DE69633668T2

DE69633668T2 - Allogene zelltherapie für krebs infolge allogener stammzellen transplantation

Info

Publication number: DE69633668T2
Application number: DE69633668T
Authority: DE
Inventors: Shimon Slavin
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1995-05-25
Filing date: 1996-05-24
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2016-05-25
Also published as: AU5930396A; JPH11511746A; WO1996037208A1; US6143292A; EP0831860B1; CA2220971A1; MX9708989A; DE69633668D1; IL118418A0; IL118418A; EP0831860A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft Medikamente zur Ausrottung von Tumorzellen, die nach allogener Stammzellentransplantation in einem Patienten lebensfähig bleiben.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Patienten, die an bösartigen hämatologischen Erkrankungen wie etwa Leukämie oder Lymphom leiden, können unter geeigneten Umständen autologe oder allogene Knochenmarktransplantate als Teil einer therapeutischen Vorgehensweise verabreicht werden. Solche Transplantate können auch im Zusammenhang mit der Therapie nichthämatologischer bösartiger Erkrankungen, wie etwa Brustkarzinome oder anderer massiver Tumore, nützlich sein. Knochenmarktransplantation ermöglicht es, Patienten mit resistenter Krankheit hohe, „supra-letale" Kombinationen von Chemotherapie und/oder Bestrahlung zu verabreichen, wobei die irreversible Toxizität solcher therapeutischer Kombinationen für den normalen Knochenmarkanteil außer Acht gelassen wird. Trotzdem kann ein solches „Entvolumisieren" des Tumors eines Patienten einen Bruchteil bösartiger Restzellen übriglassen, der zu einem Rückfall der Krankheit führen kann.
Mehrere Linien der Beweisführung suggerieren, dass ein signifikanter Anteil der günstigen Wirkung allogener Knochenmarktransplantation (d. h. Knochenmarktransplantation von einem Individuum, das mit dem Wirtpatienten nicht genetisch identisch ist) von zellvermittelten Wechselwirkungen von Immunzellen von Spenderursprung gegen Tumorrestzellen im Wirt, die der Chemo-/Bestrahlungstherapie-Entvoluminisierungsvorgehensweise entkommen sind, herrührt. Nachfolgend auf allogene Knochenmarktransplantation (Allo-KMT) ist das Vorkommen eines Rückfalls bei Leukämiepatienten mit klinischen Manifestationen akuter oder chronischer Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (Graft versus host disease, GVHD) signifikant niedriger im Vergleich zu Patienten ohne GVHD, was andeutet, dass immunvermittelte allogene Wechselwirkungen immunkompetenter Zellen von Spenderursprung gegen den Wirt von Transplantat-gegen-Leukämie-Effekten (Graft versus leukemia, GVL) begleitet werden.
Höhere Rückfallraten scheinen bei Patienten aufzutreten, die Allo-KMT mit T-Lymphozytenverarmung zur Verhinderung von GVHD unterzogen werden, verglichen mit Empfängern von nicht-T-Zellen-verarmten Markallotransplantaten, ungeachtet der Schwere von GVHD. Gleichermaßen sind die Rückfallraten bei Patienten mit akuter Leukämie oder chronischer myeloischer Leukämie, die durch Knochenmarktransplantate rekonstituiert wurden, die von einem identischen Zwilling (syngene Transplantate) erhalten wurden, beträchtlich höher als bei denjenigen, die durch Knochenmarkzellen rekonstituiert wurden, die von einem HLA-identischen, jedoch nicht-syngenen Geschwister erhalten wurden. Gleichermaßen sind die Rückfallraten nachfolgend an Transplantation des eigenen (autologen) Marks des Patienten, selbst nachfolgend auf adäquates Reinigen in vitro zur Eliminierung von Restleukämiezellen, signifikant höher als nachfolgend auf Allo-KMT.
Rezente Studien durch mehrere Gruppen haben gezeigt, dass Patienten mit chronischer myeloischer Leukämie (CML), die nachfolgend auf Allo-KMT einen Rückfall haben, erfolgreich durch Infusion ruhender (d. h. unaktiviert durch in vitro-Behandlung mit T-Zellenaktivatoren wie etwa Zytokinen) HLA-angepasster Leukozyten von dem Allo-KMT-Spender behandelt werden, um eine zweite Remission zu erzielen. Slavin et al., Blood 72 (Zusatz 1): 407a (1988); Kolb et al., Blood 76: 2462 (1990); Baer et al., Journal of Clin. Oncology 11: 513 (1993); Jiang et al., Bone Marrow Transpl. (Knochenmarktranspl.) 11: 133 (1993); Drobyski et al., Blood 82: 2310 (1993); Antin, Blood 82: 2273 (1993); Porter et al., New Engl. J. Med., 330: 100–06 (1994).
Die therapeutischen Effekte der infundierten Leukozyten werden durch die Potenzierung der GVL-Effekte, die nachfolgend an Allo-KMT hervorgerufen werden, durch immunkompetente Spender-T-Zellen abgemildert, die nicht tolerant für die bösartigen hämatopoetischen Zellen sind. Slavin et al., Blood 72 (Zusatz 1): 407a (1988); Slavin et al., Bone Marrow Transpl. (Knochenmarktranspl.) 6: 155–61 (1990); Kolb et al., Blood 76: 2462 (1990); Baer et al., Journal of Clin. Oncology 11: 513 (1993); Jiang et al., Bone Marrow Transpl. 11: 133 (1993); Drobyski et al., Blood 82: 2310 (1993); Antin, Blood 82: 2273 (1993); Porter et al., New Engl. J. Med., 330: 100–06 (1994). Unglücklicherweise reagieren nur etwa 50–70% der CML-Patienten, die nach Allo-KMT einen Rückfall erleiden, günstig auf Allo-ZT. Kolb et al., Clin. Blood 82 (Zusatz 1): 840 (1993). Außerdem ist die erkrankungsfreie Langzeit-Überlebensrate aufgrund von ausbleibender Reaktion, anschließendem Rückfall und Komplikationen aufgrund von GVHD und Markaplasie bei weitem nicht optimal.
Schließlich waren die möglichen Wirkungen allogener Lymphozyten gegen massive Tumore nachfolgend auf Allo-KMT relativ unbekannt verglichen mit den dokumentierten Wirkungen allogener Lymphozyten auf bösartige hämatopoetische Zellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung verschafft die Nutzung allogener Lymphozyten oder eines T-Zellenaktivators bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines menschlichen Krebspatienten, der sich einer Krebstherapie-Vorgehensweise unterzogen hat, einschließlich allogener Stammzellentransplantation gemäß den Ansprüchen 1, 2, 3 und 5. Der Begriff „Stammzellentransplantation", wie hierin verwendet, umfasst die Infusion hämatopoetischer Stammzellen in einen Patienten, die aus jeder geeigneten Quelle von Stammzellen im Körper gewonnen wurden. Die Stammzellen können beispielsweise aus Knochenmark, aus dem peripheren Blutkreislauf nachfolgend auf die Mobilisierung des Knochenmarks, oder aus fötalen Quellen, wie etwa fötalem Gewebe, fötalem Blutkreislauf und Nabelschnurblut gewonnen sein. „Knochenmarktransplantation" wird hierin einfach als eine Form der Stammzellentransplantation betrachtet. Die Mobilisierung von Stammzellen aus dem Knochenmark kann beispielsweise durch Behandlung des Spenders mit einem granulozytenkoloniestimulierenden Faktor (Granulocyte colony stimulating factor, G-CSF) oder anderen geeigneten Faktoren (z. B. IL-8), die das Wandern von Stammzellen aus dem Knochenmark in den peripheren Blutkreislauf anregen, erfolgen. Nach der Mobilisierung können die Stammzellen durch jede geeignete Zellapheresetechnik aus dem peripheren Blut gesammelt werden, beispielsweise durch die Verwendung einer kommerziell erhältlichen Blutsammelvorrichtung, wie durch die von der Baxter Healthcare Corporation vertriebene CS 3000^® Plus Blutzellensammelvorrichtung beispielhaft dargestellt. Verfahren zur Durchführung von Apherese mit der CS 3000^® Plus-Maschine sind beschrieben in Williams et al., Bone Marrow Transplantation (Knochenmarktransplantation) 5: 129–33 (1990) und Hillyer et al., Transfusion 33: 316–21 (1993).
Die Infusion der hämatopoetischen Stammzellen kann zur kompletten und permanenten Einpflanzung (d. h. 100% hämatopoetische Spenderzellen) oder kann zur teilweisen und vorübergehenden Einpflanzung führen, vorausgesetzt, die Spenderzellen bleiben lange genug anwesend, um die Durchführung allogener Zelltherapie, wie hierin beschrieben, zu gestatten. Somit deckt der Begriff „Stammzellentransplantation" die Stammzelleninfusion in einen Patienten ab, die entweder zur vollständigen oder teilweisen Einpflanzung, wie oben beschrieben, führt.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Allo-ZT" (allogene Zelltherapie) auf die Infusion ruhender allogener Lymphozyten, d. h. Lymphozyten, die zuvor nicht dem T-Zellenaktivator in vitro ausgesetzt wurden; der Begriff „Allo-AZT" (allogene aktivierte Zelltherapie) bezieht sich auf die Infusion allogener Lymphozyten, die in vitro mit einem T-Zellenaktivator, wie etwa rekombinantem menschlichem Interleukin-2 (rhIL-2) voraktiviert wurden. Solche aktivierten Spenderlymphozyten werden hierin als „ASL" bezeichnet.
Es versteht sich, dass die in einen Patienten infundierten allogenen Lymphozyten nicht als eine gereinigte T-Zellen-Zubereitung infundiert werden müssen. Obwohl es möglich ist, eine relativ reine T-Zellen-Zubereitung zu infundieren, können die Zellen in Form einer Zubereitung mononukleärer Zellen peripheren Bluts infundiert werden. Beispielsweise ist die als Ergebnis der Apherese mit der CS 3000^® Plus-Blutzellensammelvorrichtung erhaltene Zubereitung mononukleärer Zellen peripheren Bluts geeignet für die vorliegende Erfindung. Eine solche Zellzubereitung besteht aus annähernd 95% mononukleärer Zellen, deren Großteil T-Zellen sind. Unter geeigneten Umständen ist es sogar möglich, dem Patienten allogene Lymphozyten zuzuführen, indem einfach ganzes Blut vorgesehen wird.
Sowohl Allo-ZT als auch Allo-AZT können mit oder ohne begleitende in vivo-Verabreichung eines T-Zellenaktivators durchgeführt werden. Typischerweise sind die infundierten allogenen Lymphozyten von demselben Spender gewonnen, der die Stammzellen für die allogene Stammzellentransplantation zur Verfügung stellte. Jedoch können die infundierten Lymphozyten unter geeigneten Umständen auch von anderen Spendern gewonnen werden. Beispielsweise, wenn die infundierten Lymphozyten in ihrer Lebensspanne begrenzt sind, wie unten beschrieben, kann derselbe oder ein anderer Spender die Zellen zur Verfügung stellen, abhängig von dem klinischen Umfeld.
Der Begriff „Krebs", wie hierin verwendet, schließt alle pathologischen Bedingungen ein, wobei bösartige Zellen betroffen sind; dies kann sowohl „massive" Tumore umfassen, die in festen Geweben oder Organen auftauchen (d. h. Tumorzellen, die als vielzellige, durch Blutgefäße unterstützte Massen wachsen), als auch Tumorzellen, die von hämatopoetischen Stammzellen herrühren.
Die Medikamente der vorliegenden Erfindung können zur Behandlung menschlicher Krebspatienten mit massiven Tumoren verwendet werden, welche ohne Einschränkung Brustkarzinome einschließen, die aus bösartigen Zellen zusammengesetzt sind. Die Patienten sind einer allogenen Stammzellentransplantation unterzogen worden. Nach der Transplantation werden den Patienten allogene Lymphozyten infundiert, um eine Transplantat-gegen-Tumor-Reaktion im Patienten auszulösen. Die infundierten allogenen Lymphozyten können vor der Infusion durch in vitro-Aussetzung gegenüber einem T-Zellenaktivator aktiviert werden. Ob die Lymphozyten nun vor der Infusion aktiviert werden oder nicht, der Patient kann auch in vivo mit dem T-Zellenaktivator versehen werden, um die Lymphozyten nach der Infusion mit einem weiterlaufenden Aktivationsstimulus zu versehen.
Der T-Zellenaktivator umfasst zumindet einen T-Zellen-Signalübertragungs-Wegeaktivator. Der T-Zellenaktivator kann, ohne Einschränkung, einen oder mehr der folgenden Signalübertragungs-Wegeaktivatoren umfassen: Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-5 (IL-5), Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-7 (IL-7), Interleukin-12 (IL-12), Interleukin-13 (IL-13), Interleukin-15 (IL-15), Interferon-Alpha (IFNα), Interferon-Gamma (IFN_Y), Tumornekrosefaktoren wie etwa TFNα, Anti-CD3-Antikörper (Anti-CD3), Anti-CD28-Antikörper (Anti-CD28), Phytohämagglutin, Concanavalin-A und Phorbolester. Die T-Zellenaktivatoren können aus natürlichen Quellen erhaltene native Faktoren sein, durch rekombinante DNA-Technologie produzierte Faktoren, chemisch synthetisierte Polypeptide oder andere Moleküle, oder jedes Derivat, das die funktionale Aktivität des nativen Faktors hat. Meistbevorzugt ist der T-Zellenaktivator IL-2, beispielsweise rekombinantes menschliches IL-2 (rhIL-2). Der zur in vitro-Aktivierung der Spenderlymphozyten verwendete T-Zellenaktivator und der zur in vivo-Verabreichung verwendete T-Zellenaktivator können dieselben oder unterschiedliche T-Zellen-Signalübertragungs-Wegeaktivatoren sein.
