DE69622859T2

DE69622859T2 - Mutante die ein verstärker für die pestizide wirkung von bacillus produzieren

Info

Publication number: DE69622859T2
Application number: DE69622859T
Authority: DE
Inventors: William D. Lidster; Susan C. Macintosh; Denise Manker; Helle Outtrup; Robert L. Starnes
Original assignee: Valent BioSciences LLC
Current assignee: Valent BioSciences LLC
Priority date: 1995-05-30
Filing date: 1996-05-17
Publication date: 2003-04-30
Anticipated expiration: 2016-05-18
Also published as: EP0828819A1; PT828819E; ES2183947T3; AU5797096A; ZA963315B; EP0828819B1; CA2222801A1; WO1996038539A1; JPH11506004A; CZ362597A3; PL183156B1; DK0828819T3; PL323472A1; DE69622859D1; JP3794705B2; HUP9802569A3; AU717681B2; HUP9802569A2; ATE221912T1

Description

1. GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft einen mutierten Bacillus-Stramm, welcher einen Faktor produziert, welcher die pestizide Wirksamkeit eines Bacillus-verwandten Pestizids, eines chemischen Pestizids und/oder eines Virus mit pestiziden Eigenschaften verstärkt, worin ein derartiger Faktor in größeren Mengen enthalten ist oder eine größere verstärkende Wirksamkeit im Vergleich zu dem Elternstamm aufweist, und Verfahren zur Herstellung solcher mutierter Stämme, Die Erfindung betrifft auch Verfahren zum Erhalten des Faktors.

2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Alljährlich schädigen Schädlinge die Landwirtschaft, die Forstwirtschaft, und das öffentliche Gesundheitswesen verursacht Verluste von Millionen von Dollar. Verschiedene Strategien sind verwendet worden, um derartige Schädlinge zu kontrollieren.
Eine Strategie ist die Verwendung von chemischen Pestiziden mit einem breiten Bereich oder Spektrum an Wirksamkeit. Jedoch gibt es mehrere Nachteile bei der Verwendung chemischer Pestizide. Ausdrücklicher können diese Pestizide wegen ihres breiten Wirksamkeitsspektrums Nicht-Target- Organismen wie nützliche Insekten und Parasiten von zerstörerischen Schädlingen zerstören. Zudem sind chemische Pestizide häufig toxisch für Tiere und Menschen. Des weiteren entwickeln Zielschädlinge häufig eine Resistenz, wenn sie wiederholt derartigen Substanzen ausgesetzt werden.
Eine andere Strategie schließt die Verwendung von Biopestiziden ein, um Insekten-, Pilz- und Unkrautbefall zu kontrollieren. Biopestizide sind natürlich vorkommende Krankheitserreger und/oder die Substanzen, die von diesen Krankheitserregern produziert werden. Der Vorteil der Verwendung von Biopestiziden ist, dass sie im allgemeinen im Vergleich zu chemischen Pestiziden für Nicht-Target-Organismen und die Umwelt als Ganzes weniger schädlich sind.

2.1. Bacillus thuringiensis

Das am verbreitetsten verwendete Biopestizid ist Bacillus thuringiensis. Bacillus thuringiensis ist ein bewegliches, stäbchenförmiges, grampositives Bakterium, das in der Natur weit verbreitet ist, insbesondere im Boden und in insektenreichen Umgebungen. Während der Sporenbildung produziert Bacillus thuringiensis einen parasporalen Kristalleinschluss/Kristalleinschlüsse, welcher für Insekten tödlich ist nach Aufnahme in empfindliche Insektenlarven der Ordnungen Lepidoptera, Diptera und Coleoptera. Die Einschlüsse können in Form, Anzahl und Zusammensetzung variieren. Sie bestehen aus einem oder mehreren Proteinen mit den Namen delta- Endoxotine, welche im Größenbereich von 27-140 kDa vorkommen können. Die für Insekten tödlichen delta-Endoxotine werden im Allgemeinen durch Proteasen im Larvendarm in kleine (gestutzte) toxische Polypeptide konvertiert, die Mitteldarmzerstörung und schließlich den Tod des Insektes hervorrufen (Höfte und Whiteley, 1989, Microbiological Reviews 53: 242-255).
Es gibt mehrere Bacillus thuringiensis-Stämme, die verbreitet als Biopestizide in der Forstwirtschaft, der Landwirtschaft und in Bereichen des öffentlichen Gesundheitswesens verwendet werden. Bacillus thuringiensis Subsp. kurstaki und Bacillus thuringiensis Subsp. aizawai produzieren delta-Endoxotine, die für Lepidoptera spezifisch sind. Ein delta-Endotoxin, das für Coleoptera spezifisch ist, wird produziert durch Bacillus thuringiensis Subsp. tenebrionis (Krieg et al., 1988, US-Patent Nr. 4.766.203). Weiterhin produziert Bacillus thuringiensis Subsp. israelensis delta- Endoxotine, die für Diptera spezifisch sind (Goldberg, 1979, US- Patent Nr. 4.166.112).
Andere Bacillus thuringiensis-Stämme, die für Dipteren- Schädlinge spezifisch sind, sind ebenfalls beschrieben worden.
Ein Bacillus thuringiensis-Isolat ist offenbart worden, welches toxisch ist für Diptera und Lepidoptera (Hodgman et al., 1993, FEMS Microbiologogy Letters 114: 17-22). Eine SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese von dem gereinigten Kristall delta-Endotoxin aus diesem Isolat deckte drei Proteinspezies auf, welche verwandt sind mit den Toxinen CryIA(b), CryIB und CryIIA. Es ist außerdem ein Bacillus thuringiensis-Isolat offenbart worden, welches ein Dipteren-aktives Kristall produziert, das sich zusammensetzt aus Proteinen mit den relativen Molekülmassen 140, 122, 76, 72 und 38 kDa (Payne, 1994, US-Patent Nr. 5.275.815). EPO 480.762 offenbart fünf B.t.- Stämme, welche jeweils wirksam sind gegen Dipteren-Schädlinge; jeder besitzt auch ein eindeutiges Kristall-delta- Endotoxinmuster.
Verschiedene Bacillus thuringiensis-Stämme sind beschrieben worden, welche pestizide Wirksamkeit gegen andere Schädlinge als Lepidoptera, Coleoptera und Diptera aufweisen. Fünf Bacillus thuringiensis-Stämme sind offenbart worden, welche delta-Endotoxine produzieren, die toxisch gegen Nematoden sind (Edwards, Payne und Soares, 1988, Eur. Pat. Anmeldung Nr. 0 303 426 B1). Es ist außerdem ein Bacillus thuringiensis-Stamm, PS81F, offenbart worden, welcher verwendet werden kann, um Menschen und Tiere zu behandeln, die parasitischen Protozoen als Wirt dienen (Thompson und Gaertner, 1991, Eur. Pat. Anm. Nr. 0 461 799 A2). Mehrere Bacillus thuringiensis-Isolate sind ebenfalls offenbart worden mit Wirksamkeit gegen Milben-und- Zecken-Schädlinge. Diese Isolate produzieren Kristalle, die sich aus Proteinen zusammensetzen mit relativen Molekülmassen in dem (breiten) Bereich von 35 kDa bis 155 kDa (Payne, Cannon und Bagley, 1992, PCT Application No. WO 92/19106). Es sind auch Bacillus thuringiensis-Stämme offenbart worden mit Wirksamkeit gegen Schädlinge der Ordnung Hymenoptera (Payne, Kennedy, Randall, Meier und Uick, 1992, Eur. Pat. Anm. Nr. 0 516 306 A2); mit Wirksamkeit gegen Schädlinge der Ordnung Hemiptera (Payne und Cannon, 1993, US-Patent Nr. 5.262.159); mit Wirksamkeit gegen Saugwurm-Schädlinge (Hickle, Sick, Schwab, Narva und Payne, 1993, US-Patent Nr. 5.262. 399); und mit Wirksamkeit gegen Schädlinge der Ordnung Phthiraptera (Payne und Hickle, 1993, US- Patent Nr. 5.273.746. Weiterhin ist ein anderer Stamm von Bacillus thuringiensis Subsp. kurstaki, WB3S-16, isoliert aus australischen Schafwollabfällen, offenbart worden, der toxisch ist für die Beißlaus Damalinia ovis, ein Phthiraptera Schädling (Drummond, Miller und Pinnock, 1992, J. Invert. Path. 60: 102- 103).
Die delta-Endotoxine werden codiert durch cry(Kristallprotein)-Gene, welche allgemein auf Plasmiden ausfindig zu machen sind. Die cry-Gene sind auf der Basis relativer Aminosäurehomologie und pestizider Spezifität in sechs Klassen und mehrere Subklassen unterteilt worden. Die Hauptklassen sind Lepidoptera spezifisch (cryI); Lepidoptera- und Diptera spezifisch (cryII); Coleoptera spezifisch (cryIII); Diptera spezifisch (cryIV) (Höfte und Whiteley, 1989, Microbiologlcal Reviews 53: 242-255); Coleoptera- und Lepidoptera spezifisch (bezeichnet als cryV-Gene durch Tailor et al., 1992, Molecular Microbiology 6: 1211-1217); und Nematodespezifisch (bezeichnet als cryV- und cryVI-Gene durch Feitelson et al., 1992, Bio/Technology 10: 271-275).
Delta-Endoxotine sind durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt worden. Die delta-Endoxotine, die durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt werden, können in Kristallform sein oder auch nicht.
Für einige Stämme von Bacillus thuringiensis ist gezeigt worden, dass sie ein hitzestabiles pestizides Adenin-Nucleotid- Analog produzieren, das bekannt ist als β-Exotoxin Typ I oder Thuringiensin, welches allein pestizid ist (Sebesta et al., in H. D. Burges (ed.), Microbial Control of Pests and Plant Diseases, Academic Press, New York, 1980, Seite 249-281). β- Exotoxin Typ I ist in dem Überstand einiger Bacillus thuringiensis-Kulturen gefunden worden. Es hat eine relative Molekülmasse von 701 und ist zusammengesetzt aus Adenosin, Glucose und Allarsäure (Farkas et al., 1977, Coll. Czechosslovak Chem. Comm. 42: 909-929; Lüthy et al., in Kurstak (ed.), Microbial and Viral Pesticides, Marcel Dekker, New York, 1982, S. 35-72). Sein Wirtsbereich umfasst, ist aber nicht beschränkt auf, Musca domestica, Mamestra configurata Walker, Tetranychus urticae, Drosophila melanogaster und Tetranychus cinnabarinus. Es wird angenommen, dass die Toxizität von β-Exotoxin Typ I der Hemmung von DNA-gerichteter RNA-Polymerase durch Konkurrenz mit ATP zuzuschreiben ist. Es wurde gezeigt, dass β-Exotoxin Typ I durch ein cry-Plasmid in fünf Bacillus thuringiensis-Stämmen codiert wird (Levinson et al., 1990, J. Bacteriol. 172: 3172- 3179). Für β-Exotoxin Typ I wurde herausgefunden, dass es durch Bacillus thuringiensis Subsp. thuringiensis Serotyp 1, Bacillus thuringiensis Subsp. tolworthi Serotyp 9 und Bacillus thuringiensis Subsp. darmstadiensis Serotyp 10 produziert wird.
Ein anderes β-Exotoxin, das klassifiziert ist als β- Exotoxin Typ II, ist beschrieben worden (Levinson et al., 1990, J. Bacteriol. 172: 3172-3179). Für β-Exotoxin Typ II wurde herausgefunden, dass es durch Bacillus thuringiensis Subsp. morrisoni Serotyp 8ab produziert wird und wirksam ist gegen Leptinotarsa decemlineata. Die Struktur von β-Exotoxin Typ II ist nicht vollständig bekannt, aber unterscheidet sich signifikant von der von β-Exotoxin Typ I darin, dass sich eine Pseudouridin- Komponente an der Stelle von Adenin befindet, worin Anlagerung an den Ribose-Ring an einer Position ist, die ansonsten durch ein Proton besetzt sein würde (Levinson, in Hickle und Finch (eds.), Analytical Chemistry of Bacillus thuringiensis, ACS Symposium Series, Washington, D. C., 1990, S. 114-136). Weiterhin gibt es nur ein Signal in dem Proton-NMR-Spektrum entsprechend der Nucleosidbase (bei 7,95 ppm), und das Spektrum hat kein anomeres Ribose-Typ-Protein-Signal (5,78 ppm).
Andere wasserlösliche Substanzen, die aus Bacillus thuringiensis isoliert worden sind, schließen alpha-Exotoxin ein, welches toxisch ist gegen die Larven von Musca domestica (Luthy, 1980, FEMS Microbiol. Lett. 8: 1-7); gamma-Exotoxine, welche verschiedene Enzyme sind einschließlich Lecithinasen, Chitinasen und Proteasen, deren toxischen Wirkungen nur ausgedrückt werden in Kombination mit beta-Exotoxin oder delta- Endotoxin (Forsberg et al., 1976, Bacillus thuringiensis: Its Effects an Enviromental Quality, National Research Council of Canada, NRC Associate Committee an Scientific Criteria for Environmental Quality, Subcomittess an Pesticides and Related Compounds and Biological Phenomena); sigma-Exotoxin, welches eine Struktur ähnlich zu beta-Exotoxin aufweist und auch wirksam gegen Leptinotarsa decemlineata ist (Argauer et al., 1991, .J. Entomol. Sci 26: 206-213); und Anhydrothuringiensin (Prystas et al., 1975, Coll. Czechosslovak Chem. Comm. 40: 1775).

