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DE69622564T2 - Synthetische modifizierung von spinosyn-verbindungen - Google Patents

Synthetische modifizierung von spinosyn-verbindungen

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Publication number
DE69622564T2
DE69622564T2 DE69622564T DE69622564T DE69622564T2 DE 69622564 T2 DE69622564 T2 DE 69622564T2 DE 69622564 T DE69622564 T DE 69622564T DE 69622564 T DE69622564 T DE 69622564T DE 69622564 T2 DE69622564 T2 DE 69622564T2
Authority
DE
Germany
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spinosyn
dihydro
compound
epoxy
propyl
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
DE69622564T
Other languages
English (en)
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DE69622564D1 (de
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Biagio Anzeveno
Camillo Creemer
D. Crouse
Vincent Deamicis
Michael Gifford
Richard Green
J. Hatton
B. Hegde
A. Kirst
G. Martynow
L. Mclaren
J. Ricks
Raymond Schoonover
C. Sparks
R. Thoreen
V. Worden
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Corteva Agriscience LLC
Original Assignee
Dow AgroSciences LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Description

    Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung bezieht sich auf Verbindungen, die durch chemische Modifikationen von Spinosyn-Verbindungen, die von Saccharopolyspora spinosa produziert werden, hergestellt sind. Die Verbindungen besitzen insektizide Aktivität.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Das im U. S. Patent Nr. 5 362 634 als A83543 identifizierte Gärprodukt ist eine Familie von verwandten Verbindungen, die von Saccharopolyspora spinosa produziert wird. Auf diese Verbindungen wurde hingewiesen als Faktoren oder Bestandteile A, B, C, D, E, F, G, H, J, K, L, M, N, O, P, Q, R, S, T, U, V, W, Y und dergleichen (siehe auch PCT WO 93/09126 und PCT WO 94/20518), und auf sie wird hierin später anschließend als Spinosyn A, B und dergleichen Bezug genommen. Die Spinosyn-Verbindungen sind zur Kontrolle von Spinnentieren, Nematoden und Insekten, insbesondere von Lepidoptera- und Diptera- Arten, nützlich. Die natürlich produzierten Spinosyn-Verbindungen bestehen aus einem 5,6,5-trizyklischen Ringsystem, verschmolzen mit einem 12-gliedrigen makrozyklischen Lacton, einem Neutralzucker (Rhamnose) und einem Aminozucker (Forosämin) (siehe Kirst et al. (1991), Tetrahedron Letters, 32: 4839). Wenn der Aminozucker nicht vorhanden ist, wurden die Verbindungen als das Pseudoaglycon von A, D, usw. bezeichnet, und wenn der Neutralzucker nicht vorhanden ist, wurden die Verbindungen als die reversen Pseudoaglycone von A, D, usw. bezeichnet. Eine mehr bevorzugte Nomenklatur ist die Bezeichnung der Pseudoaglycone als Spinosyn A 17-Psa, Spinosyn D 17-Psa und dergleichen. Eine mehr bevorzugte Nomenklatur ist die Bezeichnung der reversen Pseudoaglycone als Spinosyn A 9-Psa, Spinosyn D 9-Psa und dergleichen. Die Spinosyn-Verbindungen haben typischerweise die folgenden Strukturen besessen:
  • Die natürlich produzierten Spinosyn-Verbindungen können via Fermentation aus den Kulturen NRRL 18719, 18537, 18538, 18539, 18719, 1843 und 18823 produziert werden. Diese Kulturen wurden hinterlegt und wurden zu einem Teil der Stammkultur-Sammlung des "Midwest Area Northern Regional Research Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, IL 61604".
  • Wie zuvor angegeben, sind die Spinosyn-Verbindungen insbesondere gegen Lepidoptera- und Diptera-Arten wirksam. Die Spiriosyn-Verbindungen sind ziemlich umweltfreundlich und besitzen ein attraktives toxikologisches Profil. Aber in einigen Anwendungen wäre es besonders wünschenswert, eine längere Restwirkung zu haben, als die durch die Spinosyne, die in vorherigen Patenten und Publikationen offenbart werden, bereitgestellt wird. Ein Spinosyn-Analogon, das eine längere Restwirkung besitzt, könnte verwendet werden, um Milben auf Früchten und Nüssen zu kontrollieren oder um Apfelwickler zu kontrollieren, der Apfelfrüchte beeinträcht.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfindung, die hierin offenbart ist, betrifft die synthetische Modifikation von Produkten, die von Saccharopolyspora spinosa produziert werden, wobei dabei Zwischenprodukte und/oder insektizide Produkte zur Verwendung in den landwirtschaftlichen und Tiergesundheitsmärkten produziert werden. Die zahlreichen synthetischen Modifikationen wurden am Rhamnosezucker, am Forosaminzucker, an den Molekülen durch Hydrierung, Epoxidation, Reduktion, Halogenierung, Oxidation, Addieren von Alkylgruppen, Addieren von Stickstoffgruppen, und der Addition und dem Entfernen von Substituenten am makrozyklischen Lacton durchgeführt.
  • Es wird festgestellt, dass alle Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine Einfachbindung oder eine Epoxidbindung zwischen den Positionen 5 und 6 in der obigen Formel I besitzen.
    • Genaue Beschreibung der Erfindung
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden direkt oder indirekt durch Modifizierung der Verbindungen hergestellt, die natürlicherweise von Saccharopolyspora spinosa produziert werden, siehe U. S. Patent 5 362 634 von DowElanco. Es wurde gezeigt, dass die Verbindungen der Erfindung eine Wirksamkeit gegenüber Insekten, Spinnentieren und Nematoden besitzen. Deswegen können die Verbindungen verwendet werden, um andere Verbindungen herzustellen, oder die Verbindungen selbst können zur Hemmung oder Inaktivierung eines Insekts oder einer Milbe verwendet werden. Eine hemmende oder inaktivierende Menge der Verbindung kommt in Kontakt mit dem Ort eines Insekts oder einer Milbe. Der "Ort" des Insekts bezieht sich auf die Umgebung, in der das Insekt oder die Milbe lebt oder wo seine Eier vorhanden sind, einschließlich die Luft, die es umgibt, die Nahrung, die es isst oder Gegenstände, mit denen es in Kontakt kommt. Typischerweise werden diese Verbindungen auf dem Laub einer Pflanze appliziert, die von einem Insekt oder einer Milbe angefressen wird. Soweit es hierin nicht anders angegeben ist, haben die Ausdrücke und Begriffe die folgende Bedeutung: mit dem Begriff "Halogenalkyl" ist ein Alkyl bezeichnet, das 1 bis 4 Kohlenstoffatome besitzt, worin mindestens ein Halogen an ein Kohlenstoffatom gebunden ist. Mit dem Begriff "Halogen" ist Cl, F, Br oder I bezeichnet. Mit dem Begriff "Alkanoyl" ist ein Alkyl bezeichnet, das 1 bis 4 Kohlenstoffatome besitzt, worin mindestens eine Carbonylgruppe an eine Alkylgruppe angeheftet ist. Mit dem Begriff "Alkylhydroxylamin" ist ein Substituent mit der Formel
  • bezeichnet, worin R¹&sup0; und R¹¹ jeweils unabhängig ein Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder ein Alkanoyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen sind. Mit dem Begriff "geschütztes Hydroxyl" sind substituierte Methylether bezeichnet, so wie, aber nicht beschränkt auf Methoxymethyl, Tetrahydropyran, substituierte Ethylether, so wie, aber nicht beschränkt auf 1-Ethoxyethyl, substituierte Benzylether, so wie, aber nicht beschränkt auf p-Methoxybenzyl, Silylether, so wie, aber nicht beschränkt auf Silylether, die 1 bis 2 Kohlenstoffatome besitzen, typischerweise Trimethylsilyl, Ester, typischerweise Ester, die 1 bis 2 Kohlenstoffatome besitzen, insbesondere Formiat oder Acetat, Carbonate, typischerweise Carbonate, die 1 bis 2 Kohlenstoffatome besitzen, insbesondere Methylcarbonat, und Sulfonate, die typischerweise 1 bis 2 Schwefel besitzen, insbesondere Methylsulfonate. Diese schützenden Gruppen werden genauer in "Greene, T. W., Wuts, P. G. M. Protecting Groups in Organic Syntheses, John Wiley and Sons, New York, 1991", S. 17-18 beschrieben. Durch den Begriff "geschütztes Amin" sind Carbamate bezeichnet, die 1 bis 2 Kohlenstoffatome besitzen, Amide, die 1 bis 4 Kohlenstoffatome besitzen, typischerweise n-Formyl und n-Acetyl, und Imine so wie n-Benzylien. Diese schützenden Gruppen sind weiter in "Greene, Protectinci Groups in Organic Syntheses" beschrieben. Mit dem Begriff "hemmend auf Insekten oder Milben" ist gemeint, dass es einen Rückgang in der Anzahl der lebenden Insekten oder Milben oder einen Rückgang in der Anzahl der Eier gibt. Mit einer "inaktivierenden Menge" ist gemeint, dass eine Menge einer Verbindung verwendet wird, um einen messbaren Rückgang in der behandelten Insekten- oder Milbenpopulation zu verursachen. Typischerweise werden von etwa 1 bis etwa 1000 ppm (oder 0,01 bis 1 kg/Morgen ("Acre")) der Verbindung verwendet.
  • Diese Verbindungen sind typischerweise wirksam gegen Macroste/es fascifrons (Asfier-Wanderzikade), Spodoptera exiqua (Zuckerrübeneule), Meloidogyne arenarle (Erdnuss-Wurzelgallennematode), Aphis gossypii (Baumwoll-Blattlaus), Tetranychus urticae (Gemeine Spinnmilbe), Diabrotica undecipunctata howardi (Südlicher Maiswurzelbohrer), Heliothis zea (Baumwoll- Eulenfalter), Peregrinus maidis (Mais-Zikade), Heliothis virescens (Tabakeule), Blattella germanicus (Hausschabe), Ostrinia nubilalis (Maiszünsler), Nephotettix cinciticeps (Grüne Singzikade), Nilaparvata lugens (Braune Zwergzikade) und Chilo suppressalis (Reisstengelbohrer) und dergleichen.
  • Die synthetischen Verbindungen werden typischerweise durch Modifizieren des Rhamnosezuckers, durch Modifizieren des Forosaminzuckers oder durch Starten mit einem 9- oder 17-Pseudoagiycon und dann durch Substituieren eines nicht-Zuckers oder eines anderen Zuckers mit Rhamnose- oder Forosaminzucker hergestellt. Synthetische Verbindungen wurden auch durch Modifizieren des 5,6,5-trizyklischen und/oder 12-elementigen makrozyklischen Lactonteils der natürlich hergestellten Verbindungen oder der Pseudoaglycone der natürlichen Verbindungen, wie hierin in den Beispielen beschrieben, hergestellt. Die hierin beanspruchten Verbindungen schließen alle Isomere und jedes Säureadditionssalz der Verbindungen und ihrer Isomere ein.
  • Die hierin beanspruchten Verbindungen existieren in mehreren diastereomeren Isomeren. Weil es mehrfache stereogene Zentren gibt, wird erwartet, dass die diastereomeren Isomere eine Nützlichkeit als Insektizide besitzen werden. Obwohl einige diastereomere Isomere effizienter sein können als andere, sind alle der diastereomeren Isomere für die beanspruchte Erfindung äquivalent.
  • In Beispiel 17, Teil A, ist der Rhamnosezucker an R5', R6' und R7' der Formel I durch Addition von langkettigen Alkylgruppen, aromatischen Gruppen und/oder der Addition von langkettigen Alkylgruppen, aromatischen Gruppen mit Halogensubstituenten modifiziert. Ester wurden auch an der an R5'-, R6'- und R7'-Position hergestellt. Zusätzliche Zucker wurden an diesen Positionen auch platziert. Eine andere Art von Modifikation war die Addition von Substituenten hieran, die Atome so wie Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Silizium enthielten. Zusätzlich zu den Modifikationen am Rhamnosezucker wurde die Doppelbindung zwischen der C5- und der C6-Position in Formel 1 durch Epoxidation oder Hydrierung modifiziert.
  • In Beispiel 17, Teil C wurde der Forosaminzucker durch Wechseln der Substitution am Stickstoff von H oder Methyl zu einer langkettigen Alkylgruppe, einer Acylgruppe, einem quartären Ammoniumsalz oder einem N-Oxid modifiziert. In Beispiel 17, Teil D wurde das Molekül an der Doppelbindung an den C13- und C14-Positionen durch Hydrierung, Epoxidation, Reduktion und der Addition von Alkylgruppen und Stickstoffgruppen so wie Hydroxylamine und Cyanide, modifiziert. In Beispiel 17, Teil E wird der C17-Substituent des makrozyklischen Lactons eliminiert, um eine Doppelbindung zu ergeben und/oder die C5- und C6-Positionen des Moleküls werden mit Halogenen, Epoxiden und Alkoxiden modifiziert. In Beispiel 17, Teil F wird das Molekül an der C5- und C6- Postioion durch Hydrierung, Epoxidation, Halogenierung, Oxidation und der Addition von Heteroatom-Substituenten und Estern modifiziert.
  • In Beispiel 17, Teil I werden desoyxgenierte Rhamnose-Analoge hergestellt und weiter mit Ester und Heteroatom-Substitutionen modifiziert.
  • Die hierin offenbarten Verbindungen sind nicht nur zur Herstellung landwirtschaftlicher Produkte nützlich, auch Säureadditionssalze dieser Verbindungen sind wünschenswerte Produkte. Säureadditionssalze können aus den in den Formeln I, II, VI, VIII offenbarten Verbindungen hergestellt werden. Die Salze der Verbindungen werden unter Verwendung von Standardverfahren zur Herstellung von Salzen hergestellt, die den Fachleuten gut bekannt sind. Salze können neutralisiert werden, um ein Säureadditionssalz zu bilden. Säureadditionssalze, die besonders nützlich sind, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Salze, die durch Standardreaktionen sowohl mit organischen als auch anorganischen Säuren gebildet werden, so wie Schwefel-, Chlorwasserstoff-, Phosphor-, Essig-, Bernstein-, Zitronen-, Milch-, Malein-, Fumar-, Chol-, Pamoa-, Schleim-, Glutamin-, Campher-, Glutar-, Glycol-, Phthal-, Wein-, Ameisen-, Laurin-, Stearin-, Salicyl-, Methansulfon-, Benzolsulfon-, Sorbin-, Pikrin-, Benzoe-, Cinnamon- und ähnliche Säuren.
  • Zusammensetzungen werden gemäß der Verfahren und Formeln hergestellt, die im Fachgebiet der landwirtschaftlichen Kontrolle oder Schädlingskontrolle konventionell sind. Die Zusammenstellungen können aufkonzentriert und in Wasser dispergiert werden oder können in Form eines Staubs, eines Köders oder Granulatformulierungen verwendet werden. Die Dispersionen sind typischerweise wässrige Suspensionen oder Emulsionen, die aus aufkonzentrierten Formulierungen der Verbindungen hergestellt werden. Die wasserlöslichen oder wässrigen Suspensionen oder emulgierbaren Formulierungen sind entweder Feststoffe, benetzbare Pulver oder Flüssigkeiten, bekannt als emulgierbare Konzentrate oder wässrige Suspensionen. Benetzbare Pulver können agglomeriert oder komprimiert werden, um wasserdispergierbare Körnchen zu bilden. Diese Körnchen umfassen Gemische aus Verbindung, inerten Trägern und oberflächenaktiven Stoffen. Die Konzentration der Verbindung beträgt typischerweise zwischen etwa 0,1% und etwa 90% Gewichts-%. Der inerte Träger sind typischerweise Attapulgit-Tone, Montmorillonit-Tone und die Diatomeenerden oder gereinigte Silikate.
  • Oberflächenaktive Stoffe umfassen typischerweise etwa 0,5% bis etwa 10% des benetzbaren Pulvers, worin die oberflächenaktiven Stoffe typischerweise sulfonierte Lignine, kondensierte Naphtalin-Sulfonate, die Naphtalin-Sulfonate, Alkylbenen-Sulfonate, Alkylsulfonate oder nicht ionische oberflächenaktive Substanzen so wie Ethylenoxid-Addukte von Alkylphenolen oder Gemischen davon sind.
  • Emulgierbare Konzentrate der beanspruchten Verbindungen sind im Bereich von etwa 50 bis etwa 500 Gramm der Verbindung pro Liter Flüssigkeit, äquivalent mit etwa 10% bis etwa 50%, gelöst in einem inerten Träger, der ein Gemisch aus einem mit Wasser unmischbaren Lösungsmittel und Emulgatoren ist. Organische Lösungsmittel schließen organische Verbindungen ein, so wie Xylole, und Erdölfraktionen, so wie hochsiedende naphthalinische und olefinische Erdölfraktionen, die schwere und aromatische Petrolether einschließen. Andere organische Verbindungen, so wie terpenische Lösungsmittel -Harzderivate, aliphatische Ketone, so wie Cyclohexanone und komplexe Alkohole, können auch verwendet werden. Emulgatoren für emulgierbare Konzentrate sind typischerweise gemischte ionische oder nicht ionische oberflächenaktive Substanzen so wie die hierin erwähnten oder deren Äquivalente.
  • Wässrige Suspensionen können hergestellt werden, enthaltend wasserunlösliche Verbindungen, worin die Verbindungen in einem wässrigen Beförderungsmittel mit einer Konzentration, die typischerweise im Bereich zwischen etwa 5% bis etwa 50 Gewichts-% liegt, dispergiert werden. Die Suspensionen werden hergestellt durch feines Zermahlen der Verbindung und heftiges Mischen davon in einem Beförderungsmittel aus Wasser, oberflächenaktiven Substanzen und Dispergiermittel, wie hierin diskutiert. Inerte Bestandteile so wie anorganische Salze und synthetische Harze oder Pflanzenharze können auch verwendet werden, um die Dichte und/oder Viskosität des wässrigen Beförderungsmittel zu erhöhen, wie es erwünscht ist.
  • Präzipitierte fließfähige Stoffe können durch Lösen der aktiven Moleküle in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel und oberflächenaktiven Stoffen oder oberflächenaktiven Polymeren hergestellt werden. Wenn diese Formulierungen mit Wasser gemischt werden, präzipitiert der aktive Bestandteil, wobei der oberflächenaktive Stoff die Größe des resultierenden mikrokristallinen Präzipitats kontrolliert. Die Größe des Kristalls kann durch die Auswahl spezieller Polymer- und oberflächenaktiver Stoffgemische kontrolliert werden.
  • Die Verbindungen können auch als körnige Zusammensetzung angewendet werden, die in die Erde appliziert wird. Die Granulatzusammensetzung enthält typischerweise von etwa 0,5% bis etwa 10 Gew-% der Verbindung. Die Verbindung wird in einem inerten Träger dispergiert, der typischerweise ein Ton oder eine äquivalente Substanz ist. Im Allgemeinen werden Granulatzusammensetzungen hergestellt durch Lösen der Verbindung in einem geeigneten Lösungsmittel und Applizieren auf einen körnigen Träger, der in der gewünschten Partikelgröße vorgebildet ist. Die Partikelgröße beträgt typischerweise zwischen etwa 0,5 mm bis 3 mm. Die Granulatzusammensetzungen können auch durch Bilden einer Streichlösung oder Paste aus dem Träger und der Verbindung, Trocknen des vereinigten Gemischs und Zerkleinern der Streichlösung oder Paste bis zur gewünschten Partikelgröße hergestellt werden.
  • Die Verbindungen können auch mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel vereinigt werden. Das organische Lösungsmittel ist typischerweise ein mildes Öl auf Erdölbasis, das in der landwirtschaftlichen Industrie breite Verwendung findet. Diese Kombinationen werden typischerweise als ein Spritzmittel appliziert. Typischerweise werden die Verbindungen als eine Dispersion in einem flüssigen Träger appliziert, worin der flüssige Träger Wasser ist. Die Verbindungen können auch in Form einer Aerosol-Zusammensetzung appliziert werden. Die Verbindung wird in einem inerten Träger gelöst, der ein druckerzeugendes Treibgasgemisch ist. Die Aerosol-Zusammensetzung wird in einen Behälter verpackt, worin das Gemisch durch ein Zerstäuberventil dispergiert wird. Treibgasgemische beinhalten entweder niedrig siedende Halogenkohlenwasserstoffe, die gemischt werden können mit organischen Lösungsmitteln oder wässrigen Suspensionen, die mit inerten Gasen oder gasförmigen Kohlenwasserstoffen unter Druck gesetzt werden.
  • Die Menge der Verbindung die an den Ort der Insekten oder Milben appliziert wird, ist nicht kritisch und kann von Fachleuten leicht bestimmt werden. Im Allgemeinen stellen die Konzentrationen von etwa 10 ppm bis etwa 5000 ppm die gewünschte Kontrolle bereit. Für Feldfrüchte, so wie Sojabohnen und Baumwolle, ist die Applikationsrate etwa 0,01 bis etwa 1 kg/ha, worin die Verbindung in einer 5 bis 50 Gallon/Acre (gal/A) Spritzmittelformulierung appliziert wird. Die Verbindungen können an jedem Ort appliziert werden, der von einem Insekt oder einer Milbe bewohnt wird. Solch ein Ort ist typischerweise Baumwolle, Sojabohnen und Gemüsefeldfrüchte, Früchte und Nussbäume, Weintrauben, Häuser und Zierpflanzen. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind auch nützlich zur Behandlung von Tieren, um Arthropoden, d. h. Insekten und Spinnentiere, zu kontrollieren, die Schädlinge auf Tieren sind. Diese Arthropoden-Schädlinge greifen ihre Wirte typischerweise auf der äußeren ("ekto") Oberfläche an; Mittel, die solche Schädlinge kontrollieren, werden als "Ektoparasitizide" bezeichnet.
  • Alle Tiere sind dem Angriff von solchen Schädlingen ausgesetzt, obwohl die Probleme am schwersten unter Vertebratenwirten sind. Menschen sind potentielle Wirte für viele Parasiten, und in tropischen Gegenden und in Gegenden mit minimaler Hygiene sind Parasiteninfektionen ein regelmäßiges Problem in der medizinischen Praxis. Stark ausgesetzt gegenüber dem Angriff von Parasiten sind auch die zahlreichen Viehtiere, so wie Rinder, Schafe, Schweine, Ziegen, Büffel, Wasserbüffel, Hirsche, Kaninchen, Hühner, Truthähne, Enten, Gänse, Straußen und dergleichen. Pferde und andere Vergnügungstiere sind Parasitenangriffen ausgesetzt, so wie es Nerze und andere Tiere sind, die wegen ihres Fells aufgezogen werden, und Ratten, Mäuse und andere Tiere, die im Labor und in Forschungsversuchen verwendet werden. Gefährtentiere, so wie Hunde und Katzen, sind einem Parasitenangriff verstärkt ausgesetzt, und wegen ihrer engen Beziehung mit Menschen wirft solch ein Parasitismus Probleme für die Menschen auf, mit denen sie assoziiert sind. Fische, Krustentiere und andere Wasserarten sind auch einem Parasitenangriff ausgesetzt. Kurz gesagt betrifft Parasitismus im Wesentlichen das gesamte Tierreich als Wirte.
  • Der wirtschaftliche Verlust durch ektoparasitische Infestation ist groß. Im Bereich des Viehs leiden die Tiere an einer verringerten Futtermitteleffizienz und an verminderten Wachstumsraten. Die Milch- und Wollproduktion leidet und es gibt einen großen Schaden an Schurwolle, Leder und Fellen. Die Tiere werden empfindlich für sekundäre mikrobiologische Infektionen und für weiteren Parasitenbefall. Ektoparasiten verursachen auch erhebliche Beschwerden, sogar, wenn sie für die Gesundheit und die Produktion nicht stark schädlich sind. Obwohl eine Anzahl von Parasitiziden in Verwendung sind, leiden sie an einer Vielzahl von Problemen, einschließlich einem begrenzten Spektrum der Wirksamkeit, Umwelttoxizität, dem Bedarf einer wiederholten Behandlung und in vielen Fällen einer Resistenz der Ektoparasiten. Deshalb gibt es einen fortgesetzten Bedarf an neuen Extoparasitiziden.
  • Die vorliegenden Verbindungen stellen ein neues Werkzeug in dem Waffenarsenal zur Kontrolle von Ektoparasiten bereit. In dieser Ausführungsform, richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Hemmung oder Abtötung eines Arthropodenschädlings auf einem Wirtstier, umfassend in Kontakt bringen des Schädlings mit einer wirksamen Menge einer Verbindung der vorliegenden Erfindung.