Die allogenen Lymphozyten können dem Patienten in einer Serie schrittweise ansteigender Mengen verabreicht werden, wobei der Patient zwischen den Einzelschritten auf Anzeichen von GVHD überwacht wird. Manifestiert sich keine GVHD, oder wenn die GVHD nicht schwerwiegend ist und durch Standard-Anti-GVHD-Prophylaxe kontrollierbar ist, dann kann dem Patienten eine schrittweise höhere Dosis allogener Lymphozyten verabreicht werden, als in der vorigen Infusion vorgesehen war. Typischerweise, jedoch nicht notwendigerweise, werden die Dosierungen durch log-Schritte eingestellt, beispielsweise 10⁵, 10⁶, 10⁷ Lymphozyten/kg und so weiter. Vorzugsweise sind die allogenen Lymphozyten HLA-kompatibel (siehe unten) mit dem Patienten, obwohl dies nicht in allen Fällen notwendig ist, insbesondere wenn die infundierten Lymphozyten mit einer begrenzten Lebensspanne versehen sind. Beispielsweise können die allogenen Lymphozyten ein „Suizidgen" tragen, das das Abtöten der Zellen nach der Infusion in den Patienten durch Verwendung eines chemotherapeutischen Mittels gestattet. Nach der Infusion der allogenen Lymphozyten wird der Patient in Hinblick auf Niveaus bösartiger Zellen überwacht.
Die Medikamente der vorliegenden Erfindung können zur Behandlung menschlicher Krebspatienten mit bösartigen hämatopoetischen Zellen verwendet werden, beispielsweise Patienten mit chronischer myeloischer Leukämie oder akuter lymphatischer Leukämie. Wie in dem Fall bei Patienten mit massivem Tumor, wurden diese Patienten einer allogenen Stammzellentransplantationsprozedur als Teil einer Vorgehensweise zur Behandlung der bösartigen Erkrankung unterzogen. Nachfolgend auf die allogene Stammzellentransplantation wird der Patient mit allogenen Lymphozyten infundiert, die vor der Verabreichung an den Patienten in vitro durch Aussetzung gegenüber einem T-Zellenaktivator aktiviert wurden. Nachfolgend auf die Infusion wird der Patient auf Niveaus bösartiger hämatopoetischer Zellen überwacht. Der Patient kann auch mit in vivo-T-Zellenaktivator versehen werden. Der T-Zellenaktivator, ob nun zur in vitro-Aktivierung genutzt oder in vivo verabreicht, kann sein wie oben für die Ausführungen für massive Tumore beschrieben.
Die Medikamente der vorliegenden Erfindung sind besonders nützlich zur Behandlung derjenigen unglücklichen Patienten, die trotz eines allogenen Stammzellentransplantats fortfahren, bösartige Zellen aufzuweisen, wie durch offenen Rückfall oder ein anderes Anzeichen, dass die bösartigen Zellen nicht vollständig ausgerottet worden sind, nachgewiesen. Die Medikamente sind weiterhin anwendbar für die Behandlung von Patienten, die nicht nur nicht auf ein allogenes Stammzellentransplantat reagierten, sondern auch nicht auf eine nach der Transplantation angewandte Zelltherapie-Vorgehensweise einschließlich der Infusion allogener ruhender Spenderlymphozyten (Allo-ZT) reagierten.
Dem Patienten können etwa 10⁵ Zellen/kg bis etwa 10⁹ Zellen/kg allogener ASL verabreicht werden, und er wird dann auf Niveaus bösartiger Zellen überwacht. Dem Patienten kann auch T-Zellenaktivator in vivo verabreicht werden, beispielsweise durch Injektion zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Vorzugsweise wird der T-Zellenaktivator dem Patienten über einen Zeitverlauf von zwei bis sieben Tagen verabreicht, vorzugsweise zwei bis fünf Tage, und meistbevorzugt zwei bis vier Tage. Der T-Zellenaktivator kann beginnend an demselben Tag wie die Infusion der allogenen aktivierten Spenderlymphozyten verabreicht werden.
Vorzugsweise sind die allogenen Spenderlymphozyten HLAkompatibel mit dem Patienten. HLA-kompatible Lymphozyten umfassen Zellen, die vollständig HLA-passend zu dem Patienten sind. Alternativ sollten die HLA-kompatiblen Zellen zumindest haploidentisch mit dem Patienten sein. Werden die HLA-kompatiblen Lymphozyten von einem Geschwister des Patienten gewonnen, so sind die Zellen vorzugsweise vollständig HLA-passend zu dem Patienten, obwohl ein gewisses Nichtzusammenpassen toleriert werden kann. Beispielsweise können die HLA-kompatiblen Lymphozyten von einem Geschwister in manchen Fällen an einer einzelnen HLA-Stelle nicht zusammenpassend sein. Werden die HLA-kompatiblen Lymphozyten von einer nicht verwandten Person gewonnen, so sind die Zellen vorzugsweise vollständig HLA-passend zu dem Patienten.
Die vorliegende Erfindung verschafft die Verwendung sowohl allogener Spenderlymphozyten, unaktiviert oder in vitro-aktiviert, als auch T-Zellenaktivatoren bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung menschlicher Krebspatienten, wie oben beschrieben. Ein Herstellungsgegenstand, der Verpackungsmaterial und einen Behälter innerhalb des Packungsmaterials umfasst, kann verschafft sein. Das Verpackungsmaterial kann ein Etikett oder eine Packungsbeilage enthalten, das bzw. die andeutet, dass der Inhalt des Behälters zur Behandlung menschlicher Krebspatienten verwendet werden kann, wie oben beschrieben. Der Behälter kann ein faltbarer Behälter sein, der gegenüberliegende Wände aus flexiblem Material und ein aus dem Behälter ragendes flexibles Röhrchen umfasst. Der Inhalt des Behälters kann unaktivierte Lymphozyten oder ASL umfassen, die in Bezug auf den zu behandelnden Patienten allogen sind. Alternativ kann der Behälter einen T-Zellenaktivator enthalten.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1. Überlebensprozentsatz als Funktion von Tagen, nachfolgend auf die intradermale Einimpfung von 4T1 Tumorzellen (10⁴) in 13 BALB/c- oder F1-Mäuse in 3 getrennten Experimenten per Mäuselinie.
2. Überlebensprozentsatz als Funktion von Tagen, nachfolgend auf eine intradermale Anfechtungsdosis von (10⁴) 4T1-Zellen, verabreicht an nicht vorbehandelte BALB/c-Mäuse (n = 20) oder BALB/c-Mäuse, die 3 Mal mit 10⁷ bestrahlten 4T1-Zellen, verabreicht in Intervallen von 7–10 Tagen, intradermal vorimmunisiert wurden. Die Anfechtungsdosis wurde 7 Tage nach der 3. immunisierenden Dosis injiziert.
3. Detektion des Y-Chromosoms durch PCR-Analyse. Proben peripheren Bluts wurden weiblichen BALB/c-Empfängermäusen 1, 3, 6 und 9 Monate nachfolgend an die hämatopoetische Rekonstitution mit männlichen DBA/2-Spenderzellen (Pfade: jeweils 1–4) entnommen. Pfad 5: männliche positive Kontrolle direktes PCR, Pfad 6: positive DNA-Kontrolle. Pfad 7: keine DNA-Kontrolle. Pfad 8: Hae III-Größenmarker. Die Intensität des Signals hängt von der Anzahl von Zellen ab, die in jeder Probe unterschiedlich war.
4. 4T1-Tumorgröße als Funktion von Tagen nachfolgend auf Tumoreinimpfung in 13 nicht vorbehandelte BALB/c-Mäuse und 15 Chimären-BALB/c-Mäuse, die mit DBA/2-hämatopoetischen Zellen rekonstituiert waren (DBA--BALB/c). Die Tumorzellen wurden 60–90 Tage nachfolgend an die Knochenmarkzellrekonstitution in Chimärenmäuse eingeimpft. Die Ergebnisse stellen 3 getrennte Experimente dar.
5. 4T1-Tumorgröße als Funktion von Tagen nachfolgend auf die Tumorzelleneinimpfung in 18 nicht vorbehandelte F1(BALB/c × C57B1/6)-Mäuse und 11 Chimären-F1-Mäuse, die mit C57B1/6-hämatopoetischen Zellen rekonstituiert waren (C57--F1). Tumorzellen wurden in Chimärenmäuse 60–90 Tage nachfolgend auf die Knochenmarkzellrekonstitution eingeimpft. Die Ergebnisse stellen 3 getrennte Experimente dar.
6. Entwicklung von Leukämie in normalen BALB/c-Kontrollmäusen (Gruppe A, n = 10) und in B6 → BALB/c-Chimärenmäusen (Gruppe B, n = 12), die intravenös mit 10⁶ BCL1-Zellen geimpft waren.
7. Zeitintervalle, die für effektive Transplantat-gegen-Leukämie-Effekte benötigt wurden: Entwicklung von Leukämie in sekundären adoptiven Empfänger-BALB/c-Mäusen nach dem Empfang von 10⁵ Milzzellen, erhalten von B6 → BALB/c-Chimären, denen 10⁶ BCL1-Zellen 7 Tage (Gruppe A), 14 Tage (Gruppe B) und 21 Tage (Gruppe C) vor dem adoptiven Transfer eingeimpft worden waren; und von normalen BALB/c-Mäusen, die mit 10⁶ BCL1-Zellen geimpft waren: 7 Tage (Gruppe D), 14 Tage (Gruppe E) und 21 Tage (Gruppe F) vor dem adoptiven Transfer. Jede Gruppe bestand aus 10 Mäusen.
8. Verstärkung der Transplantat-gegen-Leukämie-Effekte durch allogene Milzzellen und rhIL-2: Entwicklung von Leukämie in sekundären adoptiven Empfänger-BALB/c-Mäusen nach dem Empfang von 10⁵ Milzzellen, erhalten von B6 → BALB/c-Chimären oder normalen BALB/c-Mäusen 7 Tage nach der Impfung mit 10⁶ BCL1-Zellen. Gruppe A: unbehandelte Chimären; Gruppe B: mit rhIL-2 injizierte Chimären; Gruppe C: mit Milzzellen infundierte Chimären; Gruppe D: mit Milzzellen und mit rhIL-2 infundierte Chimären; Gruppe E: normale BALB/c-Kontrollen ohne weitere Behandlung; Gruppe F: normale BALB/c-Kontrollen, denen rhIL-2 injiziert worden war; Gruppe G: normale BALB/c-Kontrollen, denen Milzzellen infundiert worden waren; Gruppe H: normale BALB/c-Kontrollen, denen Milzzellen und rhIL-2 infundiert worden waren. Jede experimentelle Gruppe bestand aus 10 Mäusen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Eine Serie von Tierexperimenten wurde unternommen, um 1) die Fähigkeit allogener Lymphozyten, eine Reaktion eines massiven Tumors nachfolgend an allogene Stammzellentransplantation zu bewirken, und 2) die Durchführbarkeit und Wirksamkeit von Allo-AZT mit oder ohne T-Zellenaktivatorverabreichung in vivo nachfolgend an allogene Stammzellentransplantation zu bewerten. Die in den Tierexperimenten entwickelten Konzepte wurden auch auf den klinischen Bereich ausgedehnt, um die Effizienz sowohl bei menschlichen Brustkrebspatienten als auch bei menschlichen Krebspatienten, die nicht auf Allo-KMT und Allo-ZT reagierten, zu demonstrieren.
Die unten erläuterten Tierexperimente demonstrieren die Durchführbarkeit des Herbeiführens eines immunvermittelten Transplantat-versus-Tumor(TVT)-Effekts bei massiven Tumoren, unter Verwendung eines Mäuse-Modells von Mamma-Adenokarzinom, abgeleitet aus BALB/c/(H-2^d)-Mäusen. Eine Mäuse-Brustkrebszelllinie (4T1) wurde verwendet, die in syngenen (BALB/c) oder haploidentischen F1(BALB/c × C57B1/6)(Fl)-Mäusen hoch tumorerzeugend ist, nur teilweise tumorerzeugend ist bei einer kongenen H-2^d-Mäuselinie (DBA/2) und in einer nicht verwandten MHC(H-2^b)-Mäuselinie (C57B1/6) nicht tumorerzeugend ist. 4T1-Zellen drücken an ihren Oberflächen Antigene der Klasse I mit größerer Histokompatibilität (MHC), Haftmoleküle und CD44-zielansteuerungsverbundene Haftmoleküle aus, drücken jedoch nicht MHC-Klasse II-Antigene oder kostimulierende Moleküle wie etwa B7 aus.
Weibliche BALB/c(H-2^d)- oder F1(H-2^d/b)-Mäuse wurden mit männlichen, in kleinerem Umfang nicht zusammenpassenden DBA(H-2^d)-gewonnenen Knochenmarkzellen beziehungsweise mit in größerem Umfang nicht zusammenpassenden C57(H-2^b)-gewonnenen Knochenmarkzellen rekonstituiert, 24 Stunden nach einer tödlichen Ganzkörperbestrahlung. Empfängermäuse, die in kleinerem oder größerem Umfang nicht zusammenpassende transplantierte Spenderzellen trugen, wurden 2–3 Monate nachfolgend auf die Knochenmarkrekonstitution mit 4T1-Tumorzellen geimpft. Die allogenen Spenderzellen, ob sie sich nun von den Tumorzellen durch in geringem Umfang nicht zusammenpassende oder MHC-Antigene unterschieden, waren in der Lage, die Entwicklung des Primärtumors zu beeinflussen, der MHC-Alloantigene vom Wirtstyp ausdrückte. Die Tumorgröße bei Knochenmarkchimären über in kleinerem Umfang nichtzusammenpassende oder MHC-Antigene war signifikant (p < 0,05) kleiner als die bei untransplantierten BALB/c- oder F1-Kontrollmäusen beobachtete Tumorgröße. Diese Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, einen Transplantat-gegen-Tumor-Effekt bei alloreaktiven Zellen in einem Mäusemodell von Mammakarzinom herbeizuführen.
