 (breites s, 2H, NH), 3,66 (t, J = 6,2 Hz, 2H, RCH2OH), 3,42 (breites m, 4H, NHCH2R), 1,80 (breites s, 1H, OH), 1,3-1,7 (nicht aufgelöste cm, 10H, bulk Methylene), 0,94 (t, J = 7,2 Hz, 3H, Methyl).
13C-NMR (CDCl3): d 181,5 (Thiocarbonyl), 62,2 (RCH2OH), 44,2 (NHCH2R), 44,1 (NHCH2R), 31,9 (CH2), 31,0 (CH2), 28,6 (CH2), 23,0 (CH2), 19,9 (CH2), 13,6 (CH3).N-Butyl-N-5-pentanolthiourea (6): 5-Amino-1-pentanol (1.416 mL, 13 mmol) was dissolved in 7 mL of CH 2 Cl 2 and extracted by syringe with butyl isothiocyanate (1.570 mL, 13 mmol ). After 2.5 hours, the solvent was removed under reduced pressure leaving an oil. Under high vacuum, the oil was freeze-dried 2X with liquid nitrogen and left under reduced pressure overnight. The next morning, 2.615 g of pure solid product was collected (12 mmol, 92%).
1 H-NMR (CDCl 3 ): d 5.90 (broad s, 2H, NH), 3.66 (t, J = 6.2 Hz, 2H, RCH 2 OH), 3.42 (broad m, 4H , NHCH 2 R), 1.80 (broad s, 1H, OH), 1.3-1.7 (unresolved cm, 10H, bulk methylenes), 0.94 (t, J = 7.2 Hz, 3H , Methyl).
13 C-NMR (CDCl 3 ): d 181.5 (thiocarbonyl), 62.2 (RCH 2 OH), 44.2 (NHCH 2 R), 44.1 (NHCH 2 R), 31.9 (CH 2 ), 31.0 (CH 2 ), 28.6 (CH 2 ), 23.0 (CH 2 ), 19.9 (CH 2 ), 13.6 (CH 3 ).

1-Butyl-3-(6-pentanol)-thiobarbiturat (7): 345 mg (15 mmol) Natrium wurden in trockenem Ethanol gelöst und nachdem sich nahezu das gesamte Natrium gelöst hatte, unter Argon mit Diethylmalonat (2,278 ml, 15 mmol) versetzt. Das Gemisch wurde dann auf 60°C erhitzt, um das ausgefallene Natriummalonat zu lösen. Das Erhitzen wurde dann eingestellt und es wurde N-Butyl-N-5-pentanolthioharnstoff (6) (1,310 g, 6 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 3,5 Tage bei 100°C unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde das Reaktionsgemisch filtriert und mit EtOH gewaschen. Ein etwa gleiches Volumen H2O wurde dem Filtrat zugesetzt und das Filtrat wurde mit konzentrierter HCl auf pH 1–2 angesäuert. Die wäßrige Lösung wurde 3× mit 1:1 EtOAc/Hexan extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über MgSO4 getrocknet, filtriert und konzentriert, wobei ein Öl zurückblieb. Ein DC mit EtOAc/MeOH (4:1) zeigte, daß zusätzlich zum Barbiturat-Hauptprodukt zwei unpolare Verunreinigungen vorlagen. Durch eine Kieselgel-Flash-Chromatographie (4 × 17 cm), EtOAc/MeOH (4:1)) konnte eine gewisse Reinigung erreicht werden. Das Material lag nach wie vor als Öl vor und eine zweite Chromatographie mit CHCl3/MeOH/AA (90:8:2) wurde durchgeführt. Trotzdem das Produkt als Öl vorlag, wurden 0,726 g (2,54 mmol, 42%) reines Produkt gewonnen.
1H-NMR (CDCl3): d 4,31 (cm, 4H, NCH2R), 3,71 (breites s, 2H, Ring-Methylen), 3,63 (t, J = 6,3 Hz, 2H, RCH2OH), 2,75 (breites s, 1H, OH), 1,5-1,8 (cm, 6H, bulk Methylene), 1,2-1,5 (cm, 4H, bulk Methylene), 0,94 (t, J = 7,2 Hz, 3H, Methyl).1-Butyl-3- (6-pentanol) thiobarbiturate (7): 345 mg (15 mmol) of sodium was dissolved in dry ethanol and, after dissolving almost all of the sodium, under argon with diethyl malonate (2.278 ml, 15 mmol). added. The mixture was then heated to 60 ° C to dissolve the precipitated sodium malonate. The heating was then stopped and N-butyl-N-5-pentanolthiourea (6) (1.310 g, 6 mmol) was added. The reaction mixture was refluxed at 100 ° C for 3.5 days. After cooling, the reaction mixture was filtered and washed with EtOH. An approximately equal volume of H 2 O was added to the filtrate and the filtrate was acidified to pH 1-2 with concentrated HCl. The aqueous solution was extracted 3x with 1: 1 EtOAc / hexane. The combined extracts were dried over MgSO 4 , filtered and concentrated to leave an oil. A TLC with EtOAc / MeOH (4: 1) showed that in addition to the main barbiturate product, there were two nonpolar impurities. Silica gel flash chromatography (4 x 17 cm), EtOAc / MeOH (4: 1)) allowed some purification to be achieved. The material was still in the form of oil and a second chromatography with CHCl 3 / MeOH / AA (90: 8: 2) was performed. Although the product was an oil, 0.726 g (2.54 mmol, 42%) of pure product was recovered.
1 H-NMR (CDCl 3 ): d 4.31 (cm, 4H, NCH 2 R), 3.71 (broad s, 2H, ring methylene), 3.63 (t, J = 6.3 Hz, 2H, RCH 2 OH), 2.75 (broad s, 1H, OH), 1.5-1.8 (cm, 6H, bulk methylene), 1.2-1.5 (cm, 4H, bulk methylene) , 0.94 (t, J = 7.2 Hz, 3H, methyl).