  • Die vorliegenden Verbindungen können zum Kontrollieren einer breiten Vielfalt von Arthropodenschädlingen verwendet werden. Repräsentative Schädlinge, die durch die vorliegenden Verbindungen kontrolliert werden können, sind folgende:
  • Spinnentiere (Arachniden), Amblyomma americanum (Amerikanische Schildzecke), Amblyomma maculatum (Golfküsten-Zecke), Argas persicus (Lederzecke), Boophilus microplus (Rinderzecke), Chorioptes spp. (Räudemilbe), Demodex bovis (Rinderfollikel-Milbe), Demodex canis (Hundefollikel-Milbe), Dermacentor andersoni (Gepunktete Rocky Mountain Fieberzecke), Dermacentor variabilis (Amerikanische Hundezecke), Dermanyssus gallinae (Vogelmilbe), Ixodes ricinus (Gemeine Schafmilbe), Knemidokoptes gallinae (Räudemilbe), Knemidokoptes mutans (Schuppenbein-Milbe), Otobius megnini (Ohrzecke), Psoroptes equi (Räudemilbe), Psoroptes ovis (Schaf-Räudemilbe), Rhipicephalus sanguineus (Braune Hundezecke), Sarcoptes scabiei (Krätzmilbe), Insekten- Aedes (Stechmücken), Anopheles (Stechmücken), Culex (Stechmücken), Culiseta, Bovicola bovis (Rinderhaarling), Callitroga homnivorax (Schmeißfliege), Chrysops spp. (Bremse), Cimex lectularius (Bettwanze), Cochllomyia spp. (Schraubenwurmfliege), Ctenocephalides canis (Hundefloh), Ctenocephalides felis (Katzenfloh), Culicoides spp. (Mücken, Sandfliegen, Stechmücken, "punkies" oder "no-see-ums"), Damalinia ovis (Schaflaus), Dermatobia spp. (Hautdassel), Gasterophilus haemorrhoidalis (Nasendasselfliege), Gasterophilus intestinalis (Magendassel des Pferdes), Gasterophilus nasalis (Kinnfliege), Glossina spp. (Tsetsefliege), Haematobia irritans (Hornfliege, Büffelfliege), Haematopinus asini (Pferdelaus), Haematopinus eurysternus (Kurznasiger Rinderhaarling), Haematopinus ovillus (Kleiderlaus), Haematopinus suis (Schweinelaus), Hydrotaea irritans (Kopffliege), Hypoderma bovis (Bombenfliege), Hypoderma lineatum (Fersenfliege), Linognathus ovillus (Körperlaus), Linognathus pedalis (Fußlaus), Linognathus vituli (Langnasige Rinderlaus), Lucilia spp. (Goldfliege), Melophagus ovinus (Schaflausfliege), Musca spp. (Hausfliege, Stubenfliege), Oestrus ovis (Schaf-Nasenfliege), Pediculus spp. (Läuse), Phlebotomus spp. (Sandfliege), Phormia regina (Schmeißfliege), Psorophora spp. (Stechmücke), Pthirus ssp. (Läuse), Reduvius ssp. (Raubwanze), Simulium spp. (Kriebelmücke), Solenopotes capllatus (Kleiner Blauer Rinderhaarling), Stomoxys calcitrans (Wadenstecher), Tabanus spp. (Bremse), Tenebrio spp. (Mehlwürmer), Triatoma spp. (Raubwanzen).
  • Eine ektoparasitische Wirksamkeit der vorliegenden Verbindungen ist erreicht, wenn die Verbindungen mit den Schädlingen in Kontakt kommen. Der Kontakt kann mit dem Ei, der Larve, dem adulten Tier oder anderen Lebensstadien erfolgen. "Kontakt" schließt eine Ingestion der Verbindung durch den Schädling ein.
  • Verfahren zu Bereitstellung von Ektoparasitiziden sind Fachleuten gut bekannt. Im Allgemeinen wird eine vorliegende Verbindung auf die äußere Oberfläche eines Tieres appliziert, wobei sie mit Schädlingen in Kontakt kommt, die sich bereits auf dem Wirt befinden, ebenso wie mit solchen, die während der Wirkungsperiode der Verbindung auf dem Körper des Wirts eintreffen. Typischerweise ist die Verbindung in einer flüssigen Formulierung formuliert, die auf die Oberfläche des Tieres gesprüht wird oder auf die Oberfläche des Tieres geschüttet wird. Eine andere konventionelle Behandlung ist ein "Eintauchen", wobei Rinder behandelt werden, indem sie im Wesentlichen in eine verdünnte Lösung eines Ektoparasitizids eingetaucht werden. Für einige Wirte und Schädlinge kann die Formulierung ein Staub sein, mit dem der Wirt bestreut wird, oder ein Shampoo oder eine Creme, die durch Baden des Tieres angewendet wird. Kragen an Katzen und Hunden werden auch als Weg der Bereitstellung eines Ektoparasitizids direkt an der Oberfläche des Tieres verwendet.
  • In einem anderen Verfahren wird ein Ektoparasitizid an Standorten appliziert, die von Tieren häufig besucht werden, so dass Schädlinge sowohl dabei mit der Verbindung in Kontakt kommen, als auch bei direkter Applikation auf den Wirt. Eine Applikation an Haustierstreu ist gut bekannt, ebenso wie es Applikation auf Teppichen ist. Bei Rindern sind Staubbeutel gut bekannt. Diese werden in einem Eingang positioniert, wo die Rinder unvermeidlicherweise an dem Beutel reiben und Schädlinge mit der vorliegenden Verbindung in Kontakt kommen.
  • In noch einer anderen Ausführungsform können die vorliegenden Verbindungen verwendet werden, um Insekten und Spinnentiere zu kontrollieren, die Schädlinge in den Fäkalien von Rindern und anderen Tieren sind. In dieser Ausführungsform werden die Verbindungen oral verabreicht und die Verbindungen wandern durch den Intestinaltrakt und tauchen in den Fäkalien auf. Eine Kontrolle von Schädlingen in den Fäkalien schützt die Tiere indirekt vor den Schädlingen.
  • Für die Verwendung als Ektoparasitizide sind die Verbindungen in einer Art formuliert, die Fachleuten bekannt ist. Im Allgemeinen wird eine Formulierung eine Verbindung der vorliegenden Erfindung und ein oder mehrere physiologisch akzeptable Adjuvantien einschließen. Formulierungen schließen konzentrierte Versionen ein, worin der vorliegende Wirkstoff in einer Konzentration von 0,001 bis 98,0 Prozent vorliegt, wobei der Restbestandteil aus physiologisch akzeptablen Trägern besteht. Solche Formulierungen, besonders solche mit weniger als 50 Prozent an vorliegender Verbindung, können manchmal direkt verwendet werden, aber diese Formulierungen können auch mit anderen physiologisch akzeptablen Trägern verdünnt werden, um verdünntere Behandlungsformulierungen zu bilden. Diese letzteren Formulierungen können den Wirkstoff in geringeren Konzentrationen von 0,001 bis 0,1 Prozent einschließen.
  • In einer anderen Ausführungsform werden die vorliegenden Verbindungen wirksam mit anderen Ektoparasitiziden oder mit Anthelminthiken kombiniert, wobei die letzteren auch als Endoparasitizide bekannt sind ("endo" = innen, Kontrollieren von inneren Parasiten, die typischerweise Plattwürmer (Plathelminthen) und Rundwürmer (Nemathelminthen) sind).
  • Repräsentative Endoparasitiziden schließen die Folgenden ein:
  • Abamectin, Albendazol, Avermectin, Bunamidin, Coumaphos, Dichlorvos, Doramectin, Epsiprantel, Febantel, Fenbendazol, Flubendazol, Ivermectin, Levamisol, Mebendazol, Milbemycin, Morantel, Moxidectin, Netobimin, Niclosamid, Nitroscanat, Oxfendazol, Oxibendazol, Piperazin, Praziquantel, Pyrantel, Ricombendazol, Tetramisol, Thiabendazol, Clorsulon, Closantel, Diamphenethid, Nitroxynil, Oxyclozanid, Rafoxanid, Triclabendazol.
  • Andere repräsentative Endoparasitiziden schließen die Folgenden ein: Abamectin, Alphamethrin, Amitraz, Avermectin, Coumaphos, Cycloprothrin, Cyfluthrin, Cyhalothrin, Cypermethrin, Cyromazin, Deltamethrin, Diazinon, Diflubenzuron, Dioxathion, Doramectin, Famphur, Fenthion, Fertvalerat, Flucytrinat, Flumethrin, Hexaflumuron, Ivermectin, Lindan, Lufenuron, Malathion, Methopren, Metriphonat, Moxidectin, Permethrin, Phosme, Pirimiphos, Propetamphos, Propoxur, Rotenon, Temephos, Tetrachlorvinphos, Trichlorfon, Zetacypermethrin, B.t. Biotoxine und Borsäure.
    • Beispiele Allgemeiner experimenteller Teil
  • Alle Reagenzien und Lösungen wurden direkt verwendet, so wie sie von kommerziellen Lieferanten gekauft wurden, und alle Reaktionen wurden, soweit nicht anders vermerkt, unter konstantem magnetischen Rühren bei Umgebungstemperatur (20-22ºC) durchgeführt. Alle Reaktionen, die metallorganische, feuchtigkeitsempfindliche oder Metallhydrid-Reagenzien einbeziehen, wurden in kommerziell erhältlichen Trockenlösungen unter einer trockenen Stickstoff-Atmosphäre durchgeführt. Teilungen, Extraktionen oder Waschschritte mit NaCl, NaHCO&sub3;, NH&sub4;Cl und anderen Salzen beziehen sich auf gesättigte wässrige Lösungen dieser Salze. Reaktionen werden typischerweise durch Extraktion einer organischen Lösung der Produkte mit einer der obigen Salzlösungen "aufgearbeitet"; die organische Schicht wurde mit K&sub2;CO&sub3;, Na&sub2;SO&sub4; oder MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und im Vakuum verdampft. Umkehrphasen- Dünnschichtchromatographie (RPTLC) wurde auf glasgebackenen Octadecylsilangebundenen Platten mit 0,2 mm Dicke von Whatman durchgeführt. Chromatographie bezieht sich auf Flash-Chromatographie und wurde auf einem E. Merck Silicagel 60 (Siebmasche 230-400) durchgeführt. Umkehrphasen- Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie (RPHPLC) wurde auf einem C18- gebundenen Silicagel (Rainin Dynamax 60 A, 8 um) durchgeführt. Alle Schmelzpunkte wurden in offenen Kapillaren bestimmt und sind nicht korrigiert. ¹H NMR und ¹³C NMR-Spektren wurden bei 300 oder 400 MHz und 75 beziehungsweise 101 MHz in CDCl&sub3; bestimmt. Massenspektrometrische Daten wurden via Elektrospray-Ionisierung (ESI) gemessen. Elementaranalysen wurden durch das analytische Labor von DowElanco oder Midwest Microlabs bereitgestellt.
    • Beispiel 1 Synthese eines Spinosyn A-Aglycons
  • Eine Probe von Spinosyn A (8,50 g, 11,61 mmol) wurde in EtOH (100 ml) gelöst. Wasser (100 ml) wurde zugegeben, und unter Rühren wurde zu dieser Lösung eine 4 N (wässrige) H&sub2;SO&sub4;-Lösung (200 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde unter Rückfluss unter einer Stickstoff-Atmosphäre für 4,5 h erhitzt. Es wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, mit Toluol (250 ml) und Ethylacetat (300 ml) verdünnt, und es wurde Lauge (300 ml) zugegeben. Nach der Extraktion wurden die Phasen getrennt. Die Wasserschicht wurde noch einmal mit Ethylacetat (100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden nacheinander mit verdünnter Lauge (3x) und 5%igem wässrigem NaHCO&sub3; (2·) gewaschen, und dann über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in einer Flash- SiO&sub2;-Säule (250 g; Ethylacetat) gereinigt. Nach dem Aufkonzentrieren der chromatographisch reinen Fraktionen zur Trockene wurde Spinosyn A-Aglycon als ein glasiger Feststoff erhalten (4,08 g, 87%), [a]&sub5;&sub8;&sub9; = -145,6º (MeOH), [a]&sub5;&sub8;&sub9; = -131,7º (CHCl&sub3;).
    • Beispiel 1 Synthese von Spinosyn A 17-Psa
  • Spinosyn A (20,0 g, 27,4 mmol) wurde in 300 ml einer 1 N H&sub2;SO&sub4; gelöst und unter mechanischem Rühren für 2 h auf 80ºC erhitzt. Die Reaktion wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Präzipitat wurde mit Unterdruck filtriert und mit frischem 1 N H&sub2;SO&sub4; gewaschen. Das feste Produkt wurde dann in Dichlormethan gelöst, mit Lauge gewaschen und über K&sub2;CO&sub3; getrocknet und unter reduziertem Druck verdampft. Das rohe Produkt wurde mittels Silicagel- Chromatographie mit 70% EtOAc in Hexan gereinigt, um Spinosyn A 17-Psa (14,46 g; 89%) als farbloses Glas zu ergeben.
    • Beispiel 2 Synthese von Spinosyn A 17-Psa
  • Spinosyn A (20,0 Gramm, 27,4 mmol) wurde in 300 ml einer 1 N H&sub2;SO&sub4; gelöst und unter mechanischem Rühren für 2 h auf 80ºC erhitzt. Die Reaktion wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Präzipitat wurde mit Unterdruck filtriert und mit frischem 1 N H&sub2;SO&sub4; gewaschen. Das feste Produkt wurde dann in Dichlormethan gelöst, mit Lauge gewaschen und über K&sub2;CO&sub3; getrocknet und unter vermindertem Druck verdampft. Das rohe Produkt wurde durch eine Silicagel-Chromatographie mit 70% EtOAc in Hexan gereinigt, um Spinosyn A 17-Psa (14,46 Gramm; 89%) als ein farbloses Glas zu erhalten.
    • Beispiel 3 Spinosyn A 9-Psa
  • Eine Suspension von N-Chlorsuccinimid (1,20 g, 9,00 mmol) in Dichlormethan (45 ml) wurde unter Stickstoff auf -78ºC abgekühlt. Diethylsulfid (1,07 ml, 9,90 mmol) wurde über 5 min ordentlich zu dieser Suspension zugegeben und das Gemisch wurde bei -78ºC für 0,5 h gerührt. Spinosyn J (2,15 g, 3,00 mmol) in 8 ml Dichlormethan wurde langsam über 15 min zu diesem Gemisch zugegeben, wobei die Reaktionstemperatur unter -60ºC gehalten wurde. Als die Addition abgeschlossen war, wurde die Lösung bei -78ºC für 5 Stunden gerührt. Triethylamin (1,25 ml, 9,00 mmol) wurde dann tropfenweise zugegeben und der Lösung wurde es erlaubt, auf Raumtemperatur aufzuwärmen. Die Reaktion wurde mit 40 ml Dichlormethan verdünnt und in 20 ml 1 N Natriumbisulfat und 30 ml Wasser geschüttet. Die Schichten wurden getrennt und die organische Phase wurde mit 30 ml gesättigtem Natriumbicarbonat extrahiert und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck verdampft und der Rückstand wurde in MeOH (100 ml) gelöst. Wasserfreies K&sub2;CO&sub3; (4,15 g, 30,00 mmol) wurde zugegeben, und die Suspension wurde bei Raumtemperatur gerührt. Nach 2-stündigem Rühren wurde das Gemisch auf 0ºC abgekühlt und das Lösungsmittel in einem Rotationsverdampfer auf 1/5 seines Volumens eingedampft. Dichlormethan (100 ml) und Wasser (100 ml) wurden zugegeben und die Schichten wurden getrennt. Die wässrige Schicht wurde mit 3 · 50 ml Dichlormethan extrahiert, und die organischen Extrakte wurden vereinigt und zuerst mit Wasser, dann mit Laugenlösung gewaschen. Die Lösung wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und in einem Rotationsverdampfer aufkonzentriert, um 2,49 g eines klebrigen gelben Öls zu ergeben. Dieses Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (250 g Silicagel, 5% MeOH in Dichlormethan mit 0,5% konz. NH&sub4;OH) gereinigt, um Spinosyn A 9-Psa als einen weißen Schaum (1,52 g; 93%) zu ergeben ¹HNMR (CDCl&sub3;) &delta; 78 (br s, 1, H-13), 4,63 (m, 1, H-21), 4,43 (m, 2, H-1", H-9), 2,23 (s, 6, N(CH&sub3;)2).
    • Beispiel 4 Herstellung von Spinosyn mit der Kultur Saccharomyces spinosa NRRL 18395 Teil A. Schüttelkolbengährung
  • Die Kultur Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395 wurde verwendet, entweder als lyophilisiertes Pellet oder als Suspension in flüssigem Stickstoff erhalten, um ein vegetatives Medium, das die Zusammensetzung A oder B (Medium B wird für eine Produktion im großen Maßstab bevorzugt) besitzt, anzuimpfen, wobei das vegetative Medium A (Menge in %) Trypticase-Soja-Nährlösung* 3,0, Hefextrakt 0,3, MgSO&sub4;·7 H&sub2;O 0,2, Glucose 0,5, Maltose 0,4, deionisiertes Wasser ad 1 l, ohne pH-Einstellung, umfasste (*erworben bei Baltimore Biological Laboratories), und das vegetative Medium B Enzym-hydrolysiertes Casein** 3,0, Hefextrakt 0,3, MgSO&sub4;·7 H&sub2;O 0,2, Glucose 1,0, deionisiertes Wasser ad 1 l, mit einem pH von 6,2, der mit Natriumhydroxid auf 6,5 eingestellt wurde, umfasste (**erworben bei NZ Amine A, Sheffield Products, P. O. Box 638, Norwich, NY 13815). Schrägen oder Platten wurden durch Zugabe von 2,5% Agar zu dem vegetativen Aussaatmedium A oder B hergestellt. Die beimpften Schrägen wurden bei 30ºC für etwa 10 bis 14 Tage inkubiert. Die reife Schrägkultur wurde mit einem sterilen Werkzeug abgekratzt, um die Sporen zu lockern und die Mycelmatte zu entfernen und zu mazerieren. Etwa ein Viertel der gelockerten Sporen und der Wachstumskultur, die so erhalten wurden, wurden verwendet, um 50 ml eines vegetativen Aussaatmediums der ersten Stufe zu beimpfen. Alternativ kann das Medium der ersten Stufe aus einer Ampulle vom flüssigen Stickstoff beimpft werden. Wenn die Kultur in flüssigem Stickstoff gehalten wird, wurden die Ampullen unter Verwendung gleicher Volumina an vegetativer Kultur (48-72 Stunden Inkubation, 30ºC) und Suspensionsmedium hergestellt. Das Suspensionsmedium enthält Lactose (100 g), Glycerol (200 ml) und deionisiertes Wasser (ad auf 1 l). Eine Ampulle aus dem flüssigen Stickstoff wird verwendet, um 100 ml des vegetativen Mediums in 500 ml Erlenmeyerkolben (oder 50 ml Medium in 250 ml Kolben) zu beimpfen. Die Kulturen werden bei 30ºC für 48 h auf einem Schüttler, der in einem 2-Inch-Kreis (5,08 cm) mit 250 rpm umläuft, inkubiert. Die inkubierte Kultur (5% v/v Impfkultur) wird verwendet, um 100 ml eines Produktionsmediums zu beimpfen, das die folgende Zusammensetzung besitzt: (Menge in %) Glucose 4,0, pflanzliches Protein, teilweise enzymatisch hydrolysiert* 1,5-3,0, Baumwollsamenpulver** 1,0, CaCO&sub3; (zur Analyse oder Massenproduktgüte) 0,3, Sojabohnenöl 1,0, Leitungswasser ad 1 Liter (pH vor Sterilisierung mit NaOH auf 7,0 eingestellt) *Sheftone H, Sheffield Products, **Proflo, Traders Protein, P. O. Box 8407, Memphis, TN 38108. Das beimpfte Produktionsmedium wurde in 500 ml Erlenmeyerkolben bei 28-30ºC für 6 bis 8 Tage auf einem Schüttler inkubiert, der in einem 2-Inch-Kreis mit 250 rpm umläuft.
    • B Rührbioreaktor-Gärung
  • Um ein größeres Volumen an Impfmedium bereitzustellen, wurden 10 ml des inkubierten Mediums der ersten Stufe verwendet, hergestellt, wie in Teil A beschrieben, um 400 ml eines vegetativen Mediums der zweiten Stufe zu beimpfen, das dieselbe Zusammensetzung besitzt, wie das vegetative Medium der ersten Stufe. Dieses Medium der zweiten Stufe wurde in einem 2 l Weithals- Erlenmeyerkolbens für etwa 48 h bei 30ºC auf einem Schüttler inkubiert, der einem zwei-Inch-Kreis bei 250 rpm umläuft. So hergestelltes inkubiertes Medium der zweiten Stufe (2 l) wurde verwendet, um 80 bis 115 Liter eines sterilen Produktionsmediums, wie in Teil A beschrieben, zu beimpfen. Zusätzliches Sojaöl wird zugegeben, falls nötig, um das Schäumen zu kontrollieren.
  • Das beimpfte Produktionsmedium wurde in einem geschüttelten 165 l-Bioreaktor für 5 bis 8 Tage bei einer Temperatur von 28ºC vergärt. Die Luftmenge und die Rührgeschwindigkeit im Rührgefäß waren Computer-kontrolliert, um einen gelösten Sauerstoffgehalt bei oder über 50% der Luftsättigung zu erhalten.
    • Beispiel 5 Isolierung von Spinosyn A, B, C und D
  • Ein Gärungs-Nährmedium (225 l), hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben, wurde unter Verwendung einer Filterhilfe (1% Hyflo) filtriert, und die abgetrennte Biomasse wurde mit Wasser (~ 50 l) gewaschen. Die Biomasse wurde dann für etwa eine Stunde mit Methanol (~ 100 l) bewegt und filtriert. Das Methanolfiltrat wurde auf ein Volumen von etwa 1 Liter aufkonzentriert. Das Konzentrat wurde dreimal mit Diethylether (jeweils 1 Liter) extrahiert. Die vereinigten Etherextrakte wurden auf ein Volumen von etwa 200 ml aufkonzentriert. Ein Anteil des Konzentrats (8 ml) wurde auf einer Silicagel-Säule (RP-8 Lobar, Größe B, E. M. Science, eine Tochtergesellschaft von E. M. Industries, 30 Inc.) chromatographiert. Dieses Verfahren wurde für insgesamt 12 Durchläufe (Zyklen) wiederholt. Der instrumentelle Aufbau und das Durchführungsverfahren, um die präparative Chromatographie in einer "Autoprep"-Methode durchzuführen, ist wie folgt beschrieben:
  • Ein komplettes "Autoprep" HPLX-System umfasste drei Rainin Rabbit HPX- Pumpen, ein Druckmodul, einen HPLC-Fraktionssammler Gilson Modell 20 13, einen Isco-v4 Extinktionsdetektor und einen Apple Macintosh Plus Computer. Das komplette System wird nach den Anweisungen angeordnet, die im Dynamax HPLC-Methoden-Manager-Handbuch von Rainin Instrument Company, Inc. gegeben werden. Die "Autoprep" HPLC-Konfiguration zieht Vorteile aus der Systemautomatisierung, um zu erlauben, dass präperative Trennungen wiederholt unter virtuell identischen Bedingungen mit virtuell identischen Ergebnissen betrieben werden können. Das Sammeln und Vereinigen entsprechender Fraktionen aus mehrfachen Läufen stellt eine Chromatographiekapazität ohne den Bedarf an einer großen Säule bereit. Zwei Lösungsmittelgemische (A) und (B) wurden in der isokratischen Methode bei einer Fließrate von 8,0 ml/min verwendet. Lösungsmittelsystem A bestand aus 95 ml CH&sub3;OH, 95 ml CH&sub3;CN, 10 ml H&sub2;O und Lösungsmittelsystem B bestand aus 100 ml CH&sub3;OH, 100 ml CH&sub3;CN, 0 ml H&sub2;O. Das verwendete isokratische Gemisch enthält 60% des Lösungsmittels B.
  • Die Laufzeit für jeden Zyklus betrug 28,0 Minuten. Die Eluate der ersten 16 Minuten jedes Laufs wurden verworfen. Dir folgenden Eluate wurden in 6-fachen Fraktionen gesammelt, jeweils 2 Minuten (16 ml). Die automatisch vereinigten Fraktionen aus jedem der 12 Zyklen resultierten in 6 Endfraktionen (chromatographische Schnitte). Die Anwesenheit der aktiven Spinosyn- Verbindungen wurde durch Analysieren jeder Endfraktion auf Stechmückenlarven-Wirksamkeit und auch durch analytische HPLC bestimmt. Die wirksamen Fraktionen wurden dann gemäß ihrer Wirksamkeit und ihrer HPLC-Profile vereinigt, und wurden weiter aufgereinigt unter Verwendung desselben "Autoprep" HPLC- und Lösungsmittelsystems, aber mit einer hohen Auflösung, 21,4 mm · 25 cm präparative Säule (Rainin Dynamax), vorgepackt mit einem 8u C-18 Umkehrphasen-Silicagel, um Spinosyn A, B, C und D zu ergeben. Die Spinosyne A und D kristallisieren aus CH&sub3;OH/H&sub2;O.
    • Beispiel 6 Reinigung von Spinosyn A und D
  • Gärungs-Nährmedium (10 l) wurde wie in Beispiel 4, Teil A beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, dass 1) 200 ml des Produktionsmediums in 1 l Kolben verwendet wurde; 2) Sojabohnenöl in dem Produktionsmedium weggelassen wurde; und 3) eine Inkubation bei 30ºC für 4-6 Tage erfolgte. Die Nährlösung wurde filtriert. Das Filtrat, das 4 mcg an Spinosyn A/ml und keine nachweisbaren Mengen an Spinosyn B, C oder D/ml enthielt, wurde verworfen. Die Biomasse wurde mit Wasser gewaschen und für eine Stunde mit Methanol extrahiert. Der Extrakt (7 l) enthielt 72 mcg an Spinosyn A/m) und 7 mcg an Spinosyn D/ml. Der Methanolextrakt wurde auf ein Volumen von 5 l aufkonzentriert und auf eine HP-20-Säule (150 ml, Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., Japan) in Wasser (2 l) gegeben. Dieses Gemisch wurde für eine Stunde gerührt. Das HP-20-Säulengemisch wurde dann in einer Glassäule platziert. Der anfängliche Ausfluss und das Eluat unter Verwendung von Methanol : Wassser (1 : 1, 1 l) waren nicht wirksam. Das zweite Eluat unter Verwendung von Methanol : Wassser (7 : 3, 1 l) enthielt sehr geringe Mengen an Spinosyn A. Das folgende Eluat unter Verwendung von Methanol (1 l) enthielt die Spinosyn A- und Spinosyn D-Aktivität. Das Methanoleluat wurde aufkonzentriert und mit zwei ähnlichen Fraktionen aus anderen Aufarbeitungen vereinigt, und zur Trockene aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in 75 ml Methanol : THF (4 : 1) gelöst und durch Zugabe von 10 Volumen Acetonitril präzipitiert. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat wurde zur Trockene aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in Methanol (25 ml) gelöst und, auf eine 5,5 · 90-cm Säule von LH-20 Sephadex (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., U. S. A.), hergestellt in Methanol, aufgetragen, gesammelt und analysiert in 125 25-ml Fraktionen, unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen HPLC- Verfahrens.