2.2. ZWITTERMICIN

Es wurde eine Substanz isoliert von Bacillus cereus, welche das Wachstum des Pflanzenpathogens Phytophthora medicaginis hemmt und die Infektion von Luzernen verringert (siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 4.877.738 und 4.878.936). Es wurde keine andere Wirksamkeit offenbart. Die folgende Struktur ist ausgeklärt worden für Zwittermicin A (He et al., Tet. Lett. 35: 2499-2502):

3. AUFGABEN DER ERFINDUNG

Das Fachgebiet hat sich bemüht, eine erhöhte Mortalität von B.t.-Formulierungen zu erreichen. Zu den Mitteln gehörten die Suche nach neuen Stämmen mit erhöhter Mortalität, der Versuch, vorhandene Stämme gentechnisch herzustellen, und der Versuch, wirksamere Formulierungen durch Kombinieren von B.t.- Sporen und Kristallen mit neuen pestiziden Trägern, chemischen Pestiziden oder Verstärkern zu entwickeln (siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 5.250.515, ein Trypsin-Hemmer). Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die pestizide Wirksamkeit von Pestiziden zu verstärken. Es ist außerdem eine Aufgabe der Erfindung, Stämme zu isolieren, die große Mengen an Potentiatoren produzieren.

4. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft einen mutierten Bacillus-Stamm gemäß Anspruch 1, welcher einen Faktor produziert, welcher die pestizide Wirksamkeit eines Bacillus-verwandten Pestizids verstärkt, wobei die Menge des Faktors, die durch den Mutanten produziert wird, größer ist als die Menge des Faktors, die durch einen entsprechenden Elternstamm produziert wird.
Der Faktor, der durch den Mutanten produziert wird, ist ein Potentiator. Wie hier definiert, ist ein "Potentiator" eine Substanz, welche keine signifikant pestizide Wirksamkeit aufweist, z. B. mit einem LC&sub5;&sub0; (LC&sub5;&sub0; ist die Konzentration der Substanz, die erforderlich ist, um 50% der Schädlinge zu töten) von mehr als ungefähr 3000 ug/g, wie durch Bioassay bestimmt wird (siehe Abschnitt 6), aber so wirkt, dass sie die pestizide Wirksamkeit eines Bacillus-verwandten Pestizids um mindestens ungefähr 50% erhöht und keine Larvenverkrüppelung verursacht. Wie in Abschnitt 2 angemerkt, haben andere Substanzen, die in der Lage sind, die pestizide Wirksamkeit zu erhöhen und die auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie delta-Endotoxine, Trypsinhemmer und Exotoxine, pestizide Wirksamkeit.
In einer speziellen Ausführungsform ist der Faktor wasserlöslich. Wie hier definiert, ist eine Substanz oder eine Verbindung "wasserlöslich", wenn mindestens ungefähr 1 mg einer Substanz in 1 ml Wasser gelöst werden kann. Der Faktor kann auch die pestizide Wirksamkeit eines chemischen Pestizids und/oder eines Virus mit pestiziden Eigenschaften verstärken.
Wie hier definiert, ist "ein Bacillus-verwandtes Pestizid" ein Bacillus(z. B. Bacillus thuringiensis oder Bacillus subtilis)-Stamm, Spore, oder eine Substanz, z. B. Protein oder Fragment davon, mit Wirksamkeit gegen Schädlinge oder einen Mikroorganismus, oder welche diese töten, und in der Lage sind, ein Bacillus-Gen zu exprimieren, das ein Bacillus-Protein oder Fragment davon codiert mit Wirksamkeit gegen Schädlinge, oder welches Schädlinge tötet (z. B. Bacillus thuringiensis delta- Endotoxin), und ein verträglicher Träger (siehe Abschnitt 5.2, unten, für Beispiele von solchen Trägern). Der Schädling kann zum Beispiel ein Insekt, ein Fadenwurm, eine Milbe oder eine Schnecke sein. Ein Mikroorganismus, der in der Lage ist, ein Bacillus-Gen zu exprimieren, das ein Bacillus-Protein oder Fragment davon codiert mit Wirksamkeit gegen Schädlinge, oder welches Schädlinge tötet, lebt in der Phylloplane (der Oberfläche der Pflanzenblätter), und/oder in der Rhizosphäre (die Eide, die die Pflanzenwurzeln umgibt), und/oder in Wasserpflanzenumgebungen, und ist in der Lage, in der entsprechenden Umgebung (Kulturpflanze oder anderen Insektenlebensräumen) mit den Mikroorganismen des Wildtyps erfolgreich zu konkurrieren, und sorgt für die stabile Erhaltung und Expression eines Bacillus-Gens, das ein Bacillus-Protein oder Fragment davon codiert mit einer Wirksamkeit gegen Schädlinge, oder welches Schädlinge tötet. Beispiele für derartige Mikroorganismen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Bakterien, z. B. die Gattungen Bacillus, Pseudomonas, Erwinia, Seratia, Klebstella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azobacter, Leuconostoc, Alcaligenes und Clo stridium; Algen, z. B. die Familien Cyanophyceae, Prochlorophyceae, Rhodophyceae, Dinophyceae, Chrysophyceae, Prymnesiophyceae, Xanthophyceae, Raphidophyceae, Bacillariophyceae, Eustigmatophyceae, Cryptophyceae, Euglenophyceae, Prasinophyceae und Chlorophyceae; und Pilze, insbesondere Hefe, z. B. die Gattungen Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula und Aureobasidium.
Wie hier definiert, bewertet "pestizide Wirksamkeit" das Maß an Wirksamkeit gegen einen Schädling durch Töten oder Hemmen des Wachstums des Schädlings oder durch Schützen der Pflanze gegen Schädlingsbefall.
Ein Verfahren zum Erhalten des Mutanten der vorliegenden Erfindung umfasst folgendes:
(a) Behandeln des Elternstamms Bacillus thuringiensis Subsp. kurstaki EMCC 0086 mit einem Mutagen;
(b) Aufzucht des mutierten Bacillus-Stammes aus Schritt (a) unter geeigneten Bedingungen zum Selektieren des Mutanten; und
(c) Selektieren des Mutanten aus Schritt (b).
Im Wesentlichen reiner Faktor kann von dem Mutanten der Erfindung erhalten werden durch:
(a) Kultivieren des Mutanten des Bacillus-Stammes der Erfindung unter geeigneten Bedingungen;
(b) Sammeln eines Überstandes der Kultur des Mutanten aus Schritt (a) und
(c) Isolieren des Faktors aus dem Überstand aus Schritt (b), um den im Wesentlichen reinen Faktor zu erhalten.
Der Faktor, der aus diesem Mutanten erhalten wird, kann in eine Zusammensetzung formuliert werden, die nicht nur den Faktor und einen pestiziden Träger, sondern auch den Faktor und ein Bacillus-verwandtes Pestizid, chemisches Pestizid und/oder ein Virus mit pestiziden Eigenschaften umfasst. Diese Zusammensetzungen können verwendet werden zum Kontrollieren eines Schädlings, zum Herabsetzen der Resistenz eines Schädlings gegen ein Bacillus-verwandtes Pestizid, was Aussetzen des Schädlings gegenüber einer Zusammensetzung umfasst, die den Faktor und einen pestizid verträglichen Träger umfasst, oder zum Verstärken der pestiziden Wirksamkeit eines Bacillus-verwandten Pestizids.

5. KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 zeigt schematisch das allgemeine Verfahren, das für die Reinigung von Ia verwendet wird.
Fig. 2 zeigt das ¹³C-NMR-Spektrum von Ia.
Fig. 3 zeigt das Proton-NMR-Spektrum von Ia.
Fig. 4 zeigt die Ergebnisse von NOE-Experimenten an dem acetylierten Derivat von Ia.

6. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Gemäß der Erfindung ist der parenterale Bacillus thuringiensis-Stamm Bacillus thuringiensis, Subsp. kurstaki, und der Mutant besitzt die Identifikationscharakteristika von EMCC 0129, hinterlegt bei der NRRL und mit der Zugriffsnummer NRRL B- 21445, oder er besitzt die Identifikationscharakteristika von EMCC 0130, hinterlegt bei der NRRL und mit der Zugriffsnummer NRRL B-21444.

