DE69623328T2

DE69623328T2 - Verwendung von mannanasen als schleimkontrollmittel

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Publication number: DE69623328T2
Application number: DE69623328T
Authority: DE
Inventors: Laura Van Pee; Jozef Van Poele; M. Van Speybroeck
Original assignee: BetzDearborn Inc
Current assignee: Hercules LLC
Priority date: 1995-05-19
Filing date: 1996-05-17
Publication date: 2003-05-15
Anticipated expiration: 2016-05-18
Also published as: ATE222883T1; EP0871596B1; AU5897696A; BR9609113A; NO975188L; NZ309051A; TW474900B; ES2183955T3; CA2215635A1; EP0871596A1; NO975188D0; WO1996036569A1; AU696190B2; ZA963900B; KR19990014926A; JPH11505565A; DE69623328D1

Description

Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung für die Verhinderung und/oder Entfernung von Biofilm auf Oberflächen (Anti- Biofilm-Zusammensetzung), die wenigstens eine Mannanase, gegebenenfalls in Kombination mit wenigstens einem Enzym aus der Gruppe bestehend aus Proteasen, Lipasen, Glycoproteasen, umfasst, wobei die Zusammensetzung keine Nigeranase, α-Mannanase und Pullulanase enthält, und die Verwendung der Zusammensetzung für die Verhinderung und/oder die Entfernung von Biofilm von Oberflächen.
Die Anheftung von Mikroorganismen an feste Oberflächen ist in Fluidsystemen üblich. Dieses Phänomen wird allgemein als Biobewuchs ("biofouling") bezeichnet. Die Anhäufung von bewuchsbildendem Biofilm ist das Ergebnis von Prozessen, umfassend: 1) den Transport von Material aus der Fluidmasse zu der Oberfläche und die nachfolgende Anheftung, 2) mikrobiellen Metabolismus innerhalb des Biofilms, 3) Fluid-Scherbeanspruchung an der Filmoberfläche, 4) Oberflächenmaterial und -rauhigkeit, 5) Bewuchskontrollprozeduren.
Probleme, die mit der Biofilmbildung bei verschiedenen industriellen Verfahren verbunden sind, sind Energieverluste, Materialverschlechterung und verringerter Verfahrenswirkungsgrad. Energieverluste bedeuten verringertes Wärmeaustauschvermögen bei Kühltürmen und erhöhten Energieverbrauch bei Fluidverteilungssystemen und bei der Verschiffungsindustrie. Materialverschlechterung, die durch die der festen Oberfläche nächstliegende Biofilmschicht verursacht wird, bedeutet Korrosion und Fäulnis. Ein verringerter Verfahrenswirkungsgrad wird bei der Wasserbehandlung, der Zellstoff- und Papierindustrie und der Wasserqualitätsdatensammlung festgestellt.
Auch die Gesundheitspflege hat mit Biobewuchs zu tun, z. B. die Bildung von Zahnplaque, die Anheftung von mikrobiellen Zellen an eukaryotische Gewebe, was Krankheiten verursacht, die Qualität des Trinkwassers, die Freisetzung von pathogenen Organismen aus Biofilmen in industrielle Wassersysteme. Industrielle Prozess- oder Verfahrenswassersysteme, wie z. B. offene oder geschlossene Wasserkreislaufsysteme von Papierfabriken oder Kühlwassersysteme, bieten geeignete Bedingungen für die Vermehrung von Mikroorganismen mit dem Ergebnis, dass ein als Biofilm bekannter Schleim auf Oberflächen von wasserführenden Systemen gebildet wird. Insbesondere im Falle von Kühlwassersystemen können diese Biofilmablagerungen zu einem verringerten Wärmeaustausch, Schäden an den Verbindungen von Rohrleitungen und Korrosion innerhalb der Systeme führen. Auf diese Weise sind abträgliche Auswirkungen auf die Verfahrenssteuerung möglich, die den Wirkungsgrad des in Frage stehenden industriellen Verfahrens verringern oder die Produktqualität beeinträchtigen können. Zusätzlich dazu führen Biofilm- oder Schleimablagerungen im allgemeinem zu höherem Energieverbrauch. Von einer erhöhten Biofilmbildung am meisten betroffen sind industrielle Verfahren, wie die Herstellung von Zellstoff, Papier, Karton und Textilien. Beispielsweise im Falle von Papiermaschinen werden recht große Mengen an Wasser in als "Kreidewassersysteme" bezeichneten Kreislaufsystemen (primärer oder sekundärer Kreislauf, d. h. Kreidewasser I oder II) umgepumpt. Das Kreidewasser, das dispergierten Zellstoff enthält, bildet ein ideales Kulturmedium für die Vermehrung von Mikroorganismen.
Abgesehen von industriellen wasserführenden Systemen tritt eine Biofilmbildung auch auf Oberflächen in anderen Umgebungen, wie auf Ultrafiltrations- und Dialysemembranen in der Gesundheitspflege, auf. Innerhalb des Umfangs der Erfindung kann die enzymatische Zusammensetzung für die Schleimverhinderung und -entfernung in einem jeglichen System, in dem eine Biofilmbildung auftritt, eingesetzt werden.
Biofilm oder Schleim wird durch Bakterien, insbesondere gramnegative Bakterien, wie Pseudomonas, Acinetobacter und Aerobacter plus Flavobacterium, Desulfovibrio, Escherichia, Sphaerotilus, Enterobacter und Sarcina gebildet. Die Zellwandstruktur von gramnegativen Bakterien ist ein Faktor, der zur Schleimbildung besonders beiträgt. Die Zellwand umfasst Peptidoglycan, das aus Acetylaminozuckern und Aminosäuren besteht, plus eine äußere Membran, die aus Proteinen, Lipopolysacchariden und Lipoproteinen gebildet wird. Im Gegensatz dazu wird die Zellwand von grampositiven Bakterien, z. B. Bacillus, hauptsächlich aus Peptidoglycan und Teichonsäuren gebildet.
Biofilm wird des weiteren durch Pilze und Hefen, wie Pullularia pullulans, Alternaria sp., Lenzytes, Lentinus, Polyporus, Fomes, Sterium, Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Candida, Saccharomyces und Basidomycetes, gebildet.
Ein Biofilm kann verschiedene Mikroorganismen umfassen. Innerhalb eines Biofilms werden Spezies von gramnegativen und grampositiven Bakterien, Pilze und, wenn Licht zur Verfügung steht, wie auf Latten von Kühltürmen, Algen gefunden. Die Entwicklung eines Biofilms wird durch die Aufkonzentrierung von organischen Molekülen, d. h. Lipiden, Proteinen, Zuckern, an einer inerten Oberfläche initiiert. Dann erfolgt das Anziehen von Mikroorganismen zu dieser Schicht und eine nachfolgende Anheftung durch Exopolymere. Die angehefteten Mikroorganismen bilden dann diskrete Mikrokolonien. Wenn nach einer Weile mehr Kolonien ineinander wachsen, wird ein wahrer Biofilm gebildet. Der Biofilm wird dicker, bis ein Fließgleichgewichtszustand erreicht wird: die Anziehung von Mikroorganismen aus der Flüssigkeit zu dem bestehenden Biofilm wird kompensiert durch das Abscheren von Mikroorganismen aus dem Biofilm in strömende Flüssigkeit.
Die Dicke eines Biofilms nimmt mit der Substratkonzentration zu. Innerhalb eines dicken Biofilms können bestimmte Bereiche an Nährstoffen verarmt sein, was zu schwachen Strukturen führt. Diese schwachen Stellen können sich ablösen, was Löcher in der biologischen Matrix erzeugt. Ein nachfolgendes Einwirken von Strömung auf diese Löcher kann mehr Material ablösen, was einen dünnen Biofilm zurücklässt. Wenn der Biofilm dicker wird, entwickelt sich nahe der Oberfläche ein anaerober Bereich. In diesem Bereich sind Mikroben in der Lage, die Oberfläche zu zerstören.