Vorige Studien (Cohen et al., J. Immunol. 151: 1803–10 (1993) haben demonstriert, dass die Verwendung von in vitro-aktivierten Spenderlymphozyten (ASL) mit oder ohne in vivo rhIL-2 (Allo-AZT +/– rhIL-2) signifikante Transplantat-gegen-Leukämie-Effekte bei Mäusen hervorruft. Da jedoch ein 100%-iges Überleben bei allen Mäusen, denen allogene Lymphozyten verabreicht wurden, beobachtet wurde, war es nicht möglich, besondere Erhöhungen der Transplantat-gegen-Leukämie-Effekte durch die Verwendung von ASL oder in vivo-rhIL-2 zu identifizieren. Diese Studie verschaffte auch die Bestätigung, dass die Transplantat-gegen-Leukämie-Effekte vorwiegend durch allogene T-Zellen und nicht durch natürliche Killer(NK)-Zellen verursacht wurden, die bis vor kurzem als nicht-MHC-begrenzt betrachtet wurden. Alloreaktive NK-Zellen, B-Zellen und Makrophagenzellen können jedoch eine Rolle bei den durch allogene T-Zellen herbeigeführten Transplantat-gegen-Leukämie- oder Transplantat-gegen-Tumor-Effekten spielen. Die Ergebnisse deuteten weiterhin an, dass die Transplantat-gegen-Leukämie-Effekte nicht auf die Kaskade allogener Reaktionen, entzündlicher Reaktionen und der in vivo-Cytokinfreisetzung, die von GVHD per se herrührt, zurückzuführen sind.
In einer weiteren, unten berichteten Reihe von Experimenten wurden BALB/c-, C57B1/6 (B6)- und (BALB/c × B6)F1 (F₁)-Mäuse benutzt, um verschiedene allogene Zelltherapieprotokolle, die entweder von in vivo-Verabreichung eines T-Zellenaktivators begleitet waren oder nicht, auszuwerten. BCL1-Zellen, die eine spontane B-Zellen-Leukämie/Lymphom von BALB/c-Ursprung, ursprünglich von Slavin und Strober, Nature 272: 624 (1978) beschrieben, darstellen, wurden als Tumormodell verwendet. Die Infusion von 10 bis 100 BCL1-Zellen in BALB/c-Mäuse führt zu einer typischen B-Zellen-Leukämie/Lymphom, gekennzeichnet durch Splenomegalie (Vergrößerung der Milz) mit anschließender peripherer Blutlymphozytose und Tod von 100% der Empfänger. BCL1 verursacht ebenfalls Leukämie bei F₁-Empfängern, die Entwicklung dauert jedoch im Vergleich zu BALB/c-Empfängern länger. Der derzeitige Erfinder erforschte die Empfänglichkeit gut etablierter und voll rekonstituierter toleranter B6 → BALB/c-Chimären für BCL1-Zellen. Chimären wurden erzeugt, indem BALB/c-Mäuse tödlich bestrahlt und 24 Stunden später mit T-Zellen-verarmten B6-Knochenmarkzellen voll rekonstituiert wurden. Keine der Chimären zeigte irgendein klinisches Anzeichen von GVHD. Normale BALB/c-Mäuse und B6 → BALB/c-Chimären wurden intravenös mit 10⁴, 10⁵ oder 10⁶ BCL1-Zellen injiziert. Alle normalen BALB/c-Mäuse entwickelten innerhalb von 21–58 Tagen Leukämie und starben, während alle gut etablierten Chimären (d. h. die 2–3 Monate nach Herbeiführen des Chimärentums Chimären blieben) länger als 6 Monate ohne Nachweis der Erkrankung überlebten. Im Gegensatz dazu zeigten vorige Studien, dass die frühe Einimpfung von BCL1 in B6 → BALB/c- oder B6 → F1-Empfänger bei allen Empfängern mit MRD zu Leukämie führten. Weiss et al., Cancer Immunol. Immunother. 31: 236 (1990).
Adoptive Transferexperimente wurden sowohl mit den normalen BALB/c- als auch den B6 → BALB/c-Chimären, denen 10⁶ BCL1-Zellen injiziert worden waren, durchgeführt. Milzzellen (10⁵) wurden auf 10 sekundäre nicht vorbehandelte BALB/c-Mäuse 7, 14 und 21 Tage nach der Einimpfung der BCL1-Zellen übertragen. Sieben von 10 sekundären Empfängern, die Zellen von Chimären empfingen, die 7 Tage nach der Einimpfung mit BCL1 entnommen wurden, entwickelten innerhalb von 44 Tagen Leukämie. Im Gegensatz dazu entwickelte keiner der sekundären Empfänger, die Zellen erhielten, welche von Chimären erhalten wurden, die 14 und 21 Tage vor dem Zelltransfer mit BCL1-Zellen geimpft wurden, Leukämie. Die Daten suggerieren, dass eine Zeitdauer von zumindest 14 Tagen für die vollständige Ausrottung der 10⁶ BCL1-Zellen erforderlich ist, während bei 7 Tagen die Ausrottung von Leukämiezellen noch unvollständig ist.
Weitere Experimente wurden bei den Chimären durchgeführt, um die Effekte von in vivo-Verabreichung von T-Zellenaktivator (rhIL-2) zu bestimmen. Chimären wurden 10⁶ BCL1-Zellen injiziert und sie wurden dann unterschiedlich mit in vivo-rhIL-2, Lymphozyten oder Kombinationen von rhIL-2 und Lymphozyten behandelt. Nach sieben Tagen wurden alle Mäuse geopfert, und die Milzzellen wurden für adoptiven Transfer in sekundäre BALB/c-Empfänger verwendet, wie oben.
Alle sekundären BALB/c-Empfänger, die Milzzellen von den normalen BALB/c-Kontrollmäusen empfingen, entwickelten Leukämie. Weiterhin wurden bei mit rhIL-2, allogenen Splenozyten oder beidem behandelten normalen BALB/c-Kontrollmäusen keine antileukämischen Effekte festgestellt. Im Gegensatz dazu entwickelten 70% der Chimären in der Gruppe ohne jede zusätzliche Behandlung für eine Zeitspanne von mehr als 6 Monaten keine Leukämie. Bei den 30%, die Leukämie entwickelten, war der Beginn um 44–52 Tage verzögert. von den Chimären, die nur B6-Lymphozyten empfingen, blieben 80% krankheitsfrei und die restlichen 20% zeigten einen verzögerten Beginn von Leukämie. Von den Chimären, die mit rhIL-2 behandelt wurden, oder die sowohl mit rhIL-2 als auch B6-Lymphozyten behandelt wurden, waren 100% länger als 6 Monate krankheitsfrei.
Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse an, dass durch die Bestrahlung von BALB/c-Mäusen und die Rekonstitution mit T-Zellen-verarmten B6-Knochenmarkzellen erzeugte Chimären in der Lage sind, dem leukämieerzeugenden Potential von BCL1-Zellen (die von BALB/c-Ursprung sind) zu widerstehen, vorausgesetzt, dass das Chimärentum etabliert ist und die Empfänger immunkompetent sind. Dies trotz der Tatsache, dass Chimären vollständig tolerant gegenüber BALB/c-Alloantigenen sind, da nachgewiesen wurde, dass solche Chimären vollständig tolerant gegenüber Wirts-(BALB/c)-Alloantigenen sind und Spendertyp-Hautalloeinpflanzungen undefiniert akzeptieren. Levite und Reisner, Transplantation 55: 3 (1993). Außerdem sind die Chimären resistent gegenüber den BCL1-Zellen, bei Abwesenheit von GVHD. Somit können die Antitumor-Effekte bei toleranten Chimären die Erkennung von mit Tumoren zusammenhängenden oder tumorspezifischen Zelloberflächen-Bestimmungsfaktoren, anderen als die Bestimmungsfaktoren vom Wirtstyp des größeren Histokompatibilitätskomplexes (MHC), unabhängig von GVHD umfassen. Signifikanterweise kann die Verbesserung von Transplantat-gegen-Leukämie-Effekten erzielt werden, ohne GVHD oder alternativ mit kontrollierbarer GVHD, durch die Verabreichung nach Transplantation von ASL mit oder ohne einen kurzen Verlauf von relativ niedrig dosiertem rhIL-2.
Es ist besonders vorteilhaft, abgestufte Schritte allogener Zellen zu verwenden, während auf GVHD kontrolliert wird. Je größer das Zeitintervall von KMT zur Zelltherapie ist, desto weniger wahrscheinlich ist die Entwicklung unkontrollierbarer GVHD und desto größer die Anzahl allogener Spender-T-Zellen, die gegeben werden kann. Siehe Slawin et al., Journal of Exp. Med. (Journal für experimentelle Medizin) 147: 963 (1978); Slavin et al., Cancer Invest. (Krebsforschung) 10: 221–7 (1992). Dies kann mit Mäusen mit Resttumorzellen, denen allogene T-Zellen während der frühen Nach-Knochenmarktransplantationsperiode gegeben wurden, verglichen werden. Die infundierten allogenen T-Zellen werden in diesen Fällen nicht tolerant gegenüber dem Wirt, was zu GVHD führt. Somit ermöglicht es die Infusion allogener Lymphozyten, insbesondere nachfolgend auf die in vitro- und in vivo-Aktivierung von Spender-T-Zellen durch T-Zellenaktivatoren wie etwa rhIL-2, relativ spät nach einer Knochmarktransplantation nichttumortolerante Spender-T-Zellen zu infundieren, die vom Empfänger akzeptiert werden, die jedoch potente Transplantat-gegen-Leukämie-Effekte hervorrufen. Die T-Zellen können in abgestuften Schritten gegeben werden, wobei proportional mehr Zellen verabreicht werden, wenn die Zeit seit der Knochenmarktransplantation voranschreitet.
Die von den Mäuseexperimenten herrührenden Ergebnisse und Hinweise wurden mit menschlichen Patienten, die an Brustkrebs und bösartigen hämatologischen Erkrankungen, einschließlich akuter und chronischer Leukämien, litten, in den klinischen Bereich ausgedehnt. Spezieller hat der heutige Erfinder entdeckt, dass eine therapeutische Vorgehensweise von Allo-ZT bei der Behandlung von Brustkrebs nach allogener Knochenmarktransplantation effizient sein kann. Der vorliegende Erfinder hat auch entdeckt, dass aktivierte Spenderlymphozyten Anti-Tumor-Effekte verschaffen können, die sogar über diejenigen hinausgehen, die mit unaktivierten allogenen Lymphozyten erreichbar sind. Beispielsweise können Allo-AZT und in vivo-T-Zellenaktivator erfolgreich in einem klinischen Umfeld verwendet werden, um den Rückfall nachfolgend auf Allo-KMT zu behandeln. Somit verschaffen die Ergebnisse bei menschlichen Patienten eine wichtige Bestätigung und Ausweitung der oben berichteten Tierdaten.
Spezieller hat der vorliegende Erfinder entdeckt, dass die in vitro-Aktivierung von Spender-PBL vor der Infusion in den Patienten ein Mittel verschafft, um Remission nachfolgend an eine nicht erfolgreiche Vorgehensweise von Knochenmarktransplantation und Zell-Immuntherapie herbeizuführen. Überraschenderweise verschafften in vitro aktivierte Spender-PBL einen messbaren Transplantat-gegen-Leukämie-Effekt, wenn dieselben Zellen, in Abwesenheit solcher in vitro-Behandlung, nicht in der Lage waren, die Tumorzellen auszurotten. Es ist anzumerken, dass in manchen Fällen diese unaktivierten Zellen, obwohl sie vor der Infusion keinem T-Zellenaktivator ausgesetzt waren, trotzdem in vivo nachfolgend auf die Infusion aktivierendem T-Zellenaktivator ausgesetzt waren. Im Gegensatz dazu waren PBL von demselben Spender effizient, wenn sie vor der Infusion voraktiviert wurden (Allo-AZT-Herangehensweise) und von einem in vivo-T-Zellenaktivator begleitet waren. Zusätzlich wird hierin demonstriert, dass eine Allo-AZT-Vorgehensweise in diesem Umfeld vorgenommen werden kann, ohne unbedingt eine klinisch signifikante GVHD herbeizuführen.
Zur Dokumentation der Fähigkeit allogener Lymphozyten, einen therapeutischen Effekt bei Patienten mit massivem Tumor zu verschaffen, wurde ein menschlicher Patient mit akuter myeloischer Leukämie (AML) und zurückkehrendem Brustkrebs mit Induktionschemotherapie, allogener Stammzellentransplantation und Nach-Transplantationsallogener Zelltherapie behandelt (siehe Beispiel 3 unten). Die Herangehensweise bei der Behandlung dieses Patienten war auf AML hin orientiert, obwohl von den meisten für die Induktionschemotherapie verwendeten Komponenten bekannt ist, dass sie auch gegen Brustkrebs aktiv sind. Trotzdem war die Dosisintensität weniger als optimal für die Behandlung von zurückkehrendem Brustkrebs, und es würde nicht erwartet, dass ein Patient mit einem agressiven zurückkehrenden Brustkrebs auf eine solche „suboptimale" Chemotherapie ansprechen würde. Daher kann die Brustkrebsreaktion der von diesem Patienten erhaltenen allogenen zellvermittelten Immuntherapie zugeschrieben werden.
Als illustratives Beispiel zur Demonstration der klinischen Effizienz der Allo-AZT- plus in vivo-T-Zellenaktivator-Behandlungsvorgehensweise wurde ein menschlicher Patient mit chronischer myeloischer Leukämie (CML) mit einer sehr schlechten Prognose behandelt (siehe Patient Nr. 1 in Beispiel 3, unten).