6.1. VERFAHREN ZUM ERHALTEN DES MUTANTEN

Der Elternstamm Bacillus thuringiensis Subsp. kurstaki EMCC 0086 kann mit einem Mutagen behandelt werden, um ein Mutationsereignis auszulösen. Spezieller wird in einem Verfahren zur Mutation von Bacillus thuringiensis-Stämmen zum Erhalten von Mutanten, die in der Lage sind, im Wesentlichen größere Mengen Faktor als ihre Elternstämme zu produzieren, der Elternstamm:
i) mit einem Mutagen behandelt,
ii) die behandelten Zellen werden in einem geeigneten Kulturmedium (z. B. NSMP-Medium) kultiviert; und
iii) es werden Zellen selektiert, welche eine größere Menge Faktor produzieren.
In Schritt (i) kann das Mutagen zum Beispiel ein "chemisches Mutagen N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin; N,N'- Dinitro-N'-nitrosoguanidin oder Ethylmethansulfonat, Gammastrahlung, Röntgenstrahlung und/oder UV-Strahlung sein.
Die Zellen können selektiert werden durch Testen auf die Produktion des Faktors, zum Beispiel durch Kapillarelektrophorese oder Immunoassay unter Verwendung eines Antikörpers gegen den Faktor.
Es kann ein anderes Verfahren zum Erhalten der stark produzierenden Mutanten der Erfindung ins Auge gefasst werden, wie Aufzucht des Elternstamms in einem flüssigen Medium und Selektieren spontaner Mutanten nach Ausbreiten der Kulturnährlösung auf einem Agarmedium, das für die Selektion von Mutanten geeignet ist.
Andere Verfahren zum Screenen von stark produzierenden Mutanten der Erfindung können ins Auge gefasst werden, zum Beispiel Trennen der Mutanten von anderem Material auf der Basis Masse direkt durch Zentrifugation oder andere Mitte zum Trennen von Massen.

6.2. ERHALTEN DES FAKTORS

Die Bacillus-Mutanten der vorliegenden Erfindung können kultiviert werden unter Verwendung von Medien und Fermentationstechniken, die auf dem Gebiet bekannt sind (siehe zum Beispiel Rogoff et al., 1969, J. Invertebrate Path. 14: 122- 129; Dulmage et al., 1971, J. Invertebrate Path. 18: 353-358; Dulmage et al., in Microbial Control of Pests and Plant Diseases, H. D. Burges, ed., Academic Press, N. Y., 1980). In einer speziellen Ausführungsform kann das Fermentationsmedium hydrolysiertes Protein, hydrolysierten Kohlenwasserstoff, Salze und Spurenmetall umfassen. Das Fermentationsmedium kann auch wahlweise eine oder mehrere Aminosäuren umfassen. Nach Vervollständigung des Fermentationszyklus kann der Überstand gesammelt werden durch Trennen von B.t.-Sporen und -Kristallen aus der Fermentationsnährlösung durch Mittel, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, z. B. Zentrifugation und/oder Ultrafiltration. Der Faktor ist in dem Überstand enthalten, welcher gesammelt werden kann durch Mittel, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, z. B. Ultrafiltration, Verdampfung und Sprühtrocknung. Dieses Verfahren wird spezieller in den folgenden Abschnitten beschrieben.
Reinigung des Faktors kann ausgeführt werden durch verschiedene auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Chromatographie (z. B. Ioneneinfang-, Affinitäts- und Ausschlusssäulenchromatographie), Elektrophoreseverfahren, unterschiedliche Löslichkeit, Extraktion, oder jedes andere auf dem Fachgebiet bekannte Standardverfahren.
Die verstärkende Wirksamkeit des Faktors der pestiziden Wirksamkeit des Bacillus-verwandten Pestizids, Virus mit pestizider Wirksamkeit oder chemischen Pestizids gegen verschiedene Schädlinge kann getestet werden unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie zum Beispiel eine aufgenommene künstliche Insektennahrung, künstliche Nahrungsüberlagerung, Blattfärbung, Blattspitze und Blattspritzmittel. Spezielle Beispiele für derartige Assays werden in Abschnitt 7, unten, geliefert. Die Menge Faktor, die produziert wird, kann zum Beispiel durch Kapillarelektrophorese quantifiziert werden.
Der Faktor kann eine relative Molekülmasse von ungefähr 350 bis ungefähr 1200 haben, oder in einer speziellen Ausführungsform von ungefähr 350 bis ungefähr 700.
Der Faktor verstärkt die pestizide Wirksamkeit eines Bacillus-verwandten Pestizids mindestens ungefähr 1,5-fach bis möglicherweise ungefähr 1000-fach, vorzugsweise ungefähr 100- fach bis ungefähr 400-fach. In einer speziellen Ausführungsform verstärkt der Faktor die pestizide Wirksamkeit eines Bacillus thuringiensis delta-Endotoxins einschließlich, aber nicht begrenzt auf, eines Proteins Cryl (einschließlich, aber nicht begrenzt auf, CryIA, CryIB und CryIC), CryII, CryIII, CryIV, CryV oder CryVI in voller Länge oder eine proteolytisch verarbeitete, gestutzte Form ungefähr 1,5-fach bis ungefähr 100- fach. In einer speziellsten Ausführungsform verstärkt der Faktor ein Brt. delta-Endotoxin ungefähr 100-fach bis ungefähr 400- fach. Der Faktor kann auch die pestizide Wirksamkeit eines chemischen Pestizids und/oder eines Virus mit pestiziden Eigenschaften verstärken.
Der Faktor kann außerdem wasserlöslich sein, in Wasser bis zu ungefähr 100ºC mindestens ungefähr 5 Minuten lang stabil sein, mindestens ungefähr 10 Stunden lang stabil sein, wenn er direktem Sonnenlicht ausgesetzt wird, und/oder bei einem pH von ungefähr 2 ungefähr 19 Tage lang stabil sein. Der Faktor kann 13 Kohlenstoffatome aufweisen. Weiterhin kann der Faktor ¹H-NMR- Verschiebungen aufweisen bei ungefähr d 1,5, 3,22, 3,29, 3,35, 3,43, 3,58, 3,73, 3,98, 4,07, 4,15, 4,25, 4,35, und ¹³C- Verschiebungen aufweisen bei ungefähr 31,6, 37,2, 51,1, 53,3, 54,0, 54,4, 61,5, 61,6, 64,1, 65,6, 158,3, 170,7 und 171,3.
In einer speziellsten Ausführungsform besitzt der Faktor die Struktur Ia oder ein Salz davon. Das Salz würde in der Lage sein, ein Bacillus-verwandtes Pestizid zu verstärken.