Im allgemeinen sind Mikroorganismen in Biofilmen von großen Mengen von extrazellulären Biopolymeren, die als Glycocalyx bezeichnet werden, umgeben. Die Glycocalyx ist als eine "jegliche Polysaccharid enthaltende bakterielle Oberflächenstruktur, die sich distal zu der Oberfläche der äußeren Membran von gramnegativen Bakterien oder zu der Oberfläche der Peptidoglycanschicht von grampositiven Bakterien befindet", definiert. Die Glycocalyx kann aus regelmäßig angeordneten Glycoproteinen, die als S-Schicht bezeichnet werden, an der Zellwand oder aus einer faserförmigen Polysaccharidmatrix, einer Kapsel, an der Zelloberfläche, die sich teilweise in das Lösungsmittel hinein ablösen kann, bestehen. Diese Kapsel kann hochgradig organisiert sein. Manchmal wird festgestellt, dass die die Mikrobe umgebende Polysaccharid-Kapsel an die Zelloberfläche nicht kovalent angeheftet ist. Beim Pelletieren der Zellen bleibt die Glycocalyx dann im Überstand zurück.
Von Glycocalyx eingeschlossene Mikrokolonien werden durch eine Zellreplikation, die so auftritt, dass beide Tochterzellen innerhalb derselben Glycocalyx eingeschlossen sind, gebildet. Die intermolekulare Bindung von Glycocalyx-Biopolymeren wird durch zweiwertige Kationen beeinflusst. Eine Komplexierung dieser Kationen mit EDTA ist wirksam, Biofilme abzulösen. Mehrere Forscher haben eine allgemeine Schlussfolgerung betreffend die Funktion der bakteriellen Glycocalyx, wie heute bekannt, gezogen. Sie hat eine Funktion
1) bei der Anheftung von Zellen an feste Oberflächen oder an andere prokaryotische oder eukaryotische Zellen und
2) beim Abfangen von organischen Nährstoffen aus dem Medium.
3) Eine Kapsel kann ausreichend hoch organisiert sein, so dass Teilchen ausgeschlossen werden, und den Mikroorganismus so vor der Umgebung schützen. Man kann sich die Glycocalyx als eine erste Verteidigungswand gegen Antibiotika, Antikörper, Bakteriophagen vorstellen.
Biofilme bestehen selten aus mikrobiellem Material allein. Oftmals sind anorganische Substanzen Teil des Schleims, z. B. CaCO&sub3;, Aluminiumoxid, Siliciumdioxid, Eisen, Magnesium, Kupfer. In Papiermühlen kann eine Menge Material in dem Film enthalten sein, z. B. Fasern, Füllstoffe, Harz, Harzleim u. s. w.
Die Ablagerung von bakteriellen Schleimen kann mit Bioziden wirksam kontrolliert werden, wobei die Wirkung dieser Biozide auf der Tatsache beruht, dass sie die Mikroorganismen im Betriebswasser töten und folglich die Schleimproduktion verhindern. Jedoch sind Biofilm produzierende Bakterien gegenüber toxischen Substanzen weit resistenter als planktonische Bakterien. Dementsprechend sind sehr hohe Konzentrationen an Bioziden erforderlich, um Biofilm zu entfernen. Dies ist darauf zurückzuführen, dass Biofilm-Zellen sich langsam vermehren und hinsichtlich des Stoffwechsels weniger aktiv sind und da sie von ihrer Glycocalyx geschützt werden, die nicht nur als ein toxische Substanzen immobilisierendes Ionenaustauscherharz, sondern auch als eine hydrophob/hydrophile Barriere, die verhindert, dass Biozide die Zelle erreichen, wirken kann. Ferner werfen Biozide aus ökologischen Gründen viele Zweifel auf und erzeugen aufgrund ihrer Toxizität beträchtliche Probleme bei der Handhabung. Aus diesem Grunde wurden in der Vergangenheit alternative Wege zur Beseitigung von Biofilm gesucht, wobei Enzymen besondere Aufmerksamkeit geschenkt worden ist.
Obwohl die Biofilmmatrix eine heterogene Zusammensetzung haben kann, wird sie primär aus Polysacchariden aufgebaut. Die Forschungsanstrengungen auf dem Gebiet der Schleimentfernung haben sich folglich insbesondere auf Untersuchungen von Polysaccharidasen (Carbohydrasen) konzentriert. Die Verwendung von Enzymen, insbesondere Carbohydrasen, um die Glycocalyx abzubauen und folglich Biofilm zu entfernen oder um eine Schleimbildung in industriellen Wassersystemen zu verhindern, ist in diesem Fachgebiet wohlbekannt.
Zu diesem Zweck sind bereits mehrere Ansätze vorgeschlagen worden, die auf den verschiedenen Ansichten hinsichtlich der Zusammensetzung von industriellem Schleim bzw. Biofilm basieren.
Ein, erster Ansatz besteht in der Verwendung eines lytischen Enzyms, das nicht gegen die sekretierten Polysaccharide im Schleim, sondern gegen Polysaccharide in den Zellwänden wirksam ist. Diese Enzyme zerstören folglich Zellwände und töten Bakterien. Beispielsweise wird in DE 37 41 583 die Verwendung einer Mischung bestehend aus Glucanase und Protease, die eine lytische Enzymaktivität gegenüber 1,3-Glucosebindungen in den Zellwänden aufweist, offenbart. Jedoch kann die Schleimschicht, die die Bakterienzellen schützt, die Enzyme daran hindern, die Zellwände zu erreichen.
Ein zweiter Ansatz beruht auf der Ansicht, dass industrieller Schleim aus einem einzigen Polysaccharidtyp, der von einer Bakterienspezies produziert wird, zusammengesetzt ist. Beispielsweise wird in US 3,824,184 und US 3,773,623 die Verwendung einer Levanhydrolyse, die Levan, das von einer großen Vielzahl von Bakterien produziert wird, abbaut, offenbart. Levan wird jedoch nur von Bakterien, die auf Saccharose wachsen, produziert. In Hinblick auf Papiermühlen oder Kühlsysteme ist es unwahrscheinlich, dass Saccharose in signifikanten Mengen vorhanden ist, so dass Levan keinen bedeutenden Bestandteil von Biofilmen darstellen wird.
CA 1,274,442 und WO 90/02794 offenbaren die Verwendung des Enzyms Alginatlyase, das Alginat, das hauptsächlich von Pseudomonas spp. produziert wird, abbaut. Ferner wird industrieller Schleim stets von einer Population, die aus verschiedenen Mikroorganismen besteht, die abhängig von dem industriellen Standort variieren können, produziert. Da jeder Mikroorganismus sein eigenes typisches Exopolysaccharid-Muster (EPS) produziert, wird industrieller Schleim niemals aus einem einzigen Polysaccharid zusammengesetzt sein.
In US 4,055,467 ist die Verwendung einer Pentosanase-Hexosanase zur Verhinderung von Biofilmbildung in einem Kühlturm offenbart worden.
Ein dritter Ansatz geht von der Tatsache aus, dass in industriellem Schleim eine Menge unterschiedlicher Heteropolysaccharide vorhanden ist. Es ist in diesem Fachgebiet wohlbekannt, dass die Polysaccharide hauptsächlich aus Glucose, Galactose, Mannose, Fucose, Rhamnose, Ribose, Glucosamin, Galactosamin, Mannuronsäure, Galacturonsäure und Glucuronsäure in einer sehr komplexen Anordnung zusammengesetzt sind (siehe L. Kenne et al. in G. Aspinall (Hrsg.) "The Polysaccharides", Band II (1982), Academic Press; I. W. Sutherland in "Surface Carbohydrates of the Procaryotic Cell", Academic Press, London, 1977, 27-96). Des weiteren sind zahlreiche andere Zuckerbestandteile in geringeren Mengen vorhanden.
Dementsprechend könnte angenommen werden, dass viele verschiedene Enzymaktivitäten kombiniert werden müssen, um eine gewisse Wirkung auf industriellen Schleim zu haben. Die Kenntnis der Monosaccharidzusammensetzung von Schleim ist jedoch für die Definition einer Enzymmischung, die Biofilm erfolgreich entfernen kann, nicht ausreichend. Die oben erwähnten Monosaccharide können auf zahlreiche unterschiedliche Weisen verknüpft sein. Glucose kann beispielsweise α-1,2-, α-1,3-, α-1,4-, α-1,6-, β-1,2-, β-1,3-, β-1,4- oder β-1,6-verknüpft sein. Für jede von diesen könnte eine separate enzymatische Aktivität zugesetzt werden, um den Schleim zu beeinflussen. Auch sind das benachbarte Monosaccharid und die Sequenz als solche oder Substituenten an den jeweiligen Sacchariden für die Aktivität einer bestimmten Carbohydrase sehr wichtig.