1-Butyl-3-(5-brompentan)-thiobarbiturat (8): (7) (98 mg, 343 μmol) wurde in 600 μl trockenem CH2Cl2 gelöst und mit Kohlenstofftetrabromid (142 mg, 429 μmol) gemischt. Die Lösung wurde auf Eis gekühlt und mit Triphenylphosphin (135 mg, 515 μmol) versetzt. Es zeigte sich eine Gasentwicklung und die Lösung färbte sich sofort gelb. Nach 30 Minuten wurde das Lösungsmittel entfernt und der feste Rückstand mit Hexan versetzt. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt. Ein DC zeigte nur ein Barbiturat in der Hexanlösung, zusammen mit Triphenylphosphinoxid. Die Verunreinigung wurde mittels Kieselgel-Flash-Chromatographie ((2,5 × 22 cm), befüllt mit EtOAc/MeOH (98:2)) entfernt. Die unpolare Verunreinigung wurde mit dem Befüllungslösungsmittel und nachfolgend mit EtOAc/MeOH (90:10) von der Säule gewaschen. Das gewünschte Produkt wurde mit CHCl3/MeOH/AA (93:5:2) eluiert, wobei 40 mg (115 μmol, 34%) erhalten wurden.
1H-NMR (CDCl3): d 4,33 (cm, 4H, NCH2R), 3,72 (s, 2H, Ring-Methylen), 3,42 (t, J = 6,7 Hz, 2H, RCH2Br), 1,91 (cm, 2H, Methylen), 1,66 (cm, 4H, Methylene), 1,52 (cm, 2H, Methylen), 0,95 (t, J = 7,2 Hz, 3H, Methyl). 1-Butyl-3- (5-bromopentane) thiobarbiturate (8): (7) (98 mg, 343 μmol) was dissolved in 600 μl of dry CH 2 Cl 2 and mixed with carbon tetrabromide (142 mg, 429 μmol). The solution was cooled on ice and treated with triphenylphosphine (135 mg, 515 μmol). It showed a gas evolution and the solution immediately turned yellow. After 30 minutes, the solvent was removed and the solid residue was added with hexane. The mixture was stirred overnight. A TLC showed only a barbiturate in the hexane solution, along with triphenylphosphine oxide. The contaminant was removed by silica gel flash chromatography ((2.5 x 22 cm) filled with EtOAc / MeOH (98: 2)). The non-polar contaminant was washed from the column with the loading solvent and subsequently with EtOAc / MeOH (90:10). The desired product was eluted with CHCl 3 / MeOH / AA (93: 5: 2) to give 40 mg (115 μmol, 34%).
1 H-NMR (CDCl3): d 4.33 (cm, 4H, NCH 2 R), 3.72 (s, 2H, ring methylene), 3.42 (t, J = 6.7 Hz, 2H , RCH 2 Br), 1.91 (cm, 2H, methylene), 1.66 (cm, 4H, methylene), 1.52 (cm, 2H, methylene), 0.95 (t, J = 7.2 Hz, 3H, methyl).

1,3-Dibutyl-5-(3-phenylaminopropendienyl)-thiobarbiturat (10): Malonaldehyd-bis-(phenylimin) (500 mg, 1,69 mmol) wurde in 20 ml trockenem DMF gelöst. Getrennt davon wurde 1,3-Dibutylthiobarbiturat (430 mg, 1,76 mmol) in 5 ml trockenem Pyridin gelöst und in einen 10 ml Tropftrichter überführt. Die Thiobarbituratlösung wurde langsam während 5 Minuten zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde 5 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde mit etwa 20 ml Wasser versetzt, worauf ein gelber Niederschlag entstand. Der Feststoff wurde abfiltriert und getrocknet, wobei 575 mg (1,5 mmol, 89%) erhalten wurden. Geringere Verunreinigungen, einschließlich Oxonol, wurden mittels Kieselgel-Flash-Chromatographie ((3 × 15 cm), EtOAc/Hexan (1:1)) entfernt. Ein Teil des Materials fiel auf der Säule aus. Nach dem Trocknen wurden 390 mg reines Produkt erhalten (1 mmol, 59%).
1H-NMR (CDCl3/MeOH): d 8,10 (d, J = 3,0 Hz, 1H), 8,04 (s, 1H), 7,3-7,5 (cm, 3H), 7,1-7,25 (cm, 3H), 4,40 (cm, 4H, NCH2R), 1,65 (cm, 4H, NCH2CH2R), 1,36 (cm, 4H, NCH2CH2CH2CH3), 0,90 (t, J = 7,3 Hz, 6H, Methylgruppen).1,3-Dibutyl-5- (3-phenylaminopropendienyl) thiobarbiturate (10): Malonaldehyde bis (phenylimine) (500 mg, 1.69 mmol) was dissolved in 20 mL of dry DMF. Separately, 1,3-dibutylthiobarbiturate (430 mg, 1.76 mmol) was dissolved in 5 ml of dry pyridine and transferred to a 10 ml dropping funnel. The thiobarbiturate solution was added slowly over 5 minutes and the reaction mixture was stirred for 5 hours. The mixture was added with about 20 ml of water, whereupon a yellow precipitate formed. The solid was filtered off and dried to give 575 mg (1.5 mmol, 89%). Lower impurities, including oxonol, were removed by silica gel flash chromatography (3 x 15 cm), EtOAc / hexane (1: 1)). Part of the material fell out on the column. After drying, 390 mg of pure product were obtained (1 mmol, 59%).
1 H-NMR (CDCl3 / MeOH): d 8.10 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.3-7.5 (cm, 3H), 7.1-7.25 (cm, 3H), 4.40 (cm, 4H, NCH 2 R), 1.65 (cm, 4H, NCH 2 CH 2 R), 1.36 (cm, 4H, NCH 2 CH 2 CH 2 CH 3 ), 0.90 (t, J = 7.3 Hz, 6H, methyl groups).

