DE69634248T2

DE69634248T2 - Zusammensetzungen zur verbesserung der verdaulichkeit und ausnutzung von nähestoffen

Info

Publication number: DE69634248T2
Application number: DE69634248T
Authority: DE
Inventors: Lodewijk Simon SCHARPE
Original assignee: Medzyme NV
Current assignee: Medzyme NV
Priority date: 1995-05-31
Filing date: 1996-05-31
Publication date: 2006-01-12
Anticipated expiration: 2016-06-01
Also published as: US6051220A; DE69634248D1; EP0828509A1; ATE287725T1; CA2222682A1; WO1996038170A1; EP0828509B1; ES2236738T3; AU6221496A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung für die Verbesserung der Verdaulichkeit und Verwertung von Nährstoffen. Die Erfindung betrifft ebenso die Verwendung von pilzartiger säurestabiler Amylase und säurestabiler Lipase für die Behandlung klinischer Zustände, die mit einer unzureichenden Verdauungsfunktion wie zum Beispiel exokriner Pankreasinsuffizienz verbunden sind, und bei der Herstellung dieser Zusammensetzungen.
Die Effizienz, mit der Nährstoffe vom menschlichen und tierischen Körper absorbiert (und damit verwertet) werden, hängt unter anderem von der Effizienz der Verdauung ab. Die Verdauung wird unter anderem durch verschiedene Enzyme vermittelt, die spezielle Funktionen an verschiedenen Orten im Verdauungstrakt haben. Eine Schwächung der Aktivität dieser Enzyme wird einen Einfluss auf den Abbau der Nahrungsbestandteile und konsequenterweise auf die Aufnahme von Nährstoffen haben. Eine verschlechterte Aufnahme wird unter anderem zu verringertem Wachstum führen.
Im gesamten Verdauungsprozess spielt die Pankreas (Bauchspeicheldrüse) eine wichtige Rolle. Sie sondert einen Sekret mit zwei Hauptkomponenten, einem alkalischen Fluid und Enzymen, in das Duodenum ab. Die zwei Komponenten treten abhängig von der Anregung in variablen Verhältnissen auf. Die alkalische Fluidkomponente, die in ihrem Volumen von 200–800 ml/Tag reicht, hat eine hohe Konzentration an Bicarbonat, welches den Mageninhalt, der in das Duodenum eintritt, neutralisiert und hilft den pH des Darmtraktes zu regulieren.
Die Enzyme des Pankreassekretes werden von den Drüsenzellen, die ebenfalls ein Fluid absondern, das in seiner elektrolytischen Zusammensetzung einem Ultrafiltrat von Plasma ähnlich ist, synthetisiert und abgesondert. Bei unregelmäßigen Essern, wie dem Menschen, Hund und Katze, ist das Volumen des von den Drüsenzellen abgesonderten Fluids sehr klein, und es hat wenig Auswirkung auf das Volumen und die Zusammensetzung des Pankreassekretes, das in den Hauptgang der Pankreas fließt.
Das Pankreassekret enthält vier Hauptenzymgruppen: lipolytische, proteolytische, amylolytische und Nukleinsäurespaltende Enzyme. Diese Pankreasenzyme, von denen einige in mehrfacher Form abgesondert werden, besitzen Spezifitäten, die die an die Intestinalmembran gebundenen Enzyme ergänzen. Frisches, nicht-kontaminiertes Pankreassekret ist ohne proteolytische Aktivität, da diese Enzyme in der Form inaktiver Zymogene vorliegen. Ein wichtiger Teil des Calciums im Pankreassekret begleitet die Enzyme, insbesondere Alpha-Amylase. Das menschliche Pankreassekret ist in Bezug auf andere Säugetiere mit einem hohen Gehalt an Lipase und Alpha-Amylase dem des Schweins sehr ähnlich [1]. Deshalb war der Extrakt des Schweinepankreas, Pankreatin genannt, bis jetzt die bevorzugte Enzymquelle für die therapeutische exokrine Pankreassubstitution.
Die Hauptgruppen von Patienten, die die Bereitstellung von Verdauungsenzymen benötigen, sind die mit erworbener chronischer Pankreatitis, meistens neben Alkoholismus, Kinder und Erwachsene mit zystischer Fibrose und Patienten mit Pankreaskarzinomen. Exokrine Pankreasinsuffizienz tritt bei der Mehrzahl der Patienten mit zystischer Fibrose auf, was zu chronischem Fettdurchfall und einer großen Häufigkeit eines Zustandes der Unterernährung führt, was mit einer ernsten Lungenerkrankung und ebenso mit Morbidität und Mortalität verbunden ist [2].
Das letztendliche Ziel der exokrinen Pankreassubstitutionstherapie ist es, die Fehlabsorption zu eliminieren und eine angemessene Ernährung aufrechtzuerhalten. Die Behandlung exokriner Insuffizienz der Pankreas sollte relativ einfach sein, indem man ein Extrakt von Säugetierpankreas wie zum Beispiel Schweinepankreas verabreicht. Unglücklicherweise hat sich herausgestellt, dass eine angemessene Behandlung schwierig Handzuhaben ist und es ist über große Variationen bezüglich des Ausmaßes der Pankreasenzymsubstitution berichtet worden, ungeachtet der Verfügbarkeit wirksamer Extrakte der Schweinepankreas und der häufigen Einnahme sehr hohen Dosen. Probleme, die diesen Pankreaszubereitungen selbst anhaften sowie Besonderheiten der Umgebung, in welcher diese Enzyme arbeiten sollen, müssen beachtet werden [3].
Die Verdauung im Magen durch gastrische Lipase [4] ist bei Patienten mit exokriner Pankreasinsuffizienz nicht beeinträchtigt. Für die Vervollständigung der Verdauung im Duodenum muss der Gehalt an Magensäure mittels pankreatischem Bicarbonat auf einen wesentlich höheren pH-Wert gebracht werden, da sich der optimale pH der meisten Pankreasenzyme im Bereich zwischen 6 und 9 befindet (1). Dieser Anstieg des pH verändert ebenso das physikalische Verhalten der Fettsäuren. Diese werden teilweise ionisiert, wandern an die Grenzfläche der emulgierten Lipidteilchen und vermitteln zusammen mit Gallesalzen, Phospholipiden und Cholesterol die Lipidauflösung.