Des weiteren würde man normalerweise erwarten, dass eine einzelne Carbohydrase mit einer der vielen möglichen Aktivitäten gegen eine der Hauptsaccharidbaueinheiten des EPS oder sogar eine Mischung von einigen wenigen Carbohydrasen keine oder nur eine sehr begrenzte Wirkung auf diese komplexe Mischung von Heteropolysacchariden haben würde. Es ist in diesem Fachbereich festgestellt worden, dass mehr oder weniger komplexe Mischungen eine positive Wirkung auf den Abbau von Heteropolysacchariden entwickeln. US 5,071,765 und EP-A-0 388 115 betreffen die Verwendung von Mischungen von Cellulase, α-Amylase und einer Protease, die β- und α-1,4-verknüpfte Glucose bzw. extrazelluläres Protein angreifen.
In US 5,238,572 wird eine Kombination von Enzymen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Galactosidase, Galacturonidase, Rhamnosidase, Xylosidase, Fucosidase, Arabinosidase und α- Glucosidase, offenbart.
JP-A-06246257 offenbart eine Zusammensetzung zum Entfernen von Schleim, umfassend ein α-Glycan zersetzendes Enzym, ausgewählt aus der Gruppe von Nigeranase, α-Mannanase und Pullulanase.
Ein vierter Ansatz, um eine Biofilmbildung zu verhindern, besteht darin, den anfänglichen Schritt der Schleimbildung, d. h. die Anheftung von Bakterien, zu kontrollieren. In EP-A-0 425 017 wird offenbart, dass Mikroorganismen an eine Oberfläche teilweise durch gegenüber Typ II-Endoglycosidasen reaktive Bindungen gebunden werden. Dieser Typ von Enzymen (Endo-β-N- acetylglucosaminidasen, Endo-α-N-acetylgalactosaminidasen und Endo-β-N-acetylgalactosidasen) ist in der Lage, spezielle interne glycosidische Bindungen, die in Glycoproteinen gefunden werden, zu spalten. Es ist bekannt, dass einige dieser Enzyme ebenfalls lytisch sind.
Es sind in diesem Fachgebiet viele verschiedene enzymatische Verfahren für die Entfernung von Biofilm oder die Biofilmverhinderung vorgeschlagen worden, die entweder eine Kombination von zahlreichen Enzymen erforderten oder die, soweit nur ein oder einige wenige Enzyme verwendet wurden, nur ein begrenztes Wirkspektrum hatten. Zusätzlich waren diese Ansätze nicht erfolgreich, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die abgesehen vom Entfernen oder Kontrollieren von Schleim auch die Bakterienanheftung an Oberflächen von wasserführenden Systemen verhindert und eine Ablösung von anhaftenden Bakterien bewirkt.
Das der Erfindung zugrundeliegende Problem besteht dementsprechend darin, eine enzymatische Zusammensetzung oder ein Enzym mit einem breiten Wirkspektrum bereitzustellen. Die Zusammensetzung sollte vorzugsweise auch in der Lage sein, sowohl die Anheftung von Bakterien zu verhindern als auch Bakterien, die bereits an den Oberflächen des Systems haften, abzulösen. Es sollte insbesondere ein Mittel bereitgestellt werden, das nur ein Enzym bzw. eine einfache Mischung von sehr wenigen Enzymen enthält. Vorteilhafterweise sollte die Zusammensetzung keinerlei Biozid enthalten. Das Enzym oder die Enzyme sollten eine Aktivität haben, die die Anwendung von geringeren Mengen von Enzymen, als sie für Enzyme oder Enzymmischungen im Stand der Technik bekannt sind, ermöglicht.
Der Gegenstand der Erfindung besteht dementsprechend darin, eine Zusammensetzung oder ein Verfahren zur Verhinderung von Schleimbildung und zur Entfernung von Biofilm auf Oberflächen von wasserführenden Systemen verfügbar zu machen, die bzw. das die Nachteile von herkömmlichen Bioziden vermeidet, aber deren Wirksamkeitsausmaß erreicht bzw. übersteigt.
Gemäß der Erfindung wird das Problem durch eine Zusammensetzung (Anti-Biofilm-Zusammensetzung) gelöst, die wenigstens eine Mannanase umfasst, wobei die Zusammensetzung keine Nigeranase, α-Mannanase und Pullulanase umfasst.
Innerhalb des Umfangs der Erfindung wird entweder eine einzelne Mannanase eingesetzt, oder die Mannanase liegt alternativ in Form einer Zusammensetzung, die mehrere Mannanasen umfasst, vor.
Gemäß der Erfindung ist überraschenderweise festgestellt worden, dass eine Zusammensetzung, die wenigstens eine Mannanase umfasst, breite Aktivität aufweist und gegen zahlreiche Mikroorganismen unterschiedlicher Typen wirksam ist.
Die enzymatische Zusammensetzung umfasst insbesondere eine einzelne Mannanase, die am meisten bevorzugt eine 1,4-β-D-Mannan-Mannohydrolase ist, die zufallsgesteuert β(1,4)-Bindungen in Mannanen, Galactomannanen und Glucomannanen hydrolysiert, wie z. B. Gamanase®, die von Novo Nordisk vertrieben wird.
Innerhalb des Umfangs der Erfindung bezieht sich "Mannanase" auf Mannohydrolase, was Mannan-Mannohydrolase (d. h. Endomannanase) wie auch Mannosid-Mannohydrolase (d. h. Exomannanase) umfasst. Der Begriff umfasst ferner Mannohydrolasen, einschließlich aller möglichen Spezifitäten, wie α, β, 1,2, 1,3, 1,4, 1,6, L, D. Dies bedeutet, dass Mannanasen für die Zwecke der Erfindung nützlich sind, die ein jegliches Mannose enthaltendes Polysaccharid an einer Bindung, die mindestens einen Mannose-Zuckerrest involviert, spalten (z. B. EC 3.2.1.24, EC 3.2.1.25 u. s. w.). Beispiele sind Gamanase®, Galactomannanase und Primalco-Mannanase, die allesamt kommerziell erhältliche Mannanasen sind.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine enzymatische Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, die wenigstens eine Mannanase und wenigstens ein Enzym aus der aus Proteasen, Lipasen und Glycoproteasen bestehenden Gruppe umfasst, wobei die Zusammensetzung keine Nigeranase, α-Mannase und Pullulanase umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die Enzymzusammensetzungen wenigstens 4·10² Mannanase-U/kg, beispielsweise 4·10³ U/kg enthalten. Die Mannanase(n) in der Zusammensetzung hat (haben) vorzugsweise eine Aktivität von wenigstens 4·10&sup4; U/kg, mehr bevorzugt 4·10&sup5; U/kg und am meisten bevorzugt 4·10&sup6; U/kg.
Proteasen, die gemäß dieser Erfindung bevorzugt mit Mannanase(n) kombiniert werden, sind Serinproteasen, Metalloproteasen, Cysteinproteasen und dergleichen.
Lipasen, die gemäß dieser Erfindung bevorzugt mit Mannanase(n) kombiniert werden, sind Carboxylesterhydrolase, Arylesterhydrolase, Glycerinesterhydrolase und ähnliche.
Glycoproteasen, die gemäß dieser Erfindung bevorzugt mit Mannanase(n) kombiniert werden, sind Endo-β-N-acetylglucosaminidase D, Endoglycosidase S. N-Glycosidase F und Endoglycosidase H, die allesamt von Boehringer Mannheim vertrieben werden.
Wenn die Mannanase(n) mit wenigstens einem weiteren Enzym aus der obigen Gruppe kombiniert wird (werden), wird vorzugsweise wenigstens eine Protease verwendet, vorteilhafterweise eine alkalische Protease, die ein breites Spektrum von Peptidbindungen hydrolysiert (z. B. Esperase®). Das Verhältnis der zwei Enzyme in der Zusammensetzung kann von 1/99 bis 99/l. Mannanase(n)/alkalische Protease variieren.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung umfasst die Zusammensetzung des weiteren wenigstens ein Enzym-stabilisierendes Agens, ein Biodispergens, ein Biozid und/oder ein Surfactant. Glycol-Komponenten mit Biofilm entfernenden Eigenschaften, wie sie in der deutschen Patentanmeldung 44 45 070.2 offenbart werden, insbesondere Diethylenglycol oder Propylenglycol, sind weitere bevorzugte Additive.
Darüber hinaus können diese Agentien mit wenigstens einem zusätzlichen Enzym aus der aus Carbohydrasen, Proteasen, Lipasen, Glycoproteasen bestehenden Gruppe kombiniert werden.