  • Fraktionen, enthaltend die gewünschten Verbindungen wurden vereinigt und aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in Methanol (10 ml) gelöst und auf eine präparative 41,1-mm · 25-cm Säule, vorgepackt mit 8u C-18 Umkehrphasen- Silicagel (Rainin Dynamax) aufgetragen. Die Säule wurde in Methanol : Acetonitril : Wasser: (37,5 : 37,5 : 25) konditioniert. Nach dem Probenauftrag wurde die Säule unter Verwendung eines linearen 180 min- Gradienten der folgenden Lösungsmittel entwickelt: Lösungsmittelsystem A 37,5 ml CH&sub3;OH, 37,5 ml CH&sub3;CN, 25 ml H&sub2;O, und Lösungsmittelsystem B enthielt 45 ml CH&sub3;OH, 45 ml CH&sub3;CN, 10 ml H&sub2;O. Fraktionen, die Spinosyn A enthielten, wurden vereinigt, zur Trocknene, gelöst in t-BuOH (5 ml) und lyophilisiert, um 778 mg reines Spinosyn A zu ergeben. Fraktionen, enthaltend Spinosyn D, wurden mit den D-enthaltenden Fraktionen aus 6 ähnlichen Trennungen vereinigt und wurden aufkonzentriert und chromatographiert, wie hierin beschrieben, unter Verwendung derselben Säule, aber verschiedener Lösungsmittel. Die Säule wurde konditioniert in Methanol : Acetonitril : Wasser: (40 : 40 : 20). Die Lösungsmittelsysteme, die verwendet wurden, um die Säule in einer linearen 180 min-Gradientenoperation zu entwickeln, waren: Lösungsmittelsystem A bestand aus 40 ml CH&sub3;OH, 40 ml CH&sub3;CN, 20 ml H&sub2;O und Lösungsmittelsystem B bestand aus 95 ml CH&sub3;OH, 95 ml CH&sub3;CN, 10 ml H&sub2;O. Fraktionen, die Spinosyn D enthielten, wurden vereinigt und aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in t-BuOH gelöst (5 ml) und lyophilisiert, um 212 mg Spinosyn D zu ergeben.
    • Beispiel 7 Isolierung der Bestandteile Spinosyn E, F, G, H und J und Spinosyn A 17-Psa
  • Gärungs-Nährmedium (8 l), hergestellt unter Verwendung von Verfahren, ähnlich den in Beispiel 4 beschriebenen, wurde wie in Beispiel 4 beschrieben behandelt. Fraktionen aus der LH-20 Sephadex-Säule, enthaltend die gewünschten Verbindungen, wurden mit entsprechenden Fraktionen von ähnlichen Gärungen vereinigt. Da die Bestandteile E, F, G, H, J und die Pseudoaglycone von A in sehr kleinen Mengen hergestellt wurden, waren zahlreiche Gärungen erforderlich, um ausreichende Mengen für eine weitere Reinigung bereitzustellen.
  • Ein Pool von kleinen Faktoren, der auf diese Art und Weise hergestellt wurde und der annähernd 1,6 Gramm an festem 15 Material enthielt, wurde auf eine HPLC- Säule (Rainin Dynamax) geladen, vorgepackt mit einem 8 Mikro C-18 Umkehrphasen-Silicagel (ODS), wie in Beispiel 4 beschrieben. Die Säule wurde in CH&sub3;OH : CH&sub3;CN : H&sub2;O (75 : 75 : 50) konditioniert, und der Gradient wurde von 100% des Lösungsmittels (A) bis 50% (B) gefahren mit den folgenden Lösungsmittelsystemen: Lösungsmittelsystem A 75% CH&sub3;OH, 75% CH&sub3;CN, 50% H&sub2;O und Lösungsmittelsystem B 95% CH&sub3;OH 95% CH&sub3;CN, 10% H&sub2;O wurden in 25 ml-Fraktionen gesammelt. Die folgenden Fraktionen 30 wurden vereinigt:
  • Ein Anteil von Pool 5 (100 ml) wurde zu einem Rückstand aufkonzentriert, gelöst in Methanol (1 ml), und auf eine 21,4 mm · 250 mm HPLC-Säule (Rainin Dynamax), wie in Beispiel 5 beschrieben, aufgetragen. Die Säule wurde konditioniert unter Verwendung von Lösungsmittelsystem (A) der folgenden Lösungsmittelsysteme: Lösungsmittelsystem A 30 : 30 : 40 CH&sub3;OH/CH&sub3;CN/H&sub2;O (1 N NH&sub4;OAc, pH 5) und Lösungsmittelsystem B 95 : 95 : 10 CH&sub3;OH/CH&sub3;CN/H&sub2;O (1 N NH&sub4;OAc, pH 5) wurden unter Verwendung eines linearen 120-Minuten- Gradienten von 100% des Lösungsmittels (A) bis 50% des Lösungsmittels (B) entwickelt, wobei 15 ml-Fraktionen bei 7,5 ml/min gesammelt wurden. Die Elution wurde bei 50% (B) für zusätzliche 60 Minuten fortgesetzt. Die folgenden Fraktionen wurden vereinigt:
  • Diese Pools wurden mit Pools aus anderen chromatographischen Läufen unter Verwendung von ähnlichen Ausgangsmaterialien vereinigt. Die vereinigten Pools wurden weiter unter Verwendung von Säulenchromatographie gereinigt, wie hierin beschrieben; auf HP-20 Säulen unter Verwendung von Standardverfahren entsalzt, und aufkonzentriert und lyophilisiert, um die folgenden Bestandteile zu ergeben:
  • * durch Massenspektrometrie
    • Beispiel 8 Herstellung von Spinosyn K, Spinosyn O und Spinosyn Y mit der Kultur NRRL 18743 A. Schüttelkolben-Gärunci
  • Die Kultur Saccharopolyspora spinosa NRRL 18743 wurde entweder als ein lyophilisiertes Pellet oder als eine in flüssigem Stickstoff gehaltene Kultur verwendet, um ein vegetatives Medium zu beimpfen, das die folgende Zusammensetzung besitzt:
    • Vegetatives Medium Bestandteil Menge (g)
  • Trypticase-Soja-Nährmedium * 30
  • Hefeextrakt 3
  • MgSO&sub4; H&sub2;O 2
  • Glucose 5
  • Maltose 4
  • Deionisiertes Wasser ad 1 l
  • Autoklavieren für 30 min bei 120ºC
  • * Baltimore Biological Laboratories, Cockeysville, MD
  • Schrägen oder Platten können durch Zugabe von 2,5% Agar zu dem vegetativen Medium hergestellt werden. Die beimpften Schrägen wurden bei 30ºC für etwa 10 bis 14 Tage inkubiert. Die reifen Schrägkulturen wurden mit einem sterilen Werkzeug, abgekratzt, um die Sporen zu lockern und die Mycelmatte zu entfernen und zu mazerieren. Etwa ein Viertel der gelockerten Sporen und der Wachstumskultur, die so erhalten wurde, wurden verwendet, um 50 ml eines vegetativen Aussaatmediums der ersten Stufe zu beimpfen. Alternativ kann das Medium der ersten Stufe aus einer Ampulle vom flüssigen Stickstoff beimpft werden.
  • Stammimpflösung für flüssigen Stickstoff wurde hergestellt durch Homogenisieren einer vegetativen Kultur, 1 : 1 (Volumen : Volumen) Verdünnen mit einem sterilen suspendierenden Mittel aus Glycerol : Lactose : Wasser (2 : 1 : 7) und Dispergieren in sterile Röhrchen (1,5 ml/Röhrchen). Das verdünnte Impfmedium wurde dann über flüssigem Stickstoff in geeigneten Lagerungsbehältern gelagert und als Arbeits-Stammimpfmedium für die Kultivierung von Schüttelkolben- Kulturen und als Fermenter-Saatimpfmedium verwendet.
  • Eine Ampulle aus dem flüssigen Stickstoff wurde schnell aufgetaut und 0,5 ml wurden verwendet, um 50 ml vegetatives Medium in 250 ml Weithals- Erlenmeyerkolben zu beimpfen. Die Kulturen wurden bei 32ºC für 48 Stunden auf einem Schüttler, der um einen zwei-Inch-Kreis (5,08 cm) bei 250 rpm umläuft, inkubiert.
  • Die inkubierten Kulturen (5% v/v Impflösung) wurde verwendet, um 25 ml eines Produktionsmediums zu beimpfen, das die folgende Zusammensetzung besitzt:
    • Produktionsmedium Bestandteil Menge (g)
  • Glucose 80
  • Peptonisierte Milch* 20
  • Baumwollsamenpulver** 30
  • Getreide-Einweichflüssigkeit 10
  • CaCO&sub3; (Massenproduktgüte) 5
  • Methyloleat 30
  • Leitungswasser ad 1 l
  • * Peptonisierter Milchnährstoff, Sheffield Products, Norwich, NY
  • ** Proflo, Graders Protein, Memphis TN
  • Das beimpfte Produktionsmedium wird in 250 ml Weithals-Erlenmeyerkolben bei 30ºC für 7 Tage auf einem Schüttler, der um einen zwei-Inch-Kreis bei 250 rpm umläuft, inkubiert.
    • B. Rührreaktor-Gärung
  • Um ein größeres Volumen an Impflösung bereitzustellen, wurden 10 ml des inkubierten Mediums der ersten Stufe, hergestellt wie oben beschrieben, verwendet, um 400 ml eines vegetativen Mediums der zweiten Stufe zu beimpfen, das dieselbe Zusammensetzung besitzt wie die des Mediums der ersten Stufe. Dieses vegetative Medium der zweiten Stufe besitzt eine Reinheit von > 98%. Spinosyn K enthaltende Poole der ersten präparativen HPLC- Trennung und der Nachreinigung von Spinosyn O wurden vereinigt, auf 200 ml aufkonzentriert und in derselben Art und Weise wie Spinosyn O entsalzt. Fraktionen, die > 98% an reinem Bestandteil K enthielten, wurden vereinigt, zur Trockene aufkonzentriert und aus t-BuOH lyophilisiert, um Spinosyn K (11,1 g; > 99% Reinheit) zu ergeben.
    • Beispiel 9 Isolierung von Spinosyn K, Spinosyn O und Spinosyn Y aus Stamm NRRL 18743
  • Ein Gärungs-Nährmedium (260 l) wurde hergestellt, wie im Wesentlichen im obigen Beispiel in Teil B beschrieben. Aceton (260 l) wurde zu der Gesamtnährlösung nach Einstellen des pH mit 5 N HCl auf 3,0 zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde durch einen Keramikfilter filtriert, um ein Filtrat (480 l) zu ergeben, das über das Wochenende unter Kühlung gehalten wurde. Das Nährlösung/Aceton-Filtrat wurde mit 25% NaOH auf pH 12 eingestellt, zweimal durch den Keramikfilter filtriert, ehe es auf eine Stahlsäule (10 l, 10 cm · 122 cm), die ein HP-20ss-Harz enthielt (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., Japan) bei einer Fließrate von 0,5 l/Minute, geladen wurde. Die Säule wurde mit CH&sub3;CN - CH&sub3;OH - 0,1% wässrige NH&sub4;OAc (eingestellt auf pH 8,1 mit NH&sub4;OH) (25 : 25 : 50; 20 l) gewaschen. Spinosyn K, O und Y wurden mit CH&sub3;CN - CH&sub3;OH 0,1% wässrige NH&sub4;OAc (eingestellt auf pH 8,1 mit NH&sub4;OH) (95 : 95 : 10; 30 l) bei einer Fließrate von 1 l/Minute eluiert. Das Eluat (30 l) wurde aufkonzentriert, in CH&sub3;OH wieder gelöst, wieder zur Trockene aufkonzentriert, in CH&sub3;OH (100 ml) wieder gelöst, dann in CH&sub3;CS (2 l) präzipitiert. Das resultierende Präzipitat wurde durch Filtration entfernt, mit CH&sub3;CN gewaschen und verworfen: das mit der Waschlösung (3 l) vereinigte Filtrat wurde zur Trockene aufkonzentriert. Der resultierende Rückstand wurde in Dichlormethan (50 ml) wieder gelöst und auf eine Säule (7,5 cm · 50 cm) aus Silicagel (EM-Grad 62. Maschenzahl 60-200) aufgetragen, die mit Acetonitril äqulibriert war. Die Säule wurde mit CH&sub3;CN (10 l), dann mit CH&sub3;CN - CH&sub3;OH (9 : 1 : 20 l), gefolgt von CH&sub3;CN - CH&sub3;OH (8 : 2 : 10 l) eluiert, wobei 1 l-Fraktionen gesammelt wurden. Die Fraktionen 11-30 wurden vereinigt und zur Trockene aufkonzentriert. Der resultierende Rückstand wurde in CH&sub3;OH (50 ml) gelöst und auf eine präperative Umkehrphasen-HPLC-Säule (Rainin Dynamax-60Å 8 um C18, 41,4 mm ID · 25 cm mit 41,1 mm · 5 cm Schutzmodul), die mit H&sub2;O - CH&sub3;OH - CH&sub3;CN äqulibriert war, aufgetragen (in 10 Läufen); (50 : 175 : 175, enthaltend 0,1% NH&sub4;OAc). Die Säule wurde bei einer Fließrate von 40 ml/Minute mit einem linearen 60 Minuten-Gradienten von H&sub2;O CH&sub3;OH - CH&sub3;CN (50 : 175 : 175, enthaltend 0,1 NH&sub4;OAc) bis H&sub2;O - CH&sub3;OH CH&sub3;CN (10 : 45 : 45, enthaltend 0,1 NH&sub4;OAc) eluiert. Der Fortschritt der Trennung wurde mit einem varibablen Wellenlängen-UV-Detektor, der auf 250 nm abgestimmt war, beobachtet. Die ersten drei gesammelten Peaks (10 Läufe gepoolt) entsprachen der Elution des kleinen Spinosyn Y (Pool 1, 1-L), Spinosyn K (Pool 2, 8-L) und Spinosyn 0 (Pool 3, 4-L). Spinosyn K wurde auf ein kleines Volumen aufkonzentriert, dann durch wiederholtes Chromatogrphieren auf derselben Säule entsalzt, wobei ohne Puffer eluiert wurde. Der dem UV-Absorptionspeak entsprechende Ausfluss wurde zur Trockene aufkonzentriert, in t-BuOH gelöst und lyophilisiert, um reines Spinosyn K (7,3 g) zu ergeben. Spinosyn O wurde entsalzt und in der gleichen Art und Weise lyophilisiert, um reines Spinosyn O (1,4 g) zu ergeben. Spinosyn Y wurde durch eine ähnliche Chromatographie (Rainin Dynamax-60A 8 um C18-Säule, 21,4 mm ID · 25 cm mit 21,4 mm · 5 cm Schutzmodul) entsalzt und in der gleichen Art und Weise lyophilisiert, um reines Spinosyn Y (46 mg) zu ergeben.
    • Beispiel 10 Präparation von Spinosyn J, Spinosyn L und Spinosyn M und Spinosyn N mit NRRL 18719
  • Die Kultur Saccharopolyspora spinosa NRRL 18719 wurde verwendet, um Spinosyn J, Spinosyn L, Spinosyn M und Spinosyn N zu erhalten.
    • A. Schüttelkolben-Gärung
  • Die Kultur Sccharopolyspora spinosa NRRL 18719 wurde entweder als ein lyophilisiertes Pellet oder als eine in flüssigem Stickstoff gehaltene Suspension verwendet, um ein vegetatives Medium zu beimpfen, das die folgende Zusammensetzung besitzt:
    • Vegetatives Medium Bestandteil Menge (g)
  • Trypticase-Nährmedium* 30
  • Hefeextrakt 3
  • MgSO&sub4;·7H&sub2;O 2
  • Glucose 5
  • Maltose 4
  • Deionisiertes Wasser ad 1 l
  • Autoklavieren für 30 min bei 120ºC
  • * Baltimore Biological Laboratories, Cockeysville, MD
  • Schrägen oder Platten werden durch Zugabe von 2,5% Agar zu dem vegetativen Medium hergestellt. Die beimpften Schrägen wurden bei 30ºC für etwa 10 bis etwa 14 Tage inkubiert. Die reifen Schrägkulturen wurden mit einem sterilen Werkzeug abgekratzt, um die Sporen zu lockern und die Mycelmatte zu entfernen und zu mazerieren. Etwa ein Viertel der gelockerten Sporen und der Wachstumskultur, die so erhalten wurde, wurden verwendet, um 50 ml eines vegetativen Aussaatmediums der ersten Stufe zu beimpfen. Alternativ kann das Medium der ersten Stufe aus einer Ampulle aus dem flüssigen Stickstoff beimpft werden.
  • Wenn die Kultur in flüssigem Stickstoff gehalten wird, werden die Ampullen durch Homogenisieren einer vegetativen Kultur hergestellt (48-72 Stunden Inkubation, 30ºC), 1 : 1 (Volumen : Volumen) mit einem sterilen suspendierenden Mittel verdünnt und in sterile Röhrchen (1,5 ml/Röhrchen) dispergiert. Das suspendierende Mittel enthält Lactose (100 g), Glycerol (200 ml) und deionisiertes Wasser (ad 1 l).
  • Eine Ampulle aus dem flüssigen Stickstoff wurde verwendet, um 100 ml vegetatives Medium in 500 ml Erlenmeyerkolben (oder 50 ml Medium in 250 ml Kolben) zu beimpfen. Die Kulturen wurden bei 30ºC für 48 Stunden auf einem Schüttler, der um einen zwei-Inch-Kreis (5,08 cm) bei 260 rpm umläuft, inkubiert.
  • Die inkubierte Kultur (10% v/v Impflösung) wurde verwendet, um 50 ml oder 100 ml eines Produktionsmediums, abhängig von der Größe des Erlenmeyerkolbens, zu beimpfen, das die folgende Zusammensetzung besitzt:
    • Produktionsmedium Bestandteil Menge (g)
  • Glucose 80
  • Peptonisierte Milch* 20
  • Baumwollsamenpulver** 30
  • Getreide-Einweichflüssigkeit 10
  • CaCO&sub3; (Massenproduktgüte) 5
  • Methyloleat 30***
  • Leitungswasser ad 1 l
  • pH-Wert mit 1 N NaOH auf pH 7,0 eingestellt, sterilisiert für 40 min bei 120ºC
  • * Peptonisierter Milchnährstoff, Sheffield Products, Norwich, NY 13815
  • ** Proflo, Traders Protein, Memphis TN 38108
  • *** Die Menge an Methyloleat betrug 30 ml
  • Das beimpfte Produktionsmedium wurde in 250 ml oder 500 ml Erlenmeyerkolben bei 30ºC für 7 bis 10 Tage auf einem Schüttler, der um einen zwei-Inch-Kreis bei 260 rpm umläuft, inkubiert.
    • B. Rührreaktor-Gärunci
  • Um ein größeres Volumen an Impflösung bereitzustellen, wurden 10 ml des inkubierten Mediums der ersten Stufe, hergestellt wie in Abschnitt A beschrieben, verwendet, um 400 ml eines vegetativen Mediums der zweiten Stufe zu beimpfen, das dieselbe Zusammensetzung besitzt, wie die des Mediums der ersten Stufe. Dieses vegetative Medium der zweiten Stufe wurde in einem 2 l Weithals-Erlenmeyerkolben für etwa 48 h bei 30ºC einem Schüttler, der um einen zwei-Inch-Kreis bei 260 rpm umläuft, inkubiert. Das inkubierte Medium der zweiten Stufe (2 l) wurde verwendet, um 80 bis 115 Liter eines sterilem Produktionsmediums zu beimpfen, hergestellt wie oben in Sektion A beschrieben.
  • Das beimpfte Produktionsmedium wurde in einem geschüttelten 165 l- Biorührreaktor für 7 Tage bis 10 Tage bei einer Temperatur von 30ºC vergärt. Die Luftmenge und die Rührgeschwindigkeit in dem gerührten Gefäß waren Computer-kontrolliert, um einen gelösten Sauerstoffgehalt bei oder über etwa 60% bis etwa 80% der Luftsättigung zu erhalten.
  • Die folgenden Tabellen veranschaulichen die Menge an Spinosyn J, Spinosyn L, Spinosyn M und Spinosyn N, die durch die Kultur NRRL 18719 hergestellt wurde.
    • Tabelle I
  • Menge der Spinosyn-Verbindung, die durch Schüttelkolben-Gärung mit der Kultur NRRL 18719 hergestellt wurde.
    • Faktor Menge (mg/ml)
  • Spinosyn J 661
  • Spinosyn L 133
  • Spinosyn M ND*
  • Spinosyn N ND*
  • * Nicht bestimmt durch HPLC-Assay
    • Tabelle II
  • Menge der Spinosyn-Verbindung, die durch Rührreaktor-Gärung mit der Kultur NRRL 18719 hergestellt wurde.
    • Faktor Menge (mgl)
  • Spinosyn J 5,282
  • Spinosyn L 2,487
  • Spinosyn M 136
  • Spinosyn N 71
    • Beispiel 11 Spinosyn J Spinosyn L, Spinosyn M und Spinosyn N mit der Kultur NRRL 18719
  • Ein Gärungs-Nährmedium (105 l), hergestellt wie oben beschrieben, wurde durch Zugabe von 5 N NaOH auf pH 10 eingestellt (anfänglich pH 6,8). Das resultierende Gemisch wurde durch einen Keramikfilter filtriert. Das Filtrat wurde verworfen, ein Gemisch aus Aceton und Wasser (1 : 1, 50 l) wurden zu den Mycel-Feststoffen zugegeben und das resultierende Gemisch wurde filtriert. Ein zweites Gemisch aus Aceton und Wasser (1 : 1, 50 l) wurde zu den Mycel- Feststoffen zugegeben, und der pH des resultierenden Gemischs wurde mit 25%iger Schwefelsäure auf pH 3,0 eingestellt. Das resultierende Gemisch wurde filtriert und ein drittes Gemisch aus Aceton und Wasser (1 : 1, 50 l) wurde zu den Mycel-Feststoffen zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde filtriert und die sauren Filtrate wurden vereinigt.
  • Die vereinigten Filtrate wurden mit Heptan extrahiert (10 l). Die Phasen wurden getrennt und die wässrige Phase wurde zu einer zweiten Portion Heptan (10 l) zugegeben. Der pH des resultierenden Gemischs wurde mit 5 N NaOH auf pH 10 eingestellt. Die resultierende Emulsion wurde mit 50 l Wasser verdünnt. Die Phasen wurden getrennt und die wässrige Phase wurde mit einer dritten Portion Heptan (10 l) extrahiert. Die Phasen wurden getrennt und der zweite und der dritte Heptanextrakt wurden vereinigt und auf ein Volumen von etwa 4 Liter aufkonzentriert. Das Konzentrat trennte sich beim Stehen in 3 Phasen: eine wässrige Phase, eine Emulsion und eine organische Phase. Die organische Phase wurde lyophilisiert, um 15,29 g eines rohen Produktes zu ergeben.
  • Das rohe Produkt wurde in Methanol (500 ml) gelöst, filtriert und im Vakuum zur Trockene aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in einer zweiten Portion Methanol (20 ml) gelöst und auf eine Säule aus LH-20 SEPHADEX (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Piscataway, NJ, 7,5 cm · 46 cm) aufgetragen, mit Methanol eluiert und in 25 ml-Fraktionen gesammelt. Unter Verwendung des HPLC-Systems wurden die Fraktionen analysiert, um zu bestimmen, welche Fraktionen die Spinosyn-Verbindungen enthielten. Die Fraktionen 18-50 wurden vereinigt und zur Trockene aufkonzentriert.
  • Der Rückstand wurde in einem Gemisch aus Methanol, Acetonitril und Wasser (5 : 5 : 1) gelöst und in 1 ml-Portionen auf eine präparative Umkehrphasen-HPLC- Säule (Rainin Dynamax-60A, C18, 41,4 mm · 300 mm, 8 mm Teilchen, 60Å- Pore, Woburn, MA) chromatographiert. Die Säule wurde mit einem Gemisch aus Methanol, Acetonitril und Wasser (87,5 : 87,5 : 25) eluiert, wobei Ammoniumacetat bis zu einer Endkonzentration von 0,1% (pH 7,6) zugegeben wurde, eluiert. Die Fraktionen wurden unter Verwendung eines HPLC-Systems analysiert, ähnliche Fraktionen wurden vereinigt und aufkonzentriert, um drei halbreine Konzentrate A, B und C zu ergeben.