1-(1,3-Dibutylthiobarbiturat)-3-(1-butyl-3-(5-hydroxypentyl)-thiobarbiturat)-trimethinoxonol-triethylammoniumsalz (11): Verbindung (7) (85 mg, 297 μmol) wurde mit (10) (114 mg, 297 μmol) in 1,2 ml trockenem Pyridin gelöst und 17 Stunden gerührt. Ein DC (EtOAc/MeOH) zeigte 3 Oxonol-Hauptprodukte an. 80% des Reaktionsgemisches wurden mit konzentrierter HCl unter Bildung eines Niederschlags versetzt, filtriert und mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen wurden 220 mg eines roten Feststoffs erhalten. 96 mg dieses Feststoffs wurden mit 1–2 ml EtOAc gemischt und filtriert. Der verbliebene Feststoff wurde in CHCl3/MeOH (95:5) gelöst und auf eine Kieselgel-Säule (19 × 2,5 cm) aufgegeben. Nach dem Eluieren mit dem gleichen Lösungsmittel wurde der größte Teil des unpolaren Oxonols von der Säule gewaschen. Das Lösungsmittel wurde dann durch CHCl3/MeOH/Et3N (90:8:2) versetzt, um die mittlere Bande zu eluieren, die sich mittels NMR-Analyse als das gewünschte Produkt herausstellte. Nach dem Konzentrieren und Trocknen wurden 18,5 mg (28 μmol, 27%) des reinen Produkts erhalten.
1H-NMR (CDCl3): d 8,60 (t, J = 13,9 Hz, 1H, mittleres Methin), 8,14 (dd, J1 = 13,8 Hz, J2 = 2,2 Hz, 2H, Methine), 4,45 (cm, 8H, NCH2R), 3,66 (t, J = 6,3 Hz, 2H, RCH2OH), 3,20 (q, J = 7,3 Hz, 6H, Triethylammonium), 1,5-1,8 (cm, 8H, NCH2CH2R), 1,2-1,5 (cm, 10H, bulk Methylene), 1,35 (t, J = 7,3 Hz, 9H, Triethylammonium), 0,95 (t, J = 7,2 Hz, 9H, endständiges Methyl). MS.1- (1,3-Dibutylthiobarbiturate) -3- (1-butyl-3- (5-hydroxypentyl) thiobarbiturate) -trimethyoxonol triethylammonium salt (11): Compound (7) (85 mg, 297 μmol) was mixed with (10 ) (114 mg, 297 μmol) in 1.2 ml of dry pyridine and stirred for 17 hours. A TLC (EtOAc / MeOH) indicated 3 oxonol main products. Concentrated HCl was added to 80% of the reaction mixture to give a precipitate, filtered and washed with water. After drying, 220 mg of a red solid were obtained. 96 mg of this solid were mixed with 1-2 ml EtOAc and filtered. The residual solid was dissolved in CHCl 3 / MeOH (95: 5) and applied to a silica gel column (19 x 2.5 cm). After elution with the same solvent, most of the nonpolar oxonol was washed from the column. The solvent was then added by CHCl 3 / MeOH / Et 3 N (90: 8: 2) to elute the middle band, which was found to be the desired product by NMR analysis. After concentrating and drying, 18.5 mg (28 μmol, 27%) of the pure product were obtained.
1 H-NMR (CDCl 3 ): d 8.60 (t, J = 13.9 Hz, 1H, average methine), 8.14 (dd, J 1 = 13.8 Hz, J 2 = 2.2 Hz , 2H, methines), 4.45 (cm, 8H, NCH 2 R), 3.66 (t, J = 6.3 Hz, 2H, RCH 2 OH), 3.20 (q, J = 7.3 Hz, 6H, triethylammonium), 1.5-1.8 (cm, 8H, NCH 2 CH 2 R), 1.2-1.5 (cm, 10H, bulk methylenes), 1.35 (t, J = 7.3 Hz, 9H, triethylammonium), 0.95 (t, J = 7.2 Hz, 9H, terminal methyl). MS.

1-(1,3-Dibutylthiobarbiturat)-3-(1-butyl-3-(5-tosyloxypentyl)-thiobarbiturat)-trimethinoxonol (12): (11) (86,1 mg, 131 μmol) wurde in 4 ml Pyridin mit Tosylchlorid (333 mg, 1,75 mmol) gemischt. Das Reaktionsgemisch wurde 3,5 Stunden gerührt, bevor das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt wurde. Der Rückstand wurde in EtOAc gelöst und mit 1 M HCl und 2× mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Ein DC in EtOAc/MeOH (9:1) zeigte, daß der größte Teil des Ausgangsmaterials in ein eher unpolares Produkt umgewandelt wurde. Eine polare Oxonolverunreinigung war jedoch offensichtlich und das Material mußte weiter mit Flash-Chromatographie gereinigt werden. Die Säule wurde mit CHCl3/MeOH (97:3) beschickt. Es war erforderlich, die Polarität auf CHCl3/MeOH (92:8) zu erhöhen, um das Produkt von der Säule zu waschen. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und getrocknet, wobei 74,8 mg (102 μmol, 78%) des Produkts erhalten wurden.
1H-NMR (CDCl3): d 8,50 (t, 1H, mittleres Methin), 7,92 (dd, J1 = 14 Hz, J2 = 2 Hz, 2H, Methine), 7,81 (d, 2H, Tosyl), 7,35 (d, J = 8,2 Hz, 2H, Tosyl), 4,37 (cm, 8H, NCH2R), 4,09 (breites t, 2H, RCH2Ots), 2,45 (s, 3H, Tosylmethyl), 1,2-1,9 (nicht aufgelöstes cm, Bulk-Methylene), 0,91 (p, J = 7,2 Hz, 9H, endständiges Methyl).1- (1,3-dibutylthiobarbiturate) -3- (1-butyl-3- (5-tosyloxypentyl) thiobarbiturate) trimethine oxonol (12): (11) (86.1 mg, 131 μmol) was dissolved in 4 ml pyridine with tosyl chloride (333 mg, 1.75 mmol). The reaction mixture was stirred for 3.5 hours before the solvent was removed under reduced pressure. The residue was dissolved in EtOAc and washed with 1 M HCl and 2x with brine. A TLC in EtOAc / MeOH (9: 1) showed that most of the starting material was converted to a more non-polar product. However, polar oxonol contamination was evident and the material had to be further purified by flash chromatography. The column was charged with CHCl 3 / MeOH (97: 3). It was necessary to increase the polarity to CHCl 3 / MeOH (92: 8) to wash the product off the column. The fractions containing the desired product were combined and dried to give 74.8 mg (102 μmol, 78%) of the product.
1 H-NMR (CDCl 3 ): d 8.50 (t, 1H, intermediate methine), 7.92 (dd, J 1 = 14 Hz, J 2 = 2 Hz, 2H, methines), 7.81 (i.e. , 2H, tosyl), 7.35 (d, J = 8.2 Hz, 2H, tosyl), 4.37 (cm, 8H, NCH 2 R), 4.09 (broad t, 2H, RCH 2 Ots) , 2.45 (s, 3H, tosylmethyl), 1.2-1.9 (unresolved cm, bulk methylenes), 0.91 (p, J = 7.2Hz, 9H, terminal methyl).

BEISPIEL X – SYNTHESE VON FLUORESZIERENDEN LANTHANID-CHELATEN MIT EINER EINZELNEN NEGATIVEN LADUNGEXAMPLE X - SYNTHESIS OF FLUORESCENT LANTHANIDE CHELATES WITH A SINGLE NEGATIVE LOAD