Ein Mangel an pankreatischer Bicarbonatabsonderung beeinträchtigt jedoch bei exokriner Pankreasinsuffizienz diese Neutralisation des pH's. Als Ergebnis kann der postprandiale Duodenal-pH sowohl bei chronischer Pankreatitis als auch zystischer Fibrose unterhalb eines pH von 5 bleiben (2). Dieser niedrige Duodenal-pH kann die Leistung der Substitutionstherapie mit Pankreatin auf verschiedenartigste Weise verringern.
Wenn Pankreatin in der einen oder anderen galenischen Formulierung an Patienten verabreicht wird, wird es mit dem Nahrungsmittel vermischt und leistet eine gewisse Verdauung im Magen. Die Pankreaslipase und -amylase sind jedoch bei pH 4 irreversibel inaktiviert und deshalb werden die meisten enzymatischen Aktivitäten zerstört, bevor sie den Duodenum des Patienten erreichen, wo der pH aufgrund verschlechterter Bicarbonatexkretion zu gering ist [5). Therapeutische Ergebnisse können nur bei Patienten erwartet werden, bei denen der postprandiale pH als Folge von zum Beispiel alkoholischer Gastritis oder gleichzeitiger Medikation mit Inhibitoren der Magensäuresekretion relativ hoch bleibt.
Des weiteren kann die Effizienz der Lipolyse durch Gallensalzausfällung gefährdet werden. Die Ausfällung von Gallensalzen, die für die Lipidauflösung notwendig sind, wird somit zu einer niedrigeren Lipidverdauung als normal führen.
Die substituierenden Enzyme des Pankreatin sind ebenfalls von ihrem entsprechenden pH-Optimum für eine ausreichend katalytische Aktivität zu weit entfernt.
Die enterische Beschichtung ist bis jetzt der üblichste Weg, die gastrische Inaktivierung von Pankreasenzymen zu umgehen.
Eine Beschichtung, die gegenüber Säure undurchlässig ist, sich aber bei einem neutraleren pH auflöst, wird verwendet, um die Enzyme während ihres Durchgangs durch den Magen zu schützen. Enterisch beschichtete Zubereitungen sollten nicht zerfallen und ihren Inhalt freisetzen, bis sie einem definierter pH-Wert, zum Beispiel 5.6, ausgesetzt sind [6]. Um wirksam zu sein, darf der Mageninhalt auch nicht zeitweise durch die Nahrungsmittel über diesen Wert gebracht werden. Auf der anderen Seite wird die Auflösung der Beschichtung im Duodenum einen pH von 5.6 oder mehr in diesem Medium erfordern. Deshalb kann es ein Problem sein, dass bei Patienten mit exokriner Pankreasinsuffizienz aufgrund des geringen Ausstoßes an Bicarbonat, der Zeitraum, während dessen der pH des duodenalen Inhaltes einen Wert von mehr als 5 bis 6 erreicht, sehr kurz ist oder zu kurz ist, um eine angemessene Auflösung der Beschichtung zu ermöglichen. Die Absorption der Nährstoffe findet hauptsächlich im ersten Teil des Duodenum-Jejunum statt. Enterisch beschichtete Pankreaszubereitungen werden sich nicht oder zu spät im Dünndarm auflösen, um die Enzyme an dem Ort, an dem sie aktiv werden sollten, bereitzustellen.
Des weiteren hat es mehrere Versuche gegeben, den intraduodenalen pH durch Verringerung der freien Säure im Magen zu optimieren. Die Histamin H₂-Rezeptorblocker, Metiamid [7], Cimetidin [8–10] und Ranitidin [11] als auch der H⁺/K⁺-ATPase-Inhibitor Omeprazol [12,13] und das Prostaglandin E1 Analogon Misoprostol [14] sind in klinischen Studien in Kombination mit Pankreaszubereitungen eingeführt worden. Einige Ergebnisse scheinen ermutigend zu sein, aber es sind auch ernste Nebenwirkungen beobachtet worden und eine Balance zwischen den positiven Wirkungen auf gesteigerte intraduodenale Enzymaktivitäten und der physiologischen Anforderung von Azidität im Magen muss beachtet werden. Die Nebenwirkungen, die einigen dieser Arzneimittel in Abhängigkeit einer lebenslang begleitenden Behandlung anhaften, müssen in Betracht gezogen werden. Ebenso eliminert die verringerte gastrische Azidität eine natürliche physikalische Schutzbarriere und kann bei wiederholtem Gebrauch ein übermäßiges bakterielles Wachstum [15] und gastrointerale Infektionen [16], einem zusätzlichen Risiko bei Patienten mit zystischer Fibrose, die aufgrund der Natur der Erkrankung für intestinale Infektionen empfänglicher sind, provozieren.
Kombinationen von Pankreatin mit säure-bindenden Mitteln wie Bicarbonat scheint nicht zu einer zusätzlichen Wirkung zu führen [17–19]. Mutmaßliche Gründe können eine Reflexstimulierung der Säuresekretion, Bindung von Gallensäure durch Calcium und Bildung von Calcium- und Magnesiumseifen mit den freigesetzten Fettsäuren sein.
Die Verwendung von gastrischen Lipasen muss ebenfalls in Betracht gezogen werden, vorausgesetzt, dass sie in industriellem Maßstab mit tragbaren Kosten verwendet werden können. Ihre isomerische Spezifität jedoch, die hauptsächlich auf die sn-3 Position von Triglyzeriden beschränkt ist, lässt einen solchen Versuch abwegig erscheinen.
Anhand des oben Gesagten wird klar, dass eine neue Behandlung exokriner Pankreasinsuffizienz äußerst wünschenswert ist. Es ist somit ein spezieller Gegenstand der Erfindung, eine solche Behandlung bereitzustellen. Im Allgemeineren ist es Gegenstand der Erfindung, die Verdaulichkeit und Verwertbarkeit von Nährstoffen bei Menschen und Tieren zu verbessern.