  • Das halbreine Konzentrat C wurde erneut auf dem System, das im vorhergehenden Abschnitt beschrieben wurde, chromatographiert, wobei in jedem von 10 Läufen 200 ml geladen wurden. Die Fraktionen aus jedem der Läufe wurden vereinigt und aufkonzentriert, um die Präparationen C1 und C2 zu ergeben. Präparation C2 wurde ein drittes Mal chromatagraphiert; aber anstelle des 0,1%igen Ammoniumacetat (Entsalzungsschritt) wurde Wasser verwendet. Fraktionen, enthaltend Spinosyn L in mindestens 99,5% HPLC-Reinheit, wurden vereinigt und aufkonzentriert. Der Rückstand wurde aus Ethanol/Wasser (1 : 1) kristallisiert, um 2,4 g Spinosyn L zu ergeben.
  • Präparation C1 und das halbreine Konzentrat B wurden vereinigt und entsalzt, wie in dem vorhergehenden Abschnitt beschrieben (12 · 200 ml-Läufe); die gewünschte Verbindung wurde aber mit einem Gemisch aus Methanol, Acetonitril und Wasser (11 : 11 : 3) eluiert. Die Fraktionen, die Spinosyn J in einer HPLC-Reinheit von mindestens 99,5% enthielten, wurden vereinigt und aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in warmem t-Butanol gelöst und lyophilisiert, um 4,3 g Spinosyn zu ergeben.
  • Halbreines Konzentrat A wurde wie oben beschrieben chromatographiert, außer, dass die gewünschten Verbindungen mit einem Gemisch aus Methanol, Acetonitril und Wasser (37,5 : 37,5 : 25) eluiert wurden, wobei Ammoniumacetat bis zu einer Endkonzentration von 0,1% zugegeben wurde. Die Fraktionen aus jedem der Läufe (4) wurden vereinigt und aufkonzentriert, um die Präparationen A1, A2 und A3 zu ergeben.
  • Präparation A1 wurde unter Verwendung der oben beschriebenen Säule chromatographiert; die Säule wurde aber mit einem Gemisch aus Methanol, Acetonitril und Wasser (2 : 2 : 1) eluiert. Fraktionen, enthaltend Spinosyn M in mindestens 99,5% HPLC-Reinheit, wurden vereinigt und aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in t-Butanol gelöst und lyophilisiert, um 136 mg Spinosyn zu ergeben.
  • Die Präparation A2 wurde, wie in dem vorhergehenden Abschnitt beschrieben, chromatographiert und weiterverarbeitet, um 71 mg Spinosyn N zu ergeben.
    • Beispiel 12 Präparation von Spinosyn Q mit der Kultur NRRL 18823 A. Schüttelkolben-Gärung
  • Die Kultur Saccharopolyspora spinosa NRRL 18823 wurde entweder als ein lyophilisiertes Pellet oder als eine in flüssigem Stickstoff erhaltene Suspension verwendet, um ein vegetatives 5-Medium zu beimpfen, das die folgende Zusammensetzung besitzt:
    • Vegetatives Medium 1 Bestandteil Menge (g)
  • Trypticase-Nährmedium* 30
  • O Hefeextrakt 3
  • MgSO&sub4; 7 H&sub2;O 2
  • Glucose 5
  • Deionisiertes Wasser ad 1 l
  • Autoklavieren für 30 min bei 120ºC
  • * Baltimore Biological Laboratories, Cockeysville, MD
  • Das Medium der ersten Stufe kann mit einer Ampulle aus flüssigem Stickstoff beimpft werden. Solche Ampullen werden hergestellt durch Homogenisierung einer vegetativen Kultur (48-72 Stunden Inkubation, 30ºC), 1 : 1 (Volumen : Volumen) Verdünnen mit einem sterilen suspendierenden Mittel und Verteilen in sterile Röhrchen (1,5 ml/Röhrchen). Das suspendierende Mittel enthält Lactose (100 9), Glycerol (200 ml), und deionisiertes Wasser (ad 1 l). Eine Ampulle aus flüssigem Stickstoff wird verwendet, um 50 ml vegetatives Medium in 250 ml Weithals-Erlenmeyerkolben zu beimpfen. Die Kulturen werden bei 32ºC für 48 Stunden auf einem Schüttler, der um einen zwei-Inch-Kreis (5,08 cm) bei 250 rpm umläuft, inkubiert.
  • Die inkubierte Kultur (58 v/v Impflösung) wurde verwendet, um Produktionsmedium in einem 50 ml Erlenmeyerkolbens zu beimpfen, das die folgende Zusammensetzung besitzt:
    • Produktionsmedium Bestandteil Menge (g)
  • Glucose 80
  • Peptonisierte Milch* 20
  • Baumwollsamenpulver** 30
  • Getreide-Einweichflüssigkeit 10
  • CaCO&sub3; (Massenproduktgüte) 5
  • Methyloleat 30***
  • Leitungswasser ad 1 l
  • pH-Wert mit 1 N NaOH auf pH 7,0 eingestellt, sterilisiert für 40 min bei 120ºC
  • * peptonisierter Milchnährstoff, Sheffield Products, Norwich, NY
  • ** Proflo, Traders Protein, Memphis TN
  • *** Die Menge an Methyloleat betrug 30 ml
  • Das beimpfte Produktionsmedium wird in 250 ml Erlenmeyerkolben bei 30ºC für 7 Tage auf einem Schüttler, der um einen zwei-Inch-Kreis bei 250 rpm umläuft, inkubiert.
    • B. Rührreaktor-Gärung
  • Um ein größeres Volumen an Impflösung bereitzustellen, wurden 10 ml des inkubierten Mediums der ersten Stufe, hergestellt wie oben in Abschnitt A beschrieben, verwendet, um 400 ml eines Mediums der zweiten Stufe zu beimpfen, das dieselbe Zusammensetzung besitzt wie die des Mediums der ersten Stufe. Dieses vegetative Medium der zweiten Stufe wird in einem 2 l Weithals-Erlenmeyerkolben für etwa 48 h bei 32ºC auf einem Schüttler, der um einen zwei-Inch-Kreis bei 260 rpm umläuft, inkubiert. Das inkubierte Medium der zweiten Stufe (2 l), das so hergestellt wurde, wird verwendet, um 115 Liter eines sterilen Produktionsmediums zu beimpfen, hergestellt wie oben in Sektion A beschrieben.
  • Das beimpfte Produktionsmedium wurde in einem 165 l-Biorührreaktor für 7 Tage bei einer Temperatur von 30ºC zu vergärt. Die Luftmenge und die Rührgeschwindigkeit in dem gerührten Gefäß waren Computer-kontrolliert, um einen gelösten Sauerstoffgehalt bei oder über etwa 60% bis etwa 80% der Luftsättigung zu erhalten.
    • Beispiel 13 Isolierung von Spinosyn Q, Spinosyn R, Spinosyn S und Spinosyn T aus der Kultur NRRL 18823
  • Ein Gärungs-Nährmedium (100 l; Erntetiter an Spinosyn H, 303 pg/ml, an Spinosyn Q, 50 pg/ml), hergestellt, wie in dem obigen Beispiel beschrieben, wurde zwei Tage vor der Verarbeitung gekühlt. Aceton (100 l) wurde zu der Gesamtnährlösung nach Einstellen des pH mit 5 N HCl auf 3,0 zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde durch einen Keramikfilter filtriert, um ein Filtrat (170 l) zu ergeben, das über das Wochenende unter Kühlung gehalten wurde. Das Nährlösung/Aceton-Filtrat wurde auf pH 13 eingestellt und vor dem Laden auf eine Stahlsäule (10 l, 10 cm · 122 cm), enthaltend ein HP-20SS-Harz (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., Japan), bei einer Fließrate von 1 l/Minute, erneut durch den Keramikfilter filtriert. Die Säule wurde bei einer Fließrate von 1 l/Minute mit einem Gradienten, gemischt aus Lösungsmittel "A" (0,1% wässriges NH&sub4;OAc, eingestellt mit NH&sub4;OH auf pH 8,1) und Lösungsmittel "B" (CH&sub3;CN CH&sub3;OH 1 : 1), wobei 4 l-Fraktionen gesammelt wurden. Das Pumpensystem wurde programmiert, um einen Gradienten von 0 bis 50% B in einer Minute, gefolgt durch einen Gradienten von 50 bis 100% B in 90 Minuten, gefolgt von einer isokratischen Zustellung von 100% B für zusätzliche 15 Minuten zu erzeugen. Eine HPLC-Analyse zeigte an, dass die Fraktion 17 (4 l) überwiegend Spinosyn R mit zusätzlichen polareren Materialien und eine geringe Menge der Spinosyne T und H enthielt; Fraktionen 18-22 enthielten überwiegend Spinosyn H mit geringeren Mengen an Spinosyn R und Q und kleine Mengen an Spinosyn S und polareren Materialien; die Fraktionen 23-24 enthielten die Spinosyne H und Q. Eine HPLC-Analyse der Pools ließ auf die folgenden Mengen schließen: Spinosyn H 23,0 g; Spinosyn Q 3,4 g; Spinosyn R 2,0 g; Spinosyn S 0,2 g; Spinosyn T 0,2 g.
    • Beispiel 14 Rückgewinnung von Spinosyn Q, Spinosyn R, Spinosyn S und Spinosyn T aus einem Spinosyn Q-produzierenden Stamm
  • Gärungs-Nährmedium (85 l; Erntetiter an Spinosyn H, 302 pg/ml, an Spinosyn Q, 44 pg/ml), hergestellt als Spinosyn Q-produzierender Stamm, wurde vor der Bearbeitung über Nacht gekühlt. Aceton (90 l) wurde zu der Gesamtnährlösung nach Einstellen des pH mit 5 N HCl auf 3,0 zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde durch einen Keramikfilter filtriert, um ein Filtrat (176 l) zu ergeben, das über das Wochenende unter Kühlung gehalten wurde. Das Nährlösung/Aceton-Filtrat wurde mit 50%iger NaOH auf pH 13 eingestellt und vor dem Laden auf eine Stahlsäule (10 l, 10 cm · 122 cm), enthaltend ein HP- 20SS-Harz (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., Japan), bei einer Fließrate von 1 l/Minute, erneut durch den Keramikfilter (140 l Filtrat) filtriert. Die Säule wurde bei einer Fließrate von 1 l/Minute mit einem Gradienten, gemischt aus Lösungsmittel "A" (0,1% wässriges NH&sub4;OAc, eingestellt mit NH&sub4;OH auf pH 8,1) und Lösungsmittel "B" (CH&sub3;CN - CH&sub3;OH 1 : 1), wobei 4 l-Fraktionen gesammelt wurden. Das Pumpensystem wurde programmiert, um einen Gradienten von 0 bis 50% B in einer Minute, gefolgt durch einen Gradienten von 50 bis 100% B in 90 Minuten, gefolgt von einer isokratischen Zustellung von 100% B für zusätzliche 10 Minuten zu erzeugen. Eine HPLC-Analyse zeigte an, dass Pool 1 (Fraktionen 16-21; 24,5 l) die Spinosyne H (12,32 g) und Q (0,34 g) enthielt; Pool 2 (Fraktionen 22-25; 16 l) die Spinosyne H (4,66 g), Q (2,06 g), R, S und T enthielt.
    • A. Isolierung von reinem Bestandteil Q
  • Pool 2 wurde zur Trockene aufkonzentriert, in Dichlomethan (50 ml) wieder gelöst und auf eine Glassäule (5,5 cm · 30 cm) aufgetragen, die Silicagel enthielt (EM-Qualität 62, Siebmasche 60-200), und in Dichlomethan äquilibriert. Die Säule wurde mit Dichlormethan (3 l) gewaschen, dann mit Dichlormethan- Methanol (95,5) entwickelt, wobei 250 ml-Fraktionen gesammelt wurden. Die Fraktionen 3 bis 15 wurden vereinigt und bis auf einen Rückstand aufkonzentriert, dann in Ethanol/Wasser (400 ml) gelöst und bei Raumtemperatur über das Wochenende stehen gelassen. Die resultierenden Kristalle wurden mit kaltem Ethanol/Wasser (1 : 1) gewaschen und getrocknet, um 6,1 g getrocknete Kristalle zu ergeben, die nach HPLC-Analyse 68,7% Spinosyn H und 31,2% Spinosyn Q enthielten. Das getrocknete kristalline Material wurde in Tetrahydrofuran/Methanol (1 : 1) gelöst und in 12 Läufen auf eine präparative Umkehrphasen-HPLC-Säule (Rainin Dynamax 60A 8 um C18, 41,4 mm ID · 25 cm mit 41,4 mm · 5 cm Schutzmodul) aufgetragen. Die Säule wurde bei einer Fließrate von 50 I/Minute mit einem Gradienten, gemischt aus Lösungsmittel "A" (H&sub2;O - CH&sub3;CN; 30 : 35 : 35, enthaltend 0,1% NH&sub4;OAc) und Lösungsmittel "B" (H&sub2;O - CH&sub3;CN - CH&sub3;OH; 10 : 45 : 45, enthaltend 0,1% NH&sub4;OAc), geflutet. Das Pumpensystem wurde programmiert, um einen Gradienten von 50 bis 100% B in 60 Minuten zu erzeugen. Der Fortschritt der Trennung wurde mit einem variablen Wellenlängen-UV-Detektor, der auf 250 nm abgestimmt war, beobachtet.
  • Peak 1, enthaltend Spinosyn H (99%, 6 l), eluierte zuerst, gefolgt von Spinosyn Q. Die vereinigten Peaks 2 (enthaltend Spinosyn H 20%, Komponente Q 80%; 8 l) aller (12) Läufe wurden auf 500 ml aufkonzentriert, wieder auf dieselbe Säule aufgetragen und unter denselben Bedingungen der mobilen Phase in 5 Läufen eluiert. Pool 2 (2 l), enthaltend 99% reines Spinosyn Q, wurde durch Auftragen auf dieselbe Säule, die mit H&sub2;O - CH&sub3;OH - CH&sub3;CN (20 : 40 : 40) äqulibiriert war, entsalzt. Die Säule wurde mit H&sub2;O - CH&sub3;OH - CH&sub3;CN (10 : 45 : 45) eluiert, wobei 10 drei-Minuten-Fraktionen gesammelt wurden. Fraktionen 2 bis 7 wurden vereinigt, bis zu einem Rest aufkonzentriert und in warmem EtOH (80 ml) gelöst. Ein gleiches Volumen an H&sub2;O wurde zugegeben und die Lösung wurde über Nacht abgekühlt. Die resultierenden Kristalle wurden auf einem Filter gesammelt, mit kaltem EtOH - H&sub2;O (1 : 1) gewaschen, und getrocknet, um 1,5 g reines Spinosyn Q zu ergeben.
    • Beispiel 15 Insektizide Zusammensetzungen A. Wässrige Suspension
  • Spinosyn-Verbindung 12,5%
  • TERGITOL TMN-6 (nicht ionischer oberflächenaktiver Stoff) 1,0%
  • ZIOSYL 200 (Silica) 1,0%
  • AF-100 (auf Silicon basierendes Antischaummittel) 0,2%
  • Xanthanlösung (2%) 10,0%
  • MAKON 10 (10 mol Ethylenoxid-Nonylphenol oberflächenaktiver Stoff) 9,0%
  • Leitungswasser 66,3%
    • B. Emulgierbare Konzentrate
  • Spinosyn-Verbindung 12,4%
  • EXXON 200 (Naphtalen-Lösungsmittel) 83,6%
  • TOXIMUL H (Gemisch aus nicht ionischem/anionischem oberflächenaktivem Stoff) 2,0%
  • TOXIMUL D (Gemisch aus nicht ionischem/anionischem oberflächenaktivem Stoff) 2,0%
    • Beispiel 16 Formulierungen der Erfindung A. Futtermittel-Vormischung
  • Spinosyn-Verbindung 10%
  • Reishülsen 85
  • Leichtes Mineralöl 5
    • B. Futtermittel-Vormischung
  • Spinosyn-Verbindung 25%
  • Luzernemehl 60
  • Gemahlener Lehm 5
  • Melasse 10
    • C. Suspension
  • Spinosyn-Verbindung 30%
  • Naphtalensulfonat-Salz 5
  • Nicht ionischer oberflächenaktiver Stoff 5
  • Quarzstaub 1
  • Wasser 59
    • D. Lösung zum Auftropfen
  • Spinosyn-Verbindung 20%
  • Nicht ionischer oberflächenaktiver Stoff 0,8
  • Propylenglycol 15
  • Wasser 64,2
    • E. Lösung zum Auftropfen
  • Spinosyn-Verbindung 10
  • Nicht ionischer oberflächenaktiver Stoff 1
  • Leichtes Mineralöl 89
    • F. Injizierbare Lösung
  • Spinosyn-Verbindung 15%
  • Propylenglycol 85
    • G. Injizierbare Suspension
  • Spinosyn-Verbindung 25%
  • Propylenglycol 15
  • Wasser 60
    • H. Injizierbare Suspension
  • Spinosyn-Verbindung 30%
  • Polyvinylpyrrolidon 2
  • Wasser 68
    • Beispiel 17 Synthetische Modifikationen Teil A Rhamnose-modifizierte Derivate Beispiel A1 (5,6-Dihydro-Derivat der Verbindung 9-O-(2,3,4-Tri-O-ethyl-&alpha;-L- rhamnosyl)-Spinosyn A 9-Psa
  • Die Verbindung 9-O-(2,3,4-Tri-O-ethyl-&alpha;-L-rhamnosyl) Spinosyn A 9-Psa (106 mg, 0,137 mmol) wurde in 5 ml Toluol gelöst. Zu dieser Lösung wurde Tristriphenylphosphinrhodium(I)-chlorid (11,9 mg, 0,0128 mmol) zugegeben. Der Kopfraum des Kolbens wurde evakuiert und es wurde dreimal Stickstoff eingebracht. Es wurde evakuiert und dreimal Wasserstoff eingebracht. Der Kolben wurde mit einem Ballon unter Wasserstoff gehalten und die Reaktion wurde auf 110-120ºC erhitzt. Nach 3,5 h wurde der Kolben auf RT abgekühlt und der Wasserstoff evakuiert und durch Stickstoff ersetzt. Das Toloul- Lösungsmittel wurde verdampft und durch 20 ml Ether ersetzt. Die Etherlösung wurde mit 3 · 10 ml 1 N HCl extrahiert. Die sauren Extrakte wurden vereinigt und mit 10 ml 4 N NaOH neutralisiert. Die neutralisierte Suspension wurde mit 3 · 10 ml Ether extrahiert, die Etherextrakte wurden vereinigt, mit 20 ml Lauge gewaschen, über K&sub2;CO&sub3; getrocknet und im Vakuum verdampft. Das ergab die Verbindung 5,6-Dihydro-Derivat der Verbindung 9-O-(2,3,4-Tri-O-ethyl-&alpha;-L- rhamnosyl)-Spinosyn A 9-Psa, 39,4 mg, 36,8% partial ¹H-NMR &delta; 6,84 (1H, bs), 1,01 (1H, m), 0,68 (1H, m).
    • Beispiel A2 (5S,6R)-Epoxy-2'-O-(p-trifluormethyl)benzoyl-Spinosyn Q
  • Die Verbindung (5S,6R)-Epoxy-Spinosyn Q (406 mg, 0,543 mmol) wurden in trockenem CH&sub2;Cl&sub2; (10 ml) gelöst. DMAP (369 mg, 3,0 mmol) wurde zugeben, gefolgt von (p-Triflourmethyl)benzoylchlorid (623 mg, 445 ul, 2,98 mmol). Nach Rühren für 14 h bei RT wurde Triethylamin (2 ml) zugegeben und das Rühren wurde für 30 min fortgesetzt. Die Lösung wurde mit EtOAc (100 ml) und Toluol (30 ml) verdünnt, dann nacheinander mit Lauge, 5%igem wässrigem NaHCO&sub3; (2·) und Wasser (1·) gewaschen und über K&sub2;CO&sub3; getrocknet. Die organische Schicht wurde im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde über einer SiO&sub2;-Flash-Säule (80 g/EtOAc) gereinigt, um die Verbindung (5S,6R)-Epoxy-2'- O-(p-trifluormethyl)benzoyl-Spinosyn Q zu liefern; 391 mg, 78% IR &nu; 1728, 1664, 1324, 1272 cm&supmin;¹; ¹H-NMR (CDCl&sub3;) &delta; 8,12 (1H, bd: 8,2 H&sub2;), 7,67 (1H, bd: 8,2 Hz), 6,54 (1H, bs) 5,42 (1H, dd: 3,2, 1,8 Hz) 1,31 (3H, CH&sub3;, bs).
    • Beispiel A3 5,6-Dihydro-3'-O-ethyl-Spinosyn J
  • Die Verbindung 5,6-Dihydro-Spinosyn J (399 mg, 0,554 mmol) wurden in CH&sub2;Cl&sub2; (5,0 ml) gelöst. K&sub2;CO&sub3; (1,10 g) wurde zugeben. Der Reaktionskolben wurde in ein Wasserbad (10ºC) eingetaucht und 15%iges wässriges NaOH (10 ml) wurde unter heftigem Rühren zugegeben, gefolgt von Tetrabutylammoniumhydrogensulfat (0,90 g). 1-Iodethan (5,0 ml) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde bei RT unter N&sub2; für 72 h heftig gerührt. CH&sub2;Cl&sub2; (100 ml) und Wasser (50 ml) wurden zugegeben. Die Phasen wurden getrennt. Die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen (2·), über K&sub2;CO&sub3; getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde über einer SiO&sub2;-Flash-Säule (100 g/EtOAc) gereinigt. Eine Aufkonzentration der reinen Fraktionen lieferte die Verbindung 5,6-Dihydro-3'-O-ethyl-Spinosyn J; 217 mg, 52% ¹H-NMR (CDCl&sub3;) &delta; 6,72 (1H, bs), 3,57 (1H, m), 3,49 (2H, m) 2,13 (6H, 2 · CH&sub3;, s), 1,14 (3H, CH&sub3;, t: 7,3 Hz) ppm.
    • Beispiel A4 5,6-Dihydro-3'-O-n-propyl-Spinosyn J
  • Die Verbindung 5,6-Dihydro-Spinosyn J (86 mg, 0,11 9 mmol) wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (3,0 ml) gelöst. K&sub2;CO&sub3; (0,68 g) wurde zugeben. Der Reaktionskolben wurde in ein Wasserbad (10ºC) eingetaucht und 20%iges wässriges NaOH (6 ml) wurde unter heftigem Rühren zugegeben, gefolgt von Tetrabutylammoniumhydrogensulfat (0,81 g). 1-Iodbuthan (1,20 ml) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde bei RT unter N2 für 20 h heftig gerührt. CH&sub2;Cl&sub2; (100 ml) und Wasser (50 ml) wurden zugegeben. Die Phasen wurden getrennt. Die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen (2·), über K&sub2;CO&sub3; getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde über einer SiO&sub2;-Flash- Säule (25 g/EtOAc) gereinigt. Eine Aufkonzentration der reinen Fraktionen lieferte die Verbindung 5,6-Dihydro-3'-O-n-propyl-Spinosyn J; 55,0 mg, 60% ¹H-NMR (CDCl&sub3;) &delta; 6,78 (1H, bs), 3,55 (3H, m), 2,16 (6H, 2 · CH&sub3;, s) 0,89 (3 H, CH&sub3;, t: 7,3 Hz) ppm; ¹³C-NMR (CDCl&sub3;) &delta; 72,5 (O-CH&sub2;-), 23,9 (CH&sub2;) und 11,2 (CH&sub3;) ppm.
    • Beispiel A5 5,6-Dihydro-3'-O-n-butyl-Spinosyn J
  • Die Verbindung 5,6-Dihydro-Spinosyn J (93 mg, 0,129 mmol) wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (3,0 ml) gelöst. K&sub2;CO&sub3; (0,70 g) wurde zugeben. Der Reaktionskolben wurde in ein Wasserbad (10ºC) eingetaucht und 20%iges wässriges NaOH (10 ml) wurde unter heftigem Rühren zugegeben, gefolgt von Tetrabutylammoniumhydrogensulfat (0,66 g). 1-Iodbutan (2,0 ml) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde bei RT unter N&sub2; für 20 h heftig gerührt. CH&sub2;Cl&sub2; (100 ml) und Wasser (50 ml) wurden zugegeben. Die Phasen wurden getrennt. Die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen (2·), über K&sub2;CO&sub3; getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde über einer SiO&sub2;-Flash- Säule (25 g/EtOAc) gereinigt. Eine Aufkonzentration der reinen Fraktionen lieferte die Verbindung 5,6-Dihydro-3'-O-n-butyl-Spinosyn J; 63 mg, 63% ¹H- NMR (CDCl&sub3;) &delta; 6,78 (1H, bs), 3,57 (3H, m), 2,16 (6H, 2 · CH&sub3;, s) 0,87 (3H, CH&sub3;, t: 7,2 Hz) ppm; Elementaranalyse: für C&sub4;&sub4;H&sub7;&sub3;NO&sub1;&sub0; berechnet C 68,10, H 9,48, N 1,80; gefunden C 68,23, H 9,65, N 1,83.
    • Beispiel A6 5,6-Dihydro-3'-O-n-propyl-Spinosyn J Hemiglutarat-Salz
  • Die Verbindung 5,6-Dihydro-3'-O-n-propyl-Spinosyn J (88,3 mg, 0,115 mmol) wurde in 3 ml Aceton gelöst und eine Lösung von Glutarsäure (7,5 mg, 0,056 mmol) in 2 ml Aceton wurde zugeben. Die Lösung wurde bei RT über Nacht gerührt, Das Verdampfen des Lösungsmittel unter Vakuum ergab die Verbindung 5,6-Dihydro-3'-O-propyl-Spinosyn J Hemiglutarat-Salz; 86,1 mg. Anal. berechnet für C&sub4;&sub3;H&sub7;&sub1;NO&sub1;&sub0;¹/&sub2;(C&sub5;H&sub8;O&sub4;) C 65,99, H 9,12, N 1,69; gefunden C 65,30, H 10,00, N 1,77; Schmelzpunkt 74-84ºC.