Terbium(III)-bis-(N,N'-bis-(salicyliden)-ethylendiamin)-piperidiniumsalz, Hpip+ Tb(SALEN)2 –: N,N'-Bis-(salicyliden)-ethylendiamin (SALEN) (0,719 g, 2,68 mmol) wurde bei 60°C in 40 ml MeOH gelöst und mit Terbiumchloridhexahydrat (0,5 g, 1,34 mmol) in 1 ml Wasser versetzt. Anschließend wurde Piperidin (536 μl, 5,42 mmol) zugesetzt, worauf sich ein gelber Niederschlag bildete. Nach 1 Stunde wurde das Erhitzen eingestellt und das Reaktionsgemisch über Nacht gerührt. Der Feststoff wurde abfiltriert und getrocknet, wobei 709 mg (0,91 mmol, 68%) des gewünschten Komplexes erhalten wurden.
Elektrospray-MS (neg. Ion) [MeOH/H2O: 95/5] (Peak, rel. Int.) 691,2 (M–1, 100), berechnet M–1 = 691,5 amu.Terbium (III) bis (N, N'-bis (salicylidene) ethylenediamine) piperidinium salt, Hpip + Tb (SALEN) 2 - : N, N'-bis (salicylidene) ethylenediamine (SALEN) (0.719 g, 2.68 mmol) was dissolved at 60 ° C in 40 ml of MeOH and treated with terbium chloride hexahydrate (0.5 g, 1.34 mmol) in 1 ml of water. Subsequently, piperidine (536 μl, 5.42 mmol) was added, whereupon a yellow precipitate formed. After 1 hour, the heating was stopped and the reaction was stirred overnight. The solid was filtered off and dried to give 709 mg (0.91 mmol, 68%) of the desired complex.
Electrospray MS (Neg. Ion) [MeOH / H 2 O: 95/5] (Peak, Rel. Int.) 691.2 (M -1 , 100), Calculated M -1 = 691.5 amu.

Europium(III)-bis-(N,N'-bis-(salicyliden)-ethylendiamin)-piperidinium, Hpip+ Eu(SALEN)2 –: N,N'-Bis-(salicyliden)-ethylendiamin (SALEN) (0,360 g, 1,34 mmol) wurde bei 60°C in 40 ml MeOH und Piperidin (298 μl, 3,02 mmol) gelöst und mit Europiumchloridhexahydrat (0,246 g, 0,67 mmol) in 0,5 ml Wasser versetzt, worauf sich sofort ein gelber Niederschlag bildete. Nach 1 Stunde wurde das Erhitzen eingestellt und das Reaktionsgemisch für 2 Stunden stehengelassen. Der Feststoff wurde abfiltriert und getrocknet, wobei 341 mg (0,44 mmol, 66%) des gewünschten Komplexes erhalten wurden.Europium (III) bis- (N, N'-bis (salicylidene) -ethylenediamine) -piperidinium, Hpip + Eu (SALEN) 2 - : N, N'-bis- (salicylidene) -ethylenediamine (SALEN) (0.360 g, 1.34 mmol) was dissolved at 60 ° C in 40 ml of MeOH and piperidine (298 ul, 3.02 mmol) and treated with europium chloride hexahydrate (0.246 g, 0.67 mmol) in 0.5 ml of water, whereupon immediately made a yellow precipitate. After 1 hour, the heating was stopped and the reaction mixture allowed to stand for 2 hours. The solid was filtered off and dried to give 341 mg (0.44 mmol, 66%) of the desired complex.

Die vorstehende Erfindung wurde anhand von Erläuterungen und Beispielen zum Zwecke der Klarheit und Verständnis genauer beschrieben. Für den Fachmann wird es naheliegend sein, dass Veränderungen und Modifikationen in den Umfang der anhängenden Patentansprüche fallen. Die vorstehende Beschreibung soll daher zur Veranschaulichung dienen und nicht beschränkend sein. Der Umfang der Erfindung sollte daher nicht nur unter Bezugnahme auf die Beschreibung bestimmt werden, sondern auch unter Bezugnahme der folgenden anhängenden Patentansprüche zusammen mit den umfassenden Äquivalenten die in die Patentansprüche fallen.The foregoing invention has been described in more detail by way of illustration and examples for purposes of clarity and understanding. It will be obvious to those skilled in the art that changes and modifications are within the scope of the appended claims. The foregoing description is therefore intended to be illustrative and not restrictive. The scope of the invention should, therefore, be determined not only with reference to the description, but also with reference to the following appended claims, together with the broad equivalents falling within the claims.

Claims (20)