6.3. ZUSAMMENSETZUNGEN, DIE DEN FAKTOR ENTHALTEN

Der Faktor, der von den Mutanten der vorliegenden Erfindung erhalten wird, kann allein formuliert werden; mit einem Bacillus-verwandten Pestizid formuliert werden, welches wie oben definiert ein Bacillus-Stamm, -Spore, -Protein oder -Fragment oder eine andere Substanz davon ist, mit Wirksamkeit gegen Schädlinge, oder welche Schädlinge töten oder Pflanzen gegen einen Schädling schützen; mit einem chemischen Pestizid und/oder einen bei Insekten krankheitserregenden Virus und einem verträglichen Träger in einer pestiziden Zusammensetzung, d. h. zum Beispiel einer Suspension, einer Lösung, einer Emulsion, einem Bestäubungspulver, einem dispergierbaren Körnchen, einem benetzbaren Pulver, einem emulgierbaren Konzentrat, einem Aerosol oder imprägnierten Körnchen, formuliert werden. Beispiele für solche Bacillus-Stämme umfassen, sind aber nicht begrenzt auf, Bacillus thuringiensis Subsp. kurstaki (vertrieben als DIPELTM von Abbott Laboratories, Inc., JAVELINTM von Sandoz, BIOBOTTM von Novo Nordiks A/S, FORAYTM von Novo Nordisk A/S, BIOCOTTM von Novo Nordiks A/S, MVPTM von Mycogen, BACTOSPEINETM von Novo Nordiks A/S und THURICIDETM von Sandoz); Bacillus thuringiensis Subsp. aizawai (vertrieben als FLORBACTM von Novo Nordiks A/S und XENTARITM von Abbott haboratories, Inc.); Bacillus thuringiensis Subsp. tenebrionis, (vertrieben als NOVODORTM von Novo Nordisk A/S, TRIDENTTM von Sandoz, M-TRAKTM und M-ONETM von Mycogen und DITERRATM von Abbott Laboratories Inc.); Bacillus thuringiensis Subsp. israelensis (vertrieben entweder als BACTIMOSTM oder SKEETALTM von Novo Nordisk A/S, TEKNARTM von Sandoz und VECTOBACTM von Abbott Laboratories, Inc); Bacillus thuringiensis kurstaki/tenebrionis (vertrieben als FOILTM von Ecogen); Bacillus thuringiensis kurstaki/aizawai (vertrieben als CONDORTM von Ecogen und AGREETM von Ciba-Geigy); und Bacillus thuringiensis kurstaki/kurstaki (vertrieben als CUTLASSTM von Ecogen). Das Bacillus-verwandte Protein kann gewählt werden aus der Gruppe einschließlich, aber nicht darauf begrenzt auf, CryI, CryI, CryIII, CryIV, CryV und CryVI. Das chemische Pestizid kann zum Beispiel ein Insektenwachstumsregulator wie Diflubenzuron, ein Carbamat wie Thiodicarb und Methomyl, ein Organophosphat wie Chlorpyrifos, ein Pyrethroid wie Cypermethrin und Esfenvalerat, anorganisches Fluor wie Kryolit und ein Pyrrol sein. Das bei Insekten krankheitserregende Virus kann ein Baculovirus, z. B. Autographa california, ein Nuclear-Polyhedrosis-Virus (NPV), Syngrapha falcifera NPV, Cydia pomonella GV (Granulosis-Virus), Heliothis zea NPV, Lymantria dispar NPV, Orgyia pseudotsugata NPV, Spodoptera exigua NPV, Neodiprion lecontei NPV, Neodiprion sertifer NPV, Harrisina brillians NPV und Endopiza viteana Clemens NPV sein.
In Zusammensetzungen, die die Substanz und ein Bacillusverwandtes Pestizid umfassen, kann die Substanz vorhanden sein in der Menge von mindestens ungefähr 0,1 g/BIU oder 0,05 g Faktor pro g Bacillus delta-Endoxotin und Spore, wahlweise bis ungefähr 300 g/BIU oder 150 g Substanz pro g Bacillus delta- Endotoxin und Spore, vorzugsweise 2 g /BIU oder 1 g Substanz pro g Bacillus delta-Endotoxin und Spore. Wie hier definiert, ist "BIU" Billion International Units, wie durch Bioassay bestimmt wird. Der Bioassay vergleicht die Probe mit einem Standard- Bacillus-Bezugsmaterial unter Verwendung von Trichoplusia ni oder einem anderen Schädling als dem Standardprüfinsekt. Die Potenz wird bestimmt durch Dividieren des Bezugsstandard-LC&sub5;&sub0;, dann Multiplizieren mit der Bezugsstandardwirkungsstärke.
In einer anderen Ausführungsform kann die Zusammensetzung den Faktor in im Wesentlichen reiner Form umfassen, oder einen Überstand von Bacillus in trockener, konzentrierter oder flüssiger Form und einen pestizid verträglichen Träger umfassen, wofür Beispiele unten offenbart werden. Diese Zusammensetzung kann getrennt auf eine Pflanze, z. B. transgene Pflanzen, angewendet werden. Spezieller kann die Zusammensetzung auf eine Pflanze angewendet werden, die vorher ein Bacillus thuringiensis-Gen enthält und exprimiert. In einer anderen Ausführungsform kann die Zusammensetzung angewendet werden auf eine Pflanze, die vorher einer Bacillus thuringiensis- Zusammensetzung ausgesetzt wurde. In einer anderen Ausführungsform kann die Zusammensetzung angewendet werden auf andere Umgebungen eines Dipteren-Schädlings, z. B. Wasser oder Boden. Die Substanz ist in der Zusammensetzung vorhanden bei einer Konzentration von ungefähr 0,001% bis ungefähr 60% (M/M).
Die Zusammensetzung, die die Substanz und zusätzlich einen pestizid verträglichen Träger umfasst, zum Kontrollieren eines Schädlings kann auch verwendet werden, um die Resistenz eines Schädlings gegen ein Pestizid herabzusetzen. Alternativ kann die Zusammensetzung verwendet werden, um ein Bacillusverwandtes Pestizid zu verstärken. Die Zusammensetzung in einer Ausführungsform kann zur gleichen Zeit angewendet werden wie das Pestizid in einer Menge von mindestens ungefähr 2 g Substanz/BIU bis zu wahlweise ungefähr 300 g Substanz/BIU. In einer anderen Ausführungsform kann die Zusammensetzung bis zu ungefähr 24 Stunden nach dem Pestizid angewendet werden als ein Hilfsmittel, um die Wirksamkeit des restlichen Pestizids zu verlängern.
Derartige oben offenbarte Zusammensetzungen können erhalten werden durch die Zugabe von einer oberflächenaktiven Substanz, einem inerten Träger, einem Konservierungsmittel, einem Benetzungsmittel, einem Fressstimulans, einem Lockstoff, einem Einkapselmittel, einem Bindemittel, einem Emulgator, einem Trocknungsmittel, einem UV-Schutzmittel, einem Puffer, einem Flussmittel oder von einer anderen Komponente, um die Produkthandhabung und -anwendung für bestimmte Zielschädlinge zu erleichtern.
Geeignete oberflächenaktive Mittel schließen anorganische Verbindungen ein wie ein Carboxylat, zum Beispiel ein Metallcarboxylat einer langkettigen Fettsäure; ein N- Acylsarcosinat; Mono- oder Diester von Phosphorsäure mit Fettalkoholethoxylaten oder Salze derartiger Ester; Fettalkoholsulphate wie. Natriumdodecylsulphat, Natriumoctadecylsulphat oder Natriumcetylsulphat; ethoxylierte Fettalkoholsulphate; ethoxylierte Alkylphenolsulphate; Ligninsulphonate; Petroleumsulphonate; Alkylarylsulphonate wie Alkyl-benzolsulphonate oder Niederalkylnaphthalensulphonate, z. B. Butyl-Naphthalensulphonat; Salze oder sulphonierte Naphthalenformaldehydkondensate; Salze oder sulphonierte Phenolformaldehydkondensate; oder komplexere Sulphonate wie die Amidsulphonate, z. B. das sulphonierte Kondensationsprodukt von Ölsäure und N-Methyltaurin oder die Dialkylsulphosuccinate, z. B. das Natriumsulphonat oder das Dioctylsuccinat. Nicht-ionische Mittel umfassen Kondensationsprodukte von Fettsäureestern, Fettalkoholen, Fettsäureeamiden oder Fettalkyl- oder -alkenyl-substituierten Phenolen mit Ethylenoxid, Fettester von Polyalkoholether, z. B. Sorbitanfettsäureester, Kondensationsprodukte wie Ester mit Ethylenoxid, z. B. Polyoxyethylensorbitfettsäureester, Blockcopolymere von Ethylenoxid und Propylenoxid, Acetylenglykole wie 2,4,7,9-Tetraethyl-5-decyn-4,7-diol oder ethoxylierte Acetylenglykole. Beispiele für eine kationische oberflächenaktive Substanz umfassen zum Beispiel ein aliphatisches Mono-, Di- oder Polyamid als ein Acetat, Naphthenat oder Oleat; ein Sauerstoffhaltiges Amin wie ein Aminoxid von Polyoxyethylenalkylamin; ein Amid-verknüpftes Amin, hergestellt durch die Kondensation von einer Carbonsäure mit einem Di- oder Polyamin; oder ein quartäres Ammoniumsalz.
Beispiele für inerte Materialien umfassen anorganische Mineralien wie Kaolin, Glimmer, Gips, Düngemittel, Phyllosilicate, Carbonate, Sulfate oder Phosphate; organische Materialien wie Zucker, Stärke oder Cyclodextrine; oder botanische Materialien wie Holzprodukte, Kork, pulverisierte Maiskolben; Reisschalen, Erdnussschalen oder Walnussschalen.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in einer geeigneten Form für die direkte Anwendung sein, oder als ein Konzentrat oder eine primäre Zusammensetzung vorliegen, welche Verdünnung mit einer geeigneten Menge Wasser oder einem anderen Lösungsmittel vor der Anwendung erfordern. Die pestizide Konzentration wird variieren abhängig von der Natur der einzelnen Formulierung, spezieller, ob es sich um ein Konzentrat handelt oder ob sie direkt verwendet werden kann. Die Zusammensetzung enthält 1 bis 98% eines festen oder flüssigen inerten Trägers, und 0 bis 50%, vorzugsweise 0,1 bis 50% einer oberflächenaktiven Substanz. Diese Zusammensetzungen werden mit der ausgezeichneten Menge für das kommerzielle Produkt verabreicht werden, vorzugsweise ungefähr 0,01 Pfund (453,59 g) bis 5,0 Pfund pro Acre (4047 m²), wenn sie in trockener Form vorliegen, und mit ungefähr 0,01 Pint (0,47 l) bis 25 Pint pro Acre, wenn sie in flüssiger Form vorliegen.
In einer weiteren Ausführungsform kann das Bacillus thuringiensis-Kristall delta-Endotoxin und/oder der Faktor vor der Formulierung behandelt werden, um die pestizide Wirksamkeit zu verlängern, wenn es in der Umgebung eines Zielschädlings angewendet wird, so lange die Vorbehandlung nicht schädlich ist für das Kristall delta-Endotoxin oder die Substanz. Eine solche Behandlung kann durch chemische und/oder physikalische Mittel erfolgen, solange die Behandlung sich nicht schädlich auf die Eigenschaften der Zusammensetzung(en) auswirkt. Beispiele für chemische Reagenzien umfassen, sind aber nicht begrenzt auf, halogenierende Mittel; Aldehyde wie Formaldehyd und Glutaraldehyd; Infektionsschutzmittel wie Zephiranchlorid; Alkohole wie Isopropanol und Ethanol; und histologische Fixierungsmittel wie Bouin-Fixierungsmittel und Helly- Fixierungsmittel (siehe zum Beispiel Humason, Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman und Co., 1967).
Die Zusammensetzungen der Erfindung können direkt auf eine Pflanze angewendet werden, zum Beispiel durch Spritzen oder Zerstäuben zu der Zeit, wenn der Schädling begonnen hat, auf der Pflanze zu erscheinen, oder vor dem Erscheinen der Schädlinge als eine Schutzmaßnahme. Pflanzen, die innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung geschützt werden sollen, umfassen, sind aber nicht begrenzt auf, Zerealien (Weizen, Gerste, Roggen, Hafer, Reis, Sorghum und verwandte Körner), Rüben (Zuckerrüben und Futterrüben), Steinfrüchte, Kernfrüchte und weiche Früchte (Äpfel, Birnen, Pflaumen, Pfirsiche, Mandeln, Kirschen, Stachelbeeren, Himbeeren und Heidelbeeren), Leguminosen (Luzerne, Bohnen, Linsen, Erbsen, Sojabohnen), Ölpflanzen (Raps, Senf, Mohn, Oliven, Sonnenblumen, Kokosnuss, Rizinusölpflanzen, Kakaobohnen, Erdnüsse), Gurkenpflanzen (Gurken, Eierkürbisse, Melonen, Faserpflanzen (Baumwolle, Leinen, Hanf, Jute), Zitrusfrüchte (Orangen, Zitronen, Grapefruit, Mandarinen), Gemüse (Spinat, Salat, Spargel, Kohlpflanzen und andere Kohlarten, Karotten, Zwiebeln, Tomaten, Kartoffeln), Lauraceae (Avocados, Zimt, Kampher), Laubbäume und Koniferen (Lindenbäume, Eibenbäume, Eichenbäume, Erlen, Pappeln, Birkenbäume, Tannen und Fichten, Lärchen, Pinien), oder Pflanzen wie Mais, Rasenpflanzen, Tabak, Nüsse, Kaffee, Zuckerrohr, Tee, Weinreben, Hopfen, Bananen und natürliche Gummipflanzen sowie Zierpflanzen. Die Zusammensetzung kann ausgebracht werden durch Blatt-, Furchen, Flächenkörnchen-, "Beiseitelegen-" oder Bodenberieselungsapplikation. Es ist allgemein wichtig, eine gute Kontrolle von Schädlingen in den Frühstadien des Pflanzenwachstums zu erhalten, da das die Zeit ist, zu der die Pflanze am schwersten beschädigt werden kann. Das Spritzmittel oder Bestäubungsmittel kann praktischerweise ein anderes Pestizid enthalten, falls dies für notwendig gehalten wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zusammensetzung der Erfindung direkt auf die Pflanze ausgebracht.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können außerdem direkt auf Teiche, Seen, Fließgewässer, Flüsse, stehende Gewässer und andere Bereiche ausgebracht werden, die einem Befall durch Dipteren-Schädlinge, insbesondere Schädlinge von Bedeutung für die öffentliche Gesundheit, unterliegen. Die Zusammensetzung kann ausgebracht werden durch Spritzen, Bestäuben, Besprenkeln oder dergleichen.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können wirksam sein gegen Insektenschädlinge der Ordnung Lepidoptera, z. B. Achroia grisella, Acleris gloverana, Acleris variana, Adoxophyes orana, Agrotis ipsilon, Alabama argillacea, Alsophila pometaria, Amyelois transitella, Anagasta kuehniella, Anarsia lineatella, Anisota senatoria, Antheraea pernyi, Anticarsia gemmatalis, Archips sp., Argyrotaenia sp., Athetis mindara, Bombyx mori, Bucculatrix thurberiella, Cadra cautella, Choristoneura sp., Cochylis hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia latiferreanus, Cydia pomonella, Datana integerrima, Dendrolimus sibericus, Desmis funeralis, Diaphania hyalinada, Diaphania nitidalis, Diatraea grandiosellar Diatraea saccharalis, Ennomos subsignaria, Eoreuma loftini, Ephestia elutella, Erannis tiliaria, Estigmene acrea, Eulia salubricola, Eupoecilia ambiguella, Euproctis chrysorrhoea, Euxoa messoria, Galleria mellonella, Grapholita molesta, Harrisina americana, Helicoverpa subflexa, Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Hemileuca oliviae, Homoeosoma electellum, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Lambdina fiscellaria fiscellaria, Lambdina fiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxostege sticticalis, Lymantria dispar, Macalla thyrsisalis, Malacosoma sp., Mamestra brassicae, Mamestra configurata, Manduca quinquemaculata, Manduca sexta, Maruca testulalis, Melanchra picta, Operophtera brumata, Orgyia sp., Ostrinia nubilalis, Paleacrita vernata, Papilio cresphontes, Pectinophora gossypiella, Phryganidia californica, Phyllonorycter blancardella, Pieris napi, Plans rapae, Plathypena scabra, Platynota flouendana, Platynota sultana, Platyptilia carduidactyla, Plodia interpunctella, Plutella xylostella, Pontia protodice, Pseudaletia unipuncta., Pseudoplusia includens, Sabulodes aegrotata, Schizura concinna, Sitotroga cerealella, Spilonota ocellana, Spodoptera sp., Thaurnstopoea pityocampa, Tineola bissallialla, Trichoplusia ni, Udea rubigalis, Xylomyges curialis, Yponomeuta padella; Ordnung Diptera, z. B. Aedes sp., Andes vittatus, Anastrepha ludens, Anastrepha suspensa, Anopheles barberi, Anopheles quadrimaculatus, Armigeres subalbatus, Calliphora stygian, Calliphora vicina, Ceratitis capitata, Chironomus tentans, Chrysomya rufifacies, Cochliomyia macellaria, Culex sp.., Culiseta inornata, Dacus oleae, Delia antigua, Delia platura, Delia radicum, Drosophila melanogaster, Eupeodes corollae, Glossina austeni, Glossina brevipalpis, Glossina fuscipes, Glossina morsitans centralis, Glossina morsitans morsitans, Glossina moristans submorsitans, Glossina pallidipes, Glossina palpalis gambiensis, Glossina palpalis palpalis, Glossina tachinoides, Haemagogus equinus, Haematobia irritans, Hypoderma bovis, Hypoderma lineatum, Leucopis ninae, Lucilia cuprina, Lucilia sericata, Lutzomyia longlpaipis, Lutzomyia shannoni, Lycoriella mali, Mayetiola destructor, Musca autumnalis, Musca domestica, Neobellieria sp., Nephrotoma suturalis, Ophyra aenescens, Phaenicia sericata, Phlebotomus sp., Phormia regina, Sabethes cyaneus, Sarcophaga bullata, Scatophaga stercoraria, Stomoxys calcitrans, Toxorhynchites amboinensis, Tripteroldes bambusa. Jedoch können die Zusammensetzungen der Erfindung auch wirksam sein gegen Insektenschädlinge der Ordnung Coleoptera, z. B. Leptinotarsa sp., Acanthoscelides obtectus, Callosobruchus chinensis, Epilachna varivestis, Pyrrhalta luteola, Cylas formicarius elegantulus, Listronotus oregonensis, Sitophilus sp., Cyclocephala borealis, Cyclocephala immaculata, Macrodactylus subspinosus, Popillia japonica, Rhizotrogus majalis, Alphitobius diaperinus, Palorus ratzeburgi, Tenebrio molitor, Tenebrio obscurus, Tribolium castaneum, Tribolium confusum, Tribolius destructor; Acari, z. B. Oligonychus pratensis, Panonychus ulmi, Tetranychus urticae; Hymenoptera, z. B. Iridomyrmex humilis, Solenopsis invicta; Isoptera, z. B. Reticulitermes hesperus, Reticulitermes flavipes, Coptotermes formosanus, Zootermopsis angusticollis, Neotermes connexus, Incisitermes minor, Incisitermes immigrans; Siphonaptera, z. B. Ceratophyllus gallinae, Ceracophyllus niger, Nosopsyllus fasciatus, Leptopsylla segnis, Ctenocephalides canis, Ctenocephalides felis, Echicnophaga gallinacea, Pulex irritans, Xenopsylla cheopis, Xenopsylla vexabilis, Tunga penetrans; und Tylenchida, z. B. Melodidogyne incognita, Pratylenchus penetrans.
Die folgenden Beispiele werden präsentiert zur Veranschaulichung, nicht zur Begrenzung.