Ein stabilisierendes Mittel, wie Propylenglycol, andere Polyole, Zucker, Zuckeralkohole oder Borsäure, werden das Enzym vor einem mikrobiellen Abbau bewahren, irreversible Denaturierung und Oxidation des Enzym verhindern.
Biodispergentien, wie Natriumdodecylbenzolsulfonat, Dodecyldimethylammoniumchlorid oder Ethoxy-Propoxy-Blockpolymere, tragen zur Verhinderung des Schleimaufbaus oder zur Biofilmentfernung bei, ohne die Mikroben zu töten, indem die Oberflächenenergie des Biofilms, des Wassers und/oder der aufnehmenden Oberfläche verändert wird.
Biozide sind Bestandteile, die in einer industriellen Wasserleitung vorhandene Bakterien töten. Beispiele sind Isothiazolinone, Methylenbisthiocyanat, Natriumdimethyldithiocarbamat, Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid, Poly[oxyethylen(dimethylimino)ethylen(dimethylimino)ethylendichlorid], 2,2-Dibrom-3- nitrilopropionamid, 1,3-Bromnitro-2-propandiol, Dithiol, Persäuren (z. B. HOCl, H&sub2;O&sub2;, Peressigsäure).
Obwohl es Gegenstand der Erfindung ist, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die für die Verhinderung und/oder die Entfernung von Biofilm auf Oberflächen von wasserführenden Systemen geeignet ist ohne die Notwendigkeit, dem System Biozide zuzusetzen, könnte die Verwendung von Bioziden in Fällen, wo eine dicke Schleimschicht auf den Oberflächen bereits vorhanden ist, erforderlich sein. In diesem Falle hat sich die Kombination von Mannanase(n), gegebenenfalls mit wenigstens einem weiteren Enzym aus der aus Proteasen, Lipasen und Glycoproteasen bestehenden Gruppe, mit wenigstens einem Biozid als sehr wirksam bei der Biofilmentfernung erweisen. Die enzymatische Zusammensetzung der Erfindung wird jedoch vorzugsweise ohne Biozid verwendet, und ihre Wirksamkeit ist vergleichbar mit der Verwendung von Bioziden allein, d. h. ihre Aktivität ist akzeptabel, aber im Gegensatz zu Bioziden ist die Zusammensetzung der Erfindung nicht-toxisch und biologisch abbaubar.
Innerhalb des Umfangs der Erfindung umfasst die Zusammensetzung wenigstens eine Mannanase (entweder gereinigt oder in roher Form), gegebenenfalls in Kombination mit anderen Enzymen und/oder Additiven (Enzym-stabilisierenden Agentien, Biodispergentien, Bioziden und/oder Surfaktantien), vorzugsweise zusammen mit geeigneten Trägersubstanzen, und umfasst keine Nigeranase, α-Mannanase und Pullulanase.
Die Zusammensetzung der Erfindung kann in einer jeglichen Form, die für ein Zugeben zu dem wasserführenden System geeignet ist, z. B. in flüssiger oder trockener Form, vorliegen. Im trockenen Zustand kann die Zusammensetzung in Form eines Pulvers oder einer Tablette, die durch Lyophilisation hergestellt werden können, vorliegen.
Obwohl es bevorzugt ist, dass die Zusammensetzung der Erfindung gereinigte Enzyme, gegebenenfalls in Kombination mit den oben angegebenen Bestandteilen, umfasst, können die Enzyme auch in roher Form vorhanden sein. Beispielsweise ist die Verwendung von Kulturüberständen von Enzym exprimierenden Mikroorganismen, die Mannanase(n) und/oder Enzyme aus der aus Proteasen, Lipasen, Glycoproteasen bestehenden Gruppe enthalten, möglich.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Mannanase(n) enthaltende Zusammensetzung dem wasserführenden System in einer Menge zugesetzt, die zu einer Konzentration von 1-1000 ppm, vorzugsweise 1-200 U/l und am meisten bevorzugt 1-50 U/l führt. Eine Einheit (U) ist als die Menge von Enzym definiert, die erforderlich ist, um die Viskosität einer 0,2%-igen Mannanlösung in 30 min bei pH 7 und 30ºC um 50% zu verringern. Wenn das zu behandelnde System pH- und Temperaturbedingungen aufweist, die sich von jenen, wie sie oben definiert wurden, unterscheiden, kann es erforderlich sein, die Menge an Enzymaktivität zu modifizieren, um eine optimierte Biofilmbehandlung zu erreichen.
Die Kombination einer Mannanase, wie 1,4-β-D-Mannan-Mannohydrolase, und einer alkalischen Protease ist bevorzugt und führt zu einem synergistischen Verhalten gegenüber der Biofilmentfernung und der Verhinderung von Biofilmbildung.
Die Zusammensetzung der Erfindung, die Mannanase(n) gegebenenfalls in Kombination mit anderen Enzymen oder Agentien enthält, kann entweder an verschiedenen Stellen des wasserführenden Systems zugesetzt werden oder sich an einem einzigen Ort befinden. Es ist auch möglich, die Mannanase(n) enthaltenden Zusammensetzungen an einer Stelle und weitere Enzyme und/oder zusätzliche Agentien, wie Biodispergens(Biodispergentien), Biozid(e) und/oder Surfactant(ien), an einer oder mehreren anderen Stellen zuzugeben. Gemäß der Erfindung ist die Zugabe einer einzelnen Zusammensetzung, wie oben beschrieben, entweder in flüssiger oder trockener Form (siehe oben) am meisten bevorzugt.
Gemäß der Erfindung ist überraschenderweise festgestellt worden, dass eine Mannanase, d. h. eine einzige Carbohydrase, umfassende Zusammensetzung verwendet werden kann, um sowohl die Anheftung von Bakterien in einem hohen Maße zu kontrollieren, als auch Biofilm auf Oberflächen von wasserführenden Systemen zu entfernen. Es war vollständig unerwartet, dass diese einzelne Carbohydrase, die gegenüber einem Homopolymer von Mannose aktiv ist, hohe Aktivität gegen EPS, das eine große Anzahl unterschiedlicher Heteropolysaccharide, wie oben erläutert, umfasst, ausübt.
Der Vorteil der Erfindung liegt dementsprechend unter anderem in der Tatsache, dass bereits ganz zu Beginn des Biobewuchsprozesses eine störende Beeinflussung stattfindet, wobei die Mannanase(n) die Anheftung von Bakterien verhindert bzw. verhindern. Im Gegensatz dazu entfalten andere Carbohydrasen ihre Aktivität normalerweise nur ab dem Punkt, wo Substrat (EPS) durch an den Oberflächen haftende Bakterien bereits gebildet worden ist. Mannanase(n) ist(sind) zusätzlich in der Lage, Biofilm von den Oberflächen von wasserführenden Systemen zu entfernen.
Die Tatsache, dass Mannanase die Anheftung von Bakterien verhindert, ist besonders überraschend, da die Rolle von EPS bei der Anheftung von Mikroorganismen durch mehrere Autoren in der Literatur des Standes der Technik in Zweifel gezogen worden ist. Vor diesem Hintergrund war zu erwarten, dass eine Carbohydrase keine Wirkung auf den Anheftungsprozess selbst haben würde.
Gemäß der Erfindung ist des weiteren überraschenderweise festgestellt worden, dass eine synergistische Wirkung hinsichtlich Schleimentfernung und Verhinderung von Biofilmbildung erzielt wird, indem Mannanase(n) mit Protease(n) kombiniert wird bzw. werden.
Die Zusammensetzung der Erfindung ist für Schleimverhinderung und Biofilmentfernung in einem jeglichen wasserführenden System, d. h. entweder einem offenen oder geschlossenen industriellen Prozesswasser-System, das Biofilm produzierende Mikroorganismen enthält, geeignet. Die Verwendung der Zusammensetzung der Erfindung ist besonders gut geeignet für offene oder geschlossene Wasserkreisläufe in Papierfabriken, insbesondere Kreidewasser-führende Kreisläufe oder für Kühlkreisläufe. Ferner die Biofilmentfernung in industriellen Kühlwassertürmen, Wasserspeicherbehältern, Wasserverteilungssystemen, Zellstoff- und Papiermühlenwasser wie auch Ultrafiltrations- und Dialysemembranen und in der Gesundheitspflege.
Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Bestimmung der Mannanaseaktivität von Gamanase® 1.5L