Chronische myeloische Leukämie (CML) ist eine hämatologische Erkrankung, die das Ergebnis neoplastischer Umwandlung pluripotenter Stammzellen ist. Das Philadelphia(Ph)-Chromosom wurde zuerst in 1960 als ein im Knochenmark von Patienten mit CML vorgefundenes verkürztes Chromosom beschrieben. Das Ph-Chromosom ist das Ergebnis einer reziproken Verlagerung zwischen den langen Armen der Chromosome 9 und 22. Die potentiellen Bruchstellen an Chromosom 22 treten in einer kleinen 5,8 kb-Region, Bruchstellen-Häufungsregion (Breakpoint cluster region, bcr) genannt, auf. Die Bruchstellen-Häufungsregion ist Teil eines großen bcr-Gens, das vier Exone enthält. Potentielle Bruchstellen am Chromosom 9 sind über einen Abstand von zumindest 100 kb verteilt, befinden sich jedoch alle 5' zu dem c-abl-Proto-Onkogen. Die Ph-Verlagerung befördert das c-abl-Gen von seiner Position auf Chromosom 9 zu dem Ph-Chromosom. Da 90% der CML-Patienten das Ph-Chromosom tragen, stellt es das typische Kennzeichen von CML dar und ist diagnostisch für die Krankheit. Annähernd 5% der Kindheits- und 30% der Erwachsenenfälle akuter lymphatischer Leukämie (ALL) tragen ebenfalls das Ph-Chromosom. Das Ph-Chromosom in CML und ALL rührt von derselben Verlagerung von c-abl auf verschiedene Introne des bcr-Gens her.
Die Eliminierung von Zellen, die den Ph-Karyotyp aufweisen, ist ein Anzeichen für Remission. Ein alternatives Verfahren zur Überprüfung des Vorhandenseins des Ph-Chromosoms ist durch die Anwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) zum Aufspüren des bcr/abl-Transkripts. Die Eliminierung des bcr/abl-Transkripts bei PCR-Analyse ist Indikativ für die erfolgreiche Eliminierung von Zellen, die zu CML führen.
Vor der Behandlung hatte der Patient (Patient Nr. 1 in Beispiel 3, unten) nachfolgend auf Allo-KMT einen Rückfall erlitten und war nachfolgend auf einen Verlauf von Allo-ZT, begleitet von in vivo-Behandlung mit rhIL-2, positiv für CML-Marker geblieben. Der Patient hatte keine GVHD als Ergebnis des Knochenmarktransplantats oder der Allo-ZT/rhIL-2-Vorgehensweise erfahren. Leukozyten aus peripherem Blut (PBL), genommen von demselben HLA-passenden Bruder, der Zellen für die Allo-KMT spendete, wurden in vitro durch Inkubation mit rhIL-2 voraktiviert. Die aktivierten Spenderlymphozyten wurden in einer Dosis zwischen 10⁷ und 10⁸ Zellen pro Kilogramm Körpergewicht verabreicht. Dies wurde unmittelbar gefolgt durch einen dreitägigen Verlauf von rhIL-2, in vivo verabreicht, um einen weiteren Stimulus für die Aktivierung nachfolgend auf die Infusion von Zellen in den Patienten zu verschaffen.
Der so behandelte Patient hat keine klinischen Laboranzeichen von GVHD erfahren und hat eine vollständig normale Knochenmarkmorphologie.
Signifikanterweise wurde nachfolgend an die Allo-AZT/rhIL-2-Vorgehensweise der PCR-Test auf Vorhandensein des bcr/abl-Verschmelzungsprodukts negativ. 28 Monate nach der Behandlung zeigt der Patient keinerlei Anzeichen für das Ph-Chromosom, weder durch kryogenetische noch durch PCR-Analyse. Zusätzliche Patienten, denen allogene Zelltherapie gegeben wurde, sind in Beispiel 3, unten, aufgeführt.
Vorzugsweise werden, wenn die Medikamente der vorliegenden Erfindung für die Behandlung von menschlichen Patienten mit massiven Tumoren verwendet werden, die PBL des Spenders, unaktiviert oder in vitro aktiviert, nachfolgend an allogene Stammzellentransplantation in den Patienten infundiert. Im allgemeinen werden die PBL des Spenders infundiert, nachdem der Patient zumindest eine teilweise hämatopoetische Erholung von dem Stammzellentransplantat erreicht hat; in vielen Fällen können, je größer das Zeitintervall von der Stammzellentransplantation bis zur Verabreichung von Spender-PBL ist, desto mehr Lymphozyten vorgesehen werden, da das Risiko unkontrollierbarer GVHD zu späteren Zeiten nach der Transplantation proportional kleiner ist. Dem Patienten können abgestufte Schritte von Spender-PBL verabreicht werden, wobei typischerweise mit 10⁵ oder 10⁶ T-Zellen/kg begonnen wird und mit log-Schritten vorangegangen wird, z. B. 10⁷, 10⁸, 10⁹ T-Zellen/kg, vorausgesetzt, dass der vorigen Infusion keine oder minimale (kontrollierbare) GVHD folgt. Wenn verwendet, werden proportional weniger aktivierte Spenderlymphozyten in Vergleich zu den entsprechenden unaktivierten Spender-PBL verabreicht. Dies deswegen, weil aktivierte Lymphozyten, obowhl sie möglicherweise einen erhöhten Anti-Tumor-Effekt im Vergleich zu unaktivierten Lymphozyten hervorrufen, den Patienten auch einem etwas höheren Risiko von GVHD aussetzen. Es ist jedoch anzumerken, dass, wenn ASL mit einer begrenzten Lebensdauer verwendet werden, das Risiko von GVHD abgeschwächt wird und größere Anzahlen ASL verwendet werden können. Beispielsweise können, wie nachstehend erläutert, allogene Lymphozyten mit einer „Suizidgen"-Gestaltung umgeformt werden, die ein selektives Abtöten der infundierten Zellen gestattet, nachdem sie den Anti-Tumor-Zelleffekt im Patienten ausgeübt haben.
Zur Aktivierung der Spender-PBL werden die Zellen in rhIL-2 in einer Konzentration von 60 IU/ml bis 12.000 IU/ml, vorzugsweise von 600 IU/ml bis 8.000 IU/ml, und meistbevorzugt von 6.000 IU/ml inkubiert. Es ist deutlich, dass diese Konzentrationen variiert werden können, um bestimmten Inkubationsmedien, unterschiedlichen Chargen und Zubereitungen von rhIL-2 und anderen Routinevariationen bei klinischen und Laborprozeduren zu entsprechen. Wenn beispielsweise der T-Zellenaktivator monoklonale Antikörper wie etwa Anti-CD3 und/oder Anti-CD28 enthält, die zusammen mit rhIL-2 verwendet werden, dann kann eine entsprechend niedrigere Konzentration von rhIL-2 erforderlich sein. Andere T-Zellenaktivatoren als IL-2 können bei den vorliegenden Prozeduren verwendet werden, solange die Spender-PBL geeignet aktiviert werden. Solche alternativen T-Zellenaktivatoren können, ohne Einschränkung, Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-5 (IL-5), Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-7 (IL-7), Interleukin-12 (IL-12), Interleukin-13 (IL-13), Interleukin-15 (IL-15), Interferon-Alpha (IFNα), Interferon-Gamma (IFN_Y), Tumornekrosefaktoren wie etwa TFNα, Anti-CD3-Antikörper einschließlich Antigen-bindender Fragmente davon (Anti-CD3), Anti-CD28-Antikörper einschließlich Antigen-bindender Fragmente davon (Anti-CD28), Phytohämagglutin, Concanavalin-A und Phorbolester umfassen.
Die Peripherblutlymphozyten des Spenders werden in dem T-Zellenaktivator inkubiert, bis ein ausreichendes Aktivierungsniveau erreicht ist. Beispielsweise können die Zellen in T-Zellenaktivator wie etwa rhIL-2 2 bis 14 Tage, vorzugsweise 4 bis 5 Tage, lang inkubiert werden. Die Länge der Inkubation kann variiert werden, um Routinevariationen in Temperatur, Medienrezepturen, normalen Variationen der Peripherblutlymphozyten-Reaktivität, Verwendung zusätzlicher Zytokine, die erforderlich sind, um Zellwachstum und -aktivierung zu optimieren, und anderen Routinevariablen entgegenzukommen, vorausgesetzt, dass die Peripherblutlymphozyten einen geeigneten Aktivierungszustand annehmen. Sind beispielsweise relativ große Anzahlen von Zellen für die Infusion in den Patienten erwünscht, so kann eine entsprechend verlängerte Inkubationszeit erforderlich sein. Es können verschiedene Labortests verwendet werden, um einen geeigneten Endpunkt für die in vitro-Aktivierungsperiode zu bestimmen. Diese könnten fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FAZS) zum Aufspüren verschiedener relevanter T-Zellen-Phänotypen und die Messung zytotoxischer T-Lymphozyten-Vorläufer-Aktivität (CTLp) umfassen.
Zur Verminderung oder Eliminierung der Möglichkeit von GVHD können allogene Spenderlymphozyten verwendet werden, deren Lebensdauer begrenzt ist. Beispielsweise können Spenderlymphozyten mit einem Anfälligkeitsfaktor oder „Suizidgen" umgewandelt werden, das die Lymphozyten für ein chemotherapeutisches Mittel anfällig macht. Siehe z. B. Tiberghien, J. Leukocyte Biol. 56: 203–09 (1994). In einer Ausführung wird Thymidinkinase vom Herpes simplex-Virus (HS-tk) als Suizidgen angewendet.
Zellen, die HS-tk ausdrücken, sind anfällig für Abtötung durch Aussetzen gegenüber Acyclovir oder Ganciclovir. Das HS-tk-Gen kann mittels eines retroviralen Vektors, der geeignete Promoter, selektierbare Marker und/oder andere flankierende Elemente enthält, in T-Zellen befördert werden. Tiberghien et al., Blood 84: 1333–41 (1994); Mavilio et al., Blood 83: 1988–97 (1994). Nachfolgend auf die Infusion in den Patienten können solche Lymphozyten selektiv abgetötet werden, nachdem ein Anti-Tumor-Effekt hervorgerufen wurde, jedoch vor dem Beginn schwerer GVHD. Andere Verfahren zur Begrenzung der Lebensdauer der infundierten allogenen Lymphozyten können ohne Einschränkung Bestrahlung, Photosensibilisierung und die Verwendung von Anti-Lymphozyten-Antikörpern umfassen.
Die exakte Anzahl infundierter allogener Lymphozyten kann von der Verfügbarkeit und von den zuvor identifizierten Risikofaktoren des Patienten für GVHD abhängen. Beispielsweise kann der Patient mit 10⁵ Zellen/kg begonnen haben, mit einer Steigerung um einen (1) log-Schritt alle 1–4 Wochen, wenn sich nachfolgend an die vorige Verabreichung keine GVHD entwickelt. Um die fortgesetzte Aktivierung der allogenen Lymphozyten nach der Infusion in den Patienten zu gestatten, kann dem Patienten T-Zellenaktivator, wie etwa IL-2, durch subkutane Injektion oder jedes andere, zur Routineverabreichung von Medikamenten geeignete Verfahren verabreicht werden. Diese in vivo-Verabreichung von T-Zellenaktivator wird vorzugsweise an demselben Tag begonnen wie die Infusion der allogenen Lymphozyten oder kann zu jedem Zeitpunkt bis zu etwa 7 Tagen nach der Infusion begonnen werden. Der in vivo verabreichte T-Zellenaktivator kann über einen Zeitverlauf von 1 bis 14 Tagen, vorzugsweise über einen Zeitverlauf von 2 bis 7 Tagen, bevorzugter über einen Zeitverlauf von 2 bis 4 Tagen und meistbevorzugt von 3 Tagen gegeben werden. In einer bevorzugten Ausführung wird rhIL-2 drei Tage lang in einer Konzentration von 10⁶ bis 10⁷, vorzugsweise 6 × 10⁶, IU/m² Körperaberflächengebiet infundiert. Zeitverlauf, und Konzentrationen können variiert werden, um klinischen Indikationen zu entsprechen, wie etwa der Neigung zu GVHD oder Fähigkeit des Patienten, den gewählten T-Zellenaktivator zu tolerieren.
Nachfolgend auf die Allo-ZT- und/oder Allo-AZT-Behandlung und, falls erwünscht, in vivo-Behandlung mit T-Zellenaktivator, wird der Patient auf Anzeichen und Symptome von GVDH und, wo geeignet, auf Niveaus bösartiger Restzellen überwacht. Die Überwachung auf Niveaus bösartiger Restzellen kann die klinische Überwachung des Patienten auf körperliche Rückfallsymptome beinhalten. Vorzugsweise beinhaltet die Überwachung die Auswertung diagnostischer Kriterien, die das Aufspüren bösartiger Zellen vor dem Auftreten körperlicher Symptome gestattet. Beispielsweise können kryogenetische Studien durchgeführt werden, worin die makroskopische Chromosomenmorphologie untersucht wird. Alternativ kann die Überwachung die Verwendung von Molekularsonden umfassen, um beispielsweise abweichende Nukleinsäuresequenzen aufzuspüren, die charakteristisch für die bösartigen Zellen sind. Im Fall von CML kann der Patient auf den Nachweis des Ph-Chromosoms überwacht werden, wie es durch kryogenetisches Screening enthüllt wird, oder wie es durch die PCR-Analyse des bcr/abl-Transkripts in Zubereitungen von Nukleinsäure, aus dem peripheren Blutkreislauf entnommen, enthüllt wird. Andere krankheitsspezifische Marker können gleichermaßen nützlich sein, wie etwa der Alpha-RAR-Marker für AML-M3 oder eine breite Spanne von Markern, die für massive Tumore verschiedenen Ursprungs entwickelt wurden. Das Verschwinden der gewählten Marker ist eine Indikation dafür, dass der Patient aufgrund der Allo-ZT oder Allo-AZT-Behandlungs-Vorgehensweise in die Remission eingetreten ist.
Bei Abwesenheit krankheitsspezifischer Marker können andere Marker gleichermaßen nützliche Information über den Status wirtabgeleiteter gegenüber spenderabgeleiteter Zellen verschaffen. Beispielsweise kann das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein geschlechtschromosomenspezifischer Marker im Blutkreislauf des Wirts verwendet werden, um weiblich-zu-männliche oder männlich-zu-weibliche Wirt-/Spenderkombinationen zu überwachen. Gleichermaßen ist das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein wirtsspezifischer Bänder, die auf variable nukleäre Tandemwiederholungssuche folgen, gleichermaßen ein Anzeichen für die Effizienz der Zelltherapie.