System zur Bestimmung des elektrischen Potentials über einer Membran umfassend: a) eine Anregungslichtquelle zur Fluoreszenzanregung, b) einen Detektor zur Emissionsmessung, c) ein erstes Reagenz umfassend: ein hydrophobes fluoreszierendes Ion, das zur Umverteilung von einer Seite einer Membran zu einer zweiten Seite dieser Membran als Antwort auf ein Potential über diese Membran fähig ist, und d) ein zweites Reagenz, das ein Chromophor umfasst und einen Energietransfer mit dem ersten Reagenz durchmacht oder die Fluoreszenz des ersten Reagenz löscht, wobei die ersten und zweiten Reagenzien nicht durch eine Linkergruppe verbunden sind.System for determining the electrical potential across a membrane comprising: a) an excitation light source for fluorescence excitation, b) a detector for emission measurement, c) a first reagent comprising: a hydrophobic fluorescent ion capable of redistributing from one side of a membrane to a second side of said membrane in response to a potential across that membrane, and d) a second reagent comprising a chromophore undergoing energy transfer with the first reagent or quenching the fluorescence of the first reagent, wherein the first and second reagents are not linked by a linker group. System nach Anspruch 1, weiter umfassend einen Detektor zur Emisssionsdetektion von Doppelwellenlängen.The system of claim 1, further comprising a detector for emission detection of dual wavelengths. Detektor nach Anspruch 2, worin der Detektor weiter einen Photomultiplier zur Lichtemissionsdetektion bei einer bestimmten Wellenlänge umfasst.The detector of claim 2, wherein the detector further comprises a photomultiplier for light emission detection at a particular wavelength. System nach Anspruch 1, weiter umfassend Optiken zur konfokalen Detektion.The system of claim 1 further comprising optics for confocal detection. System nach Anspruch 1, weiter umfassend eine Zelle.The system of claim 1, further comprising a cell. System nach Anspruch 5, wobei die Zelle eine eukaryontische Zelle ist.The system of claim 5, wherein the cell is a eukaryotic cell. System nach Anspruch 5, wobei die Zelle mit einer Spannungsklemme versehen ist.The system of claim 5, wherein the cell is provided with a voltage clamp. System nach Anspruch 5, wobei die Zelle mindestens einen exogenen Ionenkanal, Transporter, Pumpe oder Austauscher umfasst.The system of claim 5, wherein the cell comprises at least one exogenous ion channel, transporter, pump or exchanger. System nach Anspruch 5, wobei sich die Zelle in einer Platte mit mehreren Vertiefungen befindet.The system of claim 5, wherein the cell is in a multi-well plate. System nach Anspruch 1, worin das erste Reagenz ein Oxonol umfasst.The system of claim 1, wherein the first reagent comprises an oxonol. System nach Anspruch 10, worin das Oxonol die allgemeine Formel (I) hat:
Figure 00680001
worin: R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, Hydrocarbyl und Heteroalkyl; X Sauerstoff oder Schwefel ist; und n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; und Salze davon.The system of claim 10, wherein the oxonol has the general formula (I):
Figure 00680001
wherein: R is independently selected from the group consisting of H, hydrocarbyl and heteroalkyl; X is oxygen or sulfur; and n is an integer of 1 to 3; and salts thereof. System nach Anspruch 11, worin X Schwefel ist.The system of claim 11, wherein X is sulfur. System nach Anspruch 12, worin R eine C4-40-Alkylgruppe, vorzugsweise eine C5-20-Alkylgruppe ist.The system of claim 12 wherein R is a C 4-40 alkyl group, preferably a C 5-20 alkyl group. System nach Anspruch 1, worin das zweite Reagenz ein grün fluoreszierendes Protein umfasst.The system of claim 1, wherein the second reagent comprises a green fluorescent protein. System nach Anspruch 1, worin das zweite Reagenz ein fluoreszent markiertes Protein umfasst.The system of claim 1, wherein the second reagent comprises a fluorescently labeled protein. System nach Anspruch 1, worin das zweite Reagenz ein Cumarin umfasst.The system of claim 1, wherein the second reagent comprises a coumarin. System zur Bestimmung des elektrischen Potentials über einer Membran umfassend: a) eine Anregungslichtquelle zur Fluoreszenzanregung, b) einen Detektor zur Emissionsmessung, c) ein erstes Reagenz umfassend: ein hydrophobes fluoreszierendes Ion, das zur Umverteilung von einer Seite einer Membran zu einer zweiten Seite dieser Membran als Antwort auf ein Potential über diese Membran fähig ist, und d) ein zweites Reagenz, das ein Chromophor umfasst und einen Energietransfer mit dem ersten Reagenz durchmacht oder die Fluoreszenz des ersten Reagenz löscht, wobei das zweite Reagenz ein grün fluoreszierendes Protein, ein fluoreszent markiertes Protein oder ein Cumarin umfasst.System for determining the electrical potential across a membrane comprising: a) an excitation light source for fluorescence excitation, b) a detector for emission measurement, c) a first reagent comprising: a hydrophobic fluorescent ion capable of redistributing from one side of a membrane to a second side of said membrane in response to a potential across that membrane, and d) a second reagent comprising a chromophore undergoing energy transfer with the first reagent or quenching the fluorescence of the first reagent, wherein the second reagent comprises a green fluorescent protein, a fluorescently labeled protein or a coumarin. System nach Anspruch 14 oder 17, worin das grün fluoreszierende Protein Membran-assoziiert ist.The system of claim 14 or 17, wherein the green fluorescent protein is membrane-associated. System nach Anspruch 16 oder 17, worin das Cumarin ein Lipid umfasst.The system of claim 16 or 17, wherein the coumarin comprises a lipid. System nach Anspruch 19, worin das Cumarin, das ein Lipid umfasst, ein Cou-Lipid ist, worin:
Figure 00690001
oder
Figure 00700001
aufweist, worin: jeweils R3, das gleich oder unterschiedlich sein kann, unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, Halogen, C1-6-Alkyl, CN, CF3, COOR5, CON(R5)2, OR5 und einem Verknüpfungspunkt für ein Lipid; R4 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus OR5 und N(R5)2; Z O, S oder NR5 ist; und jeweils R5, das gleich oder unterschiedlich sein kann, unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, C1-6-Alkyl und einem Verknüpfungspunkt für ein Lipid.The system of claim 19, wherein the coumarin comprising a lipid is a co-lipid, wherein:
Figure 00690001
or
Figure 00700001
wherein each R 3 , which may be the same or different, is independently selected from the group consisting of H, halo, C 1-6 alkyl, CN, CF 3 , COOR 5 , CON (R 5 ) 2 , OR 5 and a point of attachment for a lipid; R 4 is selected from the group consisting of OR 5 and N (R 5 ) 2 ; Z is O, S or NR 5 ; and each R 5 , which may be the same or different, is independently selected from the group consisting of H, C 1-6 alkyl and a point of attachment for a lipid.
DE69635193T 1995-06-07 1996-06-06 System for measuring the electrical potential through a membrane Expired - Lifetime DE69635193T3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/481,977 US5661035A (en) 1995-06-07 1995-06-07 Voltage sensing by fluorescence resonance energy transfer
US481977 1995-06-07

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DE69635193D1 DE69635193D1 (en) 2005-10-20
DE69635193T2 DE69635193T2 (en) 2006-01-19
DE69635193T3 true DE69635193T3 (en) 2011-03-10

Family

ID=23914150

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69605041T Expired - Lifetime DE69605041T3 (en) 1995-06-07 1996-06-06 DETECTION OF TRANSMEMBRANE POTENTIALS BY OPTICAL METHODS
DE69635193T Expired - Lifetime DE69635193T3 (en) 1995-06-07 1996-06-06 System for measuring the electrical potential through a membrane

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69605041T Expired - Lifetime DE69605041T3 (en) 1995-06-07 1996-06-06 DETECTION OF TRANSMEMBRANE POTENTIALS BY OPTICAL METHODS

Country Status (11)

Country Link
US (2) US5661035A (en)
EP (3) EP0977035B2 (en)
JP (2) JP4033899B2 (en)
AT (2) ATE186400T1 (en)
AU (1) AU716130B2 (en)
CA (1) CA2223927C (en)
DE (2) DE69605041T3 (en)
DK (1) DK0834074T4 (en)
ES (1) ES2140870T5 (en)
HK (1) HK1090422A1 (en)
WO (1) WO1996041166A2 (en)