Die Erfindung schlägt somit einen neuen Ansatz zur Verbesserung der Verdaulichkeit und Verwertbarkeit von Nährstoffen in Abhängigkeit von Zuständen, wie zum Beispiel exokriner Insuffizienz, vor. Sie besteht aus einer Zusammensetzung, die eine oder mehrere säurestabile Amylasen, optional mit einer oder mehreren säurestabilen Lipasen umfasst.
Die säurestabile Lipase stammt bevorzugt von einem Pilz und stammt von Rhizopus arrhizus oder Rhizopus javanicus. Die bevorzugte säurestabile Amylase stammt ebenfalls von einem Pilz, zum Beispiel stammt sie von Aspergillus niger. Die Zusammensetzung der Erfindung kann jedoch gegebenenfalls mit rekombinanten säurestabilen Lipasen und Amylasen hergestellt werden.
Die aus Rhizopus javanicus isolierte säurestabile Lipase hat eine breite pH-Aktivitätszone, die von pH 2.8 bis 9 reicht (4), während menschliche Pankreaslipase nur bei pH-Werten um 5 stabil ist (siehe 1).
Die Präinkubation von Nahrungsmittelfett im Mageninhalt sowohl mit natürlich auftretender gastrischer Lipase und der säurestabilen Lipase, der pilzartigen Lipase, der Erfindung wird Fettsäuren kürzerer und mittlerer Kettenlänge, welche bereits durch die Magenschleimhaut absorbiert werden können, freisetzen und wird als Energiequelle für den Organismus zur Verfügung stehen. Auf der anderen Seite werden die freigesetzten langkettigen Fettsäuren teilweise im Duodenum ionisiert und die Bildung von Lipid-Gallensalzmizellen unterstützen. Die im Magen erzeugten Fettsäuren tragen zur gleichen Zeit durch ihre antibakteriellen und antiviralen Eigenschaften zur Verhinderung von gastrointestinalen Infektionen bei [23, 24].
Im Gegensatz zur menschlichen Pankreaslipase gibt es keinen Bedarf an Colipase und kein negativer Einfluss der Aktivität eines Säureduodenalgehaltes. Sowohl die menschliche als auch die säurestabile pilzartige Lipase haben in Bezug auf ihre Substrate dieselbe isomerische Spezifität und eine gleiche Fettsäurespezifität.
Es konnte keine detektierbare Mutagenität, akute oder subakute orale Toxizität gezeigt werden. Die Struktur der bevorzugten säurestabilen Lipase ist auf molekularer Ebene, wie in den Beispielen beschrieben, gelöst worden.
Für einen vollständigeren Komfort des Patienten muss nicht nur die Lipolyse, sondern auch die Amylolyse maximal korrigiert werden, um die Energiebalance zur Aufrechterhaltung der normalen bakteriellen Flora durch Entgegenwirken der Entwicklung und der Verbreiterung pathogener Keime zu verbessern, und um einen verlängerten Aufenthalt von osmotisch aktiven Zuckern im intestinalen Lumen und der damit verbunden schädlichen Absorption von Wasser und Ionen zu verhindern. Deshalb umfasst die Zusammensetzung der Erfindung bevorzugt weiter eine oder mehrere säurestabile Amylasen.
Der pilzartige Amylasekomplex, der in der Erfindung verwendet werden soll, hat mit der ausgewählten pilzartigen Lipase eine erweiterte Stabilität in Abhängigkeit der pH-Variationen gemeinsam. Seine Stabilität und Aktivität bei niedrigen pH-Werten vermeidet das Erfordernis einer enterischen Beschichtung, die Einnahme von säurebindenden Mitteln oder Inhibitoren der Magensäureabsonderung. Die oben beschriebenen Nachteile konnten somit vermieden werden. Das saure pH-Optimum für die enzymatische Aktivität begünstigt die Amylolyse besonders bei klinischen Zuständen, die mit geringer pankreatischer Bicarbonatfreisetzung verbunden sind, wie zum Beispiel bei der Mehrzahl von Patienten mit zystischer Fibrose und chronischer Pankreatitis. Diese Eigenschaften werden von pankreatischer Amylase, die bei pH-Werten unterhalb 4 inaktiviert ist und ein enzymatisches Optimum um einen neutralen pH herum besitzt, nicht erreicht.
Der bevorzugt in der Zusammensetzung der Erfindung verwendete säurestabile Amylasekomplex ist als sicher (GRAS Status) bewertet worden und als geeignet als Nahrungsmittelqualitätsenzym erklärt worden. Seine orale Toxizität ist bei Ratten getestet worden (13 Wochen). Die LD50 liegt oberhalb 2000 ml/kg Körpergewicht, was sie als nicht toxisch klassifiziert.
Die Erfindung umfasst nicht nur Zusammensetzungen, die eine Kombination einer säurestabilen Lipase und einer säurestabilen Amylase umfasst, sondern betrifft ebenfalls eine Zusammensetzung, die einzig säurestabile Amylase als den aktiven Inhaltsstoff umfasst, optional zusammen mit geeigneten Arzneimittelträgern.
Die Zusammensetzung kann als solche ohne zusätzliche Behandlung mit anderen Medikamenten verwendet werden. Die Zusammensetzung der Erfindung kann jedoch des weiteren ebenso proteolytisch- und/oder Nukleinsäure- und/oder phosphorlipid- und/oder andere Lipid-spaltende Enzyme umfassen, um die abbauende Aktivität der Zusammensetzung weiter zu unterstützen. Als Alternative kann Pankreatin verwendet werden, um alle anderen Pankreasenzyme zu ersetzen (mit Ausnahme von Lipase und/oder Amylase).
Galenische Formulierungen der Zusammensetzung der Erfindung umfassen als aktive Komponenten säurestabile Amylase (magenresistent), eine möglicherweise magenresistente Lipase und/oder pankreatische Extrakte (beschichtet oder unbeschichtet), optional in Gegenwart eines geeigneten Arzneimittelträgers.
Die dem Menschen oder den Tieren täglich verabreichte Menge an Amylase und/oder Lipase hängt vom speziellen Ergebnis, das erreicht werden soll, ab. Der Durchschnittsfachmann wird in der Lage sein, die erforderliche Dosis auf Basis seiner Diagnose des zu behandelnden Zustandes festzusetzen.