    • Beispiel A7 5,6-Dihydro-2'-O-ethyl-Spinosyn H
  • Die Verbindung 5,6-Dihydro-Spinosyn H (462 mg, 0,64 mmol) wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (6 ml) gelöst. Kaliumcarbonatpulver (1,0 g) wurde zugeben. Der Reaktionskolben wurde in einem Wasserkühlbad (ca. 10ºC) platziert. Unter heftigem Rühren wurde eine 10%ige wässrige NaOH-Lösung (15 ml) zugegeben, gefolgt von festem NBu&sub4;HSO&sub4; (1,2 g). Ethyliodid (4,0 ml) wurde dann zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei RT unter Stickstoff für 46 Stunden heftig gerührt. Methylenchlorid (100 ml) und H&sub2;O (100 ml) wurden zugegeben. Danach wurden die Extraktionsphasen getrennt. Die organische Phase wurde über wasserfreiem K&sub2;CO&sub3; getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde über einer SiO&sub2;-Flash-Säule (80 g/EtOAc) gereinigt, um die reine Verbindung 5,6- Dihydro-2'-O-ethyl-Spinosyn H zu ergeben; 336 mg, 70% ¹H-NMR (CDCl&sub3;) &delta; 6,69 (1H, bs), 4,59 (1H, bs), 3,37 (3H, CH&sub3;, s) 3,30 (3H, CH&sub3;, s), 2,06 (6H, 2 · CH&sub3;, s) ppm.
    • Beispiel A8 5,6-Dihydro-2'-O-n-propyl-Spinosyn H
  • Die Verbindung 5,6-Dihydro-Spinosyn H (488 mg, 0,68 mmol) wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (8 ml) gelöst. Kaliumcarbonatpulver (1,1 g) wurde zugeben. Der Reaktionskolben wurde in ein Wasserkühlbad (ca. 10ºC) eingebracht. Unter heftigem Rühren wurde eine 10%ige wässrige NaOH-Lösung (20 ml) zugegeben, gefolgt von festem NBu&sub4;HSO&sub4; (0,95 g). n-Propyliodid (5,0 ml) wurde dann zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei RT unter Stickstoff für 48 h heftig gerührt. Methylenchlorid (100 ml) und H&sub2;O (100 ml) wurden zugegeben. Nach der Extraktion wurden die Phasen getrennt. Die organische Phase wurde über wasserfreiem K&sub2;CO&sub3; getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde über einer SiO&sub2;-Flash-Säule (80 g/EtOAc) gereinigt, um die reine Verbindung 5,6-Dihydro-2'-O-n-propyl-Spinosyn H zu ergeben; 335 mg, 69%: ¹H-NMR (CDCl&sub3;) &delta; 6,72 (1H, bs), 4,63 (1H, d: 1,3 H&sub2;), 3,41 (3H, CH&sub3;, s) 3,34 (3H, CH&sub3;, s), 2,10 (6H, 2 · CH&sub3;, s), 0,67 (3H, CH&sub3;, t: 7,4 Hz) ppm.
    • Beispiel A9 (5R,6S)-5,6-Epoxy-3'-O-n-propyl-Spinosyn L und (5S,6R)-5,6- Epoxy-3'-O-n-propyl-Spinosyn L
  • Die Verbindung 3'-O-n-Propyl-Spinosyn L (1,07 g, 1,38 mmol) wurde in Methylenchlorid (25 ml) unter einer Stickstoff-Atmosphäre gelöst und m-CPBA (50%, 1,88 g, 5,44 mmol) wurde zugegeben und die Reaktion wurde für 24 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethylacetat (50 ml) verdünnt und mit 10%igem wässrigem Natriumsulfit (3 · 25 ml) extrahiert, gefolgt von gesättigtem wässrigem Natriumbicarbonat (3 · 25 ml). Die organische Schicht wurde mit Lauge (25 ml) gewaschen und über wasserfreiem Natriumcarbonat getrocknet, um einen gelben Feststoff (0,80 g) zu ergeben. Das rohe Produkt wurde durch Umkehrphasen-HPLC (Methanol : 0,1%iges wässriges Ammoniumhydroxid, 90 : 10) gereinigt, um (5R,6S)-5,6-Epoxy-3'-O-n-propyl-Spinosyn L (26,6 mg, 2,4%) zu ergeben: partial ¹H-NMR (CDCl&sub3;) &delta; 6,68 (bs, 1H), 4,78 (s, 1H), 4,67 (m, 1H), 4,37 (d, 1H), 4,21 (q, 1H), 3,58 (m, 1H); und (5S,6R)- 5,6-Epoxy-3'-O-n-propyl-Spinosyn L (114 mg, 10,4%): partial ¹H-NMR &delta; 6,54 (bs, 1H), 4,78 (s, 1H), 4,63 (m, 1H), 4,38 (d, 1H), 4,20 (m, 1H), 3,60 (m, 1 H).
    • Beispiel A10 (5R,6S)-3'-Desoxy-5,6-epoxy-3'-methylen-Spinosyn J und (5S,6R)-3'-Desoxy-5,6-epoxy-3'-methylen-Spinosyn J
  • Die Verbindung 3'-Desoxy-3'-methylen-Spinosyn J (640 g, 0,896 mmol) wurde in Methylenchlorid (100 ml) gelöst. Die Lösung wurde auf 0ºC abgekühlt und m- CPBA (1,06 g, ca. 3 mmol) wurde in wenigen Portionen zugegeben. Rühren bei 0ºC wurde für 1 h fortgesetzt. Eine 10%ige wässrige NaHSO&sub3;-Lösung (100 ml) wurde zugegeben, gefolgt von Methylenchlorid (150 ml). Nach der Extraktion wurden die Phasen getrennt und die organische Phase wurde in der üblichen Art und Weise aufgearbeitet. Das rohe Produkt wurde über eine Silicagelsäule gereinigt und dann durch HPLC (88 : 12, MeOH/H&sub2;O) getrennt, um zu ergeben: a) die Verbindung (5R,6S)-3'-Desoxy-5,6-epoxy-3'-methylen-Spinosyn J (20 mg, 3%) weißer Feststoff: ¹H-NMR &delta; 6,64 (s, 1H), 5,23 (t, J = 1,7, 1H), 5,07 (d, J = 1,5, 1H), 4,69 (d, J = 1,6, 1H), 3,41 (s, 3H), 3,26 (s, 3H); und die Verbindung (5S,6R)-3'-Desoxy-5,6-epoxy-3'-methylen-Spinosyn J (170 mg, 26%) weißer Feststoff: ¹H-NMR &delta; 6,47 (s, 1H), 5,18 (s, 1H), 5,02 (s, 1H), 4,64 (s, 1H), 3,36 (s, 3H), 3,20 (s, 3H).
    • Beispiel A11 Ein Gemisch der Verbindung 5,6-Dihydro-3'-O-n-propyl-Spinosyn J (60%-85%) und der Verbindung 3'-O-n-Propyl-Spinosyn L (40%-15%)
  • Ein Gemisch der Verbindung 3'-O-n-Propyl-Spinosyn J (60%-85%) und der Verbindung 3'-O-n-Propyl-Spinosyn L (40%-15%) (8,35 g) wurde in Ethanol (250 ml) gelöst. Cyclohexen (60 ml) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde unter Stickstoff auf 0ºC abgekühlt und 10% Pd/C-Katalysator (7,0 g) wurden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde sanft unter Rückfluss für 3 h erhitzt. Dann wurde es auf 0ºC abgekühlt und Pyridin (2 ml) wurde zugegeben, der Katalysator wurde filtriert und das Filtrat wurde aufkonzentriert, dann in Ethylether (300 ml) gelöst. Die normale Aufarbeitung ergab ein Gemisch aus der Verbindung 5,6-Dihydro-3'-O-n-propyl-Spinosyn J (60%-85%) und der Verbindung 3'-O-n-Propyl-Spinosyn L (40%-15%) (7,40 g) als weißen Feststoff: ¹H-NMR &delta; 6,73 (s, ca. 0,8H), 6,63 (s, ca. 0,2H), 5,37 (s, ca. 0,2H), 0,84 (t, J = 7,4, 3H).
    • Beispiel A12 Ein Gemisch der Citratsalze der Verbindung 5,6-Dihydro-3'-O-n- propyl-Spinosyn J (60%-85%) und der Verbindung 3'-O-n-Propyl-Spinosyn L (40%-15%)
  • Ein Gemisch der Verbindung 5,6-Dihydro-3'-O-n-propyl-Spinosyn J (60%- 85%) und der Verbindung 3'-O-n-Propyl-Spinosyn L (40%-15%) (205 mg, 0,269 mmol) wurde in Aceton (8 ml) gelöst, und eine Lösung aus Citronensäuremonohydrat (56,7 mg, 0,269 mmol) in Aceton (3 ml) wurde zugegeben und die Lösung wurde für 2 h gerührt. Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung entfernt, um ein Gemisch der Citratsalze (211 mg) der Verbindung 5,6-Dihydro-3'-O-n-propyl-Spinosyn J (60%-85%) und der Verbindung 3'-O-n-Propyl-Spinosyn L (40%-15%) zu ergeben.
    • Beispiel A13 5,6-Dihydro-3'-O-isopropyl-Spinosyn J
  • 3'-O-Isopropenyl-Spinosyn J (280 mg, 0369 mmol) wurde über 20 min mit Triethylsilan (110 mg, 0,94 mmol) und TFA (340 mg, 3,0 mmol) umgesetzt, es folgte das Verfahren, das für die Verbindung 3'-O-Isopropyl-Spinosyn J (Beispiel A101) beschrieben wird. Nach einer HPLC-Trennung (90 : 10, MeOH/H&sub2;O) des rohen Produktes ergab dies 5,6-Dihydro-3'-O-Isopropyl-Spinosyn J (47 mg, 17%) als einen weißen Feststoff: ESI MS m/z 763 (M + 1).
    • Beispiel A14 5,6-Dihydro-3'-epi-N-formyl-3'-propyl-Spinosyn J und 5,6- Dihydro-3'-epi-3'-propyl-Spinosyn J
  • Die Verbindung 3'-Allyl-3'-epi-Spinosyn J (218 mg, 0,287 mmol) wurde in Ethanol (30 ml) gelöst. Die Lösung wurde unter Stickstoff auf 0ºC abgekühlt. 10% Pd/C (911 mg) wurde zugegeben, gefolgt von Cyclohexen (10 ml, vor der Verwendung nicht gereinigt). Das Gemisch wurde unter Stickstoff unter Rückfluss für 3 h erhitzt. Triethylamin (1 ml) wurde zugegeben. Nach der Aufarbeitung und Chromatographie auf einem Silicagel wurde das rohe Produkt mittels HPLC (94 : 6, MeOH/H&sub2;O) getrennt. Dies ergab a) 5,6-Dihydro-3'-epi-N- formyl-3'-propyl-Spinosyn J (28 mg, 12%) als einen gelblichen durchsichtigen Feststoff: ¹H-NMR &delta; 8,04 (s, 1H), 6,81 (s, 1H), 3,47 (s, 3H) 3,39 (s, 3H), 2,71 (s, 1,5H), 2,19 (s, ca. 1,5H). ESI MS m/z 766 (M + 1) und b) 5,6- Dihydro-3'-epi-3'-propyl-Spinosyn J (94 mg, 43%) als einen weißen Feststoff: ¹H-NMR &delta; 6,75 (s, 1H), 3,42 (s, 3H), 3,34 (s, 3H), 2,13 (s, 6H).
    • Beispiel A15 5,6-Dihydro-3'-O-vinyl-Spinosyn J
  • 5,6-Dihydro-Spinosyn J (1,85 g, 2,57 mmol) wurde in Butylvinylether (50 ml, im Überschuss) gelöst. Quecksilberacetat (4,2 g, im Überschuss) wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 4 h unter Rückfluss erhitzt. Festes Kaliumcarbonat (10 g) wurde dann zugegeben. Die übliche Aufarbeitung und Chromatographie auf Silicagel (Ethylacetat) ergab 5,6-Dihydro-3'-O-vinyl- Spinosyn J (1,02 g, 53%) als einen weißen Feststoff: ¹H-NMR &delta; 6,74 (s, 1H), 6,31 (dd, J, = 16,9, J&sub2; = 6,5, 1H), 4,30 (m, 2H), 3,90 (m, 2H), 3,38 (s, 3 H), 3,36 (s, 3H).
    • Beispiel A16 (14S)-5,6,13,14-Tetrahydro-3'-O-n-propyl-Spinosyn J
  • 5,6-Dihydro-3'-O-n-propyl-Spinosyn J (1,88 g, 2,47 mmol) wurde mit Lithiumtri-tert-butoxyaluminohydrid (97% Pulver, 2,40 g, 9,16 mmol) in Et&sub2;O (100 ml) über 3,5 Stunden umgesetzt, nach dem für (14S)-13,14-Dihydro-3'-O- ethyl-Spinosyn M angegebenen Verfahren. Nach Aufarbeitung und Chromatographie auf Silicagel (Ethylacetat) ergab dies (14S)-5,6,13,14- Tetrahydro-3'-O-n-propyl-Spinosyn J (1,440 g, 76%) als einen weißen Feststoff: ¹H-NMR &delta; 4,66 (d, J = 1,4, 1H), 4,64 (m, 1H), 3,41 (s, 3H), 3,34 (s, 3H), 2,09 (s, 3H), 1,00 (d, J = 6,6, 3H).
    • Beispiel A17 5,6-Dihydro-3-methoxymethyl-Spinosyn J
  • 3'-Methoxymethyl-Spinosyn J (243 mg, 0,319 mmol) und Palladium auf Aktivkohle (10%, 200 mg) wurden in einem 25 ml Rundkolben plaziert. Ethanol (7,25 ml) und Cyclohexen (1,75 ml, 17,3 mmol) wurden zugegeben und die resultierende Lösung wurde für 3 Stunden bei Rückflusstemperatur erhitzt. Das Gemisch wurde nacheinander durch Celite und ein PTFE-Filter (Gelman, Acrodisc 13 CR, 0,2 mm) filtriert. Das Gemisch wurde unter vermindertem Druck aufkonzentriert und der Rückstand wurde auf einer Umkehrphasensäule (Kromasil' C18, Silica ODS, 1001, 10 m, sphärisch, 25 cm · 20 mm) unter Verwendung von 85% MeOH und 15% Wasser (enthaltend 0,1% v/v konz. wässriges NH&sub4;OH) chromatographiert, um einen amorphen weißen Feststoff (68 mg, 28%) zu ergeben, MS m/z 764,7 (berechnet für M + H 764,5).
    • Beispiel A18 4"-N-Desmethyl-4"-N-(2-fluorethyl)-5,6-dihydro-3'-O-propyl- Spinosyn J
  • Diese Verbindung wurde gemäß des Verfahrens in Beispiel CZ aus 1-Brom-2- fluorethan (0,20 ml, 0,34 g, 2,7 mmol), Nal (0,04 g, 0,3 mmol), (i-Pr)&sub2;NEt (0,40 ml, 0,30 g, 2,3 mmol), 4"-N-Desmethyl-5,6-dihydro-3'-O-propyl-Spinosyn J (0,300 g, 0,401 mmol) und DMF (2 ml) hergestellt. MPLC (25 : 75 bis 50 : 50 EtOAc/Hexan) ergab 0,235 g (74%) 4"-N-Desmethyl-4"-N-(2-fluorethyl)-5,6- dihydro-3'-O-propyl-Spinosyn J als ein weißes Pulver.
    • Beispiel A19 4"-N-Desmethyl-5,6-dihydro-3'-O-propyl-Spinosyn J
  • F-TEDA (0,98 g, 2,8 mmol) wurde zu einer Lösung aus 5,6-Dihydro-3-O-n- propyl-Spinosyn J (0,94 g, 1,23 mmol) in CH&sub3;CN (10 ml) zugegeben. Nach 10 min wurde das Gemisch zwischen EtOAc und 0,1 M HCl aufgeteilt. Die organische Schicht wurde nacheinander mit NaHCO&sub3; und Lauge gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (MgSO&sub4;), filtriert und verdampft. MPLC (SiO&sub2;, 5 : 95 bis 10 : 90 MeOH/CH&sub2;Cl&sub2;) ergab 0,64 g (70%) 4"-N-Desmethyl-5,6- dihydro-3'-O-propyl-Spinosyn J als ein weißes Pulver (5,6-Dihydro-3'-O-n- propyl-Spinosyn J, 0,25 g (27%) wurde auch wiedergewonnen).
    • Teil C Modifikationen innerhalb des Forosamin-Substituenten Beispiel C1 5,6-Dihydro-4"-N-(2-methyl-1-propyl)-Spinosyn B
  • Diese Verbindung wurde gemäß des Verfahrens in Beispiel C81 aus 1-Iod-2- methylpropan (0,10 ml, 0,16 g, 0,87 mmol), (i-Pr)&sub2;NEt (0,23 ml, 0,17 g, 1,3 mmol), 5,6-dihydro-Spinosyn B (0,31 g, 0,43 mmol) und DMF (2 ml) hergestellt. MPLC (SiO&sub2;, 40 : 60 EtOAc/Hexan) ergab 0,16 g (48%) 5,6-dihydro-4"-N-(2- methyl-1-propyl)-Spinosyn B als ein weißes Pulver. Anal. berechnet für C&sub4;&sub4;H&sub7;&sub3;NO&sub1;&sub0;: C, 68,10; H, 9,48; N, 1,80. Gefunden: C, 68,10; H, 9,37; N, 1,87.
    • Beispiel C2 Verbindung 3",4"-Dehydro-4"-desamino-5,6-dihydro-Spinosyn A
  • 5,6-Dihydro-Spinosyn A N-Oxid (1,26 g, 1,68 mmol) wurde in trockenem THF (10 ml) gelöst. Die Lösung wurde auf -78ºC abgekühlt und Pyridin (5 ml) wurde zugegeben. Während des Rührens wurde Trifluoressigsäureanhydrid (1,8 ml, 2,67 g, 12,7 mmol) zugegeben. Nach 16 Stunden wurde Et&sub2;O (120 ml) zugegeben, das Gemisch wurde mit verdünnter Lauge (2·), dann mit 10%iger wässriger KHCO&sub3; (2·) extrahiert, über K&sub2;CO&sub3; getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde über einer SiO&sub2;-Flash-Säule (Et&sub2;O) getrennt, um 3",4"-Dehydro-4"-desamino-5,6-dihydro-Spinosyn A (122 mg, 10,5%) als einen weißen Feststoff zu ergeben: ¹H-NMR d 6,82 (bs, 1H), 5,61 (m, 1H), 5,53 (bd, J = 10 Hz, 1H), 4,66 (q, J = 6 Hz, 1H), 1,23 (d, J = 6,3 Hz, 3H); 1,19 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 1,15 (d, J = 7,0 Hz, 3H).
    • Beispiel C3 Verbindung 5,6-Dihydro-N-formyl-Spinosyn B und Verbindung 4"- desamino-5,6-dihydro-4"-keto-Spinosyn C
  • 5,6-Dihydro-Spinosyn A (1,43 g, 1,95 mmol) wurde in Methylenchlorid (25 ml) gelöst und Pyridin (6 ml) wurde zugegeben. Der Kolben wurde bei + 10ºC gekühlt. Brom (3,0 ml) wurde unter heftigem Rühren unter N&sub2; zugegeben. Nach 30 min wurde Wasser (2,0 ml) zugegeben und das Rühren wurde für 1 Stunde fortgesetzt. Et&sub2;O (200 ml) wurde zugegeben, das Gemisch wurde nacheinander extrahiert mit: Wasser, 10%igem wässrigem NaHSO&sub3;, Wasser und 10%igem wässrigem KHCO&sub3;, über wasserfreiem K&sub2;CO&sub3; getrocknet, filtriert und aufkonzentriert. Das rohe Produkt wurde in zwei gleiche Teile aufgeteilt. Ein Teil wurde durch Flash-Chromatographie (SiO&sub2;/Et&sub2;O) gereinigt und durch wiederholte RP-HPLC (C-18) (92 : 8, MeOH/H&sub2;O) getrennt, um a) 5,6-dihydro-N-formyl- Spinosyn B (230 mg, 31%) als einen weißen Feststoff: ¹H-NMR d 7,96 (bs), und 7,93 (bs, gesamt 1H), 6,74 (bs, 1H), 2,64 (s, 3H), 1,14 (d, J = 5,8 Hz, 3H), 1,05 (d, J = 6,9 Hz, 3H), 1,02 (d, J = 6,3 Hz, 3H) und b) Fraktionen, angereichert mit bis ca. 50% an 4"-Desamino-5,6-dihydro-4"-keto-Spinosyn C (168 mg, ca. 12%) zu ergeben. Das obige Verfahren wurde in einem Sfach größeren Maßstab wiederholt, was zu reinem 4"-Desamino-5,6-dihydro-4"-keto- Spinosyn C (212 mg, 3,1%) führte, einem weißen Feststoff: ¹H-NMR d 6,79 (bs, 1H), 4,90 (dd, J = 8,2 Hz, 2,5 Hz), 3,95 (q, J = 6,7 Hz); ¹³C NMR d 208,7, 203,2, 172,6, 149,6, 145,1, 100,9, 95,4, 17,6 (CH&sub3;), 16,1 (CH&sub3;), 15,3 (CH&sub3;), 9,2 (CH&sub3;).
    • Beispiel C4 Verbindung 4"-Desamino-5,6-dihydro-4"-(S)-hydroxy-Spinosyn C
  • 4"-Desamino-5,6-dihydro-4"-keto-Spinosyn C (192 mg, 0,273 mmol) wurde in trockenem Et&sub2;O (50 ml) gelöst. Die Lösung wurde auf 0ºC abgekühlt und Lithiumtri-t-butoxyaluminohydrid (97%, 145 mg, 0,55) wurde in einer Portion zugegeben. Das Rühren bei derselben Temperatur wurde für 15 min fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann vorsichtig mit Lauge gequencht. Ethylether (100 ml) wurde zugegeben und das Gemisch wurde mit wässriger 2 N NaOH (2·), dann mit 10%iger wässriger KHCO&sub3; extrahiert, über K&sub2;CO&sub3; getrocknet und aufkonzentriert. Das rohe Produkt wurde über einer SiO&sub2;-Flash-Säule (EtOAc) gereinigt und durch RP-HPLC (C-18) (92 : 8, MeOH/H&sub2;O) getrennt, um 4"- Desamino-5,6-dihydro-4"-(S)-hydroxy-Spinosyn C (91 mg, 47%) als einen weißen Feststoff zu ergeben: ¹H-NMR d 6,81 (bs, 1H), 4,43 (bd, J = 7,4 Hz, 1 H), 3,57 (m, 1H), 1,21 (d, J = 6,1 Hz, 6H), 1,12 (d, J = 6,9 Hz, 3H).
    • Beispiel C5 Verbindung 4"-Desamino-5,6-dihydro-4"-(S)-methoxy-Spinosyn C
  • 4"-Desamino-5,6-dihydro-4"-(S)-hydroxy-Spinosyn C (66 mg, 0,093 mmol) wurde in Methylenchlorid (1,5 ml) gelöst. Iodmethan (2,0 ml) wurde zugegeben, gefolgt von einer 40%igen wässrigen NaOH-Lösung (3,0 ml) und Tetrabutylphosphoniumbromid (320 mg). Das Reaktionsgemisch wurde bei RT/N&sub2; heftig gerührt und KOH-Pulver (0,60 g) wurde zugegeben. Das Rühren wurde für 2 Stunden fortgesetzt. Wasser (10 ml) und Et&sub2;O (100 ml) wurden zugegeben und das Gemisch wurde mit Wasser, dann mit 10%iger wässriger KHCO&sub3;-Lösung (2·) gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem K&sub2;CO&sub3; getrocknet, filtriert und im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde über einer SiO&sub2;-Flash-Säule (CH&sub2;Cl&sub2;-Et&sub2;O, 8 : 2) gereinigt, um 4"-Desamino-5,6- dihydro-4"-(S)-methoxy-Spinosyn C (40,0 mg, 59%) als einen weißen Feststoff zu liefern: ¹H-NMR &delta; 6,82 (bs, 1H), 4,43 (dd, J = 9,4 Hz, 1,9 Hz), 3,52 (s, 3 H), 3,46 (s, 3H), 3,45 (s, 3H), 3,32 (s, 3H), 1,25 (d, J = 6,3 Hz, 3H), 1,20 (d, J = 6,1 Hz, 3H), 1,14 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 0,77 (t, J = 7,4 Hz, 3H).
    • Teil D Modifikation der 13'- und 14'-Position am trizyklischen Anteil der Verbindung in Formel I Beispiel D1 (14S)-5,6,13,14-Tetrahydro-Spinosyn A
  • Die Reaktion wurde wie in Beispiel D5 beschrieben durchgeführt, wobei mit Spinosyn A (106,8 mg, 0,15 mmol) begonnen wurde. Dies ergab (14S)- 5,6,13,14-Tetrahydro-Spinosyn A (85,5 mg; 80% Ausbeute) als einen farblosen, leicht klebrigen Feststoff, FDMS, m/e (relative Intensität) 736 (M&spplus;, 100).