7. BEISPIEL: CHARAKTERISIERUNG VON Ia

Wie hierin ausführlich angegeben, wird Ia gesammelt und gereinigt. Die Charakterisierung von Ia wird unten ausführlich beschrieben.

7.1. SAMMLUNG UND REINIGUNG VON Ia

B. thuriengiensis Subsp. kurstaki-Stamm EMCC 0086 (hinterlegt bei der NRRL als B-21147) wird 72 Stunden lang fermentiert bei 30ºC in einem Medium, das sich aus einer Kohlenstoffquelle, wie Stärke, hydrolysierte Stärke oder Glucose, und einer Stickstoffquelle, wie Protein, hydrolysiertes Protein oder Maisquellwasser, zusammensetzt. Die Produktion von Ia wird nach 13 Stunden in der Fermentation detektiert. Für die maximale Aktivität wird herausgefunden, bei ungefähr 30 Stunden zu sein.
Der Überstand von einer B. thuriengiensis Subsp. kurstaki-Fermentation wird gesammelt durch Zentrifugation, und wird dann geklärt durch Ultrafiltration durch eine 30-kDa-MW-CO- Membran unter Verwendung eines Rhone Poulenc UF-Systems. Die 30- kDa-Filtration entfernte jedes restliche Zellbruchstück, jedes Kristall delta-Endotoxin, alle Sporen und jedes lösliche Protein größer als eine relative Molekülmasse von 30 kDa. Das Permeat wird um das 10-fache durch Eindampfung eingeengt. Das Permeat wird zentrifugiert und dann 0,2-u-filtriert, um weiter unlösliche Teile aus der Brühe zu entfernen, wodurch eine klare Brühe zurückbleibt, die Ia enthält.
Die Reinigung von Ia bis zur Homogenität wird erreicht unter Verwendung eines mehrstufigen Reinigungsverfahrens, das schematisch in Fig. 1 dargestellt ist. In Zusammenhang mit dem Sammelprotokoll, das oben ausgeführt ist, ging die Reinigung weiter mit einem 5-kDa-Ultrafiltrationsschritt. Das Permeat von der 5-kDa-Ultrafiltration wird auf einem Sulfopropyl(SP)- Kationenaustauscherharz adsorbiert und mit einer Ammoniumacetatlösung eluiert. Die Verbindung wird dann auf ungefähr das 30-fache durch Lyophilisierung eingeengt, und das Salz und andere Inhaltsstoffe werden entfernt durch eine BioRad P2-Ausschlusssäule. Der Pool von der P2-Säule wird über eine Hochauflösungs-SP-HPLC-Kationenaustauschersäule laufen gelassen, was eine homogene Verbindung erbringt. Das kontaminierende Salz wird entfernt durch wiederholte Lyophilisierung.
Die Wirksamkeit wird überwacht durch einen Spodoptera exigua-Mikrobioassay, und die Reinheit wird bestimmt durch Kapillarelektrophorese. Die Probe bestehend aus 50 ul Ia und 50 ul CryIA(c)-Protein (15 ug/ml), gereinigt aus BIOBITTM FC (100 ul), wird auf einzelne Vertiefungen einer Gallertschale aufgebracht, die 500 ul fest gewordene künstliche Insektennahrung enthält. Die Schalen, die die verschiedenen Proben enthalten, werden luftgetrocknet. Zwei bis vier Spodoptera exigua des 2. oder frühen 3. Larvenstadiums werden zu den Vertiefungen, die die getrocknete Probe enthalten, hinzugegeben. Die Vertiefungen werden mit gelöcherter Mylarfolie abgedichtet und 2-3 Tage lang bei 30ºC inkubiert. Der Grad der Verkrüppelung und der prozentuale Anteil der Mortalität werden dann aufgezeichnet. Typischerweise werden 5 Replikatvertiefungen für jede Probe durchgeführt.

7.2. STRUKTURAUFKLÄRUNG

Für die wirksame Verbindung wird herausgefunden, dass sie wasserlöslich ist, aber nicht löslich ist in organischen Lösungsmitteln. Sie ist positiv geladen und wird mit Nynhydrin umgesetzt, wie durch Silicadünnschichtchromatographie nachgewiesen wird. ¹³C- und Proton-NMR von der Verbindung sind in Fig. 2 bzw. 3 dargestellt. ¹³C-NMR-Experimente deckten das Vorhandensein von 13 Kohlenstoffatomen auf (bezogen auf 3-[Trimethylsilylpropansäure). Ein DEPT-Experiment stellte fest, dass es drei quartäre Kohlenstoffatome (C), sieben Methine (CH), drei Methylene (CH&sub2;) kund keine Methylgruppen (CH&sub3;) gab. Unter Verwendung von Protonenkopplungsexperimenten wie 1-D-Entkopplung und COSY wird ein großes Spinsystem identifiziert, das 8 Kohlenstoffatome enthält. Zusätzlich ist ein kleineres Spinsystem vorhanden, das aus zwei Kohlenstoffatome besteht. Ein Kohlenstoff-Proton-Korrelations-Experiment (HMBC) erlaubte die Zuordnung von jeder Protonenresonanz in dem Molekül zu ihrem gebundenen Kohlenstoff.
Behandlung der wirksamen Verbindung (13 mg) mit Essigsäureanhydrid in Pyridin führte zu der Bildung eines acetylierten Derivats, welches viel weniger polar ist. Dieses Derivat wird durch HPLC gereinigt, um 3 mg reines acetyliertes Derivat zu ergeben. Massenspektroskopieanalyse zeigte, dass das.
Derivat 7 Acetate und ein relatives Molekülgewicht von 690 besitzt, was ein relatives Molekülgewicht von 396 für die wirksame Verbindung ergibt und anzeigt, dass eine gerade Zahl von Stickstoffatomen vorhanden ist. Es werden außerdem Fragmente, die 6 Acetate und 5 Acetat e enthalten, detektiert. Hochauflösungsdaten für 5- und 6-Acetat-Tochterionen sind 645,2594 (6 Acetate) und 607,2519 (5 Acetate), was auf die folgende Molekülformel für Ia hinweist: C&sub1;&sub3;H&sub2;&sub8;N&sub6;O&sub8;.
Behandlung der wirksamen Verbindung (13 mg) mit 6 N HCl ergab ein Derivat, welches Ninhydrin-positiv ist. Diese Ergebnisse zeigen das Vorhandensein von Amidbindungen an. Das Derivat hat den gleiche Rf-Wert, wie durch Dünnschichtchromatographie als 2,3-Diaminopropansäure bestimmt wurde. Diese Ergebnisse zusammen mit den NMR-Daten legen das Vorhandensein von 2,3-Diaminopropansäure nahe.
Ein anderes Verfahren, das verwendet wurde, um Ia zu analysieren, ist NOE (Nuclear Overhauser Effect, Kern- Overhauser-Effekt), was die Nähe von Protonen zueinander über den Abstand detektieren kann. NOE wird ausgeführt an einem acetyliertem Derivat von Ia. In einem zweidimensionalen NOE- Experiment (NOESY) werden NOEs beobachtet zwischen einem N-H- Proton bei 8,06 ppm und dem 5,17-Proton (Fig. 4).
Die folgende Struktur ist für Ia aufgeklärt worden:
Sie kann als ein Ureidoamid klassifiziert werden. Zu den Bestandteilen gehören 2 Amide, ein Harnstoff, zwei Aminogruppen und fünf Hydroxylgruppen. Sie enthält sieben Chiralitätszentren.