Im Falle der Behandlung exokriner Insuffizienz beim Menschen umfasst zum Beispiel eine Dosierungsform bevorzugt wenigstens 30.000 FIP (Fédération Internationale Pharmaceutique) Lipaseeinheiten und wenigstens 30 AG Einheiten Amylase. FIP Einheiten sind international anerkannte Einheiten [1]. AG Einheiten sind AmyloGlucosidase-Einheiten und sind als die Menge an Enzym, das 1 Mikromol Maltose pro Minute bei 25°C, pH 4.3 (Acetatpuffer) hydrolysiert, definiert. Ein Patient sollte gewöhnlich wenigstens 4 Dosierungsformen am Tag erhalten, die bevorzugt während oder nach einer Mahlzeit eingenommen oder verabreicht werden.
Die Zusammensetzung kann jede vorstellbare Dosierungsform haben, ist aber bevorzugt eine orale Dosierungsform, wie zum Beispiel Kapseln, Tabletten, Pellets, ein Pulver, Mikrokügelchen, ein wiederherstellbares Sirup.
Die bevorzugtesten Ausführungsformen umfassen harte Gelatinkapseln, die Mikrokügelchen säurestabiler pilzartiger Lipase mit einer lipolytischen Aktivität von wenigstens 150.000 FIP Einheiten/g und Mikrokügelchen eines säurestabilen pilzartigen Amylasekomplexes mit einer Aktivität zum Maltose- und Stärkeabbau von wenigstens 300 Amyloglycosidaseeinheiten/g (AG-Einheiten/g) umfassen. Die Mikrokügelchen haben zum Beispiel einen Durchmesser zwischen 0.5 und 2.0, bevorzugt zwischen 0.8 und 1.6 mm. FIP-Einheiten/g und AG-Einheiten/g zeigen die spezifische Aktivität der Amylase und Lipase an.
Besonders geeignet für die Verabreichung an Kinder ist eine Zusammensetzung, die eine lyophilisierte Zubereitung der Lipase und Amylase umfasst, optional zusammen mit Färbemitteln und Geschmacksmitteln, wobei die Zubereitung nach Zugabe von Wasser einen Sirup ergibt.
Die Erfindung betrifft des Weiteren pharmazeutische Zusammensetzungen für die Verwendung bei der Behandlung exokriner Pankreasinsuffizienz. Optional kann die Zusammensetzung zusammen mit Pankreatin verabreicht werden. Die exokrine Pankreasinsuffizienz kann das Ergebnis oder eine Nebenwirkung erworbener chronischer Pankreatitis, Alkoholismus, einer zystischer Fibrose oder von Pankreaskarzinomen sein.
Eine andere Verwendung der säurestabilen Amylase ist die Wiederherstellung der Darmflora eines Individuums, zum Beispiel nach der Behandlung mit Antibiotika.
In einem anderen Aspekt berücksichtigt die Erfindung die Verwendung einer säurestabilen Lipase, die von Rhizopus javanicus erhältlich ist, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung exokriner Pankreasinsuffizienz, und ebenso die Verwendung einer säurestabilen Amylase, die von Aspergillus niger erhältlich ist, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung exokriner Pankreasinsuffizienz.
Des weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung einer säurestabilen Amylase, die von Aspergillus niger erhältlich ist, für die Herstellung eines Verdauungshilfsmittels oder einer Zusammensetzung, um die Darmflora eines Individuums wiederherzustellen, zum Beispiel nach der Behandlung mit Antibiotika.
Obwohl die Behandlung exokriner Pankreasinsuffizienz als ein spezielles Beispiel der Erfindung verwendet wird, sollte verständlich sein, dass verschiedene andere Begebenheiten, bei welchen eine Verbesserung der Verdaulichkeit und der Verwertung von Nährstoffen erforderlich oder gewünscht ist, ebenso in den Bereich der Erfindung fallen.
Die Erfindung ist zum Beispiel ebenfalls für die Verbesserung der Gewichtszunahme bei Tieren, die für den Verzehr beabsichtigt sind, geeignet. Die Lipase und Amylase der Erfindung können entweder alleine oder in Kombination miteinander und/oder anderer Enzyme die Verdaulichkeit und somit die Verwertung von Nährstoffen verbessern und können deshalb die Effizienz der Verwertung der Nahrung steigern. Die Enzyme können separat verabreicht werden oder dem Nahrungsmittel zugesetzt werden.
„Amylase", wie in dieser Beschreibung verwendet, soll ein Enzym oder ein Komplex von Enzymen mit stärke- und/oder zuckerabbauender Kapazität umfassen. In der Praxis ist ein Amylasekomplex bevorzugt, der die drei Arten an zuckerabbauender Aktivität, nämlich die Maltaseaktivität, die Maltose in zwei Glucosemoleküle spaltet, die Glucoamylasaktivität, welche sequentiell Glucosemoleküle eines Stärkemoleküls spaltet und die Aktivität zum Abbau zu Dextrin, welche ein Stärkemolekül in Stärkefragmente auseinander bricht, kombiniert. Der Durchschnittsfachmann wird leicht erkennen, dass jede Kombination dieser und anderer zuckerabbauender Aktivitäten gemäß der Erfindung verwendet werden können.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, die nur für veranschaulichende Zwecke angegeben werden, erläutert.
Beispiele
Beispiel 1 – Isolierung und Charakterisierung eines magenresistenten Amylasekomplexes
1. Einführung
Amylolytische Enzyme sind in Mikroorganismen weit verbreitet. Die Vielfältigkeit von Amylasen innerhalb verschiedener Aspergillus-Spezies und Bazillen betonen die Bedeutung dieser Enzyme für ihr Wachstum und ihr Überleben. Die meisten von ihnen sind extrazelluläre Enzyme und haben ein pH-Optimum nahe neutral oder zwischen pH 4 und 7. Bei den Untersuchungen, die zu der Erfindung führten, wurde eine Quelle von Aspergillus niger Amylase ermittelt, die in der Lage ist, einer sauren Behandlung bei pH 2.5 bei 37°C für 30 min zu widerstehen. Diese Amylase wurde für weitere Charakterisierung ausgewählt.