Die Erfindung wird weiter verstanden unter Verweis auf die folgenden illustrativen Ausführungen, die rein beispielhaft sind und nicht als die wahre Reichweite der vorliegenden Erfindung, wie sie in den Ansprüchen beschrieben ist, einschränkend verstanden werden sollen. Beispiel 2 ist nur zu illustrativen Zwecken eingeschlossen und stellt keinen Teil der vorliegenden Erfindung dar.
BEISPIEL 1
Induktion eines Transplantat-gegen-Tumor-Effekts in einem Mäusemodell von Mammakarzinom
Materialien und Verfahren
Mäuse
BALB/c (H-2^d) und F1 (BALB/c × C57B1/6)(H-2^d/b)-Mäuse im Alter von 10–12 Wochen, DAB/2 (H-2^d)- und C57B1/6 (H-2^b)-Mäuse im Alter von 7–9 Wochen wurden von Harlan Sprague Dawley, USA, erhalten und in einem von spezifischen Pathogenen freien Tierhaus an, der Medizinischen Schule der Hebräischen Universität Hadassah gemäß Israel-spezifischen nationalen Gesetzen gehalten.
Tumor
4T1 ist einer aus einer Serie von Subpopulationen, isoliert aus einem einzelnen, spontan auftauchenden Mammatumor einer BALB/cfC3H-Maus. Dexter et al., Cancer Res. (Krebsforschung) 38: 3174–81 (1978). Es wird durch die Passage in vitro in RPMI 1640-Medium, das 10% wärmeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS) (Grand Island Biological Co., Grand Island, NY), 2 mM Glutamin, 100 mg/ml Streptomycin, 100 U/ml Penicillin und 1% nichtessentielle Aminosäuren enthält, gehalten. Die Zubereitung von Zellen zur Injektion umfasst das Ernten durch 0,25% Trypsin in 0,05% EDTA, Waschen mit RPMI 1640 und Resuspendieren in Hanks Medium zur intradermalen (ID)-Injektion in Mäuse in einem Volumen von 0,1 ml. Alle Gewebekulturmedien und Reagentien wurden von Biological Industry, Beit Ha'emek, Israel erworben. Die Zellen wurden auf 37°C in einem befeuchteten 5% CO₂-/Luftinkubator gehalten.
Messung primären Tumorwachstums in vivo
Die Tumorgröße wurde einmal pro Woche in zwei senkrechten Dimensionen mit einem Greifzirkel gemessen. Die Tumorgröße in cm³ wurde mit der Formel (a × b²)/2 berechnet, wobei a die größere und b die kleinere Abmessung des Tumors ist.
Zytometrische Flussanalyse
Eine Quantität von 5 × 10⁵ Zellen wurde direkt mit den folgenden monoklonalen Antikörpern gefärbt: Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) Anti-H-2K^d und r-Phycoerythrin (PE)-anti-I-A^d (Pharmigen, CA, USA). Indirektes Einfärben wurde unter Verwendung von Ratten-Anti-Maus-ICAM-1 (Takei, J. Immunol. 134: 1403–07 (1985)), VCAM-1 (Miyake et al., J. Exp. Med. 173: 599–607 (1991)), CD44 (Trowbridge et al., Immunogenetics 15: 299–312 (1982)) und B7-1 (Razi-Wolf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4210–14 (1992))-Antikörpern durchgeführt. Ein FITC-konjugiertes affinitätsgereinigtes Fragment (Fab)2 von Mäuse-Anti-Ratten-IgG wurde als sekundärer Antikörper verwendet (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., PA, USA). Alle Färbeprozeduren wurde 30 Minuten lang auf Eis durchgeführt, gefolgt durch Waschen mit phosphatgepufferter Salzlösung, die 1% Rinderserumalbumin und 0,03% Natriumazid enthielt. Die Zellen wurden in 1% Paraformaldehyd fixiert und durch FACScan-Zytometrie unter Verwendung des Lysys II-Programms (Becton Dickinson, Santa Clara USA) analysiert.
Immunisierungsprotokoll
Kultivierte 4T1-Zellen (10⁷) wurden bestrahlt (120 Gy), um die Abwesenheit sich fortpflanzender Zellen aus der Immunisierungsdosis sicherzustellen, dann intradermal (ID) 3 Mal in Intervallen von 7–10 Tagen in nicht vorbehandelte BALB/c-Mäuse injiziert. Sieben bis 10 Tage nachfolgend auf die letzte Immunisierungsdosis wurde eine Anfechtungsdosis von 10⁴ frischen nichtbestrahlten 4T1-Zellen intradermal gegeben. Eine Kontrollgruppe nicht vorbehandelter nichtimmunisierter BALB/c-Mäuse wurde parallel mit 10⁴ frischen 4T1-Zellen geimpft.
Induktion von Knochenmarkchimären
Weibliche BALB/c-Mäuse wurden einer tödlichen Dosis von 9 Gy Ganzkörperbestrahlung (Total body irradiation – TBI) 24 Stunden vor der intravenösen Injektion mit 10⁷ Knochenmarkzellen, gewonnen von männlichen DBA/2-Mäusen, ausgesetzt. Weibliche F1(BALB/c × C57B1/6)-Mäuse wurden einer tödlichen Dosis von 11 Gy Ganzkörperbestrahlung 24 Stunden vor der intravenösen Injektion mit 10⁷ Knochenmarkzellen, gewonnen aus männlichen C57B1/6-Mäusen, ausgesetzt. Die Ganzkörperbestrahlung wurde durch einen Linearbeschleuniger mit einer Energie von 6 mev. mit einer Dosisrate von 1,9 Gy/min. abgegeben. Die Knochenmarkzellen wurden durch Spülen von RPMI 1640-Medium durch die Schäfte der Femora und der Tibia der Spender mit einer 25-Standardmaßnadel hergestellt.
Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die Polymerasekettenreaktion wurde ausgeführt wie vorangehend beschrieben. Pugatsch et al., Leukemia Res. (Leukämieforschung), 17. 900–1002 (1993). Blutproben wurden kurz in sterilem destillierten Wasser lysiert und 10 Sekunden auf 12,000 g in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert. Aufschwimmende Bestandteile wurden entfernt und 50 ml 0,06 M NaOH wurden den Zellpellets zugesetzt. Die Proben wurden 10 Min. lang gekocht und 6 ml 1 M Tris, pH-Wert 7,2, wurden zugesetzt. Die Proben wurden 5 Minuten lang auf 12.000 g zentrifugiert, und es wurde darauf geachtet, nur die aufschwimmenden Stoffe für den Test zu verwenden. Oligonukleotidprimer wurden gemäß der veröffentlichten Sequenz eines Y-Chromosom-spezifischen Gens (Gubbay et al., Nature 346: 245–50 (1990)) aus Position 22–39 für den 5. Primer beziehungsweise 342–359 für den 3. Primer gewählt. Die DNA wurde in einem MJR-Mini Cycler in einem Gesamtvolumen von 50 ml erweitert. Primer wurden in einer Endkonzentration von 100 pmol und Taq-DNA-Polymerase (Appligene, Frankreich) von 1 U/Probe zugesetzt. Das folgende Programm wurde verwendet: 94°C, 30''; 50°C, 45''; 72°C, 1'; für eine Gesamtheit von 35 Zyklen. Die Reaktionsprodukte wurden auf 1,6% Agargelen (Sigma, St. Louis, USA), die 0,05% Ethidiumbromid enthielten, sichtbar gemacht.
Ergebnisse
Phänotypanalyse von 4T1-Zelloberflächenmarkern
Die Phänotypcharakterisierung von 4T1-Mäuse-Mammaezelloberflächenmarkern wurde unter Verwendung von Flusszytometrie-FACS-Analyse, wie oben beschrieben, durchgeführt. 4T1-kultivierte Zellen drücken sowohl H-2^d-Klasse I-Antigene (93%) als auch Haftmoleküle wie ICAM, VCAM (64% beziehungsweise 59%) und die CD44-zielansteuerungszugehörigen Haftmoleküle (76%) aus. 4T1-Zellen drücken keine I-A^d-Klasse II-Antigene oder kostimulierende Moleküle wie B7-1 aus.
4T1-Tumorerzeugung
Die Fähigkeit von H-2^d-Zellen von BALB/c-Ursprung zur Bildung von Tumoren in sowohl H-2-kompatiblen als auch inkompatiblen Wirten wurde getestet. Die intradermale Einimpfung von 10⁴ 4T1-Zellen in syngene H-2^d-BALB/c-Mäuse führte innerhalb von 21 Tagen in 100% der Mäuse zu einem messbaren örtlichen Tumor. Der Primärtumor führte schließlich zu Lungenmetastasen und dem Tod aller Mäuse innerhalb eines durchschnittlichen Zeitraums von 39 Tagen (1). Ein verzögertes Auftreten des örtlichen Tumors wurde nur in einem Bruchteil der BALB/c-Wirte (44%) nachfolgend auf die Einimpfung von 10³ 4T1-Zellen beobachtet. Die intradermale Einimpfung von 10⁶ 4T1-Zellen in kongene H-2^d-DBA/2-Mäuse verursachte einen lokalen Tumor und Tod nur bei 20% der Mäuse, während eine niedrigere Zelldosis (10⁵) zu einem vorübergehenden örtlichen Tumor führte, der sich 28 Tage nach der Tumoreinimpfung zurückbildete. Ein messbarer Primärtumor und Lungenmetastasen traten in 84% semi-allogener H-2^d/b-Wirtsmäuse innerhalb von 38 Tagen nachfolgend auf die Einimpfung von 10⁴ 4T1-Zellen auf. Alle H-2^d/b-Wirte mit entwickeltem Tumor starben innerhalb eines durchschnittlichen Zeitraums von 50 Tagen (1). Die Einimpfung von H-2^d 4T1-Zellen in allogene H-2^b C57B1/6-Mäuse scheiterte bei der Erzeugung eines Tumors in irgendeinem der Wirte, selbst bei einer Zellendosis von 5 × 10⁵. Die Ergebnisse zeigen, dass 4T1-Mammatumorzellen, die H-2^d-Antigene tragen, hoch tumorerzeugend bei vollständig in großem Umfang histokompatiblen und haploidentischen H-2-Wirten (BALB/c beziehungsweise (BALB/c × C57B1/6)F1) sein können, schwach tumorerzeugend bei in geringerem Umfang histoinkompatiblen Wirten (DBA/2) und bei in größerem Umfang histoinkompatiblen Wirten (C57B1/6) nicht tumorerzeugend sind.
Immunerzeugung von 4T1-Zellen
Bestrahlte 4T1-Zellen (10⁷) wurden 3 Mal in Intervallen von 7–10 Tagen in syngene BALB/c-Mäuse eingeimpft, bevor sie mit einer frischen tumorerzeugenden Dosis von 10⁴ 4T1-Zellen herausgefordert wurden. Diese Vielfachinjektionen bestrahlter 4T1-Zellen riefen keinen Immunschutz gegen eine Anfechtung durch nicht-bestrahlte 4T1-Tumorzellen hervor (2). Alle Mäuse starben sowohl mit einem großen örtlichen Primärtumor als auch Lungenmetastasen in einem durchschnittlichen Zeitraum von 42 Tagen nachfolgend auf die Anfechtungsimpfung. Nicht vorbehandelte BALB/c-Mäuse, die mit einer Anfechtungsdosis geimpft waren, starben nur in einem durchschnittlichen Zeitraum von 45 Tagen. Die Einimpfung entweder einer niedrigeren Dosis bestrahlter Zellen oder dieselbe Zelldosis, die nur ein- oder zweimal gegeben wurde, scheiterte bei der Herbeiführung einer Tumorimmunität (Daten nicht dargestellt).
Hervorrufen von BM-Chimären über in kleinerem und größerem Umfang histokompatible Antigene
Weibliche BALB/c(H-2^d)- und (BALB/c × C57B1/6)F1(H-2^d/b)-Empfängermäuse wurden mit männlich abgeleiteten, in geringerem Umfang histoinkompatiblen DBA/2-gewonnenen (H-2^d) beziehungsweise in größerem Umfang histoinkompatiblen C57B1/6-gewonnenen (H-2^b)-Knochenmarkzellen rekonstituiert, nachfolgend auf eine tödliche Dosis Ganzkörperbestrahlung (Daten nicht dargestellt). Die Induktion hämatopoetischer Chimären wurde unter Verwendung von Molekularanalyse zum Aufspüren männlicher Y-Chromosom-Sequenzen in peripheren Blutzellenproben, genommen Z, 3, 6 und 9 Monate nachfolgend auf die BM-Rekonstitution, getestet. Die in 3 dargestellten Ergebnisse zeigen Beweise für das Vorhandensein des Y-Chromosom-Markers bereits 1 Monat nachfolgend auf die Knochenmarkzelleneinimpfung und das Andauern seines dominanten Vorhandenseins in einer Zeitspanne von > 280 Tagen in DBA-BALB/c-Chimären. Ein stabiles hämatopoetisches Chimärentum wurde mit leichten Symptomen chronischer GVHD (Fell- und geringer Gewichtsverlust) über in geringerem Umfang histokompatible Antigene und mit keinen offenen GVHD-Symptomen über in größerem Umfang histokompatible Antigene etabliert. Die Überlebenszeit von 9 DBA-BALB/c-Chimären betrug 261 (durchschnittlich) mit einem Bereich von 147–341 Tagen beziehungsweise > 300 Tage bei 14 C57B1/F1-Chimären.