Eine Einheit ist als die Menge an Enzym definiert, die erforderlich ist, um die Viskosität einer 0,2%-igen Mannanlösung in 30 min bei pH 7 und 30ºC um 50% zu verringern. Unter Bedingungen, wo Temperatur, pH, Ionenstärke und Salzzusammensetzung von den Bedingungen des folgenden Beispiels abweichen, kann die Aktivität der gleichen Enzymmenge sich von der Aktivität, die unter den zuvor definierten Standardbedingungen gemessen wird, unterscheiden.
Das Folgende sind mögliche Quellen für Mannan (diese Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, aber nicht beschränken):
Konjac-Glucomannan
Johannisbrotgummi
Guar gum
Xanthangummi
LPS aus Pseudomonas diminuta Stamm NCTC 8545
exozelluläres Mannan von Rhodotorula glutinis
Bäckerhefe-Mannan.
In dem speziellen Falle von Johannisbrotgummi wurde ein Assay, wie folgt, ausgeführt:
Es wurde eine Stammlösung von Johannisbrotgummi in Tris-Puffer (50 mM, pH 7) hergestellt. Die Substratkonzentration in dem Assay betrug 2000 ppm. Enzymstammlösungen wurden in einem stabilisierenden Puffer (1/100 von 52,5 g CaCl&sub2; und 1,21 g/l Tris, pH 7) hergestellt. 1 ml Enzymstammlösung wurde zu 9 ml Substrat hinzugesetzt.
Von jeder Enzymstammlösung wurde ein Teil durch Kochen für 15 min denaturiert. Der Assay erfolgte in Teströhrchen, Inkubation für 30 min bei 30ºC. Die Enzymhydrolyse wurde durch Kochen für 15 min gestoppt. Die Viskosität wurde mit einem Ubbelohde- Viskosimeter bei 30ºC gemessen. Die prozentuale Viskositätsverringerung wurde berechnet, wobei die Viskosität von Wasser und die Viskosität der Probe, die das inaktivierte Enzym enthält, berücksichtigt wurden. Das Ergebnis kann in Fig. 1 ersehen werden.