Families Citing this family (103)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6028190A (en) 1994-02-01 2000-02-22 The Regents Of The University Of California Probes labeled with energy transfer coupled dyes
US6008373A (en) 1995-06-07 1999-12-28 Carnegie Mellon University Fluorescent labeling complexes with large stokes shift formed by coupling together cyanine and other fluorochromes capable of resonance energy transfer
US5661035A (en) * 1995-06-07 1997-08-26 The Regents Of The University Of California Voltage sensing by fluorescence resonance energy transfer
US6596522B2 (en) * 1997-05-08 2003-07-22 The Regents Of The University Of California Detection of transmembrane potentials by optical methods
US6342379B1 (en) * 1995-06-07 2002-01-29 The Regents Of The University Of California Detection of transmembrane potentials by optical methods
US7388092B2 (en) 1996-05-03 2008-06-17 Applera Corporation Oligonucleotides and analogs labeled with energy transfer dyes
US5945526A (en) 1996-05-03 1999-08-31 Perkin-Elmer Corporation Energy transfer dyes with enhanced fluorescence
US6593135B2 (en) * 1996-08-16 2003-07-15 The State Of Oregon, Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of The University Of Oregon Long wavelength engineered fluorescent proteins
AT405103B (en) * 1996-10-16 1999-05-25 Avl Verbrennungskraft Messtech SENSOR LAYER FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF AT LEAST ONE CHEMICAL COMPONENT OF A GASEOUS OR LIQUID SAMPLE
FR2756633B1 (en) * 1996-11-29 1999-01-15 Centre Nat Rech Scient IN VITRO DETECTION METHOD FOR MITOCHONDRIAL TRANSMEMBRANE POTENTIAL
US6342345B1 (en) 1997-04-02 2002-01-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Detection of molecular interactions by reporter subunit complementation
FR2764387B1 (en) * 1997-06-05 1999-07-23 Centre Nat Rech Scient USE OF A FLUORESCENT PROTEIN FOR THE DETECTION OF INTERACTIONS BETWEEN A TARGET PROTEIN AND ITS LIGAND
US6221612B1 (en) 1997-08-01 2001-04-24 Aurora Biosciences Corporation Photon reducing agents for use in fluorescence assays
US6214563B1 (en) 1997-08-01 2001-04-10 Aurora Biosciences Corporation Photon reducing agents for reducing undesired light emission in assays
US6200762B1 (en) 1997-08-01 2001-03-13 Aurora Biosciences Corporation Photon reducing agents and compositions for fluorescence assays
US6348322B1 (en) * 1997-10-17 2002-02-19 Duke University Method of screening for specific binding interactions
US7244349B2 (en) * 1997-12-17 2007-07-17 Molecular Devices Corporation Multiaperture sample positioning and analysis system
JP2002502859A (en) * 1998-02-05 2002-01-29 メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド Novel GABAB receptor DNA sequence
US6388788B1 (en) 1998-03-16 2002-05-14 Praelux, Inc. Method and apparatus for screening chemical compounds
US20030036855A1 (en) * 1998-03-16 2003-02-20 Praelux Incorporated, A Corporation Of New Jersey Method and apparatus for screening chemical compounds
US6083486A (en) * 1998-05-14 2000-07-04 The General Hospital Corporation Intramolecularly-quenched near infrared fluorescent probes
US6592847B1 (en) 1998-05-14 2003-07-15 The General Hospital Corporation Intramolecularly-quenched near infrared flourescent probes
AU4188599A (en) * 1998-05-15 1999-12-06 Geron Corporation Method and apparatus for detecting hazardous agents
US5998146A (en) * 1998-07-17 1999-12-07 Wallac Oy Homogeneous luminescence assay method based on energy transfer
US6420130B1 (en) * 1998-12-14 2002-07-16 Aurora Biosciences Corporation Optical molecular sensors for cytochrome P450 activity
WO2000035900A1 (en) * 1998-12-14 2000-06-22 Aurora Biosciences Corporation Optical molecular sensors for cytochrome p450 activity
US8148110B2 (en) 1999-03-15 2012-04-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Detection of molecular interactions by β-lactamase reporter fragment complementation
US6285909B1 (en) 1999-05-27 2001-09-04 Cardiac Pacemakers, Inc. Preserving patient specific data in implantable pulse generator systems
US6662039B2 (en) * 1999-06-18 2003-12-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Optical probing of neuronal connections with fluorescent indicators
US6323039B1 (en) 1999-06-22 2001-11-27 Mitokor Compositions and methods for assaying subcellular conditions and processes using energy transfer
CA2375542A1 (en) * 1999-06-22 2000-12-28 James A. Dykens Compositions and methods for assaying subcellular conditions and processes energy transfer
CA2379580A1 (en) * 1999-07-20 2001-01-25 Merck & Co., Inc. Novel human calcium sensitive potassium channel subunits
US6358684B1 (en) 1999-08-27 2002-03-19 Pe Corporation UV excitable fluorescent energy transfer dyes
DE69915468T2 (en) * 1999-09-01 2005-01-20 Invitrogen Corp., Carlsbad Photon damper for fluorescence assays
US6468763B1 (en) 1999-09-29 2002-10-22 Caliper Technologies Corp. Optical detection of transmembrane potential changes
AU783191B2 (en) * 1999-10-08 2005-10-06 Caliper Life Sciences, Inc. Use of nernstein voltage sensitive dyes in measuring transmembrane voltage
US6740466B1 (en) * 1999-11-15 2004-05-25 Fuji Photo Film Co., Ltd. Photopolymerizable composition and recording material using the same
GB0003069D0 (en) * 2000-02-11 2000-03-29 Cambridge Drug Discovery Ltd Improved assay
US6287758B1 (en) * 2000-03-23 2001-09-11 Axiom Biotechnologies, Inc. Methods of registering trans-membrane electric potentials
JP2004500119A (en) 2000-03-31 2004-01-08 メルク　エンド　カムパニー　インコーポレーテッド Derma center valabilis GABA-dependent chloride channel
US7615356B2 (en) 2000-07-10 2009-11-10 Vertex Pharmaceuticals (San Diego) Llc Ion channel assay methods
DE60143064D1 (en) * 2000-07-10 2010-10-21 Vertex Pharma San Diego Llc Ion channel assays
US7312043B2 (en) * 2000-07-10 2007-12-25 Vertex Pharmaceuticals (San Diego) Llc Ion channel assay methods
JP5603850B2 (en) * 2000-07-10 2014-10-08 ヴァーテックス ファーマシューティカルズ （サンディエゴ）エルエルシー Ion channel assay
JP2004531691A (en) * 2000-11-22 2004-10-14 アラーガン、インコーポレイテッド High-throughput screen to identify channel blockers that selectively discriminate between transient and persistent sodium channels
US7383076B2 (en) * 2000-11-27 2008-06-03 The General Hospital Corporation Fluorescence-mediated molecular tomography
US20030044353A1 (en) * 2001-01-05 2003-03-06 Ralph Weissleder Activatable imaging probes
US20030211575A1 (en) * 2001-02-07 2003-11-13 Swartz Kenton J. Constituitively open voltage-gated kand methods for discovering modulators thereof
US7005511B2 (en) 2001-02-26 2006-02-28 The Regents Of The University Of California Fluorescent protein variants and methods for making same
CA2441366A1 (en) * 2001-03-24 2002-10-03 Aviva Biosciences Corporation Biochips including ion transport detecting structures and methods of use
US20050058990A1 (en) * 2001-03-24 2005-03-17 Antonio Guia Biochip devices for ion transport measurement, methods of manufacture, and methods of use
US20050009004A1 (en) * 2002-05-04 2005-01-13 Jia Xu Apparatus including ion transport detecting structures and methods of use
US20060029955A1 (en) * 2001-03-24 2006-02-09 Antonio Guia High-density ion transport measurement biochip devices and methods
US20040146849A1 (en) * 2002-01-24 2004-07-29 Mingxian Huang Biochips including ion transport detecting structures and methods of use
US20050196746A1 (en) * 2001-03-24 2005-09-08 Jia Xu High-density ion transport measurement biochip devices and methods
US7060292B2 (en) * 2001-06-09 2006-06-13 Gesynthesis, Inc. Lipid structures and uses thereof
DE10130172A1 (en) * 2001-06-22 2003-01-09 Evotec Ag New oxonol derivatives, used as fluorescent dyes for detecting cell membrane potential, especially in high throughput screening, are optionally bridged alpha,omega-bis-barbitur-5-yl-mono- and poly-methine compounds
FR2826666B1 (en) * 2001-07-02 2004-07-02 Novaleads METHOD FOR SELECTING BIO-ACTIVE AGENTS BY LUMINESCENCE COUPLING AND LIVING CELLULAR SYSTEM FOR CARRYING OUT SAID METHOD
EP1425065A4 (en) * 2001-07-12 2004-12-15 Merck & Co Inc Electrical field stimulation of eukaryotic cells
US7361478B2 (en) 2001-11-20 2008-04-22 Allergan, Inc. High-throughput screen for identifying selective persistent sodium channels channel blockers
US20070197583A1 (en) * 2002-03-29 2007-08-23 Welsh Michael J Novel compositions and methods for modulation of the acid-sensing ion channel (ASIC) for the treatment of anxiety and drug addiction
US20030186860A1 (en) * 2002-03-29 2003-10-02 Welsh Michael J. Novel compositions and methods for modulating the acid-sensing ion channel (ASIC)
US20050181464A1 (en) * 2002-04-04 2005-08-18 Affinium Pharmaceuticals, Inc. Novel purified polypeptides from bacteria
EP1501924A4 (en) * 2002-05-04 2006-05-24 Aviva Biosciences Corp Apparatus including ion transport detecting structures and methods of use
US20030228566A1 (en) * 2002-06-11 2003-12-11 Biotechplex Corporation Method of and apparatus for screening for drug candidates
US7427489B1 (en) * 2002-06-17 2008-09-23 The Scripps Research Institute Screening assay to identify modulators of the sleep/wake cycle
EP1560915B1 (en) * 2002-10-10 2009-03-04 Merck & Co., Inc. Assay methods for state-dependent calcium channel agonists/antagonists
US20050037364A1 (en) * 2003-08-13 2005-02-17 International Business Machines Corporation Techniques for recording signals
US7125908B2 (en) * 2003-08-29 2006-10-24 Allergan, Inc. Treating pain using selective antagonists of persistent sodium current
US7060723B2 (en) 2003-08-29 2006-06-13 Allergan, Inc. Treating neurological disorders using selective antagonists of persistent sodium current
US8329390B2 (en) * 2004-10-21 2012-12-11 Anaspec Incorporated Detection of transmembrane potentials using N,N,N′-trialkyl thiobarbituric acid-derived polymethine oxonols
JP2008524633A (en) 2004-12-21 2008-07-10 セダーズ−シナイ メディカル センター Methods for drug screening and characterization by ion flux analysis
FR2890174B1 (en) * 2005-08-30 2009-04-24 Cis Bio Internat Sa METHOD FOR THE DEMONSTRATION OF A BIOLOGICAL PROCESS BY MEASURING FREIGHT
US7998749B2 (en) * 2005-10-12 2011-08-16 Allergan, Inc. Assays of molecular or subcellular interactivity using depolarization after resonance transfer energy (DARET)
WO2007122602A1 (en) * 2006-04-26 2007-11-01 Seng Enterprises Ltd. A method and system for measuring membrane potential based on fluorescence polarization
US9006283B2 (en) * 2007-07-12 2015-04-14 Acumen Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying amyloid β oligomers using non-peptidic compounds
US20110098309A1 (en) * 2007-07-12 2011-04-28 Acumen Pharmaceuticals, Inc. Methods of inhibiting the formation of amyloid-beta diffusable ligands using acylhydrazide compounds
US8962677B2 (en) 2007-07-12 2015-02-24 Acumen Pharmaceuticals, Inc. Methods of restoring cognitive ability using non-peptidic compounds
ES2658852T3 (en) * 2008-01-18 2018-03-12 Visen Medical, Inc. Fluorescent Imaging Agents
US20090291150A1 (en) * 2008-05-21 2009-11-26 University Of Iowa Research Foundation Method and compositions for treating and preventing seizures by modulating acid-sensing ion channel activity
WO2010068747A1 (en) 2008-12-12 2010-06-17 University Of Florida Research Foundation, Inc. Cell-based detection of apf through its interaction with ckap4 for diagnosis of interstitial cystitis
WO2010117420A2 (en) * 2009-03-30 2010-10-14 Pacific Biosciences Of California, Inc. Fret-labeled compounds and uses therefor
US9222043B2 (en) * 2009-09-22 2015-12-29 Authentix, Inc. Dipyrromethenes and azadipyrromethenes as markers for petroleum products
CA2838330C (en) 2010-08-23 2021-01-26 President And Fellows Of Harvard College Optogenetic probes for measuring membrane potential
US9207237B2 (en) 2010-08-23 2015-12-08 President And Fellows Of Harvard College Systems, methods, and workflows for optogenetics analysis
WO2013130808A1 (en) 2012-02-29 2013-09-06 D.E. Shaw Research, Llc Methods for screening voltage gated proteins
WO2014005125A2 (en) * 2012-06-29 2014-01-03 Biotium, Inc. Fluorescent compounds and uses thereof
KR101933620B1 (en) * 2012-09-18 2018-12-28 삼성전자주식회사 Compositions and kits for detecting a vesicle, and methods for analyzing the vesicle using the same
CN105143885B (en) 2012-12-11 2019-07-12 通用电气医疗集团生物科学公司 The photosensitizer chemical bleaching of dyestuff
EP3000848B1 (en) 2013-05-23 2017-10-25 Keio University Compound for generating second harmonic of light, dye composition for generating second harmonic of light, and cell examination method
US8933239B1 (en) 2013-07-16 2015-01-13 Dow Global Technologies Llc Bis(aryl)acetal compounds
US8962779B2 (en) 2013-07-16 2015-02-24 Dow Global Technologies Llc Method of forming polyaryl polymers
US9410016B2 (en) 2013-07-16 2016-08-09 Dow Global Technologies Llc Aromatic polyacetals and articles comprising them
US9063420B2 (en) 2013-07-16 2015-06-23 Rohm And Haas Electronic Materials Llc Photoresist composition, coated substrate, and method of forming electronic device
WO2015195769A2 (en) 2014-06-18 2015-12-23 President And Fellows Of Harvard College Optogenetic probes for measuring membrane potential
CN104357045B (en) * 2014-11-05 2016-06-01 北京化工大学 There is synthetic method and the application thereof of the spiro-pyrans small-molecule fluorescent probe of extremely acid/pole alkali switching response
US10077463B2 (en) 2015-01-15 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College Optical selection of cells
US11536716B2 (en) * 2015-06-25 2022-12-27 Hoffmann-La Roche Inc. Cell based assay for determining antibody or ligand binding and function
US11332484B2 (en) 2017-03-02 2022-05-17 Akita Innovations Llc Voltage sensitive dyes
WO2019212946A1 (en) 2018-04-30 2019-11-07 Ribon Therapeutics Inc. Screening methods for parp modulators
MX2021000644A (en) 2018-07-18 2021-08-19 Manzanita Pharmaceuticals Inc Conjugates for delivering an anti-cancer agent to nerve cells, methods of use and methods of making thereof.
RU197959U1 (en) * 2020-01-28 2020-06-09 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "МИРЭА - Российский технологический университет" DEVICE FOR RESEARCH OF SUBSTANCE COMPONENTS USING MICROWAVE PLASMA BY OPTICAL AND NMR SPECTROSCOPY METHODS
WO2022008720A1 (en) * 2020-07-10 2022-01-13 Life & Brain Gmbh Novel hybrid optical voltage sensors