2. Materialien und Verfahren
2.1. Reinigung eines magenresistenten Aspergillus niger-Amylasekomplexes
Rohe Ernten kontrollierter Gärungen von Aspergillus niger wurden einem Reinigungsverfahren unter Verwendung eines Millipore 600 E Flüssigchromatographiesystems (Milford, USA) oder eines Pharmacia Biotech Bio-Pilot-Systems (Uppsala, Schweden) unterzogen. Sepharose fast flow, Streamline DEAE-Sepharose, XK 16/20 und XK 50/30 Kolonnen wurden ebenfalls von Pharmacia Biotech erhalten. Das Reinigungsverfahren wurde aufgrund des hervorragenden Verhaltens unter hohen Flussgeschwindigkeiten und für den Fall der Übertragung auf einen industriellen Maßstabmit Streamline DEAE-Sepharose durchgeführt. In Bezug auf die Kapazität war dieses Adsorbents mit Sepharose fast flow gut vergleichbar. Nachdem eine geeignete Probe auf die Kolonne aufgetragen worden war, wurde die Kolonne mit einem linearen Gradienten von Ammoniumacetat zwischen 0.1 und 1 M bei pH 4.5 gewaschen und eluiert.
Es war ebenfalls möglich, eine schrittweise Eluierung der beiden Komponenten mit 325 mM und 775 mM Ammoniumacetat auszuführen. Die Gradienteneluierung entfernte das gelbbraune Pigment des Anfangsmaterials jedoch effizienter.
Das Reinigungsverfahren kann in einer linearen Weise unter Verwendung von 300 ml Adsorbens in einer Kolonne von 5 cm Durchmesser vergrößert werden. Die Probe wurde mit 20 ml/min aufgetragen. Die Kolonne wurde mit 2.6 1 100 mM Ammoniumacetat pH 4.5 gewaschen und mit 3 1 mit einem linearen Gradienten von 0.1 bis 1 M Ammoniumacetat pH 4.5, alle mit 20 ml/min, eluiert. Die Banden wurden zwischen 240 und 400 mM und zwischen 450 und 630 mM in 530 bzw. 600 ml gesammelt. Die Bandenfraktionen aller Kolonnen wurden vor dem Aufkonzentrieren zusammengefasst. Eine 30 ml Probe der salzarmen Bande wurde unter Verwendung eines Centripep-Konzentrators (Amicon, Beverly, USA) auf konzentriert, in 10 mM Ammoniumacetat gewechselt und durch Vakuumzentrifugation in einem Savant SpeedVac SC100 (New York, USA) getrocknet.
Die Probe war weiß und enthielt, wie durch Gewicht bestimmt, hauptsächlich Protein. Dieses Material wurde für Elektrophorese unter Verwendung eines Standardprotokolls [20] und für die pH Aktivitätsstudie verwendet.
2.2 Aktivitätsassays
Die in der Erfindung verwendete Amylase ist ein Komplex von Molekülen mit verschiedenen Arten von Aktivitäten, abhängig vom verwendeten Substrat.
2.2.1. Maltaseassay
Das Maltaseassay verwendet die Eigenschaft der Aspergillus niger Glycoamylase, um Maltose in zwei Glucosemoleküle zu spalten. Üblicherweise wird eine 20 μl Probe in 500 μl Maltose (Difco) 5 g/l in 100 mM Natriumacetatpuffer pH 4.3 verdünnt. Die Reaktionsmischung wurde bei 37°C inkubiert. Nach exakt 30 min wurde die Reaktion gestoppt, indem 52 μl der Reaktionsmischung in 75 μl TRIS.HCl 1.66 M pH 7.6, das in einem geeigneten Fläschchen für eine automatische Glucosanalyse mit dem Cobas-Bio-Instrument (Roche Analytical Instruments, Inc., Nutley, New Jersey) enthalten war, pipettiert wurden. Das Glucosereagenz enthielt 0.5 mg/ml 2,2'-Azo-di-(3-ethylbenzthiazolinsulfonat] (ABTS, Boehringer Mannheim, Deutschland), 1.5 Einheiten/ml Meerrettichperoxidase und 9.5 Einheiten/ml Glucoseoxidase (beide Enzyme von Boehringer Mannheim). In dem automatisierten Assay wurde eine 6 μl Probe in 200 μl Glucosereagenz verdünnt und das Absorptionsvermögen wurde bei 420 nm, wenn kein weiterer Anstieg beobachtet wurde, gewöhnlich nach 15 min abgelesen. Das Assay wurde mit Glucosestandards von 65 und 130 mg/l kalibriert. Üblicherweise war ein Pufferblindwert und ein Enzymblindwert (TRIS.HCl 1.66 M pH 7.6, hinzugegeben vor der Inkubation) enthalten. Eine Einheit ist die Menge an Enzym, die 1 μmol Maltose pro Minute spaltet.
2.2.2. Glucoamylaseassay
Die Glucoamylaseaktivität des Amylasekomplexes spaltet aus Stärke Glucosemoleküle. Ein ähnliches Assay wie unter 2.2.1. beschrieben wurde unter Verwendung von löslicher Stärke (Merck) (0.5%) als Substrat anstatt Maltose angewendet. In diesem Fall war die Inkubation bei 37°C auf 10 min verkürzt. Die Aktivität wird als μmol der glycosidischen Bindungen, die pro Minute gespalten wurden, ausgedrückt.
2.2.3. Assay der Alpha-Amylaseaktivität zum Abbau zu Dextrin
Die Fähigkeit Stärkefragmente zu erzeugen, wird Aktivität zum Abbau zu Dextrin genannt, die Umwandlung von Stärke in Glucose wird Verzuckerungsaktivität genannt. Um die Amylaseaktivität zum Abbau zu Dextrin schnell zu beurteilen, wurde die Probe mit einer löslichen Stärkelösung inkubiert und nach 10 Minuten die verbliebene Menge an Stärke mit Jod bestimmt.