Tumorerzeugung von 4T1-Zellen in hämatopoetischen Chimären
4T1-Tumorzellen, die H-2^d-histokompatible Antigene von BALB/c-Ursprung trugen, wurden intradermal in nicht vorbehandelte BALB/c-(H-2^d)-Mäuse und in BALB/c-Chimären, die in geringerem Umfang histoinkompatible hämatopoetische Zellen von DBA/2-(H-2^d)-Ursprung trugen, eingeimpft. Die Tumorgröße als eine Funktion von Tagen nachfolgend auf die Tumoreinimpfung ist in 4 dargestellt. Ein messbarer örtlicher Tumor am Tag 20 war bei nicht vorbehandelten BALB/c-Mäusen mit der Zeit bis auf 1,43 cm³ deutlich vergrößert. Ein signifikant kleinerer Tumor (p < 0,01) mit einem begrenzten Wachstum von bis zu 0,27 cm³ wurde in Chimären-DBA-BALB/c-Mäusen beobachtet. Die Einimpfung von 4T1-Zellen in nicht vorbehandelte F1(H-2^d/b)-Mäuse und F1-Chimären, die in größerem Umfang histoinkompatible hämatopoetische Zellen von C57B1/6-Ursprung trugen, zeigte einen örtlichen Primärtumor von 0,26 cm³, der bis zu 2,40 cm³ in nicht vorbehandelten F1-Mäusen vergrößert war und in Chimären-C57B1/6-F1-Mäusen signifikant kleiner (p < 0,05) war, mit eingeschränktem Wachstum bis zu 0,31 cm³ (5).
BEISPIEL 2
Transplantat-gegen-Tumor-Effekte in einem Mäusemodell von Leukämie
1.Prozeduren
Durch Inzucht gezüchtete, 8–12 Wochen alte männliche und weibliche BALB/c-, C57B1/6 (B6)- und (BALB/c × B6)F1 (F1)-Mäuse wurden von Jackson Memorial Laboratory, Bar Harbor, ME, USA, erworben. Die Mäuse wurden während der Induktion des Chimärentums in kleinen isolierten Käfigen gehalten (5 Tiere in jedem Käfig) und wurden mit sterilem Futter und saurem Wasser (pH-Wert 3,0) gefüttert. Die Einimpfung von Leukämie und die Immuntherapie nach der Transplantation wurden in einer nicht isolierten Standard-Tieranlage vorgenommen.
Die BALB/c-Mäuse wurden einer Einzeldosis von 10 Gy Ganzkörperbestrahlung (TBI) von einer Gamma-150-A⁶⁰Co-Quelle (Atomic Energy of Canada) mit einem Abstand zwischen Brennpunkt und Haut von 75 cm mit einer Dosisrate von 58 cGy/min. ausgesetzt. Vierundzwanzig Stunden später erhielten die tödlich bestrahlten Mäuse 5 × 10⁶ T-Zellen-verarmte Knochenmarkzellen von B6-Spendern durch die laterale Schwanzvene. Die Markeinpflanzungen waren durch Sojalecithinagglutination gemäß Reisner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 2933 (1978) mit Stammzellen angereichert und verarmt an immunkompetenten T-Zellen, mit kleineren Modifikationen, wie in Schwarz et al., J. Immunol. 138: 460 (1987) berichtet.
RhIL-2 wurde durch Dr. C. R. Franks, EuroCetus BV, Amsterdam, Niederlande, als 1 mg Proleukin (18 × 10⁶ Internationale Einheiten – 3 × 10⁶ Cetus-Einheiten) geliefert. RhIL-2 wurde anfänglich für die Injektion mit Wasser verdünnt und anschließend mit 5% Dextrose wiederverdünnt.
BCL1-Zellen wurden in vivo in BALB/c-Mäusen durch intravenöses Einbringen von 10⁶–10⁷ Lymphozyten aus peripherem Blut (PBL), erhalten von tumortragenden Mäusen, gehalten. Alle Empfänger von BCL1-Zellen entwickelten Splenomegalie und markierte Lymphozytose im Blut zu dem Zeitpunkt, als sie geopfert wurden, um als Spender für BCL1-Zellen in experimentellen Mäusen verwendet zu werden. Slavin et al., Cancer Res, (Krebsforschung), 41: 4162 (1982). PBL-Zählungen aller experimentellen Gruppen wurden wöchentlich durchgeführt. Der Beginn von Leukämie war definiert als PBL-Zählungen, die 20.000/mm³ überschritten. Auf dem Höhepunkt der Erkrankung erreichten die PBL-Zählungen normalerweise > 100.000/mm³. Das Überleben der BCL1-Empfänger wurde täglich überwacht.
Chimärentum (d. h. Vorhandensein nicht-eigener, d. h. hämatopoetischer Spenderzellen in einem Empfänger) wurde 4–9 Wochen nach Knochenmarktransplantation aus den peripheren Blut- oder Milzzellen bestimmt, wie zuvor beschrieben. Lapidot et al., Blood 73: 2025 (1989). Das Chimärentum wurde bestätigt durch Testen von Peripherblutlymphozyten unter Verwendung eines in vitro komplementabhängigen Mikrozytotoxizitätstests mit spezifischen Alloantiseren (BALB/c-Anti-B6 und B6-Anti-BALB/c) und Kaninchenkomplement vor der Einimpfung mit BCL1-Zellen. Der Prozentsatz von Wirt- oder Spendertypzellen wurde durch den Trypan-Blaufärbungs-Ausschlusstest bestimmt. Die spezifischen Alloantiseren wurden durch Kreuzimmunisierung von Mäusen mit einem Haut-Allotransplantat voller Dicke, gefolgt von 6 intraperitonalen Injektionen von 30–50 × 10⁶ Spendertyp-Milzzellen, die 1–2 Wochen auseinander gegeben wurden, hergestellt. Den Mäusen wurde Blut abgenommen und die Seren wurden auf –70°C gelagert. Das Chimärentum wurde durch Typisieren jeder Lymphozytenprobe mit beiden Antiseren getestet: die von F1-Empfängern erhaltenen Lymphozyten wurden zu 100% durch sowohl BALB/c-Anti-B6- als auch B6-Anti-BALB/c-Antiseren lysiert, während von B6-BALB/c-Chimären erhaltene Lymphozyten nur durch BALB/c-Anti-B6-Antiserum zu 100% lysiert wurden; B6-Anti-BALB/c-Antiserum wurde zur Bestätigung der Eliminierung von Wirtszellen verwendet. Der Nettoprozentsatz des Chimärentums wurde wie folgt berechnet: Prozentsatz von Zellen, die nachfolgend an die Behandlung mit BALB/c-Anti-B6-Antiseren (Durchschnitt von Duplikatuntersuchungen) lysiert wurden minus Zellen, die nachfolgend an die Behandlung mit B6-Anti-BALB/c-Antiseren lysiert wurden, minus Zellen, die nur mit dem Komplement lysiert wurden.
2. Ergebnisse
Beweise für Chimärentum in BALB/c-Mäusen, denen T-Zellen-verarmtes B6-Knochenmark transplantiert wurde
Wie oben beschrieben, wurden BALB/c-Mäuse tödlich bestrahlt und mit T-Zellen-verarmten B6-Knochenmarkzellen rekonstituiert. Das Chimärentum wurde durch Testen der Peripherblutlymphozyten kurz nach der Transplantation und nochmals drei Monate später, unmittelbar vor der Einimpfung mit BCL1-Zellen, bestätigt. Es wurde festgestellt, dass alle Mäuse Chimären waren. Die Prozentsätze von Spendertypzellen im Blut beliefen sich auf zwischen 74 und 100%. Keine der Chimären zeigte irgendein klinisches Anzeichen von GVHD, und das Körpergewicht der Chimären war dem Körpergewicht normaler Kontrollen vergleichbar (Daten nicht dargestellt).
Widerstandsfähigkeit von Chimären gegenüber BCL1 Normale BALB/c-Mäuse und B6-BALB/c-Chimären wurden intravenös mit 10⁶ BCL1-Zellen injiziert. Alle normalen BALB/c-Mäuse entwickelten Leukämie, die Mehrheit innerhalb von weniger als 40 Tagen (durchschnittlich 21 Tage) und starben, während alle 10 getesteten Chimären mehr als 6 Monate ohne Anzeichen von Krankheit überlebten (6). Eine Gesamtdosis von 10² BCL1-Zellen ist ausreichend, um den 100%-igen Tod durch Leukämie bei normalen BALB/c-Empfängern zu verursachen (Daten nicht dargestellt). Slavin et al., Cancer Res. (Krebsforschung), 41: 4162 (1989).
Eliminierung klonogener BCL1-Zellen in B6 → BALB/c-Chimären ohne GVHD
Keine der B6-BALB/c-Chimären zeigte ein klinisches Anzeichen von GVHD. Um dem Schicksal großer Mengen klonogener BCL1-Zellen, die den B6 → BALB/c-Chimären gegeben wurden, zu folgen, wurden adoptive Transferexperimente durchgeführt. 10⁵ Milzzellen (hergestellt aus einer Gruppe von 3 Chimären) wurden auf 10 sekundäre, nicht vorbehandelte BALB/c-Mäuse 7, 14 und 21 Tage nach dem Einimpfen mit 10⁶ BCL1-Zellen übertragen (7). Mit Ausnahme einer einzigen Maus (1/30) entwickelten alle Adoptivempfänger von Kontroll-Milzzellen, die von normalen Mäusen erhalten wurden, 1, 2 und 3 Wochen nachfolgend auf die Einimpfung mit BCL1-Zellen innerhalb von 37 Tagen Leukämie und starben. Sieben von 10 sekundären Empfängern von Zellen, die von Chimären erhalten wurden, die 7 Tage vor dem Zelltransfer eingeimpft wurden, entwickelten innerhalb von 44 Tagen Leukämie. Im Gegensatz dazu entwickelte keiner der Adoptivempfänger von Milzzellen, die von B6 → BALB/c-Chimären bei 14 und 21 Tagen nach Einimpfung mit BCL1 erhalten wurden, Leukämie bei Überwachung für mehr als 6 Monate. Die Daten suggerieren, dass ein Zeitraum von zumindest 14 Tagen zur vollständigen Ausrottung und/oder Inaktivierung von 10⁶ BCL1-Zellen erforderlich ist, während bei 7 Tagen die Ausrottung der Leukämiezellen noch unvollständig ist.
Erweiterung von Transplantat-gegen-Leukämie-Effekten durch immunkompetente allogene Milzzellen und rhIL-2-Therapie bei Chimären, die mit BCL1-Zellen eingeimpft waren
Vierundzwanzig normalen BALB/c-Mäusen und 24 gut etablierten B6-BALB/c-Chimären wurden 10⁶ BCL1-Zellen injiziert. Die injizierten Chimären wurden in 4 Gruppen aufgeteilt. (A) B6 → BALB/c-Chimären, die als Kontrollen ohne zusätzliche Therapie dienten; (B) B6 → BALB/c-Chimären, die rhIL-2 (10.000 IU × 3/Tag intraperitonal, 5 Tage lang) erhielten, beginnend einen Tag nachfolgend auf die Einimpfung mit Leukämiezellen; (C) B6 → BALB/c-Chimären, die 10⁷ normale immunkompetente B6-Milzzellen erhielten; (D) B6 → BALB/c-Chimären, die sowohl 10⁷ normale B6-Milzzellen als auch rhIL-2 erhielten. Zum Vergleich waren mehrere Kontrollen eingeschlossen: (E) eine Kontrollgruppe normaler BALB/c-Mäuse, eingeimpft mit 10⁶ BCL1-Zellen ohne zusätzliche Therapie; normale BALB/c-Mäuse geimpft mit 10⁶ BCL1-Zellen erhielten entweder rhIL-2 (F) oder allogene Milzzellen (G) oder beides (H). Sieben Tage später wurden alle Mäuse geopfert und ihre Milzzellen wurden für adoptive Transferexperimente benutzt, um das Vorhandensein klonogener BCL1-Zellen zu bewerten. Sekundäre BALB/c-Empfänger (5 in jeder Gruppe) empfingen 10⁵ Milzzellen, erhalten aus einer Gruppe von 3 Kontroll-BALB/c-Mäusen oder aus 3 B6 → BALB/c-Chimären von jeder experimentellen Gruppe. Es wurden übereinstimmende Ergebnisse erzielt, wenn das Experiment mit den restlichen drei Mäusen jeder Gruppe dupliziert wurde. Daher wurden die Daten zusammengenommen, und jede in 8 gezeigte experimentelle Gruppe besteht aus 10 Mäusen.
Alle sekundären BALB/c-Empfänger, die Milzzellen erhielten, die von normalen BALB/c-Mäusen (E) erhalten wurden, entwickelten innerhalb von 32–37 Tagen Leukämie. Siebzig Prozent der sekundären Empfänger, die Milzzellen erhielten, die von B6 → BALB/c-Chimären (Gruppe A) erhalten wurden, entwickelten für > 6 Monate keine Leukämie, während bei den 30%, die Leukämie entwickelten, der Krankheitsbeginn verzögert war (Beginn innerhalb von 44–52 Tagen). Mit rhIL-2, allogenen immunkompetenten Spendertyp-Splenozyten (C) oder der Kombinationsbehandlung von beiden (D) behandelte B6 → BALB/c-Chimären wiesen einen deutlichen widerstand gegen Leukämie auf, ohne Anzeichen der Krankheit für > 6 Monate bei allen sekundären Empfängern von Milzzellen, die von den Gruppen B und D erhalten wurden, und bei einem verzögerten Beginn von Leukämie bei nur 20% der Mäuse, die Milzzellen von Gruppe C erhielten. Bei normalen Kontroll-BALB/c-Mäusen, die mit rhIL-2, allogenen Splenozyten oder beidem behandelt waren (F, G beziehungsweise H) wurden keine Anti-Leukämie-Effekte festgestellt.