    • Beispiel D2 (14R)-5,6,13,14-Tetrahydro-Spinosyn A
  • Zu einer Lösung aus (14R)-13,14-Dihydro-Spinosyn A (210,3 mg, 0,29 mmol) in Benzol (9 ml) wurde Tris(triphenylphosphin)rhodium(I)chlorid (47,2 mg, 0,05 mmol) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde unter einer Atmosphäre von Wasserstoff platziert. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 4 Tage gerührt, dann wurde das Lösungsmittel bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck verdampft. Das Produkt wurde durch Chromatographie auf Silica gereinigt, wobei mit 5% Methanol in Dichlormethan eluiert wurde. Das Produkt wurde weiter gereinigt durch Chromatographie auf Silica, wobei mit 70% Ethylacetat in Dichlormethan eluiert wurde. Dies ergab (14R)-5,6,13,14- Tetrahydro-Spinosyn A (93,3 mg; 44% Ausbeute) als ein farbloses Glas, FDMS, m/e (relative Intensität) 735 (MH&spplus;, 100).
    • Beispiel D3 (14S)-5,6,13,14-Tetrahydro-3'-desoxy-Spinosyn J
  • Zu einer Lösung von 3'-Desoxy-Spinosyn J (108,8 mg, 0,16 mmol) in Ethylacetat (50 ml) wurde 5% Paladium auf Aluminiumoxid (100 mg) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde unter 60 psi Wasserstoff platziert und bei Raumtemperatur für 8 Stunden gerührt. Nach der Filtration des Katalysators wurde das Lösungsmittel bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck verdampft. Der Rückstand wurde durch Chromatographie auf Silica gereinigt, wobei mit 2,5% Ethanol in Ethylacetat eluiert wurde. Dies ergab (14S)- 5,6,13,14-Tetrahydro-3'-desoxy-Spinosyn J (50,5 mg; 45% Ausbeute) als einen weißen Feststoff, FDMS, m/e (relative Intensität) 707 (65), 706 (M&spplus;, 100).
    • Teil E Modifikation des Pseudoaglycons an der C17-Position des trizyklischen Anteils der Verbindung Formel 1 Beispiel E1 (5R,6R)-5-(2-Hydroxyethoxy)-6-brom-Spinosyn A 17-Psa
  • Zu einer Suspension von Spinosyn A (154,1 mg, 0,21 mmol) in Ethylenglykol (5 ml) wurde N-Bromsuccinimid (79,8 mg, 0,45 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 1,5 Stunden auf 80ºC erhitzt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Gemisch wurde mit Dichlormethan verdünnt und mit Wasser gewaschen. Das Dichlormethan wurde dann mit Lauge gewaschen, mit K&sub2;CO&sub3; getrocknet und bei Raumtemperatur verdampft. Die Produkte wurden durch Chromatographie auf Silica getrennt, mit 70% Ethylacetat in Hexan und dann mit 5% Methanol in Dichlormethan eluiert. Dies ergab die Verbindung a) Spinosyn A 17-Psa (41,7 mg; 34% Ausbeute) als ein farbloses Glas. (5R,6R)-5-(2-Hydroxyethoxy)-6-brom-Spinosyn A 17-Psa wurde weiter durch Chromatographie auf Silica gereinigt, wobei mit 70% Ethylacetat in Hexan eluiert wurde. Dies ergab die reine Verbindung b) (5R,6R)-5-(2- Hydroxyethoxy)-6-brom-Spinosyn A 17-Psa (50,2 mg; 33% Ausbeute) als ein farbloses Glas, FDMS, m/e (relative Intensität) 734 (65), 732 (MH&spplus;, 60), 189 (100).
    • Beispiel E2 (5S,6R)-5,6-Epoxy-17-O-trimethylsilyl-Spinosyn A 17-Psa
  • Zu einer Lösung von (5S,6R)-5,6-Epoxy-Spinosyn A 17-Psa (503,7 mg, 0,83 mmol) in Ether (20 ml) wurden Chlortrimethylsilan (21 l ml, 1,66 mmol) und Diisopropylethylamin (289 ml, 1,66 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 23 Stunden gerührt, dann wurden zusätzlich Chlortrimethylsilan (105 ml, 0,83 mmol) und Diisopropylethylamin (144 ml, 0,83 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für weitere 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde der Ether dekantiert und das zurückbleibende Präzipitat wurde mit frischem Ether pulverisiert. Die Ether wurden vereinigt, mit wässriger gesättigter NaHCO&sub3; gewaschen, mit K&sub2;CO&sub3; getrocknet und bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck verdampft. Das rohe Produkt wurde durch Chromatographie auf Silica gereinigt, wobei mit 50% Ethylacetat in Hexan eluiert wurde. Dies ergab (5S,6R)-5,6-Epoxy-17-O- trimethylsilyl-Spinosyn A 17-Psa (521,1 mg; 92% Ausbeute) als ein farbloses Glas, FDMS, m/e (relative Intensität) 679 (75), 678 (M&spplus;, 100), 190 (30), 100 (35).
    • Beispiel E3 (5S,6R)-5,6-Epoxy-Spinosyn A 17-Psa
  • Zu einer Lösung aus Spinosyn A 17-Psa (1,0 Gramm, 1,71 mmol) in Dichlormethan (45 ml) wurde m-Chlorperoxybenzoesäure (591,7 mg, 3,34 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 23 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde denn mit Dichlormethan verdünnt und mit wässrigem gesättigtem NaHCO&sub3; gewaschen, mit K&sub2;CO&sub3; getrocknet und bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck verdampft. Das Produkt wurde durch Chromatographie auf Silica gereinigt, wobei mit 15% Aceton in Dichlormethan eluiert wurde. Dies ergab (5S,6R)-5,6-Epoxy-Spinosyn A 17-Psa (1,04 Gramm; ~100% Ausbeute) als ein farbloses Glas, FDMS, m/e (relative Intensität) 607 (M&spplus;, 70), 190 (100), 101 (99).
    • Teil F Modifikation der C-5 und C-6-Positionen des trizyklischen Anteils der Verbindung Spinosyn A Beispiel F1 (5S,6R)-5-(2-Hydroxyethoxy)-6-brom-Spinosyn A
  • Zu einer Suspension aus Spinosyn A (1,0 Gramm, 1,37 mmol) und N- Bromsuccinimid (289,5 mg, 1,63 mmol) in Ethylenglykol (20 ml) wurde 5 N HCl (295 ul, 1,47 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch schlug ins gelbliche um und wurde bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden gerührt, während dieser Zeit verblasste die Farbe und es wurde farblos. Das Gemisch wurde in gesättigte wässrige NaHCO&sub3; geschüttet und mit Ether extrahiert. Der Ether wurde mit MgSO&sub4; getrocknet und bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck verdampft. Die ergab rohes (5R,6R)-5-(2-Hydroxyethoxy)-6-brom-Spinosyn A (896,8 mg; 75% Ausbeute). Die Verbindung konnte durch Chromatographie auf Silica gereinigt werden, wobei mit 5% Methanol in Dichlormethan eluiert wurde, was (5R,6R)-5-(2-Hydroxyethoxy)-6-brom-Spinosyn A als ein weißes Glas ergab, FDMS, m/e (relative Intensität) 873 (100), 871 (M&spplus;, 80).
    • Beispiel F2 (5S,6R)-5,6-dihydroxy-5,6-dihydro-Spinosyn A
  • Zu einer Suspension aus Spinosyn A (487,8 mg, 0,67 mmol) und Trimethylamin N-Oxid Dihydrat (108 mg, 0,97 mmol) in t-Butylalkohol (3 ml) mit Wasser (0,5 ml) wurde Pyridin (60 ml, 0,74 mmol) zugegeben, gefolgt von Osmiumtetroxid (0,1 M; 40 ml, 0,004 mmol). Das Reaktionsgemisch wurde unter einer Stickstoff-Atmosphäre unter Rückfluss für 19 Stunden erhitzt. Das dunkel gefärbte Gemisch wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt und in wässriges 20%iges NaHSO&sub3; geschüttet und mit Ether extrahiert. Der Ether wurde mit Lauge gewaschen, mit MgSO&sub4; getrocknet und bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck verdampft. Das Produkt wurde durch Chromatographie auf Silica gereinigt, mit 7% Methanol in Dichlormethan eluiert. Dies ergab (5S,6R)- 5,6-Dihydroxy-5,6-dihydro-Spinosyn A (282,1 mg; 55% Ausbeute) als einen beigen Feststoff, FDMS, m/e (relative Intensität) 766 (M&spplus;, 60), 765 (100).
    • Beispiel F3 (5S,6R)-Spinosyn A Carbonat
  • Zu einer Lösung aus (5S,6R)-5,6-Dihydroxy-Spinosyn A (85 mg, 0,11 mmol) und Ethylencarbonat (109,2 mg, 1,2 mmol) in Benzol (3 ml) wurde wasserfreies K&sub2;CO&sub3; (40,2 mg, 0,29 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde unter Rückfluss erhitzt. Nach 2,5 Stunden wurde das Gemisch auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Dichlormethan verdünnt. Das Dichlormethan wurde mit Wasser, Lauge gewaschen, mit K&sub2;CO&sub3; getrocknet und bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck verdampft. Das Produkt wurde durch Chromatographie auf Silica gereinigt, wobei mit 7% Methanol in Dichlormethan eluiert wurde. Dies ergab (5S,6R)-5-Spinosyn A Carbonat (65,1 mg; 75% Ausbeute) als einen weißen Feststoff, FDMS, m/e (relative Intensität) 792 (M&spplus;, 70), 791 (100).
    • Beispiel F4 (5S,6S)-5-Acetoxy-6-brom-Spinosyn A und (5R,6R)-5-Acetoxy-6- brom-5,6-dihydro-Spinosyn A
  • Zu einer Lösung aus Spinosyn A (511,7 mg, 0, 7 mmol) in Eisessig (5 ml) wurde N-Bromsuccinimid (152,9 mg, 0,86 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt und wurde dann langsam in 5 N NaOH (35 ml) geschüttet. Das wässrige Gemisch wurde dann mit NaCl abgesättigt und mit Ether extrahiert. Der Ether wurde mit Lauge gewaschen, mit K&sub2;CO&sub3; getrocknet und bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck verdampft. Dies ergab ein rohes Gemisch (544,2 mg). Das Gemisch konnte durch Chromatographie auf Silica gereinigt werden, wobei mit 7% Methanol in Dichlormethan eluiert wurde, und die Isomere konnten durch eine präparative HPLC auf einer C&sub1;&sub8;-Säule getrennt werden, wobei mit Acetonitril : Methanol : 0,1% NH&sub4;OAc (41 : 41 : 18 bis 42 : 42 : 16) in einem linearen 60 Minuten-Gradienten eluiert wurde. Dies ergab reines (5S,6S)-5-Acetoxy-6-brom-Spinosyn A, FDMS, mle (relative Intensität) 874 (50), 873 (98), 872 (48), 871 (M&spplus;, 100) und (5R,6R)-5-Acetoxy-6-brom-5,6-dihydro-Spinosyn A, FDMS, m/e (relative Intensität) 874 (60), 873 (90), 872 (45), 871 (M&spplus;, 100) als weiße Feststoffe.
    • Beispiel F5 5,6-Dibrom-Spinosyn A 17-Psa
  • Zu einer Lösung aus Spinosyn A (257,2 mg, 0,35 mmol) in Tetrachlorkohlenstoff (10 ml) wurde Brom (18 ml, 0,35 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 20 Stunden gerührt, während dieser Zeit verblasste die Reaktionsfarbe zu einem hellen gelb. Das Lösungsmittel wurde dann bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck verdampft aber eine TLC (eluiert mit 10% Methanol in Dichlormethan) zeigte, dass die Reaktion nicht vollständig war. Der Rückstand wurde in Tetrachlorkohlenstoff (10 ml) wieder gelöst und Brom (18 ul, 0,35 mmol) wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 3 Tage gerührt, während dieser Zeit verblasste die Reaktionsfarbe. Das Gemisch wurde dann mit Dichlormethan verdünnt und mit wässrigem 5%igem Natriumthiosulfat gewaschen. Das Dichlormethan wurde mit MgSO&sub4; getrocknet und bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck verdampft. Das Produkt wurde durch Chromatographie auf Silica gereinigt, wobei mit 3% Methanol in Dichlormethan eluiert wurde. Dies ergab reines 5,6- Dibrom-Spinosyn A 17-Psa (142,9 mg; 54% Ausbeute) als einen weißen Feststoff, FDMS, m/e (relative Intensität) 750 (M&spplus;, 10), 189 (30), 101 (100).
    • Beispiel F6 5,6-Dihydro-Spinosyn A (246088)
  • Zu einer Lösung aus Spinosyn A (504 mg, 0,69 mmol) in trockenem Benzol (30 ml) wurde Tris(triphenylphosphin)rhodiumchlorid (50,6 mg; 0,055 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde in einem atmosphärischen Hydrogenator unter Wasserstoff platziert. Nach magnetischem Rühren (die Temperatur wurde nicht überwacht) für 6 Stunden und dann einem Stehen für 19 Stunden unter Stickstoff-Atmosphäre, zeigte die NMR eines kleinen Aliquots, dass die Reaktion zu etwa 2/3 abgeschlossen war. Zusätzliches Tris(triphenylphosphin)rhodiumchlorid (50 mg; 0,055 mmol) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde wieder unter eine Wasserstoffatmophäre platziert. Nach magnetischem Rühren und zusätzlichen 24 Stunden wurde das Gemisch bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck verdampft. Der Rückstand wurde zunächst durch Flash-Chromatographie auf Silica mit 5% MeOH in Dichlormethan gereinigt, was das rohe Produkt (489,1 mg) als gelbes Glas ergab. Das Produkt wurde weiter durch Delta-Präp-Umkehrphasen-HPLC gereinigt, wobei mit CH&sub3;CN [38%] : MeOH [38%] : 0,05% NH&sub4;OAc [24%] mit einem Gradienten von CH&sub3;CN [45%] : MeOH [45%] : 0,05% NH&sub4;OAc [10%] eluiert wurde. Dies ergab 5,6-Dihydro-Spinosyn A (275,4 mg, 54% Ausbeute) als ein blasses gelbes Glas. Partial ¹H-NMR (CDCl&sub3;) &delta; 6,82 (1H, bs), 4,79 (1H, s), 4,61 (1H, m), 4,39 (1H, bd), 4,17 (1H, bq), 3,23 (1H, m), 2,90 (1H, m), 2,76 (1 H, m), 2,50 (1H, m), 0,97 (1H, m), 0,64 (1H, m).
    • Beispiel F7 (5S,6R)-5,6-Epoxy-Spinosyn A und (5R,6S)-Epoxy-Spinosyn A
  • Zu einer Lösung eines 6 : 1 Gemischs aus (5S,6R) und (5R,6S)-Expoxy-Spinosyn A wurden N-Oxid (2,6 Gramm; 3,4 mmol) in 300 ml Chloroform unter Stickstoff, Triphenylboran (823 mg; 3,4 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 6 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde dann mit Dichlormethan verdünnt und mit 1 N NaOH gewaschen. Das Dichlormethan wurde mit K&sub2;CO&sub3; getrocknet und unter vermindertem Druck verdampft, was ein weißes Glas (2,57 Gramm) ergab. Das Rohmaterial wurde durch Delta-Präp- Umkehrphasen-HPLC gereinigt, wobei mit MeOH [42%] : CH&sub3;CN [42%] : 0,25% NH&sub4;OAc [16%] für 22 Minuten und dann mit MeOH [45%] : CH&sub3;CN [45%] : 0,25% NH&sub4;OAc [10%] für 14 Minuten eluiert wurde. Dies ergab (5R,6S)- Epoxy-Spinosyn A (0,26 Gramm, 11%) partial ¹H-NMR (CDCl&sub3;) d 6,71 (1H, bs), 4,86 (1H, s), 4,71 (1H, m), 4,42 (1H, bd), 4,30 (1H, bq), 2,56 (1H, dt), 2,47 (1H, dd) und (5S,6R)-5,6-Epoxy-Spinosyn A (1,3 Gramm; 54% Ausbeute) partial ¹H-NMR (CDCl&sub3;) &delta; 6,59 (1H, bs), 4,86 (1H, s), 4,68 (1H, m), 4,42 (1H, bd), 4,23 (1H, bq), 2,59 (1H, dt), 2,45 (1H, dd), beide als weiße Feststoffe.
    • Beispiel F8 (5S,6R)-Epoxy-Spinosyn D und (5R,6S)-Epoxy-Spinosyn D
  • Die Reaktion wurde wie in Beispiel F8 beschrieben durchgeführt, ausgehend von einem 6 : 1-Gemisch aus (5S,6R) und (5R,6S)-Epoxy-Spinosyn D, N-Oxid (450 mg, 0,58 mmol). Dies ergab (5R,6S)-Epoxy-Spinosyn D (16,4 mg, 4%) partial ¹H-NMR (CDCl&sub3;) &delta; 6,71 (1H, bs), 4,59 (1H, m), 1,40 (3H, s) und (5S,6R)- Epoxy-Spinosyn D (82,1 mg; 19% Ausbeute) partial ¹H-NMR (CDCl&sub3;) &delta; 6,59 (1 H, bs), 4,85 (s), 4,68 (1H, m), 4,42 (1H, bd), 4,23 (1H, bq), 2,56 (1H, dt), 2,41 (1H, dd), 1,39 (3H, s), beide als weiße Feststoffe. Die geringen Ausbeuten sind auf einen Verlust bei der Umkehrphasen-HPLC-Säule zurückzuführen.
    • Beispiel F9 Gemisch aus (5S,6R) und (5R,6S)-Epoxy-Spinosyn A N-Oxid
  • Zu einer Lösung aus Spinosyn A (212,2 mg; 0,238 mmol; 82,1% Reinheit) in 10 ml Dichlormethan wurde m-Chlorperoxybenzoesäure (135 mg; 0,771 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 3 Tage gerührt. Die Reaktion wurde aufgeteilt zwischen gesättigtem NaHCO&sub3; und Dichlormethan. Die Phasen wurden getrennt und die wässrige Phase wurde mit frischem Dichlormethan extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt, mit MgSO&sub4; getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck verdampft, was einen weißen Feststoff (246,8 mg) ergab. Das rohe Produkt wurde durch Chromatographie auf Silica gereinigt, wobei mit einem Gradienten in einem Schritt mit 10% MeOH in Dichlomethan zugehend auf 20% MeOH in Dichlormethan eluiert wurde. Dies ergab ein 6 : 1-Gemisch aus (5S,6R) und (5R,6S)-Epoxy-Spinosyn A N-Oxid als ein weißer Feststoff (181,2 mg; ~100%); partial ¹H-NMR (CDCl&sub3;) &delta; 6,71 und 6,60 (1H, s), 4,87 (1H, s), 4,76 (m, 1H), 4,70 (1H, m), 4,32 (1H, m), 4,26 (1H, m), 3,42 (s), 3,31 (s), 3,24 (s).
    • Beispiel F10 (5S,6R) und (5R,6S)-Epoxy-Spinosyn D, N-Oxid
  • Die Reaktion wurde wie in Beispiel F10 beschrieben durchgeführt, ausgehend von Spinosyn D (517,9 mg, 0,70 mmol). Dies ergab ein 6 : 1-Gemisch aus (5S,6R) und (5R,6S)-Epoxy-Spinosyn D, N-Oxid (450,4 mg, 83% Ausbeute) als ein gelbes Glas. Partial ¹H-NMR (CDCl&sub3;) &delta; 6,71 und 6,60 (1H, bs), 1,40 (3H, s).
    • Beispiel F11 (5R,6R)-5,6-Dibrom-4"-keto-Spinosyn A und 5,6-Dibrom-Spinosyn B
  • Die Verbindung Spinosyn A (1,98 g, 2,70 mmol) wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (90 ml) gelöst. Triethylamin (10 ml) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde auf 0ºC abgekühlt. Brom (5,0 g, 27,8 mmol) wurde unter heftigem Rühren zugegeben. Nach 15 min wurde die Temperatur auf RT angehoben und das Rühren wurde für weitere 30 min fortgesetzt. Das Gemisch wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; (100 ml) verdünnt und nacheinander mit Wasser (2·) und 10%igem wässrigem NaHSO&sub3; (2·) gewaschen. Die organische Schicht wurde über K&sub2;CO&sub3; getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde auf einer SiO&sub2;-Flash-Säule (230-400 m, 120 g/EtOAc, dann EtOH) chromatographiert, um zu ergeben: a) Verbindung (5R,6R)-5,6-Dibrom-4"-keto-Spinosyn A (342 mg, 15%) IR (KBr) &nu; 1720, 1660, 740, 595 cm&supmin;¹; ¹H-NMR (CHCl&sub3;) d: 6,70 (1H, bs), 4,90 (1H, dd: 7,7, 2,9 Hz), 4,72 (3H, m: WH/2 = 12 Hz), 3,95 (1H, q: 6,6 Hz) und b) Verbindung (5R,6R)-5,6-Dibrom-Spinosyn B (1,22 g, 51%) IR (KBr) &nu; 3410, 1720, 1665 cm&supmin;¹; ¹H-NMR (CHCl&sub3;) &delta;: 6,71 (1H, bs), 4,87 (3H, m: WH/2 = 12 Hz), 2,5 (3H, CH&sub3;, s).
    • Beispiel F12 5,6-cis-Dihydroxy-5,6-dihydro-Spinosyn B (ein 2 : 1-Gemisch der (5S,6R)- beziehungsweise (5R,6S)-Isomere
  • Die Verbindung Spinosyn A (3,26 g, 4,45 mmol) wurde in Aceton (70 ml) gelöst. Wasser (30 ml) wurde zugegeben, gefolgt von N-Methylmorpholin-N-Oxid (645 mg, 5,5 mmol). Nachdem das N-Oxid gelöst war, wurde OsO&sub4; zugegeben (160 mg einer 2,5%igen Lösung in t-BuOH, 0,0015 mmol). Das Reaktionsgemisch wurde bei RT gerührt. Nach 24 Stunden wurden EtOAc (100 ml) und Benzol (100 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde nacheinander mit 10%iger wässriger NaHSO&sub3;-Lösung (1·), Wasser (1·) und einer 5%igen wässrigen NaHSO&sub3;-Lösung (1·) gewaschen. Die organische Schicht wurde über K&sub2;CO&sub3; getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde auf einer SiO&sub2;-Flash-Säule (EtOAc, darin 10% MeOH in EtOAc) getrennt, um ein Gemisch aus 5,6-cis-Dihydroxy-5,6-dihydro-Spinosyn A (ein 2 : 1-Gemisch der (5S,6R)- und (5R,6S)-Isomere (2,236 g, 66%) und ein Gemisch aus 5,6-cis- Dihydroxy-5,6-dihydro-Spinosyn B (ein 2 : 1-Gemisch der (5S,6R) und (5R,6S)- Isomere (339 mg, 10%) ¹H-NMR (CDCl&sub3;) d: 6,72 (1H, bs), 4,76 (1H, bs), 3,92 (0,65H, m), 3,85 (0,35 H, m), 2,43 (3H, CH&sub3;, s) zu ergeben.
    • Beispiel F13 Dichlorketenacetal von (5S,6R)-5,6-Dihydroxy-Spinosyn A (5S,6R)- 5,6-Bis(trichloracetoxy)-Spinosyn A
  • (5S,6R)-5,6-Dihydroxy-5,6-dihydro-Spinosyn A (376 mg, 0491 mmol) wurde in trockenem CH&sub2;Cl&sub2; (10 ml) gelöst. Pyridin (3 ml) wurde zugegeben, gefolgt von N,N-Dimethylaminopyridin (600 mg), Das Reaktionsgemisch wurde bei RT unter Stickstoff gerührt und Trichloracetylchlorid (1,00 ml, im Überschuss) wurde zugegeben. Nach 1 Stunde wurde das Gemisch mit EtOAc (100 ml) und PhH (50 ml) verdünnt. Die Lösung wurde nacheinander mit Lauge (1·) und 5%igem wässrigem NaHCO&sub3; (2·) gewaschen und über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Die organische Schicht wurde im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde durch eine Flash-Säulenchromatographie auf einer Flash-SiO&sub2;-Säule (60 g/EtOAc) getrennt, um zu ergeben: a) die Verbindung Dichlorketenacetal von (5S,6R)-5,6- Dihydroxy-Spinosyn A (104 mg, 25%) IR (CHCl&sub3;) &nu;: 1805, 1722, 1660 cm&supmin;¹; ¹H-NMR (CDCl&sub3;) d: 6,62 (1H, bs), 4,96 (1H, dd: 7,8, 3,3 Hz), 4,85 (1H, dd: 7,8, 3-9 Hz), 2,20 (6H, 2 · CH&sub3;, s) und Verbindung b) (5S,6R)-5,6- Bis(trichloracetoxy)-Spinosyn A (129 mg, 25%) IR (CHCl&sub3;) &nu;: 1772, 1720, 1662 cm&supmin;¹; ¹H-NMR (CDCl&sub3;) 6,67 (1H, bs), 5,66 (1H, m: WH/2 = 8 Hz), 5,50 (1H, dd: 5,7, 3,3 Hz) 2,19 (6H, 2 · CH&sub3;, s) ppm; Cl MS m/z 1056 (M + 1).
  • Verunreinigt, was ohne weiteres aus Et&sub2;O kristallisierte, um die reine Verbindung 5-Keto-6,7-en-6-hydroxy-Spinosyn A (1,01 g, 67%) IR (CHCl&sub3;) &nu; 1720, 1665, 1648 cm&supmin;¹; ¹H-NMR (CDCl&sub3;) d: 6,68 (1H, bs), 3,84 (1H, dd: 9,2, 9,0 Hz), 2,13 (6H, 2 · CH&sub3;, s); Cl MS m/z 762 (M + 1) zu ergeben.