Beispiel 2

Verhinderung einer Anheftung von Bakterien an Glasobjektträger durch Gamanase® 1.5L

Der Anheftungstest wurde ausgeführt, wie von M. Fletcher, J. Gen. Microbiology 94 (1976), 400-404, beschrieben. Die Ergebnisse können in Tabelle 1 ersehen werden.
25 ppm Gamanase 1.5L verringert die Anheftung von Pseudomonas fluorescens, das bekanntermaßen in Freilandschleimen vorhanden ist, drastisch um 61% verglichen mit einer Kontrolle. Des weiteren kann eine synergistische Wirkung zwischen Proteasen und Mannanasen beobachtet werden. Eine Kombination von 12,5 ppm Gamanase und 12,5 ppm Esperase hindert die Bakterien nahezu vollständig an der Anheftung.

Beispiel 3

Biofilmentfernung durch Gamanase® 1.5L

Ein Biobewuchsreaktor, der Rohrleitungen mit Abschnitten aus rostfreiem Stahl enthielt, wurde mit Pseudomonas fluorescens und CDC A-5 Untergruppe B, störenden Mikroorganismen, die aus Papiermühlenschleimproben isoliert worden waren, angeimpft. Die Betriebsbedingungen des Biobewuchsreaktors können in Tabelle 2 ersehen werden. Nach 70 Stunden Versuchsdauer hatte sich in den Abschnitten aus rostfreiem Stahl eine ausreichend Menge Biofilm gebildet. Diese Abschnitte wurden aus dem System entfernt, die Außenseite wurde mit steriler PBS gespült und die Abschnitte wurden in großen Petrischalen befestigt. Es wurde sterile PBS, die eine bestimmte Konzentration der Enzymformulierung enthielt, zugesetzt. Für jede Enzymkonzentration gab es eine hitzeinaktivierte Kontrolle. Die Petrischalen wurden 3 oder 24 h bei 40ºC und 50 UpM inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Abschnitte gespült, getrocknet und die Gewichte des Biofilms auf den mit aktivem Enzym behandelten Abschnitten wurden mit denen, die mit der inaktivierten Kontrolle behandelt worden waren, verglichen. Die Ergebnisse von einem der Experimente sind in Tabelle 3 gezeigt. Sie zeigten, dass nur die geringeren Enzymkonzentrationen positive Ergebnisse liefern. Dies wurde auch in einem Anheftungsassay mit Glasobjektträgern festgestellt. 25 ppm Gamanase entfernten 25% des Biofilms.