7.3. EIGENSCHAFTEN VON Ia

Für das isolierte Ia wurde herausgefunden, dass es die Wirksamkeit von Bacillus thuringiensis Subsp. kurstaki- und Bacillus thuringiensis Subsp. aizawai-Kristall-delta-Endotoxinpestiziden Proteinen gegen Spodoptera exigua verstärkt, ungeachtet der Form der pestiziden Proteine. Die pestizide Wirksamkeit von formuliertem B.t.k., isolierten Kristallen, mit voller Länge (130 kDa relative Molekülmasse) oder gestutzten CryIA-Proteinen (~65 kDa relative Molekülmasse) wird jeweils verstärkt. Die Wirksamkeit von CryII- und CryIC-Einschlüssen wird ebenfalls verstärkt. Es wurde auch herausgefunden, dass es die Wirksamkeit der einzelnen gestutzten CryIA(a)-, -(b)- und -(c)-Proteine verstärkt. Es wurde nicht festgestellt, dass die Inkubationszeit von Ia mit dem Cry-Protein für die Biowirksamkeit kritisch ist. Jedoch ist Ia allein unwirksam. Für den Grad der Verstärkung wurde herausgefunden, dass er 100-200- fach für die gestutzten CryIA-Proteine, CryII- und CryIC- Einschlüsse und ungefähr 320-fach mit CryIA(c) in voller Länge ist (siehe Tabelle I bzw. II). Spezieller für das Protein voller Länge produzieren 0,75 ug/ml CryIA(c) die gleiche Insektenmortalität/Verkrüppelungsbewertung, wenn Ia als 240 ug/ml CryIA(c) allein eingeschlossen ist. In dem Fall des gestutzten CryIA(c) ergab ein OD&sub2;&sub8;&sub0; von 0,0006 die gleiche Verkrüppelungsbewertung in Kombination mit Ia wie die gleiche Probe CryIA(c), die allein mit einem OD&sub2;&sub8;&sub0; von 0,075 getestet wurde. CryII-Einschlüsse mit einer Konzentration von 0,6 ug/ml ergaben die gleiche Verkrüppelungsbewertung und ähnliche Mortalität in Kombination mit Ia wie CryII-Protein allein bei 75 ug/ml, eine 125-fache Verstärkung. CryIC-Einschlüsse bei 0,3 ug/ml mit der Zugabe von Ia ergaben ähnliche Mortalität und ähnliche Verkrüppelungsbewertung wie 75 ug/ml des CryIC-Proteins allein, was einen 250-fachen Verstärkungsgrad widerspiegelt. Die Konzentration von CryIA-Protein, die Verkrüppelung produzierte, erbrachte Mortalität bei Zugabe von Ia.
Für Ia wurde herausgefunden, dass es beim Kochen 5 Minuten lang stabil ist, aber alle Wirksamkeit verliert bei der Behandlung im Autoklaven (> 190C). Weiter ist es mindestens 10 Stunden lang stabil, wenn es direktem Sonnenlicht ausgesetzt wird. Ia ist 3 Tage lang bei pH 2 stabil, aber instabil bei pH 12. Es wurde herausgefunden, dass es alle Wirksamkeit verliert, wenn es gegenüber Periodsäure oder konzentrierter HCl ausgesetzt wird. TABELLE I VERSTÄRKUNGSEFFEKTE VON Ia MIT GEREINIGTEM GESTUTZTEN Bt-PROTEIN
* Mortalität = Anzahl toter Insekten/Anzahl Gesamtinsekten nach 2 Tagen
** Verkrüppelungsbewertung ist definiert durch die Durchschnittsgröße der lebendigen Insektenlarve am Ende des Bioassays: 4,0 = unbehandelte Kontrollprobe, 3,0 = 75% der Größe der unbehandelten Kontrollprobe, 2,0 = 50% der Größe der unbehandelten Kontrollprobe, 1,0 = 25% der Größe der unbehandelten Kontrollprobe; 0,0 = kein Wachstum oder Größe unverändert seit Beginn des Experimentes. TABELLE II VERSTÄRKUNGSEFFEKTE VON Ia MIT Bt-PROTEIN
* Mortalität = Anzahl toter Insekten/Anzahl Gesamtinsekten nach 2 Tagen
** Verkrüppelungsbewertung ist definiert durch die Durchschnittsgröße der lebendigen Insektenlarve am Ende des Bioassays: 4,0 = unbehandelte Kontrollprobe, 3,0 = 75% der Größe der unbehandelten Kontrollprobe, 2,0 = 50% der Größe der unbehandelten Kontrollprobe, 1,0-25% der Größe der unbehandelten Kontrollprobe; 0,0 = kein Wachstum oder Größe unverändert seit Beginn des Experimentes.

7.4. BEWERTUNG VON ANDEREN SUBSPEZIES VON Bacillus thuringiensis UND ANDEREN SPEZIES VON Bacilli

Mehrere Bacillus-Spezies werden bewertet für die Produktion von Ia. Die Stämme werden 72 Stunden bei 30ºC in einem Medium fermentiert, das zusammengesetzt ist aus einer Kohlenstoffquelle, wie Stärke, hydrolysierte Stärke oder Glucose, und einer Stickstoffquelle, wie Protein, hydrolysiertes Protein oder Maisquellwasser. Die Überstände werden geprüft auf Ia-Produktion unter Verwendung des Spodoptera exigua- Mikrobioassays, wie oben beschrieben. Für B. thuringiensis Subsp. aizawai-Stamm EMCC 0087 (hinterlegt bei der NRRL als NRRL B-21148) und B. thuringiensis Subst. galleriae (hinterlegt bei der NRRL) wurde herausgefunden, dass sie Ia in ungefähr der gleichen Konzentration wie B. thuringiensis Subst. kurstaki produzieren.
Ia wird auch produziert in B. subtilis, B. cereus, B.t. Subsp. alesti, B.t. Subsp. canadiensis, B.t. Subsp. darmstadiensis, B.t. Subsp. dendrolimus, B.t. Subsp. entomocidus, B.t. Subsp. finitimus, B.t. Subsp. israelensis, B.t. Subsp. kenyae, B.t. Subsp. morrisoni, B.t. Subsp. subtoxicus, B.t. Subsp. tenebrionis, B.t. Subsp. thuringiensis, und B.t. Subsp. toumanofft, B. cereus, B. subtilis und B. thuringiensis Subsp. kurstaki cry- spo-Mutant, wie durch Kapillarelektrophorese bestimmt.
Ausdrücklicher wird ein Beckmann P/ACE Capillary Electrophoresis System, ausgestattet mit einer unbeschichteten 50 um · 57 cm-Kapillare, 0,2 M Phosphatpuffer pH 6,8, Spannung bei 15 kV, und Detektion bei 200 nm, für die Quantifizierung des Gehaltes von Ia verwendet. Probenvolumen sind 20 nl mit einer Laufzeit von 25 Minuten.
Eine Standardkurve wird erzeugt unter Verwendung von gereinigtem Ia als dem Standard bei Gehalten von 1,25 mg/ml, 0,625 mg/ml, 0,3125 mg/ml, 0,156 mg/ml und 0,078 mg/ml. Eine lineare Kalibrierkurve wird erzeugt. Die resultierende Gleichung y = mx + b wird verwendet, um die Konzentration von Ia in jeder Probe zu liefern.
Vor jedem Durchlauf wird die Kapillare mit Laufpuffer (0,2 M Phosphat, pH 6,8) drei Minuten lang gespült. Nach jedem 25-Minuten-Lauf wird die Kapillare mit 1 N NaOH 1 Minute, gefiltertem HPLC-Wasser 1 Minute, 0,5 M Phosphorsäure 3 Minuten und gefiltertem HPLC-Wasser 1 Minute lang gespült. Die Fläche unter jedem Peak wird integriert, und die Peakfläche wird bestimmt, und eine Endkonzentration wird aus der Standardkurve berechnet.

7.5. BEWERTUNG VON B.t.-PRODUKTEN

Die Menge Ia, die in verschiedenen kommerziell erhältlichen B.t.-Produkten vorhanden ist, wird bestimmt durch Kapillarelektrophorese, die in Abschnitt 6.4 oben beschrieben ist. BACTOSPEINETM, JAVELINTM, NOVODORTM, SPHERIMOSTM, BACTIMOSTM, FORAYTM FLORBACTM und BIOBITTM werden erhalten von Novo Nordisk A/S. XENTARITM und DIPELTM werden erhalten von Abbott Laboratories. AGREETM wird erhalten von Ciba-Geigy; MVPTM wird erhalten von Mycogen, und CUTLASSTM wird erhalten von Ecogen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle III unten dargestellt und weisen darauf hin, dass Ia in verschiedenen Mengen im Bereich von weniger als 0,001 g Ia/BIU bis 0,071 g Ia/BIU vorhanden ist. TABELLE III Ia IN Bacillus thuringiensis-PRODUKTEN