    • Beispiel F14 (5R,6R)-5,6-Dibrom-Spinosyn A
  • Die Verbindung Spinosyn A (1,59 g, 2,17 mmol) wurde in trockenem CH&sub2;Cl&sub2; (30 ml) gelöst. Die Lösung wurde bei RT unter Stickstoff gerührt. Phenylselenenylbromid (98%, 1,05 g, 4,34 mmol) wurde in einer Portion zugegeben. Nach 30 min Rühren wurde die Lösung auf 0ºC augekühlt. MCPBA (2,5 g, ca. 7 mmol) wurde zugegeben. Das Rühren wurde für 30 min bei 0ºC fortgesetzt. Triethylamin (3 ml) wurde dann zugegeben und nach 10-minütigem Rühren wurde das Gemisch mit Benzol (150 ml) und EtOAc (50 ml) verdünnt. Die Lösung wurde nacheinander mit 10%igem wässrigem NaHSO&sub3; (2·), mit Lauge (1·) und 5%igem wässrigem NaHSO&sub3; (2·) gewaschen. Die organische Phase wurde über K&sub2;CO&sub3; getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Säulenchromatographie (SiO&sub2;/EtOAc) und dann durch HPLC (C-18 beschichtet, 6 m, 100 A gepackt; 5% H&sub2;O in MeOH als mobile Phase) gereinigt. Reine Fraktionen ergaben a) nicht umgesetzte Verbindung Spinosyn A und b) die Verbindung (5R,6R)-5,6-Dibrom-Spinosyn A (297 mg, 16%) ¹H-NMR (CDCl&sub3;) d: 6,69 (1H, bs), 4,74 (3H, m: WH/2 = 12 Hz), 2,17 (6H, 2 · CH&sub3;, s) ppm; Cl MS m/z 894 (M + 3, 892 (M + 1).
    • Beispiel F21 (5S)-5,6-Dihydro-5-hydroxy-Spinosyn A, (6S)-5,6-Dihydro-6- hydroxy-Spinosyn A, (6R)-5,6-Dihydro-6-hydroxy-Spinosyn A
  • Quecksilbertrifluortriacetat (1,12 g, 2,62 mmol) wurde in 30 ml THF : Wasser, 2 : 1, (v/v) suspendiert. Zu dieser gelben Suspension wurde die Verbindung Spinosyn A (0,98 g, 1,34 mmol) zugegeben. Die Reaktion wurde dann bei RT für 30 min gerührt. Die Reaktion wurde mit 7 ml 1 N NaOH behandelt, gefolgt von 2,5 ml 0,5 M NaBH&sub4; in 3 M NaOH. Die Reaktion wurde schwarz, was ein Präzipitat unterstützte. Man ließ sich die Feststoffe auf den Boden des Kolbens absetzen und dekantierte die Flüssigkeit in einen Scheidetrichter ab, der 50 ml Ether enthielt. Die Schichten wurden getrennt und wässrig mit 2 · 25 ml Ether extrahiert. Die Etherextrakte wurden vereinigt, mit 30 ml gesättigtem wässrigem NaHCO&sub3; gewaschen, über K&sub2;CO&sub3; getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde durch Mitteldruck-Flüssigkeitschromatographie (230-400 m SiO&sub2; CH&sub2;Cl&sub2; : MeOH, 95 : 5 (v/v) gereinigt, um zu ergeben: Verbindung a) (5S)- 5,6-Dihydro-5-hydroxy-Spinosyn A (349,7 mg, 30,4%) partial ¹H-NMR (CDCl&sub3;) d: 6,80 (1H, bs), 4,00 (1H, m), 2,95 (1H, m) 0,68 (1H, m); partial ¹³C-NMR (CDCl&sub3;) d 148,64, 67,40, 45,79, 43,01, 35,16 und ein Gemisch der Verbindungen (6S)-5,6-Dihydro-6-hydroxy-Spinosyn A und (6R)-5,6-Dihydro-6- hydroxy-Spinosyn A. Die Verbindungen (6S)-5,6-Dihydro-6-hydroxy-Spinosyn A und (6R)-5,6-Dihydro-6-hydroxy-Spinosyn A wurden mittels HPLC (C-18 beschichtet, 6 m, 10A gepackt; 10% H&sub2;O in MeOH als mobile Phase) getrennt, um die Verbindung b) (6R)-5,6-Dihydro-6-hydroxy-Spinosyn A (7,1 mg, 1%) partial ¹H-NMR (CDCl&sub3;) d: 6,86 (1H, bs), 3,48 (1H, m), 2,92 (1H, m) 0,85 (1 H, m), ¹³C-NMR (CDCl&sub3;) d 148,64, 72,66, 44,86, 43,96 34,52 und die Verbindung c) (6S)-5,6-Dihydro-6-hydroxy-Spinosyn A (11,4 mg, 1%) partial ¹H- NMR (CDCl&sub3;) d 6,80 (1H, bs), 4,11 (1H, m), 2,78 (1H, m) 1,40 (1H, m), ¹³C- NMR (CDCl&sub3;) d 148,64, 66,52, 38,18, 37,65, 32,95 zu ergeben.
    • Beispiel F16 (5R,6R)-5-Acetoxy-6-thiomethoxy-Spinosyn A
  • Die Verbindung Spinosyn A (2,64 g, 3,61 mmol) wurde in CH&sub3;CN (trocken, Gehalt 1% Diethylsulfid; 30 ml) gelöst. Zu dieser Lösung, die bei RT gehalten wurde, wurde Dimethyl(methylthio)sulfoniumtetrafluorborat (1,10 g, 5,61 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde für 10 min beschallt (50 W Ultraschall- Reiniger). Wasserfreies Natriumacetatpulver (2,5 g, im Überschuss) wurde dann zugegeben und das Gemisch wurde für 1 Stunde beschallt. Die Lösung wurde mit EtOAc (50 ml) und PhH (100 ml) verdünnt und nacheinander mit 5%igem wässrigem K&sub2;CO&sub3;, 5%igem wässrigem NaHCO&sub3; und H&sub2;O gewaschen. Die organische Schicht wurde über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Säulenchromatographie auf SiO&sub2; und dann durch präparative HPLC (C-18 beschichtet, 6 m, 100 A gepackt; 8% H&sub2;O in MeOH als mobile Phase) gereinigt. Reine Fraktionen ergaben die Verbindung (5R,6R)-5-Acetoxy-6-thiomethoxy-Spinosyn A (2,07 g, 68%) ¹H- NMR (CDCl&sub3;) d: 6,69 (1H, bs), 5,31 (1H, dd: 2,4, 2,2 Hz), 2,16 (6H, 2 · CH&sub3;, s), 2,11 (3H, CH&sub3;, s), 2,01 (3H, CH&sub3;, s); Elementaranalyse für C&sub4;&sub4;H&sub7;&sub1;NO&sub1;&sub2;S berechnet C 63,06, H 8,54, N 1,67; gefunden C 63,15, H 8,77, N 1,76.
    • Beispiel F17 (5R,6R)-5-Acetoxy-6-methylsulfonyl-Spinosyn A
  • Die Verbindung (5R,6R)-5-Acetoxy-6-thiomethoxy-Spinosyn A (1,05 g, 1,25 mmol) wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (100 ml) gelöst. Die Lösung wurde auf 0ºC abgekühlt und unter Rühren wurde m-CPBA (50%, 1,95 g, 5,6 mmol) in einigen Portionen zugegeben. Nach 40 min wurde das Reaktionsgemisch mit CH&sub2;Cl&sub2; (50 ml) verdünnt. Die Lösung wurde nacheinander mit 10%igem wässrigem NaHSO&sub3; (2·), Wasser (1·) und 5%igem wässrigem NaHCO&sub3; (2·) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde durch eine Flash-Säulenchromatographie (230-400 m SiO&sub2;/EtOAc, dann 10% EtOH in EtOAc) gereinigt, um die Verbindung (5R,6R)-5-Acetoxy-6-methylsulfonyl-Spinosyn A (966 mg, 89%) IR (CHCl&sub3;) &nu; 1740, 1724, 1662, 1320, 1135 cm&supmin;¹; ¹H-NMR (CDCl&sub3;) d: 6,57 (1H, bs), 5,52 (1H, dd: 4,5, 4,0 Hz), 2,87 (3H, CH&sub3;, s), 2,17 (6H, 2 · CH&sub3;, s), 1,98 (3H, CH&sub3;, s) zu ergeben.
    • Beispiel F18 (5R,6R)-6-Brom-5-hydroxy-Spinosyn J
  • Die Verbindung Spinosyn A (1,33 g, 1,82 mmol) wurde in DMSO (15 ml) gelöst. Wasser (5 ml) wurde zugegeben, was eine Präzipitation verursachte. Unter Rühren wurde konz. H&sub2;SO&sub4; (1,8 mmol) eingeführt. Das Präzipitat löste sich sofort auf. Die Lösung wurde auf 0ºG abgekühlt und N-Bromsuccinimid (322 mg, 1,8 mmol) wurde zugegeben. Nachdem für 15 min bei 0ºC gerührt wurde, wurde das Reaktionsgemisch auf 50 ml gesättigtes wässriges NaHCO&sub3; geschüttet. Das Gemisch wurde mit Et&sub2;O (3·) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Lauge gewaschen, über K&sub2;CO&sub3; getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde durch Umkehrphasen-HPLC (C-18 Dynamax-Säule, 20% Wasser in MeOH als mobile Phase) gereinigt, um die Verbindung (5R,6R)-6-Brom-5-hydroxy-Spinosyn J (1,30 g, 86%) Cl MS m/z 828 (M + 1); ¹H-NMR (CDCl&sub3;) d: 6,56 (1H, bs), 4,24 (2H, m: WH/2 = 14 H&sub2;), 3,85 (1H, dd: 3,5, 3,5 Hz), 2,05 (6H, 2 · CH&sub3;, s) zu ergeben.
    • Beispiel F19 5,6-Dihydro-Spinosyn A 9-Psa
  • Die Verbindung Spinosyn A 9-Psa (46,5 mg, 0,0856 mmol) wurde in 5 ml Toluol gelöst. Zu dieser Lösung wurde Tris-triphenyiphosphinrhodium(I)chforid (8,5 mg, 0,0092 mmol) zugegeben. Der Kopfraum des Kolbens wurde evakuiert und drei Mal wurde Stickstoff eingeführt. Es wurde drei Mal evakuiert und Wasserstoff eingeführt. Der Kolben wurde mit einem Ballon unter Wasserstoff gehalten und die Reaktion wurde auf 110-120ºC erhitzt. Nach 3,5 Stunden wurde der Kolben auf RT abgekühlt und der Wasserstoff wurde evakuiert und durch Stickstoff ersetzt. Das Toluol-Lösungsmittel wurde verdampft und durch 20 ml Ether ersetzt. Die Etherlösung wurde mit 3 · 10 ml 1 N HCl extrahiert. Die sauren Extrakte wurden vereinigt und mit 10 ml 4 N NaOH neutralisiert. Die neutralisierte Suspension wurde mit 3 · 10 ml Ether extrahiert, die Etherextrakte wurden vereinigt, mit 20 ml Lauge gewaschen, über K&sub2;CO&sub3; getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert. Dies ergab die Verbindung 5,6-Dihydro-Spinosyn A 9- Psa (29,5 mg, 63%) partial ¹H-NMR (CDCl&sub3;) d 6,84 (1H, bs), 1,01 (1H, m), 0,68 (1H, m).
    • Beispiel F20 5,6-Dihydro-Spinosyn A 17-Psa
  • Das Verfahren, wie oben in Beispiel F25 beschrieben, wurde auf die Verbindung Spinosyn A 17-Psa (270,8 mg, 0,458 mmol) mit 32,8 mg [(Ph)&sub3;P]&sub3;RhCl angewendet. Nach dem Verdampfen des Toluols wurde die Verbindung direkt durch Mitteldruck-Flüssigkeitschromatographie (230-400 m SiO&sub2;, CH&sub2;Cl&sub2; : MeOH, 95 : 5 (v/v) gereinigt. Dies ergab die Verbindung 5,6-Dihydro-Spinosyn A 17-Psa (188,1 mg, 69,2%) partial ¹H-NMR (CDCl&sub3;) d 6,84 (1H, bs), 3,63 (1H, m), 1,02 (1H, m), 0,68 (1H, m); partial ¹³C-NMR (CDCl&sub3;) d 149,28, 72,48, 46,55, 27,00.
    • Beispiel F21 5,6-Dihydro-Spinosyn J
  • Das Verfahren, wie oben in Beispiel F25 beschrieben, wurde angewendet auf die Verbindung Spinosyn J (1,00 g, 1,39 mmol) unter Verwendung von 91,3 mg [(Ph)&sub3;P]&sub3;RhCl in 20 ml Toluol. Dies ergab die Verbindung 5,6-Dihydro-Spinosyn J (0,70 g, 70%) partial ¹H-NMR (CDCl&sub3;) d 6,84 (1H, bs), 3,82 (1H, dt), 1,01 (1 H, m), 0,69 (1H, m).
    • Beispiel F22 5,6-Dihvdro-Spinosyn H
  • Die Verbindung Spinosyn H (2,57 g, 3,58 mmol) wurde in 20 ml Toluol in einem 250 ml Rundkolben gelöst. Zu dieser farblosen Lösung wurde eine Lösung von [(Ph)&sub3;P]&sub3;RhCl (169,2 mg, 0,183 mmol) in 5 ml Toluol zugegeben. Der Kolben wurde mit einem Rücklaufkondensator ausgerüstet und der Kopfraum des Kolbens wurde drei Mai evakuiert und Stickstoffgas wurde eingeführt. Der Stickstoff wurde drei Mal evakuiert und Wasserstoffgas wurde eingeführt. Der Kolben wurde mit einem Ballon unter 1 atm Wasserstoff gehalten und auf 100- 110ºC in einem Ölbad erhitzt. Nach 10 Stunden wurde die Hitze entfernt und der Kolben wurde drei Mal evakuiert, wobei Stickstoffgas nach jeder Evakuierung eingeführt wurde. Die Inhalte des Kolbens wurde heiß unter einer Stickstoff- Atmosphäre durch eine 3"-Celite-Säule filtriert. Das Celite wurde mit 100 ml Ether gewaschen, um die verbleibende Verbindung zu eluieren. Das Filtrat wurde mit 3 · 50 ml 1 N HCl extrahiert. Die sauren Extrakte wurden vereinigt, mit 25 ml Ether rückextrahiert und mit 50 ml 4 N NaOH basisch gemacht. Der weiße Feststoff, der ausfiel, wurde in Ether (2 · 25 ml) extrahiert und die Etherextrakte wurden mit 25 ml Laugenlösung gewaschen. Die Etherlösung wurde durch einen Celite-Pfropfen filtriert und im Vakuum verdampft. Dies ergab die Verbindung 5,6-Dihydro-Spinosyn H (2,24 g, 87,1%). Anal. berechnet für C&sub4;&sub0;H&sub6;&sub5;NO&sub1;&sub0;: C 66,73, H 9,10, N 1,95; Gefunden C 66,31, H 9,01, N 2,02. CI MS (m/z) 721 (M + 1).
    • Beispiel F23 5,6-Dihydro-Spinosyn A Hemiglutarat-Salz
  • Die Verbindung 5,6-Dihydro-Spinosyn A (232,2 mg, 0,316 mmol) wurde in 3 ml Aceton gelöst. Eine Lösung von Glutarsäure (20,8 mg, 0,157 mmol) in 3 ml Aceton wurde zugegeben und die Lösung wurde bei RT über Nacht gerührt. Eine Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum ergab die Verbindung 5,6-Dihydro- Spinosyn A Hemiglutarat-Salz (250,8 mg). Anal, berechnet für C&sub4;&sub1;H&sub6;&sub7;NO&sub1;&sub0;· 1/2(C&sub5;H&sub8;O&sub4;) C 65,31, H 8,94, N 1,75; gefunden C 65,14, H 8,78, N 1,87; Schmelzpunkt 83-92ºC.
    • Beispiel F24 5,6-Dihydro-Spinosyn B
  • Hydrierungsverfahren A: eine Lösung aus Spinosyn B (1,10 g, 1,53 mmol) und (Ph&sub3;P)&sub3;RhCl (0,05 g, 0,09 mmol) in PhMe (15 ml) wurde auf einem Parr-Apparat platziert und für 2 h bei 104-107ºC unter einer H&sub2;-Atmosphäre (45-50 psi) gehalten. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Gemisch im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde entfärbt (Et&sub2;O/Aktivkohle) und filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde durch MPLC gereinigt (SiO&sub2;, 5 : 95 &rarr; 10 : 90 MeOH/CH&sub2;Cl&sub2;), um 0,90 g (82%) 5,6- Dihydro-Spinosyn B als ein weißes Pulver zu ergeben. Berechnet für C&sub4;&sub0;H&sub6;&sub5;NO&sub1;&sub0;: C 66,73, H 9,10, N 1,95. Gefunden C 66,53, H 9,14, N 2,15.
    • Beispiel F25 Synthese der Verbindung (5S,6R)-Epoxy-Spinosyn Q
  • Spinosyn Q (970 mg, 1,32 mmol) wurde in Methylenchlorid (150 ml) gelöst. Die Lösung wurde auf 0ºC abgekühlt und m-CPBA (1,19 g von ca. 50% Reagenz, ca. 3,45 mmol) wurde in einer Portion zugegeben. Sofort, nachdem das m-CPBA gelöst war, wurde das Reaktionsgemisch abseits in einen Kühlschrank gestellt. Nach 40 Stunden wurde das Reaktionsgemisch mit einer 10%igen wässrigen Lösung aus NaHSO&sub3; (2·), mit Wasser (1·) und mit einer 5%igen wässrigen Lösung aus NaHCO&sub3; (2·) extrahiert. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem K&sub2;CO&sub3; getrocknet, filtriert und im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde über einer SiO&sub2;-Flash-Säule (230-400 m, 70 g/EtOAc) getrennt. Die Aufkonzentrierung von chromatographisch homogenen Fraktionen im Vakuum ergab einen weißen Feststoff (694 mg). Ein weißer Feststoff (88 mg) präzipitierte aus einer Lösung aus diesem Material während einer versuchten Kristallisation aus trockenem Et&sub2;O. Die Etherlösung ergab beim Verdampfen die Verbindung (5S,6R)-Epoxy-Spinosyn Q (606 mg, 61%) ¹H-NMR d 6,51 (1 H, bs), 4,73 (1H, d: 1,2 Hz), 3,87 (1H, dd: 1,2, 1,8 Hz), 2,16 (6H, bs 2 · CH&sub3;), 1,31 (3H, s, CH&sub3;) ppm.
    • Beispiel F26 Gemisch aus (5S,6R)-5,6-Dihydro-5,6-dihydroxy-Spinosyn A (65%) und (5R,6S)-5,6-Dihydro-5,6-dihydroxy-Spinosyn A (35%)
  • Spinosyn A (3,26 g, 4,45 mmol) wurde in Aceton (70 ml) gelöst. Wasser (30 ml) wurde zugegeben, gefolgt von N-Methylmorpholin N-Oxid (645 mg, 5,5 mmol) und Osmiumtetroxid (2,5%ige Lösung in 2-Methyl-2-propanol; 160 mg, 0,015 mmol). Nach einer Stunde wurde eine weitere Portion OsO&sub4; (300 mg) zugegeben. Nach 24 h wurde das Gemisch mit einer 10%igen wässrigen NaHSO&sub3;-Lösung (200 ml) vereinigt und aufgearbeitet. Das rohe Produkt wurde über einer kurzen. Flash-Säule mit Silicagel (10% MeOH in EtOAc) gereinigt, um ein untrennbares Gemisch aus (5S,6R)-5,6-Dihydro-5,6-dihydroxy-Spinosyn A (65%) und (5R,6S)-5,6-Dihydro-5,6-dihydroxy-Spinosyn A (35%) (2,24 g, 66%) als einen weißen Feststoff zu liefern: ¹H-NMR d 6,71 (s, 1H), 3,93 (m, 0,65H), 3,88 (m, 0,35H), 2,11 (s, 6H).
    • Beispiel F27 5,6-Dihydro-Spinosyn B
  • Eine Lösung aus Spinosyn B (1,10 g, 1,53 mmol) und (Ph&sub3;P)&sub3;RhCl (0,08 g, 0,09 mmol) in PhMe (15 ml) wurde einer H&sub2;-Atmosphäre (45-50 psi) bei 104-107ºC auf einem Parr-Apparat ausgesetzt. Nach 2 h wurde das Gemisch filtriert und verdampft. Der Rückstand wurde in Et&sub2;O gelöst und mit Aktivkohle aufgeschlämmt. Diese Aufschlämmung wurde filtriert und verdampft. MPLC (5 : 95 MeOH/CH&sub2;Cl&sub2;) ergab 0,90 g (82%) 5,6-Dihydro-Spinosyn B als ein weißes Pulver. Anal, berechnet für C&sub4;&sub0;H&sub6;&sub5;NO&sub1;&sub0;: C 66,73, H 9,10, N 1,95. Gefunden C 66,53, H 9,14, N 2,15.
    • Beispiel F28 5,6-Dihydro-Spinosyn D
  • Zu einer Lösung aus Spinosyn D (2,5 g, 3,4 mmol) in absolutem Ethanol (60 ml) wurde 10% Pd/C und Cyclohexen in ein 100 ml Parr-Gefäß zugegeben. Diese Suspension wurde für 48 h bei 120ºC erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde das Reaktionsgemisch durch ein Celite-Kissen filtriert und im Vakuum aufkonzentriert, um 2,4 g eines 2 : 1-Gemischs aus 5,6-Dihydro-Spinosyn D beziehungsweise Spinosyn D zu ergeben. Der Rückstand (200 mg) wurde in Dichlormethan (20 ml) gelöst und auf 0ºC abgekühlt. MCPBA (95 mg, 0,45 mmol) wurde zum Reaktionsgemisch zugegeben und bei 25ºC für 16 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit einer Natriumbicarbonatlösung gequericht und die Schichten wurden getrennt. Die wässrige Schicht wurde mit Dichlormethan (2 · 20 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit 10% NaHCO&sub3; für 3 h gerührt, mit Lauge gewaschen, über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde durch eine präparative HPLC auf einer C-18-Säule gereinigt, wobei mit 10% Wasser (0,1% NH&sub4;OH) in Methanol eluiert wurde, um die Verbindung 5,6-Dihydro-Spinosyn D (10 mg) zu ergeben. MS m/z 748. ¹H-NMR (CDCl&sub3;, 300 MHz) 6,85 (1H, s), 4,82 (1H, s), 4,65 (1H, m), 4,42 (1H, d), 4,20 (1H, m), 0,95 (3H, d).
    • Teil I Desoxy-Rhamnose-Derivate Beispiel I1 9-(2H-5-R-Acetoxy-5,6-dihydro-6-S-methyl-2-a-pyranyl)-Spinosyn A 9-Pseudoaglycon
  • Spinosyn A 9-Pseudoaglycon (272 mg, 0,500 mmol) und 3,4-di-O-Acetyl-6- desoxy-L-glucal (214 mg, 1,00 mmol) wurden in CH&sub2;Cl&sub2; (3 ml) gelöst. Molekularsiebe (4Å, 40 mg) und Camphersulfonsäure (128 mg, 0,550 mmol) wurden zugegeben. Nach 18 h wurde weitere Camphersulfonsäure (20 mg, 0,086 mmol) zugegeben. Das Gemisch wurde für 3 Tage gerührt. Das Gemisch wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; (10 ml) verdünnt und mit einem 1 : 1 : 1-Gemisch aus Wassergesättigtem wässrigen Natriumbicarbonat-1,0 N NaOH gewaschen. Die wässrige Schicht wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; (zweimal) extrahiert und die vereinigten organischen Phasen wurden mit Wasser gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und verdampft, um ein dunkles Öl zu erhalten. Der Rückstand wurde chromatographiert auf einer Umkehrphasensäule (Kromasil'C18, Silica ODC, 100Å, 10 m, sphärisch, 25 cm · 20 mm) unter Verwendung von 90% MeOH und 10% Wasser (enthaltend 0,1% V/V konz. wässriges NH&sub4;OH), um einen weißen Schaum (44 mg, 11%) zu erhalten. ¹H-NMR d 5,92-5,73 (m, 4H), 5,01 (br s, 1H), 2,09 (s, 3H).
    • Beispiel I2 5,6-Dihydro-9-(2-desoxy-3-O,4-O-diethyl-1-&alpha;-rhamnosyl)-Spinosyn A 9-Pseudoaglycon
  • 9-(2-desoxy-3-O,4-O-diethyl-1-a-rhamnosyl)-Spinosyn A 9-Pseudoaglycon (200 mg, 273 mmol) und Cyclohexen (0,40 ml, 3,95 mmol) wurden in absolutem Ethanol (4 ml) gelöst. Palladium auf Aktivkohle (10%, 20 mg, 19 mmol) wurde vorsichtig zugegeben, und das resultierende Gemisch wurde bei Rückflusstemperatur für 3 h erhitzt. Das Gemisch wurde für weitere 17 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde durch Celite filtriert und unter einer Stickstoffströmung verdampft. Der Rückstand wurde chromatographiert auf einer Umkehrphasensäule (Kromasil' C18, Silica ODS, 100Å, 10 m, sphärisch, 25 cm · 20 mm) mit 90% MeOH und 10% Wasser (enthaltend 0,1% V/V konz. wässriges NH&sub4;OH), um einen gläsernen Feststoff (45 mg, 22%) zu ergeben ¹H-NMR d 6,83 (br s, 1H), 2H-Multiplett bei 5,9-5,7 nicht vorhanden.