BEISPIEL 3
Klinische Ergebnisse
1. Brustkrebs
Eine 40jährige Patientin stellte sich vor, die im Alter von 37 Jahren eine Masse im oberen mittleren Quadranten in der linken Brust entwickelt hatte. Die körperliche Untersuchung enthüllte eine undefinierte Masse in diesem Bereich und eine 4 × 3 cm-Masse in der linken Achselhöhle. Es wurde eine Exzisionsbiopsie von der Masse in der Brust genommen, und die pathologische Untersuchung enthüllte ein multifokales infiltrierendes duktales Karzinom III. Grades mit drei Massen mit einer Größe von 3 × 2 × 2, 1,5 × 1 × 1 und 1 × 1 × 1 cm. Zusätzlich lag eine Tumorinvasion in die Lymphgefäße mit einer positiven chirurgischen Grenze vor. Die Patientin wurde mit 7 Zyklen CAF (Cylophosphamid, Adriamycin und 5-Fluoruracil) behandelt. Die Chemotherapie wurde gefolgt von der Ektomie des oberen Quadranten und der Dissektion der Achsellymphknoten. Der Pathologiebericht von dieser Probe enthüllte drei Rest-Brennpunkte infiltrierenden duktalen Karzinoms von 1 × 1 × 1, 1 × 1 × 1,5 und 0,5 × 0,5 × 0,5 cm Größe. Drei von 17 Knoten waren krebsbefallen. Die Patientin vollendete eine 56 Gy-Brustbestrahlung, gefolgt von einer 14 Gy-Zusatzdosis auf das Tumorgebiet unter Verwendung von 12 MeV Elektronenstrahlbestrahlung.
Dreiundzwanzig Monate später wurde eine Masse von 1,5 cm im mittleren Aspekt der Quadrantenektomienarbe festgestellt, an der Brustwand anhaftend. Es wurde FNA-Ansaugung durchgeführt, und die zytologische Analyse enthüllte bösartige Zellen, die mit Brustkrebs übereinstimmten. Die Blutwerte zu dem Zeitpunkt zeigten ein Hgb von 7,5 g% und WBC von 1,3 × 10⁹/l. Es wurde eine Knochenmarkbiopsie durchgeführt und die Diagnose war kompatibel mit AML-M2. Die Analyse des Phänotyps der Blasten durch eine fluoreszenzaktivierte Zellensortiervorrichtung zeigte folgende Wertes HLA-DR 76%, CD34 65%, CD33 66%, CD13 56%, CD15 41%, CD11B 40% und CD11C 80%. Die Systemevaluation umfasste einen Ganzkörper-CT-Scan, Unterbauch-Ultraschalluntersuchung, Leberscan, Knochenscan, CA-15-3 und CEA; alle lagen im normalen Bereich. Die Patientin wurde mit einem Zyklus Amscarin und einer hohen Dosis Cytosar mit anschließendem Verschwinden der Blasten im Knochenmark behandelt. Ein geringer Rückgang der Größe der Masse in der Brustwand wurde festgestellt.
Vier Monate nach der Diagnose von AML unterzog die Patientin sich einer T-Zellen-verarmten allogenen Stammzellentransplantation von einem voll HLA A, B, C, DR und DRB1-passenden MLR-nicht reaktiven Bruder. Das Konditionierungsprotokoll umfasste die Immunsuppression vor der Transplantation mit Anti-Thymozytenglobulin (Fresenius) 10 mg/kg für 4 aufeinanderfolgende Tage und anschließende Verabreichung von Busulfan 4 mg/kg/Tag × 4, Thiotepa 10 mg/kg/Tag × 1, Cytoxan 50 mg/kg/Tag × 4 und intrathekal ARA-C zur CNS-Krankheitsprophylaxe. Die T-Zellen-Verarmung wurde durch Zusatz monoklonaler Ratten-Anti-Mensch-Lymphozyten(CDx52)-Antikörper (Campath-1G, bereitgestellt durch Dr. G. Hale, Universität Oxford, GB) mit 0,3 ug/10⁶ nukleierter Zellen in den Beutel, der die Markzellen enthielt, vollzogen, wie zuvor beschrieben (Naparstek et al., Exp. Hematol. 17. 723 (Zusammenfassg.) (1989)). Die Einbringung (ANC > 0, 5 × 10⁹/l, PLT > 25 × 10⁹/l) wurde am 21. Tag nachfolgend auf die Transplantation dokumentiert. Nachfolgend auf die Transplantation enthüllten die zytogenen Studien die volle Rekonstitution mit spenderabgeleiteten Zellen im Blut.
Zehn Wochen nach der Transplantation lagen keine klinischen Anzeichen von GVHD vor; von daher wurde die Patientin mit allogener zellvermittelter Immuntherapie (Allo-ZT) behandelt, bestehend aus einer Spenderblut-Lymphozyteninfusion mit einer Zellendosis entsprechend 1 × 10⁵ T-Zellen/kg. Vier Wochen später wurde eine vorübergehende Beeinträchtigung von Leberfunktionstests (GGTP 712-, ALT 301- und AST 258-Einheiten) beobachtet.
Keine anderen klinischen Befunde, die Anzeichen für GVHD gaben, wurden bemerkt. Zwanzig Wochen nach der Transplantation wurde eine höhere Dosis von Spenderblutlymphozyten, bestehend aus 0,6 × 10⁶ T-Zellen/kg gegeben. Bei mehr als 8 Monaten nach der Transplantation ist die Patientin erscheinungsfrei, ohne Anzeichen von sowohl Brustkrebs als auch AML. Kein Anzeichen entwickelter akuter oder chronischer Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GVHD), obwohl die Patientin keine Anti-GVHD-Prophylaxe erhielt.
Der vorliegende Erfinder ist sich keiner Fälle bewusst, worin eine Patientin mit einem solch aggressiven zurückkehrenden Brustkrebs in eine stabile vollständige Reaktion überging, nachdem sie nur „suboptimale" Chemotherapie erhalten hatte, wie sie bei dieser Patientin angewendet worden war.
II. Bösartige hämatologische Erkrankungen
Patient Nr. 1. Ein 17-jähriger Mann mit CML in beschleunigter Phase wurde für allogene Knochenmarktransplantation in die Hospitalabteilung für Knochenmarktransplantation der Hadassah-Universität aufgenommen. Der Patient hatte einen HLA-A, B, DR, DRB1 passenden Bruder nicht-reaktiv in bilateraler gemischter Lymphozytenkultur für allogene Knochenmarktransplantation. Die vor der Transplantation stattfindende zytogene Analyse des Patienten enthüllte 100% Ph-Positivität in spontanen Knochenmarkmetaphasen mit drei verschiedenen bösartigen Verlagerungsklonen: 35% 46XY t(9:22); 35% 46XY t (9:22) add (15) (q26); 30% 46XY t (9:22) add (2) (q37). Zusätzlich war der Patient als 100% positiv für das bcr/abl-Fusionsprodukt eingestuft, wie durch PCR in einer Peripherblutprobe aufgespürt. Die Konditionierung vor der Transplantation umfasste Cyclophosphamid (60 mg/kg × 2 Tage) und Ganzkörperbestrahlung (200 cGy täglich × 6 Tage).
Am 21. Juli 1993 wurde er mit 2,5 × 10⁸ lebensfähigen nukleierten Zellen/kg (nicht-T-Zellen-verarmt) von seinem kompatiblen Bruder transplantiert. Er wurde mit Cyclosporin A (Beginntag – 1) und Methotrexat (Tage 1, 3, 6 und 11) als Anti-GVHD-Prophylaxe behandelt, wie zuvor beschrieben. Goldman, Leuk. and Lymph. 3: 159–64 (1990). Die Einpflanzung war normal mit einem weißen Blutzellenwert (WBC) von > 1 × 10⁹/l am Tag +26, Neutrophilzählung von > 0,5 × 10⁹/l am Tag +25, und Blutplättchenzählung von > 25 × 10⁹/l am Tag +25. Er wurde 24 Tage nach der Knochenmarktransplantation in sehr guter allgemeiner Verfassung ohne Anzeichen von GVHD entlassen. Einen Monat nach der Knochenmarktransplantation enthüllte die PCR kein bcr/abl-Verschmelzungsprodukt. Cyclosporin A wurde ausschleichend gegeben und 3 Monate nach der Knochenmarktransplantation abgesetzt. Einen Monat später, 4 Monate nach der Knochenmarktransplantation, schlug das PCR zu bcr/abl-Positivität um, und die zytogene Markanalyse enthüllte 100% Ph+ bei klonaler Selektion. Die Markmorphologie war kompatibel mit CML der chronischen Phase. Es wurde kein signifikanter Anstieg in Peripherblutwerten bemerkt.
In dem Versuch, eine Remission herbeizuführen, wurde er mit allogener zellvermittelter Immuntherapie (Allo-ZT) behandelt, unter Verwendung der Peripherblutlymphozyten (PBL) des kompatiblen Bruders (8,9 × 10⁷ Zellen infundiert/kg). Zwei Wochen später wurde dem Patienten, in Abwesenheit jedes Anzeichens von GVHD, eine weitere Infusion von PBL (5 × 10⁷ Zellen/kg) mit in vivo-rhIL-2 (3 × 10⁶ IU/m²) subkutan an 3 aufeinanderfolgenden Tagen auf ambulanter Basis verabreicht. Es entwickelten sich keine Anzeichen von GVHD. Es lag ein vorübergehender Abstieg in den WBC-Werten von 14,7 × 10⁹/l bis 6,2 × 10⁷/l mit keiner Veränderung bei den Hämoglobin- und Plättchenzählungen vor. Das PCR für das bcr/abl-Verschmelzungsprodukt blieb positiv. Bei fortgesetztem Nachweis bösartiger Zellen nachfolgend auf Knochenmarktransplantation und Allo-ZT war die Prognose für den Patienten ohne zusätzliche therapeutische Maßnahmen sehr schlecht.
In einem Versuch, die therapeutische Vorgehensweise zu eskalieren, wurden Peripherblutlymphozyten von dem kompatiblen Bruder in RPMI-Medium (Beit HaemeK, Israel) vorkultiviert, angereichert mit 5% inaktiviertem autologem AB-Serum und weiter angereichert mit 6.000 IU/ml rhIL-2. Die PBL wurden vier Tage lang in diesem Medium in einem befeuchteten 5% CO₂-in-Luft-Inkubator auf einer Konzentration von 2,5 × 10⁶ Zellen/ml belassen. Nach 4 Tagen Inkubation einer anfänglichen Zellendosis von 17 × 10⁸ lebensfähiger Zellen wurde eine Gesamtheit von 28 × 10⁸ ASL geerntet.
Im Januar 1994 empfing der Patient 3,7 × 10⁷ allogene ASL/kg, zusammen mit 3 Tagen Verabreichung subkutanen rhIL-2 (3 × 10⁶ IU/m2), beginnend an demselben Tag wie die ASL-Verabreichung, zur weiterer in vivo-Aktivierung der allogenen ASL. Der WBC-Wert sank von 11,3 × 10⁹/l auf 1,3 × 10⁹/l. Das Hämoglobin sank von 11,5 g% auf 8,3 g% und der Plättchenwert sank von 346 × 10⁹/l auf 23 × 10⁹/l. PCR wurde negativ für das bcr/abl-Fusionsprodukt. Die zytogene Knochenmarkanalyse spürte einen 100% normalen männlichen Karyotyp in allen spontanen Metaphasen auf. Die Knochenmarkmorphologie war vollständig normal und es lagen keine klinischen Laboranzeichen von GVHD vor. Die Blutwerte verbesserten sich schrittweise ohne weitere Therapie. 2 Monate nachfolgend auf die Allo-AZT, zu der Zeit betrug der WBC-Wert 2,8 × 10⁹/l, Plättchen 78 × 10⁹/l und Hämoglobin 10,2 g%, entwickelte der Patient ausgesäten Herpes zoster mit abnormalen Leberfunktionstests einschließlich Bilirubin 17 (normaler Bereich 2,5–17) mikromol/l, AST 444 (normaler Bereich 7–40) Einheiten, ALT 561 (normaler Bereich 6–53) Einheiten, GTP 346 (normaler Bereich 60–170) Einheiten. Der Patient ist mehr als 28 Monate nach Allo-AZT ohne Anzeichen des Ph+-Klons (durch sowohl zytogene als auch PCR-Analyse) und ohne Anzeichen für schwere GVHD und in gutem Allgemeinzustand.
Patient Nr. 2. Ein fünfjähriger Junge wurde im Jahr 1988 mit calla-positiver akuter lymphatischer Leukämie (ALL) diagnostiziert. Allogene Knochenmarktransplantation wurde am 8. Januar 1990 in Barcelona, Spanien, durchgeführt. Zur Zeit der Knochenmarktransplantation war der Patient in einer zweiten vollständigen Remission. Die Konditionierungsvorgehensweise bestand aus Cyclophosphamid, 60 mg/kg an zwei aufeinanderfolgenden Tagen, plus fraktionierter Ganzkörperbestrahlung (TBI), 200 cGY × 6 (insgesamt 1200 cGY). Das Spenderknochenmark stammte von einem vollständig passenden Bruder und wurde ohne T-Zellen-Verarmung gegeben. Dem Patienten wurde die Standard-Nach-Transplantations-Anti-GVHD-Prophylaxe mit Cyclosporin A gegeben. Nachfolgend auf die Knochenmarktransplantation entwickelte sich GVDH 1. Grades. Einen Monat später wurde ein offener hämatologischer und zytogener Rückfall diagnostiziert mit T(2; 3), (Q37; P14), DEL(13)(Q?), DEL (20)(Q11) Klonen.
Der Patient erhielt Nach-Transplantations-Allo-ZT, bestehend aus den PBL des Spenders in einer äquivalenten Dosis von 1,4 × 10⁷ T-Zellen/kg, gegeben am 8. Oktober 1991, am 3. November 1991 gefolgt von 3,5 × 10⁸ T-Zellen/kg mit damit einhergehender Verabreichung von rhIL-2 subkutan (6 × 10⁶ IU/m²) während 3 aufeinanderfolgender Tage, beginnend am Tag der Zelleninfusion. Anschließend erhielt der Patient im Dezember 1991 3 × 10⁸ ASL/kg, hergestellt durch Behandlung von Spender-PBL in vitro mit 6000 IU/ml rhIL-2 4 Tage lang. Fünf Tage später entwickelte der Patient kutane GVHD III. Grades, die im Verlauf eines Monats auf Kortikosteroidtherapie reagierte. Nachfolgend auf die Allo-AZT- und in vivo-T-Zellenaktivatorvorgehensweise trat der Patient in eine vollständige Remission ein, dokumentiert durch ein normales zytogenes Muster, das in allen untersuchten Metaphasen beobachtet wurde. Die chronische GVHD der Haut blieb bestehen, und der Patient bleibt über 53 Monate nach der Allo-AZT in vollständiger Remission.