Beispiel 4

"Tüpfeltests" ("Spottests"): Wirkungen von Gamanase® 1.5L auf die EPS-Produktion auf festem Medium

Für dieses Experiment wurden verschiedene Bakterien, die aus Papiermühlenschleim isoliert worden waren, verwendet: Klebstella pneumoniae Serotyp 67, Pseudomonas paucimobilis und CDC A-5 Untergruppe B. Diese Stämme wurden als Inokulum auf ein festes Medium aufgebracht, wodurch die EPS-Produktion stimuliert wurde. In dem Agar wurden Löcher gemacht, zu denen Enzym zugesetzt werden konnte. Tabelle 4 repräsentiert eine Übersicht über die verschiedenen kommerziell erhältlichen Enzyme, die getestet wurden.
Für einen Satz von Experimenten wurde das Enzym zugesetzt, bevor die Bakterien kultiviert wurden. Sich klärende Zonen um das Loch herum zeigen eine Hemmung der EPS-Bildung durch Diffusion des Enzyms in den Agar an. Dies war der Fall für alle 3 Bakterienstämme, wenn Gamanase 1.5L (Enzym 10) angewendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefasst.
Für einen zweiten Satz wurde das Enzym den Löchern zugesetzt, nachdem man zugelassen hatte, dass die Bakterien sich vermehrten und EPS produzierten. Das Auftreten von sich klärenden Zonen um die Löcher herum zeigt den Abbau des EPS durch das Enzym an. Dies war wieder der Fall für alle 3 Bakterien, wenn Gamanase 1.5L verwendet wurde, aber in einem viel größeren Ausmaß für Pseudomonas paucimobilis. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 angegeben.
Die obigen Experimente zeigen, dass Mannanase(n) sowohl für die Verhinderung als auch den Abbau von EPS, d. h. die Verhinderung von Bakterienanheftung und die Entfernung von Biofilm von Oberflächen von wasserführenden Systemen geeignet ist (sind). Zusätzlich zeigen sie die überlegene Leistungsfähigkeit von Mannanasen gegenüber anderen Enzymen.

Beispiel 5

Auswertung von bioziden Aktivitäten der kommerziell erhältlichen Formulierung Gamanase® 1.5L.

Der Zweck dieses Tests bestand darin, zu untersuchen, ob die positiven Hemmungs- und Entfernungsergebnisse nicht auf eine lytische Enzymaktivität oder auf ein Konservierungsmittel, die in der Ehzymformulierung enthalten sind, zurückzuführen waren.
Als Inokulum wurden ± 10&sup7; CFU/ml Pseudomonas fluorescens (CFU/ml bedeutet Kolonien-bildende Einheiten pro ml) verwendet. Dieses Inokulum wurde durch Zentrifugation einer Übernachtkultur des Organismus bei 8000 UpM, 4ºC für 5 min hergestellt. Das Pellet wurde zweimal in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und resuspendiert und auf die benötigte Zelldichte verdünnt. Die zugesetzten Konzentrationen der Enzymformulierung reichten von 100 bis 12,5 ppm. Für jede Enzymkonzentration wurde auch eine hitzeinaktivierte Kontrolle getestet. Die Inkubation erfolgte zwei Stunden bei 40ºC und pH 7 (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung). Proben wurden bei t = 0, 1 und 2 h genommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 angegeben. Daraus kann auf keine biozide Aktivität des Enzyms geschlossen werden.

Beispiel 6

Enzymatische Hydrolyse von aus einer Freilandschleimprobe isolierten EPS und Analyse mit HPLC-PAD ("High-Performance Ion- Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection"; Hochleistungsionenaustauschchromatographie mit gepulster amperometrischer Detektion).

EPS wurde aus einer Freilandschleimprobe unter Verwendung einer Acetonfällung isoliert. Dieses EPS wurde mit verschiedenen kommerziellen Enzymen hydrolysiert. Die Hydrolysemischung wurde mittels HPLC-PAD analysiert und mit einer Leerwertprobe des Enzyms und des EPS verglichen. Es wurde die Konzentration von aus dem EPS freigesetzten Monosacchariden berechnet. Peaks, die in dem Oligosaccharidbereich des Chromatogramms auftraten, sind in Fläche ausgedrückt. Die Ergebnisse können in Tabelle 8 ersehen werden. Verglichen mit den anderen Enzymen hydrolysiert 1,4-β-D-Mannan-Mannohydrolase EPS sehr erfolgreich.

Beispiel 7

1. Anheftungsassays:

Gamanase® (Novo Nordisk) und reine Galactomannanase (Fluka Chemicals) wurden in dem Anheftungsassay unter Verwendung von Pseudomonas putida als ein beispielhaftes Bakterium ausgewertet.
Enzym % Hemmung
Gamanase® 20
Galactomannanase 19
(Enzymkonzentration: 50 ppm)

2. Hemmung von Biobewuchs durch Mannanasebehandlung:

Man ließ Biofilm sich mit oder ohne Anwesenheit von Mannanase entwickeln. Das Biofilmgewicht wurde als Funktion der Zeit gemessen. Das Ergebnis ist in Fig. 2 gezeigt. Als ein Modell für eine Mannanase wurde Primalco Mannanase M-100, erhältlich von Primalco Ltd., Biotec, verwendet. Die Mannanasebehandlung führte zu einer 75%-igen Hemmung der Biofilmbildung.

3. Zusätzliche Tüpfeltests:

a) Um auszuwerten, ob die sich klärenden Zonen in Bakterienschichten, die nach einer Anwendung von Mannanasen beobachtet wurden, nicht auf die in Tabelle 5 der Anmeldung aufgeführten Bakterien beschränkt sind, wurde Gamanase® 1.5L auf eine Reihe von zusätzlichen Bakterienstämmen aufgetüpfelt.
Es wurden sich klärende Zonen bei Bakterien, die aus Papiermühlenschleim isoliert worden waren, beobachtet (siehe Tabelle 9). Es ist klar, dass die beobachtete Wirkung nicht auf eine kleine Auswahl von Bakterienstämmen beschränkt ist. Siehe auch Tabelle 10.
b) Zwei Mannanasen wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit, bei einer Anzahl von Bakterien sich klärende Zonen zu erzeugen, verglichen (siehe Tabelle 10). Bei den meisten der Bakterien erzeugt die Anwesenheit von Mannanase sich klärende Zonen. In einigen Fällen werden Unterschiede zwischen den zwei Mannanasen beobachtet, aber so, dass sie ein komplementäres Verhalten zeigen.