7.6. NAHRUNGSEINLAGERUNGS-BIOASSAYS

B.t.k.-Wirksamkeit wird bestimmt durch einen künstliche Nahrungseinlagerungs-Bioassay unter Verwendung von Spodoptea exigua-Larven im dritten Larvenstadium, Helicoverpa zea-Larven im zweiten Larvenstadium, Spodoptera frugiperda-Larven im dritten Larvenstadium, Heliothis virescens-Larven im zweiten Larvenstadium, Trichoplusia ni-Larven im dritten Larvenstadium, Pseudoplusia includens-Larven im dritten Larvenstadium, Plutella xylostella-Larven im dritten Larvenstadium, Spodoptera littoralis im dritten Larvenstadium und Mamestra brassicae- Larven im dritten Larvenstadium.
Um den Grad der Verstärkung durch Zugabe von Ia zu B.t.- Produkten zu bestimmen und den Bereich von Insekten festzustellen, die betroffen sind, werden Nahrungseinlagerungs- Bioassays durchgeführt. In den Experimenten mit hohen Konzentrationen von Ia gegen Spodoptea exigua (7,4-23,7 g Ia/BIU) wird gereinigtes Ia (70% wirksamer Bestandteil, 30% Acetatgegenion) verwendet, um BIOBITTM FC (FC steht für fließfähiges Konzentrat) zu verstärken. Die übrigen Daten, die in Tabelle IV dargestellt sind, zeigen die Verstärkung von BIOBITTM HPWP (high potency wettable powder, Hochwirksamkeitssuspensionsspritzmittel) mit Ia (0, 658% wirksamer Bestandteil). S. littoralis und M. brassicae werden geprüft unter Verwendung von FLORBACTM HPWP und Ia.
Die verschiedenen B.t.-Produkte werden gewogen und Ia wird hinzugegeben, um 0,1 bis 237 g Ia/BIU zu ergeben. Das Volumen wird mit 0,1% TweenTM eingestellt. Die Proben werden 1 Minute lang beschallt und dann auf Endvolumen verdünnt. Reinproben (ohne Ia) und Bezugssubstanzen werden ebenfalls vorbereitet. Bezugssubstanzen umfassen B.t.k. HD-1-S-1980 (erhalten von der NRRL), welchem eine Wirkungsstärke von 16.000 internationalen Einheiten (IU) pro Milligramm zugewiesen ist, und JAVELINTM WG, welchem eine Wirkungsstärke von 53.000 Spodoptera-Einheiten/mg (SU) zugewiesen ist.
Künstliche Standardnahrung, zusammengesetzt aus Wasser, Agar, Zucker, Casein, Weizenkeimen, Methylparaben, Sorbinsäure, Leinöl, Cellulose, Salzen und Vitaminen, wird vorbereitet in einem beheizten 20-1-Kessel. Das liefert genug Nahrung, um 10 bis 12 Proben mit sieben unterschiedlichen Konzentrationen von jeder Prüfsubstanz zu testen. Die B.t.-Lösungen werden reihenverdünnt, um 16-ml-Aliquote zu ergeben. Jeder aliquote Teil wird zu 184 g schmelzflüssiger Nahrung hinzugegeben. Die Mischung wird anschließend homogenisiert und dann in eine Kunststoffschale geschüttet, die 40 einzelne Zellen enthält. Drei Kontrollschalen werden für jede Nahrungscharge vorbereitet. Sobald die Nahrung abgekühlt ist und festgeworden ist, wird ein Insekt mit einem bekannten Alter (2.-3. Larvenstadium) zu jeder Zelle hinzugegeben, und die Schalen werden mit einem perforierten Bogen durchsichtiger Mylarfolie bedeckt. Die Schalen werden auf Gestellen platziert und vier Tage lang bei 28ºC und 65% relativer Luftfeuchtigkeit inkubiert.
Nach vier Tagen wird die Insektenmortalität bewertet. Jede Schale erhält einen kräftigen Schlag gegen eine Tischoberfläche, und Larven, die sich nicht bewegen, werden als tot gezählt. Die Mortalität in Prozent wird berechnet, und die Daten werden durch parallele Probitanalyse analyisiert. Werte für LC&sub5;&sub0;, LC&sub9;&sub0;, die Steigung der Regressionskurven, der Variationskoeffizient und die Wirkungsstärken werden bestimmt. Proben werden mindestens 3 Mal ausgeführt oder solange, bis drei Wirkungsstärken innerhalb von 20% eines berechneten Mittelwertes für jede Probe liegen. Um die Zunahme der Wirksamkeit zu berechnen, die mit jeder Konzentration von Ia verbunden ist, wird der LC&sub5;&sub0; der B.t./Ia-Probe korrigiert, um die Menge an B.t. in der Probe widerzuspiegeln. Die LC&sub5;&sub0;-Werte der paarweisen Reinproben werden dividiert durch die korrigierten LC&sub5;&sub0;-Werte, um die Mehrfachreduktion von LC&sub5;&sub0; zu ergeben, die mit Ia verbunden ist.
Das folgende Verfahren wird verwendet, um Lobesia bothrana zu untersuchen. Weintrauben, die von Lobesia bothrana befallen sind, werden in einem ungespritzten Feld gesammelt und Larven entfernt. Eine Verdünnungsreihe von Ia (250 ug/ml, 500 ug/ml und 1000 ug/ml) wird in Wasser hergestellt. Eine Larve wird in die Mitte der Petrischale gelegt. Falls beobachtet wird, dass die Larve trinkt, wird sie in eine Petrischale mit frisch geschnittenen Traubenbeeren gebracht. Die Larven werden bei 22ºC 3-4 Tage lang aufbewahrt.
Wie in Tabelle IV gezeigt, werden signifikante Reduktionen der LC&sub5;&sub0;-Werte für alle Spezies beobachtet. TABELLE IV NAHRUNGSEINLAGERUNGS-BIOASSAYS
Die Verstärkung von verschiedenen Produkten an Spodoptera exigua durch Ia wird bestimmt unter Verwendung von Nahrungseinlagerungs-Bioassays, die oben beschrieben sind.
Mengen von zugesetztem Ia/BIU Produkt sind in Tabelle V unten dargestellt. Eine Ia/B.t.-Produktmischung wird in eine Agarbasierte Weizenkeimcaseinnahrung eingelagert. Die Insekten werden vier Tage lang auf die Nahrung gesetzt und bei 28ºC gehalten. Mortalität wird aufgezeichnet und analyisiert unter Verwendung von Probitanalyse. LC&sub5;&sub0;, LC&sub9;&sub0; und Wirkungsstärke werden berechnet aus passendem Produkt, das kein Ia enthält. Die Ergebnisse, die in Tabelle V gezeigt werden, weisen darauf hin, dass Ia verschiedene B.t.k. und B.t.a.-Produkte verstärkt, die von verschiedenen Quellen erhalten wurden. Die B.t.-Stämme, die in diesen Produkten enthalten waren, sind in Abschnitt 5.2 oben beschrieben. TABELLE V Verstärkung von B.t.-Produkten an Spodoptera exigua

7.7. BLATT-BIOASSAYS

Blatt-Bioassays werden durchgeführt mit Spodoptera exigua-Larven im zweiten Larvenstadlum an Broccolipflanzen unter Verwendung von BIOBITTM FC und Ia. Das Verhältnis von Ia zu BIOBITTM FC entspricht 2 g Ia/BIU BIOBITTM FC. Die Behandlungen werden auf Broccolipflanzen über ein Spurspritzgerät in einem Trägervolumen von 20 Gallonen pro Acre ausgebracht. Blätter werden von den Pflanzen entfernt, nachdem der Spritzmittelniederschlag trocknen geworden ist, und mit Spodoptera exigua-Larven im zweiten Larvenstadium verseucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI, unten, dargestellt. 100% Mortalität wird beobachtet bei einer Menge von 8,7 BIU/Hektar BIOBITTM FC + Ia, während BIOBITTM FC allein 92% der Larven bei 58,8 BIU/Hektar und 8% bei 17,6 BIU/Hektar tötete. Behandelte Pflanzen werden auch acht Stunden lang in direktes Sonnenlicht gelegt, wonach Blätter entfernt und verseucht werden. Nach acht Stunden im Sonnenlicht ergab BIOBITTM FC allein bei 58,8 BIU/Hektar 27% Mortalilät, während BIOBITTM FC + Ia 100% Mortalilät bei 8,7 BIU/Hektar ergab.
Ein Blattassay, der mit Larven des frühen vierten Larvenstadiums durchgeführt wurde, wies BIOBITTM FC allein mit 75% Mortalilät bei 52 BIU/Hektar auf, und BIOBITTM FC (FC ist fließfähiges Konzentrat) + Ia ergab 100% Mortalilät bei 13 BIU/Hektar. TABELLE VI BLATT-BIOASSAYS

7.8. FELDVERSUCHE

Feldversuche an Garbonzobohnen (Spodoptera exigua) zeigten, dass BIOBITTM FC allein bei 70 BIU/Hektar 51% Kontrolle ergaben, während 2 g Ia/BIU BIOBITTM FC bei 40 BIU/Hektar 89% Kontrolle lieferten (relativ zu keiner Behandlung). JAVELINTM WG bei 45 BIU/Hektar ergab 51% Kontrolle.
Feldversuche an Zuckermais (Spodoptera frugiperda) zeigten, dass bei 39,5 BIU/Hektar 2 g Ia/BIU BIOBITTM FC 84% Kontrolle lieferten.

7.9. RESISTENZVERHÄLTNISSE

Kolonien von empfindlichen und restistenten Plutella xylostella werden durch Bioassay getestet. Resistente Motten sind feldgesammelte Proben aus Florida, die B.t.-Resistenz im Anschluss an eine intensive Aussetzung gegenüber JAVELINTM WG entwickelt haben. BIOBITTM HPWP mit Ia wird analysiert unter Verwendung eines Blattspitzen-Bioassays. Resistenz gegen JAVELINTM und XENTARITM wird ohne Ia getestet. Kohlblattscheiben mit sechs cm Durchmesser werden 10 Sekunden lang in eine von acht unterschiedlichen Konzentrationen von B.t.-Produkten oder B.t./Ia-Formulierungen eingetaucht. Die Konzentrationen erstrecken sich von 1 bis 1000 ppm. Die Blattscheiben werden zwei Stunden an der Luft trocknen gelassen und in Kunststoffpetrischalen mit Larven im zweiten Larvenstadium (0,2 bis 0,4 mg) gelegt. Fünfundzwanzig Insekten/Dosis/Tag werden wiederholt, um 50 Insekten/Dosis zu ergeben. Nach 72 Stunden bei 27ºC wird die Mortalität aufgezeichnet. Dosismortalitätsregression wird analysiert durch Probitanalyse. Resistenzverhältnisse werden berechnet durch Dividieren der LC&sub5;&sub0;- und LC&sub9;&sub0;-Werte der empfindlichen Motten. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII dargestellt und weisen darauf hin, dass das BIOBITTM HPWP mit 2 g Ia/BIU und 4 g Ia/BIU verstärkt wird. Ausdrücklicher gibt es ist mit 4 g Ia/BIU eine 2-fache Minderung im LC&sub5;&sub0;-Resistenzverhältnis und eine 10-fache Minderung im LC&sub9;&sub0;- Resistenzverhältnis. TABELLE VII Resistenzverhältnisse für Plutella xylostella (B.t.k.-Resistent)

7.10. MUTANTEN

7.10.1. Stamm

Die Stämme Bacillus thuringiensis Subsp. kurstaki EMCC 0086 (NRRL B-21147), Septoria nodorum (A04119) und Alternaria alternata (Stamm 6, IM-SMP) werden verwendet.

7.10.2. Pilzwachtumshemmtest

Mutanten des Bacillus thuringiensis Subsp. kurstaki- Stamms, welche den Faktor produzieren, werden identifiziert unter Verwendung von Pilzagarplatten von Septoria nodorum und Alternaria alternata. Der Faktor hemmt das Wachstum beider Pilze.
Die zwei Pilze werden aufgezogen auf PDA(potato dextrose agar, Kartoffeldextroseagar)-Platten bei 26ºC 10-14 Tage lang, bis genügend Sporenbildung erhalten wird. Alternaria alternata wird inkubiert im Wechsel von UV-Licht und Dunkelheit (jeweils 12 Stunden). Die Sporen werden von den Platten entfernt und in sterilem Wasser suspendiert. Septoria nodorum-Sporen werden durch ein steriles G1-Filter filtriert. Die Alternaria alternata-Sporenkonzentration wird auf ungefähr 2 · 10&sup5; pro ml, und die Septoria nodorum-Sporenkonzentration wird auf ungefähr 2 · 10&sup6; pro ml unter Verwendung eines Burker-Turk- oder Fuchs- Rosenthal-Zählers eingestellt. Proben von 1,5 ml der Sporensuspension werden dann mit 1,5 ml sterilem 40%igem Glycerol in Wasser gemischt, 1 Tag lang eingefroren bei -20ºC und danach bei -80ºC bis zur Verwendung aufbewahrt.
Testplatten für den Faktor werden hergestellt durch Mischen einer 1,5-ml-Sporenprobe (wie oben beschrieben) bei 46ºC mit 115 ml antibiotischem Agarmedium Nr. 2 (25,5 g pro Liter), das Streptomycin bei einer Endkonzentration von 100 ug pro ml umfasst, und Überführen der Mischung auf sterile Kunststoffschalen (Nung Nr. 101875). Nachdem das Agar fest geworden ist, werden mm-Löcher in das Agar gestoßen (120 Löcher pro Schale).
Proben einer Kultur werden reihenverdünnt in 100 ug Streptomycin pro ml sterilem Wasser, und 10 ul der verdünnten Proben werden in die Schalen dispergiert, die wie oben beschrieben präpariert wurden. Die Schalen werden bei 26ºC 2 Tage lang inkubiert. Verdünnungen des Faktors werden außerdem als eine positive Kontrolle durchgeführt.
Die Sensitivität des Pilswachstumshemmtest liegt im Bereich von 0,05 Gramm des Faktors pro Liter (gerade noch sichtbar) und 0,1 Gramm des Faktors pro Liter (klare Zone) für beide Pilze.