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1597482B2 (en) * 1967-09-22 1977-03-24 Agfa-Gevaert Ag, 5090 Leverkusen LIGHTSENSITIVE PHOTOGRAPHIC RECORDING MATERIAL CONTAINING ANTI-HALATION OR FILTER DYES
JPS59218956A (en) * 1983-05-27 1984-12-10 Fujirebio Inc Membrane fusion measurement method
ES8607563A1 (en) * 1983-10-13 1986-06-01 Univ Georgia Res Found Bioluminescent immunoassays.
US4647531A (en) * 1984-02-06 1987-03-03 Ortho Diagnostic Systems, Inc. Generalized cytometry instrument and methods of use
US4861727A (en) * 1986-09-08 1989-08-29 C. R. Bard, Inc. Luminescent oxygen sensor based on a lanthanide complex
US4900934A (en) * 1987-07-15 1990-02-13 University Of Utah Apparatus for simultaneous visualization and measurement of fluorescence from fluorescent dye-treated cell preparations and solutions
AT393035B (en) * 1989-04-25 1991-07-25 Avl Verbrennungskraft Messtech METHOD FOR QUANTITATIVELY DETERMINING AT LEAST ONE CHEMICAL PARAMETER OF A SAMPLE MEDIUM
US5169788A (en) * 1989-06-09 1992-12-08 New England Deaconess Hospital Corporation Methods of measuring membrane potential using j-aggregate forming dyes
DE59005928D1 (en) * 1989-11-21 1994-07-07 Bayer Ag Optical biosensor.
US5244813A (en) * 1991-01-25 1993-09-14 Trustees Of Tufts College Fiber optic sensor, apparatus, and methods for detecting an organic analyte in a fluid or vapor sample
DE4121426A1 (en) * 1991-06-28 1993-01-14 Basf Ag CHEMICAL SENSOR
CA2087412A1 (en) * 1992-01-17 1993-07-18 Joseph R. Lakowicz Ph and pco2 sensing by luminescent lifetimes and energy transfer
WO1995008637A1 (en) * 1993-09-21 1995-03-30 Washington State University Research Foundation Immunoassay comprising ligand-conjugated, ion channel receptor immobilized in lipid film
GB9406464D0 (en) * 1994-03-31 1994-05-25 British Tech Group Assay for determining biochemical changes at phospholipid bilayer membrane surfaces
US5661035A (en) * 1995-06-07 1997-08-26 The Regents Of The University Of California Voltage sensing by fluorescence resonance energy transfer