Liste von Tabellen und Figuren

Tabelle 1: Wirkung von Gamanase® 1.5L und Esperase auf die Anheftung von Pseudomonas fluorescens an Glasobjektträger.
Tabelle 2: Betriebsbedingungen der Biobewuchstesteinheit.
Tabelle 3: Biofilmentfernungsexperiment mit Gamanase® 1.5L.
Tabelle 4: Aktivitäten von kommerziell erhältlichen Enzymen, die in "Tüpfelteste" ("Spot-Tests") ausgewertet wurden.
Tabelle 5: Hemmung der EPS-Bildung durch kommerziell erhältliche Enzyme.
Tabelle 6: Abbauende Aktivität von kommerziell erhältlichen Enzymen gegenüber EPS.
Tabelle 7: Tötungstest mit Gamanase® 1.5L.
Tabelle 8: Freisetzung von Monosacchariden aus aus Papiermühlenschleim isolierten EPS, wie mit HPLC detektiert.
Tabelle 9: Tüpfeltests mit Gamanase® 1.5L.
Tabelle 10: Der Klärungszoneneffekt von zwei unterschiedlichen Mannanasen auf eine Anzahl von zufällig ausgewählten Bakterien.
Fig. 1: Viskositätsverringerung von Johannisbrotgummi durch Galactomannanasen.
Fig. 2: Hemmung von Biobewuchs durch Mannanasebehandlung.

Tabelle 1

BEHANDLUNG Δ% gegenüber KONTROLLE
KONTROLLE 0
25 ppm ESP. -76
25 ppm GAM. -61
12,5 ppm GAM. + 12,5 ppm ESP. -93

Tabelle 2: Betriebsbedingungen der Biobewuchstesteinheit.

Fermenterbedingungen:

Inokulum:
Pseudomonas fluorescens LMG 1794
Übernachtkultur in PBS, pH 7 + 20% Glycerin 100 ml
Belüftung: 1 bar, 25%
500 UpM
TSB: 20 ml/h
Verdünnungswasser: 80 ml/h
Überlauf der Biobewuchseinheit: 100 ml/h
D = 0,05/h
Animpfung des Fermenters und Beginn Belüftung 3 h vor Anlagenstart ("rig upstart"")

Biobewuchstesteinheit:

Nährstoffkonzentration (ppm):
MgSO&sub4;·7H&sub2;O 20
CaCl&sub2;·2H&sub2;O 240
K&sub2;HPO&sub4;·3H&sub2;O 3
NaHCO&sub3; 36
Glucose 338
Bacto-Soytone 20
D = 0,86/h
pH 7
30-35ºC

Tabelle 3

Biofilmentfernungsexperiment mit Gamanase 1.5L

Die Biofilm-Trockengewichte sind in mg/cm2 angegeben.
Die Enzymkonzentrationen sind in ppm Formulierung angegeben.
% Entfernung nur angegeben, wenn der Unterschied zu der Kontrolle signifikant ist (95% Konfidenzniveau) Entfernungsexperimente mit 48 h altem Biofilm ausgeführt (pH 7-Puffer, 40ºC, Schütteln 50 UpM, 24 h Inkubation). Tabelle 4 Aktivität von kommerziell erhältlichen Enzymen, die in "Tüpfeltests" ("Spot-Tests") ausgewertet wurden.

Tabelle 5

Hemmung der EPS-Bildung durch kommerziell erhältliche Enzyme

- :keine sich klärende Zone
+ :sich klärende Zone

Tabelle 6

Abbauende Aktivität von kommerziell erhältlichen Enzymen gegenüber EPS

- : keine sich klärende Zone
+/- : keine sich klärende Zone
+ : deutliche sich klärende Zone
++ : große sich klärende Zone Tabelle 7 Tötungstest mit Gamanase 1.5L

Tabelle 8

Enzymatische Hydrolyse von aus einer Papiermühlenschleimprobe isolierten EPS

Bedingungen: 40ºC, pH 7, Hydrolysedauer = 2 h
EPS-Konzentration = 350 ppm
Konzentration der Enzymformulierung = 1000 ppm
Die Analyse der proben erfolgt durch Anionenaustauschchromatographie. Konzentration der durch Enzymhydrolyse freigesetzten Monosaccharide (in ppm) wird durch Abziehen der Konzentration in einer Enzym-Leerwertprobe und einer EPS-Leerwertprobe von dem Hydrolyseversuch berechnet.
Für freigesetzte Oligosaccharide ist nur die Fläche angegeben. Tabelle 9: Tüpfeltests mit Gamanase® 1.5L Tabelle 10: Der Klärungszoneneffekt von zwei unterschiedlichen Mannanasen auf eine Anzahl von zufällig ausgewählten Bakterien

Claims

1. Zusammensetzung zur Verhinderung und/oder Entfernung von Biofilm auf Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, daß sie wenigstens eine Mannanase umfaßt, wobei die Zusammensetzung keine Nigeranase, α-Mannanase und Pullulanase umfaßt.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie 1,4-β-D-Mannan-mannohydrolase umfaßt.

3. Zusammensetzung nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie ferner wenigstens ein Enzym umfaßt, das aus der aus Proteasen, Lipasen und Glycoproteasen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie wenigstens eine Protease umfaßt.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Protease eine alkalische Protease ist.

6. Zusammensetzung nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie wenigstens ein Enzym-stabilisierendes Agens, Biodispergens, Biozid und/oder Surfactant umfaßt.

7. Zusammensetzung nach den Ansprüchen I bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie in flüssiger Form vorliegt.

8. Zusammensetzung nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie in trockener Form vorliegt.

9. Verwendung der Zusammensetzung nach den Ansprüchen 1 bis 8 zur Verhinderung und/oder Entfernung von Biofilm auf Oberflächen wasserführender Systeme.

10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das wasserführende System ein offenes oder geschlossenes industrielles Prozeßwasser-System ist.

11. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das industrielle Prozeßwasser-System ein offener oder geschlossener Wasserkreislauf in einer Papierfabrik ist.

12. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberflächen Ultrafiltrations- oder Dialysemembranen sind.

13. Verwendung nach den Ansprüchen 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zusammensetzung dem Wasser in einer Menge zugibt, die zu einer Mannanase-Konzentration von 0,1 - 1000 Einheiten/l führt.

14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zusammensetzung dem Wasser in einer Menge zugibt, die zu einer Mannanase-Konzentration von 1-200 Einheiten/l führt.