7.10.3. Messung des Faktors durch Kapillarzonenelektrophorese

Zellen und andere unlösliche Teile werden aus einer Vollkulturnährlösungsprobe durch Zentrifugation und/oder durch Filtration durch ein 0,2-um-Nylonmembranfilter vor der Analyse entfernt. Ein Beckman P/ACE Capillary Electrophoresis System, ausgestattet mit einer unbeschichteten 50 um · 47 cm-Kapillare, Laufpuffer bestehend aus 0,1 M Phosphat pH 6,6, Spannung bei 15 kV und Detektion bei 200 nm, wird zur Quantifizierung des Faktors verwendet. Vor jedem Lauf wird die Kapillare mit dem Laufpuffer 2 Minuten lang gespült. Das Volumen der aufgegebenen Probe ist 20 nl.
Die Laufzeit für die Analyse beträgt 12 Minuten, wobei der Faktor bei ungefähr 8,5 Minuten eluiert wird. Die Konzentration des Faktors wird relativ zu einer Standardkurve der reinen Verbindung bestimmt.
Zwischen jedem 12-Minutenlauf wird die Kapillare nacheinander mit 1 N Natriumhydroxid 0,5 Minuten, 0,1 N Natriumhydroxid 0,5 Minuten, HPLC-Wasser 0,5 Minuten und 1,5 M Phosphorsäure 0,5 Minuten lang gespült.

7.10.4. Mutagenese von B. thuringiensis Subsp. kurstaki- Stamm

Sporen des Bacillus thuringiensis Subsp. kurstaki-Stamms werden zuerst mit Gammastrahlen bei 700 krad behandelt. Die bestrahlten Sporen werden reihenverdünnt, auf TY-Agarplatten ausgebreitet und bei 30ºC 2 Tage lang inkubiert. Achtzig Mutanten aus der Behandlung werden gereinigt durch Einzelkolonieausstreichen auf TY-Agarplatten, und werden dann in 500-ml-Schüttelflaschen überführt, die 100 ml Medium mit der folgenden Zusammensetzung enthalten:
Maisquellwasser 15 g/Liter
Maltodextrin 40 g/Liter
Kartoffelprotein 30 g/Liter
KH&sub2;PO&sub4; 1,77 g/Liter
K&sub2;HPO&sub4; 4,53 g/Liter
Die Schüttelflaschen werden bei 30ºC, 250 Upm 3 Tage lang inkubiert.
Proben von 5 ml werden täglich aus jeder der Schüttelflaschenkulturen" genommen und zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Die Überstände werden 2-10-fach verdünnt in Streptomycin bei einer Konzentration von 0,1 mg pro ml deionisiertes Wasser, und werden dann auf antifungale Wirksamkeit geprüft, wie in Abschnitt 8.2 beschrieben. Kulturproben von jenen Mutanten, die die größte Hemmung des Pilzwachstums hervorbringen, werden dann auf die Menge des Faktors durch Kapillarzonenelektrophorese analysiert, wie in Abschnitt 8.3 beschrieben. Der am stärksten produzierende Mutant aus der ersten Mutation ist NBB-76.
Der Mutant der ersten Generation NBB-76 wird dann einer zweiten Mutation unterworfen unter Verwendung von N,N'-Dinitro- N'-nitrosoguanidin (NTG). Ausdrücklicher wird der mutierte Stamm über Nacht bei 30ºC, 240 Upm in einer 500-ml-Schüttelflasche kultiviert, die 100 ml TY-Nährlösung mit der folgenden Zusammensetzung enthält, die vor der Behandlung im Autoklav auf pH 7,3 eingestellt wurde:
Trypton 20 g/Liter
Hefeextrakt 5 g/Liter
FeCl&sub2;-4H&sub2;O 6 mg/Liter
MnCl&sub2;-4H&sub2;O 1 mg/Liter
MgSO&sub4;-7H&sub2;O 15 mg/Liter
Die Übernacht-Kultur wird 100-fach in einer neuen Schüttelflasche verdünnt, die TY-Medium enthält, und bei 30ºC, 240 Upm kultiviert, bis die Kultur logarithmisches Wachstum erreichte (ungefähr 4 Stunden). Eine Probe von 10 ml von der Kultur wird aus der Schüttelflasche entfernt und dann keimfiltriert unter Verwendung einer 0,45-um-Nalgene- Filtereinheit. Die Zellen auf dem Filter werden wieder suspendiert in 10 ml TM-Puffer, der 100 ug NTG pro ml enthält. Der TM-Puffer ist zusammengesetzt aus 6,05 g Tris und 5,08 g Maleinsäure pro Liter deionisiertes Wasser, mit Natriumhydroxid auf pH 6 eingestellt. Die suspendierten Zellen werden bei 37ºC 30 Minuten lang inkubiert, und werden dann an eine Vakuumquelle angeschlossen, um das NTG von den Zellen zu entfernen. Die Zellen werden zwei Mal mit 20 ml M9-Puffer gewaschen, bevor sie in 10 ml M9-Puffer wieder suspendiert, reihenverdünnt, auf TY- Agarplatten ausgebreitet und bei 30ºC 2 Tage lang inkubiert werden. Der M9-Puffer ist zusammengesetzt aus 8, 78 g Na&sub2;HPO&sub4;-2H&sub2;O, 3 g KH&sub2;PO&sub4;, 4 g NaCl und 0,2 g MgSO&sub4;-7H&sub2;O pro Liter deionisiertes Wasser. Mutanten werden isoliert und untersucht, wie oben beschrieben. Der am stärksten produzierende Mutant, der aus der zweiten Mutationsrunde erhalten wird, ist EMCC 0130.
Der Mutant der zweiten Generation EMCC 0130 wird dann einer dritten Mutation unterworfen unter Verwendung von NTG, wie oben beschrieben. Der am stärksten produzierende Mutant, der aus der dritten Mutationsrunde erhalten wird, ist NBC-217.
Der Mutant der dritten Generation NBC-217 wird dann einer vierten Mutation unterworfen unter Verwendung von NTG, wie oben beschrieben. Der am stärksten produzierende Mutant, der aus der dritten Mutationsrunde erhalten wird, ist EMCC 0129.

7.10.5. Faktorproduktion durch Mutanten und Elternstamm

Die Mutanten EMCC 0130, NBC-217 und EMCC 0129 und der Elternstamm Bacillus thuringiensis Subsp. kurstaki EMCC 0086 werden in 250-ml-Schüttelflaschen aufgezogen, die 50 ml Medium enthalten, das aus den folgenden Komponenten zusammengesetzt ist, ergänzt mit Spurenmetallen von 0,2 ml pro Liter, und dann vor der Sterilisation mit H&sub3;PO&sub4; auf pH 7 eingestellt:
Hydrolysiertes pflanzliches Eiweiß 30 g/Liter
Hydrolysierte Stärke 40 g/Liter
K&sub2;HPO&sub4; 5 g/Liter
MgSO&sub4; 0,3 g/Liter
Die Schüttelflaschenkulturen werden bei 30ºC, 250 Upm 3 Tage lang inkubiert.
Die quantitative Analyse des Faktors, der durch die Mutanten und den Elternstamm produziert wurde, wird durchgeführt durch Kapillarzonenelektrophorese, wie in Abschnitt 8.3 beschrieben. Die quantitative Analyse weißt darauf hin, dass Mutant EMCC 0129 ungefähr 0,9 g des Faktors pro Liter Kulturnährlösung nach 3 Tagen in Schüttelflaschen produziert, während der Elternstamm ungefähr 0,15 g pro Liter produziert. Mutant EMCC 0129 produziert ungefähr 6 mal mehr Faktor als der Elternstamm.
Tabelle VIII: Produktion von Faktor durch Mutanten von Bacillus thuringiensis Subsp, kurstaki
Mutant Faktor (p/Liter)
Elternstamm 0,15
EMCC 0130 0,65
NBC-217 0,65
EMCC 0129 0,75

8. HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN

Die folgenden Stämme von Bacillus thuringiensis sind gemäß des Budapester Vertrags in der Agriculture Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Nothern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604, USA, hinterlegt worden.
Die Stämme sind hinterlegt worden unter Bedingungen, die sicherstellen, dass Zugriff auf die Kultur während der Rechtsanhängigkeit dieser Patentanmeldung zulässig sein wird für jemanden, der durch den Commissioner of Patents and Trademarks (Präsident des Patentamtes der USA) bestimmt wird, hierzu berechtigt zu sein gemäß 37 C. F. R. §1.14 und 35 U.S.C §122. Die Hinterlegung stellt eine im Wesentlichen reine Kultur von jedem hinterlegten Stamm dar. Die Hinterlegung ist nach Bedarf gemäß ausländischen Patentgesetzen in Ländern zugänglich, in denen Gegenstücke der vorliegenden Anmeldung oder deren Nachkommenschaft eingereicht werden. Es sollte jedoch verstanden werden, dass die Zugänglichkeit einer Hinterlegung keine Lizenz konstituiert, um die vorliegende Erfindung in Mißachtung von Patentrechten, die durch staatliche Handlung erteilt wurden, durchzuführen.

Claims

1. Ein Mutant eines Bacillus Stammes, der einen Faktor produziert, welcher die pestizide Wirksamkeit eines Bacillusverwandten Pestizids verstärkt, wobei der Mutant gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Mutanten, der die Identifikationscharakteristika EMCC 0129 besitzt, hinterlegt mit der NRRL B-21445, und dem Mutanten, der die Identifikationscharakteristika EMCC 0130 besitzt, hinterlegt mit der NRRL B-21444.

2. Verwendung des Mutanten gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Faktors, der ein Bacillus-Pestizid verstärkt, das ein Bacillus thuringiensis delta-Endotoxin oder ein pestizid wirksames Fragment davon umfaßt.

3. Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei das Bacillus thuringiensis delta-Endotoxin oder das pestizid wirksame Fragment davon gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CryI, CryII, CryIII, CryIV, CryV und CryVI.

4. Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei das Bacillus thuringiensis delta-Endotoxin oder das Pestizid wirksame Fragment davon gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CryIA delta-Endotoxin oder einem pestizid wirksamen Fragment davon.

5. Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei das Bacillus thuringiensis delta-Endotoxin oder das pestizid wirksame Fragment davon gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CryIC delta-Endotoxin oder einem pestizid wirksamen Fragment davon.

6. Verwendung des Mutanten gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Faktors, der ein Bacillus-Pestizid verstärkt, das eine Bacillus thuringiensis-Spore umfaßt.

7. Verfahren zur Herstellung eines Faktors von dem Mutanten gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Kultivieren eines Mutanten eines Bacillus-Stammes, der gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Mutanten, der die Identifikationscharakteristika EMCC 0129 besitzt, hinterlegt mit der NRRL B-21445, und dem Mutanten, der die Identifikationscharakteristika EMCC 0130 besitzt, hinterlegt mit der NRRL B-21444, unter geeigneten Bedingungen;

(b) Sammeln des Überstandes der Kultur des Mutanten aus Schritt (a); und

(c) Isolieren des Faktors aus dem Überstand aus Schritt (b).

8. Ein Faktor, der durch den Mutanten gemäß Anspruch 1 produziert wurde, dadurch gekennzeichnet, daß er 1H NMR Verschiebungen bei δ1.5, 3.22, 3.29, 3.35, 3.43, 3.58, 3.73, 3.98, 4.07, 4.15, 4.25, und 4.35 besitzt, und 13C Verschiebungen bei 31.6, 37.2, 51.1, 53.3, 54.0, 54.4, 61.5, 61.6, 64.1, 65.6, 158.3, 170.7 und 171.3.

9. Ein Faktor gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß er die Struktur I besitzt oder ein Salz davon