Also Published As

Publication number Publication date
AU6264396A (en) 1996-12-30
JP2004231666A (en) 2004-08-19
EP0977035B1 (en) 2005-09-14
DE69635193D1 (en) 2005-10-20
EP1610126B1 (en) 2014-04-30
ES2140870T5 (en) 2006-04-16
US6107066A (en) 2000-08-22
DE69605041T3 (en) 2006-09-21
EP0977035A3 (en) 2000-03-01
DE69605041D1 (en) 1999-12-09
ATE186400T1 (en) 1999-11-15
EP0834074A1 (en) 1998-04-08
EP1610126A1 (en) 2005-12-28
WO1996041166A3 (en) 1997-05-15
JP4064945B2 (en) 2008-03-19
CA2223927A1 (en) 1996-12-19
CA2223927C (en) 2004-04-06
DK0834074T3 (en) 2000-04-03
WO1996041166A2 (en) 1996-12-19
DE69635193T2 (en) 2006-01-19
EP0977035B2 (en) 2010-07-21
JP4033899B2 (en) 2008-01-16
HK1090422A1 (en) 2006-12-22
ES2140870T3 (en) 2000-03-01
ATE304706T1 (en) 2005-09-15
EP0834074B1 (en) 1999-11-03
EP0834074B2 (en) 2005-11-16
DE69605041T2 (en) 2000-03-16
JPH11508355A (en) 1999-07-21
AU716130B2 (en) 2000-02-17
DK0834074T4 (en) 2005-12-12
US5661035A (en) 1997-08-26
EP0977035A2 (en) 2000-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69635193T3 (en) System for measuring the electrical potential through a membrane
US7687282B2 (en) Detection of transmembrane potentials by optical methods
US7118899B2 (en) Detection of transmembrane potentials by optical methods
Gonzalez et al. Voltage sensing by fluorescence resonance energy transfer in single cells
DE3881735T2 (en) Diagnostic fluorescence test, test components and conjugates.
US10370351B2 (en) Photoinduced electron transfer voltage-sensitive compounds
KR20250023376A (en) Polymeric tandem dyes having spacing linker groups
CA2458360C (en) Detection of transmembrane potentials by optical methods
DE69929051T2 (en) LANTHANIDECHELATE OF CINOXACIN AND ITS USE AS BIOMOLECULAR SAMPLE
AU760738B2 (en) Detection of transmembrane potentials by optical methods
EP0613880A1 (en) Agent and method for the immunological determination of Diphenhydramine and its metabolites
Klier Development of Strategies for Targeting Voltage-Sensitive Fluorescent Dyes to Subcellular Organelles

Legal Events

Date Code Title Description
8363 Opposition against the patent
8366 Restricted maintained after opposition proceedings