Patient Nr. 3. Bei einem neunjährigen Mädchen wurde anfänglich im September 1990 CML vom Erwachsenentyp diagnostiziert, 100% Philadelphia-Chromosom-positive Zellen. Sie unterzog sich am 21. Februar 1991 in Seattle allogener Knochenmarktransplantation, während sie in der chronischen Phase war. Die Konditionierung bestand aus Cyclophosphamid, 60 mg/kg, an zwei aufeinanderfolgenden Tagen, gefolgt von fraktionierter Ganzkörperbestrahlung, 200 cGY × 6 (Gesamtdosis von 1200 cGY). Ein vollständig HLA AB DR-passender MLR-nichtreaktiver Bruder war der Spender, und die Zellen des Spenders wurden nicht T-Zellen-verarmt. Die Patientin erhielt die Standard-Anti-GVHD-Prophylaxe mit Cyclosporin A und entwickelte keine GVHD. Neun Monate nachfolgend auf die Knochenmarktransplantation hatte die Patientin einen offenen hämatologischen und zytogenen Rückfall, wobei 100 der beobachteten Metaphasen das Philadelphia-Chromosom aufwiesen.
Die Patientin erhielt PBL von demselben Spender in einer äquivalenten Dosis von 5 × 10⁶ T-Zellen/kg, gegeben am 3. Dezember 1991. Der Spender war jünger als drei Jahre und daher war eine vollständige Pherese technisch nicht durchführbar. Die Patientin erhielt am 15. Januar 1992 eine Gesamtdosis von Spender-PBL äquivalent zu 10⁷ T-Zellen/kg mit damit einhergehender Verabreichung von rhIL-2 subkutan (6 × 10⁶ IU/m²) während 3 aufeinanderfolgender Tage, beginnend am Tag der Zelleninfusion. Anschlieflend, im Februar 1992, erhielt die Patientin ASL in einer äquivalenten Dosis von 10⁷ Zellen/kg. Im März 1992 wurde eine zweite Dosis von 10⁷ ASL/kg verabreicht, mit damit einhergehender Verabreichung von rhIL-2 subkutan (6 × 10⁶ IU/m²) während 3 aufeinanderfolgender Tage, beginnend am Tag der Zelleninfusion. Die ASL wurden durch Behandlung von Spender-PBL in vitro mit 6.000 IU/ml rhIL-2 während 4 Tagen hergestellt.
Die Patientin reagierte hämatologisch; jedoch deutete ein umgekehrter Transkriptase-PCR-Test (RT-PCR) das Vorhandensein von Rest-Philadelphia-Chromosom-positiven Zellen an. Nach der Behandlung mit Alpha-Interferon (Roferon A) verschwanden alle zytogenen Anomalien, wie durch einen negativen RT-PCR-Test auf das bcr/abl-Verschmelzungsprodukt nachgewiesen. Die Patientin zeigte kein Anzeichen von GVHD während der Behandlung. Der Patientin geht es über 51 Monate nach Allo-AZT sehr gut; sie ist hämatologisch normal mit keinen abnormalen Karyotypen und ist konsistent negativ durch PT-PCR für das bcr/abl-Fusionsprodukt. Sie ist in ausgezeichneter klinischer Verfassung, ohne Anzeichen chronischer GVHD.
Patient Nr. 4. Bei einem dreijährigen Mädchen wurde im November 1990 Philadelphia-Chromosom-positive CML vom Erwachsenentyp diagnostiziert. Die Patientin wurde mit Busulfan, 16 mg/kg über vier aufeinanderfolgende Tage und mit Cytoxan, 200 mg/kg über vier aufeinanderfolgende Tage für allogene Knochenmarktransplantation konditioniert. Die Zellen für die allogene Knochenmarktransplantation wurden von einem voll passenden jüngeren Bruder (ein Jahr alt) genommen. Die Knochenmarktransplantation wurde am 2. Mai 1991 durchgeführt, ohne T-Zellen-Verarmung, mit Standard-Anti-GVHD-Prophylaxe unter Verwendung von Cyclosporin A. Die Patientin hatte einen wenig ereignisreiches Ergebnis nachfolgend an die Knochenmarktransplantation, ohne GVHD. 8 Monate nach der Knochenmarktransplantation entwickelte die Patientin einen offenen hämatologischen und zytogenen Rückfall.
Die Zelltherapie bestand aus Spender-PBL von dem Knochenmarktransplantatspender in einer äquivalenten Dosis von 5 × 10⁶ T-Zellen/kg, verabreicht im Februar 1992. Eine gleichartige Dosis von Spender-PBL wurde im März 1992 verabreicht, mit damit einhergehender Verabreichung von rhIL-2 subkutan (6 × 10⁶ IU/m²) während 3 aufeinanderfolgender Tage, beginnend am Tag der Zelleninfusion. Im April 1992 erhielt die Patientin ASL von dem Knochenmarktransplantatspender in einer äquivalenten Dosis von 5 × 10⁶ T-Zellen/kg. Im Juli 1992 erhielt die Patientin ASL vom Knochenmarktransplantatspender in einer äquivalenten Dosis von 3 × 10⁶ T-Zellen/kg mit damit einhergehender Verabreichung von rhIL-2 subkutan (6 × 10⁶ IU/m²) während 3 aufeinanderfolgender Tage, beginnend am Tag der Zelleninfusion.
Es entwickelten sich keine Anzeichen von GVHD, und, vielleicht demzufolge, zeigte die Patientin trotz der Zellen-Immuntherapie fortschreitende Erkrankung. Eine weitere Behandlung mit Roferon A versagte beim Herbeiführen zytogener Remission. Die Patientin wurde im September 1994 einer zweiten allogenen Knochenmarktransplantation ohne T-Zellen-Verarmung unterzogen, starb jedoch aufgrund fortschreitender Krankheit.
Patient Nr. 5. Bei einem zweijährigen Mädchen wurde im August 1992 myelodysplastisches Syndrom (MDS) refraktärer Anämie festgestellt, mit überschüssigen Blasten, die eine klonale t(9:11)-Verlagerung aufwiesen, Beweis des Übergangs zu Leukämie. Allogene Knochenmarktransplantation von einem vollständig HLA A B DR DRB1-passenden und MLR-nicht-reaktiven Bruder wurde am 10. Februar 1993 durchgeführt. Die Konditionierung bestand aus Busulfan, 16 mg/kg gegeben über vier aufeinanderfolgende Tage, Thiotepa, 10 mg/kg gegeben über zwei aufeinanderfolgende Tage, und Cytoxan, 16 mg/kg gegeben über zwei aufeinanderfolgende Tage. Die allogene Knochenmarktransplantation war nicht-T-Zellen-verarmt, und die Patientin hatte ein nichtereignisreiches Ergebnis ohne Anzeichen von GVHD nach Standard-Anti-GVHD-Prophylaxe mit Cyclosporin A. Die Patientin ging fünf Monate nach der Knochenmarktransplantation in vollen Rückfall mit derselben klonogenen Leukämie.
Im August 1993 wurde die Patientin mit Spender-PBL von dem Knochenmarkspender mit einer äquivalenten Dosis von 2,8 × 10⁸ T-Zellen/kg behandelt. Es entwickelte sich kein Anzeichen von GVHD. Im September 1993 erhielt die Patientin Peripherblutlymphozyten von demselben Spender in einer äquivalenten Dosis von 4 × 10⁷ T-Zellen/kg, bei damit einhergehender Verabreichung von rhIL-2 subkutan (6 × 10⁶ IU/m²) während 3 aufeinanderfolgender Tage, beginnend am Tag der Zelleninfusion. Im November 1993 erhielt die Patientin ASL von dem Knochenmarktransplantationsspender in einer äquivalenten Dosis von 1,4 × 10⁸ T-Zellen/kg mit damit einhergehender Verabreichung von rhIL-2 subkutan (6 × 10⁶ IU/m²) während 3 aufeinanderfolgender Tage, beginnend am Tag der Zelleninfusion. Es entwickelte sich kein Anzeichen von GVHD. Trotz der Abwesenheit von GVHD zeigte die Patientin eine vollständige hämatologische und zytogene Reaktion, wobei 20 von 20 Metaphasen einen normalen männlichen Karyotyp ohne chromosomale Abweichungen und eine normale Knochenmarkmorphologie aufwiesen. Unglücklicherweise wurde im Januar 1994 wiederum ein offener Rückfall festgestellt, und die Patientin starb im Februar 1994 aufgrund fortschreitender Krankheit.

Claims

Verwendung von allogenen Lymphozyten in der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines menschlichen Krebspatienten mit einem soliden Tumor, umfassend bösartige Zellen, wobei sich der besagte Patient einer Krebstherapiebehandlung, umfassend eine allogene Stammzellentransplantation, unterzogen hat, wobei a) allogene Lymphozyten an den genannten Patienten verabreicht werden sollen; und b) der besagte Patient auf den Grad der genannten bösartigen Zellen überwacht werden soll.
Verwendung von allogenen Lymphozyten, die durch das Aussetzen an einen T-Zellenaktivator in vitro aktiviert sind, in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Krebspatienten mit bösartigen hämatopoetischen Zellen, wobei der besagte Patient sich einer Krebstherapiebehandlung unterzogen hat, umfassend eine allogene Stammzellentransplantation, wobei a) die genannten allogen aktivierten Lymphozyten dem genannten Patienten verabreicht werden sollen; und b) der besagte Patient auf den Grad der genannten bösartigen, hämatopoetischen Zellen überwacht werden soll.
Verwendung eines T-Zellenaktivators in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines menschlichen Krebspatienten mit einem soliden Tumor, umfassend bösartiger Zellen, wobei sich der besagte Patient einer Krebstherapiebehandlung, umfassend eine allogene Stammzellentransplantation, unterzogen hat, wobei a) allogene Lymphozyten und der besagte T-Zellenaktivator an den genannten Patienten verabreicht werden sollen; und b) der besagte Patient auf den Grad der genannten bösartigen Zellen überwacht werden soll.
Verwendung nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die genannten Lymphozyten durch das Aussetzen an einen T-Zellenaktivator in vitro vor der Verabreichung an den genannten Patienten aktiviert werden.
Verwendung eines T-Zellenaktivators in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines menschlichen Krebspatienten mit einem soliden Tumor, umfassend bösartige Zellen, wobei sich der besagte Patient einer Krebstherapiebehandlung, umfassend eine allogene Stammzellentransplantation, unterzogen hat, wobei a) allogene Lymphozyten und der besagte T-Zellenaktivator an den genannten Patienten verabreicht werden sollen, wobei die genannten allogenen Lymphozyten durch das Aussetzen an einen T-zellenaktivator in vitro vor der Verabreichung an den genannten Patienten aktiviert werden; und b) der besagte Patient auf den Grad der genannten bösartigen, hämatopoetischen Zellen überwacht werden soll.
Verwendung nach Anspruch 4 oder 5, wobei der besagte T-Zellenaktivator mindestens einen Signalübertragungswegsaktivator umfasst.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei der besagte T-Zellenaktivator ausgewählt ist aus einer Gruppe, bestehend aus IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-13, IL-15, IFNα, IFN_Y, TNFα, Anti-CD3, Anti-CD28; Phytohämagglutinin, Concanavalin A und Phorbolester.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Behandlung eines Patienten mit Brustkrebs.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die genannten Lymphozyten HLA-kompatibel mit dem genannten Patienten sind.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die genannten allogenen Lymphozyten in ihrer Lebensdauer beschränkt sind.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die genannten Lymphozyten einen Suizidgen tragen, der sich auf die Anfälligkeit der Lymphozyten überträgt, durch einen chemotherapeutischen Wirkstoff nach der Verabreichung der genannten Lymphozyten an den Patienten, zu töten.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, für einen Patienten, der eine Infusion mit allogenen, ruhenden Lymphozyten erhalten hat.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, für einen Patienten, der trotz der genannten Krebsbehandlungstherapie bösartige Zellen aufweist.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, für einen Patienten, der sich nach der genannten allogenen Stammzellentransplantation in einem offenkundigen Rückfallstadium befindet.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 5, zur Behandlung eines Patienten mit chronischer myelogener Leukämie.
Verwendung nach Anspruch 2 oder 5, für einen Patienten mit akuter lymphozytischer Leukämie.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die genannten allogenen Lymphozyten in einem periheren, mononuklearen Blutzellenpräparat enthalten sind.
Herstellungsprodukt, umfassend Verpackungsmaterial und einen Behälter in dem genannten Verpackungsmaterial, wobei der genannte Behälter ein Medikament enthält, umfassend allogene Lymphozyten, und gemäß Anspruch 1 erhältlich ist.
Herstellungsprodukt, umfassend Verpackungsmaterial und einen Behälter in dem genannten Verpackungsmaterial, wobei der genannte Behälter ein Medikament enthält, umfassend allogene Lymphozyten, die durch das Aussetzen an einen T-Zellenaktivator in vitro aktiviert sind, und gemäß Anspruch 2 erhältlich ist.
Herstellungsprodukt, umfassend Verpackungsmaterial und einen Behälter in dem genannten Verpackungsmaterial, wobei der genannte Behälter ein Medikament enthält, umfassend einen T-Zellenaktivator, und gemäß Anspruch 3 oder 5 erhältlich ist.
Herstellungsprodukt nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei der genannte Behälter ein faltbarer Behälter ist, umfassend gegenüberliegende Wände aus flexiblem Material und einem flexiblen Schlauch, der aus diesem Behälter herausragt.