    • Beispiel I3 5,6-Dihydro-9-(2-desoxy-3-O,4-O-di-n-nropyl-1-&alpha;-rhamnosyl)- Spinosyn A 9-Pseudoaglycon
  • Cyclohexen (3,0 ml, 28,6 mmol) und Palladium auf Aktivkohle (10%, 43 mg) wurden zu absolutem Ethanol (3 ml) zugegeben. Eine Lösung aus 9-(2-desoxy-3- O,4-O-di-n-propyl-1-&alpha;-rhamnosyl)-Spinosyn A 9-Pseudoaglycon (188 mg, 0,248 mmol) in Ethanol (2 ml) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde bei einer Rückflusstemperatur für 5,5 h erhitzt. Zusätzliches Palladium auf Aktivkohle wurde nach 1 h (38 mg) und nach 4,5 h (67 mg) zum Reaktionsgemisch zugegeben. Das Gemisch wurde abgekühlt, durch Celite filtriert und zu einem dicken Öl aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in Et&sub2;O gelöst und mit konzentriertem wässrigem Natriumbicarbonat und Lauge gewaschen, über wasserfreiem Kaliumcarbonat getrocknet und verdampft, um einen hellen grauen Schaum zu erhalten. Dieses Material wurde chromatographiert auf einer Umkehrphasensäule (Kromasil' C18, Silica ODS, 100Å, 10 m, sphärisch, 25 cm · 20 mm) mit 92% MeOH und 8% Wasser (enthaltend 0,1% v/v konz. wässriges NH&sub4;OH), um ein weißes, amorphes Pulver (80 mg, 42%) zu erhalten. ¹H-NMR d 6,73 (br s, 1H), 2H-Multiplett bei 5,9-5,7 nicht vorhanden.
    • Beispiel 18 Nutzen als Insektizide und Mitizide
  • Die Verbindungen zeigen eine Wirksamkeit gegenüber einer Anzahl von Insekten und Milben. Insbesondere zeigen die Verbindungen eine Wirksamkeit gegenüber der Grünen Gurkenlaus (melon aphid), die ein Mitglied der Insektenordnung Homoptera ist. Andere Mitglieder der Homopteren schließen Zirkaden, Leuchtzirpen, den Birnenblattsauger (pear pyslla), den Apfelblattsauger (apple sucker), Schildläuse, Weiße Fliegen, Schaumzikaden und auch zahlreiche andere wirtsspezifische Läusearten ein. Eine Wirksamkeit wurde auch gegenüber Gewächshaus-Thripse ("greenhouse thrips") beobachtet, die Mitglieder der Ordnung Thysanoptera sind. Die Verbindungen zeigen auch eine Wirksamkeit gegenüber dem Heerwurm, der ein Mitglied der Insektenordnung Lepidoptera ist. Andere typische Mitglieder dieser Ordnung sind der Apfelwickler, der Zünsler, die Kleidermotte, der Maiszünsler ("indianmeal moth"), der Blattwickler, der Amerikanische Baumwollkapselwurm, der Maizünsler ("european corn borer"), der Kohfweißling, Trichoplusia ni ("cabbage looper"), der Eulenfalter ("cotton bollworm"), der "gabworm", Malacosoma americanum ("eastern tent caterpiller"), Acrolophus popeanellus ("sod webworm") und der Asiatische Baumwollwurm. Die Verbindungen waren nützlich zur Reduktion von Insekten- und Milbenpopulationen, und wurden in einem Verfahren zur Hemmung einer Insekten- oder Milbenpopulation verwendet, das Applizieren einer wirksamen Insekten- oder Milben-inaktivierenden Menge einer in den obigen Beispielen beschriebenen Verbindung an einen Ort des Insekts oder der Milbe umfasst. Über Ergebnisse wird in den folgenden Tabellen berichtet, worin die folgenden Abkürzungen verwendet wurden:
  • ALH bezieht sich auf die Aster-Wanderzikade ("aster leafhopper")
  • BAW bezieht sich auf die Zuckerrübeneule ("beet armyworm")
  • CA bezieht sich auf die Bauwoll-Blattlaus ("cotton aphid")
  • NEM bezieht sich auf den Erdnuss-Wurzelgallennematoden ("peanut rootknot nematode")
  • SCRW bezieht sich auf den Südlichen Maiswurzelbohrer ("southern corn rootworm")
  • TBW bezieht sich auf die Tabakeule ("tobacco budworm")
  • TSSM bezieht sich auf die Gemeine Spinnmilbe ("two spotted spider mite")
  • GECR bezieht sich auf die Hausschabe ("german cockroach")
  • Bei der Durchführung der Evaluation der insektiziden Wirksamkeit wurde jede Testverbindung als eine 400 ppm-Lösung formuliert, und diese Lösung wurde dann mit Wasser verdünnt, um geringere Konzentrationen zu ergeben. Die 400 ppm-Lösung wurde durch Kombination von 19,2 ml einer 0,05%igen Lösung aus Tween 20 (Polyoxyethylen-(20) Sorbitanmonolaurat) in Wasser mit einer Lösung aus 8 mg der Verbindung in 0,8 ml Aceton/EtOH (9/1) hergestellt.
  • Eine Wirksamkeit gegenüber der Aster-Wanderzikade (Macrosteles fascifrons) wurde wie folgt getestet. Der Test wurde unter Verwendung von Konzentrationen von 400 ppm und 50 ppm durchgeführt. Plastikschalen von einer Unze enthaltend einen Baumwolldocht wurden mit 0,4 ml des formulierten Materials unter Verwendung einer Flachgebläse-Düse besprüht. Die überschüssige Feuchtigkeit ließ man verdunsten gelassen. Dann wurden fünf bis zehn adulte, mit Kohlenstoffdioxid anästhesierte Zikaden in jede Schale zugegeben. Die Schalen wurden abgedeckt und bei Raumtemperatur für 24 Stunden gehalten. Dann wurde die prozentuale Mortalität bestimmt.
  • Eine Wirksamkeit gegenüber der Zuckerrübeneule (Spodoptera exiqua) wurde wie folgt ermittelt. Der Test wird unter Verwendung von Konzentrationen von 400 ppm und 50 ppm durchgeführt. Eine allgemein verwendbare künstliche Lepidoptera-Nahrung wurde zur Hälfte mit einem 5%igen nicht nährenden Agar verdünnt. 8 ml dieses Nahrungsmaterials wurde in Nahrungsschalen von einer Unze verteilt. Eine Stunde vor der Behandlung wurden 35 bis 40 Eier auf der Nahrungsoberfläche verteilt. Die Schalen wurden dann mit dem formulierten Material durch eine Flachgebläse-Düse besprüht. Behandelte Schalen wurden vor dem Verschließen mit Plastikdeckeln an der Luft getrocknet. Die Schalen wurden für 6 Tage bei Raumtemperatur gehalten. Die Wirksamkeit wurde dann basierend auf der Gesamtzahl der lebenden und toten Larven und anhand der Größe der lebenden Larven bewertet.
  • Eine Wirksamkeit gegenüber der Baumwoll-Blattlaus (Aphis gossypii) und der Gemeinen Spinnmilbe (Tetranychus urticael wurde wie folgt bewertet. "Golden crockneck" Kürbispflanzen wurden bis zum erweiterten Kotyledonen- Stadium aufgezogen (etwa 6 bis 8 Tage). Die Pflanzen wurden 16 bis 24 Stunden vor der Applikation des Testmaterials durch Übertragung eines befallenen Blattschnittes aus einer Stammkolonie mit Baumwoll-Blattläusen und mit Gemeinen Spinnmilben verseucht. Unmittelbar vor der Sprühapplikation des Testmaterials wird das Übertragungsblatt von den Kürbispflanzen entfernt. Der Test wird durchgeführt unter Verwendung von Konzentrationen von 400 ppm und 50 ppm. Die Pflanzen werden unter Verwendung eines Zerstäubers bei 17 psi mit der Testlösung besprüht. Beide Oberflächen der Blätter werden bis zum Abtropfen bedeckt und dann trocknen gelassen. Die Wirksamkeit jeder Verbindung wurde drei Tage nach der Behandlung bestimmt. Die Aktivität wurde bewertet als Prozentangabe basierend auf den Milben/Läusen, die in Pflanzen vorhanden sind, die nur mit Lösungsmittel besprüht wurden.
  • Eine Wirksamkeit gegenüber dem Erdnuss-Wurzelgallennematoden (Meloldogyne arenarial) wurde wie folgt bewertet. Fünf nicht behandelte Gurkensamen werden auf den Boden einer durchsichtigen Schale von einer Unze gelegt, 20 g von sauberem weißem Sand wurden zugegeben und die Schalen wurden besprüht, während sie auf einem Sockel rotierten, wobei sich 1,0 ml einer 400 ppm-Lösung auf dem Sand ablagern konnten. Auf jeder Schale wurden 2,5 bis 3,0 ml von deionisiertem Wasser verteilt, das 300 bis 500 Nematoden enthielt. Die Schalen wurden für 10 bis 12 Tage in einer ökologischen Wachstumskammer bei einer Temperatur von 76 bis 85º F und einer Umgebungsfeuchtigkeit von 50 bis 60% gehalten. Nach 10 bis 12 Tagen wurden die Schalen bewertet durch Umdrehen der Schalen und Beobachten der Mortalität der Nematoden und der Fraßschäden an den Gurkenpflanzen.
  • Eine Wirksamkeit gegenüber dem Südlichen Maiswurzelbohrer (Diabrotica undecipunctata howardi Barber) wurde bewertet durch Zugabe eines ml einer Testlösung enthaltend eine vorbestimmte Konzentration der Testverbindung, zu einer Schale enthaltend ein Maiskorn in 16 g steriler Erde. Dies produziert eine Erdkonzentration von 24 ppm. Nach 1,5 bis 2 Stunden Trocknung wurden fünf Larven im 4. Larvenstadium des Südlichen Maiswurzelbohrers zu den einzelnen Schalen zugegeben. Die Mortalität wurde nach 3-4 Tagen durch Ausleeren der Schale auf eine Platte und Untersuchen der Erde bezüglich lebender Wurzelbohrer gemessen.
  • Eine Wirksamkeit gegenüber der Tabakeule (Heliothis virescens) wurde wie folgt bewertet. Eine allgemein verwendbare künstliche Lepidoptera-Nahrung wurde zur Hälfte mit einem 5%igen nicht nährenden Agar verdünnt. 8 ml dieses Nahrungsmaterials wurde in Nahrungsschalen von einer Unze verteilt. Eine Stunde vor der Behandlung wurden 18 bis 20 Eier auf der Nahrungsoberfläche verteilt. Die Schalen wurden dann mit den formulierten Materialien durch eine Flachgebläse-Düse besprüht. Der Test wurde unter Verwendung von Konzentrationen von 400 ppm und 50 ppm durchgeführt. Behandelte Schalen wurden vor dem Verschließen mit Plastikdeckeln an der Luft getrocknet. Die Schalen wurden für 6 Tage bei Raumtemperatur gehalten. Die Wirksamkeit wurde dann basierend auf der Gesamtzahl der lebenden und toten Larven und anhand der Größe der lebenden Larven bewertet.
  • Eine Wirksamkeit gegenüber der Hausschabe (Blattelle germanicus) wurde wie folgt bewertet. 8 ml von grünem Insektennahrungsmaterial basierend auf Luzerne wurde in einer Nahrungsschale von einer Unze verteilt. Die Schalen wurden dann mit dem formuliertem Material durch eine Flachgebläse-Düse besprüht. Der Test wurde unter Verwendung von Konzentrationen von 400 ppm und 50 ppm durchgeführt. Behandelte Schalen wurden für 24 Stunden an der Luft getrocknet und mit fünf Hausschaben im späten dritten oder frühen vierten Larvenstadium verseucht. Die Schalen wurden verschlossen und für zehn Tage in einer ökologischen Wachstumskammer bei einer Temperatur von 76-85ºC gehalten. Die Wirksamkeit wurde dann basierend auf der Gesamtzahl der lebenden und toten Insekten bestimmt.
    • Nutzen als Nematizide
  • Das Verfahren wurde in Übereinstimmung mit Standardverfahren für die Applikation von Nematizien durchgeführt. Im Allgemeinen kann eine gute Wirksamkeit gegenüber Nematoden bei Größenordnungen von 1-10 Pfund/Acre (lbs/acre) erwartet werden. Die Verbindung kann wie hierin beschrieben formuliert werden. Wenn sie als Dispersionen formuliert sind, werden Nematizide typischerweise als wässrige Beizflüssigkeit um wachsende Pflanzen oder inkrementell über Bewässerungssysteme appliziert. Wenn sie als Granulat appliziert werden, können Nematizide vor dem Bepflanzen in die Erde eingearbeitet werden oder in ein Band am oberen Ende einer Saatreihe appliziert werden oder gesät und dann in die Erde eingearbeitet werden, oder als eine Nebendüngung für eine etablierte Nutzpflanze verwendet werden.
  • Die folgende Wirksamkeit wurde für die unten beschriebenen Verbindungen gefunden:
    • Beispiel 19 Spinosyn-Derivate aus Beispiel 17 Kontrolle von Stomoxys calcitrans (Stallfliege) und Phormia regina (Schmeißfliege)
  • Die Versuchsbedingungen waren wie folgt.
  • Die zu bewertende Verbindung wurde in 1 Teil Aceton/l Teil Ethanol gelöst, um eine Stammlösung der Verbindung bei einer Konzentration von 5000 ppm bereitzustellen; diese Lösung wurde für 15 Minuten auf einem Beschaller geschüttelt. Portionen der Stammlösung wurden in 15 ml Reagenzgläsern platziert und Anteile von Rinderserum wurden zugegeben, um die gewünschte Verdünnung der Versuchsverbindung bereitzustellen. Ein Zahndocht wurde in jedes Reagenzglas gelegt und dem Serum wurde erlaubt, den Docht zu sättigen.
  • Für den Schmeißfliegen-Versuch wurden annähernd 20 Schmeißfliegen- Larven auf der Mitte der Oberseite platziert und das Reagenzglas wurde mit Baumwolle verschlossen und bei 27ºC und 70% Feuchtigkeit für 24 und 48 Stunden inkubiert. Eine Ermittlung der Larvensterblichkeit wurde dann durchgeführt und für jede Sterblichkeit mit der Beförderungsmittel-Kontrolle abgeglichen, um die prozentuale Wirksamkeit gegen Schmeißfliegen zu bestimmen.
  • Für den Versuch mit adulten Stallfliegen wurde der Doch auf einem Filterpapier in einer Petrischale platziert und annähernd 10 gekühlte, lebende, hungrige Stallfliegen wurden in der Mitte des Schalenbodens platziert. Die Schale wurde abgedeckt und bei 27ºC und 60% Feuchtigkeit für 24 und 48 Stunden inkubiert. Eine Ermittlung der Sterblichkeits wurde jeweils nach 24 und 48 Stunden durchgeführt und für jede Sterblichkeit mit der Beförderungsmittel- Kontrolle abgeglichen, um die prozentuale Wirksamkeit gegen eine adulte Stallfliege zu bestimmen.
  • Über die Ergebnisse wird unten berichtet. Wissenschaftliche Tierdaten für Spinosiode

Claims (9)

1. Verbindung mit der Formel:
worin A für eine Einfachbindung oder eine Epoxid-Bindung steht;
B für eine Einfachbindung, eine Doppelbindung oder eine Epoxid-Bindung steht; R
ist;
R¹ Wasserstoff oder Methyl ist;
R², R³ und R&sup4; jeweils unabhängig ein Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoff-Atomen, ein Halogenalkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoff-Atomen oder ein Alkanoyl mit 1 bis 4 Kohlenstoff-Atomen sind;
R&sup5; Wasserstoff, ein Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoff-Atomen, ein Alkylamin mit 1 bis 4 Kohlenstoff-Atomen oder ein Alkylhydroxylamin mit der Formel
ist,
worin R¹&sup0; und R¹¹ jeweils unabhängig H oder ein Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoff- Atomen oder ein Alkanoyl mit 1 bis 5 Kohlenstoff-Atomen sind;
R&sup6; Wasserstoff oder Methyl ist;
R&sup7;, R&sup8; und R8' jeweils unabhängig ein Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoff-Atomen, ein Halogenalkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoff-Atomen oder ein Alkanoyl mit 1 bis 4 Kohlenstoff-Atomen sind und
R&sup9; Methyl oder Ethyl oder ein Säureadditionssalz davon ist.
2. Verbindung nach Anspruch 1, worin die Verbindung ein Säureadditionssalz ist.
3. Verbindung mit der Formel:
Formel II
worin R
Formel III
ist,
worin R¹ und R³ jeweils unabhängig Wasserstoff oder Methyl sind, R&sup4; Methyl oder Ethyl ist, und die folgenden Kombinationen vorliegen:
worin R&sup5;, R&sup6;, R&sup7;, R&sup8; und R&sup9; Cl, F, I oder Br sind;
R¹&sup0;, R¹¹, R¹², R¹³, R¹&sup4; jeweils unabhängig H oder ein Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoff-Atomen oder ein Halogenalkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoff-Atomen sind;
worin das Halogen Br, Cl, F oder l ist;
A&supmin; = Cl&supmin;, Br&supmin; oder I&supmin;;
S = Einfachbindung.
4. Verbindung nach Anspruch 3, worin die Verbindung ein Säureadditionssalz ist.
5. Verbindung mit der Formel (VI) oder ein Säureadditionssalz davon,
worin:
R in der Tabelle unten aufgeführt ist, H oder
ist;
R² in der Tabelle unten aufgeführt ist, H oder
ist;
worin R&sup5;, R&sup6;, und R¹&sup6; jeweils unabhängig Methyl, Ethyl, Propyl oder Suthyl sind;
R¹ H oder Methyl ist;
R&sup4; Methyl oder Ethyl ist,
und die folgende Kombination vorliegt:
worin
DBO doppelt gebundener Sauerstoff ist;
NP nicht vorhanden bedeutet;
R¹&sup0;, R¹¹ und R¹² jeweils unabhängig Wasserstoff, ein Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder ein Halogenalkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sind, worin das Halogen, das das Halogenalkyl umfasst, F, Cl, I oder Br ist;
A&supmin; I&supmin; oder Br&supmin; ist;
R¹³, R¹&sup4; und R¹&sup5; jeweils unabhängig F, Cl, I oder Br sind und Halogen F, Cl, I oder Br ist.
6. Verbindung nach Anspruch 5, worin die Verbindung ein Säureadditionssalz ist.
7. Verbindung nach Anspruch 5 mit der Formel
worin
R VII(a) ist,
worin
R¹&sup0; und R¹¹ jeweils unabhängig Wasserstoff, ein Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder ein Halogenalkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sind, worin das Halogen, das das Halogenalkyl umfasst, F, Cl, I oder Br ist,
R¹ H oder CH&sub3; ist;
R² VIII(a) ist,
R³ und R³' H oder CH&sub3; sind;
R&sup4; CHa oder C&sub2;H&sub5; ist und
R&sup9; H oder CH&sub3; ist.
8. Ein Insektizid, ein Mitizid oder eine Ektoparasiten tötende Zusammensetzung, umfassend als Wirkstoff eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1, 3, oder 5.
9. Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
einem 5,6-Dihydro-Derivat der Verbindung 9-O-(2,3,4-tri-O-ethyl-&alpha;-L-rhamnosyl)- Spinosyn A 9-Psa;
(5S,6R)-Epoxy-2'-O-(p-trifuormethyl)benzoyl-Spinosyn Q;
5,6-Dihydro-3'-O-ethyl-Spinosyn J;
5,6-Dihydro-3'-O-n-propyl-Spinosyn J;
5,6-Dihydro-3'-O-n-butyl-Spinosyn J;
5,6-Dihydro-3'-O-n-propyl-Spinosyn J Hemiglutaratsalz;
5,6-Dihydro-2'-O-ethyl-Spinosyn H;
5,6-Dihydro-2'-O-n-propyl-Spinosyn H;
(5R,6S)-5,6-Epoxy-3'-O-n-propyl-Spinosyn L
(5S,6R)-5,6-Epoxy-3'-O-n-propyl-Spinosyn L;
(5R,6S)-3'-Desoxy-5,6-epoxy-3'-methylen-Spinosyn J;
(5S,6R)-3'-Desoxy-5,6-epoxy-3'-methylen-Spinosyn J;
5,6-Dihydro-3'-O-n-propyl-Spingosyn J;
5,6-Dihydro-3'-O-isopropyl-Spingosyn J;
5,6-Dihydro-3'-epi-N-formyl-3'-propyl-Spinosyn J;
5,6-Dihydro-3'-epi-3'-propyl-Spinosyn J;
5,6-Dihydro-3'-O-vinyl-Spinosyn J;
(14S)-5,6,13,14-Tetrahydro-3'-O-n-propyl-Spinosyn J;
5,6-Dihydro-3'-methoxymethyl-Spinosyn J;
4"-N-Desmethyl-4"-N-(2-fluorethyl)-5,6-dihydro-3'-O-propyl-Spinosyn J;
4"-N-Desmethyl-5,6-dihydro-3'-O-propyl-Spinosyn J;
5,6-Dihydro-4"-N-(2-methyl-1-propyl)-Spinosyn B;
3",4"-Dehydro-4"-desamino-5,6-dihydro-Spinosyn A;
5,6-Dihydro-N-formyl-Spinosyn B;
4"-Desamino-5,6-dihydro-4"-keto-Spinosyn C;
4"-Desamino-5,6-dihydro-4-'-(S)-hydroxy-Spinosyn C;
4"-Desamino-5,6-dihydro-4'-(S)-methoxy-Spinosyn C;
(14S)-5,6,13,14-Tetrahydro-Spinosyn A;
(14R)-5,6,13,14-Tetrahydro-Spinosyn A;
(14S)-5,6,13,14-Tetrahydro-3'-desoxy-Spinosyn J;
(5S,6R)-5-(2-Hydroxyethoxy)-6-brom-Spinosyn A 17-Psa;
(5S,6R)-5,6-Epoxy-17-Otrimethylsilyl-Spinosyn A 17-Psa;
(5S,6R)-5,6-Epoxy-Spinosyn A 17-Psa;
(5R,6S)-5-(2-Hydroxyethoxy)-6-brom-Spinosyn A;
(5S,6R)-5,6-Dihydroxy-5,6-dihydro-Spinosyn A;
(5S,6R)-Spinosyn A-carbonat;
(5S,6R)-5-Acetoxy-6-brom-Spinosyn A;
(5R,6R)-5-Acetoxy-6-brom-5,6-dihydro-Spinosyn A;
5,6-Dibrom-Spinosyn A 17-Psa;
5,6-Dihydro-Spinosyn A;
(5S,6R)-5,6-Epoxy-Spinosyn A
(5R,6S)-Epoxy-Spinosyn A;
(5S,6R)-Epoxy-Spinosyn D;
(5R,6S)-Epoxy-Spinosyn D;
(5S,6R)-Epoxy-Spinosyn A,N-Oxid;
(5R,6S)-Epoxy-Spinosyn A,N-Oxid;
(5S,6R)-Epoxy-Spinosyn D,N-Oxid;
(5R,6S)-Epoxy-Spinosyn D,N-Oxid;
(5R,6S)-5,6-Dibrom-4"-keto-Spinosyn A;
(5R,6R)-5,6-Dibrom-Spinosyn B;
5,6-cis-Dihydroxy-5,6-dihydro-Spinosyn B;
Dichlorketenacetal von (5S,6R)-5,6-Dihydroxy-Spinosyn A;
(5S,6R)-5,6-bis(trichloracetoxy)-Spinosyn A;
(5R,6R)-5,6-Dibrom-Spinosyn A;
(5S)-5,6-Dihydro-5-hydroxy-Spinosyn A;
(6S)-5,6-Dihydro-6-hydroxy-Spinosyn A;
(6R)-5,6-Dihydro-6-hydroxy-Spinosyn A;
(5R,6R)-5-Acetoxy-6-thiomethoxy-Spinosyn A;
(5R,6R)-5-Acetoxy-6-methylsulfonyl-Spinosyn A;
(5R,6R)-6-Brom-5-hydroxy-Spinosyn J;
5,6-Dihydro-Spinosyn A 9-Psa;
5,6-Dihydro-Spinosyn A 17-Psa;
5,6-Dihydro-Spinosyn J;
5,6-Dihydro-Spinosyn H;
5,6-Dihydro-Spinosyn A Hemiglutarat-Salz;
5,6-Dihydro-Spinosyn B;
(5S,6R)-Epoxy-Spinosyn Q;
(5S,6R)-5,6-Dihydro-5,6-dihydroxy-Spinosyn A;
(5R,6S)-5,6-Dihydro-5,6-dihydroxy-Spinosyn A;
5,6-Dihydro-Spinosyn D;
9-(2H-5-R-Acetoxy-5,6-dihydro-6-S-methyl-2-a-pyranyl)-Spinosyn A 9-Pseudoaglycon;
5,6-Dihydro-9-(2-desoxy-3-O,4-O-diethyl-1-&alpha;-rhamnosyl)-Spinosyn A 9-Pseudoaglycon;
5,6-Dihydro-9-(2-desoxy-3-O,4-O-di-n-propyl-1-&alpha;-rhamnosyl)-Spinosyn A 9- Pseudoaglycon.
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