In eine 3 ml Küvette wurden hinzugegeben: 25 μl Natriumacetatpuffer (100 mM pH 4.3), 25 μl lösliche Stärke (Merck, 1% in Wasser) und 25 μl der Probe. Nach dem Aufwirbeln wurde die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur innerhalb von 10 min inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 25 μl KI₃ (0.01 M in 1 M HCl) angehalten und mit 2 ml Wasser verdünnt. Die Absorption wurde bei 660 nm abgelesen. Das Assay ist zwischen 1 und 0.1 Absorptionseinheiten linear.
3. Ergebnisse
Aspergillus niger sondert zwei Haupt-stärkeabbauende Proteinfraktionen ab, welche durch Anionenaustauschchromatographie (3) aufgelöst wurden. Beide Banden enthalten eine hohe Glucoamylase/Maltaseaktivität, aber nur die Fraktionen, die am salzarmen Ende des Gradienten eluiert wurden, wurden mit einer hohen Amylase-Aktivität (Abbau zu Dextrin) verbunden. Das pH-Aktivitätsprofil des gesammelten Materials der ersten Bande ist in 4 im Vergleich mit pankreatischer Alpha-Amylase gezeigt. Die Amylase- und Glucoamylseaktivität (gemessen mit löslicher Stärke) der Aspergillus niger Zubereitung hatte ein breites pH-Optimum zwischen pH 3 und 5.5. Pankreatische Amylase baut nicht über den gesamten beobachteten pH-Bereich lösliche Stärke in Glucose ab. Tabelle 2 listet die speziellen Aktivitäten des Aspergillus niger Enzyms im Vergleich mit einem F.I.P. Standard für pankreatische Amylase auf.
Tabelle 2 – Amylolytische Aktivitäten des Aspergillus niger Säureamylase-Komplexes und der Pankreasamylasen
Beispiel 2 – Charakterisierung einer magenresistenten Lipase
1. Einführung
Lipasen sind aus Säugetier-, mikrobiellen und pflanzlichen Quellen isoliert worden [22]. Einige Pilze produzieren Lipasen, die durch die äußere Membran in das Kulturmedium abgesondert werden und somit relativ leicht zu isolieren sind. Des weiteren sind sie ziemlich stabil. Dies macht sie besonders attraktiv für die medizinische Verwendung, da sie ohne die Erfordernis ein rekombinantes Produktionsverfahren zu entwickeln, maßstäblich vergrößert werden können.
Die Auswahl einer geeigneten Lipasequelle war nicht nur auf die Aktivität und Stabilität in Abhängigkeit des pHs gerichtet, sondern ebenso auf die Abwesenheit von inhibitorischen Gallensalzeffekten, das Ausmaß an Resistenz gegenüber Pepsinaktivität und die Substratspezifitäten. Es hat sich gezeigt, dass die Lipase von Rhizopus arrhizus und Rhizopus javanicus ihre lipolytische Aktivität auf primäre Esterbindungen (analog zur menschlichen Pankreaslipase) begrenzen und dass sie in einer breiten pH-Zone stabil sind. Da sich herausgestellt hat, dass der Extrakt von Rhizopus arrhizus 50% weniger Lipaseaktivität im Vergleich zu Rhizopus javanicus hat, wurde erstgenannter für die Reinigung und Charakterisierung ausgewählt.
Es hat sich des weiteren herausgestellt, dass Rhizopus javanicus Lipase gegenüber einem Angriff proteolytischer Enzyme wie Pepsin und Pankreatinproteasen bemerkenswert resistent ist, wahrscheinlich aufgrund seiner substantiellen Glycosylierung. Es fehlen negativen Auswirkungen durch physiologische Konzentrationen an Gallensalzen. Im Gegensatz zu menschlicher Pankreaslipase ist Rhizopus javanicus Lipase nicht von der Aktivatorproteincolipase abhängig. Lipase wird wie Amylase in ihrer aktiven Form abgesondert. Somit wird für die Substitution des Enzyms keine Proform benötigt.
2. Materialien und Verfahren
2.1. Reinigung, Sequenzierung, Charakterisierung von Rhizopus javanicus Lipase
Die Reinigung mittels mehrerer chromatographischer Schritte einer rohen Fermentationsernte von Rhizopus javanicus Lipase wurde gemäß den in [20] beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die für das Assay verwendeten Verfahren, Elektrophorese, Cyanogenbromidspaltung, teilweise saure Hydrolyse, proteolytische Spaltung, Aminosäuresequenzierung und Bestimmung der pH-Stabilität werden ebenfalls in [20,21] beschrieben.
2.2. Sequenzanalyse und Modellaufbau
Die Sequenzen wurden aus der EMBL/Swissprot Datenbank extrahiert und unter Verwendung kombinierter Informationen für verschiedene Versuche ausgerichtet. Die Sequenzabgleichungen wurden unter Verwendung des PIRPSQ Programms ausgeführt. Das Atommodell der säurestabilen Lipase von Rhizopus javanicus wurde unter Verwendung der Struktur der Lipase von Rhizomucor miehei im Anschluss an das Eijsink Protokoll und unter Verwendung des homologen Modellmoduls des Programms WHATIF gebildet. Die atomaren Koordinaten des α-Kohlenstoffatoms der Rhizomucor Lipase wurden von der PDB Proteindatenbank erhalten. Energieminimierung und molekulare Dynamiken wurden mit GROMOS durchgeführt [20,21].
3. Ergebnisse
Die Reinigung von Rhizopus javanicus Lipase mittels aufeinanderfolgender Chromatographieschritte führt zu einer homogenen, einzelnen Proteinbande mit einem Molekulargewicht von 36 kDa und besitzt eine spezielle enzymatische Aktivität von ungefähr 9.10⁶ FIP Einheiten. Die Aminosäuresequenzanalyse offenbart ein Protein mit einem nicht blockierten Aminoende und ist durch drei Brücken stabilisiert.
Eine substantielle Glycosylierung kann durch die Unterschiede zwischen dem berechneten Molekulargewicht des Enzyms (32163 kDa) und dem experimentell bestimmten Wert von 36000 Da abgeleitet werden.
Vergleichende Aminosäuresequenzanalyse sowohl von Rhizopus javanicus Lipase als auch Rhizomucor mihei Lipase zeigt eine Gesamthomologie von 54%, die die Möglichkeit schafft, mit großer Zuversicht ein dreidimensionales Modell zu konstruieren [20].
Concanavalin-Affinitätschromatographie zeigt die Gegenwart einer mannosereichen Glycofraktion für die Rhizopus javanicus Lipase an, was wahrscheinlich zu der bemerkenswerten Säurestabilität des Enzyms beiträgt. Untersuchung der Sequenz bestimmt das Asn¹⁹⁷ als die wahrscheinlichste Position der Glycosylierung.
Der Pro-Rest in Nachbarschaft zu Asn²¹⁰ verhindert dessen Glycosylierung und das dritte Asn¹²⁴ befindet sich in der Nähe der Kontaktzone des Enzyms mit dem Lipid/Wasserinterface. Es sollte angemerkt sein, das N-Glycosylierungsstellen in der weniger säurestabilen Rhizomucor mihei Lipase fehlen.
Beispiel 3
Klinische Studie
1. Einführung
Die Zusammensetzung der Erfindung wurde in vivo bei Patienten mit zystischer Fibrose getestet.
2. Materialien und Patienten
2.1. Dosierungsform für klinische Untersuchungen
Die Patienten erhielten in der Studie harte Gelatinkapseln Nr.1 (0.48 ml), die Amylase (Aspergillus niger) ≥ 300 AG/μg, Lipase (Rhizopus javanicus) ≥ 120.000 FIP U/g in Form von Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 0.8 und 1.6 mm in dem Verhältnis von 25% Amylase und 75% Lipase enthalten.
Die Medikationen wurden trocken bei Raumtemperatur aufbewahrt.
2.2. An der Studie beteiligte Patienten
Die an der Studie beteiligten Patienten haben zystische Fibrose, die durch klinischen Nachweis und einen positiven Schweißtest bestimmt wurde. Sie haben ebenso einen hohen Grad an ernster exokriner Pankreasinsuffizienz, die einen beeinträchtigten Ernährungszustand und/oder Wachstum (abhängig vom Alter) einschließt. Die Frauen haben einen negativen Schwangerschaftstest und nehmen ein wirksames Verhütungsmittel.
Patienten wurden in ihrer normalen Lebenssituation (keine systematische Nahrungsstandardisierung) beobachtet. Jeder Patient wurde für ein Minimum von fünf Wochen in die Studie aufgenommen. Zwei oder drei Wochen dienten als Referenzperiode. Während dieser Periode blieben die Patienten bei ihrer normalen Ernährung ohne irgendeine Änderung in der laufenden Behandlung mit Pankreatinkapseln. Die folgenden Wochen stellten die Testperiode dar, während derer die Pankreatinbehandlung mit den Kapseln der Erfindung ergänzt wurde. Am Anfang und am Ende der Studie wurde eine physikalische Untersuchung durchgeführt. Die Studie wurde mittels eines Tagebuchberichtes des Patienten, Beurteilung des Körpergewichts, der Stuhlfrequenz, Stuhlkonsistenz, Blähgefühl, abdominale Beschwerden und der Erfassung ungewöhnlicher Nebenwirkungen und begleitender Medikation beobachtet. Plasma Vitamin E Spiegel wurden am Anfang und am Ende der Studie als ein Anzeichen für die Korrektur der Fettmalabsorption gemessen. Eine Sicherheitsbeurteilung wurde durch routinemäßige klinische Labortests durchgeführt. Wenn möglich, wurden fäkale Analysen in der Referenzperiode und am Ende der Testperiode organisiert.
3. Ergebnisse
Die folgenden Unterschiede wurden am Ende der Testperiode im Vergleich zur Referenzperiode beobachtet:

1. Verschwinden von Anzeigen über chronischen abdominalen Schmerz
2. Verschwinden des Blähgefühls
3. Verbesserung der Stuhlkonsistenz und Verringerung der Stuhlfrequenz
4. Rückgewinnung von Appetit
5. Gleichbleibender und signifikanter Anstieg des Körpergewichts.

Nach Rückkehr zur gewöhnlichen Dosiseinnahme von Pankreatin am Ende der Testperiode traten die Beschwerden und Symptome, die in 1 bis 4 aufgezeigt sind, wieder auf. Der Anstieg des Körpergewichts, der während der Testperiode erhalten wurde, wurde weiter aufrechterhalten.
Ein typisches Beispiel an Daten, die für einen Patienten registriert wurden, ist in 5 zusammengefasst.
Legende für die Figuren
1 – Bereiche für die Aktivitäten (offene Balken oben) und Stabilität (schraffierte Balken unten) in Abhängigkeit des pH's der Hauptverdauungsenzyme, die in einem menschlichen Gastrointestinaltrakt vorliegen und der entwickelten magenresistenten Enzymen. Nicht gut dokumentierte Bereiche sind durch eine gestrichelte Linie dargestellt. Die aufgezeigten Bereiche sind nur ungefähr, da sie durch viele Faktoren und Reaktionsbedingungen beeinflusst werden können, z.B. durch den Aktivitätsbereich von gastrischer Lipase, der einen Shift von pH 4–6 (langkettige Triglyzeride) zu pH 4–7 erfährt (kurzkettige Triglyzeride).
2 – Duodenal pH-Werte bei Kontroll-Testpersonen während basaler, Essens- und Trinkperioden (links); basale duodenale pH-Werte bei Patienten mit zystischer Fibrose (rechts). Die irreversible Inaktivierung von Pankreaslipase und -amylase tritt bei pH 4 auf, während ihre katalytischen Aktivitäten einen pH-Wert oberhalb 5 erfordern.
Die Bereiche sind durch eine gestrichelte Linie, die Standardabweichung durch eine durchgezogene angegeben; n ist die Anzahl der untersuchten Testpersonen.
3 – Reinigung von Aspergillus niger stärkeabbauenden Enzymen an Streamline DEAE-Sepharose. Die folgenden Parameter sind gezeigt: Proteinkonzentration (offene Kreise), Aktivität zum Abbau zu Dextrin (ausgefüllte Kreise), Maltaseaktivität (ausgefüllte Quadrate), 0.1–1 m Ammoniumacetatgradient (gestrichelte Linie).
4 – pH-Aktivitätsprofil von Aspergillus niger (ausgefüllte Symbole) und Pankreasamylase (offene Symbole). Aktivität zum Abbau zu Dextrin (o,
) und Glucoamylaseaktivität (
,
) wurde mit löslicher Stärke, wie im experimentellen Teil beschrieben, gemessen, mit der Ausnahme, dass 50 mM Citrat (pH 2.5–6) und Phosphatepuffer (pH 6–7.7) verwendet wurden.
5 – Beispiel von registrierten Daten bei einem Patienten (Alter: 8 Jahre) vor (Referenzperiode) und während der Zugabe von säurestabiler Amylase (magenresistent) und Lipase (Testperiode).
Von großer Bedeutung war, dass die Zunahme an Körpergewicht nach Anhalten des Testes weiterbestand.
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Claims

Zusammensetzung zur Verbesserung der Verdaulichkeit und Verwertung von Nährstoffen, die ein Enzym oder einen Komplex von Enzymen mit Maltaseaktivität, Glucoamylaseaktivität, Aktivität zum Abbau zu Dextrin und der Säurestabilität des Amylasekomplexes Aspergillus niger umfasst.
Zusammensetzung wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das Enzym oder der Komplex von Enzymen von Pilzen stammen.
Zusammensetzung wie in Anspruch 2 beansprucht, wobei das Enzym oder der Komplex von Enzymen von Aspergillus niger stammen.
Zusammensetzung wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das Enzym oder der Komplex von Enzymen ein rekombinantes Enzym oder ein Komplex rekombinanter Enzyme ist.
Zusammensetzung wie in einem der Ansprüche 1–4 beansprucht, die weiter eine oder mehrere säurestabile Lipasen umfasst.
Zusammensetzung wie in Anspruch 5 beansprucht, wobei die Lipase von Pilzen stammt.
Zusammensetzung wie in Anspruch 6 beansprucht, wobei die Lipase von Rhizopus arrhizus oder Rhizopus javanicus stammt.
Zusammensetzung wie in Anspruch 6 beansprucht, wobei die Lipase eine rekombinante Lipase ist.
Zusammensetzung wie in einem der Ansprüche 1–8 beansprucht, die weiter proteolytische- und/oder Nukleinsäure- und/oder phospholipid- und/oder andere Lipid-spaltende Enzyme umfasst.
Zusammensetzung wie in einem der Ansprüche 1–9 beansprucht, wobei die Zusammensetzung in der Form von Kapseln, Tabletten, Pellets, eines Pulvers, Mikrokügelchen, eines wiederherstellbaren Sirups ist.
Zusammensetzung wie in Anspruch 9 beansprucht, wobei die Zusammensetzung in Form harter Gelatinkapseln vorliegt, die Mikrokügelchen säurestabiler pilzartiger Lipasen mit einer lipolytischen Aktivität von wenigstens 150.000 FIP Einheiten/g und Mikrokügelchen eines säurestabilen pilzartigen Amylasekomplexes mit einer Aktivität zum Maltose- und Stärkeabbau von wenigstens 300 Amyloglycosidaseeinheiten/g umfassen.
Zusammensetzung wie in Anspruch 11 beansprucht, wobei die Mikrokügelchen einen Durchmesser zwischen 0.5 und 2.0, bevorzugt zwischen 0.8 und 1.6 mm haben und die Kapseln ungefähr 25–75%, bevorzugter ungefähr 50–75%, am bevorzugtesten ungefähr 75% der säurestabilen Lipase und ungefähr 25–75%, bevorzugter ungefähr 25–50%, am bevorzugtesten ungefähr 25% der säurestabilen Amylase umfassen.
Zusammensetzung wie in Anspruch 10 beansprucht, wobei die Zusammensetzung eine lyophilisierte Zubereitung der Lipase und Amylase, optional zusammen mit Färbemitteln und Geschmacksmitteln, umfasst, wobei die Zubereitung nach Zugabe von Wasser einen Sirup oder eine Flüssigkeit ergibt.
Zusammensetzung wie in einem der Ansprüche 1–12 beansprucht, wobei die Zusammensetzung eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Verwendung in der Behandlung exokriner Pankreasinsuffizienz ist.
Zusammensetzung wie in einem der Ansprüche 1–12 beansprucht, wobei die Zusammensetzung eine pharmazeutische Zusammensetzung für die gemeinsame Verwendung mit Pankreatin in der Behandlung exokriner Pankreasinsuffizienz ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung wie in Anspruch 14 oder 15 beansprucht, wobei die exokrine Pankreasinsuffizienz das Ergebnis oder der Nebeneffekt einer erworbenen chronischen Pankreatitis, von Alkoholismus, einer cycstischen Fibrose oder von Pancreaskarzinomen ist.
Verwendung eines Enzyms oder eines Komplexes von Enzymen mit Maltaseaktivität, Glucoamylaseaktivität, Aktivität zum Abbau zu Dextrin und der Säurestabilität des Amylasekomplexes Aspergillus niger für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung exokriner Pankreasinsuffizienz.
Verwendung eines Enzyms oder eines Komplexes von Enzymen mit Maltaseaktivität, Glucoamylaseaktivität, Aktivität zum Abbau zu Dextrin und der Säurestabilität des Amylasekomplexes Aspergillus niger für die Herstellung eines verdauungsfördernden Hilfsmittels oder einer Zusammensetzung, um die intestinale Flora eines Individuums, zum Beispiel nach Behandlung mit Antibiotika, wieder aufzubauen.
Verwendung wie in Anspruch 17 und 18 beansprucht, wobei die Zusammensetzung weiter eine säurestabile Lipase umfasst.
Verwendung wie in einem der Ansprüche 17–19 beansprucht, wobei das Enzym oder der Komplex von Enzymen der Amylasekomplex von Aspergillus niger ist.
Verwendung wie in einem der Ansprüche 17–19 beansprucht, wobei das Enzym oder der Komplex von Enzymen ein rekombinantes Enzym oder ein Enzymkomplex ist.